凝血因子VⅡ或VⅡa樣分子的製作方法

2023-04-25 05:30:16 2

專利名稱：凝血因子VⅡ或VⅡa樣分子的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的凝血因子VII(FVII)或凝血因子VIIa(FVIIa)多肽偶聯物，其製備及在治療中的用途，特別是治療多種凝血相關疾病的用途。
背景技術：
凝血是由多種血液組分(或因子)之間複雜的相互作用組成的逐漸導致纖維蛋白凝塊形成的過程。通常參與被稱為凝血「級聯反應」的血液組分是原酶或酶原，即，不具有酶活性的蛋白，激活劑的作用可使其轉變為活性形式。FVII就是這些凝血因子中的一種。
FVII是一種維生素K依賴性血漿蛋白，在肝中合成，並以分子量為53kDa的單鏈糖蛋白形式分泌到血液中(Broze Majerus，J.Biol.Chem 1980；2551242-1247)。FVII酶原在單一位點R152-I153處被蛋白酶水解，產生由一個二硫鍵連接的雙鏈，從而轉變為活性形式(FVIIa)。FVIIa與組織因子的複合體(FVIIa複合體)可將凝血因子IX和凝血因子X均轉變為其活性形式，接下來的反應導致快速的凝血酶產生以及纖維蛋白形成(Osterud Rapaport，Proc Natl Acad Sci USA 1977；745260-5264)。
FVII經歷翻譯後修飾，包括依賴維生素K的羧基化，導致在該分子N末端區產生10個γ羧基穀氨酸殘基。因此，SEQ ID NO1中第6，7，14，16，19，20，25，26，29和35位殘基是Gla結構域中對於FVII活性重要的γ羧基穀氨酸殘基。其他翻譯後修飾包括在第145和322位的兩個天然產生的N-糖基化位點，以及在第52和60位的兩個天然產生的O-糖基化位點處分別連接糖組分。
編碼人FVII(hFVII)的基因被定位於13號染色體的q34-qter9(de Grouchy等，Hum Genet 1984；66230-233)。其包含9個外顯子，長度為12.8Kb(O′Hara等，Proc Natl Acad Sci USA 1987；845158-5162)。FVII的基因組構和蛋白結構與其它維生素K依賴性原凝血蛋白的結構相似，外顯子1a和1b編碼信號序列；外顯子2編碼多肽和Gla結構域；外顯子3編碼一段短的疏水區；外顯子4和5編碼表皮生長因子樣結構域；以及外顯子6到8編碼絲氨酸蛋白酶的催化結構域(Yoshitake等，Biochemistry 1985；243736-3750)。
利用X射線晶體成像的方法(Banner等，Nature，1996；38041和Zhang等，J.Mol.Biol，1999；2852089)，已報導了hFVIIa(Pike等，PNAS.U.S.A.，1999；968925-30和Kemball-Cook等，J.Struct.Biol，1999；127-213-223)，hFVIIa與可溶性組織因子的複合體，以及hFVII的小片段的實驗三維結構(Muranyi等，Biochemistry，1998；3710605和Kao等，Biochemistry，1999；387097)。
關於FVII蛋白工程化突變體的報導相對較少(Dickinson Ruf，J BioChem，1997；27219875-19879，Kemball-Cook等，J Biol Chem，1998；2738516-8521，Bharadwaj等，J Biol Chem，1996；27130685-30691，Ruf等，Biochemsitry，1999；381957-1966)。
已報導了FVII在BHK或其他哺乳動物細胞中的表達(WO92/15686，WO91/11514，WO88/10295)，以及FVII和kex2內切蛋白酶在真核細胞中的共表達(WO00/28065)。
人重組FVIIa的商品化製劑以NovoSeven的名稱出售。NovoSeven指明用於治療血友病A或B患者的出血發作。NovoSeven是市售的可治療出血發作的唯一有效並且可靠的rFVIIa。
WO91/1154中報導了FVII的一種無活性形式，其中152的精氨酸和/或153的異亮氨酸被修飾。這些胺基酸位於活化位點。WO96/12800描述了一種絲氨酸蛋白酶抑制劑導致的FVIIa的失活；Petersen等說明了FVIIa在I153的α胺基酸基團氨甲醯化導致的失活(Eur J Biochem，1999；261124-129)。這種失活形式可以與野生型FVII或FVIIa競爭對組織因子的結合以及抑制凝血活性。這提示這種FVIIa的失活形式可用於治療極易產生凝血的患者，如患膿毒病的患者，其易於發作心肌梗塞或血栓性中風。
在「Summary Basis for Approval for NovoSeven」(FDA參考號96-0597)中報導了rFVIIa的循環半壽期為2.3小時。相對高的劑量和頻繁地給藥對於達到並維持期望的療效和預防效果是必需的。因此，難以獲得足夠的劑量調控，而頻繁地靜脈給藥對於患者的生活方式造成了限制。
目前rFVIIa治療的另一個問題是該分子對於蛋白酶解的相對不穩定。與凍乾粉產品相反，蛋白酶解是獲得溶液型製劑的一個主要障礙。獲得穩定的溶液型製劑的好處在於方便患者操作，並且，在緊急情況下，便於更快地起作用，而這有可能是一種救生。在WO88/10295中公布了試圖通過對主要蛋白酶解位點進行定點誘變預防蛋白酶的水解。
具有更長循環半壽期的分子將降低必需的給藥次數。鑑於現有FVIIa需要經常注射，而且很有可能在獲得更好的治療性FVIIa水平的同時增強療效，很明顯需要改進FVIIa或FVIIa樣分子。
延長蛋白的循環半壽期的一種方法是確保該蛋白的腎清除率降低。這可以通過將該蛋白與一種化學組分偶聯來實現，該化學組分可賦予該蛋白降低的腎清除率。
此外，化學組分與該蛋白的連接，或對暴露於蛋白酶解作用的胺基酸的取代，可有效阻止蛋白酶接觸從而避免對該蛋白的降解。聚乙二醇(PEG)就是一種這樣的化學組分，可用於製備治療性蛋白產品。
WO98/32466提示，FVII和其他許多蛋白一樣，可以被PEG化，但對此該文獻沒有提供更進一步的信息。
發明簡述本申請公開了改進的FVII和FVIIa分子，特別是重組的hFVII和hFVIIa分子，其提供一個或多個上述所期望的益處。所以，本發明偶聯物與現有商品化rFVIIa比較提供了一種或多種改進的特性，包括延長了功能性體內半壽期和/或延長了血漿半壽期，和/或增加了生物利用率和/或降低了對蛋白酶解的敏感性。因此，使用本發明偶聯物進行治療可以獲得優於現有rFVIIa複合物的多種優點，如注射間隔更長。
相應的，一方面本發明涉及包含至少一個共價連接到多肽上的非多肽組分的偶聯物，其中該多肽的胺基酸序列不同於SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIa的序列在於，其至少引入或去除一個包含所述多肽連接基團的胺基酸殘基。
本發明的另一方面涉及一種多肽，其中該多肽的胺基酸序列不同於SEQID NO1中野生型FVII或hFVIIa的胺基酸序列在於，其至少引入或去除一個包含所述多肽連接基團的胺基酸殘基。這種新的FVII多肽被認為可用於治療、診斷以及其他目的，但特別感興趣的是作為製備本發明偶聯物的中間產物。
另一方面，本發明涉及編碼本發明多肽或本發明偶聯物多肽部分的核苷酸序列；包含本發明核苷酸序列的表達載體；包含本發明核苷酸序列或本發明表達載體的宿主細胞。
本發明進一步涉及包含本發明偶聯物的藥物組合物以及製備和使用這種偶聯物的方法。
發明詳述定義在本申請和本發明的全文中，使用下列定義術語「偶聯物」(或可互換為「偶聯的多肽」)表示由一個或多個多肽與一個或多個非多肽組分(如聚合物分子、親脂化合物、糖組分及有機衍生劑)共價連接而形成的雜合(複合或嵌合的意思)分子。優選地，偶聯物在有關濃度和條件下是可溶的，即在生理液體如血液中可溶。本發明偶聯多肽的實施例包括糖基化的和/或PEG化的多肽。
術語「共價連接」表示該多肽和非多肽組分或者彼此直接共價連接，或者通過一個或多個間插組分，如橋、間隔子或連接部分，間接地共價連接。
術語「非偶聯多肽」是偶聯物的多肽部分。
本文所用術語「非多肽組分」表示能夠與本發明多肽的連接基團偶聯的分子。此類分子的優選實例包括聚合物分子、糖組分、親脂性化合物或有機衍生劑。在本文中用於本發明的偶聯物時，應理解為非多肽組分通過多肽連接基團連接到偶聯物的多肽部分。如上說明，非多肽組分可能直接共價地連接到連接基團，或通過一個或多個間插組分，如橋、間隔子或連接部分，間接地共價連接到連接基團。
術語「聚合物分子」被定義為由兩個或多個單體共價連接形成的分子，其中所述單體無一是胺基酸殘基，除非聚合物是人白蛋白或另一種豐富血漿蛋白。術語「聚合物」可與術語「聚合物分子」互換。該術語涵蓋經體外糖基化連接的碳水化合物分子，所述體外糖基化即體外進行的合成性糖基化，其通常涉及碳水化合物分子與多肽連接基團共價連接，任選使用交聯劑。
體內糖基化如N-或O-糖基化(下文作進一步描述)連接的碳水化合物分子在本文中稱作「糖組分」。除指明偶聯物中非多肽組分如聚合物分子或糖組分的數目外，偶聯物中所含或本發明其它部分所指的「非多肽組分」表示偶聯物中的一個或多個非肽部分，如聚合物分子或糖組分。
術語「連接基團」表示多肽的能夠與非多肽組分如聚合物分子、糖組分、親脂性化合物或有機衍生劑偶聯的功能基團，特別是其胺基酸殘基或碳水化合物組分。有用的連接基團及其相配的非多肽組分表示在下圖中。
對於體內N-糖基化來說，術語「連接基團」以非常規方式用於表示構成N-糖基化位點的胺基酸殘基(序列為N-X-S/T/C，其中X是除脯氨酸之外的任何胺基酸殘基，N是天冬醯胺並且S/T/C是絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸，優選絲氨酸或蘇氨酸並且最優選蘇氨酸)。儘管N-糖基化位點的天冬醯胺殘基是在糖基化期間與糖組分連接的殘基，但這種連接不能完成，除非該N-糖基化位點存在其它胺基酸殘基。
因此，當非多肽組分是糖組分，並且偶聯是通過N-糖基化實現時，與目的多肽胺基酸序列改變聯用的術語「含有非多肽組分連接基團的胺基酸殘基」應理解為構成N-糖基化位點的一個或多個胺基酸殘基被改變，改變方式是功能性的N-糖基化位點被引入胺基酸序列或從所述序列除去。
在本申請中，胺基酸命名和原子的命名(如，CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、C等)按Protein DataBank(PDB)(www.pdb.org)所定義的來使用，此定義基於IUPAC命名法(IUPAC命名法以及胺基酸和肽的符號(殘基命名、原子命名等)，Eur.J.Biochem.，138，9-37(1984)以及其勘誤Eur.J.Biochem.，152，1(1985))。
術語「胺基酸殘基」表示包含在下組中的胺基酸殘基丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、穀氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(Ile或I)、賴氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬醯胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、穀氨醯胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、纈氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)殘基。
用於鑑定胺基酸位置的術語舉例說明如下G124表示SEQ ID NO.1所示胺基酸序列中第124位被甘氨酸殘基佔據，G124R表示第124位甘氨酸殘基被精氨酸殘基取代。備選取代可以「/」表示，如K32D/E表示第32位的賴氨酸被天冬氨酸或穀氨酸所取代。多取代以「+」表示，如K143N+X145S/T表示第143位賴氨酸殘基被天冬醯胺殘基所取代，並且第145位的天冬醯胺殘基被絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基所取代。額外胺基酸的插入，如在G124之後插入一個丙氨酸殘基，表示為G124GA。胺基酸殘基的缺失以星號表示。例如，第124位甘氨酸的缺失表示為G124*。除非另有說明，此處胺基酸殘基的序號對應於SEQ ID NO1所示野生型FVII/FVIIa的胺基酸序列。
此處所用與特定突變相關的術語「不同於」是指除特定的胺基酸差異外許可存在另外的差異。例如，除了去除和/或引入包含非多肽組分連接基團的胺基酸殘基外，FVII或FVIIa多肽可能還包含與這些胺基酸殘基的引入和/或去除無關的其他取代。因此，除了此處公布的胺基酸改變(這些胺基酸改變目的在於，去除和/或引入非多肽組分的連接基團)外，可理解本發明多肽的胺基酸序列，如果需要可包含其他改變，這些改變不一定必須與連接位點的引入或去除有關，即其他的取代、插入或缺失。例如，這些改變可能包括去除N-和/或C末端的一個或多個胺基酸殘基，或在N-和/或C末端引入一個或多個額外的胺基酸殘基，如在N末端加入一個甲硫氨酸殘基，以及「保守性胺基酸取代」，即，取代是在具有相同特性的胺基酸，例如，小胺基酸，酸性胺基酸，極性胺基酸，鹼性胺基酸，疏水胺基酸和芳香族胺基酸之間進行取代。
本發明中優選的取代特別選自下表所列出的保守取代組。
術語「突變」和「取代」在此可互換使用。
術語「核苷酸序列」表示兩個或多個核苷酸分子的連續片段。核苷酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成或合成來源或其任意組合。
術語「聚合酶鏈反應」或「PCR」通常指一種用於體外擴增所需核苷酸序列的方法，例如，按美國專利4683195描述的方法。一般來說，PCR方法涉及使用能夠與模板核酸優先雜交的寡核苷酸引物來使引物延伸合成反應反覆循環「細胞」、「宿主細胞」、「細胞系」和「培養細胞」在本文中可互換使用並且這些術語都應當理解為包括細胞生長或培養所產生的後代。「轉化」和「轉染」可互換使用，指將DNA引入細胞的過程。
「可操作連接的」指兩個或多個核苷酸序列通過酶促連接等方式共價連接在彼此相關的構象中，使序列行使正常功能。例如，編碼前序列或分泌前導序列的核苷酸序列如果表達為參與多肽分泌的前蛋白，則被可操作性連接到該多肽的核苷酸序列上；啟動子或增強子如果能影響該序列的轉錄，則與編碼序列可操作性連接；核糖體的結合位點如果處在促進翻譯的位置則與編碼序列可操作連接。通常，「可操作連接的」意指被連接的核苷酸序列是鄰接的，並且在分泌引導區的情況下，是鄰接的而且在閱讀狀態下。連接在方便的限制性位點來完成。如果不存在此類位點，那麼使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭和標準的重組DNA方法。
術語「引入」主要指包含非多肽組分連接基團的胺基酸殘基的引入，特別是通過取代現存胺基酸殘基，或者通過插入另外的胺基酸殘基。
術語「去除」主要指包含非多肽組分連接基團的胺基酸殘基的去除，特別是通過將該胺基酸殘基用另外的胺基酸殘基取代的方式去除，或者使預去除的胺基酸殘基缺失(沒有取代)。
術語「FVIIa」或「FVII」多肽指單鏈形式的FVII分子。
術語「FVIIa」或「FVIIa多肽」指活化的雙鏈形式的FVIIa分子，其中所述單鏈形式R152和I153之間的肽鍵被剪切。當本文中SEQ ID NO1的胺基酸序列用於說明FVIIa的胺基酸序列時，應理解其中一條鏈包含1-152位的胺基酸殘基，另一條鏈包含153-406位的胺基酸殘基。
術語「rFVII」和「rFVIIa」分別指重組技術產生的FVII和FVIIa分子。
術語「hFVII」和「hFVIIa」分別指野生型人FVII和FVIIa。
術語「催化位點」用於指由FVII多肽的S344，D242和H193組成的催化三聯體。
術語「活性FVIIa」，「活性FVIIa多肽」，「活性FVIIa偶聯物」或「活性偶聯物」用於指具有至少10％的野生型hFVIIa催化活性的FVIIa多肽或偶聯物。文中所用催化活性可適當地通過在檢測催化活性的方法章節或檢測低水平催化活性的方法章節中所說明的方法來確定(參見文中材料和方法一節)。用以上所述分析時，所述活性偶聯物優選具有野生型hFVIIa催化活性的至少15％，例如至少20％，如至少25％，更優選至少30％，如至少40％，最優選至少50％，如至少60％。
優選，活性偶聯物可以結合組織因子，並進一步活化血漿凝血因子X和/或IX。因此，在一個優選的實施方案中，活性FVIIa多肽或其偶聯物與野生型FVIIa相比，具有至少25％的凝血活性，如與野生型FVIIa相比具有至少50％的凝血活性，如與野生型FVII相比具有至少75％的凝血活性。因此，活性FVIIa多肽或其偶聯物的凝血活性與野生型FVIIa相比，優選在25-200％的範圍內。具體地，優選FVIIa多肽或其偶聯物的凝血活性與野生型FVIIa相比在30-150％的範圍內，如凝血活性與野生型FVIIa相比在30-100％的範圍內。凝血活性可通過本領域已知的任何方法檢測，如在材料和方法一節中進一步討論的。然而，特別優選根據「檢測凝血活性的方法」章節(參見材料和方法部分)中說明的方法確定凝血活性。
與給定的物質聯用的術語「免疫原性」旨在表示該物質可誘導免疫系統反應的能力。免疫反應可以是細胞或抗體介導的反應(對免疫原性更進一步的定義參見，如，RoittEssential Immunnology(8th Edition，Blackwell))。一般來說，抗體反應性下降提示免疫原性下降。免疫原性可通過本領域任何已知的方法來測定，如體內方法或體外方法。
術語「無活性FVIIa」，「無活性FVIIa多肽」，「無活性的FVIIa偶聯物」或「無活性偶聯物」用於指活性低於野生型hFVIIa催化活性的10％的FVIIa多肽或偶聯物。文中所用催化活性可適當地通過檢測催化活性的方法章節或檢測低水平催化活性的方法章節中所說明的方法來確定(參見文中材料和方法章節)。採用以上所述分析時，無活性偶聯物的催化活性優選低於野生型hFVIIa催化活性的8％，如6％，例如低於5％，更優選低於4％，如低於3％，最優選低於2％，例如低於1％。
通常，無活性偶聯物與野生型hFVIIa相比，體外或體內凝血活性顯著降低。這種無活性的FVII或FVIIa多肽或偶聯物可能與野生型FVII或FVIIa競爭結合組織因子，從而抑制凝血活性。優選這種無活性FVII或FVIIa多肽或偶聯物與野生型hFVII或hFVIIa相比，凝血活性低於野生型的1％。更優選這種無活性FVII或FVIIa多肽或偶聯物與野生型hFVII或hFVIIa相比，凝血活性低於野生型的0.05％。最優選這種無活性FVII或FVIIa多肽或偶聯物與野生型hFVII或hFVIIa相比，凝血活性低於野生型的0.01％。凝血活性可以與上述相同的方式，通過本領域已知的任何方法來檢測，如在材料和方法中進一步討論的。然而，特別優選根據「檢測凝血活性的方法」章節(參見材料和方法部分)中說明的方法確定凝血活性。
術語「功能性體內半壽期」使用其通常的含義，即多肽或偶聯物在體內/靶器官中仍具有50％生物活性的時間，或者多肽或偶聯物的活性為最初活性的50％的時間。作為測定功能性體內半壽期的另一種方法，可測定「血清半壽期」，即，50％多肽或偶聯物分子在被清除之前在血漿或血流中循環的時間。血清半壽期的測定常常比測定功能性體內半壽期簡單並且血清半壽期的大小通常可以很好地說明功能性體內半壽期大小。血清半壽期的其它可替換術語包括「血漿半壽期」、「循環半壽期」、「血清清除率」、「血漿清除率」和「清除半壽期」。該多肽或偶聯物通過網狀內皮系統(RES)、腎、脾或肝中一個或多個的作用，通過組織因子、SEC受體或其他受體介導的清除作用，或通過特異或非特異的蛋白水解作用而清除。通常清除依賴於大小(相對於腎小球過濾的截留值而言)、電荷、連接的碳水化合物鏈，以及是否存在該蛋白的細胞受體。保留的功能通常選自前凝血劑、蛋白酶解或受體結合活性。功能性體內半壽期和血清半壽期可通過本領域中已知的任何合適的方法來測定，測定方法在下文材料和方法節作進一步討論。
涉及功能性體內半壽期或血漿半壽期的術語「增加」用於表示偶聯物或多肽的相應半壽期經可比條件下的測定，相對於參照分子如未偶聯的rFVIIa(如NovoSeven)的半壽期在統計學上是顯著增加的。例如，相應的半壽期可能增加至少約25％，如至少約50％，例如增加至少約100％，150％，200％，250％，300％，500％或100％。
術語「腎清除」使用其通常的含義，即發生在腎的清除，例如，通過腎小球過濾、腎小管排洩或在腎小管細胞中的降解來完成。腎清除取決於偶聯物的物理特性，包括大小(直徑)流體體積、對稱性、形狀/剛性和電荷。通常來說，大約為67kDa的分子量被認為是腎清除的截留值。腎清除可通過任何合適的測定方法來建立，如已建立的體內測定方法。通常，腎清除通過將標記的(如，放射標記的或螢光標記的)多肽偶聯物給予患者並測定收集的患者尿液中的標記物活性來測定。腎清除的下降經過可比條件下與相應參照多肽，如相應的非偶聯多肽，非偶聯的相應野生型多肽，或其他偶聯多肽(如與本發明無關的偶聯多肽)進行比較而確定。優選，偶聯物的腎清除率比相應的參照多肽降低至少50％，優選降低至少75％，最優選降低至少90％。
本發明偶聯物表現對蛋白酶解敏感性降低的性質是非常重要的；包含水解產物的組合物與那些偶聯物沒有被水解或僅有小部分被水解的組合物相比，通常具有更小的特異性。此外，給藥組合物中非生理降解產物可能會激發患者的免疫系統。
術語「對蛋白酶解降低的敏感性」主要指經可比條件下的檢測，該偶聯物與非偶聯的野生型FVIIa相比，對蛋白酶解的敏感性降低。優選，蛋白酶解降低了至少10％，如至少25％(例如降低了10％-25％)，更優選降低了至少35％，如至少降低了50％(例如降低了10％-50％，如25％-50％，更優選降低了60％，如至少降低了75％，或甚至降低了至少90％。更優選，蛋白酶解降低了100％。因此，優選本發明的偶聯物與野生型FVIIa相比蛋白酶解程度小，即與非偶聯的野生型FVIIa相比，本發明偶聯物的蛋白酶解優選降低了10％-100％，如降低了25％-100％，更優選降低了50％-100％，最優選降低了75％-100％。
本發明人建立了一種合適的初步體外檢測方法，其可用於評估這種偶聯物對蛋白酶解的敏感性是否降低(自身蛋白酶解減少)。因此，在本發明優選的實施方案中，經「對蛋白酶解敏感性降低的檢測」節中說明的方法、「檢測催化活性」節中的方法或「檢測低水平催化活性方法」節(參見本文材料和方法節)中說明的方法檢測，本發明偶聯物與野生型FVIIa相比對蛋白酶解的敏感性降低。
術語「親代FVII」或「親代多肽」是指本發明中將被修飾的分子。典型的親代FVII是hFVII或hFVIIa(包括rFVIIa(NovoSeven))，其具有SEQ IDNO1所示胺基酸序列。
「變體」是一種多肽，其與親代多肽有一個或多個胺基酸殘基的差異，通常有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個胺基酸殘基的差異。本發明的偶聯物本發明偶聯物是開發FVII或FVIIa改進分子的總體新策略產生的。更具體的，通過去除和/或引入含有所述非多肽組分的連接基團的胺基酸殘基，特異地改變多肽使該分子更易於與選定的非多肽組分偶聯，使偶聯模式最佳化(如，確保非多肽組分以最適量最佳分布在FVII或FVIIa分子表面並確保分子中只存在將偶聯的連接基團)，從而獲得新的偶聯分子，其與現有的FVII和FVIIa分子相比，具有或不具有FVII的活性，此外具有一種或多種改進的特性。例如，當含有所選非多肽組分的連接基團的胺基酸殘基總數增加到或降低到一個最佳水平時，該偶聯物的腎清除率通常因偶聯導致的分子形狀、大小和/或電荷的改變而顯著降低。
本發明優選的實施方案中，FVII或FVIIa多肽的一個以上的胺基酸殘基被改變，例如所述改變包括去除和引入包含所選非多肽的連接基團的胺基酸殘基。除了去除和/或引入胺基酸殘基外，該多肽可能包含其他與非多肽組分連接基團的胺基酸殘基的去除和引入無關的取代或糖基化。該多肽還可能與絲氨酸蛋白酶抑制劑連接，以抑制該多肽的催化位點。
包含非多肽組分連接基團的胺基酸殘基，無論是被去除或引入，其選擇基於所選非多肽組分的性質，並且，多數情況下，基於將多肽和非多肽組分之間偶聯所用的方法。例如，當非多肽組分是聚合物分子，如聚乙二醇或聚環氧烷衍生的分子時，包含連接基團的胺基酸殘基可選自賴氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，穀氨酸，組氨酸，或酪氨酸，優選半胱氨酸和賴氨酸，特別優選賴氨酸。
非多肽組分連接基團被引入本發明FVII或FVIIa多肽中或從所述多肽中被去除時，進行修飾的多肽部位優選位於該多肽的表面，更優選是由有25％以上側鏈暴露於溶劑中的那些胺基酸殘基佔據的位置，優選所述胺基酸超過50％的側鏈暴露於溶劑中。經過對人FVII或FVIIa分子三維結構的分析已鑑定出這些位置，所述方法見本文材料與方法一節。此外，該位置優選是FVII分子中位於組織因子結合位點區外和/或活性位點區外的部分。這些區域在下文材料和方法中得以識別。然而，值得強調的是，某些情況下(如期望獲得無活性的偶聯物)在這些區域內或其附近進行突變是有利的。例如，認為非多肽組分的一個或多個連接基團，如體內N-糖基化位點的連接基團，插入到FVII分子的活性位置區或活性位置結合槽的脊上是有利的。在下文材料與方法中定義了這種活性位點區及活性位點結合槽的脊，其由以下殘基構成I153，Q167，V168，L169，L170，L171，Q176，L177，C178，G179，G180，T181，V188，V189，S190，A191，A192，H193，C194，F195，D196，K197，I198，W201，V228，I229，I230，P231，S232，T233，Y234，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H241，D242，I243，A244，L245，L246，V281，S282，G283，W284，G285，Q286，T293，T324，E325，Y326，M327，F328，D338，S339，C340，K341，G342，D343，S344，G345，(3346，P347，H348，L358，T359，G360，I361，V362，S363，W364，G365，C368，V376，Y377，T378，R379，V380，Q382，Y383，W386，L387，L400和F405(活性位置區)；和N173，A175，K199，N200，N203，D289，R290，G291，A292，P321和T370(活性位置結合槽的脊)
為了確定連接基團的最佳分布，基於FVII或FVIIa分子的三維結構計算該多肽表面的胺基酸殘基間的距離。更具體的，對包含這種連接基團的胺基酸殘基的CB間的距離，或一種胺基酸的功能基團(賴氨酸的NZ，天冬氨酸的CG，穀氨酸的CD，半胱氨酸的SG)與包含連接基團的另一種胺基酸殘基的CB間的距離進行了確定。對於甘氨酸，使用CA而非CB。在本發明偶聯物的FVII或FVIIa多肽部分中，任何所述距離優選大於8，特別優選大於10，以避免或降低異源偶聯。
去除連接基團時，包含這種基團並佔據以上所述位置的相應胺基酸殘基優選用一種不同的胺基酸殘基取代，該胺基酸殘基不包含所述非多肽組分的連接基團。通常，將要去除的胺基酸殘基是可產生不利偶聯的胺基酸殘基，如位於多肽功能位點或其附近的胺基酸殘基(因為這些位點的偶聯可能因破壞受體識別而導致所產生的偶聯物失活或FVII或FVIIa的活性降低)。本文中術語「功能位點」是指對於FVII或FVIIa的功能或作用必不可少的或有關的胺基酸殘基。這種胺基酸殘基是所述功能位點的一部分。該功能位點可通過本領域已知方法確定，優選通過對FVIIa-組織因子複合物的結構分析進行識別(參見Banner等，Nature 1996；38041-46)。
引入連接基團時，包含這種基團的胺基酸殘基被引入該位置，優選通過取代佔據該位置的胺基酸殘基實現。
FVII或FVIIa多肽中存在並可用於偶聯的連接基團的確切數量依賴於期望通過偶聯達到的效果。獲得的效果取決於，例如偶聯的性質和程度(例如非多肽組分的確定，期望或可能與多肽偶聯的非多肽的數目，偶聯應該發生的部位或應該避免偶聯發生的部位等)。
功能性體內半壽期取決於偶聯物的分子量，而延長半壽期所需連接基團的數目因此依賴於所述非多肽組分的分子量。在一個實施方案中，當通過Laemmli，U.K.，Nature Vol 227(1970).P680-85中的SDS-PAGE測定時，本發明偶聯物具有至少67kDa，特別是至少70kDa的分子量。FVII具有大約53kDa的分子量，因此，為獲得所期望的作用，需要另外添加大約10-20kDa。這可通過例如，偶聯2到4個10kDa的PEG分子或本文描述的其它方法實現。
為了避免對親代分子的結構和功能造成太多破壞，通常偶聯物的多肽部分具有與SEQ ID NO1所示胺基酸序列90％以上的同一性，優選95％以上，如96％以上。具體的，偶聯物多肽部分通常具有與SEQ ID NO1所示胺基酸序列97％以上的同一性，如98％以上，99％以上，99.25％以上，99.25％以上或99.5％以上。
胺基酸序列同源性/同一性可以便利地用如ClustalW程序(版本1.8，1999年6月)，使用預設參數經序列比對確定(Thompson等，1994，ClustalWImproving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment throughsequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice，Nucleic Acids Research，224673-4680)，或通過使用GENEDOC版本2.5(Nicholas，K.B.，Nicholas H.B.Jr.，and Deerfield，D.W.II.1997 GeneDocAnalysis and Visualization of Genetic Variation，EMBNEW.NEWS 414；Nicholas，K.B.and Nicholas H.B.Jr.1997 GeneDocAnalysis and Visualizationof Genetic Variation)從PEAM家族信息庫版本4.0(http//pfam.wustl.edu/)(NucleicAcids Res.1999 Jan 1；27(1)260-2)中確定。
換一種說法，根據本發明將改變的胺基酸殘基的總數(與SEQ ID NO1胺基酸序列相比)通常不超過15個。優選，本發明偶聯物的FVII或FVIIa多肽部分或本發明的多肽包含一個胺基酸序列，其與SEQ ID NO1所示胺基酸序列有1-15個胺基酸殘基，通常是1-10個或2-10個胺基酸殘基的差異，例如1-8個或2-8個胺基酸殘基，如3-7個或4-6個胺基酸殘基的差異。因此，通常偶聯物的多肽部分或本發明的多肽包含與SEQ ID NO1所示胺基酸序列不同的胺基酸序列，其區別至多為15個胺基酸殘基(如15個胺基酸殘基)，至多14個胺基酸殘基(如14個胺基酸殘基)，至多13個胺基酸殘基(如13個胺基酸殘基)，至多12個胺基酸殘基(如12個胺基酸殘基)，至多11個胺基酸殘基(如11個胺基酸殘基)，至多10個胺基酸殘基(如10個胺基酸殘基)，至多9個胺基酸殘基(如9個胺基酸殘基)，至多8個胺基酸殘基(如8個胺基酸殘基)，至多7個胺基酸殘基(如7個胺基酸殘基)，至多6個胺基酸殘基(如6個胺基酸殘基)，至多5個胺基酸殘基(如5個胺基酸殘基)，至多4個胺基酸殘基(如4個胺基酸殘基)，至多3個胺基酸殘基(如3個胺基酸殘基)，至多2個胺基酸殘基(如2個胺基酸殘基)。
類似地，本發明的偶聯物通常包含，如1-15個非多肽組分，通常1-10個非多肽組分或2-10個非多肽組分，如1-8或2-8個非多肽組分，如1-6，1-4，3-7或4-6個非多肽組分。
優選，本發明偶聯物與rFVIIa(如NovoSeven)相比，具有一項或多項以下改進的特性功能性體內半壽期延長；血漿半壽期延長，腎清除率降低以及對蛋白酶解的敏感性降低。
從WO88/10295中獲知FVII/FVIIa的蛋白酶解發生在該分子中的多個蛋白酶解位點，即在K32，K38，I42，Y44，K143，R290，R315，K341，R392，R396以及R402(或位於K32-D33，K38-L39，I42-S43，Y44-S45，K143-R144，R290-G291，R315-K316，K341-G342，R392-S393，R396-P397以及R402-A403之間)。因此，增加例如功能性體內半壽期、增加血漿半壽期或降低對蛋白酶解敏感性的一個優選策略是在這些蛋白酶解位點的一個或多個位點和/或其附近改變親代多肽，所用方法是在這些位點上或其附近引入非多肽組分。因此，本發明一個優選實施方案中，在上述鑑定出的一個或多個位置上，或相對於直接參與蛋白酶解的位置-4，-3，-2，-1，1，2，3，4，優選位置-2，-1，1，2，如位置-1，1上，引入了連接基團。
更具體的，優選將非天然產生的體內糖基化位點，特別是非天然產生的體內N-糖基化位點(參見以下)，引入選自以下的位置28-48，139-147，286-294，311-319，338-345和388-406。具體的，優選將體內糖基化位點，如體內N-糖基化位點(參見以下)，引入選自以下的位置30-34，36-46，141-144，288-292，313-317，341-343，390-398和400-404。更優選，將體內糖基化位點，如體內N-糖基化位點(參見以下)，引入選自以下的位置31-33(如31，32或33位)，37-39(如37，38或39位)，41-46(如41，42，43，45或46位)，142-144(如142，143或144位)，289-291(如289，290或291位)，314-316(如314，315或316位)，341-342(如341，342或343位)，391-393(如391，392或393位)，395-397(如395，396或397位)和401-403(如401，402或403位)。本發明的偶聯物，其中是非多肽組分是具有賴氨酸作為連接基團的分子本發明一個實施方案中，非多肽組分包含賴氨酸作為連接基團，即，本發明偶聯物包含至少一個與多肽共價偶聯的非多肽組分，其中所述多肽的胺基酸序列不同於SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIa的胺基酸序列在於，其引入或去除了至少一個胺基酸殘基。
FVII/FVIIa包含17個賴氨酸殘基。三個賴氨酸殘基(K18，K62和K85)位於組織因子結合結構域，兩個賴氨酸殘基(K197和K341)位於活性位點區。
由於賴氨酸殘基在親代多肽中的相對高含量，認為至少一個賴氨酸殘基應該優選被去除，特別是通過用非賴氨酸殘基取代賴氨酸殘基去除，以避免對非多肽組分的過度偶聯。
因此，一個實施方案中，偶聯物的FVII或FVIIa多肽部分的胺基酸序列與SEQ ID NO1所示不同，差異在於，優選通過取代去除了至少一個賴氨酸殘基，如1-15賴氨酸殘基，特別是1-10，1-6或2-4賴氨酸殘基。例如，優選通過取代去除的賴氨酸殘基選自K18，K32，K38，K62，K85，K109，K137，K143，K148，K157，K161，K197，K199，K316，K337，K341，K389或其組合。具體的，優選去除賴氨酸殘基，該殘基是組織因子結合位點和/或活性位點區的組成部分，即，殘基K18，K62，K85，K197，K341或其組合物。這種賴氨酸殘基可以用任何其他胺基酸殘基取代，但優選被R，Q，N或H，更優選被R取代。
另一實施方案中，偶聯物的FVII或FVIIa多肽部分的胺基酸序列與SEQID NO1所示的序列不同，區別在於引入了至少一個賴氨酸殘基，如1-15賴氨酸殘基，特別是1-10，1-6或2-4賴氨酸殘基，優選通過替代引入。可理解，在親代分子預定位點引入至少一個賴氨酸殘基，與上述至少一個賴氨酸殘基的去除組合是優選的。因此，本發明一個優選的實施方案中，偶聯物的FVII或FVIIa多肽部分的胺基酸序列與SEQ ID NO1所示的序列不同，區別在於去除了至少一個賴氨酸殘基並且引入了至少一個賴氨酸殘基。
賴氨酸殘基可被引入的位置包括，但不限於上述蛋白酶解位點或其附近。因此，一個優選實施方案中，用賴氨酸殘基取代非賴氨酸殘基可選自I42K，Y44K，L288K，D289K，R290K，G291K，A292K，T293K，Q313K，S314K，R315K，V317K，L390K，M391K，R392K，S393K，E394K，P395K，R396K，P397K，G398K，V399K，L400K，L401K，R402K，A403K，P404K，F405K以或其組合，特別選自R290K，R315K，R392K，R396K，R402K或其組合。
根據本發明這一方面，偶聯物的非多肽組分可以是任何分子，當使用給定的偶聯方法以賴氨酸為連接基團時，優選非多肽組分是聚合物分子。所述聚合物分子可以是「與聚合物分子偶聯」一節中提及的任何分子，但優選選自線性或分支PEG或另一聚環氧烷。優選的聚合物分子的實例是來自Shearwater Polymers，Inc.的SS-PEG、NPC-PEG、醛-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC；來自Enzon，Inc.的SC-PEG；US5880255所述的tresylated mPEG；或氧羰基-氧-N-二羧基醯亞胺-PEG(US5122614)。
一般來說，與賴氨酸殘基偶聯時，非多肽組分的分子量約為5到約20kDa，例如從大約5到大約10kDa，如約5kDa或約10kDa。
應該理解本部分所述的任何胺基酸改變，尤其是取代，可與任何胺基酸改變組合，優選與本文中其他部分所述的特定取代的特定胺基酸改變，包括糖基化位點的引入和/或去除組合。本發明的偶聯物，其中非多肽組分是具有半胱氨酸作為連接基團的分子本發明的另一個實施方案中，非多肽組分以半胱氨酸作為連接基團，即本發明偶聯物包含至少一個與多肽共價偶聯的非多肽組分，其中所述多肽的胺基酸序列不同於SEQ ID NO1中野生型人FVII或FVIIa之處在於，至少引入或去除了一個半胱氨酸殘基。
FVII/FVIIa包含24個半胱氨酸殘基，二硫鍵在以下半胱氨酸殘基之間建立C17和C22，C50和C61，C55和C70，C72和C81，C91和C102，C98和C112，C114和C127，C135和C262，C159和C164，C178和C194，C310和C329，以及C340和C368之間。
另一個實施方案中，FVII或FVIIa多肽部分的胺基酸序列與SEQ IDNO1中的不同，差異在於引入至少一個賴氨酸殘基，如1-15個賴氨酸殘基，特別是1-10，1-6或2-4個賴氨酸殘基，優選通過取代引入。
可引入賴氨酸殘基的位置包括，但不限於上述蛋白酶解位點或其附近。
因此本發明一個實施方案中，優選通過取代引入的賴氨酸殘基選自I30C，K32C，D33C，A34C，T37C，K38C，W41C，Y44C，S45C，D46C，L141C，E142C，K143C，R144C，L288C，D289C，R290C，G291C，A292C，S314C，R315C，K316C，V317C，L390C，M391C，R392C，S393C，E394C，P395C，R396C，P397C，G398C，V399C，L401C，R402C，A403C，P404C或其組合，特別選自K32C，Y44C，K143C，R290C，R315C，K341C，R392C，R396C，R402C或其組合。
本發明進一步的實施方案中，半胱氨酸殘基被引入野生型hFVII中由具有至少25％的側鏈暴露於表面的那些蘇氨酸或絲氨酸殘基所佔據的位置。例如，在FVII或FVIIa多肽的至少一個位點上，優選通過取代引入半胱氨酸殘基，所述位點選自S12，S23，S43，S45，S52，S53，S60，S67，T83，S103，T106，T108，S111，S119，S126，T128，T130，S147，T185，S214，S222，S232，T233，T238，T239，T255，T267，T293，T307，S320，T324，S333，S336，T370和S393。更優選hFVII中至少一個含S殘基的位點上引入半胱氨酸殘基，所述位點選自S12，S23，S43，S45，S52，S53，S60，S67，S103，S111，S119，S126，S147，S214，S222，S232，S320，S333，S336和S393。
本發明進一步的實施方案中，半胱氨酸殘基被引入野生型hFVII中由具有至少50％側鏈暴露於表面的那些蘇氨酸或絲氨酸殘基所佔據的位置。例如，在FVII或FVIIa多肽的至少一個位置上優選通過取代引入一個半胱氨酸殘基，所述位置選自S23，S43，S52，S53，S60，S67，T106，T108，S111，S119，S147，S214，T238，T267和T293，更優選所述位置選自S23，S43，S52，S53，S60，S67，S111，S119，S147和S214。
進一步的實施方案中，半胱氨酸殘基被引入至少一個選自上述任一位置且並非活性位點區的位置。優選該位置由T或S殘基佔據。例如，FVII多肽包含引入到至少一個選自下組的位置上的半胱氨酸殘基S12，S23，S43，S45，S52，S53，S60，S67，T83，S103，T106，T108，S111，S119，S126，T128，T130，S147，T185，S214，S222，T255，T267，T307，S320，S333，S336，T370和S393(其超過25％的側鏈暴露於表面)，所述位置特別選自S12，S23，S43，S45，S52，S53，S60，S67，S103，S111，S119，S126，S147，S214，S222，S320，S333，S336和S393(由S殘基佔據)，更優選選自S23，S43，S52，S53，S60，S67，T106，T108，S111，S119，S147，S214和T267(其超過50％的側鏈暴露於表面)，特別選自S23，S43，S52，S53，S60，S67，S111，S119，S147和S214(由S殘基佔據)。
另外的實施方案中，半胱氨酸殘基被引入至少一個選自上述任一位置且並非組織因子結合位點區的位置。優選該位置由T或S殘基佔據。例如，FVII多肽包含引入至少一個位置上的半胱氨酸殘基，所述的位置選自S12，S23，S45，S52，S53，S67，T83，S103，T106，T108，S111，S119，S126，T128，T130，S147，T185，S214，S222，S232，T233，T238，T239，T255，T267，T293，S320，T324，S333，S336，T370和S393(其超過25％的側鏈暴露於表面)，特別選自S12，S23，S45，S52，S53，S67，S103，S111，S119，S126，S147，S214，S222，S232，S233，S320，S333，S336和S393(由S殘基佔據)，更優選選自S23，S52，S53，S67，T106，T108，S111，S119，S147，S214，T238，T267和T297(其超過50％的側鏈暴露於表面)，特別選自S23，S52，S53，S67，S111，S119，S147和S214(由S殘基佔據)。
另外的實施方案中，半胱氨酸殘基被引入至少一個選自上述任一位置且並非組織因子結合位點區或活性位點區的位置。優選該位置由T或S殘基佔據。例如，FVII多肽包含引入至少一個位置上的半胱氨酸殘基，所述位置選自S12，S23，S45，S52，S53，S67，T83，S103，T106，T108，S111，S119，S126，T128，T130，S147，T185，S214，S222，T255，T267，S320，S333，S336，T370和S393(其超過25％的側鏈暴露於表面)，特別選自S12，S23，S45，S52，S53，S67，S103，S111，S119，S126，S147，S214，S222，S320，S333，S336和S393(由S殘基佔據)，更優選選自S23，S52，S53，S67，T106，T108，S111，S119，S147，S214和T267(其超過50％的側鏈暴露於表面)，特別選自S23，S52，S53，S67，S111，S119，S147和S214(由S殘基佔據)。
儘管根據本發明這方面，偶聯物的非多肽組分可以是任何分子，但當使用給定的偶聯方法，以半胱氨酸作為連接基團時，優選非多肽組分是聚合物分子。聚合物分子可以是以「與聚合物分子的偶聯」為標題的章節中描述的任何分子，但優選選自線性或分支的聚乙二醇或另一聚環氧烷。一個實施方案中聚合物分子是PEG，如VS-PEG。多肽和聚合物之間的偶聯可以任何合適的方式來完成，如以「與聚合物分子的偶聯」為標題的章節中描述的，例如使用一步法或在所述章節中所涉及的多步法。當FVII或FVIIa多肽僅包含一個可偶聯的半胱氨酸殘基時，優選與具有約5kDa到約20kDa分子量(如從約10kDa到約20kDa，如分子量約為5kDa，約為10kDa，約為12kDa，約為15kDa，或約為20kDa)的非多肽組分偶聯，或者直接偶聯或者通過低分子量聚合物間接偶聯(按WO99/55377所公開的方法)。當偶聯物包含兩個或多個可偶聯的半胱氨酸殘基時，這些非多肽組分各自的分子量通常為約5到約10kDa，如約5kDa或約10kDa。
應該理解本部分所述的任何胺基酸的改變，尤其是取代，可與任何其他部分所述的胺基酸改變組合，優選本文中公開特定胺基酸改變的其他部分所述的特定取代，包括糖基化位點的引入和/或去除。
本發明的偶聯物，其中非多肽組分是具有天冬氨酸或穀氨酸作為連接基團的分子本發明的另一個實施方案中，非多肽組分以天冬氨酸或穀氨酸作為連接基團，即本發明偶聯物包含至少一個與多肽共價偶聯的非多肽，所述多肽的胺基酸序列不同於SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIa序列之處在於，引入或去除至少一個天冬氨酸殘基和/或至少一個穀氨酸殘基。
另一個實施方案中，FVII或FVIIa多肽部分的胺基酸序列與SEQ IDNO1所示不同，差異在於引入至少一個天冬氨酸殘基和/或穀氨酸殘基，如1-15個天冬氨酸殘基和/或穀氨酸殘基，特別是1-10，1-6或2-4個天冬氨酸殘基和/或穀氨酸殘基，優選通過取代引入。
可引入天冬氨酸殘基或穀氨酸殘基的位置包括，但不限於上述蛋白酶解位點處，或其附近。
因此，本發明一個實施方案中，優選通過取代引入的天冬氨酸殘基和/或穀氨酸殘基選自I30D/E，K32D/E，A34D/E，T37D/E，K38D/E，W41D/E，Y44D/E，S45D/E，D46C，L141D/E，E142D/E，K143D/E，R144D/E，L288D/E，R290D/E，G291D/E，A292D/E，Q313D/E，S314D/E，R315D/E，K316D/E，V317D/E，L390D/E，M391D/E，R392D/E，S393D/E，P395D/E，R396D/E，P397D/E，G398D/E，V399D/E，L401D/E，R402D/E，A403D/E，P404D/E或其組合，特別選自以下組或其組合K32D/E，Y44D/E，K143D/E，R290D/E，R315D/E，K341D/E，R392D/E，R396D/E，R402D/E。
除了上述取代，根據以上實施方案偶聯物的多肽可包含至少一個天冬氨酸殘基和/或穀氨酸殘基的去除，優選是通過取代。
由於賴氨酸殘基在親代多肽中的相對高含量，認為優選至少一個天冬氨酸或穀氨酸殘基應該被去除，特別是通過取代，以避免非多肽組分的過度偶聯。
因此，一個實施方案中，偶聯物的FVII或FVIIa多肽部分的胺基酸序列與SEQ ID NO1所示不同，差異在於去除至少一個天冬氨酸或穀氨酸殘基，如1-15個天冬氨酸或穀氨酸殘基，特別是1-10，1-6或2-4個天冬氨酸或穀氨酸殘基，優選通過取代去除。例如，優選通過取代去除的天冬氨酸或穀氨酸殘基選自D33，D46，D48，E77，E82，D86，D87，E94，E99，D104，E116，D123，E132，E142，E163，D196，E210，D212，E215，D217，D219，E220，D256，E265，E270，D289，E296，D309，D319，E325，D334，D338，D343，E385，E394或其組合。
應理解，向親代分子預定位點引入的至少一個天冬氨酸或穀氨酸殘基，與至少一個上述天冬氨酸或穀氨酸殘基的去除組合是尤其優選的。因此，本發明一個優選的實施方案中，偶聯物FVII或FVIIa多肽部分的胺基酸序列與SEQ ID NO1所示不同，區別在於至少一個天冬氨酸或穀氨酸殘基被去除(優選通過替代)並且至少一個天冬氨酸或穀氨酸殘基被引入(優選通過替代)。
根據本發明這一方面，具有天冬氨酸基團或穀氨酸基團作為其連接基團的偶聯物非多肽組分，可以是具有這種特性的任何非多肽組分，優選非多肽組分是聚合物分子或有機衍生試劑，特別是聚合物分子，並且偶聯物的製備如Sakane和Pardridge Pharmaceutical Research，Vol.14，No.8，1997，pp1085-1091。
應該理解所述本部分所述的任何胺基酸改變，尤其是取代，可與任何其他部分所述的胺基酸改變組合，尤其本文中公開胺基酸改變的其他部分的特定取代，包括糖基化位點的引入和/或去除。
本發明的偶聯物，其中非多肽組分是糖組分本發明又一個實施方案中，插入和/或去除了糖組分的連接基團，如糖基化位點，特別是體內的糖基化位點。
優選，本發明的偶聯物包含至少一個與多肽共價連接的糖組分，其中所述多肽的胺基酸序列與SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIa序列區別在於，其中至少一個非天然產生的糖基化位點被引入和/或至少一個天然產生的糖基化位點被去除。尤其，天然產生的糖基化位點的去除與非天然糖基化位點的引入，或非天然糖基化位點的去除組合。引入的糖基化位點可以是O-糖基化位點或N-糖基化位點。優選糖基化位點是體內O-糖基化位點或體內N-糖基化位點，特別優選體內N-糖基化位點。
用於本文的術語「天然產生的糖基化位點」包括在N145，N322，S52和S60位置的糖基化位點。同樣的，術語「天然產生的體內O-糖基化位點」包括S52和S60位置的糖基化位點，而術語「天然產生的體內N-糖基化位點」包括N145和N322位置的糖基化位點。
通常，FVII或FVIIa多肽的胺基酸序列與SEQ ID NO1中所示的序列區別在於，引入至少一個非天然產生的糖基化位點(如至少一個非天然產生的體內N-糖基化位點)，如1-15個非天然產生的糖基化位點(如1-15個非天然產生的體內N-糖基化位點)，特別是1-10，1-6，或2-4個非天然產生的糖基化位點(如1-10，1-6或2-4個非天然產生的體內N-糖基化位點)，優選通過取代引入。
應理解為了製備偶聯物(其中所述偶聯物多肽包含一個或多個糖基化位點)，所述多肽必須在能使糖(寡糖)組分連接至糖基化位點的宿主細胞中表達，或者在體外進行糖基化。可糖基化的宿主細胞在以下「與糖組分的偶聯」一節中進一步有實例。
這方面的實施方案中，體內糖基化位點被引入親代FVII或FVIIa分子中由暴露於該分子表面的胺基酸殘基佔據的位置，優選是超過25％的側鏈暴露於溶劑中的那些胺基酸殘基，特別是超過50％的側鏈暴露於溶劑中的那些(這些位置在文中方法章節內確定)。然後引入N-糖基化位點，所用方式使得所述位點的N-殘基位於所述位置中。類似的，引入O-糖基化位點以便組成該位點的S或T殘基位於所述位置。所述位置包括K32S/T，I42S/T，Y44S/T，K143S/T，R290S/T，R315S/T，K341S/T，R392S/T，R396S/T，R402S/T或其組合。
N-糖基化時，可將體內糖基化位點引入僅需要一個突變就可創造出所述位點的位置處(即，創建功能性糖基化位點所需的任何其它胺基酸殘基已存在於該分子內)。
換句話說，本發明的偶聯物優選是這樣一個偶聯物，其中多肽胺基酸序列與SEQ ID NO1的區別在於，至少一個天然產生的N-X′-X序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸(P)之外的任何胺基酸，X是除絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)外的任何胺基酸。
類似的，本發明的偶聯物優選是這樣一個偶聯物，其中多肽胺基酸序列與SEQ ID NO1的區別在於，至少一個SEQ ID NO1中天然產生的X-X′-S或X-X′-T序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸(P)之外的任何胺基酸，X是除N外的任何胺基酸。
創建體內N-糖基化位點的這類取代的特定實例包括選自以下組或其組合的取代F4S/T，P10N，Q21N，W41N，S43N，A51N，G58N，L65N，G59S/T，E82S/T，N95S/T，G97S/T，Y101N，D104N，T106N，K109N，G117N，G124N，S126N，T128N，A175S/T，G179N，I186S/T，V188N，R202S/T，I205S/T，D212N，E220N，i230N，P231N，P236N，G237N，V253N，E265N，T267N，E270N，R277N，L280N，G291N，P303S/T，L305N，Q312N，G318N，G331N，D334N，K337N，G342N，H348N，R353N，Y357N，I361N，V376N，R379N，M391N。優選所述取代選自以下組F4S/T，P10N，Q21N，W41N，A51N，G58N，G59S/T，N95S/T，G97S/T，Y101N，D104N，T106N，K109N，G117N，G124N，S126N，T128N，A175S/T，I186S/T，V188N，R202S/T，I205S/T，D212N，E220N，V253N，E265N，T267N，E270N，L280N，G291N，P303S/T，G318N，G331N，D334N，K337N，R353N，Y357N，M391N或其組合。
替代的，體內糖基化位點引入由賴氨酸殘基或精氨酸殘基所佔據的位置，優選由賴氨酸佔據，特別是N-糖基化位點的N-殘基或O-糖基化位點的S或T殘基取代所述賴氨酸殘基。
換句話說，本發明的偶聯物優選是這樣一個偶聯物，其中多肽的胺基酸序列與SEQ ID NO1的區別在於，至少一個SEQ ID NO1中天然產生的K-X′-X序列或R-X′-X序列，優選K-X′-X序列，被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸(P)之外的任何胺基酸，X是除絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)外的任何胺基酸。
創造體內N-糖基化位點的取代的實例包括選自以下組的取代K32N+A34S/T，K38N+F40S/T，K62N+Q64S/T，K85N+D87S/T，K137N+P139S/T，K143N+N145S/T，K148N+Q149S/T，K161N+E163S/T，K197N+K199S/T，K199N+W201S/T，K316N+G318S/T，K337N，K341N+D343S/T，K389N+M391S/T或其組合。
上述糖基化方面的一個實施方案中，糖基化位點，尤其是N-糖基化位點，可被引入上述蛋白酶解位點處，或其附近(參見「本發明的偶聯物」章節)。
因此，創造體內N-糖基化位點的取代的特定實例包括選自以下組的取代 K32N+A34S/T，F31N+D33S/T，I30N+K32S/T，A34N+R36S/T，K38N+F40S/T，T37N+L39S/T，R36N+K38S/T，L39N+W41S/T，F40N+I42S/T，W41N，I42N+Y44S/T，S43N，Y44N+D46S/T，S45N+G47S/T，D46N+D48S/T，G47N+Q49S/T，K143N+N145S/T，E142N+R144S/T，L141N+K143S/T，I140N+E142S/T，R144N+A146S/T，A146N+K148S/T，S147N+P149S/T，R290N+A292S/T，D289N+G291S/T，L288N+R290S/T，L287N+D289S/T，G291N，A292N+A294S/T，T293N+L295S/T，R315N+V317S/T，S314N+K316S/T，Q313N+R315S/T，Q312N，K316N+G318S/T，V317N+D319S/T，G318N，K341N+D343S/T，S339N+K341S/T，G342N，D343N+G345S/T，R392N+E394S/T，M391N，L390N+R392S/T，K389N+M391S/T，S393N+P395S/T，E394N+R396S/T，P395N+P397S/T，R396N+G398S/T，P397N+V399S/T，G398N+L400S/T，V399N+L401S/T，L400N+R402S/T，L401N+A403S/T，R402N+P404S/T，A403N+F405S/T，P404N+P406S/T或其組合，如K143N+N145S/T+R315N+V317S/T。優選，所述取代選自以下組K32N+A34S/T，K8N+F40S/T，Y44N+D46S/T，K143N+N145S/T，R290N+A292S/T，R315N+V317S/T，K341N+D343S/T，R392N+E394S/T，R396N+G398S/T，R402N+P404S/T或其組合，如K143N+N145S/T+R315N+V317S/T。更優選，所述取代選自K32N+A34T，K38N+F40T，Y44N+D46T，K143N+N145T，R290N+A292T，R315N+V317T，341N+D343T，R392N+E394T，R396N+G398T，R402N+P404T或其組合，特別是K143N+N145T+R315N+V317T。
本發明的另一個實施方案中，優選體內糖基化位點被引入這樣一個位置，其既不形成組織因子結合部分，也不形成活性位點區部分和此處定義的活性位點結合槽的脊。可想像這種糖基化變體主要屬於之前本文定義的活性偶聯物。
因此，創造體內N-糖基化位點的取代的特定實例包括選自以下組的取代K32N+A34S/T，I30N+K32S/T，A34N+R36S/T，K38N+F40S/T，T37N+L39S/T，W41N，Y44N+D46S/T，S45N+G47S/T，D46N+D48S/T，G47N+Q49S/T，K143N+N145S/T，E142N+R144S/T，L141N+K143S/T，I140N+E142S/T，R144N+A146S/T，A146N+K148S/T，S147N+P149S/T，L288N+R290S/T，L287N+D289S/T，R315N+V317S/T，S314N+K316S/T，K316N+G318S/T，V317N+D319S/T，G318N，R392N+E394S/T，M391N，L390N+R392S/T，K389N+M391S/T，S393N+P395S/T，E394N+R396S/T，P395N+P397S/T，R396N+G398S/T，P397N+V399S/T，G398N+L400S/T，V399N+L401S/T，L401N+A403S/T，R402N+P404S/T，A403N+F405S/T，P404N+P406S/T或其組合，如K143N+N145S/T+R315N+V317S/T。優選，所述取代選自以下組K32N+A34S/T，K38N+F40S/T，Y44N+D46S/T，K143N+N145S/T，R315N+V317S/T，R392N+E394S/T，R396N+G398S/T，R402N+P404S/T及其組合，如K143N+N145S/T+R315N+V317S/T。更優選，所述取代選自K32N+A34T，K38N+F40T，Y44N+D46T，K143N+N145T，R315N+V317T，R392N+E394T，R396N+G398T，R402N+P404T或其組合，特別是K143N+N145T+R315N+V317T。
本發明的另一個實施方案中，優選體內糖基化位點被引入這樣一個位置，其不形成組織因子結合部分，但其形成活性位點區的一部分和此處定義的活性位點結合槽的脊。可想像這種糖基化變體主要屬於之前本文定義的無活性偶聯物。
所以，創建這種體內N-糖基化位點的取代的特定實例包括選自以下的取代I153N+G155S/T，Q167N+L169S/T，V168N+L170S/T，L169N+L171S/T，L170N+V172S/T，L171N+N173S/T，A175S/T，A175N+L177S/T，L177N+G179S/T，G179N，G180N+L182S/T，T181N+I183S/T，V188N，V189N+A191S/T，S190N+A192S/T，A191N+H193S/T，H193N+F195S/T，F195N+K197S/T，D196N+I198S/T，K197N+K199S/T，I198N+N200S/T，K199N+W201S/T，W201N+N203S/T，R202S/T，I205S/T，V228N+I230S/T，I229N+P231S/T，I230N，P231N，S232N+Y234S/T，T233N+V235S/T，Y234N+P236S/T，V235N+G237S/T，P236N，G237N，T238N+N240S/T，T239N+H241S/T，H241N+I43S/T，D242S/T，I243N+L245S/T，A244N+L246S/T，L245N+R247S/T，L246N+L246S/T，V281N+G283S/T，S282N+W284S/T，G283N+G285S/T，W284N+Q286S/T，G285N+L287S/T，Q286N+L288S/T，D289N+G291S/T，R290N+A292S/T，G291N，A292N+A294S/T，T293N+L295S/T，P321N+I323S/T，T324N+Y326S/T，E325N+M327S/T，Y326N+F327S/T，F328N+A330S/T，S339N+K341S/T，K341N+D343S/T，G342N+S344S/T，D343N+G345S/T，S344N+G346S/T，G345N+P347S/T，P347N+A349S/T，H348N，L358N+G360S/T，T359N+I361S/T，G360N+V362S/T，I361N，V362N+W364S/T，S363N+G365S/T，W364N+Q366S/T，G365N+G367S/T，T370N+G372S/T，V376N，Y377N+R379S/T，T378N+V380S/T，R379N，V380N+Q382S/T，Q382N+I384S/T，Y383N+E385S/T，W386N+Q388S/T，L387N+K389S/T，L400N+R402S/T及其組合。優選選自以下的取代 D289N+G291S/T，R290N+A292S/T，G291N，A292N+A294S/T，T293N+L295S/T，S339N+K341S/T，K341N+D343S/T，G342N+S344S/T，D343N+G345S/T，及其組合，更優選選自以下的取代 D289N+G291T，R290N+A292T，G291N，A292N+A294T，T293N+L295T，S339N+K341T，K341N+D343T，G342N+S344T，D343N+G345T，及其組合。
除了糖組分外，根據本發明這方面在本章節中說明的偶聯物可含有另外的非多肽組分，特別是聚合物分子，如本發明所述，其偶聯到偶聯物多肽部分的一個或多個連接基團上。
應理解本章節中特定的任何胺基酸改變，尤其是取代，可與本文其他部分中說明的特定胺基酸改變(尤其是取代)組合。
例如，本章節中公開的任何糖基化變體(所述變體具有至少一個被引入和/或去除的糖基化位點，如包含R315N+V317T和/或K143N+N145T的取代)，可進一步與一個聚合物分子，如PEG，或任何其他的非多肽組分偶聯。為此，可通過使用FVII或FVIIa中現有的連接基團，或被引入和/或去除連接基團，尤其使得可用於偶聯的連接基團總數為1-6，特別是3-4或1，2，3，4，5，或6個而獲得偶聯物。
優選，在本發明偶聯物中(其中FVII或FVIIa多肽包含兩個糖基化位點)，非多肽組分的數量和分子量是經過選擇的以使添加非多肽組分後的總分子量在5-25kDa的範圍內，如在10-25kDa範圍內，特別是約5kDa，12kDa，15kDa或20kDa。
無活性偶聯物本發明偶聯物可通過去除至少一個胺基酸殘基造成失活，所述胺基酸佔據的位置選自SEQ ID NO1的R152，I153，S344，D242和H193。這種去除可通過取代或缺失一個或多個上述胺基酸殘基實現。優選，這種去除是通過取代實現，尤其通過保守取代實現。相應的，本文中所用無活性FVII或FVIIa多肽可包含一個或多個下述取代R152X，I153X，S344X，D242X或H193X，其中X是任何胺基酸殘基，優選是導致保守性取代的胺基酸殘基。例如，無活性的FVII或FVIIa多肽包含R152X突變，其中X是除了賴氨酸以外的任何胺基酸殘基(由於賴氨酸形成部分蛋白酶解位點的一部分)。特異性取代的其他實例包括I153A/V/L；S344T/A/G/Y；D242E/A和/或H193R/A。
替代的，活性FVII或FVIIa可能因I153α胺基酸基團的氨甲醯化，或通過將所述多肽與絲氨酸蛋白酶抑制劑複合而使其失活。合適的絲氨酸抑制蛋白，例如選自有機磷化合物，sulfanylfluoride，滷甲基酮肽，優選丹磺酸-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸氯甲基酮，丹磺酸-穀氨酸-穀氨酸-精氨酸氯甲基酮，丹磺酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮，或苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮，或azapeptide。
偶聯物也可通過在選定的位置引入至少一個糖基化位點導致失活，以使後續的糖基化使偶聯物失活。
如上「本發明的偶聯物，其中非多肽組分是糖組分」章節的最後部分中所述，優選糖基化位點被引入這樣一個位點，其不形成組織因子的一部分但形成活性位點區的一部分和本文定義的活性位點結合槽的脊。優選取代的特定例子在「本發明的偶聯物，其中非多肽組分是糖組分」章節中給出。
本發明偶聯物的非多肽組分如上所述，本發明偶聯物的非多肽組分優選選自聚合物分子、親脂性化合物、糖組分(通過體內糖基化的方式)和有機衍化劑。所有這些物質都可為偶聯物的多肽部分提供所需性質，特別是增加功能性體內半壽期和/或增加血漿半壽期。偶聯物的多肽部分可以僅與一種類型的非多肽組分偶聯，但也可以與兩種或多種不同類型的非多肽組分偶聯，例如，與聚合物分子和糖組分偶聯，與親脂性基團和糖組分偶聯，與有機衍化劑和糖組分偶聯，與親脂性基團和聚合物分子偶聯等。與兩種或多種不同類型的非多肽組分偶聯可同時或按順序進行。
製備本發明偶聯物的方法在下列章節「與親脂性化合物的偶聯」，「與聚合物分子的偶聯」，「與糖組分的偶聯」和「與有機衍化劑的偶聯」中描述與各指定類型非多肽的偶聯。一般，本發明的多肽偶聯物通過在有利於所述多肽表達條件下培養合適的宿主細胞，獲取所述多肽，其中a)所述多肽包含至少一個N-或O-糖基化位點，所述宿主細胞是可進行體內糖基化的真核細胞，和/或b)所述多肽可體外偶聯非多肽組分。
應理解，對偶聯的設計應使所得分子在所連接的非多肽組分的數量，這類分子的大小和形式(如線性或分支)，以及在所述多肽上的連接位點各方面最佳。使用的非多肽組分的分子量可，如基於希望達到的效果進行選擇。例如，如果偶聯的主要目的是獲得具有高分子量的偶聯物(如降低腎清除率)，通常要偶聯儘量少的高分子量非多肽組分，以獲得期望的分子量。如果希望獲得高度的掩蓋，可使用足量的低分子量非多肽組分(如分子量從約300Da到約5kDa，如分子量從300Da到2kDa)，以有效掩蓋所有或大多數的蛋白酶解位點，或所述多肽中其他易被破壞的位點。
與親脂性化合物的偶聯多肽和親脂性化合物可以直接或通過使用接頭彼此偶聯。親脂性化合物可以是天然的化合物如飽和或不飽和脂肪酸、脂肪酸二酮、萜烯、前列腺素、維生素、類胡蘿蔔素或甾體激素，或者合成的化合物如碳酸、醇、胺和具有一個或多個烷基-、芳基-、鏈烯基-的磺酸或其它多元不飽和化合物。可按本領域已知的方法，如按Bodanszky在Peptide Synthesis，John Wiley，New York，1976和WO96/12505所述的方法來進行多肽和親脂性化合物之間的偶聯(任選通過接頭來連接)。
與聚合物分子偶聯，包括聚合物分子與多肽N末端的偶聯與多肽偶聯的聚合物分子可以是任何合適的聚合物分子，如天然或合成的均聚物或雜聚物，通常所述分子的分子量範圍約為300-100000Da，如約500-20000Da，更優選約為500-15000Da，甚至更優選的範圍約為2-15kDa，如範圍約為3-10kDa。當此處所用術語「約」涉及某一分子量時，「約」就表示大約的平均分子量，且反映這樣一個事實，即在一定的聚合物製品中通常有一定的分子量分布。
均聚物的實例包括聚醇(即，聚-OH)、聚胺(即，聚-NH2)和聚羧酸(即，聚-COOH)。雜聚物是包含不同的偶聯基團，如羥基基團和氨基基團的聚合物。
合適的聚合物分子的實例包括選自以下的聚合物分子聚環氧烷(PAO)，包括聚亞烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分支的PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚碳酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯共馬來酸酐，聚苯乙烯共馬來酸酐，葡聚糖包括羧甲基葡聚糖或任何其它適於減小免疫原性和/或增加功能性體內半壽期和/或血清半壽期的生物聚合物。聚合物分子的另一實例是人白蛋白或另一豐富的血漿蛋白。一般來說，聚亞烷基二醇衍生的聚合物是生物相容的、無毒的、無抗原性的、無免疫原性的，具有各種水溶性特性並易於從活的生物中分泌。
PEG是優選的聚合物分子，因為其與，例如多糖如葡聚糖相比僅僅具有極少量的能夠交聯的反應基團。特別感興趣的是單功能PEG，如單甲氧基聚乙二醇(mPEG)，因為其偶聯的化學相對簡單(僅僅一個反應基團可用於與多糖上的連接基團偶聯)。因此，交聯的危險被消除，所得多肽偶聯物更均一併且聚合物分子與多肽的反應更易於控制。
為了使聚合物分子與多肽共價結合，聚合物分子的羥基末端基團必須為活化形式，即具有反應性功能基團(其實例包括伯胺基團、醯肼(HZ)、巰基、琥珀酸酯(SUC)、琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀醯亞胺基琥珀醯胺(SSA)、琥珀醯亞胺基丙酸酯(SPA)、琥珀醯亞胺基羧甲基化物(SCM)、苯並三唑碳酸酯(BTC)、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、醛、硝基苯基碳酸酯(NPC)和tresylate(TRES))。適當激活的聚合物分子有商品例如可得自ShearwaterPolymer，Inc.，Huntsville，AL，USA或得自PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK。
或者，聚合物分子可通過本領域已知的常規方法，例如，如WO90/13540中所述激活。本發明中所使用的激活的線性或分支的聚合物分子的特定實例描述於Shearwater Po1ymers，Inc.1997和2000 Catalogs(FunctionalizedBiocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals，Polyethylene Glycoland Derivatives，引入本文供參考)。
激活的PEG聚合物的特定實例包括下列線性PEGsNHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG和SCM-PEG)，和NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG和支鏈PEG如PEG2-NHS和US5,932,462和US5,643,575中所公開的那些，將兩參考引入本文供參考。此外，引入本文供參考的下列出版物中公開了有用的聚合物分子和/或PEG化化學過程 US5,824,778，US5,476,653，WO97/32607，EP229,108，EP402,378，US4,902,502，US5,281,698，US5,122,614，US5,219,564，WO92/16555，WO94/04193，WO94/14758，WO94/17039，WO94/18247，WO94/28024，WO95/00162，WO95/11924，WO95/13090，WO95/33490，WO96/00080，WO97/18832，WO98/41562，WO98/48837，WO99/32134，WO99/32139，WO99/32140，WO96/40791，WO98/32466，WO95/06058，EP439 508，WO97/03106，WO96/21469，WO95/13312，EP921 131，US5,736,625，WO98/05363，EP809 996，US5,629,384，WO96/41813，WO96/07670，US5,473,034，US5,516,673，EP605 963，US5,382,657，EP510 356，EP400 472，EP183 503和EP154 316。
多肽和激活的聚合物分子的偶聯可通過使用任何常規方法，例如，按下列參考文獻所述(所述參考文獻中也描述了激活聚合物分子的適宜方法)進行R.F.Taylor，(1991)，″Protein immobilisation.Fundamental and applications″，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，″Chemistry of Protein Conjugationand Crosslinking″，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson et al.，(1993)，″Immobilized Affinity Ligand Techniques″，Academic Press，N.Y.)。技術人員會知道根據所述多肽的連接基團(以上已給出實例)以及聚合物的功能基(例如，是氨基、羥基、羧基、醛，sulfydryl，琥珀醯亞胺，馬來醯亞胺，vinysulfone或滷代醋酸鹽)來使用激活方法和/或偶聯化學。PEG化可以與多肽上的所有可利用的基團(即，暴露於多肽表面的連接基團)直接進行偶聯或可以與一個或多個特定的連接基團如，N-末端氨基直接偶聯(如US5985265描述的)。而且，偶聯可以在一步中完成或以多步方式(如，WO99/55377中所述的)來完成。
應理解PEG化作用需設計為使所得分子在結合的PEG分子數目、這些分子的大小和形式(如，是線性的還是分支的)，以及在多肽分子中結合這些分子的位置各方面最佳。例如，可以根據需要達到的效果來選擇所使用的聚合物的分子量。例如，如果偶聯的主要目的是產生具有高分子量的偶聯物(如，減小腎的清除)，通常理想的是偶聯儘可能少的高分子量聚合物分子以獲得所需分子量。當需要高度掩蓋時，可通過使用足夠數量的低分子量聚合物(如，分子量約為300Da-5kDa)來獲得，這樣可有效地掩蓋多肽中所有的或大部分的蛋白酶解位點或所述多肽的易受破壞的位點。例如，可使用2-8，如3-6個這樣的聚合物。
僅與蛋白質上一個連接基團偶聯(如N-末端氨基基團)時，有利的是線性或分支的聚合物具有高分子量，優選約10-25kDa，如約15-25kDa，例如約20kDa。
一般來說，聚合物的偶聯條件是使所有可利用的聚合物連接基團與聚合物分子反應。這可以通過使所述聚合物相對於所述多肽適當摩爾過量來實現。通常，激活的聚合物分子與多肽的摩爾比為1000-1，如約200-1，或約100-1。為獲得最佳反應有些情況下所述摩爾比也可能略低，如約50-1，10-1或5-1。
本發明也打算通過接頭來將聚合物分子與多肽偶聯。合適的接頭是技術人員公知的。優選的實例是氰尿醯氯(Abuchowski等，(1977)，J.Biol.Chem.，252，3578-3581；US4179337；Shafer等人(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
偶聯後，按本領域已知的方法如通過將伯胺加入到反應混合物中來封閉殘留的活化聚合物分子，並通過合適的方法除去所產生的失活的聚合物分子。
應理解基於各種條件(如多肽的胺基酸序列，使用的活性PEG化合物的性質以及特定的PEG化條件，包括PEG與多肽的摩爾比)，可能獲得不同程度的PEG化，較高程度的PEG化通常來自PEG與多肽的較高摩爾比。然而，來源於任何給定PEG化過程的PEG化多肽，通常包含PEG化程度略有不同的多肽偶聯物的隨機分布。
本發明一個實施方案，本發明多肽偶聯物包含一個與SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIaN末端A1共價連接的聚合物分子，其中所述聚合物分子是與所述多肽連接的唯一聚合物分子。優選這種多肽偶聯物包含與該多肽N末端連接的單一PEG分子，並且沒有其他PEG分子。特別優選分子量至少約5kDa，尤其約10-25kDa，如約15-25kDa，例如約20kDa的線性或分支的PEG分子。根據這一實施方案的多肽偶聯物可進一步包含一個或多個糖組分，所述糖組分連接於所述多肽N-連接的或O-連接的糖基化位點，或通過體外糖基化連接。
本發明另一個實施方案中，本發明多肽偶聯物包含聚合物分子，所述聚合物分子與SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIa N末端A1和N末端I153共價連接，所述聚合物分子是與所述多肽連接的唯一聚合物分子。優選這種多肽偶聯物包含與該多肽N末端連接的單一PEG分子，並且沒有其他PEG分子。特別優選分子量至少約5kDa，尤其約10-25kDa，如15-25kDa，例如約20kDa是優選的。根據這一實施方案的多肽偶聯物可進一步包含一個或多個糖組分，所述糖組分連接於所述多肽N-連接的或O-連接的糖基化位點，或通過體外糖基化連接。
將聚合物(如PEG分子)選擇性地偶聯到多肽N-末端的方法中，US5985265中公開的方法是優選的。所述方法包括還原性烷基化(多肽N-末端氨基基團與含醛基的多肽，如醛基化-PEG，在存在還原劑，如NaCNBH3，的條件下反應，)。所述方法利用多肽中可用於衍生的不同伯氨基團(賴氨酸和N-末端相對比)的不同反應性，獲得所述多肽的多種可選的衍生物，其N-末端羧基基團包含聚合物分子，如醛化PEG。所述反應在一個pH值下進行，所述pH值準許利用賴氨酸殘基的ε-氨基基團與多肽N-末端殘基α氨基基團的pKa差異。為了獲得這種不同反應性，所述反應通常在弱酸條件下進行。合適的pH值範圍包括pH4.5-7，如pH4.5-6，如pH5-6，特別是約pH5。
其他特定實施方案中，本發明的多肽偶聯物包含一個PEG分子，所述PEG分子連接在多肽中可進行PEG化的每個賴氨酸殘基上，尤其是線性的或分支的PEG分子，如分子量約1-15kDa，典型的約2-12kDa，如約3-10kDa，如約5kDa或6kDa。
其他實施方案中，本發明的多肽偶聯物包含PEG分子，所述PEG分子連接在多肽中可進行PEG化的每個賴氨酸殘基上，同時還連接在多肽N-末端的胺基酸殘基上。
碳水化合物組分(如葡聚糖)與所述多肽胺基酸殘基在體外的共價偶聯也可使用WO87/05330和Aplin等人的CRC Crit Rev.Biochem.，pp.259-306，1981中描述的方法。碳水化合物組分或PEG與蛋白質結合型和肽結合型Gln-殘基的體外偶聯也可以通過穀氨醯胺轉移酶(TGases)來進行。穀氨醯胺轉移酶以一種所謂的交聯反應的方式催化供體氨基基團轉移到蛋白-和肽-結合的Gln殘基上。供體氨基基團可以是蛋白-或肽-結合的，如賴氨酸殘基中的ε氨基基團，或也可以是小或大的有機分子的一部分。在穀氨醯胺轉移酶催化的交聯中作為氨基供體的小的有機分子如腐胺(1，4二氨基丁烷)。在穀氨醯胺轉移酶催化的交聯中作為氨基供體的大的有機分子如含氨基-PEG(Sato等，1996，Biochemistry 35，13072-13080)。
通常穀氨醯胺轉移酶是高度特異的酶，並非所有暴露於蛋白表面的Gln殘基都可用於穀氨醯胺轉移酶催化的含氨基物質的交聯。相反只有少數Gln殘基是穀氨醯胺轉移酶的天然底物，但對於控制Gln殘基作為適合的穀氨醯胺轉移酶底物的確切參數仍不可知。因此，為了使蛋白對穀氨醯胺轉移酶催化的交聯反應敏感，經常的前提是在方便的位置增加一段胺基酸序列，所述胺基酸序列已知可很好地用做穀氨醯胺轉移酶的底物。已知幾種胺基酸序列可為穀氨醯胺轉移酶的底物，或包含穀氨醯胺轉移酶的底物，如P物質，elafin，纖維蛋白原，纖連蛋白，α2-纖溶酶抑制劑，α-酪蛋白，和β-酪蛋白。
與糖組分的偶聯為了完成FVII分子(包含一個或多個糖基化位點)的體內糖基化，編碼多肽的核苷酸序列必須被插入到糖基化的真核表達宿主中。表達宿主細胞可選自真菌(絲狀真菌或酵母)、昆蟲、或動物細胞，或選自轉基因植物細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞，如CHO細胞、BHK細胞或HEK細胞，如HEK293細胞，或昆蟲細胞，如SF9細胞，或者酵母細胞如釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)或畢赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)或任何下文進一步描述的宿主細胞。
與有機衍生劑的偶聯所述多肽的共價修飾可通過多肽的一個或多個連接基團與有機衍生劑反應來進行。合適的衍生劑和方法在本領域中是公知的。例如，半胱氨醯基殘基常常與(-滷代乙酸酯(和相應的胺)，如氯乙酸或氯乙醯胺反應產生羧甲基或羧基醯胺基甲基衍生物。半胱氨醯基殘基也可與溴三氟丙酮、(-溴-(-(4-咪唑基)丙酸、氯乙醯基磷酸酯、N-烷基馬來醯亞胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、對氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯並-2- -1，3-二唑反應進行衍生。組氨醯基殘基通過與二乙基焦碳酸酯在pH5.5-7.0下反應進行衍生，因為該試劑較特異於組氨醯基側鏈。對溴苯甲醯甲基溴化物可用於衍生；該反應優選在0.1M卡可酸鈉中於pH6.0下進行反應。賴氨醯基和氨基末端殘基可與琥珀酸酐或其它羧酸酐反應。用這些試劑衍生具有使賴氨醯基殘基的電荷逆轉的作用。衍生含(-氨基的殘基的其它合適的試劑包括亞氨基酯如methyl picolinimidate、磷酸吡多醛、吡多醛、氯代氫硼化物、三硝基苯磺酸、鄰甲基異脲、2，4-戊二酮和轉氨酶催化的與乙醛酸鹽的反應。精氨醯基殘基通過與一種或多種常規試劑的反應來修飾，所述試劑包括苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-環己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生要求反應在鹼性條件下進行，因為胍功能基具有高的pKa。
此外，這些試劑可與賴氨酸以及精氨酸胍基反應。羧基側基(天冬氨醯基或穀氨醯基)通過與碳二亞胺(R-N＝C＝N-R′)反應來進行選擇性地修飾，其中R和R′是不同的烷基，如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮翁-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。而且，天冬氨醯基和穀氨醯基通過與銨離子反應轉化為天冬醯醯胺基和穀氨醯醯胺基。
功能性位點的封閉已經報導聚合物的過度偶聯可導致與聚合物偶聯的多肽活性喪失。該問題可通過如去除位於功能性位點的連接基團，或在偶聯前可逆性封閉功能性位點使功能位點在偶聯時被覆蓋而消除。後一種策略構成本發明進一步的技術方案(前一種策略在上文中進行了舉例說明，如通過去除鄰近功能性位點的賴氨酸殘基)。更具體來說，按照第二種策略，多肽和非多肽組分之間的偶聯是在多肽功能性位點用能夠結合多肽功能性位點的輔助分子(如可結合所述多肽功能位點的組織因子或絲氨酸蛋白酶抑制劑)封閉的條件下進行的。
優選地，輔助分子能特異性識別多肽功能性位點，如受體，特別是組織因子，或者是全長的，或者是適當截短形式的組織因子，或是兩個分子，其中一個是組織因子，另一個是一種肽或肽的抑制劑，其可結合到催化三聯體上(優選定義為催化三聯體附近10區域的胺基酸殘基)，從而保護該區域。
另外，輔助分子可以是抗體，特別是識別FVII多肽的單克隆抗體。特別是，輔助分子可以是中和性單克隆抗體。
可使多肽在偶聯之前與輔助分子相互作用。這確保多肽的功能性位點被掩蓋或保護並因此而不能被非多肽組分如聚合物衍生。從輔助分子洗脫後，非多肽組分和多肽之間的偶聯物可用至少部分保留的功能性位點來恢復。
具有被封閉的功能性位點的多肽與聚合物、親脂性化合物、糖組分、有機衍生劑或任何其它化合物的隨後偶聯以常規方式進行，如按上文「與……偶聯」的章節中所述的方法進行。
不考慮用於掩蓋偶聯物中多肽功能性位點的輔助分子的性質，理想的是輔助分子不含或僅僅含有少量的與分子中指定非多肽組分結合的基團，其中與這些基團的偶聯將阻止偶聯的多肽從輔助分子上解吸。因此，可與多肽非掩蓋部分中存在的連接基團選擇性偶聯並且輔助分子可反覆用於重複偶聯。例如，如果非多肽組分是聚合物分子如PEG這種具有賴氨酸(氨基或N-末端胺基酸殘基作為連接基團的分子時，理想的是輔助分子基本上不含可偶聯的(氨基，優選不含任何(氨基。因此，在優選的實施方案中，輔助分子是能夠與多肽功能性位點結合的蛋白質或肽，該蛋白質或肽不含任何與指定非多肽組分可偶聯的連接基團。
在進一步的實施方案中，輔助分子首先與固相如柱填充材料，如Sephadex或瓊脂糖珠，或表面，如反應容器共價連接。然後，將多肽裝於載有輔助分子的柱材料上並按本領域已知的方法進行偶聯，如按上文「與……偶聯」的章節中所述的方法進行。該方法允許多肽偶聯物通過洗脫從輔助分子上分離。多肽偶聯物在不導致多肽偶聯物實質性降解的理化條件下通過常規技術進行洗脫。含有多肽偶聯物的流動相從固相上分離而輔助分子仍然共價連接。分離可以其它方式來完成例如，輔助分子可用第二種可通過特異性結合劑(如，鏈黴抗生物素)來識別的分子(如生物素)來衍生。特異性結合劑可以與固相連接並因此允許通過流經第二輔助分子-固相柱，並隨後洗脫輔助分子-第二分子複合體，而非多肽偶聯物，可使多肽偶聯物與輔助分子-第二分子複合體分離。多肽偶聯物以任何合適的方式從輔助分子上釋放。可通過提供的條件完成脫保護，其中輔助分子從其結合的FVII的功能性位點上分離。例如，與聚合物偶聯的抗體和抗獨特型抗體之間的複合物可通過將pH調節到酸性或鹼性pH來分離。更優選使用識別FVII的Ca2+特異構象的構象特異性抗體，最後在溫和條件下用EDTA洗脫。
絲氨酸蛋白酶抑制劑的連接絲氨酸蛋白酶抑制劑的連接可根據WO96/12800中所述方法進行。
標記多肽的偶聯在另外的實施方案中，多肽作為融合蛋白(與標記物的，即通常由1-30，如1-20個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或肽段)來表達。除了允許快速和容易地進行純化，標記物是完成標記多肽和非多肽組分之間偶聯的便利工具。特別是，標記物可用於在微滴定板或其它載體如順磁珠上完成偶聯，這樣標記的多肽可通過標記物來固定。在微滴定板上與標記的多肽偶聯的優點是，標記的多肽可從培養肉湯直接固定到微滴定板上(原則上不經任何純化)並進行偶聯。因此，可減少操作步驟的總數(從表達到偶聯)。而且，標記物可起間隔臂分子的作用以確保使固定的多肽更易於偶聯。使用標記多肽進行的偶聯可以是與本文中公開的任何非多肽組分的偶聯，如與聚合物分子如PEG的偶聯。
對使用的特定標記物的識別不是關鍵，只要該標記物能夠與多肽一起表達並且能夠固定在適宜的表面或載體物質上即可。許多適宜的標記物可通過商業渠道獲得，例如，可購於Unizyme Laboratories，Denmark。例如，所述標記物可以是任一下列序列His-His-His-His-His-HisMet-Lys-His-His-His-His-His-HisMet-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-HisMet-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln或任一下列序列EQKLI SEEDL(描述於Mol.Cell.Biol.53610-16，1985的C-端標記物)DYKDDDDK(C-或N-端標記物)YPYDVPDYA抗上述標記物的抗體通常可通過商業渠道獲得，例如購於ADI，AvesLab和Research Diagnostics。
隨後從多肽上切割標記物可通過市售酶進行。
製備本發明多肽或本發明偶聯物多肽的方法本發明的多肽或本發明偶聯物的多肽部分(任選為糖基化形式)可通過本領域已知的任何合適的方法來製備。這些方法包括構建編碼該多肽的核苷酸序列並在合適的轉化或轉染宿主中表達該序列。優選宿主細胞是γ-羧基化的宿主細胞，如哺乳動物細胞。然而，可通過化學合成方法或化學合成方法的組合或者化學合成方法和重組DNA技術的組合來產生本發明的多肽，但效率很低。
編碼本發明多肽或偶聯物多肽部分的核苷酸序列可通過分離或合成編碼具有SEQ ID NO1所示胺基酸序列的親代FVII，如hFVII的核苷酸序列來構建，然後改變所述核苷酸序列以引入(即插入或取代)或消除(即去除或取代)相關胺基酸殘基。
核苷酸序列可通過公知方法經定點誘變方便地進行修飾。或者，核苷酸序列可通過化學合成來製備，例如通過使用寡核苷酸合成儀，其中基於所需多肽的胺基酸序列來設計寡核苷酸，並且優選選擇有利於在生產重組多肽的宿主細胞中表達的那些密碼子。例如，可以合成多個編碼所需多肽各部分的小分子寡核苷酸，然後通過PCR、連接反應或連接酶鏈反應(LCR)(Barany，PNAS 88189-193，1991)將所述寡核苷酸裝配起來。各個寡核苷酸通常含有5′或3′突出端用於互補裝配。
另外的核苷酸序列修飾方法可用於產生多肽變體以便高流量篩選的，例如US5093257中公開的有關同源交換的方法，以及有關基因改組的方法，即兩個或多個同源核苷酸序列間的重組，導致產生與起始核苷酸序列相比有許多核苷酸改變的新的核苷酸序列。基因改組(也被稱為DNA改組)涉及一次或多次核苷酸序列的隨機片段化和重新裝配的循環，隨之通過篩選選擇編碼具有所期望特性的多肽的核苷酸序列。為了使基於同源性的核酸改組能夠發生，所述核苷酸序列的相關部分優選至少有50％的同一性，如至少60％的同一性，更優選至少70％的同一性，如至少80％的同一性。重組可在體外或體內進行。
以下文獻中顯示了適當的體外基因改組方法Stemmer等，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；vol.91，pp.10747-10751；Stemmer(1994)，Naturem vol.370，pp.389-391；Smith(1994)，Nature vol.370，pp.324-325；Zhao等，Nat.Biotechnol.1998.Mar；16(3)258-61；Zhao H.和Amold，FB，Nucleic AcidsResearch，1997，Vol.25.No.6 pp.1307-1308；Shao等，Nucleic Acids Research1998，Jan 15；26(2)pp.681-83；以及WO95/17413。
WO97/07205中公開了一種合適的體內改組方法。其他通過體外或體內重組進行核酸誘變的技術在，如WO97/20078和US5837458中公開。特別的改組技術包括「基因族改組(Family shuffling)」，「合成改組」「計算機化(insliico)改組」。
基因族改組是使來自不同種屬的一族同源基因進行一次或多次的改組和後續篩選或選擇的循環。基因族改組技術在一些文獻中有說明，如Crameri等，(1998)，Nature，vol.391，pp.288-291；Christians等，(1999)，NatureBiotechnology，vol.17，pp.259-264；Chang等(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，pp.793-797；以及Ness等(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，893-896。
合成改組涉及提供重疊的合成寡核苷酸文庫，該文庫基於，如目的同源基因之間的序列比對。對這種合成的寡核苷酸進行重組，篩選得到的重組核酸序列，如需要可進行進一步的改組循環。WO00/42561中有關於合成改組的說明。
計算機化(In silico)改組指一種DNA改組過程，由計算機系統進行或模擬，因此部分或完全無須對核酸進行物理操作。WO00/42560中有關於計算機化(in silico)改組的說明。
一旦裝配(通過合成、定點誘變或另一方法)後，編碼多肽的核苷酸序列立即被插入重組載體中，並與FVII在目標轉化宿主細胞中表達必需的調控序列可操作地連接。
當然，應理解不是所有載體和表達調控序列都能同樣良好地表達本文所述多肽變體的核苷酸序列。不是所有宿主都能使相同的表達系統發揮同樣優良的功能。然而，本領域技術人員不用進行實驗就可以對這些載體、表達調控序列和宿主作出選擇。例如，在選擇載體時必須考慮宿主，因為載體必須在其中複製或能夠整合到染色體中。也應考慮載體拷貝數、控制拷貝數的能力以及載體編碼的任何其它蛋白質如抗生素標記物的表達。在選擇表達調控序列時，也應考慮各種因素。這些因素包括如序列的相對長度、其可控制性以及與編碼多肽的核苷酸序列的相容性，特別要考慮潛在的二級結構。選擇宿主時應考慮其與所選載體的相容性、核苷酸序列編碼的產物的毒性、宿主的分泌特性和宿主正確摺疊多肽的能力、宿主的發酵和培養要求和核苷酸序列編碼產物純化的難易。
重組載體可以是自主複製的載體，即載體作為染色體外實體存在，其複製獨立於染色體複製，例如質粒。另外，引入宿主細胞時，載體可整合到宿主細胞基因組中並且與其整合的染色體一起複製。
載體優選是表達載體，其中編碼本發明多肽的核苷酸序列可與核苷酸序列轉錄所需的另外的片斷可操作地連接。載體通常由質粒或病毒DNA衍生。用於在本文所述宿主細胞中表達的各種合適的表達載體是可商購的或有文獻描述的。可用於真核宿主的表達載體包括如含有來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和巨細胞病毒的表達調控序列的載體。具體的載體如pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和pCI-neo(Stratagene，LaJola，CA，USA)。可用於酵母細胞的表達載體包括2(質粒及其衍生物，POT1載體(US4,931,373)，pJSO37載體(描述於Okkels，Ann.New York Acad.Sci.782，202-207，1996)和pPICZ A，B或C(Invitrogen)。可用於昆蟲細胞的表達載體包括pVL941，pBG311(Cate等，″Isolation of Bovine and Human Genes forMullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In AnimalCells″，Cell，45，pp.685-98(1986)，pBluebac 4.5和pMelbac(都來自Invitrogen)。可用於細菌宿主的表達載體包括已知的細菌質粒，如來自大腸桿菌的質粒包括pBR322，pET3a和pET12a(都來自Novagen Inc.，WI，USA)，較寬宿主範圍的質粒，如RP4，噬菌體DNA，例如λ噬菌體的各種衍生物，例如NM989，和其它DNA噬菌體，如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。
本發明中使用的其它載體包括允許編碼多肽的核苷酸序列擴增多個拷貝的那些載體。這種可擴增的載體是本領域公知的。例如，它們包括能夠通過DHFR擴增的載體(例如參見Kaufman，U.S.Pat.No.4,470,461，Kaufmanand Sharp，″Construction Of A Modular Dihydrofolate Reductase cDNA GeneAnalysis Of Signals Utilized For Efficient Expression″，Mol.Cell.Biol.，2，pp.1304-19(1982))和可通過穀氨醯胺合成酶(″GS″)擴增的載體(例如參見US5,122,464和EP338,841)。
重組載體可進一步包含能夠使所述載體在所述宿主細胞中複製的DNA序列。此序列的一個例子(宿主細胞是哺乳動物細胞時)是SV40的複製起始點。當宿主細胞是酵母細胞時，能夠使載體複製的合適序列是酵母質粒2(複製基因REP1-3和複製起始點。
載體也可含有可選擇的標記，如基因，其產物補充宿主細胞的缺陷，如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母TPI的基因(P.R.Russell，Gene40，1985，pp.125-130)，或者賦予對藥物如氨苄青黴素、卡那黴素、四環素、氯黴素、新黴素、潮黴素或氨甲蝶呤的抗性的基因。對於釀酒酵母來說，可選擇的標誌包括ura3和Leu2。對於絲狀真菌來說，可選擇的標記包括amdS、pyrG、arcB、niaD和sC。
術語「調控序列」在本文中包括對本發明多肽表達必需的或有利的所有成分。每個調控序列對編碼多肽的核苷酸序列來說可以是天然的或外來的。這些調控序列包括但不限於前導區、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、增強子或上遊活化序列、信號肽序列和轉錄終止子。調控序列至少包括啟動子。
本發明可以使用各種各樣的表達調控序列。這些可使用的表達調控序列包括與前述表達載體的結構基因相連的表達調控序列以及已知調控原核或真核細胞或其病毒的基因表達的任何序列及其各種組合。
哺乳動物細胞中與轉錄相關的合適調控序列的實例包括SV40和腺病毒的早期或晚期啟動子，如腺病毒2的主要晚期啟動子、MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動子、人巨細胞病毒立即早期基因啟動子(CMV)、人延伸因子1((EF-1啟動子、果蠅最小熱休克蛋白70啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、人遍在蛋白C(UbC)啟動子、人生長激素終止子、SV40或腺病毒Elb區聚腺苷酸化信號和Kozak共有序列(Kozak，M.J Mol Biol 1987 Aug 20；196(4)947-50)。
為了改進在哺乳動物細胞中的表達，可以將合成的內含子插入編碼所述多肽的核苷酸序列的5′非翻譯區。合成內含子的實例是來自質粒pCI-Neo的合成內含子(購自Promega Corporation，WI，USA)。
昆蟲細胞中指導轉錄的合適調控序列的實例包括多角體蛋白啟動子、P10啟動子、苜蓿銀紋夜蛾(Autographa califomica)多角體病毒鹼性蛋白啟動子、杆狀病毒立即早期基因1啟動子和杆狀病毒39K延遲早期基因啟動子和SV40聚腺苷酸化序列。在酵母宿主細胞中使用的合適調控序列的實例包括酵母(交配系統的啟動子、酵母丙糖磷酸異構酶(TPI)啟動子、來自酵母糖酵解基因或乙醇脫氫酶基因的啟動子、ADH2-4c啟動子和誘導型GAL啟動子。在絲狀真菌宿主細胞中使用的合適調控序列的實例包括ADH3啟動子和終止子、由編碼米麴黴TAKA澱粉酶丙糖磷酸異構酶或鹼性蛋白酶、黑麴黴(澱粉酶、黑麴黴或構巢麴黴(A.Nidulans)葡萄糖澱粉酶、構巢麴黴乙醯胺酶、米赫根毛黴(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂肪酶的基因衍生的啟動子、TPI1終止子和ADH3終止子。在細菌宿主細胞中使用的合適調控序列的實例包括lac系統、trp系統、TAC或TRC系統的啟動子和(噬菌體的主要啟動子區域。
信號肽的存在或不存在如取決於用於多肽生產的表達宿主細胞、被表達的蛋白質(是細胞內的還是細胞外的蛋白質)和是不是需要分泌。為了在絲狀真菌中使用，信號肽可以由編碼麴黴屬菌株的澱粉酶或葡萄糖澱粉酶的基因、編碼米赫根毛黴脂肪酶或蛋白酶或Humicola lanuginosa脂肪酶的基因方便衍生。信號肽優選由編碼米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性(-澱粉酶、黑麴黴酸穩定澱粉酶或黑麴黴葡萄糖澱粉酶的基因衍生。為了在昆蟲細胞中使用，信號肽可以由昆蟲基因方便地衍生(參見WO90/05783)，如鱗翅目Manduca sexta脂動激素前體(US5023328)、蜜蜂蜂毒素(Invitrogen)、蛻皮甾類UDP葡萄糖基轉移酶(glucosyltransferase)(egt)(Murphy等，ProteinExpression and Purification 4，349-357(1993))或人胰脂酶(hpl)(Methods inEnzymology 284，pp.262-272，1997)。哺乳動物細胞中使用的優選信號肽是hFVII的或鼠Ig(輕鏈信號肽(Coloma，M(1992)J.Imm.Methods 15289-104)。為了在酵母細胞中使用，發現合適的信號肽是釀酒酵母(-因子信號肽(參見US4870008)、改性的羧肽酶信號肽(參見L.A.Valls等人，Cell 48，1987，pp.887-897)、酵母BAR1信號肽(參見WO87/02670)、酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信號肽(參見M.Egel-Mitani等人，Yeast 6，1990，pp.127-137)以及合成的前導序列TA57(WO98/32867)。大腸桿菌的合適信號肽是信號肽ompA(EP581821)。
本發明編碼FVII多肽的核苷酸序列，無論通過定點誘變、合成、PCR或其他何種方法製備，可選擇地包括編碼信號肽的核苷酸序列。如多肽需要從表達的細胞中分泌則需要信號肽。這種信號肽，如果存在，應該是能被表達所述多肽的細胞識別的。信號肽可與所述多肽同源(如，通常與hFVII相連)或異源(如其起源異於hFVII)，或者可以與宿主細胞同源或異源，即通常所述信號肽是該宿主細胞表達的信號肽或者通常其不是該宿主細胞表達的信號肽。相應的，所述信號肽可以是原核的，如來源於細菌如大腸桿菌，或者是真核的，如來源於哺乳動物或昆蟲或酵母細胞。
可以使用任何合適的宿主產生本發明偶聯物的多肽，包括細菌、真菌(包括酵母)、植物、昆蟲、哺乳動物或其它合適的動物細胞或細胞系以及轉基因動物或植物。細菌宿主細胞的實例包括革蘭氏陽性細菌如芽孢桿菌屬，如短芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌、假單孢菌屬或鏈黴菌屬或革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌菌株。載體可引入細菌宿主細胞，例如可通過原生質體轉化(參見如Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168111-115)，使用感受態細胞(參見如Young and Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81823-829，或Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology56209-221)、電穿孔(參見如Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques6742-751)或偶聯(參見如Koehler and Thorne，1987，Journal of Bacteriology1695771-5278)來進行。合適的絲狀真菌宿主細胞的實例包括麴黴屬菌株，如米麴黴、黑麴黴或構巢麴黴，鐮刀菌屬或木黴菌屬。真菌細胞可以轉化，轉化過程涉及原生質體形成、原生質體轉化和細胞壁通過本身已知的方式再生。在EP238023和US5679543中描述了轉化麴黴屬宿主細胞的合適方法。在Malardier等人1989，Gene 78147-156和WO96/00787中描述了轉化鐮刀菌屬的合適方法。合適的酵母宿主細胞的實例包括糖酵母屬的菌株，如釀酒酵母屬、裂殖酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬，如巴斯德畢赤酵母或P.Methanolica、漢遜酵母屬，如多形漢遜酵母或Yarrowia。酵母可使用Becker和Guarente，In Abelson，J.N.And Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology，Methods in Enzymology Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology 153163；和Hinnen等人1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA751920；以及由Clontech Laboratories，Inc，Palo Alto，CA，USA(YeastmakerTM酵母轉化系統試劑盒的產品手冊)中所述的方法來轉化。合適昆蟲宿主細胞的實例包括鱗翅目細胞系，如草地夜蛾(Sf9或Sf21)或粉紋夜蛾細胞(High Five)(US5077214)。可以按Invitrogen所述方法轉化昆蟲細胞並在其中產生異源多肽。合適的哺乳動物宿主細胞的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(如，CHO-K1；ATCC CCL-61)、綠猴細胞系(COS)(如，COS1(ATCC CRL-1650)、COS7(ATCC CRL-1651))；小鼠細胞(如，NS/O)、倉鼠幼鼠腎臟(BHK)細胞系(如，ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人細胞(如，HEK293(ATCC CRL-1573))，以及組織培養中的植物細胞。另外合適的細胞系在本領域中是已知的並可購自公共的保藏中心如美國典型培養物保藏中心，Rockville，Maryland。而且，哺乳動物細胞(如CHO細胞)可按US5047335所述方法進行改性來表達唾液酸轉移酶，如，1，6-唾液酸轉移酶，以便改進FVII或FVIIa多肽的糖基化。
為了增加分泌，使本發明多肽與內切蛋白酶，尤其是PACE(配對的鹼性胺基酸轉化酶)(如US5986079中所述)，如Kex2內切蛋白酶(如WO00/28065中所述)一起合成是有利的。
將外源性DNA引入哺乳動物宿主細胞的方法包括磷酸鈣介導的轉染、電穿孔、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體介導的轉染、病毒載體和由LifeTechnologies Ltd，Paisley，UK所述的使用Lipofectamin2000的轉染方法。這些方法在本領域中是已知的，例如在Ausbel等人(eds.)，1996，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，New York，USA中所述的。按建立的方法進行哺乳動物細胞的培養，例如在Animal Cell Biotechnology，Methods and Protocols，Nigel Jenkins編，1999，Human Press Inc，Totowa，NewJersey，USA and Harrison MA and Rae IF，General Techniques of Cell Culture，Cambridge University Press 1997中公開的。
在本發明生產方法中，用本領域已知的方法在適於生產多肽的營養培養基中培養細胞。例如，細胞可以在實驗室中通過搖瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連續、成批、補料分批或固體狀態發酵)或在合適培養基和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行工業發酵。培養在含有碳和氮源和無機鹽的合適營養培養基中使用本領域已知的方法來進行。合適的培養基可商購或可以按公開的組成來製備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中所述的)。如果多肽分泌在營養培養基中，多肽可從培養基中直接回收。如果多肽不被分泌，可從細胞裂解物中回收。
可通過本領域已知的方法來回收所得多肽。例如，可通過常規方法包括但不限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱從營養培養基中回收多肽。
可通過本領域已知的各種方法包括但不限於層析(如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(如，製備性等電聚焦)、溶解度差異(如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE或提取(參見，如Protein Purification，J.-C.Jansonand Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)來純化多肽。
在文獻中公開了純化單鏈FVII並且將其活化為雙鏈FVIIa的多種方法(Broze和Majerus，1980，J.Biol.Chem.2551242-47，Hedner和Kisiel，1983，J.Clin.Invest.711836-41等)。一種可用於純化單鏈FVII的方法是如US5700914所述在純化過程中引入鋅離子。
一個優選實施方案中，所述多肽作為單鏈FVII被純化，並進一步被PEG化。PEG化的FVII單鏈多肽活化是通過使用固定化酶(如因子IIa，IXa，Xa和XIIa)，或通過使用陽離子交換基質或其類似物自活化。
首先純化單鏈形式的FVII，然後進行PEG化(如果需要)，最後通過上述方法之一或如Pedersen等(1989，Biochemistry 289331-36)所述的自活化進行活化是有利的。在活化前進行PEG化的優點在於避免了對R152-I153的剪切所形成的新的氨基末端的PEG化。新的氨基末端的PEG化可使所述分子失活，因為D242和I153氨基末端之間形成的氫鍵是活性所必需的。
本發明的藥物組合物及其用途另一個方面，本發明涉及組合物，特別涉及一種藥物組合物，其包含本發明多肽或偶聯物(包括上述無活性的偶聯物)和可藥用載體或賦形劑。
本發明的偶聯物、多肽或藥物組合物可用做藥物。
優選，所述多肽或所述(活性)偶聯物可用於生產治療或預防哺乳動物中FVIIa/TF相關疾病或紊亂的藥物。例如所述多肽或所述(活性)偶聯物可用於生產治療或預防疾病的藥物，其中加快凝血對於所述疾病是有利的，如治療患有血管損傷時凝血不足疾病的患者。尤其，所述多肽或所述(活性)偶聯物可用做生產治療以下疾病的藥物，血友病、具有FVIII和FIX抑制劑的血友病，血小板減少的患者，血小板病的患者，如格蘭茲曼氏血小板機能不全血小板釋放缺陷和貯存庫缺陷，患von Willebrand疾病的患者，患有肝臟疾病的患者，或有嚴重出血問題的健康者，如因外傷或大手術產生了針對FVIIa的抑制劑，出血紊亂，如血友病及其他通常與嚴重組織損傷有關的疾病。
類似的，本發明的無活性偶聯物，可用做生產治療或預防哺乳動物FVIIa/TF相關疾病或紊亂的藥物。例如，本發明的無活性偶聯物可用做生產治療或預防疾病的藥物，其中降低凝血對於所述疾病是有利的，如預防或治療處於高度凝血狀態的患者，如膿毒症、深度靜脈血栓的患者，易患心肌梗塞或血栓性中風、肺梗塞的患者，急性冠狀動脈綜合症(acute coronarysyndromes)(心肌梗塞和不穩定的心絞痛)的患者，冠狀動脈性心臟病(coronarycardiac)患者，預防接受血管成型手術患者的心臟疾病和restonosis，以及患外周血管疾病的患者。本發明的無活性偶聯物也可用於生產治療呼吸疾病、腫瘤生長及轉移的藥物。
另一方面，所述多肽，所述(活性)偶聯物或包含本發明活性偶聯物的所述藥物組合物可用於治療患FVIIa/TF相關疾病或紊亂(如一種或多種以上所述疾病或紊亂)的哺乳動物的方法中，包括給予需要治療的哺乳動物以有效劑量的這種多肽，偶聯物或組合物。
類似的，所述無活性偶聯物或包含本發明無活性偶聯物的所述藥物組合物可用於治療患有FVIIa/TF相關疾病或紊亂(如一種或多種以上所述疾病或紊亂)的哺乳動物的方法中，包括給予需要治療的哺乳動物以有效劑量的這種無活性偶聯物或組合物。
以治療有效劑量給予本發明的多肽或偶聯物，所述劑量大約與用rFVII如NovoSeven治療所採用的劑量相同或更高。本文中「治療有效劑量」是指對所治疾病狀態足以產生預期效果的劑量。給藥的準確劑量取決於具體情況，可通過本領域技術人員通過公知的方法加以確定。一般來說，所述劑量應當能夠防止或減小被治療疾病或症狀的嚴重性或擴散。對本領域技術人員顯而易見的是本發明多肽、偶聯物或組合物的有效量取決於疾病、劑量、給藥時間表、多肽或偶聯物或組合物是單獨給藥還是與其它治療劑聯合給藥、組合物的血清半壽期和患者的總體健康狀況。優選，本發明的多肽、偶聯物或組合物以有效劑量給予，尤其以足以使凝血紊亂正常化的劑量給予。
本發明的多肽或偶聯物優選以組合物形式給藥，其中包括可藥用載體或賦形劑。「可藥用」意指在給藥的患者中不引起任何不利作用的載體或賦形劑。這些可藥用載體和賦形劑在本領域中是公知的(參見，如Remington′sPharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack PublishingCompany(1990)；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins，S.Frokjaer和L.Hovgaard，Eds.，Taylor Francis(2000)；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press(2000))。
本發明的多肽或偶聯物可通過公知方法配製成藥物組合物。在E.W.Martin(Mark Publ公司，16版，1980)Remington′s Pharmaceutical Sciences描述了合適的製劑。
本發明的多肽或偶聯物可以原形使用和/或以其鹽的形式使用。合適的鹽包括但不限於與鹼金屬或鹼土金屬如鈉、鉀、鈣和鎂形成的鹽，以及如鋅鹽。這些鹽或複合物可作為晶體和/或無定形結構存在。
本發明的藥物組合物可單獨給予也可以與其他治療製劑聯合給予。這些製劑可以作為同一藥物組合物中的一個組成部分給予，或者與本發明多肽或偶聯物同時或依照一定的治療時間表分別給予。此外，本發明的多肽、偶聯物或藥物組合物可用做其他治療的佐劑。
本發明中「患者」包括人和其他哺乳動物。因此所述方法醫用獸用均可。本發明多肽或偶聯物的藥物組合物可以多種形式配置，如以液體，凝膠，凍乾粉或壓制的固體形式。優選的形式根據治療的特別需要而異，這對於本領域技術人員是顯而易見的。
尤其，本發明多肽或偶聯物的藥物組合物以凍乾粉或穩定溶液形式配製。所述多肽或偶聯物可通過多種公知方法凍乾粉化。多肽或偶聯物可通過將蛋白酶解位點去除或掩蓋，製備成穩定的溶液形式。獲得穩定溶液的優點在於更便於患者使用，而且在緊急情況時，作用更快，這可能可以救生。優選的形式根據治療的特定需要而異，這對於本領域技術人員是明顯的。
本發明製劑可以多種方式給藥，包括但不限於，口服、皮下、靜脈內、小腦內、鼻內、真皮內、腹膜內、肌肉內、肺內、經陰道、經直腸、眼內或以任何其它適宜的方式。製劑可連續灌注給予，儘管大藥丸注射(bolusinjection)是可接受的，但需利用本領域公知技術，如泵或植入。一些情況下所述製劑可以溶液或噴霧直接給予。
非胃腸道給藥劑(Parentals)藥物組合物的優選實例是設計成非腸道給藥的溶液。儘管在很多情況下，藥物溶液製劑可以以適用於立即使用的液體形式提供，但所述非腸道製劑也可以以冷凍或凍幹形式提供。在前者情況下，所述組合物在使用前必須解凍。後一劑型通常用於增強組合物中所包含的活性組分在各種貯存條件下的穩定性，正如本領域技術人員已知的那樣，凍幹製劑通常比其液體相應物更穩定。所述凍幹製劑在使用前通過加入一種或多種適宜的可藥用稀釋劑如滅菌注射用水或滅菌生理鹽水溶液重新配製。
在非胃腸道給藥的情況下，製成凍幹製劑或水溶液備用，如通過將具有所需純度的多肽與一種或多種本領域常用的可藥用載體、賦形劑或穩定劑(統稱為「賦形劑」)適當混合來製備，賦形劑如緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等滲劑、非離子表面活性劑或去汙劑、抗氧化劑和/或其它各種添加劑。
緩衝劑有助於將pH保持在接近生理條件的範圍中。它們通常以大約2mM-50mM的濃度範圍存在。本發明使用的合適緩衝劑包括有機和無機酸及其鹽如檸檬酸鹽緩衝劑(如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩衝劑(如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩衝劑(如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩衝劑(如，富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸鹽(gluconate)緩衝劑(如，葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩衝劑(如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩衝劑(如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸鹽緩衝劑(如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。其它可能的緩衝劑是磷酸鹽緩衝劑、組氨酸緩衝劑和三甲胺鹽如Tris。
穩定劑涉及一大類賦形劑，其功能範圍從膨脹劑到溶解治療劑的或有助於防止變性或與容器壁粘合的添加劑。通常的穩定劑可以是多羥糖醇(上文列舉的)；胺基酸如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、穀氨酸、蘇氨酸等，有機糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環醇如環己六醇；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，如脲，穀胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、(-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即＜10個殘基)；蛋白質如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；單糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖。基於活性蛋白質重量計算，穩定劑通常的存在範圍為0.1-10000重量份。
加入防腐劑來阻滯微生物生長，加入的量通常約為0.2％-1％(w/v)。本發明使用的合適防腐劑包括酚、苯甲醇、間甲酚、羥苯甲酸(paraben)甲酯、羥苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、苯亞甲基 滷化物(如苯亞甲基 氯化物、溴化物或碘化物)、氯化己烷雙胺、羥苯甲酸烷基酯如甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇和3-戊醇。
可以加入等滲劑來確保液體組合物的等滲性，等滲劑包括多羥糖醇，優選三羥或更高級糖醇，如甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多羥基醇的量可為0.1％-25％重量比，通常為1％-5％，以其它組分的相對量計算。
可以存在非離子表面活性劑或清潔劑(也稱作「溼潤劑」)以有助於溶解治療劑以及保護治療性多肽以避免攪拌誘導的聚集，其也允許配方劑暴露於剪切表面壓力而不導致多肽變性。合適的非離子表面活性劑包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic(多元醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(吐溫20、吐溫80等)。
其它各種賦形劑包括膨脹劑或填充劑(如澱粉)、螯合劑(如EDTA)、抗氧化劑(如抗壞血酸、蛋氨酸、維生素E)和共溶劑。
活性組分也可以被包裹在製備的微囊中，例如通過coascervation技術或通過界面聚合製備，例如羥甲基纖維素、明膠或聚(甲基甲丙烯酸酯)微囊，包裹在膠體狀藥物釋放體系(例如脂質體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米膠囊)中或包裹在大乳劑中。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(同上)中公開了這些技術。
體內給藥所使用的非胃腸道製劑必須是滅菌的。該過程容易完成，例如，通過無菌濾膜來過濾。
持續釋放製劑持續釋放製劑的合適例子包括含有多肽或偶聯物的固體疏水聚合物半滲透材料、具有合適形式如膜或微囊的材料。持續釋放材料的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基甲丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-穀氨酸和L-穀氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease(技術或Lupron Depot((由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能夠長時間釋放分子如長達或超過100天，某些水凝膠在較短時間內釋放蛋白質。包囊中的多肽長時間保留在體內時，它們因在37℃潮溼的環境中暴露而變性或聚集，導致生物活性喪失並且可能改變免疫原性。合理的穩定策略可根據所涉及的機理設計。例如，如果發現聚集機理是通過硫代二硫化物相互交換形成分子內S-S鍵，那麼可通過修飾巰基、凍幹酸性溶液、控制溼度、使周適宜的引入劑和開發特異性聚合物型組合物來達到穩定。
在下列實施例中進一步描述本發明，這些實施例並無限定。
序列SEQ ID NO1顯示hFVII蛋白(包括γ-羧基化殘基)SEQ ID NO2顯示編碼hFVII蛋白的cDNA序列SEQ ID NO3顯示hFVII蛋白(無γ-羧基化殘基)SEQ ID NO4顯示FVII蛋白在哺乳動物中表達的表達盒SEQ ID NO5顯示CBProFpr174引物SEQ ID NO6顯示CBProFpr175引物SEQ ID NO7顯示CBProFpr216引物SEQ ID NO8顯示CBProFpr229引物SEQ ID NO9顯示CBProFpr221引物SEQ ID NO10顯示CBProFpr228引物SEQ ID NO11顯示CBProFpr226引物材料和方法用於確定所要改變的胺基酸的方法可接近的表面區域(ASA)使用電腦程式組(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55379-400(1971))版本2(Copyright(c)1983 Yale University)計算結構中各個原子的可接近的表面區域(ASA)。該方法通常使用1.4大小的探針並將可接近的表面區域(ASA)定義為探針中心形成的面積。於該計算前，從坐標中去除所有水分子和所有氫原子，以及其它不與該蛋白質直接相連的原子。
側鏈的分級(fractional)ASA側鏈原子的分級ASA通過側鏈中原子的ASA總和除以延長的ALA-x-ALA三肽中殘餘類型側鏈原子的ASA代表值來計算。參見Hubbard，Campbell Thornton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。在該例中，CA原子被看作甘氨酸殘基側鏈的一部分但不被看作其它殘基的一部分。下表表示側鏈的100％ASA標準
在該結構上未發現的殘基鑑定為具有100％的暴露，因其被認為位於彈性區域。位置6，7，14，16，19，20，25，26，29和35處的γ-羧基穀氨酸均被確定為100％暴露。
確定原子之間的距離利用分子繪圖軟體，如Insight II(v.98.0 MSI INC，可方便地確定原子之間的距離。
催化位點區催化位點區定義為任何這樣的殘基，所述殘基具有至少一個原子在催化三聯體(殘基H193，D242，S344)內任何原子的10距離內。
確定組織因子結合位點受體結合位點被定義為包含所有這類殘基，所述殘基在受體結合時，其可接近的表面區域改變。這通過至少兩個ASA計算來確定；一個基於配基/受體複合物中分離的配基，另一個基於完整的配基/受體複合物。
檢測FVII和FVIIa性質的方法檢測功能性體內半壽期的方法體內生物半壽期的檢測可通過上述文獻中說明的多種方法進行。FDA參考號96-0597中說明了檢測rFVIIa或其變體的體內半壽期的方法。簡要地，在給予所述偶聯物，多肽或組合物之前和之後24小時內抽取血漿，檢測該血漿內FVII凝血活性。檢測出穩定狀態下分布體積的中值，並確定中值清除率。
對蛋白酶解敏感性降低的檢測製備組合物，所述組合物包含偶聯物(100-750μg/ml，優選600μg/ml)，1.5mg Ca2+/ml(以氯化鈣形式)，甘露醇(30mg/ml)，polysorbate 80(0.1mg/ml)，氯化鈉(3mg/ml)，和甘氨醯-甘氨酸緩衝液(1.3mg/ml，pH5.5)。
製備含有野生型rFVIIa的類似組合物。
以「檢測凝血活性的方法」或「檢測低水平催化活性的方法」或「檢測催化活性的方法」章節中所述方法，確定起始凝血活性，或起始醯胺分解活性。
然後將組合物在37℃溫育直到含有野生型rFVIIa的組合物喪失其起始凝血或醯胺化活性的至少25％，優選至少50％。
然後檢測包含本發明偶聯物的組合物的凝血或醯胺分解活性。
以百分比表示本發明偶聯物與野生型rFVIIa相比，對蛋白酶解的敏感性的降低。
對蛋白酶解降低的敏感性的其他檢測方法蛋白酶解可通過US5580560的實施例5中說明的方法檢測，其中所述蛋白水解是自我蛋白酶解。
此外，降低的蛋白酶解可利用放射性標記樣品在體內模型中進行檢測，通過取血樣，並對這些血樣進行SDS-PAGE和放射自顯影來對比野生型和偶聯物的蛋白酶解作用。
無論使用何種分析確定蛋白酶解，「降低的蛋白酶解」是指與非偶聯的野生型FVIIa相比在裂解程度上的明顯降低，這是通過對考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE凝膠的凝膠掃描、HPLC測定，或利用下述顯色試驗通過相對於野生型的保守的催化活性確定。
對rFVII及其偶聯物的分子量的確定偶聯的或非偶聯的rFVII或其偶聯物的分子量是通過SDS-PAGE、凝膠過濾、Western印跡、基質輔助的雷射解吸(matrix assisted laser deserption)、質譜分析或平衡離心，如根據Laemmli，UK(Nature Vol 227(1970)，pp.680-85)的SDS-PAGE，進行確定。
檢測低水平催化活性的方法用COASETFVII(Chromogenix，Art.No 82 19 00)確定FVII/FVIIa稀釋樣品和發酵液/經過培養的培養液中的醯胺分解活性。根據生產商的使用說明測定醯胺分解活性。簡要的，FX以過量存在，並在37℃被FVIIa轉變為FXa。所獲得的FXa水解顯色底物S2765(N-α-Cbo-D-Arg-Gly-Arg-pNA)，釋放顯色分子對-硝基-苯胺(para-nitro-anillin)(pNA)，吸收波長為405nm的光。加入乙酸終止反應。通過與FVIIa(試驗緩衝液中125 pg/ml-1ng/ml)的標準曲線的比較，確定樣品中FVII/FVIIa的量。
檢測催化活性的方法偶聯物裂解小肽底物的能力可通過使用顯色底物S-2288(D-Ile-Pro-Arg-對-硝基苯胺)檢測。重組FVIIa稀釋於含0.1％BSA的0.1M Tris，0.1M NaCl，5mM CaCl2，pH8.3中。加入S-2288至1mM起動反應，37℃溫育30分鐘後檢測405nm的吸光度。
檢測凝血活性的方法使用WO92/15686所述的標準一步(one-stage)凝血分析檢測FVIIa的活性。簡言之，待測樣品在50mM Tris(pH7.5)，0.1％BSA中稀釋，取該溶液100μl與100μl FVII缺陷型血漿和200μl含10mM Ca++的促凝血酶原激酶C溫育。檢測凝血時間並與標準曲線比較，所述標準曲線使用檸檬酸化的正常人血漿的系列稀釋液製備。
檢測抗凝血活性的方法無活性FVII或FVIIa偶聯物的抗凝血活性可通過上述一步凝血分析(檢測凝血活性的方法)檢測，其中無活性偶聯物與野生型FVII競爭有限數量的relipidated組織因子。分析基本按照WO92/15686，實施例III中所述方法進行，該文本在此引用作為參考。記錄無活性偶聯物延長野生型FVII凝血時間的能力，將其作為抗凝血活性的一個指標。
實施例實施例1本實施例使用Banner等(J Mol Biol，1996；2852089)確定的與可溶性組織因子形成複合體的hFVIIa的X射線結構。注意，參照文獻中的殘基序號並不與該序列一致。此處所用序號與SEQ ID NO1一致。位置6，7，14，16，19，20，25，26，29和35處的γ-羧基穀氨酸在此均命名為GLU(三字母的簡寫)或E(單字母簡寫)。所述結構中不存在143-152位的殘基。
表面暴露對FVII片段單獨進行的分級ASA計算，結合上述方法中對非標準和/或丟失殘基的可接近性的定義，確定以下殘基有超過25％的側鏈暴露於其表面A1，N2，A3，F4，L5，E6，E7，L8，R9，P10，S12，L13，E14，E16，K18，E19，E20，Q21，S23，F24，E25，E26，R28，E29，F31，K32，D33，A34，E35，R36，K38，L39，W41，I42，S43，S45，G47，D48，Q49，A51，S52，S53，Q56，G58，S60，K62，D63，Q64，L65，Q66，S67，I69，F71，L73，P74，A75，E77，G78，R79，E82，T83，H84，K85，D86，D87，Q88，L89，I90，V92，N93，E94，G97，E99，S103，D104，H105，T106，G107，T108，K109，S111，R113，E116，G117，S119，L120，L121，A122，D123，G124，V125，S126，T128，P129，T130，V131，E132，I140，L141，E142，K143，R144，N145，A146，S147，K148，P149，Q150，G151，R152，G155，K157，V158，P160，K161，E163，L171，N173，G174，A175，N184，T185，I186，H193，K197，K199，N200，R202，N203，I205，S214，E215，H216，D217，G218，D219，S222，R％224，S232，T233，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H249，Q250，P251，V253，T255，D256，E265，R266，T267，E270，R271，F275，V276，R277，F278，L280，L287，L288，D289，R290，G291，A292，T293，L295，E296，N301，M306，T307，Q308，D309，L311，Q312，Q313，R315，K316，V317，G318，D319，S320，P321，N322，T324，E325，Y326，Y332，S333，D334，S336，K337，K341，G342，H351，R353，G354，Q366，G367，T370，V371，G372，R379，E385，Q388，K389，R392，S393，E394，P395，R396，P397，G398，V399，L400，L401，R402，P404和P406。
以下的殘基有超過50％的側鏈暴露於表面A1，A3，F4，L5，E6，E7，L8，R9，P10，E14，E16，K18，E19，E20，Q21，S23，E25，E26，E29，K32，A34，E35，R36，K38，L39，I42，S43，G47，D48，A51，S52，S53，Q56，G58，S60，K62，L65，Q66，S67，I69，F71，L73，P74，A75，E77，G78，R79，E82，H84，K85，D86，D87，Q88，L89，I90，V92，N93，E94，G97，T106，G107，T108，K109，S111，E116，S119，L121，A122，D123，G124，V131，E132，L141，E142，K143，R144，N145，A146，S147，K148，P149，Q150，G151，R152，G155，K157，P160，N173，G174，A175，K197，K199，N200，R202，S214，E215，H216，G218，R224，V235，P236，G237，T238，H249，Q250，V253，D256，T267，F275，R277，F278，L288，D289，R290，G291，A292，T293，L295，N301，M306，Q308，D309，L311，Q312，Q313，R315，K316，G318，D319，N322，E325，D334，K341，G354，G367，V371，E385，K389，R392，E394，R396，P397，G398，R402，P404和P406。
組織因子結合位點通過ASA計算，人FVII中的以下殘基在複合物中改變其ASA。這些殘基被定義為組成受體結合位點的殘基 L13，K18，F31，E35，R36，L39，F40，I42，S43，S60，K62，D63，Q64，L65，I69，C70，F71，C72，L73，P74，F76，E77，G78，R79，E82，K85，Q88，I90，V92，N93，E94，R271，A274，F275，V276，R277，F278，R304，L305，M306，T307，Q308，D309，Q312，Q313，E325和R379。
活性位點區活性位點區是具有至少一個與催化三聯體(殘基H193，D242，S344)中任何原子的間距在10範圍內的原子的任何殘基 I153，Q167，V168，L169，L170，L171，Q176，L177，C178，G179，G180，T181，V188，V189，S190，A191，A192，H193，C194，F195，D196，K197，I198，W201，V228，I229，I230，P231，S232，T233，Y234，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H241，D242，I243，A244，L245，L246，V281，S282，G283，W284，G285，Q286，T293，T324，E325，Y326，M327，F328，D338，S339，C340，K341，G342，D343，S344， G345，G346，P347，H348，L358，T359，G360，I361，V362，S363，W364，G365，C368，V376，Y377，T378，R379，V380，Q382，Y383，W386，L387，L400和F405。
活性位點結合槽的脊活性位點結合槽的脊通過對FVIIa結構1FAK.pdb的目測觀察定義為N173，A175，K199，N200，N203，D289，R290，G291，A292，P321和T370。
實施例2設計用於在哺乳動物細胞中表達人凝血因子VII的表達盒合成SEQ ID NO2所示DNA序列(包含編碼具有天然簡訊號肽的人凝血因子VII全長cDNA的短型(Hagen等，1986.PNAS 832412))，以促進其在哺乳動物細胞中的高表達。首先根據Kozak共有序列(Kozak，M.J Mol Biol1987 Aug 20；196(4)947-50)修飾ATG起始密碼子的周圍序列，以使ATG起始密碼子上遊共有序列完全匹配。然後，對天然人凝血因子cDNA的開放式閱讀框進行修飾，使所使用的密碼子為高表達的人基因中常用的密碼子。隨後，在開放閱讀框末端插入兩個翻譯終止密碼子，以便翻譯有效終止。用70聚體DNA寡核苷酸裝配完全合成且優化表達的FVII基因，最後用分別插入5′和3′末端BamHI和HindIII位點的末端引物，進行標準的PCR擴增，得到以下序列(SEQ ID NO4)ggatcccgccaccatggtcagccaggccctccgcctcctgtgcctgctcctggggctgcagggctgcctggctgccgtcttcgtcacccaggaggaagcccatggcgtcctgcatcgccggcgccgggccaatgcctttctggaagagctccgccctggctccctggaacgcgaatgcaaagaggaacagtgcagctttgaggaagcccgggagattttcaaagacgctgagcggaccaaactgttttggattagctatagcgatggcgatcagtgcgcctccagcccttgccagaacgggggctcctgcaaagaccagctgcagagctatatctgcttctgcctgcctgcctttgaggggcgcaattgcgaaacccataaggatgaccagctgatttgcgtcaacgaaaacgggggctgcgagcagtactgcagcgatcacacgggcacgaagcggagctgccgctgccacgaaggctatagcctcctggctgacggggtgtcctgcacgcccacggtggaatacccttgcgggaagattcccattctagaaaagcggaacgctagcaaaccccagggccggatcgtcggcgggaaggtctgccctaagggggagtgcccctggcaggtcctgctcctggtcaacggggcccagctgtgcggcgggaccctcatcaataccatttgggtcgtgtccgccgctcactgcttcgataagattaagaattggcggaacctcatcgctgtgctcggcgaacacgatctgtccgagcatgacggggacgaacagtcccgccgggtggctcaggtcatcattccctccacctatgtgcctggcacgaccaatcacgatatcgctctgctccgcctccaccagcccgtcgtgctcaccgatcacgtcgtgcctctgtgcctgcctgagcggacctttagcgaacgcacgctggctttcgtccgctttagcctcgtgtccggctggggccagctgctcgaccggggcgctaccgctctcgagctgatggtgctcaacgtcccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcccgcaaagtgggggactcccccaatatcacggagtatatgttttgcgctggctatagcgatggctccaaggatagctgcaagggggactccggcgggccccatgccacgcactatcgcgggacctggtacctcaccgggatcgtcagctggggccagggctgcgccacggtggggcactttggcgtctacacgcgcgtcagccagtacattgagtggctgcagaagctcatgcggagcgaaccccggcccggggtgctcctgcgggcccctttcccttgataaaagctt通過從pCINeo(Promega)克隆內含子來製備用於對所得PCR產物的進行克隆載體，該PCR產物包含天然人凝血因子VII的表達盒。pCI-Neo的合成內含子用上述標準PCR條件擴增，引物如下
CBProFpr1745′-AGCTGGCTAGCCACIGGGCAGGTAAGTATCA-3′CBProFpr1755′-TGGCGGGATCCTTAAGAGCTGTAATTGAACT-3′產生一個322bp PCR片段。該片段用NheI和BamHI剪切，之後克隆到pCDNA3.1/HygR(來自Invitrogen)，產生PF#34。
克隆PF#34上BamHI和HindIII位點之間的天然人凝血因子VII的表達盒，得到質粒PF#226。
實施例3構建編碼人凝血因子VII的變體形式的表達盒，該變體具有一個另外的體內糖基化位點用序列突出端延伸(SOE)PCR產生具有已取代的密碼子的人凝血因子變體開放閱讀框的構建體。在SOE-PCR中，FVII開放閱讀框的N-末端部分和C-末端部分都在各自初級PCR中首先得到擴增。
例如，為了將R315和V317密碼子改變為N315和T317密碼子，在初級PCR中使用以下配對引物CBProFpr2165′-CTTAAGGATCCCGCCACCATGGTCAGCCAG-3′CBProFpr2295′-GGAGTCCCCGGTTTTGTTGGACTGCTGC-3′，以及CBProFpr2215′-ACTTAAGCTTTTATCAAGGGA-3′CBProFpr2285′-GCAGCAGTCCAACAAAACCGGGGACTCC-3′然後組合初級PCR產物，加入末端引物(CBProFpr216和CBProFpr221)，產生編碼期望的R315N+V317T FVII變體的二級全長產物。該二級PCR產物用BamHI和HindIII剪切，再克隆到載體PF#34的BamHI和HindIII位點之間，產生PF#249。
此外，當引入的突變與表達質粒內的唯一限制性內切酶位點足夠靠近時，可以構建變體基因，所述構建方法包含一個單一PCR步驟和後續的克隆。例如，在一個單一PCR反應中使用以下PCR引物引入取代K143N+N145TCBProFpr2265′-CATTCTAGAAAACCGGACCGCTAGCAAACC-3′CBProFpr2215′-ACTTAAGCTTTTATCAAGGGA-3′然後通過使用限制性內切酶位點XbaI和HindIII克隆克隆所得PCR產物。
使用以上策略，可製備下述糖基化偶聯物，其醯胺分解活性的檢測如檢測低水平催化活性章節中所述。此外，對一些偶聯物進行檢測凝血活性章節所述的一步凝血分析。所得結果編輯於下表中。
+可檢測的活性；-不可檢測的活性；nd未測定實施例4引入另外的近側(位於N-末端)糖基化位點以改進糖基化位點的用途為了預防野生型人FVII的自身裂解，通過如上所述產生R315N和V317T取代，在位置315處引入一個糖基化位點，得到PF#249。
用Lipofactamine 2000轉染CHO K1細胞，獲得低水平的瞬時表達。利用醯胺分解試驗，COASETFVII，分析24小時的瞬時上清，表明該變體是有活性的。在用400μg/ml潮黴素B選擇後，獲得穩定克隆群。這些克隆以約0.2μg/ml的濃度表達R315N+V317T變體，在該濃度下可進行蛋白印記分析，以確定引入的糖基化位點的利用程度。用蛋白印跡分析從穩定克隆群的24小時上清，結果顯示在位置315處引入的糖基化位點被部分利用，約一半的完全加工後的分泌蛋白被糖基化。然而，如果145處的天然糖基化位點通過產生K143N+N145T取代轉移到143處，則蛋白印記顯示315位引入的糖基化位點被完全糖基化。
實施例5在HEK293細胞中表達FVII在T-25培養瓶中培養接種20％的匯合細胞系HEK293(ATCC#CRL-1573)，所用培養基為DMEM，高葡萄糖10％熱滅活的FCS(Gibco/BRL Cat#10091)，5μg/ml植醌，使細胞生長直到匯合。匯合的單層細胞用1，2，5，10和20μg上述質粒p226，以Lipofectamine 2000為轉染試劑(Life technologies)按照生產商的方法進行轉染。轉染後24小時對培養液取樣。24小時瞬時表達實驗中FVII的濃度平均為0.15μg/ml。
隨後，給予細胞包含100μg/ml潮黴素B的選擇培養基。每3或4天更新一次培養基，經3周選擇後，在用1μg質粒DNA和2μg質粒DNA轉染的培養瓶中，潮黴素抗性細胞已生長至匯合。收集五個培養瓶中每個瓶的細胞並匯總。獲得表達天然人凝血因子VII的穩定轉染子群，將其按照標準方法在液氮中冷凍。
實施例6製備穩定表達FVII的HEK293細胞將一小瓶HEK293 PF#226轉染子解凍，並將細胞接種於含15ml DMEM高葡萄糖，10％FCS，植醌(5μg/ml)，100 U/l青黴素，100μg/l鏈黴素(其用於之後的所有實驗)的75cm2組織培養瓶中，生長24小時。收集細胞，將其稀釋並以1/2細胞/孔的密度鋪96孔微滴定平板。12天後，約20-100個細胞的集落出現於孔中，將僅包含一個集落的那些孔進行標記。再生長2天後，在所有孔中添加100μl培養基。兩天後，改換所有僅含一個集落的孔中的培養基。第一批集落3天後轉移到25cm2組織培養瓶中培養，根據匯合程度，在接下來的11天將集落轉移到到25cm2組織培養瓶中培養。當在T-25組織培養瓶中生長到匯合時，更換培養基，使克隆持續24小時將FVII分泌到生長培養基中，然後收集上清，用COASET FVII醯胺分解試驗來檢測因子VII的存在。發現有一個克隆，C18，表達29μg/ml的FVII。
實施例7FVII糖基化變體的表達，所述變體無醯胺分解活性，可抑制FVIIa的功能用於表達活性位點脊突變體R290N+A292T和G291N的表達質粒，可基本按實施例3中所述方法構建。
用醯胺分解試驗COASETFVII(參見上述)，評估兩種FVII糖基化變體(R290N+A292T和G291N)抑制rFVIIa活性的能力。用Lipofectamin 2000將編碼R290N+A292T的質粒PF#250和編碼G291N的質粒PF#294轉染至接近匯合的經血清培養的HEK293細胞中。轉染後，將轉染細胞在37℃ 5％的CO2下溫育3小時，然後將培養基更換為無血清培養基(DMEM，ITS-A，Ex-Cyte，植醌，P/S)。轉染的40小時後，收集培養液並離心使其澄清，以備分析。
用rFVIIa0.0125ng，0.025ng，0.05ng，0.075ng和0.1ng，製作標準曲線。將兩種無活性糖基化變體R290N+A292T和G291N中的任一種的50μl未稀釋、2倍稀釋、5倍稀釋、10倍稀釋和50倍稀釋的培養液或模擬轉染的培養液中加入0.025ng rFVIIa。在COASET FVII試驗中，0.025ng的FVIIa相當於OD405＝0.35(第一輪)及OD405＝0.26(第二輪)的信號。
將得到的結果編輯在下表中糖基化偶聯物稀釋倍數 OD405標準0.35 0.26摹擬物 50 0.38 0.1925 0.31 0.1610 0.21 0.1550.22 0.1410.08 0.07R290N+A292T50 0.23 -25 0.12 -10 0.07 -50.04 -10.04 -G291N 50 - 0.1625 - 0.0810 - 0.065- 0.051- 0.04上述數據顯示糖基化偶聯物G291N和R290N+A292T抑制rFVIIa的功能。
實施例8FVII的純化和之後的活化野生型因子VII和其偶聯物的純化在4℃進行。從表達所述偶聯物(或野生型FVII)的細胞中獲得的上清經無菌過濾(0.22μm)，在冷的超純(milli Q)水中稀釋兩倍。加入EDTA至5mM，將pH調整到8.6，導電率低於10mS/cm。將樣品裝載至已於4℃用10mM pH8.6的Tris平衡的Q-Sepharose快速流動樹脂(Pharmacia)。在上樣後，用10mM Tris(pH8.6)，150mM NaCl洗滌層析柱，直到280nm的光吸收達到基線值。然後在10mM Tris(pH8.6)，100mMNaCl中平衡該層析柱。結合型偶聯物(或野生型FVII)用10mM Tris(pH8.6)，100mM NaCl，5mM CaCl2洗脫。匯集富含偶聯物(或野生型FVII)的級分，透析或使用Vivaspin濃縮裝置(Vivascience)進行濃縮。
偶聯物(或野生型FVII)的自我活化通過在10mM Tris(pH7.8-8.6)，100mM NaCl，5mM CaCl2中濃縮並溫育所洗脫的蛋白獲得。
另外，在37℃下，10mM Tris(pH7.4-8.0)，100mM NaCl，5mM CaCl2中，與CNBr-活化的Sepharose偶聯的因子Xa可活化所述偶聯物(或野生型FVII)。
將偶聯物(或野生型FVIIa)通過緩衝液交換轉移到含10mM CaCl2，50mM NaCl，3％甘露醇，0.05％Tween80，pH5.6緩衝的溶液中，過濾除菌並-80℃儲存。
實施例9FVII的N-末端PEG化在pH5.5的含10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈣，100mM氯化鈉的pH5.5緩衝液中，用M-PEG-CHO(M-ALD-5000，來自Shearwater)將因子FVII與分子量約5kDa的甲氧基聚乙二醇(mPEG)偶聯。M-PEG-CHO以過量50-100倍的摩爾濃度存在，所述蛋白濃度為0.2-0.5mg/ml。反應以300-1500μl量分批進行，每次在室溫下攪動1小時，添加過量500-1000倍的NaBH3CN，繼續過夜溫育，室溫攪動。
PEG化的FVII經緩衝液交換轉移到緩衝液A(10mM Tris，pH7.6)，並在4℃將其上樣至已在緩衝液A中平衡過的mono Q柱(Pharmacia)上。用從0-100％B的梯度(10mM Tris，(pH7.6)，500mM NaCl)以40倍柱體積洗脫結合型蛋白。
實施例10大鼠中藥物動力學研究野生型FVII和本發明偶聯物均在1.3mg/ml甘氨醯-甘氨酸緩衝液(pH5.5，含1.5mg/ml CaCl2，30mg/ml甘露醇，0.1mg/ml polysorbat 80和3mg/ml NaCl)中配製。為了確定體內半壽期，各製劑以一次性靜脈內快速(bolus)注射給予S-D(Sprague-Dawley)大鼠。注射在約10秒鐘內緩慢給予，以降低因高Ca++濃度造成的潛在的心衰危險。從9隻麻醉處死的大鼠中以適當的間隔，如注射後1分鐘，15分鐘，30分鐘，45分鐘和1小時，採集血樣。將所述血樣收集在含腺嘌呤(Sigma#C4431)及50μl檸檬酸-磷酸-葡萄糖溶液的lml試管中以避免凝血。採樣後立即將樣品儲存於約0℃直到離心，然後收集檸檬酸化血漿上清用於分析。樣品通過檢測凝血活性的方法章節中所述一步凝血試驗進行分析，然後計算半壽期。
序列表110馬克西根公司(Maxygen ApS)120凝血因子VII或VIIa樣分子1300212WO10014014116011170Patent In Ver.2.12101211406212PRT213人(Homo sapiens)220221M0D_RES222(6)..(35)223Xaa＝γ-羧基穀氨酸或穀氨酸4001Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa1 5 10 15Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys20 25 30Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp35 40 45Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln50 55 60Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn65 70 75 80Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly85 90 95Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys100 105 110Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr115 120 125Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg130 135 140Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro145 150 155 160Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln165 170 175Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala180 185 190His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu195 200 205Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg210 215 220Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn225 230 235 240His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp245 250 255His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr260 265 270Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu275 280 285Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg290 295 300Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser305 310 315 320Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser325 330 335Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr340 345 350Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys355 360 365Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile370 375 380Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu385 390 395 400Leu Arg Ala Pro Phe Pro40521022111338212DNA213人(Homo sapiens)220221CDS222(115)..(1335)4002atggtcagcc aggccctccg cctcctgtgc ctgctcctgg ggctgcaggg ctgcctggct 60gccgtcttcg tcacccagga ggaagcccat ggcgtcctgc atcgccggcg ccgg gcc117Ala1aat gcc ttt ctg gaa gag ctc cgc cct ggc tcc ctg gaa cgc gaa tgc165Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys5 10 15aaa gag gaa cag tgc agc ttt gag gaa gcc cgg gag att ttc aaa gac213Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp20 25 30gct gag cgg acc aaa ctg ttt tgg att agc tat agc gat ggc gat cag261Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln35 40 45tgc gcc tcc agc cct tgc cag aac ggg ggc tcc tgc aaa gac cag ctg309Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu50 55 60 65cag agc tat atc tgc ttc tgc ctg cct gcc ttt gag ggg cgc aat tgc357Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys70 75 80gaa acc cat aag gat gac cag ctg att tgc gtc aac gaa aac ggg ggc 405Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly85 90 95tgc gag cag tac tgc agc gat cac acg ggc acg aag cgg agc tgc cgc 453Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg100 105 110tgc cac gaa ggc tat agc ctc ctg gct gac ggg gtg tcc tgc acg ccc 501Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro115 120 125acg gtg gaa tac cct tgc ggg aag att ccc att cta gaa aag cgg aac 549Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn130 135 140 145gct agc aaa ccc cag ggc cgg atc gtc ggc ggg aag gtc tgc cct aag 597Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys150 155 160ggg gag tgc ccc tgg cag gtc ctg ctc ctg gtc aac ggg gcc cag ctg 645Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu165 170 175tgc ggc ggg acc ctc atc aat acc att tgg gtc gtg tcc gcc gct cac 693Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His180 185 190tgc ttc gat aag att aag aat tgg cgg aac ctc atc gct gtg ctc ggc 741Cys Phe 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Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro310 315 320aat atc acg gag tat atg ttt tgc gct ggc tat agc gat ggc tcc aag 1125Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys325 330 335gat agc tgc aag ggg gac tcc ggc ggg ccc cat gcc acg cac tat cgc 1173Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg340 345 350ggg acc tgg tac ctc acc ggg atc gtc agc tgg ggc cag ggc tgc gcc 1221Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala355 360 365acg gtg ggg cac ttt ggc gtc tac acg cgc gtc agc cag tac att gag 1269Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu370 375 380 385tgg ctg cag aag ctc atg cgg agc gaa ccc cgg ccc ggg gtg ctc ctg 1317Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu390 395 400cgg gcc cct ttc cct tga taa 1338Arg Ala Pro Phe Pro4052103211406212PRT213人(Homo sapiens)4003Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu1 5 10 15Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys20 25 30Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp35 40 45Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln50 55 60Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn65 70 75 80Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly85 90 95Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys100 105 110Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr115 120 125Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg130 135 140Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro145 150 155 160Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln165 170 175Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala180 185 190His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu195 200 205Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg210 215 220Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn225 230 235 240His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp245 250 255His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr260 265 270Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu275 280 285Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg290 295 300Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser305 310 315 320Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser325 330 335Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr340 345 350Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys355 360 365Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile370 375 380Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu385 390 395 400Leu Arg Ala Pro Phe Pro40521042111357212DNA213人工序列220223人工序列的描述用於在哺乳動物細胞中表達FVII的表達盒4004ggatcccgcc accatggtca gccaggccct ccgcctcctg tgcctgctcc tggggctgca 60gggctgcctg gctgccgtct tcgtcaccca ggaggaagcc catggcgtcc tgcatcgccg 120gcgccgggcc aatgcctttc tggaagagct ccgccctggc tccctggaac gcgaatgcaa 180agaggaacag tgcagctttg aggaagcccg ggagattttc aaagacgctg agcggaccaa 240actgttttgg attagctata gcgatggcga tcagtgcgcc tccagccctt gccagaacgg 300gggctcctgc aaagaccagc tgcagagcta tatctgcttc tgcctgcctg cctttgaggg 360gcgcaattgc gaaacccata aggatgacca gctgatttgc gtcaacgaaa acgggggctg 420cgagcagtac tgcagcgatc acacgggcac gaagcggagc tgccgctgcc acgaaggcta 480tagcctcctg gctgacgggg tgtcctgcac gcccacggtg gaataccctt gcgggaagat 540tcccattcta gaaaagcgga acgctagcaa accccagggc cggatcgtcg gcgggaaggt 600ctgccctaag ggggagtgcc cctggcaggt cctgctcctg gtcaacgggg cccagctgtg 660cggcgggacc ctcatcaata ccatttgggt cgtgtccgcc gctcactgct tcgataagat 720taagaattgg cggaacctca tcgctgtgct cggcgaacac gatctgtccg agcatgacgg 780ggacgaacag tcccgccggg tggctcaggt catcattccc tccacctatg tgcctggcac 840gaccaatcac gatatcgctc tgctccgcct ccaccagccc gtcgtgctca ccgatcacgt 900cgtgcctctg tgcctgcctg agcggacctt tagcgaacgc acgctggctt tcgtccgctt 960tagcctcgtg tccggctggg gccagctgct cgaccggggc gctaccgctc tcgagctgat 1020ggtgctcaac gtcccccggc tgatgaccca ggactgcctg cagcagtccc gcaaagtggg 1080ggactccccc aatatcacgg agtatatgtt ttgcgctggc tatagcgatg gctccaagga 1140tagctgcaag ggggactccg gcgggcccca tgccacgcac tatcgcggga cctggtacct 1200caccgggatc gtcagctggg gccagggctg cgccacggtg gggcactttg gcgtctacac 1260gcgcgtcagc cagtacattg agtggctgca gaagctcatg cggagcgaac cccggcccgg 1320ggtgctcctg cgggcccctt tcccttgata aaagctt 1357210521131212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物CBProFpr1744005agctggctag ccactgggca ggtaagtatc a31210621131212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物CBProFpr1754006tggcgggatc cttaagagct gtaattgaac t31210721130212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物CBProFpr2164007cttaaggatc ccgccaccat ggtcagccag 30210821128212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物CBProFpr2294008ggagtccccg gttttgttgg actgctgc28210921121212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物CBProFpr2214009acttaagcttt tatcaaggg a 212101021128212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物CBProFpr22840010gcagcagtcc aacaaaaccg gggactcc282101121130212DNA213人工序列220223人工序列的描述引物CBProFpr22640011cattctagaa aaccggaccg ctagcaaacc 30
權利要求
1.一種偶聯物，該偶聯物包含至少一個與多肽共價連接的非多肽組分，其中所述多肽的胺基酸序列不同於SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIa的胺基酸序列在於，其引入或去除了至少一個包含所述非多肽組分的連接基團的胺基酸殘基。
2.權利要求1的偶聯物，其中所述連接基團選自賴氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和穀氨酸。
3.權利要求2的偶聯物，其中所述連接基團是賴氨酸。
4.權利要求3的偶聯物，其中所述多肽的胺基酸序列不同於SEQ IDNO1在於，其去除了至少一個賴氨酸殘基。
5.權利要求4的偶聯物，其中所述賴氨酸殘基通過取代被去除。
6.權利要求4或5的偶聯物，其中所述被去除的賴氨酸殘基選自K18，K32，K38，K62，K85，K109，K137，K143，K148，K157，K161，K197，K199，K316，K337，K341，K389或其組合。
7.權利要求6的偶聯物，其中所述賴氨酸殘基選自K18，K62，K85，K197，K341或其組合。
8.權利要求5-7中任一項的偶聯物，其中所述賴氨酸殘基被選自下組的胺基酸殘基所取代R，Q，N或H。
9.權利要求8的偶聯物，其中所述賴氨酸殘基被R所取代。
10.權利要求3-9中任一項的偶聯物，其中所述多肽的胺基酸序列不同於SEQ ID NO1在於，其引入了至少一個賴氨酸殘基。
11.權利要求10的偶聯物，其中所述賴氨酸殘基通過取代被引入。
12.權利要求11的偶聯物，其中所述取代選自I42K，Y44K，L288K，D289K，R290K，G291K，A292K，T293K，Q313K，S314K，R315K，V317K，L390K，M391K，R392K，S393K，E394K，P395K，R396K，P397K，G398K，V399K，L400K，L401K，R402K，A403K，P404K，F405K或其組合。
13.權利要求12的偶聯物，其中所述取代選自R290K，R315K，R392K，R396K，R402K或其組合。
14.權利要求3-13中任一項的偶聯物，其中去除了至少一個賴氨酸殘基，並且引入了至少一個賴氨酸殘基。
15.權利要求2的偶聯物，其中所述連接基團是半胱氨酸。
16.權利要求15的偶聯物，其中所述半胱氨酸殘基通過取代被引入。
17.權利要求16的偶聯物，其中所述取代選自I30C，K32C，D33C，A34C，T37C，K38C，W41C，Y44C，S45C，D46C，L141C，E142C，K143C，R144C，L288C，D289C，R290C，G291C，A292C，S314C，R315C，K316C，V317C，L390C，M391C，R392C，S393C，E394C，P395C，R396C，P397C，G398C，V399C，L401C，R402C，A403C，P404C或其組合。
18.權利要求17的偶聯物，其中所述取代選自K32C，Y44C，K143C，R290C，R315C，K341C，R392C，R396C，R402C或其組合。
19.權利要求2的偶聯物，其中所述連接基團是天冬氨酸和/或穀氨酸。
20.權利要求19的偶聯物，其中所述多肽的胺基酸序列不同於SEQ IDNO1在於，其引入了至少一個天冬氨酸殘基和/或穀氨酸殘基。
21.權利要求20的偶聯物，其中所述天冬氨酸殘基和/或穀氨酸殘基通過取代被引入。
22.權利要求21的偶聯物，其中所述取代選自I30D/E，K32D/E，A34D/E，T37D/E，K38D/E，W41D/E，Y44D/E，S45D/E，D46C，L141D/E，E142D/E，K143D/E，R144D/E，L288D/E，R290D/E，G291D/E，A292D/E，Q313D/E，S314D/E，R315D/E，K316D/E，V317D/E，L390D/E，M391D/E，R392D/E，S393D/E，P395D/E，R396D/E，P397D/E，G398D/E，V399D/E，L401D/E，R402D/E，A403D/E，P404D/E或其組合。
23.權利要求22的偶聯物，其中所述取代選自K32D/E，Y44D/E，K143D/E，R290D/E，R315D/E，K341D/E，R392D/E，R396D/E，R402D/E或其組合。
24.權利要求19的偶聯物，其中所述多肽的胺基酸序列不同於SEQ IDNO1在於，其去除了至少一個天冬氨酸殘基和/或穀氨酸殘基。
25.權利要求24的偶聯物，其中所述天冬氨酸殘基和/或穀氨酸殘基通過取代被去除。
26.權利要求25的偶聯物，其中所述取代選自D33，D46，D48，E77，E82，D86，D87，E94，E99，D104，E116，D123，E132，E142，E163，D196，E210，D212，E215，D217，D219，E220，D256，E265，E270，D289，E296，D309，D319，E325，D334，D338，D343，E385，E394或其組合。
27.權利要求19-26中任一項的偶聯物，其中引入了至少一個天冬氨酸和/或穀氨酸殘基，並且去除了至少一個天冬氨酸和/或穀氨酸殘基。
28.上述權利要求中任一項的偶聯物，其中所述非多肽組分是聚合物分子。
29.權利要求28的偶聯物，其中所述聚合物分子選自天然的或合成的均聚物或雜聚物。
30.權利要求29的偶聯物，其中所述聚合物分子是合成的均聚物或雜聚物，其選自線性的和分支的聚乙二醇，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸和聚(乙烯吡咯烷酮)。
31.權利要求30的偶聯物，所述聚合物是線性的或分支的聚乙二醇。
32.權利要求31的偶聯物，其中所述聚乙二醇的分子量約為300-100000Da。
33.上述權利要求中任一項的偶聯物，其中所述多肽與SEQ ID NO1所示胺基酸序列有1-15個胺基酸殘基的差異。
34.權利要求1的偶聯物，其中所述非多肽組分是糖組分，並且其中所述連接基團是糖組分的連接基團。
35.權利要求34的偶聯物，其中所述連接基團是糖基化位點。
36.權利要求35的偶聯物，其中引入了至少一個非天然產生的糖基化位點。
37.權利要求35的偶聯物，其中去除了至少一個天然產生的糖基化位點。
38.權利要求36-37中任一項的偶聯物，其中引入了至少一個非天然產生的糖基化位點，並且去除了至少一個天然產生的糖基化位點。
39.權利要求36的偶聯物，其中所述引入的糖基化位點是體內糖基化位點。
40.權利要求39的偶聯物，其中所述糖基化位點是體內的O-糖基化位點。
41.權利要求39的偶聯物，其中所述糖基化位點是體內的N-糖基化位點。
42.權利要求41的偶聯物，其中所述多肽的胺基酸序列不同於SEQ IDNO1在於，至少一個天然產生的N-X′-X序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸外的任何胺基酸，X是除絲氨酸和蘇氨酸外的任何胺基酸。
43.權利要求41的偶聯物，其中所述多肽的胺基酸序列不同於SEQ IDNO1在於，SEQ ID NO1中存在的至少一個天然產生的X-X′-S或X-X′-T序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸外的任何胺基酸，X是除天冬醯胺外的任何胺基酸。
44.權利要求42或43的偶聯物，其中所述取代選自F4S/T，P10N，Q21N，W41N，S43N，A51N，G58N，L65N，G59S/T，E82S/T，N95S/T，G97S/T，Y101N，D104N，T106N，K109N，G117N，G124N，S126N，T128N，A175S/T，G179N，I186S/T，V188N，R202S/T，I205S/T，D212N，E220N，I230N，P231N，P236N，G237N，V253N，E265N，T267N，E270N，R277N，L280N，G291N，P303S/T，L305N，Q312N，G318N，G331N，D334N，K337N，G342N，H348N，R353N，Y357N，I361N，V376N，R379N，M391N或其組合。
45.權利要求44的偶聯物，其中所述取代選自F4S/T，P10N，Q21N，W41N，A51N，G58N，G59S/T，N95S/T，G97S/T，Y101N，D104N，T106N，K109N，G117N，G124N，S126N，T128N，A175S/T，I186S/T，V188N，R202S/T，I205S/T，D212N，E220N，V253N，E265N，T267N，E270N，L280N，G291N，P303S/T，G318N，G331N，D334N，K337N，R353N，Y357N，M391N或其組合。
46.權利要求41的偶聯物，其中所述多肽的胺基酸序列不同於SEQ IDNO1在於，SEQ ID NO1中存在的至少一個天然產生的K-X′-X或R-X′-X序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸外的任何胺基酸，X是除絲氨酸和蘇氨酸外的任何胺基酸。
47.權利要求46的偶聯物，其中所述取代選自K32N+A34S/T，K38N+F40S/T，K62N+Q64S/T，K85N+D87S/T，K137N+P139S/T，K143N+N145S/T，K148N+Q149S/T，K161N+E163S/T，K197N+K199S/T，K199N+W201S/T，K316N+G318S/T，K337N，K341N+D343S/T，K389N+M391S/T或其組合。
48.權利要求41的偶聯物，其中所述非天然產生的體內N-糖基化位點是通過取代引入的，取代的位置選自28-48，139-147，286-294，311-319，338-345，388-406。
49.權利要求48的偶聯物，其中所述取代選自K32N+A34ST，F31N+D33S/T，I30N+K32S/T，A34N+R36S/T，K38N+F40S/T，T37N+L39S/T，R36N+K38S/T，L39N+W41S/T，F40N+I42S/T，W41N，I42N+Y44S/T，S43N，Y44N+D46S/T，S45N+G47S/T，D46N+D48S/T，G47N+Q49S/T，K143N+N145S/T，E142N+R144S/T，L141N+K143S/T，I140N+E142S/T，R144N+A146S/T，A146N+K148S/T，S147N+P149S/T，R290N+A292S/T，D289N+G291S/T，L288N+R290S/T，L287N+D289S/T，G291N，A292N+A294S/T，T293N+L295S/T，R315N+V317S/T，S314N+K316S/T，Q313N+R315S/T，Q312N，K316N+G318S/T，V317N+D319S/T，G318N，K341N+D343S/T，S339N+K341S/T，G342N，D343N+G345S/T，R392N+E394S/T，M391N，L390N+R392S/T，K389N+M391S/T，S393N+P395S/T，E394N+R396S/T，P395N+P397S/T，R396N+G398S/T，P397N+V399S/T，G398N+L400S/T，V399N+L401S/T，L400N+R402S/T，L401N+A403S/T，R402N+P404S/T，A403N+F405S/T，P404N+P406S/T，K143N+N145S/T+R315N+V317S/T或其組合。
50.權利要求49的偶聯物，其中所述取代選自K32N+A34S/T，K38N+F40S/T，Y44N+D46S/T，K143N+N145S/T，R290N+A292S/T，R315N+V317S/T，K341N+D343S/T，R392N+E394S/T，R396N+G398S/T，R402N+P404S/T，K143N+N145S/T+R315N+V317S/T或其組合。
51.權利要求50的偶聯物，其中所述取代選自K32N+A34T，K38N+F40T，Y44N+D46T，K143N+N145T，R290N+A292T，R315N+V317T，K341N+D343T，R392N+E394T，R396N+G398T，R402N+P404T，K143N+N145T+R315N+V317T或其組合。
52.權利要求34-51中任一項的偶聯物，其中所述多肽與SEQ ID NO1所示胺基酸序列有1-15個胺基酸殘基的差異。
53.權利要求39-52中任一項的偶聯物，其中引入了兩個或多個體內糖基化位點。
54.權利要求34-53中任一項的偶聯物，該偶聯物進一步包含至少一個與所述多肽的胺基酸殘基共價連接的非多肽組分，其中所述非多肽組分與糖組分不同。
55.權利要求54的偶聯物，其中所述非多肽組分是權利要求29-32中任一項定義的聚合物分子。
56.上述權利要求中任一項的偶聯物，其中所述偶聯物的分子量至少為67kDa。
57.上述權利要求中任一項的偶聯物，其中所述偶聯物已失活。
58.一種多肽，其具有權利要求1-56中任一項定義的胺基酸序列。
59.一種核苷酸序列，其編碼權利要求58的多肽。
60.一種表達載體，其包含權利要求59的核苷酸序列。
61.一種宿主細胞，其包含權利要求59的核苷酸序列或權利要求60的表達載體。
62.權利要求61的宿主細胞，其中所述宿主細胞是可進行體內糖基化的γ-羧基化細胞。
63.一種製備權利要求1-57中任一項定義的偶聯物的方法，該方法包括在有益於所述多肽表達的條件下培養權利要求61或62所定義的宿主細胞，並回收所述多肽，其中a)所述多肽包含至少一個N-或O-糖基化位點，並且所述宿主細胞是可進行體內糖基化的真核宿主細胞，和/或b)使所述多肽在體外與一個非多肽組分偶聯。
64.一種組合物，其包含權利要求1-57中任一項所定義的偶聯物和一種可藥用的載體或賦形劑。
65.權利要求1-57中任一項所定義的偶聯物，所述偶聯物用做藥物。
66.權利要求1-56中任一項所定義的偶聯物在製備用於治療哺乳動物FVIIa/TF相關疾病的藥物中的用途。
67.權利要求66的用途，其中FVIIa/TF相關疾病選自需要加強凝血的疾病。
68.權利要求57所定義的失活的偶聯物在製備用於治療哺乳動物FVIIa/TF相關疾病的藥物中的用途。
69.權利要求68的用途，其中FVIIa/TF相關疾病選自需要減弱凝血的疾病。
70.一種治療具有FVIIa/TF相關疾病的哺乳動物的方法，包括以有效劑量給予有需求的哺乳動物以權利要求1-56中任一項所定義的偶聯物。
71.權利要求70的方法，其中所述疾病選自需要加強凝血的疾病。
72.一種治療具有FVIIa/TF相關疾病的哺乳動物的方法，包括以有效劑量給予有需求的哺乳動物以權利要求57所定義的偶聯物。
73.權利要求72的方法，其中所述疾病選自需要減弱凝血的疾病。
全文摘要
本發明涉及新的凝血因子VII(FVII)或凝血因子VIIa(FVIIa)的多肽偶聯物，其製備及在其治療方面的用途，特別是對多種凝血相關疾病治療的用途。這些新的多肽偶聯物包含至少一個共價偶聯於多肽上的非多肽組分，其中該多肽的胺基酸序列與野生型FVII或FVIIa不同在於其引入或去除了至少一個包含所述非多肽組分連接基團的胺基酸殘基。本發明的偶聯物與商品化的rFVIIa相比有一種或多種改進的特性，包括功能性體內半壽期延長和/或血漿半壽期延長，和/或生物利用率增加和/或對蛋白酶解的敏感性降低。
文檔編號C07K14/745GK1400910SQ01804864
公開日2003年3月5日 申請日期2001年2月12日 優先權日2000年2月11日
發明者金·V·安德森, 安德斯·H·佩德森, 克勞斯·博尼斯 申請人:馬克西根公司, 馬克西根控股公司