一種L‑茶氨酸硒螯合物及製備方法和含該螯合物的含片及製備方法與流程
2023-05-02 18:03:51
本發明涉及螯合物及其含片的製備方法，具體為一種L-茶氨酸硒螯合物及製備方法和含該螯合物的含片及製備方法。
背景技術：
硒是生物體內必需的營養元素之一。人體缺硒會造成重要器官的功能失調，導致許多嚴重疾病的發生。硒可以清除體內自由基，抗衰老；加入損傷心肌的修復，預防和治療肝、腎、哮喘、妊娠高血壓等病；對鉛、鎘、汞、砷、鉈等重金屬有拮抗作用，可減輕上述化學物質對人體的危害；有「抗癌之王」的美稱，能明顯抑制腫瘤擴展；維護白血球活性，是一種免疫效用增強劑。因此，堅持適量補硒，是增強人體健康、防備疾病、延年益壽的有效辦法。目前市場上補硒保健品主要分為無機硒(亞硒酸鈉)、有機硒(硒酵母)、納米硒。上海四通納米技術港有限公司出產的「硒旺膠囊」是目前市場上唯一通過國家認定，獲衛生部批准的「納米硒」產品，比傳統無機硒(亞硒酸鈉)、有機硒(硒酵母)的生物活性高5-7倍，同時又它具有無機硒、有機硒沒有的低毒性，但生產成本高，難以在市場上推廣。硒酵母在體內轉化率非常低，不能滿足補硒人群的硒需求而且氣味比較大。
茶氨酸(L-Theanine)是茶葉中含量最高的游離胺基酸，約佔游離胺基酸總量的50％以上，佔茶葉乾重的1％-2％。茶氨酸為白色針狀體，易溶於水。具有甜味和鮮爽味，是茶葉的滋味的組分。茶氨酸含量約為新茶的1～2％左右，其含量隨發酵過程減少。茶氨酸本身還具有許多生理功能：(1)能影響腦內神經傳達物質的變化，增強記憶力；(2)有鎮靜作用，可預防神經失調症、失眠症、經期綜合症等；(3)能保護神經細胞，可用於對腦栓塞、腦出血、腦中風、腦缺血以及老年痴呆等疾病的防治；(4)有降血壓作用；(5)能增強抗癌藥物的療效；(6)能抑制癌細胞的漫潤；(7)能提高免疫力。1964年，日本批准了L-茶氨酸為食品添加劑使用，而美國FDA也在1985年給予了L-茶氨酸GRAS的分類，意味著可以自由地用於各種食品中。茶氨酸在中國研究進展比較慢，直到2014年7月18日，衛計委終於批准了它作為新食品原料。
早在六七十年代就已經發現胺基酸和小肽具有促進鈣、鐵、鋅等金屬離子吸收的作用，而且胺基酸和肽的金屬複合體的生物學利用率比無機鹽高，且無毒副作用。因此，開發兼具茶氨酸多種生理功能和微量元素高生物學利用率的的多肽螯合硒保健品具有重要意義。無論是單一胺基酸還是用蛋白質水解得到的複合胺基酸，當其與金屬離子螯合時，螯合工藝大致相同，主要有：水體系合成法、微波固相法、室溫固相法及電解合成法。水體系合成法工藝周期長，螯合反應溫度和pH較難控制，易被廢液汙染，但產率較高。此工藝是胺基酸螯合微肥生產較為理想的選擇。微波固相法合成操作簡便省時，製得產品純度較高，但易產生副產物且在微波下易焦糊，很難大規模生產。室溫固相法主要用於納米材料的合成，對螯合原料純度要求較高。電解合成法昂貴又費時。目前國內外研究較多的是穀氨酸硒、蛋氨酸硒等，而對於L-茶氨酸與硒離子的螯合物幾乎沒有相關報導。
技術實現要素：
針對現有技術中存在的問題，本發明提供一種L-茶氨酸硒螯合物及製備方法和含該螯合物的含片及製備方法，生產成本較低，不受資源限制，環境汙染小，可大量生產且產品比較安全。
本發明是通過以下技術方案來實現：
一種L-茶氨酸硒螯合物的製備方法，以L-茶氨酸和硒鹽為原料，以pH值為7-10的緩衝液為反應介質構成反應體系，在70-90℃下混合，反應完全後將反應液分離純化，獲得L-茶氨酸硒螯合物；所述L-茶氨酸與硒鹽溶液質量比為(3-1)：1；所述的L-茶氨酸由枯草芽孢桿菌發酵所產的γ-穀氨醯轉肽酶，以L-穀氨醯胺和乙胺鹽酸鹽為底物發酵製備得到。
優選的，所述L-茶氨酸硒螯合物具體製備步驟如下：
步驟1，合成L-茶氨酸原料液；
步驟2，將L-茶氨酸原料液脫色過濾後，濾液備用；
步驟3，在濾液中加入濾液質量濃度為35％的硒鹽水溶液；用氫氧化鈉調節至pH值為7-10，氮氣吹掃，於70-90℃下進行2h螯合反應；
步驟4，螯合反應結束後，自然冷卻至室溫，進行純化；將所得螯合液濃縮至原體積1/3-1/6，加入5-8倍體積濃度95％乙醇水溶液，沉澱靜置8-15h，除去上清液，將沉澱用95％的乙醇洗滌抽濾多次，取濾餅乾燥後得到L-茶氨酸硒螯合物。
進一步，所述的步驟1的具體步驟如下，
1.1將枯草芽孢桿菌接種在平板培養基上，在37℃下靜置培養16h進行一次活化後，再轉接到液體培養基上進行二次活化；將經兩次活化好的枯草芽孢桿菌二級種子液按體積分數3％接種量轉接於30mL發酵培養液中，置於恆溫培養箱中37℃振蕩培養12-16h；
1.2收集振蕩培養的發酵液離心後得γ-穀氨醯轉肽酶粗酶液；採用分光光度計測定酶活，選取酶活0.01U/mL-0.2U/mL的粗酶液備用，進行催化反應；
1.3分別加入粗酶液質量10％的L-穀氨醯胺和粗酶液質量10％的乙胺鹽酸鹽溶液進行催化反應，L-穀氨醯胺的濃度為15-50mmol/L，乙胺鹽酸鹽的濃度為20-80mmol/L；用乙胺水調節催化反應體系至pH值為10，37℃靜置培養5-8h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。
再進一步，步驟2中，加入L-茶氨酸原料液重量2％的活性炭進行吸附脫色，反應過程溫度為60-80℃，反應時間為3-8min。
優選的，所述硒鹽為亞硒酸鈉。
一種由本發明所述的方法製備得到的L-茶氨酸硒螯合物。
一種含L-茶氨酸硒螯合物的含片製備方法，按質量份數計，取粉末狀的L-茶氨酸硒螯合物20-35％，β-環糊精5-20％，葡萄糖5-20％，蔗糖2-10％，檸檬酸1-3％，麥芽糊精5-20％，混合後按質量比例加入1％的硬脂酸鎂，壓片裝袋，即得含L-茶氨酸硒螯合物的含片。
一種由本發明所述的方法製備得到含L-茶氨酸硒螯合物的含片。
與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
本發明採用微生物酶法製備L-茶氨酸，在此基礎上，採用水體系合成法螯合硒離子和L-茶氨酸，生產成本低，環境安全性高，資源消耗少，能夠進行大量安全生產。L-茶氨酸被評為「最值得開發的食品新材料」，其特有的生理功能與硒離子補血功能相結合，不但能提高彼此的生物利用率，還能獲得清香茶風味，在食品行業具有廣泛應用前景。將L-茶氨酸硒螯合物製成含片，既有顯著的茶葉特色又能作為提供營養的休閒食品。本發明製備的L-茶氨酸硒螯合物結合牢固，如圖1所示，在胃中不會析出硒離子，不會造成胃腸刺激。
本發明所述的含L-茶氨酸硒螯合物的含片既有茶氨酸所含的茶香味和鮮爽味，且含硒量高，吸收快，毒副作用低。L-茶氨酸與硒離子螯合物可以通過改善機體免疫系統來提高免疫功能，增強對疾病的抵抗能力。
進一步的，本發明通過乙醇純化析出結晶，得到產品純度較好，含量可到90％以上，回收率為90％-93％，晶體質地均勻，色澤純淨，質量上佳。
附圖說明
圖1為本發明實例中所述L-茶氨酸和L-茶氨酸硒螯合物由紫外掃描儀U-1800得到的吸收光譜曲線。
圖中：a為L-茶氨酸的吸收光譜曲線，b為L-茶氨酸硒螯合物的吸收光譜曲線。
具體實施方式
下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
實施例1
一種含L-茶氨酸硒螯合物的含片製備方法，包括如下步驟：
第一：取4℃下斜面保存的枯草芽孢桿菌接種在平板培養基上，37℃靜置培養16h，再轉接到3mL液體培養基上進行活化。將活化2次的枯草芽孢桿菌二級種子液按3％體積分數接種量轉接於30mL發酵培養液中，置於恆溫培養箱中37℃振蕩培養，隔夜培養12h。
第二：收集發酵液於8000rpm離心25min，得γ-穀氨醯轉肽酶粗酶液。採用分光光度計測定酶活。選取酶活0.01U/mL的粗酶液20mL備用進行催化反應。
第三：分別加入粗酶液重量10％的L-穀氨醯胺(濃度15mmol/L)和乙胺鹽酸鹽(濃度20mmol/L)溶液進行催化反應，用乙胺水調節反應體系至pH10，37℃靜置培養5h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。
第四：將原料液過濾，除去雜質。加入原料液重量2％的活性炭攪拌，進行吸附脫色，反應過程溫度為60℃，反應時間為3min。脫色後再次過濾，濾液備用。
第五：加入質量濃度為35％的硒鹽溶液，加入量為茶氨酸溶液質量的1/3，用氫氧化鈉調節至pH7，氮氣吹掃，於70℃下反應2h進行螯合反應。採用雙硫腙顯色法初步判斷螯合物質量及穩定性。所述硒鹽為亞硒酸鈉。
第六：螯合反應結束後，自然冷卻。將反應液在4000rpm下離心20min，將所得螯合液濃縮至原體積1/3，加入5倍體積濃度95％乙醇水溶液，沉澱靜置8h，去除上清液，用等體積95％乙醇水溶液洗滌2-3次，真空冷凍乾燥。即獲得L-茶氨酸硒螯合物。真空冷凍乾燥溫度為5℃-40℃，本具體實施例優選5℃。
第七：依次加入L-茶氨酸硒螯合物粉末20％，β-環糊精5％，葡萄糖5％，蔗糖2％，檸檬酸1％，麥芽糊精5％，混合後按質量比例加入1％的硬脂酸鎂，壓片裝袋，即得L-茶氨酸硒含片。
實施例2
一種含L-茶氨酸硒螯合物的含片製備方法，包括如下步驟：
第一：取4℃下斜面保存的枯草芽孢桿菌接種在平板培養基上，37℃靜置培養16h，再轉接到3mL液體培養基上進行活化。將活化2次的枯草芽孢桿菌二級種子液按3％體積分數接種量轉接於30mL發酵培養液中，置於恆溫培養箱中37℃振蕩培養，隔夜培養14h。
第二：收集發酵液於8000rpm離心25min，得γ-穀氨醯轉肽酶粗酶液。採用分光光度計測定酶活。選取酶活0.15U/mL的粗酶液20mL備用進行催化反應。
第三：分別加入粗酶液重量10％的L-穀氨醯胺(濃度20mmol/L)和乙胺鹽酸鹽(濃度40mmol/L)溶液進行催化反應，用乙胺水調節反應體系至pH10，37℃靜置培養7h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。
第四：將原料液過濾，除去雜質。加入原料液重量2％的活性炭攪拌，進行吸附脫色，反應過程溫度為70℃，反應時間為6min。脫色後再次過濾，濾液備用。
第五：加入質量濃度為35％的硒鹽溶液，加入量為茶氨酸溶液質量的2/3，用氫氧化鈉調節至pH8，氮氣吹掃，於80℃下反應2h進行螯合反應。採用雙硫腙顯色法初步判斷螯合物質量及穩定性。所述硒鹽為亞硒酸鈉。
第六：螯合反應結束後，自然冷卻。將反應液在4000rpm下離心40min，將所得螯合液濃縮至原體積1/5，加入6倍體積濃度95％乙醇水溶液，沉澱靜置12h，去除上清液，用等體積95％乙醇水溶液洗滌2-3次，20℃下真空冷凍乾燥。即獲得L-茶氨酸硒螯合物。
第七：依次加入L-茶氨酸硒螯合物粉末28％，β-環糊精15％，葡萄糖15％，蔗糖7％，檸檬酸2％，麥芽糊精15％，混合後按質量比例加入1％的硬脂酸鎂，壓片裝袋，即得L-茶氨酸硒含片。
實施例3
一種富含L-茶氨酸硒螯合物的含片製備方法，包括如下步驟：
第一：取4℃下斜面保存的枯草芽孢桿菌接種在平板培養基上，37℃靜置培養16h，再轉接到3mL液體培養基上進行活化。將活化2次的枯草芽孢桿菌二級種子液按3％體積分數接種量轉接於30mL發酵培養液中，置於恆溫培養箱中37℃振蕩培養，隔夜培養16h。
第二：收集發酵液於8000rpm離心25min，得γ-穀氨醯轉肽酶粗酶液。採用分光光度計測定酶活。選取酶活0.2U/mL的粗酶液20mL備用進行催化反應。
第三：分別加入粗酶液重量10％的L-穀氨醯胺(濃度50mmol/L)和乙胺鹽酸鹽(濃度80mmol/L)溶液進行催化反應，用乙胺水調節反應體系至pH10，37℃靜置培養8h，合成L-茶氨酸，得到L-茶氨酸原料液。
第四：將原料液過濾，除去雜質。加入原料液重量2％的活性炭攪拌，進行吸附脫色，反應過程溫度為80℃，反應時間為8min。脫色後再次過濾，濾液備用。
第五：加入質量濃度為35％的硒鹽溶液，加入量為茶氨酸溶液質量的100％，用氫氧化鈉調節至pH10，氮氣吹掃，於90℃下反應2h進行螯合反應。採用雙硫腙顯色法初步判斷螯合物質量及穩定性。所述硒鹽為亞硒酸鈉。
第六：螯合反應結束後，自然冷卻。將反應液在4000rpm下離心60min，將所得螯合液濃縮至原體積1/6，加入8倍體積濃度95％乙醇水溶液，沉澱靜置15h，去除上清液，用等體積95％乙醇水溶液洗滌2-3次，40℃下真空冷凍乾燥。即獲得L-茶氨酸硒螯合物。
第七：依次加入L-茶氨酸硒螯合物粉末35％，β-環糊精20％，葡萄糖20％，蔗糖10％，檸檬酸3％，麥芽糊精20％，混合後按質量比例加入1％的硬脂酸鎂，壓片裝袋，即得L-茶氨酸硒含片。
本發明的範圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只作為闡明本發明各方面的單個例子，本發明範圍還包括功能等同的方法和組分。本領域技術人員在沒有脫離權利要求限定範圍的前提下，仍然可以對本發明做出各種改進和變換，所做的改進和變換仍然屬於本發明的保護範圍。