使用合成氣的多級合成方法

2023-04-25 02:58:36

使用合成氣的多級合成方法
【專利摘要】本發明提供了一種製備烴的方法，所述烴被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代，所述方法包括以下方法步驟：A)使包含至少一種選自CO2和CO的物質的碳源與第一種微生物反應，以產生乙酸鹽和/或乙醇，B)從所述第一種微生物分離出所述乙酸鹽，C)使所述乙酸鹽與第二種微生物反應，以產生被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代的烴，和任選地D)純化所述被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代的烴。
【專利說明】使用合成氣的多級合成方法發明領域
[0001]本發明的主題是製備烴的方法，所述烴被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代，所述方法包括以下方法步驟:
A)用第一種微生物將碳源轉化成乙酸鹽和/或乙醇，所述碳源包含選自CO2和CO的至少一種，
B)將所述第一種微生物與所述乙酸鹽和/或乙醇分離，
C)用第二種微生物將所述乙酸鹽和/或乙醇轉化成烴，所述烴被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代，和任選地
D)純化所述被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代的烴。

【背景技術】
[0002]在文獻中經常描述CO2作為碳源在以微生物方法合成有機化合物中的用途。
[0003]通常，在現有技術中嘗試在重組細胞中構建得自不同生物體的2個互補代謝途徑，然後可以在其幫助下合成有機物質。
[0004]在這裡產生的問題是，意在將其性能組合在一起的不同生物體是生態位中非常高特異性化的生物，且因此難以將與其有關的所有優點的總和合併在一個細胞中。另外，這些生物體的遺傳可達性的缺乏會給所希望的操作造成困難。
[0005]使用CO2作為碳源的替代方法通過發酵參數的某種選擇影響已知能夠固定CO2的微生物，使得所述微生物增加合成所希望的、簡單的有機物質，例如，乙醇、正丁醇或2，3-丁二醇。
[0006]W0200068407描述了產乙酸細菌在乙醇製備中的用途，W02012024522描述了產乙酸細菌在丁二醇製備中的用途。
[0007]所有描述的方法具有以下缺點:收率低，並且單一細胞類型的使用不能實現發酵條件下的靈活性。
[0008]本發明的目的是，提供能夠克服現有技術的至少一種缺點的方法。


【發明內容】

[0009]已經令人驚奇地發現，下面描述的具有將乙酸鹽-繼續加工的乙酸鹽-產物與CO2和/或CO分離的多級方法能夠以最簡單的方式克服現有技術的缺點。
[0010]因此，本發明提供了如權利要求1和其它獨立權利要求中描述的方法。
[0011]本發明的一個優點是，co2/co混合物是基本上更有利的原料，其此外可以由多種來源，諸如天然氣和生物氣、煤、油、以及植物殘餘物製備。
[0012]本發明的方法的另一個優點是高碳收率。這可通過返回所形成的CO2實現。因為，CO2可以在第一級中再次轉化成乙酸。
[0013]另一個優點在於，在使用的發酵條件方面的更大的靈活性，因為對於根據本發明的方法步驟C)中的實際生產而言，在乙酸鹽加工中使用的生物不同於用於碳固定的生物。
[0014]本發明的再一個優點是，與在方法步驟C)中使用糖相比，通過在方法步驟C)中使用乙酸鹽和/或乙醇、特別是乙酸鹽作為碳源，可以產生不同的產物組合物。
[0015]本發明提供了一種製備烴的方法，所述烴被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代，所述方法包括以下方法步驟:
A)用第一種微生物將碳源轉化成乙酸鹽和/或乙醇，尤其是乙酸鹽，所述碳源包含選自CO2和CO的至少一種，
B)將所述第一種微生物與所述乙酸鹽和/或乙醇分離，尤其是乙酸鹽，
C)用第二種微生物將所述乙酸鹽和/或乙醇，尤其是乙酸鹽，轉化成烴，所述烴被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代，和任選地
D)純化所述烴，其被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代，優選具有至少3個、尤其是至少4個碳原子。
[0016]在本發明的上下文中，術語「乙酸鹽」應當理解為是指乙酸以及它的鹽；這是必然得出的，因為微生物在水性介質中工作，並因此總是存在鹽和酸之間的平衡。
[0017]在本發明的上下文中，術語「第二種微生物」應當理解為是指與得自方法步驟A)的「第一種微生物」不同的微生物。
[0018]除非另外說明，所有給出的百分比(%)都是質量百分比。
[0019]在根據本發明的方法中，在方法步驟A)中，第一種微生物由包含二氧化碳和/或一氧化碳的碳源形成乙酸鹽和/或乙醇；該表述包含乙酸鹽和/或乙醇至少部分地由二氧化碳和/或一氧化碳形成。
[0020]關於底物二氧化碳和/或一氧化碳的來源，顯而易見，存在許多可能的來源用於提供CO和/或CO2作為碳源。顯然，在實踐中，可以使用能夠給微生物供應足量的碳以使它們能形成乙酸鹽和/或乙醇的任何氣體或任何氣體混合物均可用作本發明的碳源。
[0021]在根據本發明的方法中，優選的是，通過廢氣例如合成氣、煙道氣、煉油廠廢氣，通過酵母發酵或梭菌發酵形成的氣體，由含纖維素的材料的氣化或碳氣化產生的廢氣提供所述碳源。
[0022]在這方面，特別優選的是，至少部分二氧化碳和/或一氧化碳是根據本發明的方法的方法步驟C)的副產物。這具有以下技術效果:整個方法的碳收率是100%。
[0023]這些廢氣不必必然作為其他工藝的副產物(Nebenerscheinung)而產生,而是可以用在根據本發明的方法中而專門生產。
[0024]在根據本發明的方法的一個優選的實施方案中，所述碳源是合成氣。
[0025]合成氣可以例如由碳氣化的副產物提供。因此，該微生物將作為廢物產物的物質轉化成有價值的原料。
[0026]可替換地，合成氣可以通過氣化廣泛可提供的、價格便宜的農業原料提供給根據本發明的方法。
[0027]可以被轉化成合成氣的原料存在眾多例子，因為幾乎所有形式的植物都可以用於該目的。優選的原料選自多年生的草諸如中國蘆葦(Chinaschilf )，穀類殘餘物，加工廢物諸如鋸屑。
[0028]一般而言，合成氣在氣化設備中由乾燥的生物質製得，主要通過熱解、部分氧化和蒸汽重整，由此主要產物是CO、H2和C02。
[0029]通常，預加工部分產物氣體，以優化產物收率和避免焦油形成。可使用石灰和/或白雲石將不希望的焦油裂化成合成氣和CO。這些方法詳細地描述在例如Reed，1981(Reed, T.B., 1981，B1mass gasificat1n: principles and technology, Noves DataCorporat1n, Park Ridge, NJ.)中。
[0030]也可能使用不同來源的混合物作為碳源。
[0031]一般而言，在根據本發明的方法中優選的是，在方法步驟A)中的碳源包含至少50重量％、優選地至少70重量％、特別優選地至少90重量％的CO2和/或CO，其中重量％基於在方法步驟A)中微生物可利用的所有碳源計。
[0032]在方法步驟A)中，優選地與二氧化碳和/或一氧化碳一起向反應輸送還原劑，優選氫。
[0033]因此，根據本發明優選的方法的特徵在於，在方法步驟A)中的碳源包含合成氣，尤其是由合成氣組成。
[0034]長久以來已知將CO2和/或CO轉化成乙酸鹽和/或乙醇、尤其是乙酸鹽的微生物，以及在方法步驟A)中可以使用的合適方法和工藝條件。這樣的方法描述在例如以下文獻中:
W09800558，W02000014052，W02010115054
Demler 等人.React1n engineering analysis of hydrogenotrophic product1nof acetic acid by Acetobacterium woodi1.B1technol B1eng.2011 年 2 月；108(2): 470-4，
Younesia 等人.Ethanol and acetate product1n from synthesis gas viafermen ta ti on processes using anaerobi c bac teri um， Cl os tri di um I jungdahli 1.B1chemical Engineering Journal,第 27 卷，第 2 期，第 110-119 頁，
Morinaga 等人.The product1n of acetic acid from carbon d1xide andhydrogen by an anaerobic bacterium.Journal of B1technology,第 14 卷，第 2期，第 187-194 頁，
Li Product1n of acetic acid from synthesis gas with mixed acetogenicmicroorganisms, ISSN 0493644938，
Schmidt.Product1n of acetic acid from hydrogen and carbon d1xideby clostridium species ATCC 2979.Chemical Engineering Communicat1ns, 45:1-6，61-73，
Sim 等人.0ptimizat1n of ace tic acid product1n from synthesis gasby chemolithotrophic bacterium Cl ostri di um aceticum using a statisticalapproach.B1resour Technol.2008 May; 99 (8):2724-35，
Vega 等人.Study of gaseous substrate fermentat1ns CO convers1nto acetate I Batch culture and 2 continuous culture.B1technology andB1engineering 第 34 卷，第 6 期，第 774 和 785 頁，1989 年 9 月，
Cotter 等人.Ethanol and ace ta te produc ti on by Cl os tri di um I jungdahli iandCl os tri di um au toe thanogenumusing resting cells.B1process and B1systemsEngineering (2009)， 32(3)， 369-380，和 Andreesen 等人.Fermentat1n of glucose， fructose， and xylose byClostridium thermoace ti cum.Effect of metals on growth yield， enzymes， andthe synthesis of acetate from carbon d1xide.Journal of Bacter1logy (1973)，114(2)，743-51 o
[0035]由此給本領域技術人員提供了大量用於設計方法步驟A)的可行的可能性，它們都良好地起作用。
[0036]在這方面，特別適合的是產乙酸細菌。產乙酸細菌群體屬於厭氧性的原核生物，其可以利用CO2作為末端電子受體，並在該過程中形成乙酸鹽和/或乙醇。目前，在產乙酸菌中包括21個不同屬(Drake等人，2006)，其中一些也是梭狀芽胞桿菌(Drake和KUseI，2005)。它們能夠利用二氧化碳或者一氧化碳作為碳源，並利用氫作為能源(Wood，1991)。另外，醇、醛、羧酸和眾多己糖也可以用作碳源(Drake等人，2004)。導致乙酸鹽形成的還原代謝途徑被稱作乙醯輔酶A途徑或Wood-Ljungdahl途徑。
[0037]因此，優選的是，在根據本發明的方法的方法步驟A)中，使用產乙酸細菌作為第一種微生物。特別優選的是，使用選自以下的產乙酸細菌:autothenogenumDSMZ 19630、拉氏梭舊{Clostridium ragsdahlei ) ATCC n0.BAA-622^ 產乙醇梭菌{Clostridium au toe thanogenum) Λ 穆爾氏菌屬 iMoorella sp、HUC22-1、熱醋穆爾氏M (Moorella thermoace ti cum ) Λ 熱自養穆爾氏葡^ Moorella thermoau to trophi ca)^Rumicoccus productus、Acetoanaerobum、普氏產醋杆 M 1xobacter pfennig!i 巴氏甲焼八疊球菌Qiethanosarcina barker i )、嗷乙酸甲焼八疊球菌(Methanosarcinaace ti vorans )、氧化碳 P耆熱菌屬(Carboxydo thermus )、Desulpho tomaculum ku tzne tso vi1、熱球菌屬QPyrococcus、、消化鏈球菌屬iPeptostreptococcus')、食甲基丁酸桿菌(Bu tyri bac teri um me thy1 trophi cum ) A TCC 33266、蟻酸醋酸梭 HClostridiumformi coace ti cum ) Λ 酷酸梭鬼{Clostridium bu tyri cum) ^ Laktobacillus delbruki1、Propi oni bac teri um aci doprpri oni c1、Propri oni spera arbor i s、Anaerobi erspiri Humsucciniproducens、Bac ter1ides amylophiIus、Bec ter1ides ruminicola、凱伍熱厭氧桿菌(Thermcmrmerobac ter ki vui )、伍氏醋酸桿菌 tobac teri um woodi i )、潮溼厭氧醋酸菌iAcetoanaerobium醋酸梭菌{Clostridium食甲基丁酸桿菌(Bu tyri bac teri um me thylo trophi cum)、熱醋穆爾氏菌 iMoorella thermoace ti m )、產粘真桿菌 QEubac teri um Iimosum )、產生消化鏈球菌 iPep tos trep tococcus produc tus )、揚氏梭菌 iClostridium IJungdahlii )、梭菌屬 iClostridium、ATCC 29797 和食一氧化碳梭菌{Clostridium car box i di vorans ),尤其是 ATCC BAA-624。一種特別合適的細菌是食一氧化碳梭菌，尤其是諸如「P7」和「P11」等菌株。這樣的細胞描述在例如US 2007/0275447和US 2008/0057554 中。
[0038]另外的特別合適的細菌是揚氏梭菌I jungdahli P)，尤其是選自揚氏梭菌PETC、揚氏梭菌ERI2、揚氏梭菌COl和揚氏梭菌0-52的菌株，這些描述在WO98/00558 和 WO 00/68407 中，以及 ATCC 49587、ATCC 55988 和 ATCC 55989。
[0039]在根據本發明的方法的一個特別優選的實施方案中，在方法步驟A)中，形成乙醇，且使用的微生物是bacchi ATCC BAA-1772、穆爾氏菌屬HUC22-1、揚氏梭菌、拉氏梭菌或產乙醇梭菌。關於實施方法步驟A)的相應指導可以參見例如:
Saxena 等人.Effect of trace metals on ethanol produc ti on from synthesisgas by the ethanologenic acetogen Cl ostri di um ragsdale1.Journal of IndustrialMicrob1logy & B1technology Volume 38, Number 4 (2011), 513-521，
Younesi 等人.Ethanol and acetate product1n from synthesis gas viafermentat1n processes using anaerobic bacterium Cl os tridi um Ijungdahli1.B1chemical Engineering Journal Volume 27, Issue 2, 2005 年 12 月 15 日， 第110-119 頁，
Sakai 等人.Ethanol produc ti on from H2 and C02 by a newly iso la tedthermophilic bacterium, Moorella sp.HUC22-1.B1technology Letters Volume 26,Number 20 (2004)， 1607-1612，和
Abrini 等人.Cl os tri di um autoe thanogenum, sp.nov., an anaerobi c bac teri umthat produces ethanol from carbon monoxide.Archives of Microb1logy Volume161， Number 4 (1994)， 345-351。
[0040]方法步驟A)優選地在厭氧條件下進行。
[0041]在根據本發明的方法的方法步驟B)中，將在方法步驟A)中形成的乙酸鹽和/或乙醇，尤其是乙酸鹽與所述第一種微生物分離。
[0042]在最簡單的情況中，例如通過已知方法諸如沉降、離心或過濾，將微生物作為固體從包含乙酸鹽和/或乙醇、尤其是乙酸鹽的培養基中除去，並任選地將剩餘的液相直接供入方法步驟C)。所述直接供入具有以下優點:得自方法步驟A)的還另外包含的培養基組分(例如，維生素、痕量元素或誘導物)在方法步驟C)中同樣供第二種微生物利用，並因此是優選的。在這方面，在供入到方法步驟C)之前，提高乙酸鹽和/或乙醇、尤其是乙酸鹽的濃度(例如通過除去至少一部分存在的水)可能是有利的且因此是優選的。
[0043]同樣地，藉助於萃取，尤其是藉助於原位萃取，可以由方法步驟A)中的微生物除去乙酸鹽本身。合適的萃取方法是本領域技術人員已知的，因而例如得自:EP2294206，W02000014052, US 4405717, Katikaneni 等人.Purificat1n of Fermentat1n-DerivedAcetic Acid By Liquid-Liquid Extract1n and Es teri fica ti on.1nd.Eng.Chem.Res.2002, 41, 2745-2752,和 Huh 等人.Selective extract1n of acetic acid from thefermen ta ti on broth produced by Mannheimia succini ciproducens.B1technol Lett.2004 Oct; 26(20):1581-4。
[0044]合適的萃取劑描述在例如W02000014052的第8-17頁的第A點The modifiedsolvent and solvent/co-solvent mixture (改進的溶劑和溶劑/共溶劑混合物)下面。
[0045]在通過萃取分離乙酸鹽的情況中，優選包含特別是烷基胺或低沸點溶劑諸如MTBE或乙酸乙酯作為萃取劑，其中所述烷基胺優選是具有至少16個碳原子的那些，優選是三烷基胺，且特別優選是選自三己胺、三辛胺(Tr1ctylamin)、三癸胺、三辛基胺(Tricaprylamin)、三-十二烷基胺的三烷基胺。這些包含三烷基胺的萃取劑優選地與原位萃取結合用在方法步驟B)中。這具有第一種微生物不受損傷的技術效果和可以在反向流方法中進行方法步驟B)的額外優點，這是另外優選的。
[0046]作為在方法步驟B)中使用的萃取劑尤其使用三辛胺和2-乙基-1-己醇的混合物，在此這些優選地以相同量使用。
[0047]關於詳細的方法說明，可以參考EP2294206和那裡描述的方法步驟A)和B)。
[0048]在方法步驟C)中，用第二種微生物將所述乙酸鹽和/或乙醇、尤其是乙酸鹽轉化成烴，所述烴被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代。
[0049]所述被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代的烴優選是羧酸、二羧酸、羥基羧酸、羧酸酯、羥基羧酸酯、醇、醛、酮，其尤其具有4-32個、優選6-20個、特別優選8-12個碳原子。特別優選的是羧酸、羥基羧酸和羧酸酯。
[0050]所述第二種微生物優選是酵母或細菌。
[0051]所述第二種微生物優選是遺傳修飾的菌株，其尤其已經在遺傳上優化了被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代的烴的收率。
[0052]本領域技術人員由現有技術知曉適合用於各自的靶分子的第二種微生物和要使用的工藝條件。
[0053]如，
W02011127409、W02009111672和W02010062480描述了合適的第二種微生物和用於製備脂肪醇的方法，
W02012017083描述了脂肪酸乙酯的製備，
W02011157848、W02011059745、W0 2009140695,W02007106903 和 W02009124694 描述了脂肪酸的製備，
W02010126891描述了醇、脂肪酸和脂肪酸酯的製備，
W02010118410、W02010021711 和 W02010022090 描述了脂肪酸酯的製備、 W02010042664和WO 2009140695描述了脂肪酸醛的製備，
W02012038390, W02007077568 和 W02011153317 描述了二羧酸的製備，和W02011008232、WO 2009156214、W02007141208、W02004003213、GB2473755 和EP11191923.9描述了羥基羧酸的製備。
[0054]在根據本發明的方法的一種優選替代方法中，所述被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代的烴是脂肪酸，尤其是具有4-32個、優選6-20個、特別優選8-12個碳原子的直鏈飽和脂肪酸。在這種情況中，所述第二種微生物具體地是這樣的微生物:其與它的野生型相比具有增加的至少一種硫酯酶的活性。術語「與它的野生型相比增加的活性」應當理解為是指:所述微生物已經經過遺傳修飾，使得它具有該增加的活性。優選地，這被理解為是指硫酯酶的過表達或外源硫酯酶的表達。在這方面優選的硫酯酶選自醯基-ACP-硫酯酶，優選 EC 3.1.2.14 或 EC 3.1.2.22 或醯基輔酶 A-硫酯酶，優選 EC 3.1.2.2,EC 3.1.2.18、EC 3.1.2.19、EC 3.1.2.20或EC 3.1.2.22。在根據本發明的替代方法中使用的優選的第二種微生物公開於 W02010118410、W02010075483、W02008119082 和 W02007136762 中，明確地參考這些文件中關於這些微生物和關於這些硫酯酶的公開內容。
[0055]在根據本發明的方法的一個特別優選的實施方案中，所述脂肪酸是辛酸和/或癸酸，且所述硫酯酶是得自萼距花(CopAea hookeriana)的/ai似的基因產物。
[0056]在根據本發明的方法的一種優選替代方法中，所述被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代的烴是羥基羧酸、尤其是ω-羥基羧酸，或羥基異丁酸、尤其是3-羥基異丁酸。在涉及羥基異丁酸的情況中，所述第二種微生物尤其是在W02009156214、W02007141208、W02009135074和ΕΡ11191923.9中公開的微生物，明確地參考這些文件中關於這方面的公開內容。在涉及ω-羥基羧酸的情況中，所述第二種微生物尤其是在W02011008232中公開的微生物，明確地參考該文件中關於這方面的公開內容。
[0057]根據本發明優選的是，將在方法步驟C)中產生的二氧化碳返回至方法步驟Α)中的方法中，並因此用作碳源。這具有碳收率為100%的技術效果。
[0058]下面列出的實施例示例性描述本發明，沒有任何意圖將由整個說明書和權利要求書中給出的本發明、其應用範圍限制於在實施例中提及的實施方式。
[0059]下述附圖是實施例的組成部分:
圖1:在大腸桿菌(萬.co7i)中由乙酸鹽生產脂肪酸，所述乙酸鹽由微生物由合成氣製備。
實施例
[0060]實施例1:方法步驟A)乙酸鹽.和乙醇形成
將食一氧化碳梭菌DSMZ 15243的活培養物裝入I I厭氧瓶中，每瓶含有200 ml根據Hurst由I g酵母浸出物、19 g MES,30 ml礦物鹽溶液、10 ml痕量元素溶液、10 ml維生素溶液在I I雙蒸餾水中組成的改良PETC培養基。用0.5 M NaOH將pH調至pH 5.9。每升礦物鹽溶液由80 g氯化鈉、100 g氯化銨、10 g氯化鉀、10 g磷酸氫二鉀、20 g硫酸鎂、4 g氯化鈣組成。每升維生素溶液由0.01 g吡多辛、0.005 g硫胺素、0.005 g核黃素、0.005 g泛酸鈣、0.005 g硫辛酸、0.005 g (對)氨基苯甲酸、0.005 g煙酸、0.005 g維生素B12、
0.002 g生物素、0.002 g葉酸、0.01 g美司鈉組成。每升痕量元素溶液由2 g次氮基乙酸、I g硫酸錳、0.8 g硫酸鐵銨、0.2 g氯化鈷、0.2 g硫酸鋅、0.02 g氯化銅(II)、0.02 g氯化鎳、0.02 g鑰酸鈉、0.02 g硒酸鈉、0.02 g鎢酸鈉組成。
[0061]將培養基煮沸20 min，然後用純氮氣通氣20 min。然後將它在121°C高壓滅菌20分鐘。冷卻後，將培養基用50%C0、45%H2和5%C02的氣體混合物供氣3次，直到I巴的過壓。然後將壓力調至0.8巴的過壓。在即將接種之前，在無菌厭氧條件下，在每種情況下加入
1.5 ml的4%的亞硫酸鈉/半胱氨酸鹽酸鹽溶液作為還原劑。
[0062]將培養物在100 upm(5 cm離心率)下在37°C培養。在每種情況下，在72小時以後，通過接種將培養物轉移至新培養基。
[0063]由這樣的48 h齡培養物取出用於產物製備的接種物。
[0064]為此，給2 I攪拌容器(得自Infors HT的Labfos 2)裝入900 ml上述的改良PETC培養基(不包括美司鈉，不含維生素溶液)，並用氮氣通氣20分鐘。然後將容器在121°C高壓滅菌20分鐘。然後在無菌厭氧條件下加入維生素溶液。
[0065]在整個發酵過程中，用0.5 M NaOH和0.5 M HCl將pH調在5.9。
[0066]使用得自Westphal Mess- und Regeltechnik的WMR 4000氣體混合站，將氣體混合物調至80%C0和20%C02。恆定地以5 Ι/h進行通氣。
[0067]將攪拌器速度設定在恆定的400 rpm,其相當於0.2 W/1的功率輸入。
[0068]在即將接種之前，在無菌厭氧條件下，在每種情況下加入7.5 ml的4%的亞硫酸鈉/半胱氨酸鹽酸鹽溶液作為還原劑。
[0069]接種物為10%，並且同樣在無菌厭氧條件下在氣化開始以後30分鐘加入。起始OD60tl 為 0.055。
[0070]在0/14.4/16.8/20.8/24.2/38.7 h以後，使用注射器經由立管抽出3 ml樣品。
[0071]通過高效液相色譜法(HPLC)，確定乙酸、乙醇、丁酸和丁醇的濃度。使用柱AminexHPX-87H作為固定相。使用的洗脫液是5 mM硫酸，恆定流速為0.6 ml/min。柱的溫度為40°C。藉助於折射率檢測器進行乙醇和丁醇的檢測，並使用二極體陣列檢測器在210 nm的波長下檢測乙酸和丁酸。藉助確定濃度的校準直線，經由峰面積確定物質濃度。
[0072]38.7小時以後，測得O mM 丁醇、1.42 mM 丁酸鹽、3.33 mM乙醇和54.26 mM乙酸鹽。這相當於91.95%的乙酸鹽比例。
[0073]實施例2:方法步驟B)乙酸鹽.分離
分離細胞以後，通過加入乙酸，將發酵液的PH降至低於3.0的pH。然後將三正辛基胺在1-辛醇中的溶液(比率為1:1)加入發酵液中，並在25°C在至少1000 rpm的攪拌器速度下與發酵液一起混合最多2小時。隨後通過離心進行相分離。然後在120°C和500毫巴的過壓下由有機相中蒸餾出乙酸。通過HPLC確定餾出液的乙酸含量，並將該溶液以對應的濃度用在進一步發酵中(參見實施例3和4和6)。
[0074]實施例3:在重組大腸桿菌中將乙酸鹽.轉化成C8和ClO脂肪酸
用接種針將大腸桿菌菌株JW5020-1 (AfadEK可得自Yale CGSC, The Coli GeneticStock Center)由冷凍培養物劃線到LB瓊脂平板(pH 7)上，所述LB瓊脂平板由5 g酵母浸出物、10 g蛋白腖、0.5 g氯化鈉和15 g瓊脂組成。用接種針將大腸桿菌菌株JW5020-1(AfadE) pJ294 [Ptac_ChFATB2_optEc]由冷凍培養物劃線到LB平板上，所述LB平板另外包含100 mg/ml氨節西林。將平板在37°C溫育過夜。
[0075]用得自萼距花的基因/ai似的表達載體轉化大腸桿菌菌株JW5020-1 (AfadE)PJ294 [Ptac-ChFATB2_optEc] 0為了生產前述載體，對在大腸桿菌中用於該表達的基因進行密碼子優化。將該基因與tec啟動子一起合成，並且同時插入在啟動子上遊的限制位點和在終止子下遊的限制位點。將合成的DNA片段Pta。-似(SEQ ID N0.1)用限制性內切核酸酶及麗TI和AfoiI消化，並連接進對應地切割的載體pJ294 (DNA2.0 Inc., MenloPark, CA, USA)中。完成的大腸桿菌表達載體被稱作pJ294 [Ptac_ChFATB2_optEc] (SEQID N0.2)。
[0076]預培養1:將兩種培養物分別轉移接種在位於100 ml帶擋板的搖瓶中的10 ml M9mod-G液體培養基中。所述M9 mod_G培養基由溶解在800 ml M9緩衝液和150 ml ddH20中的 2.6 g/1 (NH4)2SO4'0.49 g/1 MgS04+7H20、20 g/1 葡萄糖、I ml/1 痕量元素 US3 組成。所述 M9 緩衝液由溶解在 800 ml ddH20 中的 6.79 g/1 Na2HP02+2H20、3 g/1 KH2PO4'0.5 g/1NaCl,2 g/1 NH4Cl組成。對於攜帶質粒的菌株，將lOOPg/ml氨苄西林加入培養基中。
[0077]在每種情況下，使用接種針將一滿環的細胞材料從平板轉移至相應的液體培養基中。
[0078]將培養物在37°C和200 rpm溫育過夜。
[0079]20小時以後，OD為:
大腸桿菌 JW5020-1 ( Δ fadE)10.6
大腸桿菌 JW5020-1 (AfadE) pJ294 [Ptac_ChFATB2_optEc] 12.8。
[0080]預培養2
將得自預培養I的0.5 ml轉移接種在位於100 ml帶擋板的搖瓶中的20 ml M9，mod-G中。所述M9，mod-G培養基由溶解在800 ml M9緩衝液和170 ml ddH20中的2.6 g/I (NH4)2S04、0.49 g/1 MgS04+7H20、60 mM 醋酸鈉(得自實施例 2)、1 ml/1 痕量元素 US3 組成。對於攜帶質粒的菌株的培養，加入lOOPg/ml氨節西林。
[0081]將培養物在37°C和200 rpm溫育過夜。
[0082]預培養2的OD為大腸桿菌JW5020-1 ( Δ fadE) /乙酸鹽2.5
大腸桿菌 JW5020-1 (AfadE) pJ294 [Ptac_ChFATB2_optEc] / 乙酸鹽1.75
給1000 ml帶擋板的搖瓶中的100 ml改良的M9液體培養基(含有60 mM乙酸鹽/菌株)接種所述預培養物，由此得到0.2的0D。
[0083]在37°C和225 rpm下溫育該培養物。
[0084]在約0.5的OD6tltl下，用I mM IPTG (得自IM IPTG的原液)進行誘導。
[0085]為取樣，在每種情況下，無菌取出4 ml細胞混懸液，確定0D，並將剩餘的混懸液在15 ml falcon試管中在-80°C儲存，直到對樣品進行後處理。
[0086]脂肪酸的定量在衍生化為脂肪酸甲酯後藉助於氣相色譜法進行。在加入I ml丙酮和2 ml水之後，將50μ1十七烷酸(10 g/Ι，溶解在乙醇中)作為內部參比物加入由2 ml培養液組成的樣品中。將樣品用200μ1乙酸酸化，並與10 ml的1:1 (v/v)氯仿/甲醇混合物混合。將樣品劇烈混合至少I min。然後將氯仿相取出和蒸發。將乾燥的殘餘物溶解於Iml的1.25 M鹽酸的甲醇溶液中，並在50°C溫育過夜，以酯化所含脂肪酸。通過加入5 ml飽和碳酸鈉溶液停止反應(所有物質得自Sigma-Aldrich, Steinheim)。通過加入I ml正庚烷並劇烈混合15秒，萃取脂肪酸甲酯。藉助於氣相色譜法測量將庚烷相。為了分離脂肪酸甲酯，使用毛細管柱SP?-2560 (Supelco, Sigma-Aldrich, Steinheim)作為固定相,所述SP?-2560具有100 m X 0.25 mm的尺寸和0.2Mm的膜厚度。使用的載體氣體為氦氣。歷時45 min進行分離，在開始時為260°C的注射器溫度、260°C的檢測器溫度和140°C的柱溫度，保持5 min，並以4°C /min的速率增加至240°C並保持15 min。注射體積為?μ?，分裂率為1:20，載體氣體的流通量為I ml/min。藉助於火焰離子化檢測器(GC Perkin Elmer Clarus500, Perkin Elmer, Rodgau)進行檢測。使用十七燒酸(Sigma-Aldrich, Steinheim)作為用於定量脂肪酸甲酯的內部參比物。將參比物C8:0-Me辛酸甲酯、C10:0-Me癸酸甲酯、C12:0-Me月桂酸甲酯、C14:0-Me肉豆蘧酸甲酯、C16:0-Me棕櫚酸甲酯、C16:1-Me棕櫚油酸甲酉旨、C18:0-Me 硬脂酸甲酯、C18:l-Me 油酸甲酯(GLC Standard Mix GLC-20 1892-1AMP,GLC-30 1893-1AMP, GLC-50 1894-1AMP, Sigma-Aldrich, Steinheim)用於校準。所有脂肪酸甲酯的測定限度是10 mg/1的濃度。
[0087]96 小時以後，大腸桿菌 JW5020-1 (AfadE) pJ294[Ptac_ChFATB2_optEc]的脂肪酸濃度的分布表現出標準化至I的0D，如在圖1中所示。
[0088]實施4列 4:用角軍H旨耳B氏酵母(Yarrowia lipolytica)H222-41 A 3HIBDH (ura) ~8 >1#乙酸鹽轉化成3-羥基異丁酸(3-HIB)
根據EP 11191923.9的實施例1，第1_3點，合成了具有減弱的3-羥基異丁酸脫氫酶活性的解脂耶氏酵母細胞H222-41 ;該細胞在下文中被稱作H222-41 Δ 3HIBDH (ura)-8。
[0089]與對應的野生型H222_41 (ura)-8 相比，培養 H222_41A3HIBDH (ura)-8。
[0090]培養將兩種菌株用接種針由冷凍培養物無菌劃線到YEro瓊脂平板上。所述YEro瓊脂平板由10 g葡萄糖、10 g酵母浸出物、20 g蛋白腖和15 g瓊脂組成。pH是5.4。在25°C溫育80小時。
[0091]預培養(生物質生產)
給6個1000 ml無擋板的搖瓶裝入100 ml由葡萄糖、10 g酵母浸出物、20 g蛋白腖組成的YEH)液體培養基(pH 5.4)。向每個搖瓶中加入3滴Delmex消泡劑。
[0092]每種菌株各接種轉移3個搖瓶，在每種情況下，用接種針無菌接種轉移2滿環的對應的YEro瓊脂平板的細胞材料。在28°C和180 rpm(振幅2.5 cm)下，將搖瓶溫育20小時。
[0093]用於乙酸鹽培養的接種物的製備
20小時以後，將3個含有解脂耶氏酵母H222-41 Δ 3HIBDH (ura) -8和解脂耶氏酵母H222-41 (ura)_8 的搖瓶合併。使用得自 KREIENBAUM Wissenschaftiche MeBsystemee.K.的多參數生物分析體系YSI 7100確定葡萄糖含量，為O g/Ι。將所述液體培養基分Λ 50 ml falcon試管中，並在5600 rpm下離心10分鐘。拋棄上清液,並將沉澱物再懸浮於0.9%的NaCl溶液中，並再次在5600 rpm下離心10分鐘。將該操作重複另外2次，以除去可能的殘餘糖。然後，在每種情況下將沉澱物再懸浮於15 ml乙酸鹽培養基中，並根據菌株合併培養物，並且在每種情況下用乙酸鹽培養基補充至50 ml ο
[0094]根據van Uden的乙酸鹽培養基具有下述組成:
基礎培養基
5 g/1 (NH4)2SO4, 5 g/1 KH2PO4, 0.5 g/1 MgSO4 x 7 H2O, 0.15 g/1 CaCl2 x 2 H2O,4 g/1乙酸鈉(得自實施例2)，5 ml/1維生素溶液，5 ml/1生物素溶液，5 ml/1痕量元素溶液A, 5 ml/1痕量元素溶液B。
[0095]維生素溶液
80 mg/100 ml 泛酸?丐，200 mg/100 ml 肌醇，160 mg/100 ml 煙酸，160 mg/100 ml鹽酸批B多醇，16 mg/100 ml鹽酸硫胺素。
[0096]生物素溶液生物素8 mg/1。
[0097]痕量元素溶液A
100 mg/100 ml H3BO3, 20 mg/100 ml ΚΙ, 40 mg/100 ml NaMoO4 x 2 H2O0
[0098]痕量元素溶液B
8 mg/100 ml CuSO4 x 5 H2O, 40 mg/100 ml FeCl8 x 6 H2O, 80 mg/100 ml MnSO4 x4 H2O, ZnSO4 X 7 H2O 0.001 N HCl。
[0099]將基礎培養基的固體組分溶解在700 ml ddH20中，將pH調至5.4，並將培養基高壓滅菌。將溶液無菌過濾，並在冷卻後加入到基礎培養基中，然後用無菌ddH20將總培養基補至 1000 ml ο
[0100]調節發酵罐
給得自DASGIP的平行發酵系統的4個800 ml無菌發酵罐裝入175 ml乙酸鹽培養基。將工藝條件設置為30 p02 [%]、14 sl/h空氣流、400-1500 rpm攪拌器速度、28°C溫度和pH5.4。用0.5%H2S04或25%乙酸和12.5%NH40H調節pH。使用的補料使用14%的乙酸鈉溶液，pH 5.4。
[0101]3-HIB 的生產
給每2個發酵罐接種25 ml接種物解脂耶氏酵母H222-41 A3HIBDH (ura)-8和解脂耶氏酵母 H222-41 (ura)-8。
[0102]在接種後0、3、5、21、30和46小時進行取樣。對於所有樣品，用得自R-B1pharm的Analytical Test KU，測定0D600和乙酸鹽含量。使補料適應乙酸鹽消耗。
[0103]對於在O和46小時的樣品，另外用D2O作為溶劑進行NMR測定，並進行乙酸鹽和3HIB的水抑制。
[0104]結果
OD在實驗期間由平均10增加至平均45。
[0105]在開始時，乙酸鹽含量為平均2250 mg/kg，在發酵結束時為32 mg/1。
[0106]對於解脂耶氏酵母H222-41 A3HIBDH (ura)_8和解脂耶氏酵母H222-41 (ura) -8,在發酵開始時的3HIB含量為O mg/1。
[0107]46小時以後，對於野生型解脂耶氏酵母H222-41 (ura)_8，測得O mg/kg。
[0108]具有3-HIB脫氫酶敲除的解脂耶氏酵母菌株H222-41 A3HIBDH (ura)_8已經產生了平均 18 mg/kg 3HIB。
[0109]實施例5:方法步驟B)乙醇分離
通過直接蒸餾得自實施例1的發酵液，以水性濃縮物的形式分離出乙醇。
[0110]實施例6:用厭氧細菌克魯佛梭菌(Clostridium kluyveri)將乙酸鹽和乙醇轉化成己酸和己酸乙酯
為進行培養，使用耐壓玻璃瓶，其可以用丁基橡膠塞氣密密封。所有培養步驟在厭氧條件下進行。將瓶子在121°C高壓滅菌20 min,以確保無菌。
[0111]對於培養物，給4個耐壓玻璃瓶(容積500 ml)裝入200 ml厭氧培養基，其被DSMZ作為培養基52推薦用於克魯佛梭菌。使用得自實施例2和5的需要的乙酸鹽和乙醇。然後給培養物分別接種10 ml克魯佛梭菌的培養物。將培養物分別用丁基橡膠塞密封，在35°溫育116.25 h。在培養開始和結束時取樣。研究它們的光密度並藉助NMR研究不同的分析物。由於藉助於NMR僅可以將己酸和己酸乙酯確定為累積參數，因此藉助於GC/MS分析來確認兩種物質各自在最終樣品中的存在。
[0112]經培養持續時間，平均經過4輪重複，顯示出乙酸鹽由5.4 g/Ι下降至1.4 g/Ι，且乙醇由14.2 g/Ι下降至5.8 g/Ι ο同時，可證明丁酸的形成；在這裡，值由0.13 g/Ι增加至2.5 g/Ι,和己酸/己酸乙酯的形成；在這裡,總值由0.05 g/Ι增加至7.6 g/1。
【權利要求】
1.製備烴的方法，所述烴被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代，所述方法包括以下方法步驟: A)用第一種微生物將碳源轉化成乙酸鹽和/或乙醇，所述碳源包含選自CO2和CO的至少一種， B)將所述第一種微生物與所述乙酸鹽和/或乙醇分離， C)用第二種微生物將所述乙酸鹽和/或乙醇轉化成烴，所述烴被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代，和任選地 D)純化所述被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代的烴。
2.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，方法步驟A)中的碳源包含基於在方法步驟A)中所述微生物可利用的所有碳源計至少50重量％、優選至少70重量％、特別優選至少90重量％的CO2和/或CO。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，方法步驟A)中的碳源包含合成氣，尤其是由合成氣組成。
4.根據前述權利要求中的至少一項所述的方法，其特徵在於，所述第一種微生物是產乙酸微生物。
5.根據前述權利要求中的至少一項所述的方法，其特徵在於，所述第一種微生物選自-.Clostridium autothenogenum DSMZ 19630、拉氏梭 ^iXJlostridium ragsdahlei)ATCC n0.BAA-622、產乙醇梭舊^ {Clostridium autoethanogenum)> 穆爾氏菌屬(.Moorella sp ) HUC22-1、熱醋穆爾氏菌 iMoorella thermoace ti cum )、熱自養穆爾氏菌(Moorella thermoauto trophica )^ Rumicoccus productus、Acetoanaerobum、售氏產酉昔桿菌 Wxobacter pfennig! i )、巴氏甲燒八疊球菌(Methanosarcina barker i )、卩遼乙酸甲燒八疊球菌(Me thanosarcina ace ti vorans )、氧化碳嗜熱菌屬(Carboxydo thermus )、Desulphotomaculum kutznetsovii^ 熱球菌屬(fyrococcus)、消化鏈球菌屬(Pep tos trep tococcus ) > ^ S T St If lif iButyribacterium me thy1 trophi cum )A TCC 33266、蟻酸醋酸梭菌(C/os tri di um formi coace ti cum )、酪酸梭菌(C/os tri di umbutyricum )、LaktobaciIlus delbruki1、Prop1nibacterium acidoprpr1nic1、Propr1nispera arboris> Anaerobierspirillutn succiniproducens> Bacter1idesamylophiIus> Becter1ides ruminicola、凱伍熱厭氧杆 1? (Thermoanaerobacterki vu i )、伍氏醋酸桿菌 tobac teri um woodi i )、潮溼厭氧醋酸菌(Ace toanaerobi umnotera )> 醋酸梭舊{Clostridium aceticum)、食甲基 丁酸杆舊 Uhityribacteriumme thy I ο trophi cum)、熱德?穆/^ 氏菌(Moorella iAe/woaceiica )、產粘真桿菌(MubacteriumIimosum )、產生消化鏈球菌 iPep tos trep tococcus produc tus )、揚氏梭菌(C/os tri di umIjungdahlii )、梭菌屬{Clostridium') ATCC 29797 和食一氧化碳梭菌{Clostridiumcarboxidi vorans)。
6.根據前述權利要求中的至少一項所述的方法，其特徵在於，在方法步驟B)中，通過沉降、離心或過濾，由包含乙酸鹽和/或乙醇的培養基中除去所述第一種微生物。
7.根據前述權利要求中的至少一項所述的方法，其特徵在於，在方法步驟B)中，藉助於萃取，尤其是藉助於原位萃取，優選地使用包含烷基胺的萃取劑，除去乙酸鹽。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述烷基胺選自三己胺、三辛胺(Tr1ctylamin)、三癸胺、三辛基胺(Tricaprylamin)和三-十二燒基胺。
9.根據前述權利要求中的至少一項所述的方法，其特徵在於，在方法步驟C)中，將所述乙酸鹽和/或乙醇轉化成烴，所述烴被至少一個含有至少一個氧原子的基團取代，所述烴選自羧酸、二羧酸、羥基羧酸、羧酸酯、羥基羧酸酯、醇、醛、酮。
10.根據前述權利要求中的至少一項所述的方法，其特徵在於，在方法步驟C)中，將所述乙酸鹽和/或乙醇轉化成脂肪酸，且所述第二種微生物與它的野生型相比具有增加的至少一種硫酯酶的活性。
11.根據權利要求1-9中的至少一項所述的方法，其特徵在於，在方法步驟C)中，將所述乙酸鹽和/或乙醇轉化成羥基羧酸，尤其是轉化成ω-羥基羧酸或羥基異丁酸。
12.根據前述權利要求中的至少一項所述的方法，其特徵在於，將在方法步驟C)中形成的二氧化碳再返回至方法步驟Α)中的方法中。
【文檔編號】C12P7/54GK104271751SQ201380024696
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年5月8日 優先權日:2012年5月11日
【發明者】T.哈斯, E.M.維特曼 申請人:贏創工業集團股份有限公司