一種醫用絲素蛋白材料的表面處理方法
2023-04-24 16:34:41 1
專利名稱：一種醫用絲素蛋白材料的表面處理方法
技術領域：
本發明涉及一種醫用絲素蛋白材料的表面處理方法，屬於生物材料的表面改性技術領域。
背景技術：
絲素蛋白材料作為天然生物蛋白，因它具有良好的生物相容性和良好的機械性能與物理性能，近年來受到生物材料界越來越多的關注和研究。由於絲素蛋白天賦的優異性能有望被應用與機體組織中，如作為人造韌帶、人造骨、人造血管等生物材料。
為了滿足醫用生物工程的需要，中國專利申請CN1475533A已成功地將絲素蛋白製成了二維薄膜和三維絲素管材料，並從物理角度解決了絲素蛋白材料的力學性能，而無需添加有害的有機溶劑和高分子物質就可以得到力學性能優異、不溶於水的絲素蛋白材料，繼而通過乙醇消毒和紫外線或γ射線滅菌後供臨床試用。但是作為醫用生物材料，絲素蛋白還必須經得起醫用生物學的考驗。粗看起來，現有的絲素蛋白材料似乎已能滿足醫用材料的要求，其實不然，如當絲素蛋白作為人造韌帶、人造骨、人造血管進入機體組織後，需要一個漫長的適應過程，這說明絲素蛋白材料與機體組織細胞間的親和性還不夠，或者說兩者的相容性還不能滿足要求，所以醫務工作者和患者均期望有關的生物材料工作者做出進一步努力改變這種狀況。
發明內容
本發明的目的是為了克服現有醫用絲素蛋白材料所存在的缺點，提出了一種醫用絲素蛋白材料的表面處理方法，可大幅度改善絲素蛋白材料與機體組織細胞間的相容性，一旦絲素蛋白材料作為醫用生物材料被植入機體組織後，它就能讓機體組織細胞在材料的表面快速增殖生長，並儘快的融為一體。
發明人從體外細胞培養實驗中發現，絲素蛋白作為生物材料植入機體組織後之所以需要一個漫長的適應過程，因為它作為一異體物質進入人類機體組織，它需要一個馴化過程，即一方面需要機體組織排出體液，逐步消除材料表面痕量汙染所造成的不良的信息汙染；另一方面需要營造一種機體組織細胞在材料生長的條件；換句話說，需要逐步提高絲素蛋白材料與機體組織之間的生物相容性。所以，如何預先在材料表面完成這個馴化過程，營造機體組織細胞在絲素蛋白材料優越的生長條件，這就是本發明所創造的構思。
本發明所說的醫用生物材料的表面處理方法，主要包括如下兩個方面
(1)在超聲波和能發射遠紅外線的電氣石的參與下，用活性水對材料進行深層次的清洗，以消除材料內的痕量汙染，還材料固有的本性。
通常將加工成型的(如CN1475533A公開的)醫用絲素蛋白材料(簡稱材料)按常規預處理，即先用酒精消毒、紫外線或γ射線滅菌處理，然後在無菌條件下，用雙蒸水反覆浸泡數次，使殘留在材料表面上的酒精等雜質儘量洗除。但是，通過上述清洗處理的材料內仍然含有痕量的汙染物，影響材料的固有本性，減少了它表面的應有活性。
為此，本發明將經過上述預處理材料置於盛有活性水的容器中，藉助超聲波和能發射遠紅外線的電氣石的作用，對材料進行深層次清洗，將材料內的痕量汙染物予以清除，並恢復材料固有的本性，即恢復材料表面的胺基酸基團固有的活性。
其中所說的活性水，是指恢復水本身固有活性的水，它是一種PH＝7.4，締合度為6～8的小分子態的水，具有高的滲透力、溶解力、代謝力。
目前所說的淨化水，包括採用一切淨化措施獲得的純淨水、蒸餾水、雙蒸水在內，均是略帶酸性的、締合度大於36的大分子團的水，因為水中的痕量汙染物，影響了水的本性。由於這種痕量汙染物，用常規的儀器很難檢測出來，因此有人稱這種汙染為信息汙染，意思是汙染物信息影響水的本性。
當材料用活性水清洗時，活性水易滲透絲素蛋白材料的內部，將汙染垃圾帶出除去，還材料的本來面目——一種潔淨的活性的絲素蛋白。
其中，電氣石的作用在於使水在電氣石發出的遠紅外線作用下始終保持PH＝7.4，締合度為6～8的小分子態，從而保持活性水固有的高效去汙染能力，此外電氣石發射的遠紅外線還具有活化絲素蛋白表面胺基酸分子的能力，有利於下一步的處理。
其中，超聲波的作用主要在於藉助超聲波的能量作用以加速清洗速度，提高清洗效率，即在較短的時間內完成材料的清洗過程。此外超聲波存在亦有利於活性水保持穩定的小分子團的尺度。
(2)用促進細胞生長的物質對材料表面進行改性處理，是促進細胞生長物質中的酸性基團與絲素蛋白材料表面上已被復活的賴氨酸、組氨酸等鹼性胺基酸基團耦合，使材料表面含有促進細胞生長物質，從而大大提高了材料與機體組織之間的親和性，創造適宜細胞在材料表面上生長的優化環境，是機體組織細胞在材料表面快速的增殖生長，並融為一體。
將經步驟(1)處理的材料，在無菌條件下取出瀝乾，置於盛有含促進細胞生長物質的溶液中，浸漬8～24小時，溶液中的促進細胞生長物質，由於其上酸性基團的作用會自動與材料表面上的鹼性胺基酸基團耦合，從而在材料表面(宏觀看)包圍了一層促進細胞生長物質。取出後，在無菌條件下密封包裝，並保存於-20℃以下的冰箱中，備用。
其中所說的促進細胞生長物質是指酸性成纖維細胞生長因子(簡稱為aFGF)或表皮細胞生長因子(簡稱為EGF)中的一種，用雙蒸水配製成濃度為20～200ng/ml的溶液，供表面處理用。
為了驗證本發明所說的經表面處理的絲素蛋白材料的良好的生物學性質，本發明將已處理過的絲素蛋白材料進行了生物學細胞培養試驗，方法如下1.首先將表面處理過的絲素蛋白材料置於培養瓶(或培養管)中，用動物細胞複合培養基DMEM(為Dulbecco’s Modified Eagle Medium的簡稱，它是一種公知的培養基，故敘述從略)，在37℃培養箱中進行浸潤數小時。
2.倒出DMEM，然後接種含有動物細胞的DMEM溶液，置於37℃的培養箱中，每隔24小時用倒置顯微鏡觀察計數一次細胞的生長情況。
其中所說的動物細胞是貼壁依賴型的內皮細胞如人臍靜脈血內皮細胞，或表皮細胞如中國倉鼠卵巢細胞中的一種。接種溶液中細胞密度為(3.5～3.75)×105個/ml。
培養24小時後，用倒置顯微鏡觀察結果材料表面上的細胞生長良好，均勻密布，形態呈紡錐形；用細胞計數法測得細胞增至5.05×105個/ml。
培養48小時後，用細胞計數法測得細胞增至6.0×105個/ml。
由以上實驗結果可以證明用本發明公開的方法經表面處理後的絲素蛋白材料，當它作為細胞培養機制材料時，由於有著良好的表面生長條件，促使動物細胞在表面快速生長，可以從一個側面證明經表面處理後的絲素蛋白材料有著優良的生物相容性。因此亦可以這樣說本發明的醫用絲素蛋白材料的表面處理方法，為細胞在表面增長創造一種優越的生態環境，有效的改善了絲素蛋白材料的表面生物學特性，當它植入機體組織後，就能很快的和機體組織細胞融為一體，解決了醫學生物工程所存在的難題，從而有效的推進了醫用生物材料製備技術的進步。
具體實施例方式
下面結合實施例進一步闡明本發明的內容。
實施例1.醫用絲素蛋白材料的精煉與表面處理。
1.取家蠶繭去蛹取蠶繭或收集絲織行業的廢蠶繭作原料，將10g清洗的絲繭原料放在濃度為0.5％的碳酸鈉溶液中煮沸，按絲繭與碳酸鈉溶液之間的重量比1∶100反覆精練兩次，每次30分鐘(沸騰態)，然後充分水洗至中性，在室溫下乾燥得到精煉的絲素蛋白6.7g。
2.將上述精煉所得的絲素蛋白按重量比1∶10放置在濃度9M的氯化鈣溶液中，煮沸溶解，得絲素蛋白溶液。
3.用能截留分子量≥30,000Da聚醚碸膜對絲素蛋白溶液進行超濾，操作壓力為1.0MPa，溫度為25℃。通過超濾不僅可以去除氯化鈣等雜質和分子量較小的蛋白與多肽，同時能獲得分子量≥30,000Da的濃縮的絲素蛋白溶液A1200ml。用紫外分光光度法定量測定A1溶液中蛋白濃度為53.32mg/ml。
4.將上述溶液A1用蒸餾水稀釋至蛋白濃度(指分子量≥30,000Da的絲素蛋白)為26mg/ml，傾倒在培養瓶中，傾倒量以能完全覆蓋瓶底為度。將含有絲素蛋白溶液A1的培養瓶置於40℃的乾燥箱中乾燥24～48小時成膜，即得絲素蛋白膜材料，或者按CN1475533A專利申請公開的方法，製成二維薄膜或三維管狀材料。
5.將步驟4所得絲素蛋白材料進行常規的消毒滅菌處理。將絲素蛋白材料先用75％的酒精浸泡消毒30分鐘，再用紫外線或γ射線滅菌30分鐘。然後在無菌條件下用雙蒸水反覆清洗絲素蛋白材料，儘可能的除去附著在絲素蛋白材料表面上殘留的酒精等雜質(但是痕量的雜質汙染單純靠洗滌是去不掉的)。
6.對絲素蛋白材料進行深層次的清洗和「活化」，還絲素蛋白材料固有的本質本色。將活性水注入貯有絲素蛋白材料的培養瓶或培養管中，然後在無菌條件下引入超聲波探頭和能自動發射遠紅外線的電氣石構件(或顆粒)，是水始終保持水分子活性態(即活性水的標準，PH＝7.4，締合度為6～8。)，並借超聲波的能量作用，不僅能快速的滲入絲素蛋白材料的內部，載帶出痕量的汙染雜質，予以除去，而且能使絲素蛋白材料表面的胺基酸分子從汙染信息的束縛中解放出來，得到「活化」，還純淨絲素蛋白固有的本色。
為了達到深層次清洗絲素蛋白材料的目的，視材料表面結構的複雜情況不同，可按步驟6反覆處理1～3次，每次至少半小時。處理完後，倒掉殘餘的活性水或取出絲素蛋白材料在無菌條件下瀝乾。注這裡借用活化概念來形容被汙染信息束縛中解脫出來的純淨的絲素蛋白的固有本質，所以在活化外加上引號。
7.用促進細胞生長物質對洗淨的絲素蛋白材料進行表面處理。向存放有經步驟6處理的絲素蛋白材料的培養瓶中，加入酸性成纖維細胞生長因子aFGF的溶液，其濃度為20～200ng/ml，溶液加入量以能完全覆蓋絲素蛋白材料表面為度。在無菌條件下浸漬8～24小時，一般aFGF濃度高，則浸漬時間可短一些。aFGF上的酸性基團能自動與被「活化」的絲素蛋白材料表面上的鹼性胺基酸分子耦合，是絲素蛋白材料表面含有促進細胞生長物質。
8.用體外細胞培養法來檢驗或評估經表面處理的材料的生物學特性，並預期材料與機體組織之間的親和性。其試驗方法簡述如下先將經步驟7處理的材料，至於裝有DMEM溶液的培養瓶中，在37℃培養箱中放置12～24小時，使材料表面得到DMEM的浸潤；然後倒去多餘的DMEM，再在無菌條件下，接種用DMEM配置的人臍靜脈血內皮細胞或中國倉鼠卵巢細胞溶液，所接種的溶液中細胞濃度為3.5×105個/ml，同時放入無菌的電氣石微晶，使溶液中的水在電氣石自動放射的紅外線作用下瞬間變成活性水，置於37℃培養箱培養。培養24小時後，用倒置顯微鏡觀察，材料的表面細胞生長良好，呈紡錐形，對於絲素蛋白薄膜材料試驗來說，接種溶液量為3ml已足夠，此時用細胞計數法測得細胞密度為5.01×105個/ml，比未經表面處理的材料，其細胞增長速率至少提高一倍，說明通過本發明處理的材料比未經處理的材料更適合於細胞的生長。
總之，從實施例中可以看出按照本發明所說的表面處理方法，可以大大改善絲素蛋白材料表面的生物學特性，為機體組織細胞在材料表面的增長創造了良好的生物學環境，從而推動醫用生物材料的發展。
權利要求
1.一種醫用絲素蛋白材料的表面處理方法，包括將已通過酒精消毒、紫外線或γ射線滅菌後的材料先用雙蒸水反覆清洗以儘量除去酒精等雜質；然後用活性水進行深層次清洗以除去材料內的痕量汙染物，使材料表面活化，還絲素蛋白固有的本色，最後使材料表面上耦合促進細胞生長的細胞生長因子，創造適宜於細胞在材料表面上生長的優化的環境。其特徵在於(1)所說的用活性水進行深層清洗是指在超聲波和能自動發射遠紅外的電氣石的存在下，用一種PH＝7.4，締合度為6～8的小分子團的水清洗，利用活性水高滲透高淨化特性將絲蛋白的材料內的痕量汙染物予以清除，提高材料表面胺基酸「活性」，還絲素蛋白材料固有的本質；其中電氣石作用在於使活性水始終保持PH＝7.4，締合度為6～8的小分子態，超聲波的作用除了能使水保持小分子團尺度外，主要在於藉助超聲波的能量加速清洗速度，提高清洗效率；(2)所說的使材料表面耦合促進細胞生長的物質，是指通過材料表面上鹼性胺基酸基團和促進細胞生長物質上的酸性基團之間作用進行自動耦合，其中所說的促進細胞生長物質是指酸性成纖維細胞生長因子(簡稱為aFGF)或表皮細胞生長因子(簡稱為EGF)中的一種，用雙蒸水配製成濃度為20～200ng/ml的溶液，在無菌條件下，將絲素蛋白的材料浸漬其中8～24小時，使材料表面上自動耦合有促進細胞生長的物質。
全文摘要
本發明公開了一種醫用絲素蛋白材料的表面處理方法，首先通過一定條件下的深層次清洗，消除材料上的痕量汙染，恢復絲素蛋白固有的本色，然後通過在材料表面耦合促進細胞生長的細胞生長因子，使材料表面含有細胞生長因子，從而大大提高和改善了材料表面與機體組織之間親和性，創造了細胞在材料表面上生長增殖的優越環境，使機體組織與材料很快的融為一體，有力地推動了製備生物材料工程的進步。
文檔編號A61L29/16GK1651101SQ20041008935
公開日2005年8月10日 申請日期2004年12月10日 優先權日2004年12月10日
發明者徐殿勝, 陸兵, 夏傑, 謝菁 申請人:華東理工大學