人二相代謝酶的三個功能性突變體及構建和用途的製作方法

2023-04-24 15:41:06 1

專利名稱：人二相代謝酶的三個功能性突變體及構建和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，更具體的說是涉及用杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統得到人二相代謝酶UGT2B7的三個功能性突變體基因，含有該突變基因的重組粘粒，用該載體轉染昆蟲細胞得到突變體重組酶。
背景技術：
尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶UGTs是位於內質網膜上的糖蛋白，能催化一 系列內源性和外源性親脂糖苷配基底物(如膽紅素，甾體激素，藥物，殺蟲劑等)， 使之葡萄糖醛酸化。根據胺基酸序列的同源性，可以將尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉 移酶UGTs分為兩大家族UGT1A和UGT2B。 UGT2B7屬於UGT2B亞族，其基 因含有6個外顯子，總長16kb，其中第1個外顯子和第2個外顯子編碼底物結合 區域(SBD)。從第3個外顯子到第6個外顯子編碼UDP葡醛酸結合位點。UGT2B7 不僅催化內源物如留體激素類(雄留酮和雌三醇)，膽酸和維生素A，同樣也催 化臨床上廣泛運用的非甾體激素抗炎藥(如萘普生，酮洛芬，布洛芬)，以及丙 戊酸鈉，普萘洛爾和AZT，同時也是唯一催化嗎啡類的二相代謝酶。與其他基因類似，UGT2B7基因也存在單核苷酸多態性(SNP)。特別是 802OT,在外顯子2處發生錯義，結果在268位的胺基酸由組氨酸(H)變為酪 氨酸(Y)，這個位點在SBD區。這個序列的突變在UGT2B7的多態性研究中有重 要意義[1'2'3]。據報導[4]， t/Gr2B73(H268Y，802OT)T/T基因型在中國人群中的分 布頻率為9.2%，比Caucasian (25.3%)分布低得多(; =0.00018)，但是與日本人 群的分布無顯著性差異(; =0.17)。與健康對照組相比，T/T基因型在癌症患者中 的比率更高(25% :9%， p=0.03)。與同樣暴露在苯肼下的健康人相比，膀胱癌患 者的T/T基因型比率更高。Coffman等[5]研究發現UGT2B7*2代謝Normorphine (去甲嗎啡)禾Q Naltriben (S2受體拮抗劑)，而UGT2B7"不代謝。UGT2B7*2 對Buprenorphine(丁丙諾啡)的代謝是UGT2B7*1的10倍。Sawye^等研究發現 UGT2B7*2比UGT2B7*1顯示了更高的嗎啡-6-0-葡醛酸/嗎啡比率。最近，又有報導211G〉T (位於外顯子l區)，編碼的蛋白由丙氨酸(A)突變為 絲氨酸(S)，此突變點位於SBD區域，這個突變體可能會影響底物結合的特異性。Katsuhiko等問報導UGT2B7承71S(71A〉S，211G>T)在日本人群中的分布頻率為 18.40%。研究者也發現了位於外顯子5區的突變點1192G〉A，野生型編碼的蛋白D398 是位於UDP葡醛酸結合的後半位置，這個酸性胺基酸殘基在哺乳動物中是高度保 守的，從酸性胺基酸天冬氨酸(D)突變為中性胺基酸天氨醯氨(N)可能會影響UDP-葡萄糖醛酸化的結合[3]。上述研究表明，UGT2B7基因多態性的存在可能潛在地使藥物相互作用的情況 更加複雜化，因為包含有等位基因突變的病人可能表現為葡萄糖醛酸化活性的增 強或減弱，對於不同個體用藥時會表現出不同的藥效/藥動(PK/PD)行為f^。因此，利用杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統體外構建和表達功能性突變體重組酶，並以此為 工具有助於研究UGT2B7等位基因多態性所產生的藥物代謝情況的差異，有助於預測個體化用藥可能產生的副作用，並對實行個體化合理用藥有特別重要的指導意 義，除此之外，也能在分子水平上更好地研究酶與底物藥物的構效關係。 發明內容本發明的目的是提供利用PCR定點突變技術和杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統 獲得的人二相代謝酶(UGT2B7)的三個功能性突變體重組酶UGT2B7*71S (A71S,211G>T)， UGT2B7*2(H268Y， 802 OT)和UGT2B7*5(D398N，1192G>A)。 SEQIDNO:l為UGT2B7*71S (A71S，211G>T)的核苷酸序列和胺基酸序列；SEQ ID NO:2為UGT2B7*2(H268Y, 802 OT)的核苷酸序列和胺基酸序列；SEQ ID NO:3為UGT2B7f5(D398N，1192G〉A)的核苷酸序列和胺基酸序列。本發明的另一個目的是提供人二相代謝酶(UGT2B7)的三個功能性突變體 重組酶基因的構建方法，是利用PCR定點突變技術獲得，即在PCR所用引物中 導入突變位點，以帶冇人UGT2B7的野生型基因的質粒為模板，經PCR反應、磷 酸化、自身連接和轉化，分別合成帶有UGT2B7的三個功能性突變體重組酶基因 的質粒。具體步驟為1.野生型基因的獲得按照GENEBANK中的人UGT2B7基因合成引物，上下遊引物分別引入 和^oI位點和保護鹼基。以人肝組織為模板，通過TRIZOL試劑提取總RNA， 通過RT-PCR,並在終止密碼子前添加6-His標籤，得到PCR產物後，與pGEM 載體相連接獲得pGEM-UGT2B7重組質粒，並用pGEM通用引物對重組質粒進行 測序，經過DNASTAR軟體與genebank中NM 001074序列進行比對，證明已獲得序列完全正確的UGT2B7的基因克隆。SEQ IDNO:4為UGT2B7的核苷酸序列 和胺基酸序列。2. 野生型質粒模板的提取將已測序驗證正確的pGEM-UGT2B7重組質粒 轉化入大腸桿菌感受態細胞中得重組菌落，將重組菌落在瓊脂培養板上進行劃板， 然後挑取瓊脂培養板上的單菌落，接種至2 ml 5 ml LB培養液中(含100pg/ml 氨苄青黴素)，37 °C強烈振搖過夜。取1.5 ml培養物倒入1.5 ml離心管中，12 OOOg 離心15s，棄上清回收菌體；加入100pl溶液I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細胞；加 入100pl溶液II，立即輕輕上下顛倒5次~6次，使細菌裂解，室溫放置lmin; 加入430 pl溶液III，立即上下顛倒5次 10次，使之充分中和，室溫放置2min;12 000 rpm高速離心2 min 5 min，吸取上清至套放於2 ml收集管的UNIQ-10柱中， 8 000 rpm室溫離心1 min，丟棄收集管中廢液；將UNIQ-10柱放回2 ml收集管中， 吸取500 pl洗滌溶液到UNIQ-10柱，10 000rpm室溫離心30s，重複一次；棄收 集管中的廢液，將UNIQ-10柱放回2 ml收集管中，10 000rpm室溫離心15 s;棄 收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入一乾淨的1.5 ml離心管中，加50pl溶解液 至膜中央，室溫放置2 min; 10 000 rpm室溫離心1 min。3. 引物的合成針對人藥物二相代謝酶UGT2B7的基因合成了3對引物，每 對引物含有突變位點，合成後溶於滅菌水中，-20°0保存備用。4. 利用PCR定點突變技術，引入突變位點，然後經過磷酸化、自身連接和 轉化等步驟後分別獲得人藥物二相代謝酶UGT2B7的突變基因(7(777^7*7^， t/( "57"和f/GT2B7"。5. 將人藥物二相代謝酶UGT2B7的突變基因t/GrZ57*7/S， C/Gr2S7*2和 t/G77B7*5與pFastBac載體相連接後，轉化入大腸桿菌DH10Bac感受態細胞中發 生轉座作用，獲得重組粘粒Bacmid-t/GT2S7t7M ， Bacmid-t/G77575^和 Bacmid誦t/GT257"。6. 將重組粘粒Bacmid匿:/Gr2S7氺77S， Bacmid-t/Gr2B7"和Bacmid-t/Gr257" 分別感染昆蟲細胞，從而獲得各自的第一代病毒液，然後擴增病毒液使其病毒滴 度至107 108pfu/ml，從而表達重組酶，觀察細胞的形態變化，在72小時後收集細胞，超 聲破碎獲得三個功能性突變體重組酶UGT2B7*71S， UGT2B7*2和UGT2B7*5。提供攜帶分別編碼本發明的三個功能性突變體重組酶基因序列的重組粘粒， 包括Bacmid-f/GT2B7承7M， Bacmid-t/G72S7"和Bacmid-t/Gr2B7"。本發明的宿主可以是被重組粘粒轉染，含有本發明功能性突變體基因的昆蟲7細胞其中優選的是Sf9或SGl細胞。
許多克隆載體可以購買商品化的如大腸桿菌克隆載體pGEM-T， pUC18， pUC19等。這些質粒大小適合，帶有多克隆位點，通用引物和抗性標記，用於方 便重組質粒的篩選和測序。杆狀病毒穿梭載體pFastBac可在大腸桿菌中增殖。
表達重組酶的宿主可以是大腸桿菌、酵母、杆狀病毒感染的昆蟲細胞和哺乳 動物細胞。杆狀病毒表達介導的昆蟲表達系統是一種超量重組蛋白的真核細胞表 達系統。該系統在原啟動子的作用下可以高效表達外源蛋白並提供一個真核表達 環境，有利於外源重組蛋白的正確摺疊，二硫鍵的形成，寡聚化及其它翻譯後加 工修飾，從而獲得具有生物活性的真核蛋白，使表達產物在結構及功能上接近天 然蛋白。
轉染所需核苷酸至宿主昆蟲細胞中可用脂質體轉染法。成功轉染的昆蟲細胞， 既含有本發明DNA構建體的細胞，可以通過提取基因組DNA進行PCR鑑定，或 者，細胞破碎液中蛋白可用抗His的抗體檢測。
可以通過培養杆狀病毒感染的昆蟲細胞，轉染本發明構建的重組粘粒，生產 本發明的突變體重組酶。具體的培養方法，可以先用小號細胞瓶進行小量擴增細 胞，然後轉入大號細胞瓶貼壁表達或者轉入搖瓶進行大量懸浮表達。
本發明的又一個目的是提供的人UGT2B7的三個功能性突變體重組酶在篩選
藥物中應用。本發明提供的三個功能性突變體重組酶可預測個體化用藥可能產生 的藥物副作用，從而指導合理用藥。
本發明的目再一個的是提供的人UGT2B7的三個功能性突變體重組酶在分子 水平研究酶與底物藥物的構效關係中應用。
本發明提供的功能性突變體重組酶在昆蟲細胞中高水平表達，周期較短。杆 狀病毒有嚴格的宿主範圍，無人體病原性，操作安全。因為杆狀病毒穿梭載體可 在大腸桿菌增殖，篩選重組陽性杆狀病毒穿梭載體可原核大腸桿菌中進行，避 免了複雜、費時的空斑篩選。在pFastBac轉入Bacmid時，採用mini-Tn7到att-Tn7 點特異轉位，大大提高重組效率，節省時間，簡化操作。
因此本發明用於體外表達人UGT2B7野生型和功能性突變體重組酶的方法簡 單、有效，並且容易放大進行大規模生產。應當理解的是，本發明並不局限於本 文所說明和公開的功能性突變體的構建和表達，而且包括可以從權利要求書範圍 中得出的更多的突變體。


圖1為人UGT2B7的PCR電泳結果，pGEM-T-UGT2B7質粒和酶切電泳結果， pFastBac-UGT2B7質粒和酶切電泳結果圖。 圖2為PCR定點突變原理圖。
圖3為pGEM隱C/GT2B7517 ， pGEM-t/GT257*7M， pGEM-t/C r287*3和 pGEM-f/GT257*5的質粒和酶切結果圖。
圖4為pGEM-C/GT2B7*77& pGEM-t/GrZB7*3和pGEM-C/GT2S7*5的測序
結果圖。
圖5為pFastBac-t/GT267*7， pFastBac-t/GT2S7*7/5", pFastBac陽t/GT2B7"和 pFastBac-t/Gr2S7"質粒和酶切結果圖。
圖6為5acmz'U/GT2g7，醜acvmW-pFastBac和BacmzV/的PCR結果電泳圖。
圖7為B"cwW- C/Gr2S7〃， t/Gr2g7*7/5"， SacwW- C/GT2S7"和
Sacm" C/GT2S7"的PCR結果電泳圖。
圖8為mRNA分子水平驗證UGT2B7*1， UGT2B7*71S, UGT2B7*2和 UGT2B7*5的結果圖。
圖9為western blot印跡法驗證UGT2B7*1， UGT2B7*71S， UGT2B7*2和 UGT2B7*5蛋白表達的結果圖。
圖10為UGT2B7*1， UGT2B7*71S, UGT2B7*2和UGT2B7*5重組酶作用於 7-HFC的代謝酶動力學圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。通過下列實施例對本發明的 技術特徵做詳細的描述，但不限制本發明。
實施例1生產突變體重組酶的質粒pGEM-f/GT2B7*7/5: pGEM-f/GT2B7*3 和pGEM-t/C r2B7"的構建
一材料和方法
(一)實驗材料
大腸桿菌菌株E.coli DH5 a ，本實驗保存。PCR引物，上海生工。克隆質粒 pGEM-T為Promega產品。
Takara MutanBEST試劑盒購自Takara公司，限制性內切酶、PCR產物回收 試劑盒、質粒抽提試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒均購自上海生工生物工程技術服 務有限公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司代為合成，測序服務由 上海生工生物工程技術服務公司完成。(二)實驗方法
1.人UGT2B7cDNA的克隆構建
提取人肝組織的mRNA，取lmg左右加TRIzol試劑lml，勻漿30s。 4°C "12000g)離心10min，取上清。加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管蓋，手搖劇烈振 蕩15秒，然後冰浴放置15分鐘，於4。C離心(《12000g) 15分鐘，RNA存在於 上層水相中。轉移水相至另一個乾淨離心管中，加異丙醇0.5ml，混勻，室溫放置 IO分鐘以沉澱RNA，然後於4。C離心(《12000g) 10分鐘。移去上清液，加75% 乙醇lml洗滌沉澱，經旋渦振蕩，於4。C離心(S7500g) 5分鐘，回收RNA沉澱。 移去上清液，將離心管置空氣中乾燥，揮去乙醇，沉澱用50^1無核糖核酸酶 (RNase)的水(焦碳酸二乙酯處理)溶解，65'C放置15分鐘使變性，立即置冰 上備用或凍於-70。C冰箱中保存。肝組織總RNA2ul，水4ul，隨機引物4tU， 總體積20ul振蕩混勻。
按照GENEBANK中的人UGT2B7合成引物，上下遊引物分別引入和 iol位點和保護鹼基。
SEQ ID N0.5: gtc gac att gca cca ggatgt ctg tg (擴增UGT2B7基因所用的上遊引物) SEQ ID N0.6: etc gag ggt tttc cag ctt caa ate tca(擴增UGT2B7基因所用的下遊引物) 聚合酶鏈反應(PCR)條件為lOOpl反應體系中，加入1.5^1肝組織cDNA， 20nmol/L的上下遊引物各1.5)^1， 10mmol/L的dNTPlpl， 10x反應緩衝液lO[il， Taq DNA聚合酶0.5(il，剩餘用ddH20補足。用EPPENDORF公司的(型號為Matstercycler Gradient)PCR儀，PCR條件為9《C預變性5分鐘；94"C變性40秒；54°。退火45 秒；72"C延伸2分鐘，共33個循環以後，再72'C延伸10分鐘。通過0.8%凝膠 電泳分析得到預期為1.6kb的條帶。PCR產物電泳純化用DNA片段回收試劑盒回 收純化目的條帶。取純化的UGT2B7 cDNA3pl，加入1^1 pGEM-T載體，5^1 2x 反應緩衝液，lplT4DNA連接酶，16'C反應過夜，轉化新鮮製作的DH5a感受態 細胞。轉化菌鋪於x-gal、 IPTG和氨苄青黴素的LB瓊脂平板上，37'C培養過夜。 挑取白色菌落，接種至5mL含50pg/ml LB液體培養基中，37t培養過夜，用小 量質粒提取試劑盒，用和J^ol雙酶切後進行電泳鑑定，參見圖1，其中A 圖泳道l.DNA標記，泳道2.以從肝組織獲得的cDNA為模板的PCR產物；B 圖泳道l.DNA標記，泳道2.重組的pGEM-UGT2B7質粒，泳道3:重組的 pGEM-UGT2B7質粒經I雙酶切。用pGEM-T通用引物對重組質粒進行 測序，走了一次walking後完成UGT2B7 cDNA全長測序，經過DNASTAR軟體與genebank中NM 001074序列進行比對後，證明已獲得序列完全正確的UGT2B7 cDNA的克隆。
2. pGEM-f/Gr287*7/& pGEM-[/Gr287^和pGEM-t/G7257*5的構建以pGEM-t/Gr2S7*7為模板，經過定點突變獲得pGEM-f/GT^S * ^,pGEM-f/G77B7*2和pGEM-C/GT2B7*5。1)定點突變採用PCR技術，為獲得UGT2B7"的突變型基因，設計合成突變導入引物和對應的引物，如下表所示(突變位點用斜體表示，對應的引物的5'鹼基的互補鹼基必須和突變導入引物的5'鹼基相接)突變位點引物UGT2B7*71 S(A71 S,211 G>T)SEQ ID NO.7 : aac tea tec (^ct ctt aaa att SEQ ID NO.8:gtt ggg ate aaa aag aat gga agUGT2B7*2(H268Y,802C>T)SEQ ID NO.9:cag ttt ccf" fb>t cca etc tta cc SEQ ID NO,10: aaa att cca gga gtt tgg aat aag cca tac gUGT2B7*5(D398N, 1192G>A)SEQ ID NO. 11: cca ttg ttt gec向at caa cct gat aac att gc SEQ ID N0.12: aat ccc cac cat agg gat ccc atg gta gat tgc2) PCR反應體系(50 pi總體積)10 XPyrobest BufferdNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 4 piPrimer 1(20 |amol/L;)Primer 2(20 (amol/L)1 piTemplate0.01 ~ 1 ngPyrobest DNA Polymerase(5 U/nl) 0.25 piddH20up to 50按下列反應條件進行PCR反應94 。C30 s55 60 °C30 s72 0C5 min卜3步循環30次，Hold on 8 °C3) 對PCR反應液進行1% Agarose凝膠電泳，切膠回收目的DNA片段；4) PCR產物的末端平滑化在Eppendorf管中配製以下反應液目的DNA片段 約1 pmol10 X Blunting Kination Buffer 2 |ilBlunting Kination Enzyme Mix 1 (nlddH20 up to 20 pi37。C反應10min，反應液用雙蒸水定量至100 pl，加入100 pi (等量)的苯 酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，充分混勻。離心，取上層(水相)移至另一微量離 心管中。加入IOO ^ (等量)的氯仿/異戊醇(24:1)，充分混勻。離心，取上層 (水相)移至另一微量離心管中。加入10 pi (1/10)的3 mol/L CH3COONa (pH5.2)。 加入250 ^ (2.5倍量)的冷無水乙醇，-20 °C放置30 min ~ 60 min。離心回收沉澱， 用70%的冷乙醇清洗沉澱，真空乾燥。用20pl的TE緩衝液溶解沉澱；5) 自身連接反應取約0.25 pmol (5 pi)上述溶液於新的Eppendorf管中，加 入5 |il的Ligation Solution I (試劑盒自帶)，均勻混合。16 °C反應1 h，也可延 長時間至過夜以增加連接效率。參見圖2。6) 將突變後的質粒轉化入E.coliDH5a中，小量提取質粒，抽提所得的質粒進行電泳，觀察質粒條帶位置，然後將可能正確的質粒進行SalI/XhoI雙酶切(已 插入的UGT2B7*1基因兩端帶有這兩個由PCR引物引入的酶切位點)。酶切後進 行核酸凝膠電泳，觀察是否產生1600 bp的基因片段和3000 bp的pGEM載體片段， 見圖3，初步確定幾個可能的陽性重組子克隆進行DNA測序，測序引物採用pGEM 載體的T7/SP6啟動子引物。保存測序正確的質粒，分別命名為 pGEM-t/GTZB * ", pGEM-C/GT2B7"和pGEM-f/GTZB7*5。圖3中泳道1和 10. DNA標記；泳道2. pGEM-C/Gr2S7〃質粒；泳道3. pGEM-(/GT2S7〃質粒經 Sa/I/J^zol雙酶切；泳道4. pGEM-t/GT2B7+77S質粒；泳道5. pGEM-t/Gr2B7*7M 質粒經Sa/I/^oI雙酶切；泳道6. pGEM-t/GT2S7*2質粒；泳道7. pGEM-質粒經Sa/I/J^ol雙酶切；泳道8. pGEM-C/GT2B7*5質粒；泳道9. pGEM-UGr2B7*5 質粒經A)的測序結果。實施例2 pFastBac-[/Gr2S7*7/& pFastBac-C/GT2S7*2和pFastBac-C/GT2S7"的構建將測序正確的pGEM-C/( r2B7f7/;S1， pGEM-t/GTZB7W和pGEM-C/Gr2e7"用 SalI/XhoI雙酶切，同時pFastBacTMl-t/Gr287"也用SalI/XhoI雙酶切，突變型目的 基因和載體用T4 DNA連接酶連接後，轉化入E. coli DH 5 a感受態細胞,挑取陽性 菌落提取pFastBac-C/Gr2S7承7/S， pFastBac-(/Gr2B7"和pFastBac-t/Gr2S7"重組質粒，同時進行酶切鑑定，參見圖5。圖5中泳道1和10: DNA標記；泳道2:pFastBac-C/GrZB7"質粒；泳道3: pFastBac-C/GT2S7〃質粒經5"a/I/^oI雙酶切；泳 道4: pFastBac-f/GT2B7承7M質粒；泳道5: pFastBac-￡/6!17287*7/51質粒經51"/1/;^01 雙酶切；泳道6: pFastBac-t/GT2S7"質粒；泳道7: pFastBac-t/Gr2S7W質粒經 Sa/I/A7zoI雙酶切；泳道8: 3318&0^/<3!7^87*5質粒；泳道9: pFastBac-t/GT2S7*5 質粒經Sa/I/^7zoI雙酶切。實施例3 5^脂^- 7( 7^57*7/& 5ac脂W-t/Gr2B7"和SacmW- 7(^7257*5的製備將酶切鑑定正確的pFastBac-t/GT2i5747M ， pFastBac-C/Gr287*2和 pFastBac-C/GT2S7"重組質粒轉化入E. coli DH 10Bac中，pFastBac空質粒平行 操作。通過藍白篩選,確證為白色菌落後,採用鹼裂解法相應提取轉座後的 5acwW-t/( rZB7*7^， Bac附z'J-t/GT257"和BacmW- C/GT2S7"。同法提取E. coli DH10Bac細菌中未發生轉座的Sac7mW，並用M13(+)/M13(—)為引物進行PCR 驗證,三者PCR產物應分別約在3卯0， 2300， 300bp出現條帶，參見圖6，圖7。 圖6中泳道1.DNA標記；泳道2.轉染後pFastBac-t/GrL^的粘粒的PCR結果 (3900 bp);泳道3.轉染pFastBac後的粘粒的PCR結果(2300bp);泳道4.未轉染 的粘粒的PCR結果(300 bp)。圖7中泳道1和6.DNA分子標記；泳道2.轉染 pFastBac-f/Gr2B7*』後的bacmid的PCR產物(3900 bp);泳道3.轉染 pFastBac—[/Gr2S7*7LS後的bacmid的PCR產物(3900 bp);泳道4.轉染 pFastBac—f/G72B7*2後的bacmid的PCR產物(3卯0 bp);泳道5.轉染 pFastBac-t/Gr2B7"後的bacmid的PCR產物(3900 bp)。實施例4 5^7mV/-t/Gr2B7*/，Bacw/(i畫t/Gr2B7傘7/S; 5acwW- t/Gr2S7"和13Bacmid-C/GT2B7"轉染Sf9細胞^^m^-C/G"S7"採用脂質體法進行轉染對數生長期的活力S0細胞。脂質體試 劑Cellfectin Reagent與各種重組粘粒形成複合物後在6孔板中轉染Sf9細胞。 轉染3 4 d後，細胞直徑變大變圓並出現細胞脫落現象,收集含重組病毒的培養 液，500 Xg離心5min ，取上清液，4 。C避光保存。實施例5在mRNA分子水平驗證UGT2B7*1， UGT2B7*71S, UGT2B7*2和 UGT2B7*5的轉錄情況用TRIzol (Gibco)試劑分別提取重組病毒感染的Sf9細胞及正常S 細胞的 總mRNA，進行RT-PCR。 PCR反應後，用DNA瓊脂糖電泳分析，重組病毒感染 後的PCR產物在1600 bp有條帶，而正常Sf9細胞的PCR產物在此位置無條帶， 參見圖8，其中泳道1和7: DNA標記；泳道2: UGT2B7*1的PCR產物(1600 bp); 泳道3: UGT2B7*71S的PCR產物(1600 bp);泳道4: UGT2B7*2的PCR產物(1600 bp);泳道5: UGT2B7*5的PCR產物(1600 bp);泳道6:空白Sf9細胞的PCR產 物。實施例6構建表達的UGT2B7*1， UGT2B7*71S, UGT2B7*2和UGT2B7*5重組酶 的活性測定1. 重組酶的免疫學活性測定將超聲破碎得到的UGT2B7*1， UGT2B7*71S， UGT2B7*2禾B UGT2B7*5 (帶有 His標籤)重組酶按常規方法進行SDS-PAGE電泳，然後將蛋白轉至PVDF膜上， 加入5%脫脂奶粉置4 。C封閉過夜，再加入Mouse anti-His monoclonal antibody — 抗(1: 3 000)，室溫孵育lh。洗滌3次後，加入HRP辣根過氧化酶標記的羊抗 鼠二抗(1: 2500)，室溫孵育lh，洗滌3次後，曝光顯色，參見圖9，圖中泳道 1:轉染Bacmid-t/Gr257W後的S投細胞；泳道2:轉染Bacmid-t/Gr2B7*77S後 的Sf9細胞；泳道3:轉染Bacmid-W rZ57"後的Sf9細胞；泳道4:轉染 Bacmid-C/Gr^7"後的Sf9細胞；泳道5:空白Sf9細胞。2. 重組酶的生物學活性測定UGT2B7*1， UGT2B7*71S， UGT2B7*2和UGT2B7*5重組酶的活性是通過作用於 7-HFC(4-tifluoromethylumbelliferyl glucuronide potassium salt)的代話f情況來衡量，結果見圖10，圖中八.反應速率與底物濃度的關係("=3); B.重組UGT2B7*1, UGT2B7*71S， UGT2B7*2禾口 UGT2B7*5對7-HFC活性的Lineweaver Burk圖。7-HFC是公認的UGT底物，所以以此為工具並用螢光光度法測定UGT2B7" 及其突變體的活性，文獻報導HEK293細胞系表達的UGT2B7f 1 P對7-HFC的Km值 為(0.335±0.008) mM.L"和Vmax值為(0.168±0.005) nmol.mm.mg-protein。 而本實驗測得UGT2B7"重組酶的Km值為(0.331 ±0.018) mM.L"和Vmax值為(2.14±0.04) nmol'min"-mg" protein,可見本系統表達的UGT2B7^1對底物的親 和力與在哺乳動物細胞表達的相近，而活性更高。與UGT2B7"相比，UGT2B7傘71S對7-HFC的Km值為(0.260土0.026) mM.1/1， 約是UGT2B7承1的3/4，而Vmax值為(1.36士0.05) nmol.min十mg" protein,約是 UGT2B7承1的3/5， CLint是UGT2B7"的4/5。 UGT2B7"對7-HFC的Km值為(0.53 ± 0.06) mM.L-1，是UGT2B7承1的1.6倍，而Vmax值為(9.5 ±0.05) nmol.min".mg-1 protein，是UGT2B7^的4.4倍，CLint是UGT2B7"的2.8倍。UGT2B7承5對7-HFC的 Km值為(0.59土0.05)mM'I^是UGT2B7n的1.8倍，而Vmax值為(7.52±0.28) nmol-min+mg-1 protein,是UGT2B7H的3.5倍，CLint是UGT2B7H的2.0倍。由此可 見，三個功能性突變體與野生型相比，在對於7-HFC的代謝中都存在顯著性差異 (p<0.05)， 1^丁287*2和1^丁287*5對於7-1^(:的0^都要比野生型高，而 UGT2B7471S對於7-HFC的CLint比野生型低。在這三個功能性突變體中， UGT2B742對於7-HFC的CLint值最高，即代謝能力最強，UGT2B7+71S對於7-HFC 的CLint值最低，代謝能力最弱。當人群中等位基因中存在這些突變位點時，會影響其底物藥物的代謝，從而 出現個體藥動學和藥效學的差異。110丁287*1的功能性突變體1;0丁237*718， UGT2B742和UGT2B7+5的構建和活性鑑定比較為進一步研究UGT2B7對於其它底 物藥物的差異性奠定基礎。無需進一步詳細闡述，相信採用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大 限度地應用本發明。因此，前面的實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何 方式限制本發明的範圍。本發明涉及的序列 1 1608 DNA 人工序列 CDS (1)…(1608)人二相代謝酶UGT2B7+71S(A71S,211G〉T)的序列lie GinLeu SerLeu ValTip Ala lie LeuAsp Glu Ala SerSer Ala Leu Lyslie Glu Glu AsnPhe He Lys AspThr Phe Ser liePhe Gly Ssr AsnLys Lys ValHePhe Ala GluLeuPhe Asn16 1atg tct魄aaa tgg act tea gta att ttg eta ata caa ctg age 45 MetSerValLys TrpThrSer VallieLeu Leu 1 510 15ttt tgc ttt age tct ggg aat tgt gga aag gtg ctg gtg tgg gca 90 PheCysPheSer SerGlyAsn CysGlyLys Val 1620 25 30gca gaa tac age cat tgg atg aat ata aag aca ate ctg gat gag 135 AlaGluTyrSer HisTrpMet AsnlieLys Thr 3135 40 45ctt att cag aga ggt cat gag gtg act gta ctg gca tct tea get 180 LeulieGinArg GlyHisGlu ValThrVal Leu 4650 55 60tec att ctt ttt gat ccc aac aac tea tec tct ctt aaa att gaa 225 SerlieLeuPhe AspProAsn AsnSerSer Ser 6165 70 75att tat ccc aca tct tta act aaa act gag ttg gag aat ttc ate 270 lieTyrProThr SerLeuThr LysThrGlu Leu 7680 85 90atg caa cag att aag aga tgg tea gac ctt cca aaa gat aca世315 MetGinGinlie LysArgTrp SerAspLeu Pro 9195 100 105tgg tta tat ttt tea caa gta cag gaa ate atg tea ata ttt ggt 360 TrpLeuTyrPhe SerGinVal GinGlulie Met 106 110 115 120gac ata act aga aag ttc tgt aaa gat gta gtt tea aat aag aaa 405 AsplieThrArg LysPheCys LysAspVal Val 121 125 130 135ttt atg aaa aaa gta caa gag tea aga ttt gac gtc att ttt gca 450 PheMetLys LysValGinGlu SerArgPhe Asp 136 140 145 150gat get att ttt ccc tgt agt gag ctg ctg get gag eta ttt aac 495 AspAlaHe PheProCysSer GuLeuLeu Ala151 155 160 165ata ccc ttt魄tac agt etc age ttc tct cct ggc tac act ttt 540lieProPhe ValTyrSerLeu SerPheSerPro GlyTyrThr Phe 166 170 175 180gaa aag cat agt gga gga ttt att ttc cct cct tec tac gta cct 585GluLysHis SerGlyGlyPhe liePheProPro SerTyrVal Pro 181 185 190 195gtt gtt atg tea gaa Ua act gat caa atg act ttc atg gag agg 630Val Val Met Ser Glu Leu Thr Asp Gin Met Thr Phe Met Glu Arg 196 200205 210gta aaa aat atg ate tat gtg ctt tac ttt gac ttt tgg ttc gaa 675ValLysAsn MetlieTyrVal LeuTyrPheAsp PheTipPhe Glu 211 215220 225ata ttt gac atg aag aag tgg gat cag ttt tat agt gaa gtt eta 720liePheAsp MetLysLysTip AspGinPheTyr SerGluVal Leu 226 230235 240gga aga ccc act aca tta tct gag aca atg ggg aaa get gac gta 765Gly Arg Pro Thr Thr Leu Ser Glu Thr Met Gly Lys Ala Asp Val 241 245 250 255tgg ctt att cga aac tec tgg aat ttt cag ttt cca cat cca etc 810TrpLeu lieArgAsnSerTrp AsnPheGinPhe ProHisPro Leu 256 260 265 270tta cca aat gtt gat世gtt gga gga etc cac tgc aaa cct gcc 855Leu Pro Asn Val Asp Phe Val Gly Gly Leu His Cys Lys Pro Ala 271 275 280 285aaa ccc ctg cct aag gaa atg gaa gac ttt gta cag age tct gga 900LysPro LeuProLysGluMet GluAspPheVal GinSerSer Gly 286 2卯295 300gaa aat ggt gtt gtg gtg ttt tct ctg ggg tea atg gtc agt aac 945GluAsn GlyValValVal PheSerLeuGlySer MetValSer Asn 301 305 310 315atg aca gaa gaa agg gcc aac gta att gca tea gcc ctg gcc cag 990MetThr GluGluArgAla AsnVallieAlaSer AlaLeuAla Gin 316 320 325 330ate cca caa aag gtt ctg tgg aga ttt gat ggg aat aaa cca gat 1035liePro GinLysValLeu TrpArgPheAspGly AsnLysPro Asp 331 335 340 345acc tta ggt etc aat act egg etc tac aag tgg ata ccc cag aat 1080Thr Leu Gly Leu Asn Thr Arg Leu Tyr Lys Trp lie Pro Gin Asn 346 350 355 360gac ctt eta ggt cat cca aag acc aga get ttt ata act cat ggt 1125AspLeu LeuGlyHisPro LysThrArgAlaPhe lieThrHis Gly 361 365 370 375gga gcc aat ggc ate tac gag gca'ate tac cat ggg ate cct atg 1170GlyAla AsnGlyTieTyr GluAlalieTyrHis GlyliePro Met 376 380 385 3%gtg ggg att cca ttg ttt gcc gat caa cct gat aac att get cac 1215ValGly lieProLeuPhe AlaAspGinProAsp AsnlieAla His 391 395 400 405atg aag gcc agg gga gca get gtt aga魄gac ttc aac aca atg 1260MetLys AlaArgGlyAla AlaValArgValAsp PheAsnThr Met 楊410415 420tcg agt aca gac ttg ctg aat gca ttg aag aga gta att aat gat 1305SerSer ThrAspLeuLeu AsnAlaLeuLysArg VallieAsn Asp 421425430 435cct tea tat aaa gag aat gtt atg aaa tta tea aga att caa cat 1350ProSer TyrLysGluAsn ValMetLysLeuSer ArglieGin His 436440445 450gat caa cca gtg aag ccc ctg gat cga gca gtc ttc tgg att gaa 1395AspGin ProValLysPro LeuAspArgAlaVal PheTrplie Glu 451 455 460 465ttt gtc atg cgc cac aaa gga get aaa cac ctt egg gtt gca gcc 1440PheVal MetArgHisLys GlyAlaLysHisLeu ArgValAla Ala 466470475 480cac gac etc acc tgg ttc cag tac cac tct ttg gat gtg att ggg 1485HisAsp LeuThrTrpPhe GinTyrHisSerLeu AspVal Tie Gly 481485 490 495ttc ctg ctg gtc tgt gtg gca act gtg ata ttt ate gtc aca aaa 1530PheLeu LeuValCysVal AlaThrValHePhe lieValThr Lys 496500 505 510tgt tgt ctg ttt tgt ttc tgg aag ttt get aga aaa gca aag aag 1580CysCys LeuPheCysPhe TrpLysPheAlaArgLysAlaLys Lys511 515 520 525gga aaa aat gat cat cat cat cat cat cat tag 1608GlyLys AsnAspHisHis HisHisHis His526530 535 539 2 1608 DNA 人工序列 CDS (1)...(1608)人二相代謝酶UGT2B7*2(H268Y， 802 OT)的序列 2atg tct gtg aaa tgg act tea gta att ttg eta ata caa ctg age 45MetSerValLys TrpThrSer ValHeLeuLeulie GinLeu Ser 1 510 15ttt tgc ttt age tct ggg aat tgt gga aag gtg ctg gtg tgg gca 90Phe Cys Phe Ser Ser Gly Asn Cys Gly Lys Val Leu Val Trp Ala 1620 25 30gca gaa tac age cat tgg atg aat ata aag aca ate ctg gat gag 135 AlaGluTyrSer HisTipMet Asn lie 31 35 40 45ctt att cag aga ggt cat gag gtg act gta ctg gca tct tea get 180 LeuHeGinArg GlyHisGlu Val Thr 4650 55 60tec att ctt ttt gat ccc aac aac tea tec get ctt aaa att gaa 225 SerlieLeuPhe AspProAsn Asn Ser 61 65 70 75att tat ccc aca tct tta act aaa act gag ttg gag aat ttc ate 270 lieTyrProThr SerLeuThr Lys Thr 7680 85 90atg caa cag att aag aga tgg tea gac ctt cca aaa gat aca ttt 315 Met Gin Gin lie Lys Arg Tip Ser Asp 9195 100 105tgg tta tat ttt tea caa gta cag gaa ate atg tea ata ttt ggt 360 TipLeuTyrPhe SerGinVal Gin Glu 106 110 115 120gac ata act aga aag ttc tgt aaa gat gta gtt tea aat aag aaa 405 AsplieThrArg LysPheCys Lys Asp 121 125 130 135ttt atg aaa aaa gta caa gag tea aga ttt gac gtc att ttt gca 450 PheMetLys LysValGinGlu Ser Arg 136 140 145 150gat get att ttt ccc tgt agt gag ctg ctg get gag eta ttt aac 495 AspAlalie PheProCysSer Glu Leu 151 155 160 165ata ccc ttt gtg tac agt etc age ttc tct cct ggc tac act ttt 540 lieProPhe ValTyrSerLeu Ser Phe 166 170 175 180gaa aag cat agt gga gga ttt att ttc cct cct tec tac gta cct 585 GluLysHis SerGlyGlyPhe He Phe 181 185 l卯 195gtt gtt atg tea gaa tta act gat caa atg act ttc atg gag agg 630 ValValMet SerGluLeuThr Asp Gin 196 200205 210gta aaa aat atg ate tat gtg ctt tac ttt gac ttt tgg ttc gaa 675 ValLysAsn MetlieTyrVal Leu Tyr 211 215220 225ata ttt gac atg aag aag tgg gat cag ttt tat agt gaa gtt eta 720 liePheAsp MetLysLysTrp Asp Gin 226 230235 240gga aga ccc act aca tta tct gag aca atg ggg aaa get gac gta 765 GlyArgPro ThrThrLeuSer Glu Thr 241 245 250 255LysThrlie LeuAsp GluValLeuAla SerSer AlaSerAlaLeu Lyslie GluGluLeuGlu AsnPhe lieLeuProLys AspThr PhelieMetSer liePhe GlyValValSer AsnLys LysPhe AspValliePhe AlaLeu AlaGluLeuPhe AsnSerPro GlyTyrThr PheProPro SerTyrVal ProMetThr PheMetGlu ArgPheAsp PheTrpPhe GluPheTyr SerGluVal LeuMetGly LysAlaAsp Valtgg ctt att cga aac tec tgg aat ttt cag ttt cca tat cca etc 810TipLeu HeArgAsnSerTip AsnPheGinPhe Pro丁yrPro Leu 256 260 265 270tta cca aat gtt gat ttt gtt gga gga etc cac tgc aaa cct gcc 855Leu Pro Asn Val Asp Phe Val Gly Gly Leu His Cys Lys Pro Ala 271 275 280 285aaa ccc ctg cct aag gaa atg gaa gac ttt gta cag age tct gga 900Lys Pro Leu Pro Lys Glu Met Glu Asp Phe Val Gin Ser Ser Gly 286 2卯 295 300gaa aat ggt gtt gtg gtg ttt tct ctg ggg tea atg gtc agt aac 945GluAsn GlyValValVal PheSerLeuGlySer MetValSer Asn 301 305 310 315atg aca gaa gaa agg gcc aac gta att gca tea gcc ctg gcc cag 990MetThr GluGluArgAla AsnValHeAlaSer AlaLeuAla Gin 316 320 325 330ate cca caa aag gtt ctg tgg aga ttt gat ggg aat aaa cca gat 1035liePro GinLysValLeu TipArgPheAspGly AsnLysPro Asp 331 335 340 345acc tta ggt etc aat act egg etc tac aag tgg ata ccc cag aat 1080Thr Leu Gly Leu Asn Thr Arg Leu Tyr Lys Trp lie Pro Gin Asn 346 350 355 360gac ctt eta ggt cat cca aag acc aga get ttt ata act cat ggt 1125AspLeu LeuGlyHisPro LysThrArgAlaPhe lieThrHis Gly 361 365 370 375gga gcc aat ggc ate tac gag gca ate tac cat ggg ate cct atg 1170GlyAla AsnGlyHeTyr GluAlaHeTyrHis GlyHePro Met 376 380 385 390gtg ggg att cca ttg ttt gcc gat caa cct gat aac 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AsnPhe He 7680 85 90atg caa cag att aag aga tgg tea gac ctt cca aaa gat aca ttt 315Met Gin Gin lie Lys Arg Trp Ser Asp Leu Pro Lys Asp Thr Phe 9195 100 105tgg tta tat ttt tea caa gta cag gaa ate atg tea ata ttt ggt 360TrpLeuTyrPhe SerGinVal GinGlulieMetSer liePhe Gly 106 110 115 120gac ata act aga aag ttc tgt aaa gat gta gtt tea aat aag aaa 405AsplieThrArg LysPheCys LysAspValValSer AsnLys Lys 121 125 130 135ttt atg aaa aaa gta caa gag tea aga ttt gac gtc att ttt gca 450PheMetLys LysValGinGlu SerArgPhe AspValliePhe Ala 136 140 145 150gat get att ttt ccc tgt agt gag ctg ctg get gag eta ttt aac 495Asp Ala lie Phe Pro Cys Ser Glu Leu Leu Ala Glu Leu Phe Asn 151 155 160 165ata ccc ttt gtg tac agt etc age ttc tct cct ggc tac act ttt 540lieProPhe ValTyrSerLeu SerPheSerPro GlyTyrThr Phe 166 170 175 180gaa aag cat agt gga gga ttt att ttc cct cct tec tac gta cct 585GluLysHis SerGlyGlyPhe liePheProPro SerTyrVal Pro 181 185 190 195gtt gtt atg tea gaa tta act gat caa atg act ttc atg gag agg 630Val Val Met Ser Glu Leu Thr Asp Gin Met Thr Phe Met Glu Arg 196 200205 210gta aaa aat atg ate tat gtg ctt tac ttt gac ttt tgg ttc gaa 675ValLysAsn MetHeTyrVal LeuTyrPheAsp PheTipPhe Glu 211 215220 225ata ttt gac atg aag aag tgg gat cag ttt tat agt gaa gtt eta 720HePheAsp MetLysLysTrp AspGinPheTyr SerGluVal Leu 226 230235 240gga aga ccc act aca tta tct gag aca atg ggg aaa get gac gta 765Gly Arg Pro Thr Thr Leu Ser Glu Thr Met Gly Lys Ala Asp Val 241 245 250 255tgg ctt att cga aac tec tgg aat ttt cag ttt cca cat cca etc 810TrpLeu lieArgAsnSerTrp AsnPheGinPhe ProHisPro Leu 256 260 265 270tta cca aat gtt gat ttt gtt gga gga etc cac tgc aaa cct gcc 855Leu Pro Asn Val Asp Phe Val Gly Gly Leu His Cys Lys Pro Ala 271 275 280 285aaa ccc ctg cct aag gaa atg gaa gac ttt gta cag age tct gga 900Lys Pro Leu Pro Lys Glu Met Glu Asp Phe Val Gin Ser Ser Gly 286 2卯 295 300gaa aat ggt gtt gtg gtg ttt tot ctg ggg tea atg gtc agt aac 945GluAsn GlyValValVal PheSerLeuGlySer MetValSer Asn 301 305 310 315atg aca gaa gaa agg gcc aac gta att gca tea gcc ctg gcc cag 990MetThr GluGluArgAla AsnVallieAlaSer AlaLeuAla Gin 316 320 325 330ate cca caa aag gtt ctg tgg aga ttt gat ggg aat aaa cca gat 1035He Pro Gin Lys Val Leu Trp Arg Phe Asp Gly Asn Lys Pro Asp 331 335 340 345acc tta ggt etc aat act egg etc tac aag tgg ata ccc cag aat 1080ThrLeu GlyLeuAsnThr ArgLeuTyr Lys346 350 355 360gac ctt eta ggt cat cca aag acc aga get ttt ata act cat ggt 1125AspLeu LeuGlyHisPro LysThrArg Ala361 365 370 375gga gcc aat ggc ate tac gag gca ate tac cat ggg ate cct atg 1170 GlyAla AsnGlylieTyr GluAlalie Tyr 376 380 385 390gtg ggg att cca ttg ttt gcc aat caa cct gat aac att get cac 1215ValGly lieProLeuPhe AlaAsnGin Pro391 395 400 405atg aag gcc agg gga gca get gtt aga gtg gac ttc aac aca atg 1260 MetLys AlaArgGlyAla AlaValArg Val 406410415 420tcg agt aca gac ttg ctg aat gca ttg aag aga gta att aat gat 1305 SerSer ThrAspLeuLeu AsnAla Leu 421425430 435cct tea tat aaa gag aat gtt atg aaa tta tea aga att caa cat 1350 ProSer TyrLysGluAsn ValMet Lys 436440445 450gat caa cca gtg aag ccc ctg gat cga gca gtc ttc tgg att gaa 1395 Asp Gin Pro Val Lys Pro Leu Asp Arg 451455460 465ttt gtc atg cgc cac aaa gga get aaa cac ctt egg gtt gca gcc 1440 PheVal MetArgHisLys GlyAla Lys 466470475 480cac gac etc acc tgg ttc cag tac cac tct ttg gat gtg att ggg 1485 His Asp Leu Thr Tip Phe Gin Tyr His 481485 柳 495ttc ctg ctg gtc tgt gtg gca act gtg ata ttt ate gtc aca aaa 1530 PheLeu LeuValCysVal AlaThr Val 496500 505 510tgt tgt ctg ttt tgt ttc tgg aag ttt get aga aaa gca aag aag 1580 CysCys LeuPheCysPhe TrpLys Phe 511515 520 525 gga aaa aat gat cat cat cat cat cat cat tag 1608 GlyLys AsnAspHisHis HisHis His 526530 535 539Trp lieProGin AsnPhe lieThrHis GlyHis GlyliePro MetAsp AsnlieAla HisAsp PheAsnThr MetLysArg VallieAsn AspLeuSer ArglieGin HisAlaVal PheTrplie GluHisLeu ArgValAla AlaSerLeu AspValHe GlyliePhe lieValThr LysAlaArgLysAlaLys LysHis 4 1608 DNA 人工序列 CDS(1)...(1608)人二相代謝酶UGT2B7的序列 4atg tct gtg aaa tgg act tea gta att ttg eta ata caa ctg age 45 MetSerValLys TrpThrSer Val He 1 510 15ttt tgc ttt age tct ggg aat tgt gga aag gtg ctg gtg tgg gca 90 PheCysPheSer SerGlyAsn Cys Gly 16 20 25 30gca gaa tac age cat tgg atg aat ata aag aca ate ctg gat gag 135 AlaGluTyrSer HisTrpMet Asn lie 31 35 40 45ctt att cag aga ggt cat gag gtg act gta ctg gca tct tea get 180 Leu lie Gin Arg Gly His Glu Val Thr 46 50 55 60tec att ctt ttt gat ccc aac aac tea tec get ctt aaa att gaa 225 SerlieLeuPhe AspProAsn Asn Ser 61 65 70 75att tat ccc aca tct tta act aaa act gag ttg gag aat ttc ate 270 lieTyrProThr SerLeuThr Lys Thr 76 80 85 卯atg caa cag att aag aga tgg tea gac ctt cca aaa gat aca ttt 315 Met Gin Gin lie Lys Arg Trp Ser Asp 91 95 謂105tgg tta tat ttt tea caa gta cag gaa ate atg tea ata ttt ggt 360 TrpLeuTyrPhe SerGinVal Gin Glu 106 110 115 120gac ata act aga aag ttc tgt aaa gat gta gtt tea aat aag aaa 405 AsplieThrArg LysPheCys Lys Asp 121 125 130 135ttt atg aaa aaa gta caa gag tea aga ttt gac gtc att ttt gca 450 PheMetLys LysValGinGlu Ser Arg 136 140 145 150gat get att ttt ccc tgt agt gag ctg ctg get gag eta ttt aac 495 AspAlalie PheProCysSer Glu Leu 151 155 160 165ata ccc ttt gtg tac agt etc age ttc tct cct ggc tac act ttt 540 HeProPhe ValTyrSerLeu Ser Phe 166 170 175 180gaa aag cat agt gga gga ttt att ttc cct cct tec tac gta cct 585 GluLysHis SerGlyGlyPhe lie Phe 181 185l卯 195gtt gtt atg tea gaa tta act gat caa atg act ttc atg gag agg 630 ValValMet SerGluLeuThr Asp Gin 196 200205 210LeuLeulie GinLeu SerLysValLeu ValTrp AlaLysThrlie LeuAsp GluValLeuAla SerSer AlaSerAlaLeu Lyslie GluGluLeuGlu AsnPhe lieLeuProLys AspThr PheTieMetSer TiePhe GlyValValSer AsnLys LysPhe AspValHePhe AlaLeu AlaGluLeuPhe AsnSerPro GlyTyrThr PheProPro SerTyrVal ProMetThr PheMetGlu Arg24gta aaa aat atg ate tat gtg ctt tac ttt gac ttt tgg ttc gaa 675ValLysAsn MetHeTyrVal LeuTyrPheAsp PheTipPhe Glu 211 215220 225ata ttt gac atg aag aag tgg gat cag ttt tat agt gaa gtt eta 720liePheAsp MetLysLysTrp AspGinPheTyr SerGluVal Leu 226 230235 240gga aga ccc act aca tta tct gag aca atg ggg aaa get gac gta 765Gly Arg Pro Thr Thr Leu Ser Glu Thr Met Gly Lys Ala Asp Val 241 245 250 255tgg ctt att cga aac tec tgg aat ttt cag ttt cca cat cca etc 810TrpLeu lieArgAsnSerTrp AsnPheGinPhe ProHisPro Leu 256 260 265 270tta cca aat gtt gat ttt gtt gga gga etc cac tgc aaa cct gcc 855Leu Pro Asn Val Asp Phe Val Gly Gly Leu His Cys Lys Pro Ala 271 275 280 285aaa ccc ctg cct aag gaa atg gaa gac ttt gta cag age tct gga 900LysPro LeuProLysGluMet GluAspPheVal GinSerSer Gly 286 290 295 300gaa aat ggt gtt gtg gtg ttt tct ctg ggg tea atg gtc agt aac 945GluAsn GlyValValVal PheSerLeuGlySer MetValSer Asn 301 305 310 315atg aca gaa gaa agg gcc aac gta att gca tea gcc ctg gcc cag 990MetThr GluGluArgAla AsnValHeAlaSer AlaLeuAla Gin 316 320 325 330ate cca caa aag gtt ctg tgg aga ttt gat ggg aat aaa cca gat 1035liePro GinLysValLeu TrpArgPheAspGly AsnLysPro Asp 331 335 340 345acc tta ggt etc aat act egg etc tac aag tgg ata ccc cag aat 1080ThrLeu GlyLeuAsnThr ArgLeuTyrLysTrp lieProGin Asn 346 350 355 360gac ctt eta ggt cat cca aag acc aga get ttt ata act cat ggt 1125AspLeu LeuGlyHisPro LysThrArgAlaPhe lieThrHis Gly 361 365 370 375gga gcc aat ggc ate tac gag gca ate tac cat ggg ate cct atg 1170GlyAla AsnGlyHeTyr GluAlaHeTyrHis GlyliePro Met 376 380 385 390gtg ggg att cca ttg ttt gcc gat caa cct gat aac att get cac 1215ValGly lieProLeuPhe AlaAspGinProAsp AsnlieAla His 391 395 400 405atg aag gcc agg gga gca get gtt aga gtg gac ttc aac aca atg 1260Met Lys Ala Arg Gly Ala Ala Val Arg Val Asp Phe Asn Thr Met 406 410415 420tcg agt aca gac ttg ctg aat gca ttg aag aga gta att aat gat 1305Ser Ser Thr Asp Leu Leu Asn Ala Leu Lys Arg Val lie Asn Asp 421 425430 435cct tea tat aaa gag aat gtt atg aaa tta tea aga att caa cat 13 5025ProSer TyrLysGluAsn ValMetLysLeuSer ArglieGin His 436 440445 450gat caa cca gtg aag ccc ctg gat cga gca gtc ttc tgg att gaa 1395Asp Gin Pro Val Lys Pro Leu Asp Arg Ala Val Phe Tip lie Glu 451 455460 465ttt gtc atg cgc cac aaa gga get aaa cac ctt egg gtt gca gec 1440Phe Val Met Arg His Lys Gly Ala Lys His Leu Arg Val Ala Ala 466 470475 480cac gac etc acc tgg ttc cag tac cac tct ttg gat gtg att ggg 1485His Asp Leu Thr Trp Phe Gin Tyr His Ser Leu Asp Val He Gly 481 485 490 495ttc ctg ctg gtc tgt gtg gca act gtg ata ttt ate gtc aca aaa 1530PheLeu LeuValCysVal AlaThrValliePhe lieValThr Lys 496 500 505 510tgt tgt ctg ttt tgt ttc tgg aag ttt get aga aaa gca aag aag 1580 CysCys LeuPheCysPhe TrpLys Phe 511515 520 525gga aaa aat gat cat cat cat cat cat cat tag 1608 GlyLys AsnAspHisHis HisHis His 526 530 535 539AlaArgLysAlaLys LysHis 5 26 DNA 人工序列 CDS擴增人二相代謝酶UGT2B7野生型基因所用的上遊引物序列 5gtc gac att gca cca gga tgt ctg tg 6 28 DNA 人工序列 CDS擴增人二相代謝酶UGT2B7野生型基因所用的下遊引物序列 6etc gag ggt ttt cca get tea aat etc a7 21 DNA 人工序列 CDS從人二相代謝酶UGT2B7野生型基因定點突變為UGT2B7*71S(A71S，211G打)所用的上遊引物序列 7aac tea tcc (t)ct ctt aaa att823DNA人工序列 CDS從人二相代謝酶UGT2B7野生型基因定點突變為UGT2B7f71S(A71S，211G玎)所用的下遊引物序列 8gtt ggg atc aaa aag aat gga ag9 23 DNA 人工序列 CD從人二相代謝酶UGT2B7野生型基因定點突變為1^丁237*2(1^268丫,8020丁)所用的上遊引物序列 9cag ttt cc(t) (c)at cca etc tta cc 10 31 DNA 人工序列 CDS從人二相代謝酶UGT2B7野生型基因定點突變為UGT2B7t2(H268Y,802OT)所用的下遊引物序列 10aaa att cca gga gtt tgg aat aag cca tac g 1132DNA人工序列CDS從人二相代謝酶UGT2B7野生型基因定點突變為UGT2B7*5(D398N，1192G〉A)所用的上遊引物序列 11cca ttg ttt gcc (a)at caa cct gat aac att gc 1233DNA人工序列 CDS從人二相代謝酶UGT2B7野生型基因定點突變為UGT2B745(D398N,1192G〉A)所用的卜遊引物序列 12aat ccc cac cat agg gat ccc atg gta gat tgc
權利要求
1.一種人二相代謝酶的三個功能性突變體重組酶，其特徵是所述三個功能性突變體重組酶分別是UGT2B7*71S、UGT2B7*2和UGT2B7*5，其中SEQ IDNO1為UGT2B7*71S的核苷酸序列和胺基酸序列，SEQ ID NO2為UGT2B7*2的核苷酸序列和胺基酸序列，SEQ ID NO3為UGT2B7*5的核苷酸序列和胺基酸序列。
2. 根據權利要求1所述的人二相代謝酶的三個功能性突變體重組酶的構建方 法，是在引物中導入突變位點，以帶有人UGT2B7的野生型基因的質粒為模板， 經PCR反應、磷酸化、自身連接和轉化，分別合成帶有UGT2B7的三個功能性突 變體重組酶基因的質粒，其特徵是通過以下步驟實現(1) 野生型基因的獲得按照GENEBANK中的人UGT2B7基因合成引物，上下遊引物分別引入&/I 和lol位點和保護鹼基，以人肝組織為模板，通過TRIZOL試劑提取總RNA， 通過RT-PCR，並在終止密碼子前添加6-His標籤，得到PCR產物後，與pGEM 載體相連接獲得pGEM-UGT2B7重組質粒，並用pGEM通用引物對重組質粒進行 測序，經過DNASTAR軟體與genebank中NM 001074序列進行比對，證明已獲 得序列完全正確的UGT2B7的基因克隆，SEQTDNO:4為UGT2B7的核苷酸序列 和胺基酸序列；(2) 野生型質粒模板的提取將己測序驗證正確的pGEM-UGT2B7重組質 粒轉化入大腸桿菌感受態細胞中得重組菌落，將重組菌落在瓊脂培養板上進行劃 板，然後挑取瓊脂培養板上的單菌落，接種至2 ml ~ 5 ml含有lOOpg/ml氨,青黴 素的LB培養液中，37 °C振搖過夜，取1.5 ml培養物倒入1.5 ml離心管中，12 000g 離心15秒，棄上清回收菌體，根據試劑說明書加入100pl溶液I，充分懸浮細胞， 加入100pl溶液II，上下顛倒5 6次，使細菌裂解，室溫放置l分鐘，加入430 pl溶液III，顛倒5 10次，使之充分中和，室溫放置2分鐘，12000 rpm高速離 心2 5分鐘，吸取上清至套放於2ml收集管的UNIQ-10柱中，8000 rpm室溫離 心l分鐘，棄廢液，將UNIQ-10柱放回2ml收集管中，吸取500 pl洗滌溶液到 UNIQ-10柱，10000 rpm室溫離心30秒，重複一次，棄廢液，將UMQ-10柱放 回2ml收集管中，10000 rpm室溫離心15秒，棄廢液，將UNIQ-10柱放入一乾淨的1.5 ml離心管中，加50 jia溶解液至膜中央，室溫放置2分鐘，10000 rpm 室溫離心1分鐘；(3)引物的合成針對人藥物二相代謝酶UGT2B7的基因合成了3對引物， 每對引物含有突變位點，合成後溶於滅菌水中，-2(TC保存備用，突變位點UGT2B7*71S(A71S,211G>T)UGT2B7*2(H268Y,802OT)UGT2B7*5(D398N，1192G>A)引物SEQ ID NO.7 : aac tea tec向ct ctt aaa attSEQ ID NO.8: gtt ggg ate aaa aag aat gga agSEQ ID NO.9: cag ttt c柳f"at cca etc tta ccSEQ ID NO. 10: aaa att cca gga gtt tgg aat aag ccatac gSEQ ID NO. 11: cca ttg ttt gec問at caa cct gat aac att gcSEQ ID NO. 12: aat ccc cac cat agg gat ccc atg gta gat tgc(4) 利用PCR定點突變技術，引入突變位點，然後經過磷酸化、自身連接 和轉化等步驟後分別獲得人藥物二相代謝酶UGT2B7的突變基因^( 72^7*77^， C/GT2B7"和t/G徴7"，PCR反應體系10X Pyrobest Buffer 5 ;il、 dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 4 |il、 Primer 1(20 jimol/L) 1 (il、 Primer 2(20 |imol/L) 1 pl、 Template 0.01 1 ng、 Pyrobest DNAPolymerase(5 u/pl) 0.25 pl、 ddH20 up to 50 jjI，反應條件 °C 30秒、55~60 °C 30秒、72 °C 5分鐘、1 3步循環30次， Hold on 8 °C;(5) 將人藥物二相代謝酶UGT2B7的突變基因^7(77757*7^， f/G7757*2 和C/Gr2B7"與pFastBac載體相連接後，轉化入大腸桿菌DHlOBac感受態細胞 中發生轉座作用，獲得重組粘粒Bacmid-C/Gr2B7f7W， Bacmid-C/GT2￡7*2和 Bacmid-C/GT2B7*5;(6 ) 將重組粘粒 Bacmid-C/C :T2B7傘77S ， Bacmid-t/GT2B7*2 和 Bacmid-C/G72S7"分別感染昆蟲細胞，從而獲得各自的第一代病毒液，然後擴增 病毒液使其病毒滴度至107 108pfU/ml，從而表達重組酶，觀察細胞的形態變化， 在72小時後收集細胞，超聲破碎獲得三個功能性突變體重組酶UGT2B7*71S， UGT2B7*2和UGT2B7*5。
3.根據權利要求2所述的人二相代謝酶的三個功能性突變體重組酶的構建方法，其特徵是所述宿主選用大腸桿菌、酵母或杆狀病毒感染的昆蟲細胞，優選Sf9或Sf21細胞。
4. 根據權利要求l所述的人二相代謝酶的三個功能性突變體重組酶在篩選藥 物中應用。
5. 根據權利要求l所述的人二相代謝酶的三個功能性突變體重組酶在預測個 體化用藥可能產生的藥物副作用、從而指導合理用藥中應用。
6. 根據權利要求l所述的人二相代謝酶的三個功能性突變體重組酶在分子水 平研究酶與底物藥物的構效關係中應用。
全文摘要
本發明提供人二相代謝酶的三個功能性突變體重組酶UGT2B7*71S，UGT2B7*2和UGT2B7*5。是在引物中導入突變位點，以帶有人UGT2B7的野生型基因的質粒為模板，經PCR反應、磷酸化、自身連接和轉化，分別合成帶有UGT2B7的三個功能性突變體重組酶基因的質粒。本發明提供的功能性突變體重組酶在昆蟲細胞中高水平表達，周期較短，杆狀病毒有嚴格的宿主範圍，無人體病原性，操作安全，提高重組效率，節省時間，構建和表達方法簡單、有效，並且容易放大進行大規模生產。可在篩選藥物中應用，可預測個體化用藥可能產生的藥物副作用，從而指導合理用藥，同時可在分子水平研究酶與底物藥物的構效關係中應用。
文檔編號C12N15/54GK101323846SQ20081006163
公開日2008年12月17日 申請日期2008年5月20日 優先權日2008年5月20日
發明者蘇 曾, 袁玲敏, 靜 陳 申請人:浙江大學