作為妊娠相關病症的診斷標誌物的循環mRNA的製作方法

2023-04-25 05:59:46

專利名稱：作為妊娠相關病症的診斷標誌物的循環mRNA的製作方法
相關申請本申請要求在2003年1月17日提交的美國臨時申請第60,440,906號的優先權，本發明引用其全文作為參考。
背景技術：
通常採用諸如絨毛膜取樣(CVS)或羊膜穿刺術的方法從胎兒中分離細胞來進行產前診斷。儘管操作非常仔細，但這些常規方法均是侵襲性的，並對母體和胎兒有一定的風險(Tabor et al.，Lancet 11287-1293，1986)。
在發現母體循環中存在一些類型的胎兒細胞(Johansen et al.，Prenat.Diagn.15921-931，1995)之後，更重要的是在發現母體血漿和血清中能夠檢測到循環的無細胞的胎兒DNA(Lo et al.，Lancet 350485-487，1997)之後，已經開發了替代這些侵襲性方法的產前篩查方法，例如檢測胎兒異常的方法。已證明，母體血液中的胎兒DNA的含量足夠用於遺傳學分析，與分離和富集胎兒細胞的必需步驟相比，並不需要對所述血漿或血清進行複雜的處理。利用聚合酶鏈式反應(PCR)為基礎的技術，通過檢測母體血液中的胎兒DNA來實現胎兒rhesus D(RhD)基因型的檢測(Lo et al.，N.Engl.J.Med.3391734-1738，1998)、胎兒性別的確定(Lo et al.，Hum.Genet.90483-488，1993)、以及一些胎兒病症的診斷(Amicucci et al.，Clin.Chem.46301-302，2000；Saito et al.，Lancet 3561170，2000；及Chiu et al.，Lancet 360998-1000，2002)。
此外，也有報導稱在先兆子癇(Lo et al.，Clin.Chem.45184-188，1999和Zhong et al.，Am.J.Obstet.Gynecol.184414-419，2001)、胎兒21號染色體三體性(trisomy)(Lo et al.，Clin.Chem.451747-1751，1999和Zhonget al.Prenat.Diagn.20795-798，2000)和妊娠劇吐症(hyperemesisgravidarum)(Sekizawa et al.，Clin.Chem.472164-2165，2001)的母體血漿/血清中胎兒DNA含量異常的報導。美國專利第6,258,540號也公開了用於產前遺傳分析的母體血液中胎兒核酸的檢測。
在分析胎兒DNA時，檢測者通常利用僅出現在男性胎兒中的Y染色體標誌物作為胎兒的特異性標誌物。這種方法使此項技術的應用局限於50％的妊娠婦女，這些妊娠婦女懷有男性胎兒。此外，其它遺傳多態性的利用，也增加了胎兒DNA為基礎的分析的複雜性。母體血漿中胎兒RNA的發現提供了超越這些限制的可能的新方法(Poon et al.，Clin.Chem.461832-1834，2000).
最近，美國專利申請第09/876,005號公開了以母體血液中胎兒RNA檢測為基礎的非侵襲性技術。本發明第一次公開了在母體血液中出現的某些mRNA種類的含量能夠用作診斷、監測或預測諸如先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產的妊娠相關病症、以及檢測妊娠的標誌物，所述mRNA種類包括編碼人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、人胎盤促乳素(hPL)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的mRNA。
發明概述本發明提供了通過檢測母體血液中的一種或多種循環mRNA的含量來診斷、監測或預測諸如先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產的妊娠相關病症的新方法。本發明還提供了基於相同方法學的檢測婦女妊娠的方法。所述的mRNA可以編碼諸如人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的胎兒或母體來源的蛋白。同時也提供以本發明為基礎的用於這些妊娠相關疾病狀態/妊娠的診斷/檢測試劑盒。
本發明的一個方面涉及診斷、監測或預測妊娠婦女的先兆子癇的方法。此方法包括多個步驟第一步是定量測定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定mRNA種類的含量。所述mRNA可編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。第二步是將第一步獲得的mRNA含量與代表正常非先兆子癇的婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照進行比較。所述mRNA水平的增加或降低表明存在先兆子癇或發展為所述疾病狀態的風險增加。
在一些實施方案中，此方法中用作標誌物的mRNA編碼hCRH或GAPDH。在一些實施方案中，所述方法的第一步通過反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)進行，而在其它實施方案中，第一步可採用多核苷酸雜交方法或質譜方法來實施。在一些實施方案中，所述妊娠婦女處於妊娠期的頭三月，而其它實施方案中，所述婦女處於妊娠期的中三月或末三月。在一些實施方案中，所述妊娠婦女的血液在用於所述方法的第一步之前是無細胞的。在一些實施方案中，在所述方法的第一步中使用血漿或血清。在一些實施方案中，所述mRNA含量的增加高於標準對照2倍。
本發明的方法也可用於診斷、監測或預測比先兆子癇更嚴重的諸如驚厥的臨床病程。
本發明還涉及診斷、監測或預測妊娠婦女的先兆子癇的試劑盒。所述的試劑盒包括用於定量測定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定mRNA種類的PCR引物。所述的mRNA可編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。所述試劑盒還包括代表正常非先兆子癇的婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照。本發明的試劑盒在所述PCR引物之外還可包括一種或多種用於定量測定編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA含量的探針，或用其替代所述PCR引物。
本發明的另一方面涉及用於檢測妊娠婦女中諸如18號染色體三體性或21號染色體三體性的胎兒染色體非整倍性的方法。此方法包括多個步驟第一步是定量測定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定mRNA種類的含量。所述mRNA可編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH。第二步是將第一步獲得的mRNA含量與代表懷有正常染色體胎兒的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照進行比較。所述mRNA水平的增加或降低表明懷有非整倍體胎兒的風險增加。
在一些實施方案中，此方法中用作標誌物的mRNA編碼hCG-β。在一些實施方案中，所述方法的第一步通過RT-PCR進行，而在其它實施方案中，第一步可採用多核苷酸雜交方法或質譜方法來實施。在一些實施方案中，所述妊娠婦女處於妊娠期的頭三月，而在其它實施方案中，所述妊娠婦女處於妊娠期的中三月或末三月。在一些實施方案中，所述妊娠婦女的血液在用於所述方法的第一步之前是無細胞的。在一些實施方案中，在所述方法的第一步中使用血漿或血清。在一些實施方案中，所述增加至少為2倍，而所述降低至少為50％。
本發明還涉及用於檢測妊娠婦女中胎兒染色體非整倍性(諸如18號染色體三體性或21號染色體三體性)的試劑盒。所述的試劑盒包括用於定量測定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定種類的mRNA的PCR引物。所述的mRNA可編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH。所述試劑盒還包括代表懷有染色體正常胎兒的正常婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照。本發明的試劑盒除所述PCR引物之外還可包括一種或多種用於定量測定編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1、或GAPDH的mRNA含量的探針，或用其替代所述PCR引物。
本發明的另一方面涉及診斷、監測或預測妊娠婦女的早產(pre-termlabor)的方法。此方法包括多個步驟第一步是定量測定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定種類的mRNA的含量。所述mRNA可編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。第二步是將第一步獲得的mRNA含量與代表如期分娩或將會如期分娩的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照進行比較。所述mRNA水平的增加或降低表明早產或發展為此狀態的風險增加。
在一些實施方案中，所述方法的第一步通過RT-PCR進行，而在其它實施方案中，第一步採用多核苷酸雜交方法或質譜方法來實施。在一些實施方案中，所述妊娠婦女處於妊娠期的頭三月，而在其它的實施方案中，所述妊娠婦女處於妊娠期的中三月或末三月。在一些實施方案中，所述妊娠婦女的血液在用於所述方法的第一步之前是無細胞的。在一些實施方案中，在所述方法的第一步中使用血漿或血清。在一些實施方案中，所述mRNA含量的增加高於標準對照2倍。在另一些實施方案中，所述的降低至少為50％。
本發明還涉及診斷、監測或預測妊娠婦女的早產的試劑盒。所述的試劑盒包括用於定量測定所述妊娠婦女血液中的一種或多種特定種類的mRNA的PCR引物。所述的mRNA可編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH。所述試劑盒還包括代表如期分娩或將會如期分娩的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照。本發明的試劑盒除所述PCR引物之外還可包括一種或多種用於定量測定編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA含量的探針，或用其替代所述PCR引物。
本發明的另一方面涉及檢測婦女妊娠的方法。此方法包括多個步驟第一步是定量測定所述婦女血液中的一種或多種特定種類的mRNA的含量。所述mRNA可編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLAC1。第二步是將第一步獲得的mRNA含量與代表健康且未妊娠的正常婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照進行比較。所述mRNA水平增加表明妊娠。
在一些實施方案中，所述方法的第一步通過RT-PCR進行，而在其它實施方案中，第一步採用多核苷酸雜交方法或質譜方法來實施。在一些實施方案中，所述妊娠婦女的血液在用於所述方法的第一步之前是無細胞的。在一些實施方案中，在所述方法的第一步中使用血漿或血清。在一些實施方案中，所述mRNA含量的增加高於標準對照2倍。在另一些實施方案中，所述的降低至少為50％。
本發明還涉及檢測婦女妊娠的試劑盒。所述的試劑盒包括用於定量測定所述妊娠婦女血液中一種或多種特定種類的mRNA的PCR引物。所述的mRNA可編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLAC1。所述試劑盒還包括代表健康且未妊娠的正常婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照。本發明的試劑盒除所述PCR引物之外還可包括一種或多種用於定量測定編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLAC1的mRNA含量的探針，或用其替代所述PCR引物。
附圖的簡要描述

圖1所示為分娩後母體血漿中CRH mRNA的清除狀況(A)為分娩前和分娩後2小時母體血漿中CRH mRNA的濃度，(B)則為分娩前和分娩後2小時母體血漿中GAPDH RNA的濃度。每一條線代表從一個受試者獲得的一份血漿樣本。
圖2為先兆子癇和對照組母體血漿中CRHm RNA濃度的盒須圖(boxplot)。CRH mRNA濃度以拷貝/mL表示。所述盒中的橫線表示中位數。所述盒標誌25th與75th百分點之間的區間。所述須(whisker)表示10th與90th百分點之間的區間。實心原點標誌10th與90th百分點區間以外的數據點。
圖3所示為正常妊娠母體血漿中胎盤來源的mRNA的水平。(A)為不同妊娠階段母體血漿中hPL mRNA和母體血清中蛋白水平的盒須圖。(B)為不同妊娠階段母體血漿中βhCG mRNA和母體血清中hCG蛋白水平的盒須圖。所述盒中的橫線表示中位數。所述盒標誌25th與75th百分點之間的區間。所述須表示10th與90th百分點之間的區間。實心原點標誌10th與90th百分點區間以外的數據點。(C)為母體血漿中hPL mRNA和母體血清中蛋白水平之間的相關性分析。(D)為母體血漿中βhCG mRNA和母體血清中蛋白水平之間的相關性分析。
圖4所示為分娩後母體血漿中hPL mRNA的清除狀況。(A)為分娩前和分娩後24小時的母體血漿hPL mRNA水平，而(B)為分娩前和分娩後24小時的母體血漿GAPDH mRNA水平。顯示了8例血漿樣本的結果，且每一條線代表從一個受試者獲得的一份血漿樣本。(C)為分娩前和分娩後2小時的母體血漿hPL mRNA水平，而(D)為分娩前和分娩後2小時的母體血漿GAPDH mRNA水平。顯示了13例血漿樣本的結果，且每一條線代表從一個受試者獲得的一份血漿樣本。
圖5顯示了母體血漿中GAPDH mRNA的含量。樣本1-12來自正常妊娠婦女，而樣本28-37來自先兆子癇婦女。
圖6顯示了非整倍體和對照妊娠的妊娠期頭三月中母體血清hCGβmRNA的濃度。盒須圖顯示了對照、21號染色體三體性(T21)和18號染色體三體性(T18)妊娠者的血清中的hCGβmRNA濃度(常用對數取值)。所述盒中的橫線表示中位數。所述盒標誌25th與75th百分點之間的區間。所述須表示10th與90th百分點之間的區間。實心原點標誌10th與90th百分點區間以外的數據點。
圖7所示為用於母體血漿中妊娠特異胎盤表達的mRNA標誌物的系統鑑定的策略的概括。收集配對的胎盤組織和母體全血樣本，並對其進行寡核苷酸晶片分析。挑選相對於全血在所述胎盤組織中表達增加的轉錄本，並且通過對母體血漿的定量反轉錄酶PCR(QRT-PCR)來評價其在母體血漿中的可檢測性和妊娠特異性。
圖8所示為分娩後母體血漿中胎盤mRNA的清除狀況。通過QRT-PCR檢測了分娩前和分娩後24小時母體血漿中(A)TFPI2 mRNA、(B)KISS1 mRNA和(C)PLAC1 mRNA的濃度。每一條線代表從一個受試者獲得的一份血漿樣本。
圖9顯示了母體血漿和胎盤組織中標準化胎盤mRNA水平的相關性。(A)為頭三月妊娠期血漿和CVS間的標準化胎盤mRNA水平的相關性。(B)為末三月妊娠期血漿和末期胎盤間標準化胎盤mRNA水平的相關性。通過QRT-PCR測定血漿和胎盤組織中的標準化的βhCG(nβhCG)、TFPI2(nTFPI2)、KISS1(nKISS1)、CRH(nCRH)和PLAC1(nPLAC1)mRNA的水平，並分別用圖例中所說明的符號來表示。對於非胎盤表達的轉錄本，也顯示了標準化的GAPDH(nGAPDH)和β-球蛋白(nβ-球蛋白)的結果。
定義本發明所用術語「先兆子癇」指在妊娠過程中發生的疾病狀態，其主要症狀為多種形式的高血壓並常伴有尿蛋白和水腫(浮腫)。先兆子癇有時稱為妊娠毒血症，與更嚴重的稱為驚厥的病症有關，其為先兆子癇結合癲癇發作。儘管其在出生後可立即發生或在妊娠20周之前發生，這些疾病狀態通常在妊娠的後半程(20周後)發病。
本發明所用術語「染色體非整倍性」指染色體異常的狀態，其中染色體數目不是通常單倍體數目的精確的多倍體經常是增加染色體或缺失一個。染色體非整倍性的最常見的情況是三體性，其中出現單個增加的染色體。例如18號染色體三體性是在細胞中出現第三條18號染色體的染色體異常，而細胞中存在第三條21號染色體的患者則患有21號染色體三體性疾病。
與非整倍性相反，「染色體正常」指染色體數目是所述單倍體數目的精確的多倍體的狀態，例如單倍體的染色體數目的兩倍，且每種染色體以相同的數目存在(除例如男性人類的性染色體外，其中兩種不同的性染色體X和Y各以一個拷貝存在)。
本發明所用術語「早產」或「提前分娩」指在約40周的完全妊娠期屆滿前3周以上發生分娩的狀態，如果不處理常導致早產。相對的，本申請所用的「如期分娩或將會如期分娩」的妊娠婦女指從懷胎至完全的孕期未發生早產的妊娠婦女。
本發明所用術語「血液」指從妊娠婦女或妊娠可能性檢測的婦女獲得的血液樣本或製備產物。該術語包括全血或血液的任何組分，其基本不含造血細胞或任意母體或胎兒來源的其它類型的細胞，包括血小板。「血液」通常不含有特定的物質，該物質可含有母體或胎兒來源的RNA。「血液」的例子包括血漿和血清。基本不含細胞的血液樣本也稱為「無細胞的」，其中通常不存在血小板。
本文用於描述非先兆子癇、懷有染色體正常胎兒或沒有且不會出現早產的妊娠婦女的術語「正常」指某些特徵，例如編碼在母體血液中發現的一種或多種特定胎兒蛋白的mRNA水平，其在一組隨機選擇的非先兆子癇、懷有染色體正常胎兒或沒有且不會出現早產的婦女中具有代表性。所選擇的這組應包括充足數量的婦女，從而使這些婦女中編碼特定胎兒蛋白的平均mRNA水平以適當的精確度反映懷有健康胎兒的健康妊娠婦女的整個群體的mRNA水平。此外，所選擇的這組婦女應與那些檢測血液中先兆子癇、胎兒染色體非整倍性或早產指徵的婦女有相似的妊娠齡。根據欲篩查的病症，用於本發明實踐的優選的妊娠齡可以不同。例如篩查先兆子癇風險的妊娠婦女優選在妊娠期中三月期間進行，而優選儘可能早地對胎兒染色體非整倍性進行篩查和診斷。而且，檢測的優選妊娠齡也依賴於檢測中所用的mRNA標誌物。例如，hPL mRNA在所有三個三月妊娠期中均可檢測，而隨著妊娠進程hCRH mRNA的可檢測性逐步增加。
術語「正常」也同樣用於指特定mRNA種類的含量代表在一組隨機挑選的非妊娠健康婦女血液中的含量。
本發明所用的人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，指示例性地其序列分別如GenBank登錄號NM_000737.2、NM_022640、NM_000756、U43527、NM_006528、BC022335和BC014085所給出的基因(包括其變體和突變體)和其多核苷酸轉錄本。在一些描述中，這些術語也指這些基因編碼的蛋白。
本發明所用「標準對照」指適合在本發明方法中使用來定量測定編碼特定蛋白，例如hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA含量的樣本。這些樣本含有已知含量的編碼特定蛋白的mRNA，其非常逼近反映正常妊娠婦女中此種mRNA的平均水平，如上所述該妊娠婦女是非先兆子癇、懷有染色體正常胎兒或沒有且不會出現早產的婦女。類似地，「標準對照」也可來自正常的健康非妊娠婦女。
本發明所用「mRNA含量比標準對照增加或降低」指含量相對於標準對照發生陽性或陰性變化。增加優選為至少2倍，更優選為至少5倍，並最優選為至少10倍。相似地，降低優選為至少50％，更優選為至少80％，並最優選為至少90％。
本發明所用的「多聚核苷酸雜交方法」指依據其形成Watson-Crick鹼基配對的能力，在適合的雜交條件下，利用已知序列的多聚核苷酸探針來檢測多聚核苷酸存在和/或數量的方法。這種雜交方法的例子包括Southern印記和Northern印記雜交。
本發明所用「PCR探針」指寡核苷酸，其在聚合酶鏈式反應(PCR)中用於擴增源於編碼諸如hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的目標蛋白的mRNA的核苷酸序列。至少一種用於擴增編碼上述指定蛋白的核苷酸序列的PCR引物對所述蛋白是序列特異的。
發明的詳細描述I.引言本發明第一次提供了通過分析存在於婦女血液中的一種或多種編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA來診斷、監測或預測妊娠婦女中先兆子癇、胎兒染色體非整倍性(諸如18號染色體三體性和21號染色體三體性)和早產，以及檢測婦女妊娠的方法和試劑盒。
根據本發明，能夠定量測定母體血液樣本中編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的含量，優選通過擴增方法來進行，例如反轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。隨後將一種或多種上述指定的mRNA種類與具有相同種類的mRNA的標準對照的水平進行比較，所述標準對照代表沒有這些妊娠相關病症的相同妊娠齡的正常妊娠婦女。mRNA水平的增加或降低表明存在所述病症或發展為所述病症的風險增加。因而，本發明提供了診斷先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產的新方法，其是非侵襲性的並且是非性別和多態性依賴的。
根據相同的方法學，通過將婦女血液中編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2或PLAC1的一種或多種mRNA種類的水平與來自正常非妊娠婦女的對照值進行比較，本發明也可用於檢測妊娠。
II.血液樣本的製備A.獲得血液樣本實施本發明的第一步是利用本發明方法從處於適合檢測的妊娠齡的妊娠婦女中或從檢測妊娠可能性的婦女中獲取血液樣本。如上所述，依據所檢測的病症，有時依據所用的mRNA標誌物，所述適合的妊娠齡可以不同。根據醫院和臨床通常採用的標準程序進行婦女血液的收集。收集適量的外周血，例如5-20ml，並可在進一步製備之前根據標準的步驟進行儲存。
B.製備無細胞血液樣本婦女血液的血清或血漿適合於本發明，並可通過公知的方法來獲得。例如，將婦女血液放入含有EDTA或諸如Vacutainer SST(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)的商業銷售的專用產品的管中來防止血液凝集，隨後通過離心可從全血中獲得血漿。另一方面，血液凝集後通過離心可獲得血清。通常在冷卻的環境例如約4-10℃的溫度中，採用適合的速度例如1,500-3,000xg下，進行離心。在轉移至新管中進行RNA提取前，可對血漿或血清進行額外的離心步驟。
III.婦女血液中mRNA含量的定量測定A.mRNA的提取有多種從生物樣本中提取mRNA的方法。可依據通常的mRNA製備方法(例如Sambrook和Russell，Molecular CloningA Laboratory Manual第三版，2001中所述)來進行；也可利用各種商業銷售的試劑或試劑盒，例如Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)、Oligotex Direct mRNA試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)、RNeasy Mini試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)以及PolyATtract Series 9600TM(Promega，Madison，WI)來從婦女血液樣本中獲取mRNA。也可將一種以上的上述方法組合採用。
從RNA製備產物中去除汙染性的DNA是必要的。因此，應該對樣本小心操作，利用DNase全面處理，在擴增和定量步驟中使用適合的陰性對照。
B.PCR為基礎的mRNA水平的定量測定一旦從婦女血液樣本中提取出mRNA，即可對編碼諸如hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的目標蛋白的mRNA含量進行定量檢測。測定mRNA水平的優選方法是擴增為基礎的方法，例如PCR。
在擴增步驟之前，必須合成目標mRNA的DNA複製本(cDNA)。這通過反轉錄來實現，其可分開進行或在一種擴增RNA的改進聚合酶鏈式反應——均質反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)中進行。適合核糖核酸的PCR擴增的方法如Romero與Rotbart的Diagnostic Molecular BiologyPrinciples and Applications pp.401-406；Persing et al.，eds.，MayoFoundation，Rochester，MN，1993；Egger et al.，J.Clin.Microbiol.331442-1447，1995；及美國專利第5,075,212所述。
PCR的常規方法是本領域公知的，因此本發明對其不作詳細描述。關於PCR方法、方案及設計引物的原則的綜述參見例如Innis，et al.，PCRProtocolsA Guide to Methods and Applications，Academic Press，Inc.N.Y.，1990。從諸如Roche Molecular Systems的供應商處也可獲得PCR試劑和方案。
通常PCR藉助耐熱酶以自動過程來完成。在此過程中，通過變性區、引物退火區及延伸反應區使反應混合物的溫度自動循環。適合此目的的儀器可通過商業渠道獲得。
儘管本發明實施時通常採用PCR來擴增目標mRNA。但本領域所屬技術人員應認識到，也可通過任何公知的方法來完成母體血液樣本中的這些mRNA種類的擴增，這些方法例如連接酶鏈式反應(LCR)、轉錄介導的擴增及自我持續序列複製或核酸序列為基礎的擴增(NASBA)，這些方法中的每一種都提供了充分的擴增。最近開發的分枝DNA技術(branched-DNA technology)也可用於定量測定母體血液中的mRNA標誌物的含量。用於臨床樣本中核酸序列的直接定量的分枝DNA信號擴增技術的綜述可參見Nolte，Adv.Clin.Chem.33201-235，1998。
C.其它的定量方法也可利用其它的本領域所屬技術人員公知的常規技術來檢測目標mRNA。儘管所述的檢測步驟之前通常有擴增步驟，但擴增並不是本發明方法所必需的。例如，無論是否先進行擴增步驟，均可通過大小分級來鑑定所述mRNA(例如凝膠電泳)。根據公知的技術(參見上述的Sambrook和Russell)將樣本在凝膠或聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳並用溴化乙錠進行標記，存在與標準對照大小相同的條帶是存在目標mRNA的標誌，然後根據所述條帶的強度可將其含量與對照進行比較。可選擇地，利用對編碼例如hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA特異的寡核苷酸探針來檢測這些mRNA種類的存在，並根據所述探針輸出的信號強度來指示相對於所述標準對照的含量。
序列特異探針雜交是公知的檢測包括其它種類核酸在內的特定核酸的方法。在足夠嚴格的雜交條件下，所述探針僅與基本互補的序列特異雜交。可放寬所述的嚴格雜交條件使得不定數目的序列錯配。
一些雜交的模式是本領域公知的，包括但不限於液相、固相或混和相雜交分析。以下文章提供了多種雜交分析模式的概述Singer et al.，Biotechniques 4230，1986；Haase et al.，Methods in Virology，pp.189-226，1984；Wilkinson，In situ Hybridization，Wilkinson ed.，IRL Press，Oxford University Press，Oxford；及Hames和Higgins eds.，Nucleic AcidHybridizationA Practical Approach，IRL Press，1987。
根據公知的技術檢測雜交複合物，且該檢測並不是本發明的關鍵方面。可使用通常用於檢測雜交核酸的存在的幾種方法中的任何一種來標記能夠與目標核酸(即所述的mRNA或擴增的DNA)特異雜交的核酸探針。一種通用的檢測方法是藉助3H、125I、35S、14C或32P等等標記的探針的放射自顯影。依據所選擇同位素合成的難易、穩定性和半衰期的研究參數來選擇放射性同位素。其它標記物包括能夠與抗配體結合的化合物(例如生物素和地高辛(digoxigenin))或用螢光素、化學發光劑和酶標記的抗體。可選擇地，探針能夠與諸如螢光素、化學發光劑或酶的標記物直接連接。依據所要求的敏感性、與所述探針連接的難易、穩定性要求和現有的設備來選擇標記物。
利用公知的技術可合成和標記本發明實施中必需的探針和引物。可根據Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letts.，221859-1862，1981中首次描述的固相磷醯胺酸三酯(phosphoramidite triester)方法，利用如Needham-VanDevanter et al.，Nucleic Acids Res.126159-6168，1984所述的自動合成儀來化學合成用作探針和引物的寡核苷酸。如Pearson和Regnier，J.Chrom.，255137-149，1983所述，通過天然丙烯醯胺凝膠電泳或陰離子交換HPLC來純化寡核苷酸。
IV.建立標準對照為了建立標準對照，首先選擇懷有健康胎兒的一組健康妊娠婦女。這些婦女應是相似妊娠齡的，並處於適合用本發明方法篩查諸如先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產的病症的妊娠時間段。類似地，利用來自一組健康的非妊娠婦女的樣本建立標準對照。
通過成熟的、常規使用的方法來確認所選妊娠婦女和其所懷胎兒的健康狀況，所述方法包括但不限於檢測所述婦女的血壓、記錄分娩的發生和利用CVS和羊水穿刺術進行胎兒遺傳性分析。
此外，所選擇的這組懷有健康胎兒的健康妊娠婦女或健康非妊娠婦女必須有一定的規模，從而從該組計算得到的編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的平均含量能夠可信地代表懷有健康胎兒的健康婦女或健康非妊娠婦女總群體的正常或平均含量。優選地，所選組包括至少10位婦女。
一旦依據所選組中每位婦女的個體值，建立編碼任一蛋白的mRNA含量的平均值，則該值即被認為是所述mRNA種類的標準值。因此，任何含有相似含量的同種mRNA的血液樣本均可用作標準對照。也可人工組合得到所含編碼hCG-β、hCRH、hPL、KISS1、TPFI2、PLAC1或GAPDH的mRNA的濃度等於所建立的同種mRNA的平均濃度的溶液，並將其作為標準對照。
以下僅以說明方式而非限定性的方式提供了本發明的實施例。本領域所屬技術人員應容易地認識到，通過改變或修改各種非關鍵性的參數也能實現基本相似的結果。
實施例實施例1先兆子癇婦女的hCRH mRNA水平升高A.方法受試者在得到知情同意和研究倫理委員會(Research Ethics Committee)批准的前提下，從妊娠婦女收集外周血樣本，這些妊娠婦女在香港Prince ofWales醫院婦產科看病。
在此研究的第一部分，從10例末三月妊娠期的健康妊娠婦女獲得血液樣本。在此課題的第二部分，徵募具有簡單妊娠的即將進行選擇性剖腹產手術的4例妊娠婦女。在即將分娩前和分娩後2小時採集這些受試者的外周血樣本。此研究的第三部分，對兩組患者進行了研究(a)12例先兆子癇婦女和(b)10例對照妊娠婦女。所述先兆子癇和對照組的中位妊娠齡分別為37周和38周。在沒有高血壓病史的婦女出現穩定增加的舒張壓，出現一次＞110mmHg或以至少4小時間隔出現兩次或多次＞90mmHg，並有顯著的蛋白尿，據此來確定先兆子癇。顯著的蛋白尿定義為＞0.3g/天或以至少4小時間隔收集的兩次清潔捕獲的中流段尿液樣本的檢測條檢測中≥2+。對照組包括沒有預先存在的醫學疾病或產前併發症的妊娠婦女。
血液樣本的處理依據以往報導的處理方法來處理血液樣本(Ng et al.，Chin.Chem.481212-1217，2002)。簡而言之，將10mL血液樣本收集在含有EDTA的管中，並在4℃以1600×g離心10分鐘。隨後將血漿小心地轉移至清潔的聚丙烯管中。將該血漿樣本在4℃以16000×g再次離心10分鐘，並將上清收集到新的聚丙烯管中。
RNA提取如上述引用的Ng等的文獻所述，將1.6mL的血漿與2mL的Trizol LS試劑(Invitrogen，Carlsbad，Califomia)和0.4mL氯仿混和。將所得混合物在4℃以11,900×g離心15分鐘，並將水層轉移至新的管中。向所述的水層加入等體積的70％乙醇。隨後，根據廠商的說明書將所述混合物加到RNeasy小型柱(Qiagen，Hilden，德國)中並進行處理。用30μL無RNase酶的水來洗脫總RNA，並在-80℃下儲存。進行DNase(RNase-Free DNaseSet，Qiagen，Hilden，德國)處理來去除任何汙染性的DNA。
實時定量RT-PCR根據上述引用的Ng等的文獻所述，採用一步實時定量RT-PCR對所有mRNA進行定量。所述CRH引物的序列為5』-GCCTCCCATCTCCCTGGAT-3』(正向)和5』-TGTGAGCTTGCTGTGCTAACTG-3』(反向)，而所述雙標記的螢光探針為5』-(FAM)TCCTCCGGGAAGTCTTGGAAATGGC(TAMRA)-3』。通過以1×107拷貝至1×101拷貝的濃度範圍對高效液相色譜純化的單鏈合成DNA寡核苷酸(Genset Oligos，新加坡)進行系列稀釋來製備用於CRH mRNA定量的校準曲線，該寡核苷酸對89bp CRH擴增子(amplicon)(Genbank登錄號NM_000756)特異。CRH mRNA的絕對濃度表示為拷貝/mL血漿的形式。用於CRH校準的合成DNA寡核苷酸序列為5』-GGAGCCTCCCATCTCCCTGGATCTCACCTTCCACCTCCTCCGGGAAGTCTTGGAAATGGCCAGGGCCGAGCAGTTAGCACAGCAAGCTCACAGCA-3』。如上所述製作GAPDH定量的校準曲線，並以表示為pg/mL血漿的形式(上述引用的Ng等)。
根據廠商的說明書以25μL的反應體積進行RT-PCR反應(EZ rTthRNA PCR試劑套裝，Applied Biosystems，Foster City，CA)。所用螢光探針(Genset Oligos)的濃度為100nM。對於CRH體系和GAPDH體系，所用PCR引物(Genset Oligos)的濃度均為200nM。使用5μL提取的血漿RNA進行擴增。每個樣本分析兩次，並且在每次分析中平行運行對應的校準曲線。用AmpliTaq Gold酶(Applied Biosystems，Foster City，CA)替代所述rTth多聚酶來檢測樣本，從而保證它們是DNA陰性的。在此對照分析中沒有觀察到擴增，表明所述分析對對應的mRNA具有特異性。在每一分析中也包括多個陰性空白水溶液。
用於所述CRH和GAPDH分析的溫度方案如下為了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶發揮作用，將反應在50℃引發2分鐘，隨後在60℃進行反轉錄30分鐘。在95℃變性5分鐘後，進行40個循環的以下PCR94℃變性20秒，分別對所述CRH和GAPDH體系在58℃和62℃退火/延伸1分鐘。
統計學分析利用Sigma Stat 2.03軟體(SPSS)進行統計學分析。
B.結果實時定量RT-PCR的建立為確定所述CRH RT-PCR分析的定量特性，我們利用此系統對系列稀釋的校準品進行了擴增，該校準品為依據所述CRH序列合成的DNA寡核苷酸。以往的數據表明這種單鏈寡核苷酸可靠地模擬了所述反轉錄步驟的產物，並產生與利用T7-轉錄的RNA(Bustin，J.Mol.Endocrinol.25169-193，2000)獲得的校準曲線相同的校準曲線。CRH擴增體系的校準曲線顯示了從2.5×101至1×106拷貝的動態範圍，並具有0.983的相關係數。這些分析的擴增步驟的靈敏度足以檢測25個拷貝的目標CRH。為確定包括RNA提取、反轉錄和擴增步驟的整個分析過程的準確性，我們對得自健康妊娠婦女(妊娠齡38周)的血漿樣本進行了10次平行的RNA提取，並對這些提取的RNA樣本進行RT-PCR分析。這些CRH mRNA的平行分析的Ct值的變異係數為2.8％。GAPDH RT-PCR分析的展開和特性如以上引用的Ng等人的文獻所述。
母體血漿中CRH mRNA的可檢測性為檢驗在母體血漿中是否能夠檢測到CRH mRNA的轉錄本，通過CRH RT-PCR分析對10例末三月妊娠期的妊娠婦女(妊娠齡為37到41周)的血漿樣本進行了分析。在所有檢驗樣本中均檢測到了CRH mRNA。血漿CRH mRNA濃度的中位值為73拷貝/mL(四分位數間距51至177)。作為陽性對照，在所有這些血漿樣本中均能檢測到GAPDH RNA。
分娩後母體血漿中CRH mRNA的清除為證明母體血漿的CRH mRNA來自胎兒胎盤單元(feto-placentalunit)，我們對4位婦女分娩前和分娩後2小時的血漿均進行了CRH mRNA分析。結果在所有4例分娩前的母體血漿樣本中均檢測到了CRH mRNA。相反，在任何分娩後的樣本中均沒有檢測到CRH mRNA。GAPDH mRNA在所有的血漿樣本中均可檢測到，從而證明了所述樣本的質量。所述數據如圖1A和圖1B所示。
先兆子癇的妊娠婦女血漿中的CRH mRNA的定量分析為比較先兆子癇和對照妊娠婦女母體血漿中的CRH mRNA的濃度，從妊娠齡相當的12例先兆子癇婦女和10例對照妊娠婦女獲取血漿樣本。如圖2所示，先兆子癇婦女和對照妊娠婦女的血漿CRH mRNA濃度的中位數分別為1070拷貝/mL(四分位數間距535至1468)和102拷貝/mL(四分位數間距51至158)。先兆子癇妊娠婦女的血漿CRH mRNA濃度的中位數為對照妊娠婦女的10.5倍高(Mann-Whitney檢驗，P＜0.001)。
C.結論血漿CRH mRNA代表一種新的先兆子癇的分子標誌物。與母體血漿的胎兒DNA分析相比，血漿RNA分析具有非性別和多態性依賴的優點。可以預見血漿RNA分析可最終實現未出生胎兒的非侵襲性基因表達譜分析。
實施例2妊娠婦女血漿中的hPL和hCG-βmRNA的檢測A.方法受試者從得到知情同意和研究倫理委員會批准的前提下，從單胎簡單妊娠的健康婦女收集15ml血液樣本，這些妊娠婦女在香港Prince of Wales醫院婦產科看病。
血液樣本的處理將所述血液樣本收集在含有EDTA的清潔的管中，並在4℃以1600×g離心10分鐘。隨後，將血漿和血清小心地轉移至清潔的聚丙烯管中。所述的血清樣本在-20℃保存用於hPL和hCG-β蛋白的免疫分析。將所述血漿樣本在4℃以16000×g再次離心10分鐘，並將上清收集到新的聚丙烯管中。將所有胎盤組織樣本立即保存在RNA後續穩定溶液(Laterstabilizing solution)(Ambion，Austin，TX)中，並保存在-80℃直到進行RNA提取。對於過濾試驗，將血漿樣本分成三份兩份分別用0.45μm或5μm孔徑的濾膜(Millex-GV；Millipore China Limited，香港)進行過濾。第三份不進行過濾。
RNA提取對於血漿樣本，根據上述引用的Ng等的方案，將1.6mL血漿與2mLTrizol LS試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)及0.4mL氯仿混和。對於胎盤組織，根據廠商的說明書在Trizol試劑(Invitrogen)中將樣本勻漿，隨後加入氯仿。將所得混合物在4℃以11,900×g離心15分鐘，並將水層轉移至新的管中。向所述的水層加入等體積的70％乙醇。隨後，根據廠商的說明書將所述混合物加到RNeasy小型柱(RNeasy Mini試劑盒，Qiagen，Hilden，德國)中，並進行處理。用30μL無RNase酶的水來洗脫總RNA，並在-80℃下儲存。進行DNase(RNase-Free DNase Set，Qiagen，Hilden，德國)處理來去除任何汙染性的DNA。
實時定量RT-PCR根據上述引用的Ng等的文獻所述，採用一步實時定量RT-PCR對所有mRNA進行定量。用於所有hPL、hCG-β和GAPDH的RT-PCR分析的引物均是內含子跨越的。所述hPL引物的序列為5』-CATGACTCCCAGACCTCCTTC-3』(正義)和5』-TGCGGAGCAGCTCTAGATTG-3』(反義)，而雙標記的螢光探針為5』-(FAM)TTCTGTTGCGTTTCCTCCATGTTGG(TAMRA)-3』。所述hCG-β引物的序列為5』-CTACTGCCCCACCATGACCC-3』(正義)和5』-TGGACTCGAAGCGCACATC-3』(反義)，而雙標記螢光探針為5』-(FAM)CCTGCCTCAGGTGGTGTGCAACTAC(TAMRA)-3』。通過以1×107拷貝至1×101拷貝的濃度範圍對高效液相色譜純化的單鏈合成DNA寡核苷酸(Genset Oligos，新加坡)進行系列稀釋來製備用於HPL和HCG-β定量的校準曲線，這些寡核苷酸分別對所述hPL和hCG-β擴增子特異。這些分析能夠測定100個拷貝的代表性校準靶標。hPL和hCG-βmRNA的絕對濃度表示為拷貝/mL血漿的形式。以往的數據表明這種單鏈寡核苷酸可靠地模擬了所述反轉錄步驟的產物，並產生與利用T7-轉錄的RNA(見上述引用的Bustin)獲得的校準曲線相同的校準曲線。用於hPL和hCG-β校準的合成DNA寡核苷酸序列分別為5』-TGCGGAGCAGCTCTAGATTGGATTTCTGTTGCGTTTCCTCCATGTTGGAGGGTGTCGGAATAGAGTCTGAGAAGCAGAAGGAGGTCTGGGAGTCATGC-3』和5』-GATGGACTCGAAGCGCACATCGCGGTAGTTGCACACCACCTGAGGCAGGGCCGGCAGGACCCCCTGCAGCACGCGGGTCATGGTGGGGCAGTAGCC-3』。根據上述引用的Ng等所述的方法製備用於GAPDH定量的校準曲線，並表示為pg/mL血漿的形式。
根據廠商的說明書以50μL的反應體積進行RT-PCR反應(EZ rTthRNA PCR試劑套裝，Applied Biosystems，Foster City，CA)。所用螢光探針(Genset Oligos)的濃度為100nM。對於hPL體系，所用PCR引物(GensetOligos)的濃度為300nM，而對於hCG-β體系和GAPDH體系，所用PCR引物的濃度均為200nM。使用5μL提取的血漿RNA和0.1ng提取的總胎盤RNA進行擴增。每個樣本分析兩次，並且在每次分析中平行運行對應的校準曲線。用AmpliTaq Gold酶(Applied Biosystems，Foster City，CA)替代所述rTth多聚酶來檢測樣本，從而保證它們是DNA陰性的。在此對照分析中沒有觀察到擴增，表明所述分析對對應的mRNA具有特異性。在每一分析中也包括多個陰性空白水溶液。
用於所述hPL、hCG-β和GAPDH分析的溫度方案如下為了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶發揮作用，將反應在50℃引發2分鐘，隨後在60℃進行反轉錄30分鐘。在95℃變性5分鐘後，進行40個循環的以下PCR94℃變性20秒、分別對hPL、hCG-β和GAPDH體系在56℃、58℃和60℃退火/延伸1分鐘。
重複RNA提取和RT-PCR分析，顯示hPL和hCG-βmRNA的分析系統的Ct值的變異係數分別為2.3％和3.2％。
蛋白分析分別利用放射免疫分析(Diagnostic Products Corp.，Los Angeles，CA)和電化學發光免疫分析(Roche modular E170)對母體血清中的hPL和hCG蛋白濃度進行測定。
B.結果母體血液中的胎盤mRNA的可檢測性和穩定性我們獲取了10例妊娠婦女(妊娠齡為7-14周)的外周血樣本。在樣本到達實驗室之後(靜脈取血後1小時之內)，立即對每個受試者的一半血液樣本進行血漿收集和RNA提取。為檢驗hPL和hCG-βmRNA的轉錄本在母體血漿中能否檢測到，我們用對應的實時RT-PCR分析對提取的RNA進行了分析。我們在所有10例血漿樣本中均觀察到了hPL和hCG-βmRNA信號。這些結果表明在妊娠婦女血漿中確實能夠檢測到胎盤mRNA。作為陽性對照，在所有這些血漿樣本中也檢測到了GAPDHmRNA。
為研究母體血液中胎盤mRNA的穩定性，我們將這些母體血液樣本各自餘下的部分在室溫下放置24小時。隨後提取這些樣本中的RNA，並對hPL、hCG-β和GAPDH轉錄本的水平進行檢測。沒有觀察到hPL和hCG-βmRNA轉錄本水平的顯著差異，而在室溫下放置24小時的樣本中的GAPDH mRNA顯著高於立即處理的樣本中的水平(Wilcoxon檢驗，對於所述hPL分析P＝0.770；對於所述hCG-β分析P＝0.275；對於所述GAPDH分析P＜0.05)。這些結果顯示血漿中hPL和hCG-βmRNA在室溫下可保持穩定達24小時。
妊娠齡引起的循環胎盤mRNA變化從39例不同妊娠階段的妊娠婦女獲取血漿樣本。在所有三個三月妊娠期的血漿中100％(39例中有39例)檢測到hPL mRNA。對於hCG-βmRNA，妊娠頭三月(妊娠齡7-14周)樣本的檢出率為100％(14/14)，妊娠中三月(妊娠齡15-23周)樣本的檢出率為42％(5/12)，妊娠末三月(妊娠齡35-41周)樣本的檢出率為7.7％(1/13)。在所述妊娠頭三月的血漿樣本中，hPL和hCG-βmRNA水平的中位值分別為2671(四分位數間距為375-6217)和1205拷貝/ml(四分位數間距為566-1927)(圖3A和圖3B)。妊娠中三月的血漿hPL和hCG-βmRNA水平的中位值分別為4784(四分位數間距為2679-10139)和0拷貝/ml(四分位數間距為0-125)。在妊娠末三月的血漿樣本中，血漿hPL和hCG-βmRNA水平的中位值分別為13869(四分位數間距為7829-27434)和0拷貝/ml(四分位數間距為0-0)。綜上，循環hPL和hCG-βmRNA水平分別顯示與妊娠齡有關的增加和降低的趨勢。同時也測定了對應的hPL和hCG-β蛋白的水平(圖3A和圖3B)。所有循環hPL和hCG-βmRNA的妊娠期變化與對應蛋白所呈現出的趨勢類似(Pearson相關性分析，對於hPLr＝0.622；P＜0.001，對於hCG-βr＝0.784；P＜0.001，如圖3C和圖3D所示)。
分娩後母體血漿中胎盤mRNA的快速清除我們隨後研究了分娩是否會導致母體血漿中胎盤mRNA的快速清除。由於在妊娠末三月(受試者的妊娠齡38-42周)的母體血漿中hPLmRNA含量相對豐富，因此選擇hPL mRNA作為研究的靶標。在8例分娩前的血漿樣本中，hPL mRNA轉錄本水平的中位值為50004拷貝/ml。在分娩後24小時，在任何產後樣本中不能檢測到hPL mRNA(圖4A)。作為對照，在所有分娩前和分娩後的血漿樣本中均能夠檢測到GAPDHmRNA(圖4B)。沒有觀察到母體血漿中GAPDH mRNA水平的系統改變(Wilcoxon檢驗，P＝0.313)。隨後我們研究了能否在產後較短時間點(2小時)觀察到循環hPL mRNA的清除。徵募了13例受試者用於此第二項研究，分娩前hPL mRNA水平的中位值為24499拷貝/ml(圖4C)。在產後2小時，13例婦女中有9例沒有檢測到血漿胎盤RNA。餘下的受試者在分娩後2小時有大約66-97％的母體血漿胎兒RNA被清除。我們在所有血漿樣本中均檢測到GAPDH mRNA，從而證明了所述樣本的質量(圖4D)。沒有觀察到母體血漿GAPDH mRNA水平的系統性變化(Wilcoxon檢驗，P＝1.000)。
實施例3先兆子癇婦女中母體血漿GAPDH mRNA的升高在知情同意的條件下徵募了在香港Prince of Wales醫院婦產科看病的妊娠婦女。利用實施例1所述的標準來診斷先兆子癇。
A.方法將母體血液樣本放入肝素化的管中，並如實施例1所述來處理。提取血漿RNA，並如實施例1所述定量測定GAPDH mRNA的水平。
B.結果與對照組比較，觀察到先兆子癇組的母體血漿中的GAPDH mRNA濃度升高(圖5)。對照組和先兆子癇受試者的母體血漿GAPDH mRNA水平的中位值分別為70pg/ml和281pg/ml。該差異具有統計學顯著性(Mann-Whitney檢驗，p＜0.005)。
C.結論母體血漿GAPDH mRNA是一種新的非侵襲性的先兆子癇標誌物。
實施例4非整倍性妊娠婦女的母體血清中的hCG mRNA濃度A方法通過實時定量RT-PCR對來自2003年1月至8月間研究的141例妊娠婦女的頭三月妊娠血清樣本中的βhCG mRNA濃度進行了檢測。對所有被研究的受試者進行了用於胎兒染色體組型分析的絨毛膜取樣(CVS)。在即將CVS之前收集所有母體的血液樣本。將血液樣本放入清潔的管中，並在4℃下以1600xg離心10分鐘。隨後將血清轉移至清潔的聚丙烯管中。立即將3.2mL血清放入4mL Trizol中並在-80℃保存直到進行RNA提取。如上所述，通過改良的RNeasy RNA Mini試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)從1.6mL血清中提取血清RNA(Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1004748-4753，2003)。用30μL無RNase酶的水來洗脫總RNA，並在-80℃下保存。進行DNase酶(RNase-Free DNase Set，Qiagen，Hilden，德國)處理來去除任何汙染性的DNA。
根據Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1004748-4753，2003所述，利用一步實時定量RT-PCR對βhCG mRNA進行定量分析。以25μL的反應體積進行所述的RT-PCR反應。所用的引物和螢光探針的濃度分別為300nM和100nM。用6μL提取的血清RNA進行擴增。用於所述分析的溫度方案如下為了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶發揮作用，將反應在50℃引發2分鐘，隨後在60℃進行反轉錄30分鐘。在95℃變性5分鐘後，進行40個循環的以下PCR94℃變性20秒，並在57℃退火/延伸1分鐘。Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1004748-4753，2003已經確立了所述分析的靈敏度、線性度和精確度。在所述反應混合物中僅可檢測到少至100拷貝的所述合成寡核苷酸。血清hCGβRNA濃度以拷貝/mL血清表示。因沒有進行恢復試驗，所報告的濃度(拷貝/mL)為最低的估計值。
在所徵募的149例妊娠婦女中，15例婦女懷有21號染色體三體性胎兒，11例懷有18號染色體三體性胎兒。餘下的123例懷有整倍體胎兒，並用作對照。對照組的妊娠齡的中位值為12.5周(範圍11.2-14.3周)。懷有21號染色體三體性和18號染色體三體性胎兒的妊娠齡的中位值分別為12.5周(範圍12.1-14.2周)和12.3周(範圍11.4-14.1周)。在三組中沒有發現妊娠齡的顯著差異(Kruskal-Wallis，P＝0.706)。
B.結果對149例母體血清樣本的hCGβmRNA進行了定量分析。在149例妊娠婦女中有140例(94％)的母體血清中能檢測到hCGβmRNA。在對照組中，hCGβmRNA的檢出率為96.7％(123例中有119例)。在21號染色體三體性和18號染色體三體性組中，檢出率分別為93.3％(15例中有14例)和63.6％(11例中有7例)。此三組的血清hCGβmRNA濃度的中位值分別為對照組6108拷貝/mL(四分位數間距為2867到19249拷貝/mL)，21號染色體三體性組為13165拷貝/mL(四分位數間距為4403到25265拷貝/mL)，而18號染色體三體性組為652拷貝/mL(四分位數間距為0到11662拷貝/mL)(圖6)。此三組中hCGβmRNA濃度的中位值差異是統計學顯著的(Kruskal-Wallis，P＝0.024)。進行配對多重比較，顯示18號染色體三體性組和對照組間存在顯著差異(Dunn′s檢驗，P＜0.05)，且18號染色體三體性組和21號染色體三體性組間存在顯著差異(Dunn′s test，P＜0.05)。由於樣本數量有限，在21號染色體三體性組和對照組的血清hCGβmRNA濃度之間沒有觀察到統計學顯著的差異(Dunn′s檢驗，P＞0.05)。但是，如果擴大樣本規模，將會產生統計學顯著的差異。
C.結論此研究證明，在頭三月妊娠婦女的血清中可容易和明顯地檢測到循環hCGβRNA，並具有94％的檢測率。這些數據證明，18號染色體三體性妊娠婦女中血清hCGβmRNA濃度的中位值約為對照妊娠婦女的濃度中位值的10％，並觀察到統計學顯著的差異。另一方面，儘管21號染色體三體性妊娠婦女的血清hCGβmRNA濃度的中位值為對照妊娠婦女的濃度中位值的2.2倍高，但由於樣本數量有限沒有觀察到統計學顯著的差異。這種統計學顯著的差異有望在較大規模的研究中出現。這些數據首次證明在18號染色體三體性妊娠婦女的頭三月妊娠期血清中的循環hCGβmRNA濃度顯著降低，而在21號染色體三體性妊娠婦女中所述循環hCGβmRNA濃度升高。
這些數據表明，循環hCGβRNA作為標誌物用於預測例如18號染色體三體性和21號染色體三體性的非整倍性妊娠的診斷作用。此研究觀察到在18號染色體三體性組與對照組的hCGβmRNA濃度之間有重疊。這暗示如果將母體血清hCGβmRNA檢測作為唯一的18號染色體三體性妊娠預測方法可能會導致相對較低的靈敏度和特異性。可將諸如hPL、hCRH、KiSS-1、TPFI2和PLAC1的其它標誌物與hCGβ聯合使用，從而增加診斷的靈敏度和特異性。
實施例5母體血漿中的胎盤mRNA的鑑定A.方法本研究分兩個階段進行。首先，利用寡核苷酸晶片(Oligonucleotidemicroarrays)對頭三月和末三月妊娠婦女的胎盤組織基因表達譜進行系統鑑定。其後，以實時定量反轉錄聚合酶鏈式反應(QRT-PCR)為基礎，發展了多種分析方法用來檢測母體血漿中6條已鑑定的胎盤表達的基因。對所研究的RNA轉錄本，評價了其在母體血漿中的可檢測性，以及其在血漿和胎盤組織中的水平的相關性。此研究採用的所有胎盤和血液樣本均是在知情同意的前提下從單胎簡單妊娠的健康婦女中收集的，這些妊娠婦女在香港Prince of Wales醫院婦產科看病。
胎盤基因表達譜的鑑定利用在流產前或選擇性剖腹產分娩後即刻進行的絨毛膜取樣(CVS)獲得頭三月(妊娠齡範圍9-12周)和末三月(妊娠齡範圍38-40周)妊娠期胎盤組織樣本各5例。收集後立即將所述胎盤組織樣本放入於RNAlaterTM(Ambion，Austin，TX)中並在-80℃保存，直到進行RNA提取。收集組織的同時收集6mL外周血，並放入PAXgeneTMBlood RNA管中(PreAnalytiX，Hombrechtikon，瑞士)。
根據製造商的說明書利用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)從胎盤組織提取總RNA，並用RNeasy mini-試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)進行純化。根據製造商的說明書利用PAXgeneTMBlood RNA試劑盒(PreAnalytiX，Hombrechtikon，瑞士)從外周血中提取總RNA，此過程包括DNase處理步驟(RNase-Free DNase Set，Qiagen，Hilden，德國)。
對於每種樣本，根據製造商的說明書，標記10微克提取的RNA並將其與GeneChipHuman Genome U133A晶片(Affymetrix，Santa Clara，CA)進行雜交。雜交後，在GeneChipFluidics Station 400(Affymetrix，Santa Clara，CA)中對每塊晶片進行洗滌和染色。將所述晶片用GeneArrayScanner(Affymetrix，Santa Clara，CA)進行掃描，並用GeneChipMicroarray Suite 5.0(Affymetrix)進行分析。
通過實時QRT-PCR對母體血漿中的胎盤表達的RNA轉錄本進行定量評價從10例頭三月和10例末三月妊娠婦女收集配對的胎盤和母體全血樣本。同時也徵募了10例妊娠婦女在分娩前後的外周血樣本。如上所述處理胎盤組織。將12mL血液樣本收集到EDTA管中，並在4℃以1600×g離心10分鐘。隨後將血漿小心地轉移至清潔的聚丙烯管中。將所述血漿樣本在4℃以16000×g再次離心10分鐘，並將上清收集到新的聚丙烯管中。如Ng.et al.，Clin.Chem.，481212-1217，2002中所述從母體血漿中提取RNA。進行DNase處理(RNase-Free DNase Set，Qiagen，Hilden，德國)來去除汙染的DNA。
本研究集中於對從胎盤晶片基因表達譜中鑑定出的6條胎盤表達的mRNA轉錄本的評價，所述mRNA包括人胎盤催乳素(hPL)、人絨毛膜促性腺激素β亞基(βhCG)、促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)和胎盤特異1(PLAC1)。作為對照，進行了兩種非胎盤特異轉錄本——甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和β-血紅蛋白(β-球蛋白)mRNA的定量分析。
用於檢測GAPDH、hPL、hCGβ和CRH mRNA的QRT-PCR分析如上所述(Ng.et al.，Clin.Chem.，481212-1217，2002；Ng et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA，1004748-4753，2003；和Ng et al.，Clin.Chem.，49727-731，2003)。TFPI2分析的引物序列為5』-ACAAATTTCTACACCTGGGAGGC-3』(正義)和5』-CGGCAAACTTTGGGAACTTTT-3』(反義)，且雙標記螢光探針為5』-( FAM)TGCGACGATGCTTGCTGGAGGA(TAMRA)-3』。FAM與TAMRA分別代表6-羧基螢光素和6-羧基四甲基若丹明(rhodamine)。用於KISS1定量分析的引物序列為5』-GCCCAGGCCAGGACTGA-3』(正義)和5』-GCCAAGAAACCAGTGAGTTCATC-3』(反義)，且雙標記螢光探針為5』-(FAM)CCTCAAGGCACTTCTAGGACCTGGCTCTTC(TAMRA)-3』。PLAC1分析的引物序列為5』-ATTATCCCCAGCTGCCAGAA-3』(正義)和5』-GCAGCCAATCAGATAATGAACCA-3』(反義)，且雙標記螢光探針為5』-(FAM)AAGAAATCCTCACTGGACGGCTTCCTG(TAMRA)-3』。β-球蛋白分析的引物序列為5』-GCTGCACTGTGACAAGCTGC-3』(正義)和5』-GCACACAGACCAGCACGTTG-3』(反義)，且所述螢光探針為5』-(FAM)CGTGGATCCTGAGAACTTCAGGCTC(TAMRA)-3』。
以1×106拷貝至10拷貝的濃度對Bustin et al.，J.Mol.Endocrinol.，25169-193，2000(Genset Oligos，新加坡)所述的高效液相色譜純化的單鏈合成DNA寡核苷酸進行系列稀釋來製作用於hPL、βhCG、CRH、TPFI2、KISS1、PLAC1和β-球蛋白mRNA定量分析的校準曲線，所述寡核苷酸對各自的擴增子特異。用於hPL、βhCG和CRH校準品的合成DNA寡核苷酸序列如上所述(參見Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1004748-4753，2003和Ng et al.，Clin.Chem.，49727-731，2003)。用於TPFI2、KISS1、PLAC1和β-球蛋白校準品的合成DNA寡核苷酸序列分別為5』-CGCCAACAATTTCTACACCTGGGAGGCTTGCGACGATGCTTGCTGGAGGATAGAAAAAGTTCCCAAAGTTTGCCGGCTG-3』、5』-CTGCCCAGGCCAGGACTGAGGCAAGCCTCAAGGCACTTCTAGGACCTGGCTCTTCTCACCAAGATGAACTCACTGGTTTCTTGGCAG-3』、5』-ACAAATTATCCCCAGCTGCCAGAAGAAGAAATCCTCACTGGACGGCTTCCTGTTTCCTGTGGTTCATTATCTGATTGGCTGCAGG-3』和5』-TGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTGTGTGCTGG-3』。除GAPDH mRNA以外，對胎盤組織和母體血漿中所有轉錄本的絕對濃度分別以拷貝/ng總胎盤RNA和拷貝/mL血漿的形式表示。通過系列稀釋人總RNA來製作用於GAPDH定量分析的校準曲線(Ng.et al.，Clin.Chem.，481212-1217，2002)。
根據製造商的說明書(EZ rTth RNA PCR試劑套裝，AppliedBiosystems，Foster City，CA，美國)，以50μL的反應體積進行QRT-PCR反應。應用聯合的溫度循環儀和螢光檢測儀(ABI Prism 7700，AppliedBiosystems，Foster City，CA，美國)來進行QRT-PCR分析。GAPDH、hPL、βhCG和CRH的QRT-PCR分析的反應條件如上所述(Ng.et al.，Clin.Chem.，481212-1217，2002；Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1004748-4753，2003；及Ng et al.，Clin.Chem.，49727-731，2003)。對於其它的三種轉錄本，TPFI2和β-球蛋白所用的PCR引物(Geneset Oligos，新加坡)的濃度為200nM，KISS1的引物濃度為300nM，而PLAC1的引物濃度為400nM。TFPI2所用的螢光探針(Applied Biosystems，Foster City，CA，美國)的濃度為80nM，KISS1的螢光探針濃度為150nM，PLAC1的螢光探針濃度為200nM，而β-球蛋白的螢光探針濃度為300nM。在進行QRT-PCR之前，根據製造商的說明書利用DNase I消化(Invitrogen，Carlsbad，CA)去除提取的胎盤組織RNA中的汙染性的DNA。用0.4ng提取的胎盤RNA和6μL提取的血漿RNA進行擴增。在每個分析中包括多個陰性水空白。
用於TPFI2、KISS1、PLAC1和β-球蛋白mRNA分析的溫度方案如下為了使所包含的尿嘧啶N-糖基化酶發揮作用，將反應在50℃引發2分鐘，隨後在60℃進行反轉錄30分鐘。在95℃變性5分鐘後，進行40個循環的以下PCR92℃變性15秒，對PLAC1在56℃、對TPFI2和KISS1在57℃以及對β-球蛋白在58℃退火/延伸1分鐘。
利用Sigma Stat 2.03軟體(SPSS)進行統計學分析。
B.結果通過對胎盤組織和配對的母體血液樣本的高密度寡核苷酸晶片分析來鑑定胎盤特異的基因通過對每個受試者的組織樣本進行晶片分析得到5例頭三月CVS和5例末期胎盤的基因表達譜。在所述的CVS樣本和末期胎盤中發現分別有總計7226和8871基因轉錄本表達。以往有報導，正常個體血漿中的循環DNA以造血細胞來源為主(Lui et al.，Clin.Chem.，48421-427，2002)。因此，假定母體血漿中的大部分背景母體核酸也源自造血室。由於本研究的最終目的是鑑定母體血漿的循環RNA分子中的胎兒特異的胎盤表達轉錄本，因此本發明者進一步獲取了配對母體全血的基因表達譜，並使用GeneChipMicroarray Suite 5.0軟體(Affymetrix)將這些表達譜與對應的胎盤組織的表達譜進行比較。在所有5例對比中，選擇與對應的全血樣本相比所述CVS組織中表達水平「增加的」轉錄本，鑑定了早期妊娠中胎兒特異的胎盤表達轉錄本。類似地，與配對的母體全血樣本進行比較，從末期胎盤中鑑定出了晚期妊娠的胎兒特異轉錄本。這些步驟之後，排除在胎盤組織和母體血細胞中表達均較高的轉錄本，從而對所述頭三月和末三月妊娠得到分別為1245和1743個鑑定轉錄本的組。隨後根據所述5例CVS或5例末期胎盤組織的晶片表達信號的中位值(參見附表A和B中分別對早期和晚期妊娠所列的50條較高表達的轉錄本)對這兩組轉錄本以降序歸類。所產生的這兩組含有作為胎兒特異標誌物在母體血漿中具有潛在可檢測性的候選轉錄本。圖1總結了鑑定這種胎兒特異標誌物的策略。前述可在母體血漿中檢測到的三種mRNA轉錄本hPL、βhCG和CRH出現在列表中，為這種方法提供了獨立的證明。然而，因以往的研究沒有包括在所述胎盤和母體血漿中所述基因表達水平的信息，因此在進一步的分析中同時包括了這三種轉錄本和在所述列表中鑑定的三種新標誌物TFPI2、KISS1和PLAC1。為比較胎盤組織和母體血漿間的相關基因表達譜，選擇了所述列表中不同位置的轉錄本。表1總結了這6種轉錄本的晶片表達信號強度的中位值。首先將所有陣列的總強度的均縮放至目標強度值500，每種轉錄本的信號強度則按比例進行縮放，，並確定了5例CVS和5例末期胎盤組織中按比例縮放的轉錄本強度的中位值。
用於檢測母體血漿中胎盤表達的轉錄本的實時QRT-PCR分析的開發使用6個一步實時QRT-PCR分析。通過QRT-PCR對10例頭三月和10例末三月妊娠婦女的配對胎盤組織和血漿樣本中的6種所選胎盤mRNA轉錄本進行定量分析。在所有病例的胎盤組織中均能檢測到所述的6種轉錄本。這些轉錄本在頭三月和末三月妊娠期的母體血漿中的可檢測性和濃度的中位值總結在表1中。這些結果表明，所選的通過晶片分析鑑定的胎盤表達基因轉錄本中的大部分的確能在母體血漿中檢測到。一般說來，具有較高晶片信號強度中位值的轉錄本在母體血漿中更容易被檢測到。相反，對這6種被研究的胎盤表達基因中豐度最低的轉錄本觀察到零拷貝的母體血漿濃度中位值，即PLAC1在頭三月妊娠期及hCGβ與PLAC1在末三月妊娠期。因此，這些數據表明，如果在母體血漿中能夠明顯檢測到胎盤表達的轉錄本，則表明所述表達水平超過了晶片信號的閾值。
分娩後母體血漿中胎盤表達的轉錄本的清除如果所研究的轉錄本是妊娠特異的，則預計其應當在分娩後從母體血漿中清除。如以往研究(Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1004748-4753，2003；和Ng et al.，Clin.Chem.，49727-731，2003)所述，分娩後hPL和CRH mRNA分子從母體血漿中快速清除。為探討TFPI2、KISS1和PLAC1 mRNA從母體血漿中的清除，在分娩前和分娩後24小時從10例妊娠婦女獲取血漿樣本。在所述分娩前的血漿樣本中，TFPI2和KISS1 mRNA濃度的中位值分別為112拷貝/mL和88拷貝/mL。兩種轉錄本在任何分娩後的血漿樣本中均未檢測到(圖8A和圖8B所示分別為TFPI2和KISS1 mRNA)。對於PLAC1 mRNA，在10例分娩前的血漿樣本中檢測到4例，而在任何產後樣本中均沒有檢測到信號(圖8C)。作為對照，在所有分娩前和分娩後的血漿樣本中均能檢測到GAPDH mRNA，而且其濃度沒有系統改變(Wilcoxon檢驗，P＝0.563)。
在母體血漿中用mRNA分析對非侵襲性胎盤基因表達譜進行確認通過檢測母體血漿中的胎盤轉錄本水平可間接檢測胎盤中的基因表達水平，從而尋找直接的證據。通過QRT-PCR對來自10例頭三月和10例末三月妊娠婦女的配對胎盤和血漿樣本進行hPL、hCGβ、CRH、TFPI2、KISS1和PLAC1 mRNA分析。如果這些轉錄本在母體血漿中的水平確實反映了其在胎盤中的對應水平，那麼就應該能在這些轉錄本在胎盤和母體血漿中的相對濃度之間觀察到陽性相關性。一種表達這些轉錄本的相對水平的可行方式是將其水平相對普通的胎盤特異轉錄本進行標準化。因hPL mRNA在妊娠全程中均能檢測到(Ng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1004748-4753，2003)，因此選擇hPL mRNA作為參考。通過將每一胎盤或血漿樣本中的轉錄本水平除以同一樣本中對應的hPL mRNA的水平，來計算每種轉錄本的標準化水平。只對能在母體血漿中檢測到的轉錄本進行比較。因在所有現有的頭三月和末三月妊娠期母體血漿系列樣本中分別沒有檢測到PLAC1和hCGβ，因此沒有將其包括在對應的分析中。圖9A和圖9B顯示了胎盤和配對母體血漿中hCGβ、CRH、TFPI2、KISS1和PLAC1 mRNA的標準化轉錄本水平的圖象。在頭三月妊娠期(Spearman相關性分析，r＝0.452，P＜0.05)和末三月妊娠期(Spearman相關性分析，r＝0.661，P＜0.05)的胎盤和母體血漿結果中均觀察到陽性相關性。作為對照，也分析了兩種非胎盤特異的mRNA轉錄本對末三月樣本分析了β-球蛋白，對頭三月和末三月樣本均分析了GAPDH。如圖9A和9B所示，這些非胎盤特異轉錄本明顯不依從所述胎盤特異轉錄本所表現出的相關性趨勢。這些數據表明，從母體血漿檢測到的所述胎盤特異mRNA的水平可用於評價胎盤的基因表達。
C.結論開發了用於系統鑑定母體血漿中大規模的胎兒特異RNA標誌物的策略(圖7)。這一策略是在胎盤是母體血漿中循環胎兒RNA的重要來源，以及正常個體中血漿DNA的主要造血來源的發現的基礎上設計的。用高密度寡核苷酸晶片來系統地鑑定大規模的胎盤表達轉錄本，以及選擇用於母體血漿檢測的潛在的胎兒特異的轉錄本，其中放棄將血細胞表達的基因作為潛在的靶標(附表A和B)。以往鑑定的編碼hPL、hCGβ和CRH的三種血漿胎盤特異mRNA標誌物出現在所述的靶標列表中，並為所述轉錄本的選擇策略提供了獨立的證明。此外，通過QRT-PCR在母體血漿中也檢測到所述列表中給出的三種鑑定的mRNA標誌物TFPI2、KISS1和PLAC1，並證明其胎盤組織表達水平高於某一閾值，而其在以往沒有被發現可用於非侵襲性產前監測。分娩後其從母體血漿中快速清除證實了所述胎盤特異性。這些發現進一步驗證了用於鑑定母體血漿中胎兒特異轉錄本的策略。
與所述的胎盤特異mRNA種類相對，沒有觀察到非胎盤特異轉錄本GAPDH和β-球蛋白的血漿和胎盤標準化mRNA水平間的相關性。與所述胎盤特異轉錄本相比，母體血漿中存在相對較多的GAPDH和β-球蛋白mRNA，其可以解釋為由母體組織例如造血細胞來產生這種非胎盤特異轉錄本。
綜上，本發明證明母體血漿中的循環胎盤mRNA可用於妊娠的檢測以及非侵襲性產前基因表達譜的檢測。本發明還對快速、系統地鑑定用於此目的的新胎盤mRNA標誌物的以晶片為基礎的方法進行了概述。這種開發對於產生新的用於研究和監測已知與胎盤病理學有關的諸如21號染色體三體性和先兆子癇的疾病狀態的標誌物具有特殊的意義。此外，本發明的發現對非妊娠相關的疾病也有意義。例如在癌症患者的血漿/血清中已經發現了腫瘤相關的mRNA(參見，例如Lo et al.，Clin.Chem.，451292-1294，1999；和Silva et al.，Gut.，50530-534，2002)，可利用相似的方法來快速產生新的血漿RNA為基礎的腫瘤標誌物。
本申請將所引用的全部專利、專利申請以及出版物全文引入作為參考。
表1A CVS樣本的晶片結果和頭三月妊娠期的母體血漿中六種所選胎盤轉錄本的QRT-PCR結果的總結
表1B末期胎盤組織的晶片結果和末三月妊娠期母體血漿中六種所選胎盤轉錄本的QRT-PCR結果的總結
附表A.在CVS組織中50種較高表達的基因的晶片檢測結果
附表B在末期胎盤組織中50個較高表達基因的基因晶片檢測結果
權利要求
1.診斷、監測或預測妊娠婦女的先兆子癇的方法，包括如下步驟(i)定量測定所述妊娠婦女血液中一種或多種mRNA種類的含量，其中所述mRNA種類獨立地選自編碼如下蛋白的mRNA，所述蛋白為人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)；及(ii)將步驟(i)獲得的mRNA含量與代表正常非先兆子癇的妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照進行比較，其中所述mRNA含量比標準對照增加或降低表明存在先兆子癇或發展為先兆子癇的風險增加。
2.如權利要求1所述的方法，其中步驟(i)通過反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)來進行。
3.如權利要求1所述的方法，其中步驟(i)通過多核苷酸雜交方法來進行。
4.如權利要求1所述的方法，其中步驟(i)通過質譜來進行。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述婦女處於頭三月妊娠期。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述婦女處於中三月或末三月妊娠期。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述妊娠婦女的血液在用於步驟(i)之前是無細胞的。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述妊娠婦女的血液指血漿。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述妊娠婦女的血液指血清。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述mRNA含量增加為高於標準對照的2倍。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述mRNA種類為編碼hCRH或GAPDH的mRNA。
12.診斷、監測或預測妊娠婦女的先兆子癇的試劑盒，包括(i)用於定量測定所述妊娠婦女血液中一種或多種mRNA種類含量的PCR引物，其中所述的mRNA種類獨立地選自編碼如下蛋白的mRNA，所述蛋白為人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)；及(ii)代表正常非先兆子癇的妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA的含量的標準對照。
13.用於檢測妊娠婦女中18號染色體三體性胎兒存在的方法，包括如下步驟(i)定量測定所述妊娠婦女血液中一種或多種mRNA種類的含量，其中所述的mRNA種類獨立地選自編碼如下蛋白的mRNA，所述蛋白為人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)；及(ii)將步驟(i)獲得的mRNA含量與代表懷有正常染色體胎兒的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照進行比較，其中所述mRNA含量比所述標準對照增加或降低表明懷有18號染色體三體性胎兒的風險增加。
14.如權利要求13所述的方法，其中步驟(i)通過反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)來進行。
15.如權利要求13所述的方法，其中步驟(i)通過多核苷酸雜交方法來進行。
16.如權利要求13所述的方法，其中步驟(i)通過質譜來進行。
17.如權利要求13所述的方法，其中所述婦女處於頭三月妊娠期。
18.如權利要求13所述的方法，其中所述婦女處於中三月或末三月妊娠期。
19.如權利要求13所述的方法，其中所述妊娠婦女的血液在用於步驟(i)之前是無細胞的。
20.如權利要求13所述的方法，其中所述妊娠婦女的血液指血漿。
21.如權利要求13所述的方法，其中所述妊娠婦女的血液指血清。
22.如權利要求13所述的方法，其中所述mRNA含量的降低超過所述標準對照的50％。
23.如權利要求13所述的方法，其中所述mRNA種類為編碼hCGβ的mRNA。
24.用於檢測妊娠婦女中18號染色體三體性胎兒存在的試劑盒，包括(i)用於定量測定所述妊娠婦女血液中一種或多種mRNA種類含量的PCR引物，其中所述的mRNA種類獨立地選自編碼如下蛋白的mRNA，所述蛋白為人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)；及(ii)代表懷有正常染色體胎兒的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA的含量的標準對照。
25.用於檢測妊娠婦女中21號染色體三體性胎兒存在的方法，包括如下步驟(i)定量測定所述妊娠婦女血液中一種或多種mRNA種類的含量，其中所述的mRNA種類獨立地選自編碼如下蛋白的mRNA，所述蛋白為人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)；及(ii)將步驟(i)獲得的mRNA含量與代表懷有正常染色體胎兒的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照進行比較，其中所述mRNA含量比所述標準對照增加或降低表明懷有21號染色體三體性胎兒的風險增加。
26.如權利要求25所述的方法，其中步驟(i)通過反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)來進行。
27.如權利要求25所述的方法，其中步驟(i)通過多核苷酸雜交方法來進行。
28.如權利要求25所述的方法，其中步驟(i)通過質譜來進行。
29.如權利要求25所述的方法，其中所述婦女處於頭三月妊娠期。
30.如權利要求25所述的方法，其中所述婦女處於中三月或末三月妊娠期。
31.如權利要求25所述的方法，其中所述妊娠婦女的血液在用於步驟(i)之前是無細胞的。
32.如權利要求25所述的方法，其中所述妊娠婦女的血液指血漿。
33.如權利要求25所述的方法，其中所述妊娠婦女的血液指血清。
34.如權利要求25所述的方法，其中所述mRNA含量增加為高於所述標準對照的2倍。
35.如權利要求25所述的方法，其中所述mRNA種類為編碼hCGβ的mRNA。
36.用於檢測妊娠婦女中21號染色體三體性胎兒存在的試劑盒，包括(i)用於定量測定所述妊娠婦女血液中一種或多種mRNA種類含量的PCR引物，其中所述的mRNA種類獨立地選自編碼如下蛋白的mRNA，所述蛋白為人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)；及(ii)代表懷有正常染色體胎兒的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA的含量的標準對照。
37.診斷、監測或預測妊娠婦女早產的方法，包括如下步驟(i)定量測定所述妊娠婦女血液中一種或多種mRNA種類的含量，其中所述的mRNA種類獨立地選自編碼如下蛋白的mRNA，所述蛋白為人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)；及(ii)將步驟(i)獲得的mRNA含量與如期分娩或將會如期分娩的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照進行比較，其中所述mRNA含量比所述標準對照增加或降低表明發展為早產的風險增加。
38.如權利要求37所述的方法，其中步驟(i)通過反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)來進行。
39.如權利要求37所述的方法，其中步驟(i)通過多核苷酸雜交方法來進行。
40.如權利要求37所述的方法，其中步驟(i)通過質譜來進行。
41.如權利要求37所述的方法，其中所述婦女處於頭三月妊娠期。
42.如權利要求37所述的方法，其中所述婦女處於中三月或末三月妊娠期。
43.如權利要求37所述的方法，其中所述妊娠婦女的血液在用於步驟(i)之前是無細胞的。
44.如權利要求37所述的方法，其中所述妊娠婦女的血液指血漿。
45.如權利要求37所述的方法，其中所述妊娠婦女的血液指血清。
46.如權利要求37所述的方法，其中所述mRNA含量增加為高於標準對照的2倍。
47.診斷、監測或預測妊娠婦女早產的試劑盒，包括(i)用於定量測定所述妊娠婦女血液中一種或多種mRNA含量的PCR引物，其中所述的mRNA編碼選自人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、人胎盤催乳素(hPL)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的蛋白；及(ii)代表如期分娩或將會如期分娩的正常妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA的含量的標準對照。
48.用於檢測婦女妊娠的方法，包括如下步驟(i)定量測定所述婦女血液中一種或多種mRNA種類的含量，其中所述的mRNA種類獨立地選自編碼如下蛋白的mRNA，所述蛋白為人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)和胎盤特異1(PLAC1)；及(ii)將步驟(i)獲得的mRNA含量與正常的非妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA含量的標準對照進行比較，其中所述mRNA含量比所述標準對照增加表明妊娠。
49.如權利要求48所述的方法，其中步驟(i)通過反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)來進行。
50.如權利要求48所述的方法，其中步驟(i)通過多核苷酸雜交方法來進行。
51.如權利要求48所述的方法，其中步驟(i)通過質譜來進行。
52.如權利要求48所述的方法，其中所述婦女的血液在用於步驟(i)之前是無細胞的。
53.如權利要求48所述的方法，其中所述婦女的血液指血漿。
54.如權利要求48所述的方法，其中所述婦女的血液指血清。
55.如權利要求48所述的方法，其中所述mRNA含量增加為高於所述標準對照的2倍。
56.用於檢測婦女妊娠的試劑盒，包括(i)用於定量測定所述婦女血液中一種或多種mRNA種類的PCR引物，其中所述的mRNA種類獨立地選自編碼如下蛋白的mRNA，所述蛋白為人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG-β)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、人胎盤催乳素(hPL)、KiSS-1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)和胎盤特異1(PLAC1)；及(ii)代表正常非妊娠婦女血液中編碼相同蛋白的mRNA的含量的標準對照。
全文摘要
本發明提供通過定量分析母體血液中的一種或多種mRNA種類的含量來診斷、監測或預測妊娠婦女的先兆子癇、胎兒染色體非整倍性和早產的疾病狀態以及檢測婦女妊娠的方法和試劑盒，所述的mRNA編碼人絨毛膜促性腺激素β亞基(hCG－β)、人胎盤催乳素(hPL)、人促腎上腺皮質激素釋放激素(hCRH)、KiSS－1轉移抑制因子(KISS1)、組織因子途徑抑制劑2(TPFI2)、胎盤特異1(PLAC1)或甘油醛－3－磷酸脫氫酶(GAPDH)，並將該mRNA種類的含量與標準對照比較。
文檔編號C12Q1/68GK1723289SQ200480001825
公開日2006年1月18日 申請日期2004年1月16日 優先權日2003年1月17日
發明者盧煜明, 吳啟安, 徐寶賢, 趙慧君 申請人:香港中文大學