骨橋蛋白在製備治療和/或預防神經疾病的藥物中的用途的製作方法

2023-04-25 02:35:11

專利名稱：骨橋蛋白在製備治療和/或預防神經疾病的藥物中的用途的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及神經疾病及神經失調領域。本發明與神經保護、神經髓鞘化及髓磷脂產生細胞的生成與再生有關。本發明特別涉及脫髓鞘和神經變性疾病、神經病、創傷性神經損傷、腦卒中以及先天性代謝失調而引起的神經疾病。本發明尤其涉及利用骨橋蛋白或其活性激動劑製備藥物用於治療和/或預防神經疾病。
背景技術：
神經髓鞘化是在中樞神經系統(CNS)和外周神經系統(PNS)的形成及行使功能過程中的一種基本過程。軸突周圍的髓鞘是電脈衝信號沿神經正確傳導所必須的。在許多疾病中都會出現髓磷脂的丟失，其中包括影響中樞神經系統的多發性硬化症(MS)，格-巴症候群(急性感染性多神經炎)，CIDP及其它疾病(見Abramsky和Ovadia，1997；Trojaborg，1998，Hartung等，1998)。雖然脫髓鞘疾病有各種原因，如感染性病原體或自身免疫性攻擊，但都可以引起神經功能受損，甚至可能導致癱瘓和死亡。儘管現有的治療藥物可以多發性硬化症中的炎性攻擊延緩疾病的進展，但是依然需要開發出新的治療措施以使髓鞘再生並且使神經功能恢復(Abramsky和Ovadia，1997，Pohlau等，1998)。
由急性刺激如創傷、缺氧和缺血引起的中樞神經系統損傷對神經元和白質都有影響。雖然多數注意力都集中在導致神經元死亡的過程上，但越來越多的證據表明使軸突髓鞘化的少突膠質細胞受損也是中樞神經系統損傷的特異組成部分。實驗證實大鼠腦卒中(3小時)後很快就會出現少突膠質細胞的病理學改變，說明這些細胞比神經元細胞更容易受興奮毒性的損害(Pantoni等，1996)。另外一個介導細胞死亡的潛在候選者是谷胺醯胺濃度的顯著升高，一般都伴隨有急性中樞神經損傷(Lipton等，1994)。事實上，神經元周圍的少突膠質細胞也表達功能性的谷胺醯胺受體，這些受體屬於α-氨基羥甲基惡唑丙酸/紅藻氨酸鹽亞型。而且少突膠質細胞也表現出對谷胺醯胺的高度敏感性(McDonald等，1998)。
創傷是指神經的損傷或損壞。可以是脊索創傷，即對脊索的損傷而影響損傷水平或以下的所有神經系統功能，包括肌肉控制和感覺，或腦創傷，如閉合腦損傷引起的創傷。
腦缺氧這個術語是特指大腦半球缺氧，更典型的用法是指整個腦缺氧。根據缺氧嚴重程度的不同，症狀可以包括從思維混亂到不可逆的腦損傷、昏迷及死亡。
腦卒中通常是由腦缺血引起的。可以被稱為腦血管病或腦血管事故。這是一組腦障礙，包括腦的任何一部分血液供應中斷而導致的腦功能喪失。腦大約需要整個身體血液循環供應的20％。對腦的血液供應主要通過頸部的兩條動脈(頸動脈)，其在腦內分支成多條動脈，分別供應腦的不同區域。即使一個短暫的血流中斷也可以引起腦功能的下降(神經缺損)。所影響的腦區域不同出現的症狀也不同，通常出現的問題包括視覺的改變，語言能力的改變，身體某一部分的運動功能或感覺功能降低，或者意識水平的改變。如果血流降低的時間超過數秒，該區域的腦細胞就會收到損傷(血管梗塞)，從而引起該區域的永久性改變甚至死亡。
每千人內大約有4人會出現腦卒中。在大多數發達國家包括美國中是第三位的死亡原因。隨著年齡的增加，腦卒中發生的機率迅速增加，35歲後每10年發生的機率增加一倍。65歲以上的人中大約有5％的至少會出現一次腦卒中。男性發生的機率通常大於女性。
如上面所提到的，腦卒中包括腦的某些區域血液循環丟失而導致的腦功能喪失(神經缺損)。損傷的位置、程度及引發障礙的原因不同所導致的神經缺損也不同。腦卒中發生的原因可以是血流減少(缺血)而導致的血液供應不足從而引發該區域腦組織的死亡(梗死)。缺血性腦卒中可以是由在腦內形成的血凝塊引起的，也可以是由在其它位置形成的血凝塊、動脈粥樣硬化斑塊或其它物質到達腦部而引起的。腦內出血(腦出血)所引起的症狀與腦卒中相似。
最常見的腦卒中是由動脈粥樣硬化(腦血栓形成)引起的腦卒中。動脈粥樣硬化(動脈的硬化)是指這樣一種病理狀態，其中在動脈的內壁形成脂肪沉澱，並且逐漸形成動脈粥樣硬化斑塊(由脂肪沉澱和血小板組成的塊狀物)。動脈阻塞的形成是非常緩慢的。動脈粥樣硬化不一定就會導致腦卒中。在各個腦動脈之間有許多小的動脈相連。如果血流逐漸減弱，這些小的連接動脈就會逐漸增大從而繞過阻塞區域(側循環)。如果有足夠的側循環，即使出現一個完全阻塞的動脈也不會引起神經缺損。腦內的第二中安全保障機制是動脈都足夠大，即使75％的血管閉塞也可以保證腦內的相應區域有足夠的血流供應。
血栓性腦卒中(由血栓引起的腦卒中)在老年人中是最常見的，這些老年人通常都有動脈粥樣硬化性心臟病或糖尿病。這類腦卒中在任何時候都有可能發生，包括在休息時。發生腦卒中的人可能喪失意識，也可能不喪失。
由栓塞引起的腦卒中(流動性血凝塊)是最常見的，通常由心源性栓塞、由於心臟功能障礙而形成血凝塊然後會到達腦部而引起。栓塞也可能起源於其它部位，特別是那些具有動脈粥樣硬化斑塊的區域。血栓隨血流運動，在腦內的小動脈中變成棒狀。這種腦卒中會突然發生，並且會立刻引起最嚴重的神經缺損。這種腦卒中與運動是否劇烈沒有關係，在任何時間內都可能發生。與這種障礙相伴隨的常常是心率失常，並且是血栓產生的原因。對腦造成的損傷常比由腦血栓形成導致的腦卒中嚴重的多。意識可能喪失，也可能不喪失。如果栓塞破裂造成血管損傷而出血(出血性腦卒中)則後果可能更嚴重。
周圍神經病是一種症候群，包括感覺喪失、肌無力和肌萎縮、深度腱反射減弱、血管舒張症狀的一種或幾種症狀的綜合。
這種疾病可以影響單個神經(單一精神病變)，兩個或多個分離區域的神經(多發性單一精神病變)，或者同時影響多個神經(多神經病)。最初主要是軸突受影響(如糖尿病，萊姆病，或尿毒症或毒性藥物引起的疾病)，或者是髓鞘或施萬細胞(如急性或慢性感染性多神經病，腦白質營養不良，或格-巴症候群)。對小的無髓或有髓神經纖維造成的損傷主要是導致溫度及疼痛感覺喪失；對大的有髓神經纖維造成的損傷主要是會導致運動及本體感覺障礙。某些神經障礙(如由於鉛中毒，氨苯碸的應用，蜱叮咬，卟啉病或格-巴症候群)主要影響運動纖維；其它的神經障礙(如由於腫瘤引起的背根神經節炎，麻風病，AIDS，糖尿病，或慢性吡哆醇中毒)主要影響背根神經節或感覺纖維，產生感覺症狀。有時候顱側神經也可能收到影響(如格-巴症候群，萊姆病，糖尿病，以及白喉)。確定那些神經受影響有助於判斷病因。
創傷是導致單個神經纖維收到局部損傷的最常見原因。劇烈的肌肉運動或關節的強迫過度伸張可能會造成局部神經病，重複的小創傷也可能造成局部神經病(如緊握小的工具，來自汽錘的過度振蕩)。壓力或內陷麻痺通常影響骨隆突(如在深度睡眠時，瘦弱或惡病質病人感覺缺失時，以及酒醉時)或狹窄管道(如腕管症候群)處的淺表神經(尺骨的，橈骨的，腓側的)。壓力造成的麻痺也可能是由於腫瘤、骨肥厚、拄拐杖、或長時間保持非正常姿勢(如在維護庭園時)而引起的。血液流出後進入神經以及暴露於寒冷或輻射中也可能引發神經疾病。單一精神病變也可能是由於腫瘤的直接侵潤造成的。
多發性單一精神病變通常是由膠原性血管病(如結節性多發性動脈炎，系統性紅斑狼瘡，斯耶格倫症候群(口眼乾燥、關節炎症候群)、結節病、代謝性疾病(如糖尿病，澱粉樣變性)、或感染性疾病(如萊姆病，HIV感染)引發的。微生物如果直接侵入神經(如麻風病)也可以引起多發性單一精神病變。
由急性發熱病引起的多神經病通常都是由毒素(如白喉)或自身免疫反應(如格-巴症候群)造成的；有時伴隨免疫接種而出現的多神經病可能也是自身免疫疾病。
毒性藥物通常造成的是多神經病，但有時也會引發單一精神病變。這些藥物包括吐根鹼、環幾巴比妥、巴比妥、三氯叔丁醇、磺胺類藥物、苯妥英、硝基呋喃妥英、長春花生物鹼、重金屬、一氧化碳、三鄰羥甲苯基磷酸、正二硝基苯酚、多種溶劑、其它工業毒物、以及某些抗AIDS藥物(如扎西他賓，二脫氧肌苷)。
營養缺乏和代謝障礙也可能引發多神經病。維生素B缺乏就是一種常見的原因(如酒精中毒，腳氣病，惡性貧血，異煙肼誘導的吡哆醇缺乏，吸收不良症候群，以及孕期嘔吐)。多神經病也可能發生於甲狀腺功能減退症、卟啉病、結節病、澱粉樣變性以及尿毒症時。糖尿病也可以引起感覺運動遠端多神經病(最常見)、多發性單一精神病變、以及局部單一精神病變(如動眼神經或外展腦神經所發生的局部單一精神病變)。
惡性腫瘤也可以引發多神經病，主要是通過單株性丙球蛋白病(多發性骨髓瘤，淋巴瘤)，澱粉樣侵潤，或營養缺乏，或者腫瘤相關病症而引發。
特異性單一精神病變單發的和多發的單一精神病變的特徵是疼痛、虛弱、以及受影響神經分布區域內的感覺異常。多發性單一精神病變是不對稱分布的；受影響的神經可以是起始就是全部，也可以是逐漸增多的。如果許多神經都收到影響可能會引發多神經病。
尺骨神經麻痺通常是由肘部尺骨溝內的神經創傷引起的，持續重複依靠肘部或兒童時期骨折後骨不對稱生長(慢尺骨麻痺)都可以造成肘部尺骨溝內的神經創傷。尺骨神經在肘管處也容易受到擠壓。第五手指或第四手指中間半截會出現感覺異常和感覺缺陷；拇指內收肌、第五手指外展肌以及骨間肌肉變弱和萎縮。嚴重的慢性尺骨麻痺會導致爪形手畸形。神經傳導檢查可以確定損傷的位置。在進行外科手術修復前應保守治療。
腕管症候群是由於正中神經受壓迫引起的，該神經位於橫向淺表腕韌帶和屈伸手掌的前臂肌肉的縱向肌腱之間的腕關節掌側。可以是單側或雙側。該神經受壓迫會導致手掌的橈骨掌側感覺異常以及腕和手掌的疼痛；有時疼痛發生在靠近前臂和肩部的受壓迫位置。疼痛可能在夜間更劇烈。然後前三個手指的掌側可能會出現感覺缺陷；控制拇指外展和內屈的肌肉可能變弱和萎縮。這種症候群應該和頸神經根病導致的C-6神經根受壓區別開來。
腓神經麻痺通常是由於靠腓骨頸側面的神經受壓迫而引起的。這種情況常見於瘦弱的長期臥床的病人或習慣性交叉雙腿的瘦人。足的背屈及外翻能力減弱(足下垂)。偶爾會有小腿和足背的前面偏一側及第一和第二蹠之間的空隙出現感覺缺失。壓迫性神經病的治療一般是保守的(如避免腿部交叉)。通常隨後出現不完全臨床神經病，但一般都會自然消失。如果難以恢復可以考慮進行手術探察。
橈神經麻痺(周末晚麻痺)是由於壓迫背靠肱骨的神經造成的，例如中毒或深度睡眠時將手臂靠在椅子背上。症狀包括腕和手指的伸肌無力(腕下垂)，偶爾會有第一背骨間肌肉的背側感覺消失。治療方法與壓迫性腓側神經障礙一樣。
多神經病一般是相對對稱的，通常同時影響感覺、運動和血管舒張神經纖維。可能影響軸突柱或髓鞘，或者同時受影響，可能是急性的(如格-巴症候群)，也可能是慢性的(如腎衰竭)。
由代謝障礙(如糖尿病)或身衰竭造成的多神經病進展緩慢，一般要經過數月或數年。通常首先出現下肢的感覺異常，一般來說遠端比近端嚴重。外周麻刺感、麻木、燒灼感、關節本體感覺及震動感消失是比較突出的。夜間一般疼痛比較嚴重，碰到受影響區域或溫度改變會導致症狀加重。嚴重的病人出現感覺喪失的信號，呈典型的長襪-手套(stocking-and-glove)分布。跟腱反射和其它深度腱反射減弱或消失。如果感覺缺失加重會導致指(蹠)無痛潰瘍或夏氏關節(Charcot’s joint)。感覺或本體感覺缺失會造成步態異常。運動神經受影響則會造成遠端肌無力和萎縮。自主神經系統也可能被包括在內，導致夜間腹瀉、大小便失禁、陽痿或體位性低血壓。血管舒張症狀有多種多樣。皮膚變得蒼白乾燥，有時甚至灰暗；極易出汗。嚴重的慢性病人常會出現與營養有關的症狀(光滑而有光澤的皮膚，痘痕或脊狀指甲，骨質疏鬆)。
營養性多神經病通常出現於酒精中毒和營養不良的人中。最初的軸突病變會導致長大神經纖維脫髓鞘和軸突損壞。原因是缺乏維生素B1或其它維生素(如維生素B6，泛酸，葉酸)還不清楚。維生素B6缺乏導致的神經病常常只發生在使用異煙肼治療結核的病人身上；缺乏或依賴維生素B6的嬰幼兒可能會出現驚厥。遠端肢體殘疾或對稱性無力通常是隱襲的並且快速發展，有時會伴隨感覺喪失、感覺異常和疼痛。觸碰時腓及足的疼痛、痙攣、冷感、燒灼感以及麻木等感覺會加重。當病因不清時可以給予多種維生素，但其是否有效還未被證實。
很少的情況下，感覺神經多神經病從外周疼痛和感覺異常開始，從中央到所有形式的感覺喪失。其發生與癌症的遠期效應類似(特別是支氣管的)，症狀一般出現在過量攝入維生素B6(＞0.5克/天)，以及在澱粉樣變性、甲狀腺功能低下、骨髓瘤和尿毒症中。在停止攝入維生素B6時也可能出現維生素B6誘導的神經病。
遺傳性神經病分為感覺運動神經病和感覺神經病。夏-馬-圖病(進行性神經性肌萎縮)是最常見的遺傳性感覺運動神經病。很少見感覺運動神經病起始於出生時期並導致嚴重的殘疾。感覺神經病是很少見的，遠端疼痛及溫度感覺喪失出現的機率要大于震動和位置感覺喪失的機率。主要的問題是由於對疼痛不敏感而造成的足部殘疾，並且常常發生感染和骨髓炎。
遺傳性運動和感覺神經病I型和II型(夏-馬-圖病，腓側肌肉萎縮)相對較常見，通常是常染色體顯性遺傳病，其症狀是肌無力和萎縮，主要影響腓側的和下肢肌肉。病人還可能患有其它退化性疾病(如弗氏共濟失調(Friedreich’s ataxia))或具有家族史。I型病人一般出現在兒童中期，有足下垂，並且伴有緩慢的進行性遠端肌肉萎縮，導致「䴉形腿」。稍後會出現手部的內在肌肉萎縮。出現長襪-手套(stocking-glove)模式的震動、疼痛及溫度感覺減弱。深度腱反射缺失。高足弓或錘狀趾可能只是患有該病的家族成員受影響輕微的標誌。神經傳導速度緩慢，遠端潛伏期延長。出現節段性的脫髓鞘和髓鞘再生。增大的外周神經可以通過觸診查到。病程進展緩慢緩慢並且不影響壽命。II型神經病進展更緩慢，在其生命晚期通常會出現肌無力。病人具有相對正常的神經傳導速度，但其激發勢能的振幅較低。活組織檢查發現有wallerian變性。
遺傳性運動和感覺神經病III型(肥大性間質性神經病，代-索病(進行性肥大性間質性神經病))是一種少見的常染色體隱性遺傳病，從兒童期開始出現進行性肌無力、感覺喪失及深度腱反射缺乏。開始時類似於夏-馬-圖病，但其運動功能減弱速度很快。發生脫髓鞘和髓鞘再生現象，導致外周神經膨大，神經活組織檢查可見洋蔥泡。
根據運動性肌無力的特徵性分布、足畸形、家族史及電生理異常可確診此病。可以通過基因分析，但無特異的治療措施。年輕病人通過專業諮詢以了解病程進展情況可能會有幫助。安裝矯形支架有助於矯正足下垂；通過矯形外科手術以穩定足部也可能有幫助。
神經變性疾病包括阿爾茨海默病，帕金森病，亨庭頓舞蹈病和肌萎縮性側索硬化症(ALS)。
阿爾茨海默病是一種由腦組織改變而引起的心裡功能衰退障礙。其中包括非血管病變引起的腦組織萎縮、初級變性性痴呆及彌散性腦萎縮。阿爾茨海默病也叫老年痴呆/阿爾茨海默型(SDAT)。是老年人智力下降的最常見原因。每10000人中大約有9人會有此病。這種疾病對女性的影響比男性稍弱並且主要發生在老年人身上。
引起該病的原因還部清楚。造成此疾病的神經化學因素包括神經細胞傳輸神經衝動的物質(神經遞質)的缺乏，如乙醯膽鹼、生長抑素、P物質及去甲腎上腺素。環境因素包括與鋁、錳及其它物質接觸。感染性因素包括影響腦和脊索(中樞神經系統)的朊病毒(病毒樣微生物)感染。在某些家族中(代表5-10％的病例)具有遺傳性的易感性而發生這種疾病，但並不符合遺傳法則(孟德爾定律)。通常是排除痴呆的其它原因才能診斷為這種疾病。
研究人員發現在一個多位成員患有阿爾茨海默病的家族中出現一種特異的基因變異，該變異幾乎發生在所有患此疾病的成員身上。這個基因編碼一種叫載脂蛋白E4的物質，但並不是說這個基因是引起此病的原因，只是它的存在可以增加最終患此病的機率。因為有許多具有E4基因的人並沒有受阿爾茨海默病的折磨。
患者最初的特徵是記憶損害，伴有進行性智力減退。隨著疾病的進展會出現情緒改變、語言能力改變、步態的改變及其它變化。還會出現腦組織變小(腦萎縮)、腦室(腦內腔隙)擴大、以及腦組織內出現沉澱物。
帕金森病是一種腦病，其特徵是搖擺及行走、運動和協調困難。該病與控制肌肉運動的腦組織受損有關。也叫震顫麻痺或震顫性麻痺。
每1000人中大約有2人受此病影響，大多數在50歲以後患病。對男性和女性都有影響，是老年人最常見的一種神經障礙。術語「帕金森氏症候群」是指具有帕金森氏病所表現出的運動變化類型群的任何狀態，帕金森氏病恰好是引起這群症狀的最常見疾病。帕金森氏症候群也可由其它疾病或外部因素引起(繼發性帕金森氏症候群)。
帕金森氏病是由於腦控制肌肉運動部分(基底核和錐體束外區域)的神經細胞進行性退變引起的。多巴胺是細胞用來傳導脈衝信號的一種物質(神經遞質)，通常在此區域產生。該區域的退變會減少體內多巴胺的含量。
多巴胺含量的不足會破壞多巴胺與其它神經遞質如乙醯膽鹼之間的平衡。沒有多巴胺神經細胞無法正確傳遞信號，這會導致肌肉功能的喪失。腦細胞退變的準確原因還不清楚。這種疾病會影響一側或雙側身體，其功能喪失的程度千變萬化。
除了肌肉控制功能喪失外，有些帕金森氏病病人還可能變得嚴重抑鬱。儘管早期精神異常還不常見，但嚴重的帕金森氏病病人可能會表現出全面的精神頹廢(包括痴呆、幻覺等等)。痴呆也可能是某些治療藥物的副作用。
亨庭頓舞蹈病是一種遺傳性常染色體顯性神經疾病。這種疾病不常見，發生的機率大約為萬分之一(Breighton和Hayden，1981)。該疾病在50歲以前通常不會出現臨床症狀，主要表現為精神紊亂、不隨意運動障礙及認知能力下降知道死亡。典型的病程是從開始發病到死亡約為17年。
與亨庭頓舞蹈病相關的基因叫亨庭頓基因(huntingtin)。它位於4號染色體的長臂，是潛伏期診斷及產前診斷的有效方式。基因異常是一種大量的隨機CAG重複核苷酸序列。
亨庭頓舞蹈病病人染色體上CAG重複序列長度的增加與開始出現臨床症狀的年齡高度相關。這種相關程度在那些在青少年時期就開始出現亨庭頓舞蹈病症狀的病人身體表現的尤其突出，其重複序列的數目通常超過50個。亨庭頓舞蹈病家族成員的CAG重複序列數目也表現出某些程度的不穩定，尤其是當孩子從其父親那裡遺傳到亨庭頓基因時特別明顯。
還不清楚亨庭頓舞蹈病病人中這個廣泛表達的基因是如何選擇性地導致神經元死亡的。而且序列分析也沒有發現該基因與其它已知基因具有明顯的同源性，還沒有鑑別出結構基序和功能域來研究其功能。特別是這個廣泛表達的基因是如何選擇性地導致神經元死亡的問題還沒有答案。
肌萎縮性側索硬化症是一種由神經對隨意運動肌肉的控制進行性喪失所引起的，其主要原因是腦和脊索的神經細胞受到破壞。肌萎縮性側索硬化症也叫LouGehrig病，是一種包括使用及控制肌肉功能喪失的疾病。這些神經控制的肌肉萎縮或消失，結果肌肉組織由於缺乏神經刺激而消失。肌肉強度和協調能力下降，開始是隨意肌肉(那些受意識控制的肌肉，如臂和腿上的肌肉)。肌肉控制喪失的範圍持續擴大，越來越多的肌肉群受到影響。刺激半隨意肌肉的神經也可能受影響，如那些控制呼吸和吞咽的肌肉。但對其思維和推理能力沒有影響，其原因還不清楚。
ALS發病的機率大約為十萬分之一。某些病例具有家族性。這種疾病發生的機率男性大於女性。成年時期一般不發病，通常是在50歲以後。
創傷性神經損傷可能涉及中樞神經系統，也可能涉及外周神經系統。創傷性腦損傷(TBI)也被簡單地稱為頭損傷或閉合性頭損傷(CHI)，是指由於外力擊打頭部造成腦受損的損傷。最常見的是汽車或自行車事故，但也可能是近乎溺死、心急梗死、腦卒中及感染的結果。這類創傷性腦損傷通常都是由於缺氧或腦供血不足引起的，因此也被稱為「缺氧損傷」。
腦損傷或閉合頭損傷是在頭部受到打擊的情況下發生的，比如機動車車禍或從高空墜下。在這種情況下，頭顱撞擊到靜止的物體上，頭顱內的腦沿樞椎(腦幹)轉動扭曲，造成局部或廣泛損傷。由於腦組織是由使其漂浮的液體包圍著的一大團軟組織，因此在撞到物體上後可能會反彈從而使損傷加重。
在受到創傷後可能會立即出現一段意識喪失期，可能持續數分鐘、數周或數月。由於扭曲和反彈，病人的受創傷腦組織通常會受到損壞或挫傷腦的大部分組織。這就是所謂的腦瀰漫性損傷，或「非槍彈傷」。這類非槍彈類腦損傷可以分類為初級或次級。
初級腦損傷發生在損傷時，主要是位於受撞擊位點，特別是在有顱骨破裂時。大的挫傷一般有大腦內出血或皮質撕裂傷。彌散性軸索損傷是由於顱內腦旋轉造成神經束斷裂或拉伸而形成的。軸突也會有小的出血性損傷或瀰漫性損傷，但只有在顯微鏡下才能觀察到。
次級腦損傷是損傷瞬間過後併發症的結果。其中包括腦內出血、對大腦外動脈的創傷性損壞、顱內疝出、缺氧性腦損傷、或者腦膜炎。
開放性頭損傷在檢查頭部時可以看到，可能是槍傷、事故、或物體穿過顱骨到達腦組織(腦槍彈傷)。這類頭損傷比較容易傷及腦的特定區域。
所謂的輕微腦損傷可能不會有意識的喪失，只是持續一小段時間的茫然感覺或混亂狀態。雖然所能採取的醫療措施很少，但未昏迷的腦損傷病人可能也會有一些與昏迷創傷存活者相似的症狀及缺陷。
對於創傷來說需要檢測腦的變化以防止進一步的損傷。嚴重頭損傷後腦通常會變大。這就是所謂的腦腫脹，是由於腦內的血量增加引起的。病程的後期腦內可能會出現積水，被稱為腦水腫。腦腫脹和腦積水都會導致顱內壓升高，被稱為顱內壓(ICP)。
脊索損傷佔到因截癱和四肢麻痺而住院病人的大多數。超過80％的是因為車禍。損傷可在臨床上分為兩組開放性損傷及閉合性損傷。
開放性損傷直接損壞脊索和神經根。貫穿傷可能導致廣泛的斷裂和出血。閉合性損傷佔脊索損傷的大多數，並且通常與脊柱的骨折脫位有關，一般通過放射檢查就可以證實。對脊髓的損傷依賴於骨損傷的程度，可以分為兩個階段初級損傷是挫傷，神經纖維橫切和出血壞死；次級損傷是硬膜外腫瘤(extradural heamatoma)、梗死、感染和水腫。
脊索損傷的晚期效應包括受損神經纖維的上行和下行順向變性、創傷後脊髓空洞症以及截癱的全身效應，如尿道及胸腔感染、褥瘡和肌肉萎縮。
神經障礙還可以由先天性的代謝疾病引起。髓鞘包裹這許多神經纖維，是由生命早期形成的脂蛋白層組成的。中樞神經系統中的少突膠質細胞形成的髓磷脂在化學及免疫學意義上與外周神經系統中施萬細胞形成的髓磷脂是不同的，但其功能是相同的促進神經脈衝沿軸突傳遞。
許多先天性代謝病(如苯丙酮尿症和其它胺基酸尿症；泰-薩病，尼-皮病(類脂組織細胞增多症)和高歇病；胡爾勒症候群；克拉伯病和其它腦白質營養不良)都可以影響髓磷脂的發育，主要是位於中樞神經系統。除非其生化缺陷得到矯正或補償，否則就會造成永久性的並且常常是廣泛的神經缺陷。
例如，克拉伯病或球狀體細胞白質營養不良是一種涉及外周及中樞神經系統白質的疾病。編碼溶酶體酶半乳糖腦苷脂酶(GALC)的基因突變，結果導致酶活性降低，其降解腦苷脂的能力下降，這些腦苷脂幾乎都存在於髓磷脂中。病人體內持續的髓鞘化和/或髓鞘再生需要具有功能的內源性少突膠質細胞，或者將正常少突膠質細胞或能分化成少突膠質細胞的幹細胞植入以提供足量的GALC表達(Wenger等，2000)。
神經纖維瘤病1(NF1)是一種常見的染色體異常疾病，具有多種神經學上的臨床症狀。
多系統萎縮是一種偶發的成年開始發病的神經變性疾病，其病因還不清楚。少突膠質細胞在病理遺傳學過程中所起的作用如果說不是唯一的也是極其突出的，這一特徵在神經變性疾病中是很獨特的。其與帕金森病的主要區別在於多系統萎縮用L-多巴治療無效。
在生命晚期脫髓鞘是許多神經疾病的一個特徵；這可能是由於局部創傷、毒性藥物或代謝障礙損傷神經或髓磷脂造成的。也有證據表明精神分裂症也可能導致脫髓鞘。大面積的髓磷脂丟失通常會導致軸突和胞體退化，二者都是不可逆的。但是，在許多情況下髓鞘可以再生，因而神經功能得以迅速修復、再生乃至完全恢復。中樞神經系統(即脊索、腦或視神經)脫髓鞘在初級脫髓鞘病中是最常見的，但其病因還不清楚。了解最多的是MS。
急性播散性腦脊髓炎和感染後腦脊髓炎的特徵是血管周圍的中樞神經脫髓鞘，這種脫髓鞘可能會自然發生，但多數情況下是在病毒感染或病毒疫苗接種後(極少情況下是在細菌疫苗接種後)，說明是免疫學的因素在起作用。病毒疫苗接種後或患有格-巴症候群後出現的急性炎性周圍神經病具有相同脫髓鞘病症，因此推測也有免疫發病機理，但它只影響周圍神經。
異染性腦白質營養不良是另外一種脫髓鞘疾病。腦白質腎上腺萎縮症和腎上腺脊髓神經病是少見的性染色體連鎖隱性代謝疾病，其特徵是腎上腺功能障礙和廣泛的神經脫髓鞘。腦白質腎上腺萎縮症發生在年輕男性身上；腎上腺脊髓神經病發生在青少年時期。精神頹廢、痙攣及失明可能發生。腦白質腎上腺萎縮症常常是致命的。飲食療法及免疫調節療法正在研究中。
Leber遺傳性視神經萎縮及其相關的線粒體疾病的主要特徵是雙側中央視覺喪失，通常是影響二十歲左右的年輕人。Leber遺傳性視神經萎縮類似於MS所導致的視神經炎。通過母系遺傳的線粒體DNA上的突變已被鑑定出來。
HTLV相關的脊髓病是一種與人T淋巴病毒感染相關的慢性進行性脊索疾病，其特徵是雙腿強直性肌無力。
其它的神經疾病包括異常髓鞘化神經病，下面對其作一概述。
免疫性的急性多神經病、格-巴多神經病、慢性多神經病、慢性免疫脫髓鞘性多神經病(CIDP)、多病灶的CIDP、多病灶的運動神經病(MMN)、抗髓磷脂相關蛋白症候群、抗硫腦酯抗體症候群(含有血清M-蛋白)、抗神經節苷脂2(GM2)抗體症候群、POEMS症候群、多神經病器官巨大症(Polyneuropathy Organomegaly)、內分泌病或水腫、M蛋白、皮膚變化、神經束膜炎、IgM抗GD1b抗體症候群(偶發)。
毒素白喉，藥鼠李，六氯酚，氰酸鈉，碲。
藥物主要是脫髓鞘氯喹，FK506(免疫抑制劑)，哌克昔林，普魯卡因胺，齊美定；混和脫髓鞘及軸突胺碘酮，嗜酸細胞增多性即痛症候群，金，蘇拉明，紫杉醇。
遺傳性的碳水化合物缺乏性糖蛋白，白內障及面部畸形，科凱恩症候群(侏儒-視網膜萎縮-耳聾症候群)，先天性髓鞘化程度低，先天性肌營養不良分層蛋白缺乏，法伯病(脂肪肉芽腫病)，遺傳性運動感覺神經病和夏-馬-圖三氏症候群，顯性遺傳的IA，IB，III，HNPP，EGR2，熱敏性的，隱性遺傳的III(代-索病)；4A；4B；4B2；4C；4D(LOM)；4E；4F；HMSN-R；CNS，性染色體連鎖的IX，克拉伯病，馬-斯症候群(遺傳性共濟失調、白內障、侏儒及智力缺陷症候群)，異染性腦白質營養不良，尼-皮病，佩-梅病(家族性腦白質病)(PLP)，雷夫敘姆病(植烷酸貯積症)，朊病毒蛋白(PrP27-30)Glu200Lys突變，克-雅病(傳染性海綿樣腦病)，鼠模型朊病毒過表達，Salla病，SOX10，細胞粘合素-XA，周圍髓鞘不均勻包裹，Ehlers-Danlos表型。
代謝性的(不常見)糖尿病(由於並發CIDP)，甲狀腺功能低下，肝病。
線粒體性的MNGIE症候群，肌病及外眼肌麻痺，神經病，胃腸腦病，NARP症候群，共濟失調，視網膜炎，色素性視網膜炎(Pigmentosa)。
感染性的克-雅病，白喉，HIV相關性CIDP，麻風病麻風結節(Lepromatous)；混合型軸突脫髓鞘化；克隆化的施萬細胞，變異的克-雅病。
其它詳細內容可在下列網址中查到http//www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/nother/myelin.html多發性硬化症(MS)是一種中樞神經系統的炎症性脫髓鞘疾病，具有復發-緩和(relapsing-remitting)或進行性疾病過程。MS不僅僅是一種脫髓鞘疾病，其在外周神經系統中所對應的是慢性炎症性脫髓鞘多發性神經根性神經病(CIDP)。另外，還有急性單相病變，如外周神經系統的炎症性脫髓鞘多發性神經根性神經病也叫做格-巴症候群(GBS)，以及中樞神經系統的急性散播性腦脊髓炎(ADEM)。MS和GBS都是異質性症候群。對於MS來說，外源性攻擊加上遺傳因素就會導致疾病發生並最終達到該病的診斷標準。在這兩個疾病中，除了主要的脫髓鞘損傷外還都有軸突的損傷，最終導致永久性的神經缺損。
在上述脫髓鞘疾病中MS是最常見的一種。其特徵與自身免疫疾病相類似，其中免疫系統的白細胞攻擊中樞神經系統分白質。灰質也可能被攻擊。儘管MS發病的準確機制還不清楚，但致病因子可能包括遺傳因素，細菌及病毒感染。其典型的臨床表現(超過85％的病例)是發作/緩解相發生改變，相應的模式是神經障礙發作先持續數周，然後明顯緩解或完全恢復(Noseworthy，1999)，隨著得病時間的延長緩解期逐漸縮短。然後許多病人進入疾病後期，臨床表現為神經功能逐漸喪失，有部分恢復或者無法恢復。這被稱為次級進行性MS。只有一小部分MS病人(大約15％)從開始發病後逐漸而持續的出現神經功能下降(初級進行性MS)。從嚴格意義上來說到目前為止MS還沒有明確的治癒措施，因此MS常常是致命的。
MS的基本標誌是帶有神經膠質斑的脫髓鞘斑塊形成，見於腦和脊索的白質束。與脫髓鞘相聯繫的是神經脈衝傳導出現功能性的減弱或阻斷。MS病人也可能出現軸突橫斷和死亡(Bjartmar等，1999)。病理學研究表明受影響的主要限於視神經，腦室周圍白質，腦幹和脊索(Storch等，1998)這些中樞神經受損所產生效應包括急性症狀如復視、麻木和不穩定步態，還有一些慢性症狀如強直性下身輕癱和不能自制。
MS發病的分子機制好像是有遺傳及環境因素，包括病毒和細菌感染。這些因素促使T淋巴細胞和巨噬細胞穿過血腦屏障進入中樞神經組織。
脫髓鞘是由於活化的巨噬細胞和小膠質細胞攻擊髓磷脂造成的，Fas-Fas配基信號和補體或抗體介導的細胞毒作用對髓磷脂生成細胞的損害也是造成脫髓鞘的原因。因此對髓鞘的直接攻擊以及產生和維護髓磷脂的細胞減少都可以造成脫髓鞘。
遺傳和環境因素可以導致通過血腦屏障進入大腦的炎症細胞增多。這會使進入中樞神經組織的自身活化T淋巴細胞和巨噬細胞增多。T細胞分泌的細胞因子活化抗原提呈細胞(APCs)。在APC上MHC II類分子存在的情況下當自身活化T細胞遇到推斷的MS蛋白時，這些T細胞就被活化了，MS蛋白常常是髓鞘的蛋白組分。還有幾種次要機制參與對少突膠質細胞和髓磷脂造成損傷。補體或抗體介導的細胞毒作用在某些病人中可能是引起損傷的主要因素，而在另外一些病人中，Fas-Fas配基信號和CD4+T細胞釋放的前炎症因子如TNF-α可能會攻擊白質。活化的巨噬細胞通過其增強的吞噬作用以及因子分泌也發揮重要作用。這會造成廣泛的脫髓鞘從而導致神經脈衝沿中樞神經系統的軸突傳導的效率下降。但是一旦炎症反應消失隨後的修復機制可能會使髓鞘再生。MS病人再生的軸突在病理學上的表現為沿再生的軸突周圍出現一層薄的鞘。在脫髓鞘的軸突膜上常常可以看到插有附加的鈉離子通道以補償傳導效率的下降。少突膠質細胞的前體細胞可以促進MS損傷的髓鞘再生。
少突膠質細胞具有與髓鞘的生成及維護相關的多種功能。它可以絕緣、支持和傳導維護多種神經元的軸突。一個少突膠質細胞就可以使多達50不同的軸突髓鞘化。髓鞘化只限於某些大直徑的軸突；樹突及其它細胞的突起如星形膠質細胞依然是無髓鞘的。軸突好像具有控制少突膠質細胞數目的能力，因為大鼠視神經軸突橫斷模型中髓磷脂的再生及少突膠質細胞前體細胞的生成都受到抑制(Barres和Raff的綜述，1999)。在發育過程中軸突釋放的因子可以刺激少突膠質細胞的增殖和遷移。少突膠質細胞和軸突以這種方式在中樞神經系統內密切配合。
少突膠質細胞是中樞神經系統內神經細胞周圍的支持細胞，可以使軸突束髓鞘化從而促進神經脈衝的傳導。他們在軸突的存活以及發揮功能中發揮作用。如這個圖中所顯示的那樣，一種少突膠質細胞一般只使一種軸突髓鞘化。
在某些神經膠質細胞漿膜的某些特殊區域髓鞘是多層的，富含脂質而蛋白較少。它主要是通過組織電荷進入周圍組織來支持軸突和促進中樞神經系統內的電信號傳導。神經纖維結是沿軸突髓鞘的位點，在該位點出現跳躍性傳導。
在成年腦中，少突膠質細胞來自於腦和脊索亞腦室區的還未準確定義的前體細胞(Nait-Oumesmar等，1999)。這些前體細胞是可以增殖的，並且表達髓磷脂轉錄子和蛋白，首先出現在髓鞘化前數周的胚胎脊索的腹側區域(Hajihosseini等，1996)。髓鞘化的過程發生在出生後的腦中。在出生後發育過程中這些前體細胞遷移到已髓鞘化的神經元束中。
少突膠質細胞已一種已詳細定義的特定的方式由其前體細胞發育成熟(綜述見Rogister等，1999)。少突膠質細胞按照下列確定的途徑發育，其中每一階段由幾種細胞特異性的標記物來劃分內皮神經細胞粘附分子(E-NCAM)，波形蛋白，A2B5，POU轉錄因子Tst-1/Oct6/SCIP，原少突膠質母細胞抗原(POA)，半乳糖腦苷脂(GalC)，O1，O4，以及髓磷脂特異性擔保PLP、MBP和MOG。神經幹細胞生成雙極性的pre-CD3+細胞，後者再變成O2A前體細胞。這些細胞分化成少突膠質細胞或2型星形膠質細胞。在最終分化成少突膠質細胞前還要經過原少突膠質細胞和原半乳糖腦苷脂陽性細胞階段。在少突膠質細胞發育體系的最後階段其特徵是這些細胞不再增殖。成熟的少突膠質細胞表達細胞特異性標記物半乳糖腦苷脂和硫酸腦苷脂(SUL)，還表達髓磷脂特異性蛋白質。
因此少突膠質細胞是從處於有絲分裂狀態的遷移的前體細胞分化而來的。一旦這些細胞進入有絲分裂後階段，他們就會轉錄和表達編碼髓磷脂特異性蛋白的基因。包裹髓鞘的軸突是通過成熟的少突膠質細胞和軸突自身直接接觸而形成的。通過髓鞘壓緊中樞神經的軸突而完成髓鞘化，最後形成一種複合物形式的含大分子的液晶態髓鞘(Scherer，1997)。促進髓鞘化需要考慮髓鞘各個結構蛋白之間的精確化學計量關係，因為一個組分的增加和減少就可能導致整個髓鞘結構的改變。
維持脫髓鞘軸突修復功能的少突膠質細胞的不穩定會導致神經功能障礙的累積，形成MS。促進MS病人髓鞘再生可以避免軸突喪失從而限制由中樞神經軸突死亡而導致的功能障礙的進一步發展。
MS出現的脫髓鞘表型引起了對活動MS損傷性質的多方面研究。裸露的軸突及產生髓鞘的少突膠質細胞的缺乏說明正常的髓磷脂分解以及髓鞘再生過程的畸變。大約由40％的MS損傷表現出髓鞘再生障礙，特別是在疾病的早期(Prineas等，1993)。這為我們提供了一個現實的前景就是開發促進髓磷脂修復的治療措施可能能夠組織神經系統的永久性損傷。年輕的中樞神經損傷患者中成功的可能性特別高，因為這些患者在早期髓鞘再生現象確實存在。但是負責髓鞘化和髓鞘再生的少突膠質細胞處於極端的代謝壓力下，在這種壓力下即使再加上一些微小的刺激就可能導致不可逆損傷(Scolding和Lassmann，1996)。這就會使對活動MS損傷的任意修復的可能性下降，其中一些炎症及其它因素會阻礙髓鞘再生。因此促進活動MS損傷髓磷脂修復的策略要綜合考慮髓鞘的再生和軸突的保護。
成年人中樞神經系統含有能增殖的少突膠質細胞的前體細胞，這些細胞成熟分化成負責髓鞘化的少突膠質細胞。另外，MS損傷在其慢性期內源性的少突膠質細胞前體細胞表現出衰竭的現象，這是因為這些前體細胞的增殖和分化能力受到抑制(Wolswijk，1998)。在慢性MS損傷的環境中這些前體細胞一般處於靜止狀態，因此使其無法進行髓鞘再生。因此慢性MS損傷可能包含阻止少突膠質細胞再生的因子或缺乏刺激少突膠質細胞前體細胞群增殖所必須的因子(Wolswijk，1998)。這一概念導致形成了一種假說，對MS的有效治療不應僅僅限於抑制炎症還應該促進髓鞘的再生。髓鞘再生細胞有各種來源，包括損傷中存活下來的少突膠質細胞、來源於這些倖存者的細胞、或鄰近的前體細胞。實驗表明成熟的少突膠質細胞在細胞因子如鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)的誘導下可以從新分化和增殖，說明發生了脫髓鞘疾病後體內依然存在使少突膠質細胞鏈再生的機制(Grinspan等，1996；Grinspan等，1993)。
通過用神經膠質生長因子治療動物模型的研究還發現了一些證據證明髓鞘再生對脫髓鞘疾病具有有益的效果。神經膠質生長因子2(神經調節蛋白/GGF-2)是一種已知的能促進少突膠質細胞增殖和存活的中樞神經系統生長因子，在MS的EAE鼠模型中它可以延遲疾病的起始，緩解臨床症狀以及降低疾病發作的頻率(Marchionni等，1999)。實驗還證實神經調節蛋白是由軸突產生的，具有促進成熟少突膠質細胞存活的功能(Fernandez等，2000)。
其它生長因子如血小板源性生長因子(PDGF)和胰島素樣生長因子-1在EAE模型中也被證實具有促軍髓鞘再生的功能以及具有治療作用(綜述見Dubois-Dalcq和Murray，2000)。通過誘導少突膠質細胞鏈上細胞的增殖和/或分化從而成功地刺激了髓鞘的再生，說明以髓鞘再生作為MS的治療策略還是具有良好前景的。另外確定抑制髓磷脂合成的分子也是非常重要的，因為這些分子可能會降低修復策略如MS的少突膠質細胞移植的效果。
髓鞘再生策略可以抗炎症策略一起使用以修復損傷和保護軸突以免斷裂和死亡。
少突膠質細胞可以被誘導使中樞神經軸突束從新髓鞘化，因此可以改善病症。促進髓鞘再生可以抵消如上面所述的免疫細胞進入中樞神經組織攻擊髓鞘而導致的損傷。
利用檢測不同基因表達的晶片已經分析了少突膠質細胞的分化以及多發性硬化症(DGE，Scarlato等，2000；Whitney等，1999)。這種晶片利用不同的微陣列技術分析不同族基因的表達。分化少突膠質細胞和多發性硬化症的基因表達分析表明髓磷脂特異性基因的表達出現明顯的變化。另外，所分析的一些其它基因也出現表達的變化，其中許多都是已知的參與細胞活動如細胞周期的調控、細胞骨架的再造和膜運輸的基因(Scarlato等，2000)。
骨橋蛋白是一種高度磷酸化的唾液蛋白，是骨和牙齒礦化的細胞外基質的主要組成成分。OPN的特徵是具有多聚天冬氨酸序列和介導羥磷灰石結合的Ser/Thr磷酸化位點，以及具有一個介導細胞黏附和信號傳導的高度保守的RGD基序。由於還沒有一個OPN敲除小鼠模型因此還無法確定骨橋蛋白在各種組織中的功能，最近的研究發現了一些新的有趣的現象可以使我們了解這個蛋白在各種生物學事件包括發育過程、創傷修復、免疫反應、腫瘤發生、骨吸收以及骨鈣化中功能的多樣性。骨橋蛋白通過幾個相互作用的信號通路中的多個受體刺激細胞的活動，可以解釋這個蛋白功能的多樣性(Sodek等)。
骨橋蛋白在大鼠的脊索和三叉神經系統的初級感覺神經元中有表達，其中神經元胞體和軸突上都有表達(Ichikawa等，2000)。
通過原位雜交發現成年人腦中有骨橋蛋白mRNA的表達。在嗅球和腦幹的神經元中都有表達，在腦幹中發現mRNA表達於各種功能區包括運動相關區、感覺系統區以及網狀結構區(Shin等，1999)。
另外的研究發現大鼠前腦一過性缺血模型中有骨橋蛋白mRNA的空間及瞬時表達。球形缺血後出現的OPN mRNA瞬時表達出現在紋狀體的時間比出現在海馬的時間要早。實驗還發現在微神經膠質細胞變得更活躍前在靠近側腦室的背內側紋狀體和海馬下下託有OPN mRNA的表達。另外在齒狀門到CA3邊緣的區域也有表達(LeeMY，Shin SL，Choi YS，Kim EJ，Cha JH，Chun MH，Lee SB，Kim SY，Neurosci Lett1999年8月20日2712 81-4)。
骨橋蛋白也叫Eta-1。WO 00/63241描述了調節免疫反應的方法，特別是利用Eta-1(早期T淋巴細胞活化因子-1)/骨橋蛋白調節I型免疫反應的方法。骨橋蛋白調節子據說可用於治療感染、免疫失調和疾病、自身免疫疾病包括MS、各種免疫缺陷以及癌症。骨橋蛋白的所有調節子在WO 00/63241中都有描述，這些調節子被用於治療自身免疫疾病，包括MS，這些調節子是骨橋蛋白/Eta-1的抑制劑，該專利說明書的V部分「本發明調節方法的臨床應用」和D部分″自身免疫疾病″有詳細說明，見WO 00/63241的51-53頁。
幹擾素是一類具有抗炎、抗病毒和抗增殖活性的細胞因子。根據其生物化學和免疫學特性天然人幹擾素可以分為三類幹擾素α(白細胞型)、幹擾素β(成纖維細胞型)和幹擾素γ(免疫型)。α幹擾素現在在美國及其它國家已被批准用於治療毛細胞白細胞、性病疣、卡波西肉瘤(一種惡性腫瘤，常見於獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)病人)和慢性非A、非B型肝炎。
幹擾素還是肌體應對病毒感染而產生的一種糖蛋白。可以抑制病毒在被保護細胞內的複製。幹擾素是有低分子量組成的蛋白質，其作用是非特異性的，也就是說一種病毒誘導產生的幹擾素可以有效對抗多種其它病毒的感染。但是幹擾素也是種特異性的，也就是說一個物種產生的幹擾素只能在同種或近似物種的細胞內刺激產生抗病毒活性。幹擾素是第一組被發現具有抗腫瘤和抗病毒活性的細胞因子。
三類主要的幹擾素被稱為幹擾素α、幹擾素β和幹擾素γ。這些主要種類的劃分最初是根據其細胞來源(白細胞、成纖維細胞或T細胞)。但是現在越來越清楚地顯示一種細胞可以產生幾種類型的幹擾素。因此白細胞幹擾素現在被稱為幹擾素α，成纖維細胞幹擾素被稱為幹擾素β，T細胞幹擾素被稱為幹擾素γ。幹擾素還有第四種類型，淋巴漿細胞型幹擾素，是由″Namalwa″細胞系產生的(來源於Burkitt淋巴瘤)，該細胞好像能產生白細胞型幹擾素和成纖維細胞型幹擾素的混合物。
據報導幹擾素的一個活性單位被定義(有些武斷的)為能保護50％的細胞免受病毒損傷所需要的量。
每一類幹擾素又包括幾種不同的亞類。幹擾素β和幹擾素γ是單基因產物。每一類之間的差別主要在於其糖基化的不同。
幹擾素α包括的亞類最多，大約有15個。9號染色體上有一簇幹擾素α基因，至少含有23個成員，其中25個是活動的，可以被轉錄。成熟的幹擾素α是沒有糖基化的。
幹擾素α和幹擾素β具有相同的長度(165或166個胺基酸)及相同的生物學活性。幹擾素γ含有146個胺基酸，與幹擾素α和幹擾素β的相似程度較低。只有幹擾素γ能活化巨噬細胞或誘導殺傷性T細胞的成熟。效果上這些新型的治療藥物被稱為生物學反應調節劑(BRMs)，因為他們在有機體對腫瘤的反應過程中發揮效應，通過免疫調節影響肌體對腫瘤細胞的識別。
特別是人成纖維細胞型幹擾素(幹擾素β)具有抗病毒活性，能夠刺激天然殺傷細胞對抗惡性腫瘤細胞。它是一種由病毒和雙鏈RNA誘導產生的分子量大約為20000Da的多肽。根據成纖維細胞型幹擾素基因的核苷酸序列，通過重組DNA技術進行克隆，Derynk等人(Derynk R等，1980)推算出該蛋白的完整胺基酸序列。它是166個胺基酸長度的蛋白質。
Shepard等人(shepard H.M.等，1981)描述了一個在842位鹼基突變的突變體(141位胺基酸由Cys變成Tyr)，該突變體的抗病毒活性消失，還描述了一個1119-1121位核苷酸缺失的突變克隆。
Mark等人(Mark D.F.等，1984)通過將469位的T替換成A插入了一個人工突變，使17位的胺基酸由Cys變成Ser。所得到的IFN-β的活性與天然IFN-β一樣，並且在-70℃條件下長期儲存更穩定。
Rebif(重組人幹擾素β)是最新開發出的用於治療多發性硬化症(MS)的一種幹擾素，其治療效果顯著提高。Rebif是IFN-β1a，從哺乳動物細胞系中製備，與天然人幹擾素基本一致。
IFN發揮作用的機制還不是完全清楚。但是在大多數情況下他們是通過影響某些特定基因的誘導與表達進而調節免疫系統而發揮作用的。體外實驗結果表明IFN能夠誘導或抑制大約20種基因產物。IFN-β在MS中可能通過三種途徑發揮作用
■調節T細胞的功能如活化、增殖或抑制細胞功能；■調節細胞因子的產生下調炎症前細胞因子的表達和上調抑制、抗炎症細胞因子的表達；■調節T細胞通過BBB(血腦屏障)遷移和滲入中樞神經系統。
通過PRISMS研究確立了利用幹擾素β-1a每周三次皮下注射治療發作/緩解型多發性硬化症(RR-MS)的有效性。本研究表明幹擾素β-1a對長病程MS具有積極的療效，通過MRI檢測發現可以減少疾病的發作次數和發作的嚴重程度，並且可以減輕疾病的負擔和疾病的活動(「幹擾素β-1a治療發作/緩解型多發性硬化症的隨機、雙盲、安慰劑對照研究」(Randomised，Double-Blind，Placebo-Controlled Studyof Interferon beta-la in Relapsing-remitting Multiple Sclerosis))，TheLancet 1998；352(11月7日，1998)1498-1504.)。
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發明概述本發明的目的在於提供一種治療和/或預防神經疾病的新方法。
本發明是基於這樣的發現蛋白質骨橋蛋白可以促進神經膠質細胞的增殖和分化，因而促進神經的髓鞘化和再生。與本發明相一致的是還發祥骨橋蛋白在多發性硬化症和周圍神經病的動物模型中有積極的治療效果。
因此，本發明涉及骨橋蛋白或其活性的激動劑用於神經疾病如創傷性神經損傷、腦卒中、中樞神經系統或外周神經系統的脫髓鞘疾病、神經病以及神經變性疾病的治療。
根據本發明的描述，骨橋蛋白還可以和幹擾素聯合以治療和/或預防神經疾病。利用核酸分子、含有骨橋蛋白基因的表達載體以及能表達骨橋蛋白的細胞治療和/或預防神經疾病也包括在本發明的範圍之內。本發明還提供含有骨橋蛋白和幹擾素以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑的藥用組合物。
附圖簡述

圖1A顯示的是用直方圖描述的cuprizone治療後不同時間點上骨橋蛋白的表達水平，測量方法是用TaqMan分析。3/5w.Cup＝cuprizone治療3周或5周，5w.cup+1/3/6w.＝cuprizone治療5周然後cuprizone減少到三分之一或在6周後恢復。
圖1B顯示的是在小腦發育的不同階段用TaqMan檢測骨橋蛋白、MBP和PLP mRNA與對照C1水平相比所達到的調節倍數。C1至20＝出生後1到20天的小腦，CA＝成年小腦。
圖2用示意圖描述了骨橋蛋白的結構和已知的亞型以及其C端和N端顯示的是結構。
圖3描述了含骨橋蛋白編碼序列的質粒Pac的示意圖。
圖4用直方圖說明了用cAMP處理少突膠質細胞系oli-neu 6小時(1)，2天(2)，6天(3)或10天(4)後骨橋蛋白mRNA的表達水平與對照相比上調的倍數。柱5和6描述了cuprizone實驗的骨橋蛋白mRNA水平。(5)cuprizone治療3周，(6)cuprizone治療5周。
圖5是含有骨橋蛋白編碼序列的質粒pDEST 12.2的示意圖。
圖6是含有骨橋蛋白編碼序列和螢光標記物EGFP編碼序列的質粒pDEST 12.2的示意圖。
圖7是含有帶HIS-tag的骨橋蛋白編碼序列的質粒pDEST 12.2的示意圖。
圖8顯示的是胰島素飢餓及用杆狀病毒表達的骨橋蛋白(Baculo-OPN)或表達骨橋蛋白的HEK細胞(HEK-OPN)處理24小時後oli-neu細胞的增殖情況。所讀取的是活細胞染料Alamar藍所發出的螢光。
圖9顯示的是用表達骨橋蛋白的杆狀病毒(Baculo-OPN)或表達骨橋蛋白的HEK細胞(HEK-OPN)處理24小時後胰島素飢餓的oli-neu細胞增殖的劑量效應曲線。
圖10顯示的是胰島素飢餓及用杆狀病毒表達的全長骨橋蛋白(Baculo-OPN)或骨橋蛋白的N端片段(N端BacOPN)處理後oli-neu細胞的增殖情況。
圖11顯示的是用100nM的杆狀病毒表達的骨橋蛋白處理混和皮質培養物的MBP免疫組化結果。A＝對照；B＝OPN處理；C＝B的放大；D＝另一個視野的OPN處理混和皮質培養物，此視野內看不見軸突。
圖12顯示的是用ELISA方法檢測到的髓鞘化混和皮質培養物內的MBP蛋白增加情況，該培養物是用LIF和表達骨橋蛋白的杆狀病毒處理過的。
圖13顯示的是用不同劑量(10pM，10nM，100nM)的表達骨橋蛋白的大腸桿菌(OPN-E-coli)或杆狀病毒(OPN Bac)處理後的CG4細胞的增殖情況。
圖14顯示的是EAE小鼠脊索內血管周圍的炎症浸潤情況，該小鼠皮下分別注射溶劑(PBS)，溶劑加0.1％BSA，1、10或100μg/kg的AS900011(骨橋蛋白)或100μg/kg的AS900011(骨橋蛋白)加上20000U/每隻鼠鼠幹擾素β(mIFNβ)，或者單獨的20000U/每隻鼠mIFNβ。
圖15顯示的是EAE小鼠脊索內脫髓鞘面積的百分數，該小鼠皮下分別注射溶劑(PBS)，溶劑加0.1％BSA，1、10或100μg/kg的AS900011(骨橋蛋白)或100μg/kg的AS900011(骨橋蛋白)加上20000U/每隻鼠鼠幹擾素β(mIFNβ)，或者單獨的20000U/每隻鼠mIFNβ。
圖16顯示的是治療結束後的臨床積分、EAE小鼠炎症浸潤以及脫髓鞘情況，該小鼠皮下分別注射溶劑(PBS)，溶劑加0.1％BSA，1、10或100μg/kg的AS900011(骨橋蛋白)或100μg/kg的AS900011(骨橋蛋白)加上20000U/每隻鼠鼠幹擾素β(mIFNβ)，或者單獨的20000U/每隻鼠mIFNβ。
圖17顯示的是通過壓迫坐骨神經誘導產生的神經病小鼠的體重，這些小鼠分別用溶劑，1、10或100μg/kg的骨橋蛋白(Ost)，10μg/kg的陽性對照化合物(4-MC)或100μg/kg變性骨橋蛋白(Ost-D)處理。
圖18顯示的是神經病小鼠複合肌肉動作潛勢的振幅，這些小鼠分別用溶劑，1、10或100μg/kg的骨橋蛋白(Ost)，10μg/kg的陽性對照化合物(4-MC)或100μg/kg變性骨橋蛋白(Ost-D)處理。
圖19顯示的是神經病小鼠複合肌肉動作潛勢的潛伏期，這些小鼠分別用溶劑，1、10或100μg/kg的骨橋蛋白(Ost)，10μg/kg的陽性對照化合物(4-MC)或100μg/kg變性骨橋蛋白(Ost-D)處理。
圖20顯示的是神經病小鼠複合肌肉動作潛勢的持續時間，這些小鼠分別用溶劑，1、10或100μg/kg的骨橋蛋白(Ost)，10μg/kg的陽性對照化合物(4-MC)或100μg/kg變性骨橋蛋白(Ost-D)處理。
圖21顯示的是神經病小鼠內變性纖維的百分數，這些小鼠分別用溶劑，1、10或100μg/kg的骨橋蛋白(Ost)，10μg/kg的陽性對照化合物(4-MC)或100μg/kg變性骨橋蛋白(Ost-D)處理。
圖22顯示的是神經病小鼠內每個區域內神經纖維的總數，這些小鼠分別用溶劑，1、10或100μg/kg的骨橋蛋白(Ost)，10μg/kg的陽性對照化合物(4-MC)或100μg/kg變性骨橋蛋白(Ost-D)處理。
本發明的詳細描述本發明的基礎在於發現在少突膠質細胞分化及小腦發育過程中骨橋蛋白表達是不同的這一現象。本發明還發現在少突膠質細胞內導入骨橋蛋白的cDNA使其表達可以導致這些細胞在體外呈現出不同的表型。只要有骨橋蛋白的表達，少突膠質細胞就會呈現出與分化的髓鞘形成細胞相同的表型。除此以外還發現在體外骨橋蛋白，尤其是骨橋蛋白與幹擾素聯合使用時對已知的多發性硬化症模型具有有益的效果。在一個周圍神經病實驗模型中，骨橋蛋白對神經活性具有顯著的療效，可以明顯降低變性的百分率，增加髓鞘化的程度。
因此本文的實驗結果提供了一種新的治療神經疾病的可能性，特別是對於那些與神經及神經膠質細胞功能相關的疾病。這些發現是十分令人驚奇的，因為WO00/63241是通過抑制骨橋蛋白來治療多發性硬化症的。
因此本發明涉及利用骨橋蛋白或骨橋蛋白活性激動劑來製備治療和/或預防神經疾病藥物的方法。
本文中的術語「骨橋蛋白」是指全長人骨橋蛋白，含有已知的從後80個胺基酸開始的胺基酸序列(Oldberg等，1986；Kiefer等，1989)。人骨橋蛋白的序列在本文中用附加序列表中的SEQ ID NO1表示。本文中的術語「骨橋蛋白」還表示任何動物來源的骨橋蛋白，如鼠、牛或大鼠骨橋蛋白，只要其序列足以維持其骨橋蛋白活性，以及得到的分子在人體內無免疫原性。
本文中的術語「骨橋蛋白」還表示具有生物活性的突變蛋白及蛋白片段，如骨橋蛋白的天然亞型。骨橋蛋白通過在轉錄水平(選擇性剪接)及翻譯後修飾(磷酸化，糖基化)可以表達出具有不同功能的形式。現在已知有三個剪接突變體，分別命名位OPN-a(本文也稱為「全長」骨橋蛋白)、OPN-b和OPN-c(附加序列表中的SEQ IDNO1，2和3，在圖2中也有描述)。Kon等人(2000)描述了其亞型，Saitoh等(1995)和Kon等(2002)描述了亞型的特徵。
凝血酶在體內可以將骨橋蛋白裂解為含有N端部分和C端部分的蛋白片段。骨橋蛋白，特別是其C端部分的磷酸化對於骨橋蛋白的功能維持是十分重要的。因此本文所用的術語「骨橋蛋白」也包含那些蛋白裂解片段及具有不同磷酸化的形式。
本文所用的術語「骨橋蛋白」還包括亞型、突變蛋白質、融合蛋白質、功能衍生物、活性部分或片段、或者環行排列的衍生物及其鹽。這些亞型、突變蛋白質、融合蛋白質、功能衍生物、活性部分或片段、或者環行排列的衍生物保持了骨橋蛋白的生物學活性。較好的是其生物學活性與野生型的骨橋蛋白一樣。
本文所用的術語「骨橋蛋白活性激動劑」是指能刺激或模仿骨橋蛋白活性的分子，如骨橋蛋白受體的拮抗性抗體，或能通過骨橋蛋白受體激活信號的小分子激動劑。骨橋蛋白通過兩類抗體介導其功能。首先它通過RGD(Arg-Gly-Asp)細胞附著基序在錳的正信號影響下與αv-整合素(αvβ3和αvβ5整合素)受體相互作用(Kunicki等，1997)。其次，它與CD44變異體亞型v6-v10相互作用。骨橋蛋白的C端部分被認為是參與和CD44相互作用的部分，而其N端部分被認為是參與和整合素受體相互作用以及參與巨噬細胞的增殖、存活和分化的部分。骨橋蛋白的N端部分也可以誘導IL-12和IL-10的釋放。這些受體的任何激動劑、刺激因子或增強因子都包括在本文所用術語「OPN活性激動劑」的範圍之內。
本文所用的術語「骨橋蛋白活性激動劑」還指能增強骨橋蛋白所介導活性的因子，如促進細胞黏附到細胞外基質上，促進少突膠質細胞鏈上的細胞分化成髓磷脂生成細胞，促進少突膠質細胞鏈上細胞(如祖細胞或前體細胞)的充實、增殖、分化或成熟，阻止少突膠質細胞鏈上的細胞調亡或受損。
本文所用的術語「治療」和「預防」應該被理解為阻止、抑制、減輕、改善或逆轉神經疾病的一種或多種症狀或病因，或者神經疾病所導致的症狀、疾病或併發症。當治療神經疾病時，在疾病開始後給予本發明的物質，而預防是指在病人出現症狀前給予本發明的物質。
本文所用的術語「神經疾病」包括所有已知的神經疾病或神經障礙，或者中樞神經系統及外周神經系統的損傷，包括本發明背景部分所詳細描述的那些疾病。
神經疾病包括與中樞神經系統及外周神經系統功能障礙有關的疾病，如與神經傳導有關的疾病、頭疼、頭部創傷、CNS感染、神經-眼科及顱神經病症、腦葉的運動功能障礙、木僵和昏迷、脫髓鞘疾病、譫語和痴呆、顱頸接合異常、癲癇、脊索障礙、睡眠障礙、周圍神經系統障礙、腦血管疾病或肌肉疾病。這些疾病的定義參加網址http//www.merck.com/pubs/mmanual/section14/sec14.htm本發明的神經疾病優選自下列疾病創傷性神經損傷、腦卒中、中樞神經系統或外周神經系統的脫髓鞘疾病以及神經變性疾病。
創傷性神經損傷可以涉及外周神經系統，也可以涉及中樞神經系統，可以是腦或脊索的創傷，包括本發明背景部分所描述的截癱。
腦卒中是由腦缺氧或缺血引起的。也叫腦血管病或腦血管意外。腦卒中可能會由於腦內某些區域血液供應不足而導致腦功能喪失。腦血液供應不足可以是由腦內形成的血栓(腦血栓)、或其它部位形成的運行到腦部的動脈粥樣斑塊或其它物質(血栓)引起的。腦內出血(腦出血)可能會導致與腦卒中相似的症狀。腦卒中最常見的原因是動脈粥樣硬化引起的腦卒中(腦血栓形成)，因此本發明也涉及動脈粥樣硬化的治療。
周圍神經病可能會導致感覺喪失、肌無力和萎縮、深度腱反射減弱以及血管舒張症狀的一種或多種。神經病可能影響單個神經(單一精神病變)、不同區域的兩個或多個神經(多發性單一精神病變)或多個神經同時受影響(多神經病)。受影響的可能主要是軸突(如糖尿病，萊姆病，或尿毒症及其它毒性藥物導致的損傷)，或者是髓鞘或施萬細胞(如急性或慢性炎症性多神經病，腦白質營養不良，或格-巴症候群)。按照本發明的方法還可以治療由下列原因引起的神經病鉛中毒、氨苯碸的使用、蜱咬、卟啉病或格-巴症候群，這些疾病可能主要影響運動纖維。其它的如由腫瘤的背根神經節炎、麻風病、AIDS、糖尿病或慢性維生素B6中毒引起的疾病可能主要影響背根神經節或感覺神經纖維，導致感覺障礙。腦神經也可能被影響，如格-巴症候群、萊姆病、糖尿病和白喉。
阿爾茨海默病是一種由腦組織改變而引起的心裡功能衰退障礙。其中包括腦組織萎縮、初級變性性痴呆及彌散性腦萎縮。阿爾茨海默病也叫老年痴呆/阿爾茨海默型(SDAT)。
帕金森病是一種腦病，其特徵是搖擺及行走、運動和協調困難。該病與控制肌肉運動的腦組織受損有關。也叫震顫麻痺或震顫性麻痺。
亨庭頓舞蹈病是一種遺傳性常染色體顯性神經疾病。
肌萎縮性側索硬化症(ALS)是一種由神經對隨意運動肌肉的控制進行性喪失所引起的，其主要原因是腦和脊索的神經細胞受到破壞。肌萎縮性側索硬化症也叫Lou Gehrig病，是一種包括使用及控制肌肉功能喪失的疾病。
多發性硬化症(MS)是一種中樞神經系統的炎症性脫髓鞘疾病，具有發作/緩解或進行性疾病過程。MS不僅僅是一種脫髓鞘疾病，其在外周神經系統中所對應的是慢性炎症性脫髓鞘多發性神經根性神經病(CIDP)。另外，還有急性單相病變，如外周神經系統的炎症性脫髓鞘多發性神經根性神經病也叫做格-巴症候群(GBS)，以及中樞神經系統的急性散播性腦脊髓炎(ADEM)。
其它的神經疾病還有異常髓鞘化引起的神經病如上面發明背景中所列出的那種，以及腕管症候群。脊柱矯形併發症可能會伴有創傷性神經損傷，這些損傷也在本發明所包括的範圍之內。
神經疾病還可以是由先天性代謝障礙引起的。因此本發明的一個優選實施方式就描述了這種由先天性代謝缺損引起的神經疾病。
本發明所包括的先天性代謝障礙可以是苯丙酮尿症和其它胺基酸尿症、泰-薩病、尼-皮病和高歇病；胡爾勒症候群；克拉伯病和其它腦白質營養不良。這些疾病可以影響髓鞘的發育，主要是影響CNS的髓鞘發育。
先天性代謝障礙引起的神經疾病已在發明背景中作了詳細描述。
那些不太被人熟知的神經疾病也在本發明的範圍之內，如神經纖維瘤病或多系統萎縮(MSA)。其它的一些疾病也可以根據本發明的方法進行治療，這些疾病已在發明背景中作了詳細描述。
在另外一個優選實施方式中神經疾病是指周圍神經病，最優選的是糖尿病性神經病。與化療相關的神經病也是本發明所優選的。
術語「糖尿病性神經病」是指糖尿病性神經病的任何形式，或者指糖尿病性神經病伴隨的或由其引起的一種或多種症狀或障礙，或者指上述發明背景所詳細描述的影響神經的糖尿病併發症。在糖尿病性多神經病中，許多神經同時受損。糖尿病性神經病也可以是單一精神病變。例如在局部單一精神病變中疾病只累及單個神經，如動眼神經或外展腦神經。如果是不同區域的兩個或多個神經受損也可以是多發性單一精神病變。
在另一個優選實施方式中，神經疾病是指脫髓鞘疾病。優選的脫髓鞘疾病包括CNS的脫髓鞘疾病，如急性散播性腦脊髓炎(ADEM)和多發性硬化症(MS)，也包括周圍神經系統的脫髓鞘疾病。後者有慢性炎症性脫髓鞘疾病多發性神經根性神經病(CIDP)及急性單相疾病如炎症性脫髓鞘疾病多發性神經根性神經病也叫格-巴症候群(GBS)。
本發明還有一個優選實施方式涉及神經變性疾病的治療和/或預防。神經變性疾病選自阿爾茨海默病、帕金森病、亨庭頓舞蹈病和ALS。
優選的骨橋蛋白選自下列肽、多肽或蛋白(a)含有SEQ ID NO1的多肽；(b)含有SEQ ID NO1的1到168或1到170胺基酸的多肽；(c)含有SEQ ID NO1的1到16和170到314胺基酸的多肽；(d)含有SEQ ID NO1的170到314胺基酸的多肽；(e)含有SEQ ID NO2的多肽；(f)含有SEQ ID NO3的多肽；(g)(a)到(f)的任何一個突變體，其中的胺基酸序列與(a)到(f)中至少一個序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；(h)(a)到(f)的任何一個突變體，該突變體是由在溫和條件或嚴格條件下能與編碼(a)到(f)任何一個突變體的天然DNA序列的互補序列雜交的DNA序列編碼的；(i)(a)到(f)的任何一個突變體，其中，所述胺基酸序列的任何改變都是用保守性胺基酸取代(a)到(f)任何一個突變體的胺基酸；(j)(a)到(f)任何一個突變體的鹽或亞型、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或環形排列的衍生物。
活性部分或片段可以指任何一個骨橋蛋白亞型的任一部分或區域，如N端部分或C端部分、以及如圖2所顯示的OPN-a、OPN-b或OPN-c的任何一個。GRGDS基序可以存在、可以缺失或突變。可以將肝素結合位點突變以使骨橋蛋白無法與肝素結合。而且全長骨橋蛋白或任一活性片段都可以在下列絲氨酸殘基上有一個或多個被磷酸化8，10，11，33，46，47，60，62，65，83，86，89，92，101，104，107，110，113，153，155，175，179，199，203，208，212，218，223，227，238，242，247，251，254，259，264，275，287，292，294，295。另外，絲氨酸磷酸化位點可以從絲氨酸突變成穀氨酸以模擬磷酸化。
本領域的技術人員優選即使是骨橋蛋白的一小部分也能足以維持其功能的分子，如含有維持骨橋蛋白基本功能所需的必須胺基酸殘基的活性肽。
本領域的技術人員還優選與骨橋蛋白活性一樣、甚至更好的骨橋蛋白的突變蛋白質、鹽、亞型、融合蛋白質、功能衍生物、活性部分或片段、或者環行排列的衍生物。骨橋蛋白及其突變蛋白質、亞型、融合蛋白質、功能衍生物、活性部分或片段、或者環行排列的衍生物的活性可以用共培養分析檢測，如實施例8所描述的檢測方法。含有少突膠質細胞和其它中樞神經系統源細胞(如神經元，星形膠質細胞，小膠質細胞)的混和皮質培養物與OPN或其突變體、亞型、片段、活性部分、功能衍生物及其鹽共孵育後可以上調典型髓鞘化基因的表達，如P0、MBP或MAG。基因的表達可以通過定量實時RT-PCR(TagManRT-PCR)檢測，該方法在下面的實施例中有詳細解釋。還有一種簡單的分析OPN活性的方法是少突膠質細胞增殖試驗，該方法是將適當的少突膠質細胞株如oli-neu或CG4細胞與OPN或其突變體、亞型、片段、活性部分、功能衍生物及其鹽共孵育，詳細描述見下面的實施例7。
優選的活性片段是具有和全長骨橋蛋白一樣或更好活性的片段，或者還有其它的優點，如更好的穩定性或更低的毒性或免疫原形，或者易於大量製備，或易於純化。本領域的技術人員優選那些能通過插入到適當載體中的相應cDNA克隆技術製備的並且能用上述共培養分析方法檢測的骨橋蛋白的突變體、活性片段及功能衍生物。
本發明所涉及的蛋白質可以是糖基化的，也可以是非糖基化的，可以來自天然資源如體液，也可以通過重組製備。重組表達可以在原核表達系統如大腸桿菌中進行，也可以在真核表達系統如昆蟲細胞中進行，優選哺乳動物表達系統，如CHO細胞或HEK細胞。
本文所用的術語「突變體」是指骨橋蛋白的類似物，其中天然骨橋蛋白的一個或多個胺基酸殘基被不同的胺基酸殘基替代，或者缺失，或者將一個或多個胺基酸殘基添加到骨橋蛋白的天然序列上，但與野生型的骨橋蛋白相比其活性無明顯改變。這些突變體可以通過已知的合成技術和/或位點突變技術，或者其它任何已知的合適技術製備。
按照本發明的方法能夠使用的骨橋蛋白突變體或編碼這些突變體的核酸包括一組有限的實質一致的序列作為替代多肽或多聚核苷酸，這些多肽或多聚核苷酸可以按照本文所提供的指導不需過度的實驗通過本領域的任一普通技術製備。
本發明的突變體包括核酸如DNA或RNA編碼的蛋白質，根據本發明這些核酸在溫和的或嚴格的條件下能與編碼OPN的DNA或RNA雜交。術語「嚴格條件」是指雜交和隨後的洗滌條件，本領域的普通技術人員通常將這些田間稱為「嚴格的」。見Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，同上，Interscience，N.Y.，§§6.3and 6.4(1987，1992)，和Sambrook等(Sambrook，J.C.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
嚴格的條件包括而不限於洗滌條件雜交Tm計算值下12-20℃，2×SSC和0.5％SDS洗滌5分鐘，2×SSC和0.1％SDS洗滌15分鐘；0.1×SSC和0.5％SDS 37℃洗滌30-60分鐘，然後用0.1×SSC和0.5％SDS 68℃洗滌30-60分鐘。本領域的普通技術人員所謂的嚴格條件也要考慮DNA序列、寡核苷酸探針(如10-40個鹼基)或混和寡核苷酸探針的長度。如果用混和探針，優選用四甲基氯化銨(TMAC)代替SSC。見Ausubel，同上。
在一個優選實施方式中，任何一個這種突變體與附加序列表的序列SEQ IDNO1、2或3至少都有40％的一致性或同源性。更好的是至少有50％、60％、70％、80％的一致性或同源性，最好的是有90％的一致性或同源性。
通過比較確定的一致性反映了兩個或多個多肽序列或多聚核苷酸序列之間的關。一般來說一致性是指在所比較的序列長度上兩個多聚核苷酸的核苷酸對核苷酸的精確性，或兩個多肽序列的胺基酸對胺基酸的精確性。
對於不是精確一致的序列來說可以確定其「％一致性」。通常情況下將所要比較的兩個序列排列在一起來得出兩個序列之間的最大相關性。可以通過在一個或兩個序列上插入「空格」來增加排列的整齊程度。％一致性可以在所比較的每一序列的全長上確定(所謂的通用排列)，這種排列方法特別適於長度一致或很接近的序列，或者在較短的特定的長度上確定(所謂的局部排列)，這種排列方法比較適於長度不同的序列。
比較兩個或多個序列一致性和同源性的方法是本領域所熟知的。因此Wisconsin序列分析軟體包，9.1版(Devereux J等，1984)中的程序如BESTFIT和GAP可用於確定兩個多聚核苷酸的％一致性和兩個多肽序列的％一致性及％同源性。BESTFIT利用的是Smith和Waterman(1981)的「局部同源性」算法，找出兩個序列之間的最簡單區域的相似性。其它確定序列一致性和/或相似性的程序也是本領域所熟知的，如BLAST家族的程序(Altschul S F等，1990，Altschul S F等，1997，可以通過NCBI的主頁查到，網址是www.ncbi.nlm.nih.gov)和FASTA(PearsonW R 1990Pearson 1988)。
根據本發明突變體優選的變化是已知的「保守替代」。骨橋蛋白多肽的保守胺基酸取代可以包括同組胺基酸內的同義胺基酸取代，同組胺基酸內的胺基酸具有相似的物理化學性質，其成員之間的替代可以保持分子的生物學功能(Grantham，1974)。現在已經清楚胺基酸的插入和缺失也可以在預先確定的序列上進行而不改變蛋白質的功能，特別是插入或缺失的只是少量胺基酸，如30個以內，優選10個以內，以及不刪除或替換維持功能的關鍵胺基酸，如半胱氨酸殘基。通過這種缺失和/或插入得到的蛋白質和突變體也包括在本發明的範圍之內。
優選的同義胺基酸組是表I所列的那些胺基酸。更優選的是表II所列的那些胺基酸；最優選的是表III所列的那些胺基酸。
表I優選的胺基酸組胺基酸 同義胺基酸組SerSer，Thr，Gly，AsnArgArg，Gln，Lys，Glu，HisLeuIle，Phe，Tyr，Met，Val，LeuProGly，Ala，Thr，ProThrPro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAlaGly，Thr，Pro，AlaValMet，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGlyAla，Thr，Pro，Ser，GlyIleMet，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePheTrp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyrTrp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCysSer，Thr，Cys His Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGlnGlu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsnGln，Asp，Ser，Asn
LysGlu，Gln，His，Arg，LysAspGlu，Asn，AspGluAsp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMetPhe，Ile，Val，Leu，MetTrpTrp表II更優選的胺基酸組胺基酸同義胺基酸組Ser SerArg His，Lys，ArgLeu Leu，Ile，Phe，MetPro Ala，ProThr ThrAla Pro，AlaVal Val，Met，IleGly GlyIle Ile，Met，Phe，Val，LeuPhe Met，Tyr，Ile，Leu，PheTyr Phe，TyrCys Cys，SerHis His，Gln，ArgGln Glu，Gln，HisAsn Asp，AsnLys Lys，ArgAsp Asp，AsnGlu Glu，GlnMet Met，Phe，Ile，Val，LeuTrp Trp表3最優選的胺基酸組胺基酸同義胺基酸組Ser Ser
ArgArgLeuLeu，Ile，MetProProThrThrAlaAlaValValGlyGlyIleIle，Met，LeuPhePheTyrTyrCysCys，SerHisHisGlnGlnAsnAsnLysLysAspAspGluGluMetMet，Ile，LeuTrpMet在蛋白質上進行胺基酸替換以獲得用於本發明的骨橋蛋白突變體、多肽或蛋白質可以通過任何已知的方法步驟，如Mark等人的美國專利4,959,314、4,588,585和4,737,462號；Koths等人的5,116,943號；Namen等人的4,965,195號；Chong等人的4,879,111號和Lee等人的5,017,691號；以及美國專利4,904,584號中所描述的賴氨酸替代蛋白質(Shaw等)。
術語「融合蛋白」是指由骨橋蛋白或其突變體及片段和其它蛋白融合而成的多肽，這種融合蛋白在體液內的滯留期延長。因此骨橋蛋白可與其它蛋白質、多肽及其類似物質如免疫球蛋白或其片段融合。
本文所用的術語「功能衍生物」涵蓋骨橋蛋白及其突變體和融合蛋白的衍生物，這些衍生物可以用本領域的已知技術通過改變殘基的側鏈上的功能基團或N末端及C末端基團來製備，只要其保留藥用特性，即不破壞蛋白質的活性，其活性與骨橋蛋白實質上一致，並且不會導致含有該衍生物的組合物出現毒性就可以包括在本發明中。
例如，這些衍生物可以包括能遮蔽抗原位點並且能延長骨橋蛋白在體內治滯留期的聚乙二醇側。其它衍生物包括羧基的脂肪酯，通過與氨或者初級胺或次級胺反應形成的羧基的醯胺，胺基酸殘基的游離氨基與醯基(烷基或環碳芳基)形成的N醯基衍生物，以及游離羥基(如絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基)與醯基形成的O醯基衍生物。
本發明所述的骨橋蛋白及其突變體和融合蛋白的「活性片段」涵蓋蛋白分子或者蛋白分子與其相連的分子或殘基如糖鏈或磷酸基的多肽鏈的任何片段或前體，或者蛋白分子或糖鏈自身的聚集物，所述片段的活性與骨橋蛋白實質上是一樣的。
本文的術語「鹽」是指羧基鹽和OPN分子及其類似物的胺基酸加成鹽。羧基鹽可以通過本領域已知的方式形成，包括有機鹽如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽或鋅鹽，以及類似的鹽，有機鹼鹽如與氨(如三乙醇胺，精氨酸或賴氨酸，哌啶，普如卡因及類似物質)形成的鹽。酸加成鹽包括與礦酸如鹽酸或硫酸形成的鹽，與有機酸如醋酸或草酸形成的鹽。當然，所有這些鹽都必須保持本發明所需要的OPN的生物學活性，即刺激少突膠質細胞增殖的效應。
在本發明的一個優選實施方式中，骨橋蛋白與載體分子、肽或蛋白融合以促進其穿過血腦屏障(「BBB」)。這樣可以是這些分子具有正確的靶向作用以到達病人體內的作用位點，這些病人所患疾病包括CNS的損傷。因為藥物需要通過血腦屏障，因此給藥方式要求能透過血腦屏障，通過滲透的方式或用一些具有血管作用的物質如緩激肽通過生物化學方式透過。通過血腦屏障的其它策略可以利用內源性的轉運系統，包括載體介導的轉運子，如葡萄糖載體和胺基酸載體；胰島素或運鐵蛋白的受體介導的內吞作用；以及活性射流轉運子如p-糖蛋白。通過BBB的藥物運輸策略還包括腦內植入。
骨橋蛋白的衍生物可以共價連接到多聚物上以改善蛋白的特性，如穩定性、半衰期、生物利用度、人體的耐受性或免疫原性。為了達到這一目的，骨橋蛋白可以連接到聚乙二醇(PEG)上。PEG化可以通過已知的方法進行，如WO 92/13095所描述的方法。
因此，在本發明的一個優選實施方式中，骨橋蛋白是PEG化的。
在本發明的另一個優選實施方式中，融合蛋白是一個免疫球蛋白融合子。融合可以是直接的，也可以同一個短連接肽，可以短到1至3個胺基酸殘基或更長，例如13個胺基酸殘基。所謂的連接物是位於骨橋蛋白序列與免疫球蛋白序列之間的具有E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，或者是含有Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13胺基酸連接序列。所得到的融合蛋白特性得以改善，如在體液中的滯留期延長，特異性增高、表達水平升高等。免疫球蛋白融合子還有利於融合蛋白的純化。
在另外一個優選實施方式中，骨橋蛋白與免疫球蛋白的恆定區融合。優選與重鏈區如人IgG1的CH2和CH3區融合。免疫球蛋白分子的其它亞型也適於按照本發明的方法製備融合蛋白，如IgG2或IgG4亞型，以及其它類的免疫球蛋白如IgM。融合蛋白可以是單體，也可以是多聚體，可以是異源多聚體，也可以是同源多聚體。融合蛋白中的免疫球蛋白部分可以進一步修飾以避免激活補體結合或補體級聯反應，或者結合到Fc受體上。
本發明還涉及聯合使用骨橋蛋白和免疫抑制劑製造治療和/或預防神經疾病的藥物，二者可以連續使用，也可以分別使用。免疫抑制劑可以是類固醇、氨甲蝶呤、環磷醯胺、抗白細胞抗體(如CAMPATH-1)以及類似藥物。
本發明還涉及聯合使用骨橋蛋白和幹擾素製造治療和/或預防神經疾病的藥物，二者可以連續使用，也可以分別使用。
本專利申請書中所用的術語「幹擾素」包括文獻中所定義為幹擾素的任何分子，例如包括上述「發明背景」部分所提到的任何種類的IFN。優選的是人源幹擾素，但其它物種來源的幹擾素也可以，只要其生物學活性與人源幹擾素一樣，並且在人體內沒有免疫原性。
特別是IFN-α、IFN-β和IFN-γ都包括在上述定義中。其中IFN-β是本發明優選的幹擾素。
本發明所用的術語「幹擾素β(IFN-β)」指人成纖維細胞幹擾素，通過從生物液體分離得到或通過DNA重組技術從原核或真核宿主細胞中獲得，也指幹擾素的鹽、功能衍生物、突變體、類似物和片段。
本文所用的術語「功能衍生物」涵蓋用本領域的已知技術通過改變殘基側鏈上的功能基團或N末端及C末端基團來製備的衍生物，只要其保留藥用特性，即不破壞如上所述的蛋白質的活性，如與相應受體的結合能力和啟動受體信號的能力，不會導致含有該衍生物的組合物出現毒性就可以包括在本發明中。衍生物可以有化學基團，如糖鏈或磷酸基，只要該衍生物保持蛋白的生物學活性並且可以作藥用。
例如，這些衍生物可以包括能遮蔽抗原位點並且能延長骨橋蛋白在體內治滯留期的聚乙二醇側。其它衍生物包括羧基的脂肪酯，通過與氨或者初級胺或次級胺反應形成的羧基的醯胺，胺基酸殘基的游離氨基與醯基(烷基或環碳芳基)形成的N醯基衍生物，以及游離羥基(如絲氨酸或蘇氨酸殘基的羥基)與醯基形成的O醯基衍生物。這種衍生物也可以含有能遮蔽抗原位點的聚乙二醇側鏈以延長其在體液內的滯留期。
那些能在體內滯留較長時間的衍生蛋白或與複合藥物結合的蛋白是特別重要的。例如上面所提到的PEG化的衍生物，或在體內能長期保持活性的基因工程蛋白都可以應用到本發明中。
術語「衍生物」只包括那些20種常見天然胺基酸不發生改變的衍生物。
本文的術語「鹽」既指羧基鹽也指上述蛋白質或其類似物氨基的酸加成鹽。羧基鹽可以通過本領域已知的方式形成，包括有機鹽如鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽或鋅鹽，以及類似的鹽，有機鹼鹽如與氨(如三乙醇胺，精氨酸或賴氨酸，哌啶，普如卡因及類似物質)形成的鹽。酸加成鹽包括與礦酸如鹽酸或硫酸形成的鹽，與有機酸如醋酸或草酸形成的鹽。當然，所有這些鹽都必須保持本發明所需要的蛋白質(骨橋蛋白和IFN-β)的生物學活性，如與相應受體結合的能力及啟動受體信號的能力。
幹擾素也可以被連接到多聚物上以增加蛋白質的穩定性。IFN-β和聚乙二醇(PEG)的連接在WO99/55377中已有描述。
本發明另外一個優選實施方式中，幹擾素是幹擾素β(IFN-β)，更優選的是IFN-β1a。
骨橋蛋白優選與幹擾素同時、連續或分別使用。
在本發明的一個優選實施方式中，幹擾素的用量大約為每千克體重0.0001-100毫克、每千克體重0.01-10毫克、每千克體重1-5毫克、或每千克體重2毫克。
本發明還涉及利用核酸分子製備治療和/或預防神經疾病的藥物，其中核酸分子含有的核酸序列能編碼具有如下胺基酸序列之一的多肽(a)含有SEQ ID NO1的多肽；(b)含有SEQ ID NO1的1到168或1到170胺基酸的多肽；(c)含有SEQ ID NO1的1到16和170到314胺基酸的多肽；(d)含有SEQ ID NO1的170到314胺基酸的多肽；(e)含有SEQ ID NO2的多肽；(f)含有SEQ ID NO3的多肽；(g)(a)到(f)的任何一個突變體，其中的胺基酸序列與(a)到(f)中至少一個序列至少有40％、50％、60％、70％、80％或90％的同一性；(h)(a)到(f)的任何一個突變體，該突變體是由在溫和條件或嚴格條件下能與編碼(a)到(f)任何一個突變體的天然DNA序列的互補序列雜交的DNA序列編碼的；(i)(a)到(f)的任何一個突變體，其中，所述胺基酸序列的任何改變都是用保守性胺基酸取代(a)到(f)任何一個突變體的胺基酸；(j)(a)到(f)任何一個突變體的鹽或亞型、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或環形排列的衍生物。
核酸可以裸核酸分子的形式通過肌肉注射給予。
核酸還可以包含載體序列，如病毒序列，以利於核酸分子編碼的基因在人體內表達，優選在適當細胞和組織內表達。
因此在一個優選實施方式中，核酸還包括表達載體。表達載體序列是本領域熟知的，可以包含調控目的基因表達的元件。表達載體可以含有調節序列如啟動子和增強子序列、篩選標記物序列、複製起點以及類似序列。因此基因治療方法可用於疾病的治療和/或預防。比較好的是骨橋蛋白在原位表達。
在一個優選實施方式中，表達載體是豆狀病毒來源的載體。豆狀病毒載體已被證實用於基因轉移是十分高效的，尤其是在CNS內。其它已知的病毒載體如腺病毒載體也可用於本發明中。
可以用靶向性載體以提高骨橋蛋白通過血腦屏障的能力。這種載體可以靶向如運鐵蛋白受體或其它內源性轉運蛋白。
在本發明的一個優選實施方式中，表達載體通過肌肉注射的方式給予。
利用載體誘導和/或增加在正常情況下骨橋蛋白表達停止或骨橋蛋白表達量不足的細胞內內源性骨橋蛋白的表達也是本發明所涉及的範圍。載體含有調節骨橋蛋白表達的調節序列。這種調節序列可以是啟動子或增強子。將調節序列通過同源重組插入到基因組的適當位點，人為的使調節序列與要誘導或要增強表達的基因相連。該技術通常被稱為「內源性的基因活化(EGA)」，見WO 91/09955的描述。
本發明還涉及利用經過基因改造的細胞產生骨橋蛋白用於製備治療和/或預防神經疾病的藥物。
本發明還涉及能產生用於製備治療和/或預防神經疾病的藥物-骨橋蛋白的經過基因改造的細胞。因此細胞治療方法也可用於將藥物運送到人體的適當位置。
本發明還涉及藥用組合物，特別使用於預防和/或治療神經疾病的藥用組合物，該組合物含有有效治療量的骨橋蛋白和有效治療量的幹擾素，還可以選擇添加有效治療量的免疫抑制劑。
術語「藥用的」的意思包括任何載體，這些載體不會干擾活性組分生物學活性的效果，對於所給予的宿主也沒有毒性。例如，對於胃腸道外給藥途徑來說，活性蛋白質可以製成包含在載體如鹽水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer溶液中的適於注射的單位劑量形式。
根據本發明，藥用組合物的活性成分可以通過各種途徑給予個體。給藥途徑包括真皮內注射、皮下埋植(即緩釋形式)、肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射、皮下注射、口服、硬腦膜外注射、滴眼、鞘內注射、直腸內給藥以及鼻內給藥、其它任何有效的給藥途徑都可以使用，如通過上皮組織或內皮組織吸收，或通過基因治療，其中編碼活性藥物的DNA分子注射給病人(如通過載體)使活性藥物在體內表達和分泌。另外，本發明的蛋白質也可以和生物活性藥物其它組分如藥用表面活性劑、賦形劑、載體、稀釋劑和運載媒介一起注射。
對於胃腸道外給藥途徑(如靜脈、皮下、肌肉注射)來說，活性蛋白質可以製備成溶液、懸液、乳劑或凍乾粉，這種凍乾粉能溶於藥用胃腸外給藥途徑載體(如水、鹽水、葡萄糖溶液)並且含有能維持等滲性(如甘露醇)或化學穩定性(如防腐劑和緩衝液)的添加劑。
本發明所涉及蛋白質的生物利用度也可以通過能提高分子在人體內半衰期的接合作用來改善，例如在分子上連接聚乙二醇，見PCT專利申請WO 92/13095。
活性蛋白質的有效治療劑量根據各種因素可以變化，其中包括蛋白質類型、蛋白質的親核性、激動劑所表現出的殘留毒性、給藥途徑、病人的臨床狀況(包括希望所要維持的內源性骨橋蛋白活性的非毒性水平)。
因此「有效治療劑量」是指給藥後骨橋蛋白能對神經疾病產生積極療效的劑量。給藥劑量，不論單次劑量或重複給藥劑量，都依賴與各種因素，其中包括骨橋蛋白的藥代動力學特性、給藥途徑、病人的狀況和特徵(性別、年齡、體重、健康狀況、身高)、症狀的範圍、當前的治療措施、治療的頻率及所要達到的效果。
如上所述，優選骨橋蛋白的劑量是約為每千克體重0.0001-10毫克、0.01-5毫克、0.01-5毫克、0.1-3毫克或1-2毫克。更優選骨橋蛋白的劑量是約為每千克體重0.1-1000微克、1-100微克或10-50微克。
本發明優選的給藥途徑是皮下注射。更優選的是肌肉注射。
在另一個優選實施方式中，骨橋蛋白每日給藥或隔日給藥。
每日的劑量通常分次給藥或製成緩釋劑型以達到所預期的效果。第二次給藥或隨後的給藥可以給予同樣的劑量、小於或大於初次或前次給藥的劑量。第二次給藥或隨後的給藥可以在發病開始時或發病前。
根據本發明，骨橋蛋白可以在實施有效劑量的其它治療方案或給予有效劑量的其它治療藥物(多要治療方案)特別是幹擾素前、同時或以後進行預防性或治療性給藥。與其它治療藥物同時給予的活性藥物可以在一個組合物中，也可以在不同的組合物中。
本發明還涉及治療神經疾病的方法，該方法包括給予需要的病人以有效劑量的骨橋蛋白或骨橋蛋白活性激動劑，可以選擇性地添加藥學上可接受的載體。
本發明還涉及治療神經疾病的方法，該方法包括給予需要的病人以有效劑量的骨橋蛋白或骨橋蛋白活性激動劑，以及幹擾素，可以選擇性地添加藥學上可接受的載體。
本文所引用的所有文獻，包括雜誌的文章或摘要、出版的或未出版的美國或其它國家的專利申請，已公布的美國或其它國家的專利或其它任何文獻，都已完整地納入本文作為參考，其中包括引用文獻中的所有數據、表格、附圖及文字。另外，本文所引用參老文獻內的完整內容也被全部納入本文作為參考。
對已知方法步驟、常規方法步驟、已知方法或常規步驟的參考並不是表示承認本發明的的任何方面、任何描述或實施方式在相關領域內被包括、被指導或被建議。
前面對特定實施方式的描述可以全面地闡釋本發明的基本性質，因此，在不需要額外實驗及不背離本發明的基本概念的前提下，其它人通過運用本領域的知識(包括本文所引用的參考文獻的內容)可以很容易地修改和/或應用這些特定實施方式。
因此，在本文的說明和指導的基礎上可以在所描述的實施方式等效的範圍內進行這些應用和修改。很容易理解的是本文的措辭和術語是為了描述而不是限制，因此熟練技術人員應按照本文的說明和指導，結合本領域普通技術人員已有的知識來闡釋本說明書的措辭和術語。
根據到目前所描述的發明內容，可以很容易地理解下面的實施例，這些實施例是以說明的方式來提供的，並不意味著對本發明進行限定。
實施例實施例1骨橋蛋白在脫髓鞘疾病的體內和體外模型中的不同表達。
方法體外模型系統通過用編碼t-neu癌基因，一種活化的酪氨酸激酶，的複製子缺失的逆轉錄病毒處理少突膠質細胞前體細胞而使之永生化建立起Oli-neu細胞系該細胞系在培養液中存在1mM雙丁醯環磷腺苷的情況下能被誘導分化(Jung等，1995)。這就是使以該細胞作為體外細胞模型來研究少突膠質細胞稱為可能。
A2B5鼠少突膠質細胞前體細胞來源的鼠少突膠質細胞系Oli-neu在未處理的條件下與用1-5mM雙丁醯環磷腺苷預分化處理6天後相比其細胞的形態及抗原性發生明顯變化。未處理的Oli-neu細胞是圓形的，與少突膠質細胞前體細胞一樣主要呈雙極性，而cAMP處理的細胞發生多形性的變化，呈扁平狀，甚至會出現扁平的伸展的「鞘狀」結構。另外，通過混和皮質培養進行的體外髓鞘化分析可用於觀察體外功能性髓磷脂。這個系統使我們有可能研究少突膠質細胞在其它類型的CNS細胞存在的情況下是如何與軸突接觸並使之髓鞘化的(Lubetzki等，1993)。本系統可用於檢測影響少突膠質細胞前體細胞增殖或少突膠質細胞分化和存活如影響髓磷脂片段形成的生物因子。研究體外髓鞘化過程的需要導致了一系列分析方法的出現，其中包括聚集腦細胞培養(Matthieu等，1992)、小腦切片培養(Notterpek等，1993)、以及共培養系統(Shaw等，1996；Barres等，1993)。這些模型的優點在於可以研究少突膠質細胞與其它類型細胞的接觸行為以及這些細胞是如何被刺激產生髓磷脂的。脫髓鞘現象在這種系統中也可以通過特異性的刺激來觀察，髓鞘再生過程也可用本系統進行研究。
體內模型系統現在已有各種各樣的多發性硬化症的體內及體外實驗模型。大多數體內模型與經典的MS及實驗性變應性腦脊髓炎(EAE)動物模型有關。對這種模型也作了許多改進，運用到各種哺乳動物上，其中包括小鼠、大鼠以及靈長類動物(綜述見Petry等，2000)。另外，模擬MS病毒組分動物模型的方法學已經建立，如MS的致腦炎Teiler鼠病毒模型(Dal Canto等，1995)。
研究CNS或PNS髓鞘化的專用動物模型是不常見的。這些模型已被證明可用於觀察髓鞘化的發育過程以便了解其中的少突膠質細胞或施萬細胞的分化、遷移以及增殖機制，就是所謂的「重演假說」(Franklin和Hinks，1999)。但是要比較CNS或PNS形成過程中發生的髓鞘發育和成年後發生的髓鞘再生就需要製備能特異地觀察髓鞘再生過程的動物模型。
Cuprizone模型最著名的並且是應用最廣泛的一種髓鞘再生模型是小鼠的Cuprizone髓鞘再生模型。其中包括口服給予一種有機化合物Cuprizone，這是一種對少突膠質細胞有選擇性毒性的銅鰲合劑(Morell E T，1998)。
Cuprizone處理小鼠的胼胝體會出現脫髓鞘化和髓鞘再生現象。這些病理學變化可以通過抗-CNPase抗體和MBP抗體染色觀察到。髓磷脂可以用Luxol Fast Blue-高碘酸Schiff(LFB-PAS)染色。能使髓鞘再生的少突膠質細胞前體細胞可以通過PDGFα受體或NG2的抗體染色來觀察。
給予小鼠3-5周的Cuprizone就可以導致小鼠胼胝體出現廣泛的脫髓鞘現象。Cuprizone給藥3周後，與脫髓鞘現象相伴隨的是髓磷脂特異性基因轉錄子的合成增加(Morell等，1998)。
停止給予Cuprizone能創造一個有利於恢復的環境，因此停止Cuprizone給藥6周後，小鼠的胼胝體出現廣泛的髓鞘再生現象。因而Cuprizone模型提供了一個完整的研究脫髓鞘和髓鞘再生的體內模型。其優點在於CNS組織內無T細胞侵潤，因此可以比較專一地研究髓鞘化過程，並且結果的重複性較好(Hiremath等，1998)。
Cuprizone處理的小鼠用C57BU6雌性鼠(8周齡，20±3g)，共分為6組，每組6隻。
第1組對照組，餵養正常的粉狀飼料；第2組餵養3周的含0.2％Cuprizone的粉狀飼料(Cup3w)；第3組餵養5周的含0.2％Cuprizone的粉狀飼料(Cup3w)；第4組餵養5周的含0.2％Cuprizone的粉狀飼料，然後餵養1周的正常粉狀飼料(1wR)；第5組餵養5周的含0.2％Cuprizone的粉狀飼料，然後餵養3周的正常粉狀飼料(3wR)；第6組餵養5周的含0.2％Cuprizone的粉狀飼料，然後餵養6周的正常粉狀飼料(6wR)；在預定的處理時間結束時收集每組動物的腦組織。小鼠首先被麻醉後通過左側腦室灌注。取腦組織後在胼胝體-紋狀核(紋狀體)及海馬回水平上製作一系列的皮質切片。腦組織切片用石蠟包埋進行免疫組化檢測和原位雜交。
組織學組織的製備1個體積的甲醛(Fluka，36％p.a.)和1個體積的無菌PBS用8個體積的無菌水稀釋製備成福馬林溶液。將10ml PBS加入到蠕動泵能適用的能安裝20G、1-1/5針頭的矽管內，然後連續地加入40ml福馬林，小心加入以避免形成氣泡。
在賁門內灌注固定劑以便進行隨後的器官和組織的組織學分析前，用無菌PBS1∶1稀釋的濃度為3mg/100ml的戊巴比妥鈉(Sanofi)麻醉動物。每隻鼠腹膜內注射0.05ml(0.75mg/kg)。一旦動物出現昏睡就用針頭(25G 5/8needles)穿過皮膚將動物的四肢固定在泡沫聚苯乙烯板上。用酒精清潔每隻動物的腹部，用無菌剪在外皮的水平上切開皮膚。然後向右側和左側進一步切開。用一副鑷子提起外皮，切開對角以露出腹膜，在與切口垂直的方向上再向兩側切開以暴露胸腔正中跳動的心臟。用鑷子提起心臟，立刻切開右心房，讓血液流出。讓10ml PBS和40ml福馬林循環流過每隻小鼠。每隻動物的腦和脊髓小心取下後放置到裝有10ml福馬林溶液的50ml矽管中浸泡2小時。然後用10ml無菌PBS替換福馬林溶液，置於4℃過夜。然後再更換PBS溶液置於4℃數小時。
腦半球和脊髓切成約0.5cm切片，置於包埋機配套的塑料盒中。腦和脊髓的石蠟包埋用自動的Tissue Tek Vacuum Infiltration Processor E150/E300(MilesInc.Diagnostics)按照下列程序進行50％乙醇中30分鐘70％乙醇中60分鐘60％乙醇中60分鐘80％乙醇中60分鐘80％乙醇中90分鐘96％乙醇中30分鐘96％乙醇中90分鐘96％乙醇中120分鐘100％二甲苯30分鐘100％二甲苯60分鐘石蠟中孵育4次，每次60分鐘，最後一次用於包埋。
所有的溶液都維持在40℃，石蠟維持在65℃。一旦組織切片準備好，就將腦和脊髓的切片按照預定的方位放置到製備石蠟包埋塊的塑料盒內。導入石蠟液體，置於冷卻板上使其快速冷卻到0℃。石蠟塊在切片機上切成5-10μm的切片。然後將切片放置到矽烷處理的玻璃載玻片上(SuperFrost-PlusTM，Menzelcat.no.041300)。切片放置好以後將載玻片置於無塵的環境中。
細胞培養Oli-neu鼠少突膠質細胞系(Oli-neu)細胞通過離心富集，然後重懸於Sato培養液中(Trotter等，1989)。細胞在75ml培養瓶中置於37℃、5％CO2環境下培養。在細胞培養液中直接加入1mM dbcAMP使其分化。用Trizol試劑提取RNA(見下)。
RNA提取用Trizol提取試劑盒(Life Technologies AG，巴塞爾，瑞士)從cuprizone處理的鼠腦切片及不同發育階段的出生後小鼠的全腦中提取總RNA。然後用QiagenOligotexTMcolumns(QIAGEN Inc.，28159 Stanford Avenue，Valencia，CA 91355，USA)從總RNA樣品中製備多聚(A)+RNA。
利用cDNA晶片進行DGE分析晶片實驗是在Incyte Genomics(Incyte Genomics Inc.，3160 Porter Drive，Palo A1to，California 94304，USA)進行的。利用Incyte的鼠GEMTM1基因表達晶片進行DGE分析(http//www.incyte.com/reagents/gem/products.shtml).
用於這些分析實驗的Incyte晶片加載了8734個基因的相應cDNA分子，包括已知的和未知的(EST序列)。Incyte的技術可以使每種基因的微量樣品點到一個晶片上。已知基因或EST相應的每一種cDNA分子的長度為500-500bp。Incyte的說明書給出的一個樣品中每種mRNA的動態檢測範圍為2-2000pg。每次晶片實驗所需要的RNA量為600ng多聚(A)+RNA。可檢測的差異表達水平是比例大於1.75。
信號的標準化和表達水平的確定兩種螢光強度的比例定量地提供了被分析的兩個細胞樣品內相關基因的表達水平。每種基因的比例是在標準化表達水平的基礎上計算出來的。標準化係數是通過將第二個樣品(P2)的總表達量除以第一個樣品(P1)而得到的。這個係數可被用於計算P2中每個基因的表達水平。一旦經過標準化步驟，基因比例就可以按照下列規則來計算E1代表樣品1中給定基因的表達水平，E2代表樣品2中同一基因的標準化表達水平；如果E2＞E1，則比例＝E2/E1，否則比例＝-E1/E2。
由於樣品的雜交是競爭性的同時進行的，因此Incyte晶片技術在確定表達量的相對變化方面是比較精確的，但在測量絕對表達水平方面就不太可信。然而，可以用這些表達水平值來比較樣品RNA群體對，這些樣品RNA群體實際上沒有在晶片上進行比較。這種原位比較不十分可信，但它們可提供額外的機制信息，這些信息可用於被測定的系統。
結果用於分析骨橋蛋白不同表達水平的模型表IV所列的是各種模型，用於如上所述的mRNA提取和晶片雜交(DGE分析)。
表IV用於DGE分析的模型
DGE陽性對照髓磷脂特異性基因的調節作為陽性對照，如果髓磷脂特異性基因的不同調節能用DGE來分析則首先檢測它。
表V所列的是Incyte晶片上髓磷脂特異性基因的調節。每個基因的不同表達水平值都是cuprizone治療3周和5周後得到的。這個數據是陽性對照以證明晶片的可靠性。由於在我們的實驗條件下髓磷脂結構基因的調節是已被很好特徵化的，因此在晶片上所觀察到的這些基因的表達可用於說明，a)該技術的準確度，和b)我們模型的可重複性。
表V基因晶片分析髓磷脂體內模型中髓磷脂特異性基因在體內的調節。
*出生後2/10天的小腦上表顯示的是某些髓磷脂特異性基因是如何被調節的，所用的分析方法是RNA基因晶片，所用的RNA來源於不同的研究脫髓鞘、髓鞘再生以及髓鞘發育體內動物模型。這些髓磷脂特異性基因表達的變化說明可以利用基因晶片技術在轉錄調節水平研究髓鞘化過程。
Cuprizone處理3周後在鼠腦內的特定區域可以觀察到脫髓鞘效應。因此在3周的時候預計可以檢測到與髓磷脂合成和/或髓磷脂維持相關的各種基因的下調表達。通過基因晶片分析所觀察到的髓磷脂特異性基因表達的下調可以作為本實驗系統精確度和可靠性的確證。表V中的數據表明，與對照組相比，cuprizone處理3周後在mRNA水平上MBP表達下調13.6倍，環核苷酸磷酸二酯酶1(CNPase)表達下調2.9倍。但是cuprizone處理5周後這兩個基因RNA水平的表達只比正常水平分別低1.3倍和1.1倍，說明生物系統在試圖通過促進髓磷脂結構蛋白的合成來建立髓鞘再生機制。
骨橋蛋白的不同變化通過晶片分析，cuprizone處理3周時骨橋蛋白上調2.2倍，處理5周時骨橋蛋白上調2.8倍。
實施例2通過實時定量反轉錄酶(RT)-PCR分析(TagMan)確證骨橋蛋白基因的不同表達水平方法cDNA模板的製備TagMam分析所用的cDNA模板是用TagMan反轉錄試劑(P/N N808-0234)通過反轉錄(RT)反應從總RNA樣品中製備的。所有的RT反應都在100μl體系中進行，該體系含有10μl TagMan RT緩衝液，22μl 25mM的MgCl2溶液(5.5mM)，20μl脫氧核苷三磷酸混合物(每種dNTP 500μM)，5μl隨機引物(2.5μM)，2μlRNA酶抑制劑(0.4U/μl)，2.5μl MultiScribeTM反轉錄酶(1.25U/μl)和38.5μl溶於無RNA酶水中的RNA樣品(共1μg)。反應在Eppendorf MasterCycler上進行，反應條件為25℃10分鐘(孵育步驟)，48C30分鐘(反轉錄)，以及95℃5分鐘(滅活步驟)。所有合成的cDNA都分裝成20μl的體積儲存在-20℃條件下。
引物的設計和確證所有要檢測的基因和GAPDH基因(對照的看家基因)的SYBR Green Real Time PCR正向和反向引物都是用PE Biosystems的Primer Express軟體根據所發表的序列設計的，從Interactiva(InteractivaThe Virtual Laboratory，Sedanstrasse 10，D-89077Ulm)定購，濃度為0.02μM。每一引物對的特異性及最佳濃度都經過了驗證。基因組DNA的潛在汙染通過PCR反應監測，該PCR反應所用的模板為在無RT酶的條件下進行反轉錄反應得到的陰性對照cDNA樣品。是否存在非特異性的擴增是通過在3.5％MetaPhor凝膠或預成形的NuSieve4％凝膠上進行PCR產物的凝膠電泳確定的。
上表所顯示的是基因特異性引物的序列，這些引物用於TagMan分析來確證那些經晶片檢測發現其表達出現變化的基因表達水平。該表還列出了每一引物對相應的基因名稱及用Primer Express軟體涉及每對引物時所依據的序列的GenBank序列號。
表VI用於RT-PCR分析的引物
TagMan反應SYBR Green Real-Time PCR反應體系如下每孔5μl RT產物(0.5ng總RNA)，25μl SYBR Green PCR主混合物(master mix)(Applied Biosystems，CA，USA)和AmpErase Uracil N-糖基化酶(UNG)(0.5U/孔)和20μl引物(300nM)。PCR反應條件是50℃2分鐘(AmpErase UNG孵育以消除任何由於去除前面TagMan循環中產生的PCR產物中摻入的尿嘧啶而造成的汙染)，95℃10分鐘(AmpliTag Gold活化)。然後將樣品放入ABI PRISM7700序列檢測系統(Sequence Detection System)中，運行40個循環，條件是95℃15秒，60℃1分鐘。反轉錄初的cDNA樣品進行擴增並確定其CT(閾循環)值。所有的CT值都用看家基因GADPH進行標準化。如果可能，樣品應設2個復孔或3個復孔以檢測結果的可重複性。通過電泳分析可以看到所有的待測基因和GADPH都是單一的特異性條帶。
通過循環閾值(CR)計算基因表達的變化利用SYBR Green PCR主混合物進行實時檢測原理的基礎在於直接測量SYBRGreen染料與雙鏈DNA結合而產生的螢光強度的增加值。這就可以根據PCR產物增加曲線來定量地計算出基因特異性擴增產物的相對增加量。
某種特定cDNA相對於對照樣品的定量是根據該特異性基因的mRNA所轉錄出的cDNA相對於作為生理參考的校正樣品的量來計算的。校正值是從對照或未處理樣品中得到的。某種特定cDNA的相對量是通過與內源性對照(本例中是GADPH)相比後進行標準化而得到的，並且考慮到各種因素的變化，如用於製備模板cDNA的總RNA的初始濃度和質量，以及反轉錄反應的轉化效率。相對值的計算方法如下取各個樣品進行複製反應時的平均CT值計算出靶樣品與內源性對照樣品之間平均CT值的差值(CT)，靶基因的CT減去靶基因校正子的平均CT就得到CT，最後，靶基因的相對值就用2-CT表示，以代表基因表達上調或下調的水平。
TagMan反應中螢光信號的標準化SYBR Green-雙鏈DNA複合物螢光信號是通與被動參照或不含模板DNA的陰性對照反應比較而標準化的。實驗組反應中SYBR Green-雙鏈DNA複合物所發射的螢光強度除以被動參照組所發射的螢光強度而標準化的。這樣就得到了反應的Rn比率(標準化報告因子)Rn+＝含有包括模板DNA在內的所有組分的反應的Rn值Rn-＝未反應樣品(不包括模板DNA在內)Rn值Rn＝(Rn+)-(Rn-)，其中Rn+＝(SYBR Green-雙鏈DNA複合物所發射的螢光強度)/含有模板的PCR(被動參照組所發射的螢光強度)Rn-＝(SYBR Green-雙鏈DNA複合物所發射的螢光強度)/無模板的PCR(被動參照組所發射的螢光強度)從循環閾值(CT)計算調節的倍數Rn代表了在一組給定PCR條件下進行特異性反應所產生的信號強度。循環閾值這個參數表示一個基因特異性擴增產物的相對增加值，代表了該基因的特異性轉錄子在試驗組cDNA群中豐度。它代表了一個固定的循環點，在這點上可以最先檢測到Rn出現統計學意義上的顯著升高。閾值定義為早期循環的Rn的平均標準差，再乘以校正因子。循環閾值這個參數可被用於表示基因表達量的差異。每一個基因特異性增長曲線都有一個特異性的閾值，根據曲線上的點或循環就可以計算出來，在該點上可以檢測到螢光強度明顯升高到背景水平以上。
所有相對值的計算方法如下取各個樣品進行複製反應時的平均CT值計算出靶樣品與內源性對照樣品之間平均CT值的差值(CT)，靶基因的CT減去靶基因校正子的平均CT就得到CT，最後，靶基因的相對值就用2-CT表示，以代表基因表達上調或下調的水平。
結果實時定量反轉錄酶(RT)-PCR(TagMan)提供了一種靈敏而且可靠的確定和檢測基因表達變化的方法。TaqMan序列檢測器(ABI PRISM7700序列檢測系統，AppliedBiosystems，Foster City，CA)集成了PCR分析和硬體/軟體裝置，組成了一個高通量的核酸定量系統。它結合了熱循環、螢光檢測及程序特異性的軟體，使每一個循環中特異性PCR產物的增加量都能被檢測到。
通過晶片分析找到的幾個表達變化很大的基因用TagMan檢測平臺得到了進一步的驗證。在每一個案例中，所用模型系統的時間過程都被包括在內。這使我們可以收集到更多關於特異性基因在整個過程中的行為的數據利用TagMan系統可以定量地檢測基因表達的變化，該系統通過測定SYBRGreen染料與雙鏈DNA結合後產生的螢光直接檢測PCR產物的增加量，這些雙鏈DNA代表了所要分析的基因的特異性擴增產物。某種特定cDNA相對於對照樣品的定量是根據該特異性基因的mRNA所轉錄出的cDNA相對於作為生理參考的校正樣品的量來計算的。校正值是從對照或未處理樣品中得到的。某種特定cDNA的相對量是通過與GADPH相比後進行標準化而得到的，並且考慮到各種因素的變化，如用於製備模板cDNA的總RNA的初始濃度和質量，以及反轉錄反應的轉化效率。
分泌型磷蛋白1(骨橋蛋白)基因表達的分析是在一個跨越脫髓鞘/髓鞘再生cuprizone模型的時間段內進行的。
Cuprizone髓鞘再生模型中骨橋蛋白表達的TagMan實驗結果如圖1(A)所示。Cuprizone處理3周(3w.Cup.)後鼠前腦內骨橋蛋白mRNA的表達水平上調18倍，處理5周(5w.Cup.)後上調25倍。
Cuprizone處理5周後分別停止1、3和6周(5w.cup.+1w，3w.和6w.)，骨橋蛋白的表達下調。這些結果說明骨橋蛋白在模型的脫髓鞘及髓鞘再生過程中發揮重要作用，因為脫髓鞘過程還在持續時髓鞘再生就已經開始了。
圖1(B)顯示的是孵育的小腦內骨橋蛋白的表達水平變化結果。出生後發育的早期，C4到C8天，是小腦髓鞘化的起始階段，骨橋蛋白的mRNA表達出現瞬時上調。
晶片分析結果表明cuprizone處理後鼠的前腦內骨橋蛋白的表達上調。這一結果進一步證實了cuprizone處理模型的脫髓鞘期和髓鞘再生期都有骨橋蛋白的表達，顯示cuprizone處理模型的脫髓鞘期骨橋蛋白的表達出現峰值，而在恢復期其表達又下降到接近基線水平。這些結果列在下面的表VII中。
TagMan分析結果證實了cuprizone餵養3周和5周的小鼠腦內骨橋蛋白的表達上調。
表VIIcuprizone處理模型中骨橋蛋白表達的TagMan分析結果
實施例3RNA印跡確證骨橋蛋白表達的變化方法雜交的準備利用鼠多組織Northern雜交實驗(Clontech Labs，1020 East Meadow Circle，Palo Alto CA)分析特定基因的組織表達特異性。每個泳道含2μg成年小鼠不同組織的多聚(A)+RNA。體內和體外基因表達的變化分別用不同的雜交實驗來分析。一組雜交都包括從cuprizone處理3周、5周以及處理後1周、3周和6周(最多達6周)的小鼠腦組織提取的RNA。第二組雜交包括出生後不同時間的小鼠全腦組織RNA。最後，從雙丁醯-cAMP處理不同時間的體外培養的Oli-neu細胞中提取RNA，這些RNA用於第三組雜交。用每種基因的特異性探針進行新的雜交以達到最大的檢測效率並且使雜交後不均勻洗滌造成結果變異達到最小。所有的雜交都進行兩次，首先與待測基因的探針雜交，洗滌後與鼠甘油醛-3-磷酸酯(mGADPH)的探針雜交以控制RNA上樣量的變化。
RNA(10μg/上樣孔)上樣到1.2％變性瓊脂糖凝膠上，該凝膠含有甲醛和5×MOPS(209.27g 3-(N-嗎啉代)-丙磺酸，20.5g醋酸鈉，50mL 0.5M EDTA pH 8.0，溶於5L無菌水中，然後用12M的NaOH將pH調節到7.0)。每種RNA樣品都和2μl溴化乙啶(0.01mg/ml)、2μl 5×3-(N-嗎啉代)-丙磺酸(MOPS)、3.5μl 37％甲醛和10μl甲醯胺混和。然後將樣品在65℃加熱10分鐘，迅速置於冰上。2μlRNA上樣緩衝液(50％甘油，1mM EDTA，0.4％溴酚藍和二甲苯藍)在上樣前立即加入到每個樣品中。
每個凝膠在1×MOPS電泳緩衝液(1L＝330ml 37％的甲醛，400ml 5×MOPS，270mlDEPC處理的水)中電泳約3小時，所用的電壓為5V cm-1(凝膠長度)。然後在SSC溶液(Terry Brown，UNIT 4.9，Current Protocols，1993[ed.F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith和K.Struhl])中過夜將RNA轉移到帶正電荷的尼龍膜上(HybondTM-N，Amersham Life Sciences，AmershamPlace，Little Chalfont，Buckinghamshire，England HP7 9NA)。通過在紫外燈下觀察膜和凝膠檢查RNA轉移的效率。RNA是通過Stratalinker(Stratagene，USA)與膜交聯的。雜交膜放在兩層Whatman 3MM濾紙中間置於室溫中直到進行下一步的雜交實驗。
探針的製備放射性同位素32P標記的探針是用凝膠純化的待測基因cDNA限制性酶切片段(約500～800bp)製備的。DNA片段用HighPrimeTM標記系統(Roche Diagnostics AG，Industriestraβe 7，6343 Rotkreuz，瑞士)進行32P-dCTP隨機標記，其特異性活性應＞109cpm ml-1。未摻入的32P-dCTP用含Sephadex G-25介質的Pharmacia NAP-5柱(含有0.15％KathonxCG/ICP Biocide的蒸餾水中的DNA等價)通過離心從探針混合物中去除。
雜交和信號檢測用ExpressHybTM(Clontech Labs，1020East Meadow Circle，Palo Alto CA)按照操作說明書進行探針雜交。雜交後將膜與HyperfilmTMMP(Amersham PharmaciaBiotech，England)壓在一起放到放射自顯影盒中-80℃曝光。將膜置於無菌H2O/5％SDS溶液中90-100℃孵育10分鐘然後使膜冷卻10分鐘來洗脫曝光後的探針。洗脫的膜用塑料薄膜封存，置於-20℃保存直到再次雜交。
結果Northern雜交分析以前就被作為一種輔助的確證技術用在大規模的基因表達差異研究中。(Chang等，2000)。其所具有的高敏感性和精確度使之不僅可用於分析給定基因在各種組織中表達的特異性，而且還可用於比較實驗組和對照組基因表達水平變化的幅度。這使其稱為確證基因晶片分析出的DGE結果的一種可靠方法。而且，Northern雜交技術還可以提供與轉錄子大小有關的信息及與可能出現的待測基因相應的選擇性剪切亞型有關的信息。
本發明中Northern雜交所用的RNA是從cuprizone處理鼠及對照鼠腦組織中提取的。這些RNA與放射性標記DNA片段雜交，該DNA片段是從Incyte Genomics提供給我們的克隆中製備的。Northern雜交技術重現TagMan分析所得到的結果的能力通過鼠骨橋蛋白的放射性標記探針與從cuprizone處理鼠的腦組織中分離出的RNA雜交得到證實。
通過這種方式，可以比較用Northern雜交分析及TagMan分析所得到的cuprizone模型中骨橋蛋白表達的結果。
圖3顯示的是插入到pT7T3D-Pac載體中的鼠骨橋蛋白基因的開放閱讀框架，該載體是從Incyte Genomics定購的。灰色區代表編碼區，箭頭代表骨橋蛋白的完整cDNA序列。克隆片段插入到EcoRI和NotI限制性酶切位點之間。用HincII和StyI限制性內切酶消化該載體切下一個893bp的片段製備雜交用的探針以分析該基因在組織中的表達情況。這個片段經過凝膠純化，標記後用作探針。
鼠骨橋蛋白的表達通過Northern雜交進行檢測，雜交所用的RNA來自cuprizone處理鼠模型各個階段的腦組織，其中包括恢復期的和未處理對照組腦組織。首先用鼠骨橋蛋白cDNA的放射性標記片段作為探針進行雜交，雜交膜曝光後洗滌，然後用鼠GADPH的放射性標記片段作為談政再次雜交。這個雜交作為陽性對照來說明所觀察到的表達差異變化基於印跡上各個泳道中RNA的總量。
Cuprizone處理鼠腦組織中骨橋蛋白的表達在處理後3周和5周達到高峰，其中5周時表達更高一些。在恢復期，骨橋蛋白mRNA表達水平快速下降，在停止cuprizone處理1周後出現明顯減少。在6周後骨橋蛋白mRNA的水平恢復到接近正常水平。這個結果與用TaqMan分析所得到的cuprizone處理模型中骨橋蛋白表達水平結果(見圖1A)實質一致。
實施例4Oli-neu細胞中骨橋蛋白表達的變化。
用TaqMan分析來檢測cAMP處理的少突膠質細胞(Oli-neu)中骨橋蛋白的表達情況。結果顯示在圖4中。柱1到柱4代表了少突膠質細胞內的結果。與對照組(值＝1)相比，cAMP處理6小時(柱1)就會導致骨橋蛋白mRNA表達水平的上調。cAMP處理2天(柱2)，表達上調12倍。延長處理6天到10天(柱3和柱4)確導致骨橋蛋白mRNA的低水平表達。通過與cuprizone模型中骨橋蛋白mRNA表達水平(柱5和柱6)的比較發現cuprizone處理3周和5周後前腦內骨橋蛋白的表達水平與cAMP處理2天後少突膠質細胞內的骨橋蛋白表達水平相似。
實施例5骨橋蛋白在少突膠質細胞內的表達方法Oli-neu細胞用磷酸鈣沉澱法瞬時轉染。主要過程是在轉染前一天將處於指數生長期的oli-neu細胞接種到6孔培養板上(105個細胞/孔)。將100μl 250mM的CaCl2溶液與5μg質粒DNA混和。將等量的(100μl)添加磷酸鹽(從300mM的pH＝7.05的Na2HPO4和NaH2PO4儲存液中稀釋得到的)的2×HEPES溶液(140mM NaCl，50mM HEPES，pH7.05)加到上述Ca/DNA溶液中。1分鐘後，將混合物緩慢加入培養板內，在37℃的CO2培養箱內孵育4小時。然後用新鮮的培養基替換轉染液，細胞繼續孵育24-72小時，然後收穫細胞用於Western雜交分析。
結果插入到pDEST12.2載體中的不同鼠橋接素基因構建體(pDEST12.2-骨橋蛋白-EGFP，pDEST12.2-骨橋蛋白-His6，pDEST12.2-骨橋蛋白，見圖4-7，和空白載體pCIE-EGFP)轉染到oli-neu細胞中。帶有EGFP尾巴的構建體使監測更容易，轉染24小時後，與轉染pCIE-EGFP的對照組細胞相比，轉染細胞的形態出現特異性變化(少突膠質細胞突起增加)，這說明骨橋蛋白誘導鼠少突膠質細胞株oli-neu向更成熟的形態變化。骨橋蛋白轉染oli-neu細胞的形態與髓磷脂形成細胞少突膠質細胞的形態十分相似。
這些結果證明骨橋蛋白在少突膠質細胞內的表達有助於細胞向髓鞘化的方向發育，因而提示骨橋蛋白在治療與少突膠質細胞功能喪失有關的疾病時具有積極的效果。
實施例6cuprizone模型中腦內特定區域的骨橋蛋白表達水平取cuprizone處理模型脫髓鞘及髓鞘再生期間各個時間點的腦組織進行免疫組織化學分析。結果發現cuprizone處理5周後在脫髓鞘的胼胝體和紋狀體區域出現強信號，在這個時間點上脫髓鞘區域內會出現明顯的小膠質細胞再生。為了觀察活化的小膠質細胞，在一個連續的區域內進行CD68染色，結果發現同樣的表達模式，說明骨橋蛋白在小膠質細胞內有表達。
令人感興趣的是在前腦室上分布的細胞內也有骨橋蛋白的表達。這個區域被稱為成年亞腦室區，含有能分化成神經元、星型膠質細胞和少突膠質細胞的多潛能幹細胞。用NG2、PSA-NCAM、PDGFα受體雙染色來觀察少突膠質細胞前體細胞內骨橋蛋白的表達。
實施例7骨橋蛋白蛋白對少突膠質細胞增殖的影響用t-neu癌基因進行永生化處理的鼠初級少突膠質細胞系(Oli-neu細胞系)用於本實驗。Oli-neu細胞系的建立、特性及培養條件參見Jung等(1995)的描述。
本實驗的目的在於用oli-neu細胞增殖實驗分析OPN對少突膠質細胞增殖的影響。將細胞接種到培養板上。在用對照蛋白或重組蛋白處理前加入無胰島素的培養液使細胞飢餓24小時。根據Alamar藍染色後所發出的螢光估計細胞數目。增加值的計算是基於和IGF1(對照)標準曲線的比較。增殖抑制率的計算是基於與dbcAMP標準曲線的比較。
材料儀器設備和軟體Wallac Victor 2多標記計數器(激發波長530-560nm，發射波長590nm)Graph Pad Prism軟體試劑oli-neu細胞系(Eur J Neuro 7125-1265(1995))Alamar藍(Biosourcelntl.Inc.，Camarillo，CA93012)Sato培養液的成分如下
BioCoat平底板分別用多聚D賴氨酸(356461，Becton Dickinson)；、R3-IGF1(11146，Sigma)；DbcAMP(D-0627，Sigma)包被。
方法用於體外生物分析的細胞的培養oli-neu細胞是能在多聚L賴氨酸基質上生長的粘附細胞。將細胞接種到BioCoatTM多聚賴氨酸預包被96孔板上。細胞每周傳代2-3次。為了傳代，先用PBS洗滌細胞，然後用PBS加上1mM EDTA使細胞分離。細胞在溼潤的10％CO2孵箱中培養。
所用的凍存液是含20％FCS和10％DMSO的Sato培養基。本實驗中所用的oli-neu細胞傳代不超過16代。所用細胞的終濃度為96孔板中每孔加入4000個細胞，用無胰島素的Sato培養基培養使之飢餓24小時。
Alamar藍染色在CO2孵箱中孵育48小時後，每孔中加入10μl Alamar藍，繼續孵育2.5小時。在530-560nm激發波長和590nm反射波長下監測其螢光強度。培養板最多可在4小時時讀數，最大讀數可達1000000相對螢光單位。
實驗設計作為對照的是100ng/ml R3-IGF-1(陽性對照)、1mM dbcAMP(陰性對照)、無胰島素的培養液、或100nM煮沸滅活的OPN。實驗樣品分別為1nM，10pM，0.1pM，0.01pM or 100nM的重組骨橋蛋白。對照樣品和實驗樣品都用無胰島素的Sato培養基稀釋成期望濃度的終體積為50μl的液體然後加入到孔中。Oli-neu細胞在無胰島素的培養基終生長24小時，然後用PBS加1mM EDTA消化收穫細胞。將細胞稀釋到300000/ml，每孔加50μl。然後在37℃溼潤CO2孵箱中培養48小時。加入10μl Alamar藍，然後再放入孵箱中培養2.5小時。每孔取70μl轉移到黑色96孔板中，立刻測定螢光強度。
加入不同劑量的骨橋蛋白後24小時測定未分化的oli-neu細胞的增殖情況，所加入的骨橋蛋白是用昆蟲細胞(BacOPN)或哺乳動物表達系統(HEK OPN)製備的。用螢光生長測定/比色生長測定指示劑，Alamar藍測定細胞的代謝活性來量化細胞的生長率。該指示劑含有一種氧化-還原指示劑，當細胞生長使培養基化學分解時可以出現螢光及顏色變化。該試劑及實驗方法見Ahmed等(1994)和美國專利5,501,959中的描述。
結果結果顯示在圖8到圖10中。
杆狀病毒和HEK細胞表達的重組骨橋蛋白都表現出劑量效應。將蛋白煮沸降解後會如預期的那樣破壞其生物學活性。加入杆狀病毒表達的骨橋蛋白(BacOPN)和HEK細胞表達的OPN(HEK OPN)都會導致細胞出現劑量依賴性的增殖(圖8)，BacOPN的IC50為3.7nM，HekOPN的IC50為0.05nM(圖9)。另外，具有1-168位胺基酸的OPN亞型a的N末端OPN構建體(見圖2，N-term.OPN-a)也可以在昆蟲細胞中表達。用增殖實驗將純化出的蛋白與全長蛋白作了比較。這種截短的蛋白也是有活性的(10nM，100nM)，見圖10。
實施例8骨橋蛋白對混和皮質培養物中髓鞘化標記物表達的影響在蓋玻片上生長的混和皮質培養物用Bac OPN(100nM)處理12天，從DIV(體外培養天數)的5天開始到17天結束。在體外培養的第17天，將培養物固定，然後用抗MBP抗體染色。結果表明BacOPN蓋玻片與對照相比具有更多的高度分支的MBP陽性少突膠質細胞(圖11)。另外，雖然在對照培養物中(圖11A)沒有看到髓鞘化的少突膠質細胞，但OPN處理的培養物(圖B、C和D)中富含少突膠質細胞，這些細胞包裹在軸突周圍，形成髓磷脂片段和結間段(圖11B和D)。通過對片段簇計數發現對照組沒有片段出現，而三個不同OPN劑量處理組出現16，22和18個片段簇。這些結果說明骨橋蛋白處理皮質混和細胞可以使少突膠質細胞出現分化表型，這些表型使髓磷脂化少突膠質細胞的特徵。
實施例9MBP ELISA檢測骨橋蛋白對混和皮質培養物中MBP表達的影響MBP ELISA方法用於監測OPN和LIF處理的混和皮質培養物中MBP蛋白表達的增加及因此而產生的髓鞘化。
初級培養材料來源於小鼠胚胎腦組織，這些胚胎是從交配後16天的懷孕NMR1雌性小鼠中分離的。按照Lubetzki等的方法剪開胚胎，用胰蛋白酶消化皮質分離出細胞(包括神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞和神經元前體細胞)，然後將細胞接種到多聚L賴氨酸包被的96孔培養板中，每孔加入105個細胞，體積為50μl。
重組蛋白處理處理所用的是重組蛋白(陽性對照，重組鼠白細胞抑制因子(LIF)購自AMRAD實驗室，濃度分別為1μg/ml、100ng/ml和10ng/ml；杆狀病毒表達的全長骨橋蛋白，濃度分別為100nM、10nM和10pM)。所有的蛋白質在加到細胞培養物前都用培養液稀釋到適當濃度。培養物在體外生長5天然後處理17天。每3天更換一次培養液。
從微孔板上收穫細胞樣品的操作方法在體外培養17天(DIV17)後將細胞裂解並收集樣品。細胞裂解所用的試劑為三倍去汙劑緩衝液。
三倍去汙劑緩衝液終濃度50ml Tris pH 8.01M50mM8.77g NaCl150mM2ml NaN3(10％) 0.02％5ml SDS 20％ 0.1％10ml NP40 1％5g去氧膽酸鈉 0.5％在使用前將一粒蛋白酶抑制劑(Roche no.1836170)加到三倍去汙劑緩衝液中。
將已接種到96孔預包被培養板中的混和皮質培養物的培養基去除。細胞用50μl1×PBS溫和洗滌兩次，然後每孔中加入50μl三倍去汙劑緩衝液。所有含裂解樣品的微孔板都儲存於-20℃直到進行下一步的分析。
BCA蛋白質測定Pierce BCA蛋白質測定是一種基於二金雞鈉酸(BCA)的通過比色法檢測和定量總蛋白質的去汙劑相容性分析方法。該方法結合了已知的鹼性介質中蛋白質對Cu+2到Cu+1的還原作用和利用含二金雞鈉酸的獨特試劑高敏感性高選擇性地比色檢測一價銅陽離子(Cu+1)。
本分析方法中紫色反應產物是通過BCA與一價銅離子兩個分子的鰲合作用形成的。這個水溶性的複合物在562nm處有很強的吸收，並且在20μg/ml到2000μg/ml之間蛋白濃度與吸光度值成良好的線性關係。BCA方法不是一種真正的端點方法一最終顏色繼續加深，但是隨著孵育時間的延長，顏色深度變化速度放緩到足以在一輪反應中完成大量樣品的測定。據報導，蛋白質的大分子結構、肽鍵的數目以及四種胺基酸的存在(半胱氨酸、半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸)對與BCA形成的顏色有影響。
微孔板法確定總蛋白含量標準品(BSA濃度2000μg/ml、1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、25μg/ml)和樣品各取25μl加入到微孔板的適當孔中。空白孔中加入25μl稀釋劑(三倍去汙劑緩衝液)(工作範圍20-2000μg/ml)。
200μl工作試劑(50份BCA試劑A和1份BCA試劑B的混合物)加入到每個孔中。微孔板振蕩30秒，37℃孵育30分鐘。孵育結束後測定570nm處的吸光度值。
MBP夾心ELISA96孔平底無菌微孔板(Costar)與1×PBS 1∶5000稀釋的抗MBP抗體(Chemicon，MAB5274)在4℃孵育過夜。每孔中加入50μl稀釋的抗體。
第二天，將微孔板所有孔中的抗體溶液去除，每孔中加入50μl用1×PBS稀釋的1％BSA溶液進行封閉。在室溫下封閉1小時。封閉結束後用PBS/Tween機械洗滌3次。
用1％BSA/PBS稀釋樣品和一系列濃度的MBP肽標準品，加入到微孔板中進行孵育。100ng/ml的MBP肽儲存液進行倍比稀釋。本實驗所用的稀釋度是根據BCA蛋白質測定結果計算出總蛋白含量後確定的。其含量如下100μg；50μg；25μg；12.5μg；6.2μg；3.1μg.
與MBP標準品和蛋白樣品孵育後，微孔板再用1％BSA/PBS洗滌3次。1％BA/PBS稀釋的抗MBP多克隆抗體與微孔板在室溫下進行2小時的第二次孵育。孵育後再將微孔板用上述的方法洗滌3次。
將羊抗兔生物素(Vector BA-1000，1∶10000)用1％BSA/PBS稀釋，然後每孔中加入50μl，室溫下孵育1小時。孵育後再將微孔板用上述的方法洗滌3次。
最後一步孵育是用50μl 1×PBS稀釋的鏈親和素連接的辣根過氧化物酶(strep-HRP)(Amersham RPN 1051，1∶8000)。微孔板在室溫下孵育1小時。
經過洗滌後，加入鄰苯二胺二鹽酸(0PD)(Sigma，將1粒溶解到20ml水中配製成的溶液)開始反應。通過加入3M HCl或30％H2SO4終止反應。用多掃描螢光板閱讀器(multi-scan fluoroplate reader)(Labsystems Multiskan EX)測定492nm處的光密度值。
結果如圖12所示，與對照組相比，DIV17時bac0PN(10nM)處理的培養物中MBP蛋白的水平增高3倍。這一結果支持前面所得到的杆狀病毒表達的OPN對少突膠質細胞前體細胞的增殖和髓鞘化具有促進效應的結果。
實施例10骨橋蛋白對CG4細胞增殖的影響CG4是一種永生化的大鼠少突膠質細胞系，該細胞系是從初級A2B5少突膠質細胞前體細胞自然演變而成的。CG4細胞是一種研究少突膠質細胞分化或存活的常用細胞系。它具有下列特徵●如少突膠質細胞祖細胞(O2A-樣)一樣具有高增殖活性(GD3、A2B5陽性細胞)；●在條件培養基(含有有效濃度的生長因子)中培養費用低，條件培養基來自於ATCC的B104大鼠神經母細胞瘤細胞系(Louis J.C.等，1992)。
●短期內的增殖實驗用確定成分的培養基(不含FBS)(添加FGF2+PDGF)代替B104條件培養基；●在確定成分的培養基中可以被誘導分化成少突膠質細胞(O4，GalC陽性)；●培養基中存在存在FBS時被誘導分化成星形膠質細胞(GFAP陽性)。
傳到35代的CG4細胞用於測定兩種骨橋蛋白(大腸桿菌表達的和昆蟲細胞表達的)對其增殖的影響。RD系統的大腸桿菌表達的骨橋蛋白(Cat.441-OP)用於本實驗，在體外用蛋白激酶2(GST融合的)將其磷酸化，60μl的反應反應體系含有下列成分激酶緩衝液6×Hepes 50mMMgCl210mMDTT 1mM
釩酸鈉0.2Mmβ磷酸甘油25mM樣品緩衝液2×pH6Tris-Cl 0.125甘油20％DTT 0.2M溴酚藍0.02％ATP混合物(60μM)30μl 600μM的ATP5μl32pATP265μl H2O2加入ATP混合物以啟動反應，在37℃孵育1小時。在30℃孵育(加攪拌)90分鐘後將100μl穀胱甘肽瓊脂糖顆粒(Pharmacia)加入到反應混和液中，在加入前先有PBS洗滌反應混和液以去除蛋白激酶。然後將混合物在室溫下溫和振蕩孵育1小時。懸液500g離心5分鐘將瓊脂糖顆粒沉澱下來。然後用PBS在4℃將上清液透析過夜。蛋白用BCA(Pierce)定量。
激酶反應10μl酪蛋白激酶0.05μg/μl10μl大腸桿菌OPN 0.5μg/μl20μl 50mM Tris-Cl pH810μl激酶緩衝液6×10μl ATP混合物增殖實驗檢測10pM、10nM、100nM的Bac OPN和體外磷酸化的OPN蛋白對CG4細胞的增殖作用。如Avellana等(1996)所描述的用BrdU(Amersham)作為讀出器。細胞培養液分別用70％N1確定成分的培養基(DMEM，含有4.5g/1葡萄糖，2mM谷胺醯胺，100U/ml青黴素，100pg/ml鏈黴素和1mM丙酮酸鈉，並添加5pg/ml運鐵蛋白，100mM四甲烯二胺，30nM亞硒酸鈉和10ng/ml生物素)和30％B104條件培養基(無生物素的N1)(Louis J.C.等，1992)。實驗在多聚鳥氨酸(100μg/ml)處理的24孔板上進行，每孔加入3×104個細胞。同時加入10nM BrdU，然後孵育18小時。固定後用抗BrdU抗體進行免疫組化檢測以觀察細胞的分裂情況。細胞液可用Hoechst44432(Sigma)染色以計數總的細胞數目。照相後用Leica QWin圖象分析系統分析所得到的照片。
結果結果描述在圖13中。
杆狀病毒表達的骨橋蛋白可以使CG4細胞的增殖能力提高。儘管100nM的OPN也可以使細胞增殖，但最大效應出現在OPN為10nM時。經過體外的磷酸化，大腸桿菌表達的OPN也可以使CG4細胞出現微小的增殖。
將OPN處理的CG4細胞形態與未處理的做了比較，結果發現OPN處理的細胞大部分都出現的分化，而未處理的細胞沒有觀察到分化現象。用杆狀病毒表達的OPN處理細胞的分化現象更明顯，而經體外磷酸化的大腸桿菌OPN也可以使CG4細胞出現分化(數據未顯示)。
實施例11骨橋蛋白在MOG誘導的實驗性自身免疫腦脊髓炎小鼠模型上的效應實驗目的骨橋蛋白(OPN；AS900011)是一種具有多種功能的細胞因子，其中包括對各種類型細胞的黏附、遷移、分化、存活及細胞因子分泌的調節。利用差異基因表達技術對OPN進行檢測發現其具有調節髓鞘再生和少突膠質細胞功能的效應(見實施例1)。重組的杆狀病毒表達的OPN(AS900011)可以劑量依賴的方式促進少突膠質細胞前體細胞的增殖(IC503.7pM，見實施例7)。另外，AS900011還具有使CG4細胞和初級神經球分化的作用(見實施例8)。Cuprizone處理鼠腦部脫髓鞘的胼胝體區域有OPN的表達，其中小膠質細胞上表達最強(見實施例1)。另外，在亞腦室區(SVZ)也觀察到了OPN的表達，以前的研究已經證實這一區域能產生參與髓鞘化的少突膠質細胞前體細胞(見實施例4)。從這些結果中可以推測出具有多種免疫調節功能的細胞因子骨橋蛋白也有調節神經元和神經膠質細胞功能的作用。
本實驗的目的在於檢測OPN對MOG誘導EAE小鼠模型的治療效果。
試驗方法用於本實驗的誘導EAE模型的方法在Sahrbacher等(1998)描述的說明書中已經被採用。對本實驗動物的保護是按照Italian D.L.於1992年1月27日頒布的86/609/EEC第116號管理規程執行的。動物飼養的場地和設備是按照EEC委員會86/609管理規程設置的。研究所是被Competent Veterinary Health Authorities授權的。本說明書涉及動物的所有部分已被官方獸醫批准。本說明書已被義大利衛生部授權(51/99-B號令)。
實驗系統動物種類，品系，亞系和性別來源於IFFA CREDO(Saint Germain sur I』Arbresle，France)的C57 BL6/JICO雌性小鼠，由Charles River Italia(Calco，Lecco，Italy)提供。
選擇本實驗系統的理由C57 BU6/JICO小鼠選為實驗模型；該品系小鼠已被文獻證實對EAE敏感。
動物提供者Charles River Italia S.p.A.
Via Indipendenza，1123885-Calco(Lecco)動物對環境的適應在實驗開始前至少5天開始飼養。在此期間每天觀察以確定其是否適合於本實驗。
年齡和體重約8周齡；18-22g。
動物飼養場地空調房間，每籠10隻動物。
溫度22±2℃相對溼度55％±10空氣變化約15-20/小時過濾HEPA 99.99％燈光12小時輪換(7a.m.-7p.m.)籠子Makrolon籠子，42.5×26.6×15h，每隻配備一個帶不鏽鋼蓋的飼料盒。籠子底部是網格狀的。通過網格漏到籠子底部的廢物定期清理。
動物鑑別打耳號。籠子的標牌標出實驗編號、劑量組和給藥時間。
食物Charles River Italia’s feed licensee Mucedola S.r.l.，Settimo Milanese生產的GLP 4RF25 top certificate顆粒狀食物。為了增加生病動物的營養，從第7天開始每天在籠子底部放置溼的顆粒。生長廠商提供食物營養及汙染的分析證明，汙染物的含量要在EPA-TSCA(44FR44053-44093，1979年7月26日)建議的範圍之內。RBM每年至少再分析兩次動物食物內的細菌汙染。動物隨意進食。
水水取自市政主要水系統。水經過過濾，並且通過一個自動閥門系統使動物隨意飲水。在自動供水系統上加裝塑料瓶。定期分析水內微生物的含量、重金屬含量、其它物質的汙染(如溶媒，殺蟲劑)以及其它化學和物理特徵。飲水的可接受限度是根據EEC 80/778號管理規程的要求執行的。
可能會對本實驗目的產生幹擾的汙染物都不應該出現在食物和飲水中。
實驗材料含6組氨酸尾巴的鼠骨橋蛋白(AS900011)和mIFNβ。
免疫過程在小鼠左腹部皮下注射(0天)0.2ml乳劑進行免疫，該乳劑含有200μg溶於含0.5mg結核桿菌的完全福氏佐劑(CFA，DIFCO，Detroit，U.S.A.)中的MOG35-55肽(Neosystem，Strasbourg，France)。免疫立刻在腹膜內注射500ng百日咳毒素(ListBiological Lab.，Campbell，CA，U.S.A.)，毒素溶於400μl緩衝液(0.5M NaCl，0.017％Triton X-100，0.015M Tris，pH＝7.5)中。第2天再再腹膜內注射500ng百日咳毒素。第7天，在小鼠右腹部皮下注射溶於CFA中的200μg MOG35-55肽進行第二次免疫。大約從8-10天開始，動物出現進行性的麻痺，從尾巴開始逐漸上升到前肢。
實驗設計實驗分為7組，每組15隻動物。所有組動物都按照免疫操作說明書用溶於CFA的MOG35-55肽和百日咳毒素進行免疫，各組的處理方案如下第1組陽性對照組，OPN溶劑(PBS+0.1％BSA)皮下注射。
第2組陽性對照組mIFNβ(PBS)，皮下注射。
第3組皮下注射1μg/kg骨橋蛋白(AS900011)。
第4組皮下注射10μg/kg骨橋蛋白(AS900011)。
第5組皮下注射100μg/kg骨橋蛋白(AS900011)。
第6組皮下注射1μg/kg骨橋蛋白(AS900011)加上20000U/1隻鼠mIFNβ。
第7組皮下注射20000U/1隻鼠mIFNβ。
每組動物的數目是能夠準確評價所得到的藥理學效果的最小數目。
載體PBS+0.1％BSA用於將骨橋蛋白稀釋到適當濃度。PBS用於將mIFNβ稀釋到適當濃度。
給藥途徑劑量分別為1、10和100μg/kg的骨橋蛋白(AS900011)以10ml/kg的體積皮下注射。劑量分別為20000U/1隻鼠的mIFNβ以200μl/kg的體積皮下注射。第1組皮下注射10ml/kg的PBS+0.1％BSA，第2組皮下注射200μl/PBS/1隻鼠。
實驗周期本實驗中各組開始治療的時間是在每隻動物的臨床分數1時，然後連續治療35天。
給藥劑型化合物和mIFNβ都是以溶於適當載體中的溶液形式注射的。按照Sponsor指導手冊製備各自的製劑。
臨床表現從免疫後7天開始觀察每隻動物的麻痺出現情況，以臨床分數的形式表示0＝無發病跡象0.5＝部分尾出現麻痺1＝尾麻痺1.5＝尾麻痺+單側後肢部分麻痺2＝尾麻痺+後肢弱麻痺或部分麻痺2.5＝尾麻痺+後肢部分麻痺(低位骨盆)3＝尾麻痺+後肢完全麻痺3.5＝尾麻痺+後肢完全麻痺+失禁4＝尾麻痺+後肢麻痺+前肢弱麻痺或部分麻痺5＝垂死或死亡在安靜的室內觀察動物。每天由技術人員雙盲監測每個治療組動物的臨床表現，技術人員不知道每組動物治療的情況。
每天測量動物的體重。
由專業獸醫師或權威人士判斷動物是否處於痛苦或垂死狀態。如果需要就人道地處死以使動物免受過度的痛苦或折磨。
血樣採集最後一次治療後24小時，採集每隻動物的血樣(戊巴比妥麻醉)。按常規操作分離血清，儲存在-20℃。然後將冷凍的血清送到SPRI確定血清中化合物的濃度。
組織病理學檢測在治療結束後，動物用戊巴比妥麻醉，通過左心室灌注4％甲醛進行固定。然後小心地分離出骨髓並用福馬林固定。脊髓切片用石蠟塊包埋。石蠟塊切片後分別用蘇木精和伊紅檢查炎症反應，用Kluver-PAS(LUXOL速藍(fast blus)加Periodic Acid Schiff染色)以檢查脫髓鞘情況。
數據分析臨床檢測結果用每組內的分數均值(±SEM)表示。檢測物的療效與載體處理陽性對照組的療效進行比較。組間臨床分值的差異通過Kruskal-Wallis檢驗進行分析，如果有明顯差異再用Wilcoxon配對檢驗分析每個測量時間點的數據。體重數據的評價用單向ANOVA，有明顯差異的數據再用Tukey檢驗。所用的分析軟體是S-Plus。
結果本實驗的結果顯示在圖14到圖16中。
通過血管周圍炎症侵潤的組織學分析發現OPN治療動物血管周圍炎症侵潤有減輕的趨勢，特別是最低劑量組(1μg/kg)的動物。IFNβ是一種已知的具有多發性硬化症治療效果的化合物，當OPN與其聯合使用時，比單獨使用OPN或IFN的治療效果更好(圖14)。
另外，也測量了脫髓鞘區域所佔的百分率(圖15)。OPN治療組的動物其脫髓鞘區域也有減少的趨勢。聯合使用IFN和OPN可以使脫髓鞘區域明顯減少，甚至比IFN單獨治療組低很多(圖15)。
圖16總結了本實驗中在治療結束時所觀測到的臨床分數、炎症侵潤和脫髓鞘區域。儘管OPN治療組的臨床分數與對照組相比沒有顯著的降低，但OPN和IFN聯合治療確實可以使脫髓鞘區域明顯減少，與陽性對照幹擾素治療組一樣。這一結果與所觀察到的炎症侵潤及脫髓鞘範圍一致。用OPN和IFNβ治療後這兩個指標都顯著降低(圖16)。
總之，本實驗可以得到下列結果單獨皮下注射1、10、100mg/kg的骨橋蛋白(AS900011)不能使血管周圍炎症侵潤和脫髓鞘區域出現統計學意義上的顯著降低。用mIFNβ治療(20000U/1隻鼠，皮下注射)可以誘導血管周圍炎症侵潤降低(55％)和脫髓鞘區域減少(53％)。當相同劑量的mIFNβ與100mg/kg的AS900011聯合進行皮下注射時，可以觀察到炎症侵潤顯著降低(71％)，脫髓鞘區域明顯減少(81％)。
在35天(治療結束時)將動物處死收集脊髓後進行組織學分析，所觀察到的數據與臨床分數一致。單獨皮下注射1、10、100mg/kg的骨橋蛋白(AS900011)不能顯著減輕疾病的嚴重程度。用mIFNβ治療(20000U/1隻鼠，皮下注射)可以顯著減輕疾病的嚴重程度。當相同劑量的mIFNβ與100mg/kg的AS900011聯合進行皮下注射時，可以觀察到統計學意義上的臨床症狀緩解。
這些結果說明骨橋蛋白和mIFNβ聯合治療可以有效減輕鼠EAE模型的臨床症狀和病理效應，因而可以有效治療多發性硬化症。
實施例12骨橋蛋白對坐骨神經壓迫誘導的小鼠神經病的保護性效應縮寫詞CMAP混和肌肉動作電位EMG肌電描記法IGF-1胰島素樣生長因子SC皮下的s.e.m.均值的標準差vs對前言神經病通常是選擇性的，根據受影響的外周神經元類型(如感覺神經對迷走神經)或神經元亞型(小神經對大神經)的不同而不同。外周神經的Axotomy是一種最常用的評價神經營養因子神經保護效應的動物模型。創傷性神經損傷、神經叢損傷記背根神經損傷是意外事故最嚴重的併發症。另外，能造成髓磷脂損傷的周圍神經壓迫在神經疾病中也很常見，如腕管症候群或與脊柱矯形併發症有關的疾病。Axotomy出現的變化有細胞死亡、軸突傳導速度下降及損傷神經元神經遞質的改變等。壓迫造成的損傷可以恢復，另一個感興趣的過程與神經病變的狀態有關(McMahon S.和Priestly J.V.1995)。
細胞生物學的一個基本問題就是損傷或疾病後神經再生的調節。功能性的神經再生不僅需要軸突的發芽和延伸，而且還需要有新的髓磷脂合成。髓鞘再生對正常神經傳導的恢復及保護軸突免受新的神經變性性免疫攻擊是必須的。研究神經變性疾病的主要目標是最終開發出能預防神經死亡、維持神經元的表型及修復神經元和髓磷脂損傷的幹預措施。已有許多研究致力於解釋axotomized脊髓運動神經元完全再生的分子及細胞機制(Fawcett等，1990；Funakoshi等，1993)。損傷所誘導的神經營養因子及相應受體的表達可能在神經再生過程中發揮重要作用。以前的研究已經證明各種肽類或非肽類化合物能明顯促進神經的再生，如胰島素樣生長因子(IGF-1)、ACTH(Lewis等，1993；Strand等，1980)，睪丸酮(Jones，1993)，SR57746A(Fournier等，1993)和4-甲基兒茶酚(Kaechi K等，1993，1995；Hanaoka Y等，1992)。
本實驗的目的在於評價不同劑量骨橋蛋白治療小鼠內的神經再生情況。在本模型中，OPN對神經元及軸突(感覺和運動神經元)的存活和再生，對髓鞘化或巨噬細胞侵潤的積極療效可以使運動功能得以恢復。神經再生是根據感覺運動功能的恢復情況及形態學研究來評價的。因此本研究中電生理學記錄和組織形態學分析同時進行。
材料和方法動物84隻8周齡的C57bl/6RJ小鼠(levage Janvier，Le Genest-St-Isle，France)分為7組(n＝12)(a)載體假處理組；(b)載體神經壓迫組；(c)神經壓迫/骨橋蛋白組(1μg/kg)；(d)神經壓迫/骨橋蛋白組(10μg/kg)；(e)神經壓迫/骨橋蛋白組(100μg/kg)；(f)神經壓迫/4-甲基兒茶酚組(10μg/kg)；(g)神經壓迫/變性骨橋蛋白組(100μg/kg)。
小鼠分組飼養(每隻籠子5隻小鼠)，置於恆溫(21-22℃)的飼養室內，白天和黑夜顛倒(12h/12h)，隨意進食和飲水。所有操作都按照研究指導手冊進行。
坐骨神經的損傷動物腹膜內注射60mg/kg鹽酸氯胺酮(Imalgéne 500，Rhóne Mérieux，Lyon，France)使之麻醉。在大腿中部手術暴露右側坐骨神經，在離其三根分叉部約5mm壓迫。用止血鉗(1.5mm寬；Koenig；Strasbourg；France)夾住坐骨神經90度旋轉壓迫兩次，每次30秒。
實驗計劃及藥物治療在手術前記錄一次肌電圖(基線)，在手術後3周內每周再記錄一次。
神經壓迫手術的當天為0天(D)。手術後4天內不再進行實驗。
每天機率動物體重和存活率。
從手術當天開始到實驗結束，每天皮下注射骨橋蛋白和變性的骨橋蛋白，腹膜內注射4-甲基兒茶酚。
在第4周每組處死4隻小鼠，分離坐骨神經，觀察其形態學的改變。
電生理記錄用Neuromatic 2000M電生理記錄儀(EMG)(Dantec，Les Ulis，France)記錄電生理信號。小鼠腹膜內注射100mg/kg鹽酸氯胺酮(Imalgéne 500，Rhóne Mérieux，Lyon，France)使之麻醉。用加熱燈加熱使其維持正常的30℃體溫，在尾巴上放置一個接觸溫度計(Quick，Bioblock Scientific，Illkirch，France)控制溫度。
以超極限強度(12.8mA)的電流給予坐骨神經一個0.2ms的刺激後測量腓腸肌的混和肌肉動作電位(CMAP)。記錄動作電位的幅度(mV)、潛伏期(ms)和持續時間(去極化和復極化所需要的時間)。幅度是反映活性運動單位數目的指標，而遠端潛伏期間接反映了運動神經傳導和神經肌肉傳遞速率。
形態學分析壓迫神經後3周進行形態學分析。每組隨機挑選4隻動物用於本實驗。小鼠腹膜內注射100mg/kg鹽酸氯胺酮使之麻醉。取5mm的坐骨神經片段用於組織學分析，組織用溶於磷酸緩衝液(pH＝7.4)中的4％戊二醛水溶液(Sigma，L』lsled』Abeau-Chesnes，France)固定過夜，戊二醛水溶液使用前保存在30％蔗糖中，於4℃儲存。神經在磷酸緩衝液溶解的2％四氧化鋨(Sigma，L』Isle d』Abeau-Chesnes，France)固定2小時，然後用一系列乙醇溶液脫水，再用環氧樹脂包被。包被的組織置於70℃使之聚合3天。用切片機切出1.5μm的橫切面，用1％甲苯胺藍(Sigma，L』Isle d』Abeau-Chesnes，France)染色2分鐘，脫水後置於Eukitt上。每個樣品切20個切片，用光學顯微鏡(Nikon，Tokyo，Japan)觀察，每個樣品隨機取6個切片用半自動數碼影像分析軟體(Biocom，France)進行形態學分析。每個切片分析兩個視野。計算下列參數變性纖維百分率(每個視野)和總纖維數。
數據分析對數據進行Gglobal分析時用一種因素或重複測量對方差的分析(anova)以及用單向anova和非-參數實驗(mann whitney實驗)。適當時可進一步進行dunnett實驗。顯著性差異的水平設定為p＜0.05。結果以均值的平均標準差(s.e.m.)表示。
結果經神經壓迫處理後所有的動物都存活下來。一隻鼠(神經壓迫/載體n°2)死於第7天，2隻鼠(載體假處理n°3和N°6)死於第14天，死亡是在進行EMG評價期間由麻醉造成的。
動物體重如圖17所示，整個實驗中體重增加量在組間存在顯著性差異[F(6，132)＝1.93和p＜0.001；重複測量ANOVA]。
在整個實驗過程中所有組的動物體重都有所增加。
電生理學檢測混和肌肉動作電位的幅度(圖18)整個實驗中CMAP的幅度在組間存在顯著性差異[F(6，18)＝49.185和p＜O.001；重複測量ANOVA](圖19)。
神經損傷後，所有經過神經壓迫手術的動物與假處理組的動物相比其CMAP幅度明顯下降(p＜0.001；Dunnett實驗)。
而且，在第7天和第14天，100μg/kg骨橋蛋白處理組小鼠或10μg/kg 4-甲基兒茶酚處理組小鼠的CMAP幅度比神經壓迫/載體組小鼠的CMAP幅度顯著升高(p＜0.05；Dunnett實驗)。
神經壓迫/載體組與神經壓迫/變性骨橋蛋白100μg/kg組之間無顯著性差異。
混和肌肉動作電位的潛伏期(圖19)如圖20所示，CMAP的潛伏期在組間存在顯著性差異[F(6，18)＝2.521和p＜0.001；重複測量ANOVA]。在第21天，神經壓迫組的CMAP潛伏期比假處理組顯著延長(p＜0.001；Dunnett實驗)。而且，10μg/kg和100μg/kg的骨橋蛋白表現出顯著的治療效果，這兩組的CMAP潛伏期比神經壓迫/載體組顯著縮短(p＝0.017；Dunnett實驗)。
神經壓迫/載體組與神經壓迫/變性骨橋蛋白100μg/kg組之間無顯著性差異。
混和肌肉動作電位的持續時間(圖20)CMAP的持續時間[F(6，18)＝25.15和p＜0.001；重複測量ANOVA](圖20)。
從第7天開始，神經壓迫組的CMAP持續時間顯著延長(假處理組對神經壓迫組p＜0.001；Dunnett實驗)。而且在第7天，神經壓迫/骨橋蛋白100μg/kg組的CMAP持續時間比神經壓迫/載體組的CMAP持續時間明顯縮短(p＜0.001；Dunnett實驗)。在第14天和第21天，有三組的CMAP持續時間比神經壓迫/載體組顯著縮短(a)神經壓迫/骨橋蛋白10μg/kg組；(b)神經壓迫/骨橋蛋白100μg/kg組；(c)神經壓迫/4-甲基兒茶酚10μg/kg組。
然而神經壓迫/載體組與神經壓迫/變性骨橋蛋白100μg/kg組之間無顯著性差異。
形態學分析變性纖維的百分率(圖21)統計學分析表明每個區域內變性纖維的百分率在組間存在顯著性差異(p＜0.001；單向ANOVA)(圖22)。所有神經壓迫組的變性纖維百分率都顯著增加(p＜0.001，Dunnett實驗)。而且神經壓迫/治療組的小鼠變性纖維百分率與神經壓迫/載體組的小鼠相比顯著降低(p＜0.001；Dunnett實驗)。
另外，變性骨橋蛋白(100μg/kg)處理組與骨橋蛋白處理組相比其變性纖維百分率顯著升高(p＜0.001；Dunnett實驗)。
纖維總數(圖22)神經纖維切片用光學顯微鏡觀察，通過Visiolab 2000軟體(Biocom，Paris，France)進行形態學分析。每隻動物分析5個切片，每個切片分析兩個視野。只有功能性髓鞘化的纖維才被計算機記錄(所有髓鞘變性的變性纖維不記錄在內)。
結論通過神經壓迫可以造成很好的周圍神經病模型。神經被壓迫後大多數大直徑的神經纖維立刻就會失去功能，由於機械損傷其CMAP幅度顯著下降。CMAP潛伏期不會立刻受到影響，但是在21天時會延長，這是由於受次級的免疫介導的變性作用(巨噬細胞、粒細胞)影響小直徑纖維出現變性。CMAP持續時間在第7天時開始延長，14天達到高峰，21天時又恢復到第7天的水平。這是由於在21天時壓迫所造成的損傷得以恢復，另一個感興趣的過程與神經病變的狀態有關。在3周時對照組的軸突發芽/再生現象也是很明顯的。
骨橋蛋白對神經壓迫模型鼠具有保護作用。感覺運動功能在損傷後7、14和21天時以劑量依賴的方式明顯恢復，壓迫後21天的形態學分析表明變性纖維的百分率顯著降低，總纖維數顯著增加。骨橋蛋白作為一個對照分子用在本實驗中被證明是有效的，4-甲基兒茶酚和熱滅活的變性OPN對功能性或組織學指標無任何有顯著意義的影響。這種對功能性或組織學指標的正效應是由於OPN具有以下效應-直接保護纖維免受次級免疫介導變性損傷的影響；-加速髓鞘再生和保護軸突；-加速受損軸突的再生/發芽；-促進巨噬細胞清除髓磷脂碎片。
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序列表110應用研究系統ARS股份公司(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)120骨橋蛋白在製備治療和/或預防神經疾病的藥物中的用途130037562F1150011112961512001-05-171605170PatentIn version 3.12101211314212PRT213智人(Homo sapiens)4001Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala1 5 10 15Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu20 25 30Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro35 40 45Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu50 55 60Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu65 70 75 80Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His85 90 95Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp100 105 110Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu115 120 125Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu130 135 140
Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly145 150 155 160Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg165 170 175Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser His180 185 190Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala195 200 205Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp Ser210 215 220Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser His225 230 235 240Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn Glu245 250 255His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu260 265 270Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val Asp275 280 285Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser His290 295 300Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn305 3102102211299212PRT213智人(Homo sapiens)4002Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala1 5 10 15Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu20 25 30
Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro35 40 45Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Leu Pro Ser Lys Ser Asn50 55 60Glu Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp65 70 75 80His Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val85 90 95Asp Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Aspl00 105 110Glu Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr115 120 125Glu Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg130 135 140Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg145 150 155 160Arg Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser165 170 175His Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val180 185 190Ala Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp195 200 205Ser Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser210 215 220His Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn225 230 235 240Glu His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg245 250 255Glu Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val260 265 270
Asp Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser275 280 285His Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn290 2952103211286212PRT213智人(Homo sapiens)4003Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala1 5 10 15Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Asn Ala20 25 30Val Ser Ser Glu Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser35 40 45Lys Ser Asn Glu Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp50 55 60Asp Asp Asp His Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser65 70 75 80Asp Asp Val Asp Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His85 90 95His Ser Asp Glu Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu100 105 110Pro Ala Thr Glu Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr115 120 125Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys130 135 140Lys Phe Arg Arg Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp145 150 155 160Ile Thr Ser His Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala165 170 175
Ile Pro Val Ala Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg180 185 190Gly Lys Asp Ser Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu195 200 205Thr His Ser His Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp210 215 220Glu Ser Asn Glu His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys225 230 235 240Val Ser Arg Glu Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met245 250 255Leu Val Val Asp Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe260 265 270Arg Ile Ser His Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn275 280 285210421122212DNA213智人(Homo sapiens)4004agcctgcacc cagatcctat ag 22210521121212DNA213智人(Homo sapiens)4005gcgcaaggag attctgcttc t2權利要求
1.骨橋蛋白在製備促進少突膠質細胞系增殖和分化的藥物中的用途，所述骨橋蛋白的多肽序列與SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO1的1到168胺基酸或SEQ ID NO1的1到170胺基酸至少有90％的同一性。
2.如權利要求1所述的用途，其中，所述藥物是用於治療神經疾病，選自創傷性神經損傷、腦卒中、CNS或PNS的脫髓鞘疾病、神經病和神經變性性疾病、精神分裂症和腦白質營養不良。
3.如權利要求1或2所述的用途，其中，所述神經疾病是由先天性代謝障礙引起的。
4.如上述任一權利要求所述的用途，其中，所述神經疾病是周圍神經病。
5.如權利要求4所述的用途，其中，所述神經疾病是糖尿病性神經病。
6.如權利要求2所述的用途，其中，所述脫髓鞘疾病是多發性硬化症(MS)。
7.如權利要求2所述的用途，其中，所述神經變性疾病選自阿爾茨海默病、帕金森病、亨庭頓舞蹈病和肌萎縮性側索硬化症(ALS)。
8.如權利要求1-7中任一項所述的用途，其中，所述骨橋蛋白是融合蛋白。
9.如權利要求1-8中任一項所述的用途，其中，所述骨橋蛋白與一種能促進透過血腦屏障的載體分子、肽或蛋白質融合。
10.如權利要求8或9所述的用途，其中，所述骨橋蛋白是PEG化的。
11.如權利要求8-10中任一項所述的用途，其中，所述融合蛋白含有一個免疫球蛋白(Ig)融合子。
12.上述任一權利要求所述的用途，其中，所述藥物還含有同時、相繼或分別使用的幹擾素。
13.如權利要求12所述的用途，其中，所述幹擾素是幹擾素β。
14.核酸分子在製備用於促進少突膠質細胞系增殖和分化的藥物中的應用，其中，所述核酸分子含有編碼多肽的核酸序列，該多肽含有選自以下的胺基酸序列a)與SEQ ID NO1至少有90％同一性的多肽；b)與SEQ ID NO1的1到168或1到170胺基酸至少有90％同一性的多肽；c)與SEQ ID NO2至少有90％同一性的多肽；d)與SEQ ID NO3至少有90％同一性的多肽；e)(a)-(d)任一項的融合蛋白。
15.如權利要求14所述的應用，其中，所述核酸分子還含有表達載體序列。
16.如權利要求14或15所述的應用，其特徵在於用於製備基因治療的藥物。
17.經過基因改造能產生骨橋蛋白的細胞在製備用於促進少突膠質細胞系增殖和分化的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及骨橋蛋白或骨橋蛋白活性激動劑在治療或預防神經疾病中的應用。
文檔編號A61P25/18GK1939538SQ20061013176
公開日2007年4月4日 申請日期2002年5月8日 優先權日2001年5月17日
發明者U·伯斯切特, G·非格, R·西爾瓦拉居, R·帕珀恩, L·伯納斯康尼 申請人:應用研究系統Ars股份公司