一種李氏木黴菌株及其製備方法
2023-04-24 20:12:51
一種李氏木黴菌株及其製備方法
【專利摘要】本發明屬生物【技術領域】，具體涉及通過原生質體融合技術構建高產纖維素酶的菌株，以及李氏木黴原生質體製備、分離、融合、再生及其篩選方法。本發明以三種李氏木黴為出發菌株，經PDA培養基活化、培養後，利用蝸牛酶、溶壁酶等水解細胞壁，在恆溫下振蕩，製備原生質體，經原生質體融合後，利用含纖維素的平板進行篩選，最後，得到一株纖維素酶高產菌株(Trichoderma?reesei?JL16)，該菌產纖維素酶的能力比出發菌株提高了25％。本發明李氏木黴菌株JL16可以用於工業生產；針對李氏木黴提出的原生質體製備、分離、融合、再生及其篩選方法具有很強的應用前景。
【專利說明】一種李氏木黴菌株及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬生物【技術領域】，具體涉及通過原生質體融合技術構建的高產纖維素酶的李氏木黴菌株，以及李氏木黴的製備方法。
技術背景
[0002]用於生產的纖維素酶一般來自於黴菌，比較典型的是木黴屬。而李氏木黴則是木黴屬中最為重要的一種，並在纖維素降解領域得到廣泛應用。從分離得到第一株李氏木黴到現在，李氏木黴經歷了多輪誘變、篩選，得到了包括MCG-77，QM9414，RUTC-30等眾多高產菌株。
[0003]工業生產上，一般使用真菌等生產纖維素酶，其中最著名的是李氏木黴，李氏木黴具有纖維素酶酶譜全、活力高的特點。自20世紀60年代以來，人們以野生菌株T.reeseiQM6a為出發菌株，進行了大量的誘變育種工作，其中QM9414、RutC30和MCG77等能夠大量表達內切和外切葡聚糖酶，是國內外纖維素酶生產的主要菌種。
[0004]通過使用原生質體融合的方法能夠得到高產纖維素酶的李氏木黴菌株。原生質體融合指通過人為的方法，把常規誘變所獲得的優良性狀菌株，通過原生質體融合集中到一個菌株中。目前，通過原生質體融合技術獲得優良菌株的主要專利包括CN201210301323.5、CN201010210226.6、CN201010174196.8、CN200880132218.5 等，這些原生質體融合主要採用「雙親滅活法」，操作方法仍需進一步簡化，誘變率還需進一步提高。本發明選擇三株纖維素酶高產菌株進行融合，從而提高纖維素酶系的整體活力。
【發明內容】
[0005]本發明目的之一是通過多株李氏木黴的原生質體融合，得到一株纖維素酶高產菌株。
[0006]本發明目的之二是建立李氏木黴誘變及篩選方法。
[0007]原生質體融合在本質上是基因組水平的隨機重組，它的一般步驟是，通過經典的誘變育種方法得到多個正突變菌株，也就是多樣性的的基因組庫，然後，將這些突變菌株製備成原生質體，通過原生質體融合，進行全基因組水平的隨機重組，篩選得到高產菌株。
[0008]本發明對QM9414、RutC30和MCG77進行原生質體融合，通過篩選，得到纖維素酶高產菌株。同時，建立了李氏木黴原生質體製備、分離、融合、再生和高產菌株的篩選方法。本發明構建的高產纖維素酶(李氏木黴幾16)，於2014年I月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.8807，分類命名為李氏木黴(Trichoderma reesei)。該菌株纖維素酶產率高，遺傳穩定性好。
[0009]本發明請求保護的一種李氏木黴菌株，是於2014年I月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8807的菌株，菌株的名稱為李氏木黴幾16。
[0010]所述的李氏木黴幾16，是採用三株纖維素酶高產菌株通過原生質體製備、原生質體分離、原生質體融合、原生質體再生和篩選的製備步驟構建；所述的三株纖維素酶高產菌株，是李氏木黴菌QM9414、李氏木黴菌MCG77和李氏木黴菌RutC-30。
[0011]本發明的李氏木黴JL16的製備方法的技術方案如下所述。
[0012]一種李氏木黴菌株的製備方法，有原生質體的製備、原生質體的融合、原生質體的再生和篩選的過程；
[0013]所述的原生質體的製備，是將李氏木黴菌QM9414、李氏木黴菌MCG77和李氏木黴菌RutC-30分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基，得到含有成熟李氏木黴孢子的菌絲；將三株李氏木黴孢子懸液接種至種子培養基中，得到含有抱團菌絲體的李氏木黴；將菌絲體用PH6.5的檸檬酸緩衝液定容，離心，棄上清後重新補加檸檬酸緩衝液並混勻；再分別加入到去壁混合酶液中酶解細胞壁，得到含原生質體的溶液；最後經分離得到白色沉澱的李氏木黴原生質體；
[0014]所述的原生質體的融合，用融合劑將三種白色沉澱原生質體一起吹溶，室溫靜置10~60min ;所述的融合劑，由按下列重量配比的物質組成:20 %~80 %聚乙二醇(PEG4000)、0.01 ~0.05M CaCl2 和 0.2 ~1.0M 山梨醇；
[0015]所述的原生質體的再生，是將融合完的原生質體懸液用NaCl溶液梯度稀釋，取稀釋液塗在原生質體再生培養基上，28°C見光培養96h，保持相對溼度大於60%，直到長出透明圈；所述的再生培養基，由下列重量配比的物質組成=KH2PO4 3~5g/L、NaNO3 2.6~3.0g/L、尿素 0.5 ~1.0g/L、FeSO4.7Η20 7.5 ~I Omg/L、MnSO4.H2O 2.5 ~3.0mg/L、ZnSO4.7Η20 3.6 ~5 .0mg/L、CoCl2.6Η20 3.7 ~5.0mg/L、MgSO4.7Η20 0.5 ~1.0g/L、CaCl20.5~1.0g/L、脫氧膽酸鈉2~5g/L、蛋白腖10~15g/L、NaCl 35~50g/L、瓊脂16~20g/L、球磨纖維素20g/L ；
[0016]所述的篩選，是挑取透明圈直徑/菌落直徑大的菌株一環至甘油中，得到李氏木黴JL16於-80°C下保存。
[0017]在原生質體的製備中，檸檬酸緩衝液由下列重量配比的物質組成:每升中含有
0.1M檸檬酸溶液70ml、0.1M檸檬酸鈉溶液930ml、NaCl 0.6mol。
[0018]在原生質體的製備中，去壁混合酶液由溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶，加入pH6.5檸檬酸緩衝液構成，各成分含量為溶壁酶2~8mg/ml、蝸牛酶2~8mg/ml、纖維素酶2~8mg/ml ο
[0019]在原生質體的製備中，分離所使用的分離裝置是由一支5~50ml的離心管，在距底部I~1cm處塞滿脫脂棉，厚度約為I~5cm，底部插入槍頭，用檸檬酸緩衝液浸溼脫脂棉，在分離裝置頂部加入酶解後的菌液，1000~3000rpm離心8~lOmin，底部液體即為含有原生質體的穩滲液，取出分離裝置中的脫脂棉，將分離裝置底部液體分裝至I~1ml離心管中，3000~8000rpm離心12~15min，去掉上清後底部殘留的白色沉澱即為原生質體。
[0020]在原生質體的再生中所述的球磨纖維素，是經直徑2~4mm的玻璃珠在200rpm下振蕩處理48小時得到的纖維素。
[0021]本發明提供的李氏木黴原生質體製備、分離及融合的方法，更具體的操作步驟敘述如下:
[0022]1.製備三親本的李氏木黴孢子懸液
[0023]分別挑取甘油凍存管中的三株李氏木黴菌株QM9414、MCG77、RutC-30 一環，接種在含有50ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基製成的固體斜面上，在溫度28°C、培養72h，得到含有成熟李氏木黴孢子的菌絲，加入2ml無菌蒸餾水，用vortex振蕩2min，得到含有孢子的孢子液，將該孢子液進行倍比稀釋，並在顯微鏡下計數，使得成熟的李氏木黴孢子濃度在I X 106/ml的李氏木黴孢子懸液。
[0024]所述PDA培養基由下列重量配比的物質組成:土豆:200g/L (煮沸30min並過濾)；匍萄糖:20g/L ;瓊月旨:20g/L。
[0025]2.製備三親本的菌絲懸液
[0026]分別將三株Iml的李氏木黴孢子懸液接種至20ml種子培養基中，控制搖床轉速為200rpm，溫度28°C，培養72h，用8層紗布過濾掉培養基，得到含有抱團菌絲體的李氏木黴。
[0027]將菌絲體導入50ml的離心管中，用pH6.5的檸檬酸緩衝液定容至15ml，5000轉4°C離心10min，棄掉上清後重新補加檸檬酸緩衝液至15ml，重複3次，最後，將菌絲體在緩衝液中混勻。
[0028]所述pH6.5的檸檬酸緩衝液由下列重量配比的物質組成:每升中含有:0.1M檸檬酸溶液70ml、0.1M檸檬酸鈉溶液930ml、NaCl 0.6mol。
[0029]3.去壁酶的製作
[0030]取三支5ml的EP管，分別加入的溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶，並分別加入pH6.5檸檬酸緩衝液，充分溶解。
[0031]用孔徑為0.2μπι的濾膜分別過濾三種酶液並混合到一起，最終得到的混合酶液，含量為溶壁酶2~8mg/ml、蝸牛酶2~8mg/ml、纖維素酶2~8mg/ml。
[0032]4.酶解細胞壁
[0033]三株菌各取3ml的菌絲懸液，並分別加入1ml的混合酶液，溫度35°C輕微振蕩酶解3個小時，每半個小時一鏡檢觀察。
[0034]5.三親本的原生質體的分離及融合
[0035]酶解去壁後,取一支5~50ml的離心管,在距底部I~1cm處塞滿脫脂棉,厚度約為I~5cm，底部插入槍頭，構成自製的原生質體分離裝置(如圖1)。用pH6.5的檸檬酸緩衝液浸溼分離裝置中的脫脂棉，在分離裝置頂部分別加入酶解去壁後的三種菌液，1000~3000rpm離心8~lOmin，離心後，用鑷子取出脫脂棉，將分離裝置底部含有原生質體的檸檬酸緩衝液分裝至I~1ml離心管中，3000~8000rpm離心12~15min,去掉上清後底部殘留的白色沉澱即為原生質體，立刻加入400 μ I融合劑將3種菌株的白色沉澱一起吹溶，最終室溫靜置10~60min，並鏡檢觀察。
[0036]所述的融合劑由下列重量配比的物質組成:20%~80%聚乙二醇(PEG4000)；
0.01 ~0.05M CaCl2 ；0.2 ~1.0M 山梨醇。
[0037]本發明又提供了纖維素酶高產菌株的再生、篩選方法，具體操作步驟如下:
[0038]1.原生質體的再生
[0039]將融合完的原生質體懸液用濃度0.6mol/L的NaCl溶液梯度稀釋100倍，取0.1ml稀釋液塗在原生質體再生培養基上，28°C見光培養96h，保持相對溼度大於60%，直到長出透明圈為止。
[0040]所述的再生培養基由下列重量配比的物質組成=KH2PO4:3~5g/L ；NaN03:2.6~3.0g/L ;尿素:0.5 ~1.0g/L ；FeS04.7H20:7.5 ~I Omg/L ；MnS04.H2O:2.5 ~3.0mg/L ；ZnSO4.7H20:3.6 ~5.0mg/L ；CoCl2.6H20:3.7 ~5.0mg/L ；MgS04.7H20:0.5 ~1.0g/L ；CaCl2:0.5 ~1.0g/L ;脫氧膽酸鈉:2 ~5g/L ;蛋白腖:10 ~15g/L ；NaCl:35 ~50g/L ;瓊脂:16~20g/L ;球磨纖維素20g/L (球磨纖維素事先用10g直徑3mm左右的玻璃珠200rpm振蕩處理48h)。
[0041]2.高產纖維素酶的李氏木黴菌株的篩選和檢測方法:
[0042]挑取透明圈直徑/菌落直徑大的6株菌落一環至Iml去離子水中，在顯微鏡下計數，適量稀釋至菌濃度為lX106/ml，取Iml加入發酵液中，200rpm 28~32°C培養96~144h,後取Iml的發酵液，8000rpm離心8~1min取上清，測定酶活，發現JL16號菌株的酶活明顯高於三株原始菌株高，即幾16號菌株為突變株。
[0043]每一個250ml的錐形瓶中含有10ml的發酵液，所述的發酵液由下列重量配比的物質組成:蛋白腖3~5g/L、酵母提取物0.5~1.0g/L、KH2P043~5g/L、(NH4)2S042~5g/L、尿素 0.3 ~0.5g/L、MgS040.3 ~0.5g/L、CaC035 ~10g/L、氣爆秸杆 30 ~40g/L，調節 pH至 5.5。
[0044]酶活的測定方法:將l*6cm濾紙條對摺捲起放入試管底部，加入1ml檸檬酸緩衝液，注:緩衝液要將濾紙完全浸透，水浴50°C保溫，加入適當稀釋的酶液，50°C 60min反應。加3ml DNS，充分混勻後放入沸水浴中5min，如作標準曲線，則同時加3mlDNS。空白:1.5ml檸檬酸緩衝液，酶空:1.0ml檸檬酸緩衝液+0.5ml酶液，濾紙空白:1.5ml檸檬酸緩衝液+濾紙，繪製葡萄糖標準曲線，計算樣品的葡萄糖含量，在樣品葡萄糖含量為2mg/ml處找出對應的酶濃度，用0.37/酶濃度即為此纖維素酶的活力。
[0045]本發明選擇三株纖維素酶高產菌株進行融合，得到纖維素酶高產菌株李氏木黴JL16 (Trichoderma reesei JL16),從而提高纖維素酶系的整體活力，產纖維素酶的能力比出發菌株提高了 25%，可以用於工業生產。另外，本發明針對李氏木黴提出的原生質體製備、分離、融合、再生及其篩選方法具有很強的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0046]圖1為原生質體分離裝置。提供的原生質體分離裝置附圖，幫助相關人員實施本發明。
【具體實施方式】
[0047]實施例1:優選條件下的李氏木黴的原生質體製備和融合
[0048]1.製備三親本的李氏木黴孢子懸液
[0049]李氏木黴菌QM9414和李氏木黴菌MCG77購買於ATCC(American Type CultureCollect1n),李氏木黴菌 RutC-30 購買於 CGMCC(China General Microb1logicalCulture Collect1n Center)。分別挑取甘油凍存管中的三株李氏木黴菌株QM9414、MCG77、RutC-30—環，接種在含有50ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基製成的固體斜面上，在溫度28°C、培養72h，得到含有成熟李氏木黴孢子的菌絲，加入2ml無菌蒸餾水，用vortex振蕩2min，得到含有孢子的孢子液，將該孢子液進行梯度稀釋，並在顯微鏡下計數，使得成熟的李氏木黴孢子濃度在IXlOfVml的李氏木黴孢子懸液；
[0050]所述PDA培養基由下列重量配比的物質組成:土豆:200g/L (煮沸30min並過濾)；匍萄糖:20g/L ;瓊月旨:20g/L。
[0051]2.製備三親本的菌絲懸液
[0052]分別將三株Iml的李氏木黴孢子懸液接種至20ml種子培養基中，控制搖床轉速為200rpm，溫度28°C培養72h，用8層紗布過濾掉培養基，得到含有抱團菌絲體的李氏木黴。
[0053]將菌絲體導入50ml的離心管中，用pH6.5的檸檬酸緩衝液定容至15ml，5000轉4°C離心10min，棄掉上清後重新補加檸檬酸緩衝液至15ml，重複3次，最後，後將菌絲體在緩衝液中混勻。
[0054]3.去壁酶的製作
[0055]取三支5ml的EP管,分別加入144mg的溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶,並分別加入3ml的pH6.5檸檬酸緩衝液,充分溶解。
[0056]用孔徑為0.2 μ m的濾膜分別過濾三種酶液，得到約1.5ml左右的三種酶液，各取Iml混合到一起，最終得到3ml的混合酶液，含量為溶壁酶4mg/ml、蝸牛酶4mg/ml、纖維素酶 4mg/ml。
[0057]4.酶解細胞壁
[0058]三株菌各取3ml的菌絲懸液，並分別加入1ml的混合酶液，溫度35°C輕微振蕩酶解3個小時,每半個小時一鏡檢觀察,最終液體的酶液濃度為溶壁酶4mg/ml、蝸牛酶4mg/ml、纖維素酶4mg/ml。
[0059]5.原生質體的分離及融合
[0060]酶解去壁後，取三支15ml的離心管，在距底部4cm處塞滿脫脂棉，厚度約為1cm，底部插入Iml槍頭，構成原生質體分離裝置。用pH6.5的檸檬酸緩衝液浸溼分離裝置中的脫脂棉，在分離裝置頂部分別加入酶解後的三種菌液，100rpm離心10min，離心後，用鑷子取出脫脂棉，將分離裝置底部液體分裝至Iml離心管中，4000rpm離心15min，去掉上清後底部殘留的白色沉澱即為原生質體，立刻加入400 μ I融合劑將3種菌株的白色沉澱一起吹溶，最終室溫靜置30min，並鏡檢觀察。
[0061]所述的融合劑由下列重量配比的物質組成:50% PEG4000 ；0.01M CaCl2 ；0.6M山梨醇。
[0062]實施例2:優選條件下的纖維素酶高產菌株的篩選方法
[0063]1.原生質體的再生
[0064]將融合完的原生質體懸液用濃度0.6mol/L的NaCl溶液梯度稀釋100倍，取0.1ml稀釋液塗在原生質體再生培養基上，28°C見光培養96h，保持相對溼度大於60%，直到長出透明圈為止。
[0065]所述的再生培養基由下列重量配比的物質組成::KH2PO4: 3g/L ；NaNO3:2.6g/L ；尿素:0.5g/L ；FeS04.7H20:7.5mg/L ；MnSO4.H20:2.5mg/L ；ZnSO4.7H20: 3.6mg/L ；CoCl2 *6H20:3.7mg/L ；MgS04 *7H20:0.5g/L ；CaCl2:0.5g/L ;脫氧膽酸鈉:2g/L ;蛋白腖:10g/L ；NaCl:35g/L ;瓊脂:16g/L ;球磨纖維素20g/L (球磨纖維素事先用10g直徑3mm左右的玻璃珠200rpm振蕩處理48h)。
[0066]2.高產纖維素酶李氏木黴菌株的篩選方法
[0067]挑取透明圈直徑/菌落直徑大的6株菌落一環至Iml去離子水中，在顯微鏡下計數，適量稀釋至菌濃度為lX106/ml，取Iml加入發酵液中，200rpm轉28°C培養144h，後取Iml的發酵液，8000rpm離心1min取上清,測定酶活,發現JL16號菌株的酶活明顯高於三株原始菌株高，纖維素酶酶活提高25%，即JL16號菌株為突變株。
[0068]每一個250ml的錐形瓶中含有10ml的發酵液，所述的發酵液由下列重量配比的物質組成:蛋白腖:3g/L ;酵母提取物:0.5g/L ；KH2P04:3g/L ； (NH4) 2S04:2g/L ;尿素:0.3g/L ；MgS04:0.3g/L ；CaC03:5g/L ;氣爆秸杆:30g/L ;調節 pH 至 5.5。
[0069]實施例3:李氏木黴的原生質體製備和融合、纖維素酶高產菌株的篩選方法
[0070]在優選條件的基礎上，在
【發明內容】
公開的製備條件範圍內，均可以實施本發明，得到李氏木黴幾16的菌株。
[0071]實施例4:由實施例1、2製得的李氏木黴JL16菌株與三株原始菌株的β -葡萄糖苷酶酶活及蛋白產量比較
[0072]1.發酵液樣品的提取
[0073]分別挑取斜面生長的高產菌株JL16和三株原始菌株一環至Iml去離子水中，在顯微鏡下計數，適量稀釋至菌濃度為lX106/ml，取Iml加入發酵液中，200rpm轉28°C培養144h,後取適量的發酵液，8000rpm離心1min取上清，上清於_20°C冰箱內保存。
[0074]每一個250ml的錐形瓶中含有10ml的發酵液，所述的發酵液由下列重量配比的物質組成:蛋白腖:3g/L ;酵母提取物:0.5g/L ；KH2PO4:3g/L ； (NH4) 2SO4:2g/L ;尿素:0.3g/L ；MgS04:0.3g/L ；CaC03:5g/L ;氣爆秸杆:30g/L ;調節 pH 至 5.5.
[0075]2.β-葡萄糖苷酶及蛋白的測定方法
[0076]①.β -葡萄糖苷酶酶活的測定:用50mM檸檬酸緩衝液pH4.8適當稀釋酶液，取Iml酶液+Iml 15mmol/L纖維二糖,50°C反應30min,再沸水浴5min,迅速冷卻,用葡萄糖試劑盒測其葡萄糖含量。通過測定，JL16菌株的β -葡萄糖苷酶酶活提高15%。
[0077]②.蛋白含量的測定:配製考馬斯亮藍G-250試劑及lmg/ml的BSA溶液，並配製BSA濃度為O~lmg/ml的BSA標準溶液若干，分別取BSA標準溶液和適當稀釋的酶液0.1ml於15ml試管中，加入5ml考馬斯亮藍G-250試劑充分混勻，5分鐘後測0D595。通過測定，JL16菌株的蛋白產量提高12%。
【權利要求】
1.一種李氏木黴菌株，其特徵在於，是於2014年I月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8807的菌株，菌株的名稱為李氏木黴幾16。
2.如權利要求1所述的李氏木黴菌株，其特徵在於，所述的李氏木黴菌株幾6，採用三株纖維素酶高產菌株通過原生質體製備、原生質體分離、原生質體融合、原生質體再生和篩選的製備步驟構建；所述的三株纖維素酶高產菌株，是李氏木黴菌QM9414、李氏木黴菌MCG77和李氏木黴菌RutC-30。
3.一種權利要求1的李氏木黴菌株的製備方法，有原生質體的製備、原生質體的融合、原生質體的再生和篩選的過程； 所述的原生質體的製備，是將李氏木黴菌QM9414、李氏木黴菌MCG77和李氏木黴菌RutC-30分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，得到含有成熟李氏木黴孢子的菌絲；將三株李氏木黴孢子懸液接種至種子培養基中，得到含有抱團菌絲體的李氏木黴；將菌絲體用PH6.5的檸檬酸緩衝液定容，離心，棄上清後重新補加檸檬酸緩衝液並混勻；再分別加入到去壁混合酶液中酶解細胞壁，得到含原生質體的溶液；最後經分離得到白色沉澱的李氏木黴原生質體； 所述的原生質體的融合，用融合劑將三種白色沉澱原生質體一起吹溶，室溫靜置10~60min ;所述的融合劑，由按下列重量配比的物質組成:20%~80%聚乙二醇、0.01~0.05MCaCl2和0.2~1.0M山梨醇； 所述的原生質體的再生，是將融合完的原生質體懸液用NaCl溶液梯度稀釋，取稀釋液塗在原生質體再生培養基上，28°C見光培養96h，保持相對溼度大於60%，直到長出透明圈；所述的再生培養基 ，由下列重量配比的物質組成:KH2P043~5g/L、NaN032.6~3.0g/L、尿素 0.5 ~1.0g/L,FeSO4.7Η207.5 ~10mg/L、MnS04.Η202.5 ~3.0mg/L,ZnSO4.7Η203.6 ~5.0mg/L、CoCl2.6Η203.7 ~5.0mg/L、MgSO4.7Η200.5 ~1.0g/L、CaCl20.5 ~1.0g/L、脫氧膽酸鈉2~5g/L、蛋白腖10~15g/L、NaC135~50g/L、瓊脂16~20g/L、球磨纖維素20g/L ； 所述的篩選，是挑取透明圈直徑/菌落直徑大的菌株一環至甘油中，得到李氏木黴JL16於-80°C下保存。
4.如權利要求3所述的李氏木黴菌株的製備方法，其特徵在於，在原生質體的製備中，所述的檸檬酸緩衝液，由下列重量配比的物質組成:每升中含有0.1M檸檬酸溶液70ml、0.1M 檸檬酸鈉溶液 930ml、NaCl0.6mol。
5.如權利要求3所述的李氏木黴菌株的製備方法，其特徵在於，在原生質體的製備中，所述的去壁混合酶液，由溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶，加入PH6.5檸檬酸緩衝液構成，各成分含量為溶壁酶2~8mg/ml、蝸牛酶2~8mg/ml、纖維素酶2~8mg/ml。
6.如權利要求3所述的李氏木黴菌株的製備方法，其特徵在於，在原生質體的製備中，所述的分離，使用的分離裝置是由一支5~50ml的離心管，在距底部I~1cm處塞滿脫脂棉，厚度約為I~5cm，底部插入槍頭，用檸檬酸緩衝液浸溼脫脂棉，在分離裝置頂部加入酶解後的菌液，1000~3000rpm離心8~lOmin，底部液體即為含有原生質體的穩滲液，取出分離裝置中的脫脂棉，將分離裝置底部液體分裝至I~1ml離心管中，3000~8000rpm離心12~15min，去掉上清後底部殘留的白色沉澱即為原生質體。
7.如權利要求3所述的李氏木黴菌株的製備方法，其特徵在於，在原生質體的再生中，所述的球磨 纖維素，是經直徑2~4mm的玻璃珠在200rpm下振蕩處理48小時得到的纖維素。
【文檔編號】C12N1/14GK104130946SQ201410208676
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年5月16日 優先權日:2014年5月16日
【發明者】任曉冬, 劉嘉婧, 崔雨瀟, 滕利榮, 孟慶繁, 逯家輝, 劉豔, 孟令軍, 程琪越, 張廣吉 申請人:吉林大學