抗著絲粒抗體自身抗原及其應用的製作方法

2023-04-25 01:32:26

專利名稱：抗著絲粒抗體自身抗原及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物標誌物領域，具體涉及抗著絲粒抗體自身抗原及其應用。
背景技術：
抗著絲粒抗體(anticentromere antibody,ACA)是指一類識別存在於著絲粒區域的蛋白質抗原的抗體。目前已知CENP-B、CENP-A和CENP-C是ACA的三種主要自身抗原。ACA是一些自身免疫性疾病診斷的生物標記物，特別是對於局限性硬皮病(limited cutaneoussystemic sclerosis, IcSSc)的診斷具有重要意義。同時，ACA對於細胞生物學家探索和理
解高度有序的染色體結構和細胞分裂的調節機理是一把利器。ACA首次被發現是在1980年(Fritzler MJ, 1980), Fritzler等利用間接免疫突光技術發現CREST症候群患者血清中存在可以特異性識別使細胞著絲點區域的自身抗體。目前間接免疫螢光法是最常用的檢測ACA的檢測方法之一，其使用的抗原基質為快速分裂的組織培養細胞系，如Hep-2細胞(人喉表皮樣癌細胞)等。典型的ACA免疫螢光圖譜是在分裂間期的細胞中呈現散在顆粒狀螢光，而在分裂中期的細胞中呈現聚集在細胞平板上的姐妹染色單體配對點狀螢光。目前發現的ACA的主要抗原為CENP-B，CENP-A和CENP-C。由於大部分ACA陽性血清均可以識別重組CENP-B的C端和CENP-A的N端，故臨床上常用的檢測ACA的方法還包括使用重組的CENP-B和CENP-A進行ELISA檢測和/或Western blot檢測，可以大大提高靈敏度(Mahler，M.，D，2011)。也有報導稱基於合成的CENP-A抗原表位多肽的ELISA檢測結果也比較好(Mahler, M.，L，2010)。ACA是公認的系統性硬皮病診斷和預後判斷的重要生物標記物。雖然ACA亦在多種其他疾病患者的血清中出現過，但關於ACA對其他疾病的診斷和預後價值研究的比較少或者爭議較多。著絲粒是一個高度複雜的結構，儘管著絲粒的具體分子結構尚不是很清楚，但已知有很多著絲粒蛋白質或蛋白質複合體參與了著絲粒的構建並且在其中發揮重要作用，例如CENP-A是一種著絲粒特異性的組蛋白，細胞分裂期間CENP-A與其他蛋白質組成一個緻密的顆粒狀結構動粒，在細胞分裂過程中牽拉複製染色體發生分離。研究顯示動粒中含有兩個非常保守的蛋白質-蛋白質相互作用的網絡，一個是已知的KMN(KNL1/MIND/NDC80)複合體網絡，另一個是最近發現的CENP-A-NAC/CENP-A-CAD複合體網絡。其中CENP-A-NAC (CENP-A Nucleosome Associated Complex)複合體至少包含 CENP-A、CENP-C、CENP-H、CENP-M、CENP-N、CENP-T 和 MLF1IP/CENP-U 等著絲粒蛋白質。CENP-A-CAD (CENP-ANucleosome Distal Proteins)複合體至少包含 CENP-I、CENP-K、CENP-L、CENP-0、CENP-P、CENP-Q,CENP-R和CENP-S等著絲粒蛋白質。CENP-A-NAC複合體與CENP-A-CAD複合體相互作用參與動粒蛋白質的組裝、染色體的分離及有絲分裂的進行(0kada，M.，I. M, 2006) o隨著著絲粒結構的解析和成分的鑑定，人們發現原來越多的著絲粒蛋白質成為ACA的靶標抗原。除了 CENP-B，CENP-A和CENP-C外，其他CENP-自身抗原還包括在SSc血清中被發現或鑑定到的 CENP-D(Kingwell B，1987，Ford AL，1998)，CENP-E(RattnerJB, 1996)，和CENP-O (Saito, A, 2009)以及在其他自身免疫性疾病中被發現或鑑定到的 CENP-F(Rattner JB,1993), CENP-G(He D，1998)，和 CENP-H(Sugata N,1999, Hsu,T. C. 2006)。目前只有CENP-B、CENP-A和CENP-C已經成功應用於臨床，其他的自身抗體多數僅用於細胞生物學研究或者實驗室階段疾病相關研究。
對於組成著絲粒複雜結構的其他相關蛋白質是否也是ACA的自身抗原及其與臨床症狀和疾病治療以及預後的關係等則不得而知，特別是在SSc血清中的特徵及其與SSc臨床症狀之間的關係。

發明內容
為了解決上述問題，本發明提供抗著絲粒抗體自身抗原及其應用。本發明使用臨床實驗室確認的ACA陽性血清與著絲粒蛋白質晶片雜交，鑑定每一份ACA陽性血清能夠識別的著絲粒蛋白質自身抗原譜。結果發現35份ACA陽性SSc血清能夠與晶片上的11種著絲粒蛋白質呈陽性反應，除已知的，還鑑定到6個新的著絲粒自身抗原，分別是分別 CENP-P、CENP-Q, CENP-J, CENP-M (亞型 I)、CENP-T 和 CENP-I。進一步地，本發明還提供所述的自身抗原作為生物標誌物在製備自身免疫性疾病檢測試劑中的應用。其中，所述的自身免疫性疾病優選為系統性硬皮病(SSc)。其中，所述檢測試劑為基於放射免疫、突光免疫、化學發光免疫或金免疫技術的試齊U，優選的，所述的檢測試劑為包被有一種或多種所述的自身抗原的抗著絲粒抗體檢測晶片；或為含有包被有一種或多種所述的自身抗原的酶標板的抗著絲粒抗體ELISA檢測試劑盒；或為含有一種或多種所述的自身抗原的抗著絲粒抗體Western blot檢測試劑盒。在本發明優選的實施方案中，所述檢測試劑為包被有一種或多種所述的自身抗原的抗著絲粒抗體檢測晶片，更優選的，所述的檢測晶片還可包被CENP-B，CENP-A, CENP-C,CENP-H和CENP-O中的一種或多種抗著絲粒抗體自身抗原。當然，本領域人員還可在所述的檢測晶片上包被質控陽性探針和陰性對照探針。其中，所述的質控陽性探針可為流感病毒的核心蛋白和人血清IgG中的一種或兩種。所述的陰性對照探針可為GST標籤蛋白和所述自身抗原的緩衝液(晶片點樣緩衝液)。進一步的，本發明還提供一種抗著絲粒抗體檢測晶片，其包被一種或多種所述的自身抗原。優選的，所述的檢測晶片還可包被CENP-B，CENP-A、CENP-C、CENP-H和CENP-O中的一種或多種抗著絲粒抗體自身抗原。當然，本領域人員還可在所述的檢測晶片上包被質控陽性探針和陰性對照探針。其中，所述的質控陽性探針可為流感病毒的核心蛋白和人血清IgG中的一種或多種。所述的陰性對照探針可為GST標籤蛋白和所述自身抗原的緩衝液(晶片點樣緩衝液)。進一步地，本發明還提供一種抗著絲粒抗體ELISA檢測試劑盒，其含有酶標板，所述酶標板包被一種或多種所述的自身抗原。優選的，所述的的酶標板還包被CENP-B，CENP-A, CENP-C, CENP-H和CENP-O中的一種或多種抗著絲粒抗體自身抗原。進一步的,本發明還提供一種抗著絲粒抗體Western blot檢測試劑盒,其含有一種或多種所述的自身抗原。本發明通過構建著絲粒蛋白質晶片並與SSc血清雜交篩選到11個著絲粒蛋白質抗原，其中6個為新發現的，它們是CENP-P、CENP-Q, CENP-J, CENP-M(亞型I)、CENP-T和CENP-I。抗CENP-P和CENP-Q自身抗體在新發現的自身抗體中的陽性率較高。基於重組蛋白的ELISA檢測結果顯示抗CENP-P和CENP-Q自身抗體亦可以在臨床試驗方法測定為ACA陰性的血清中檢測為陽性，且部分能夠用Western blot驗證。新發現的6種ACA，尤其是抗CENP-P抗體和抗CENP-Q抗體與SSc患者的一些臨床症狀存在顯著相關性，這些自身抗原可作為SSc檢測的生物標誌物。


圖I著絲粒蛋白質晶片的構建，質量檢測以及血清雜交的效果圖。A為晶片上每個矩陣中著絲粒蛋白質靶標的位置圖，字母代表著絲粒蛋白質的名字，M(I)和N(I)分別代表亞型I類型的CENP-M和CENP-N，M(II)和N(II)分別代表亞型II類型的CENP-M和CENP-N ；Buffer表示點樣緩衝液；GST表示GST標籤蛋白；NP表示流感病毒核心蛋白(AIV-NP) ；IgG 表示人血清IgG ；B為小鼠抗GST單克隆抗體檢測晶片上所有探針的結果圖；C為著絲粒蛋白質晶片上每種探針三個重複點之間的點樣平行性分析；D-I為不同的ACA血清與晶片雜交的結果圖。圖2所示為分別與晶片上16種著絲粒蛋白質抗原呈陽性反應的ACA陽性SSc血
清的數量。圖3所示為每份血清的IIF檢測ACA的滴度及其與晶片上每個著絲粒蛋白質抗原的反應結果。其中，灰色方格代表陽性反應和**分別代表相應CENP的亞型I和亞型II兩種表達形式。圖4所示為基於重組CENP-P蛋白質的ELISA檢測各個血清組的信號分布圖。其中，檢測的血清組包括ACA陽性的SSc血清、陰性SSc血清、健康人血清以及ACA陽性的SS、SLE、RA和PBC等自身免疫性疾病對照血清。橫坐標為個血清組，縱坐標為以cutoff值為100個單位的血清雜交信號。圖5所示為基於重組CENP-Q蛋白質的ELISA檢測各個血清組的信號分布圖。其中，檢測的血清組包括ACA陽性的SSc血清、陰性SSc血清、健康人血清以及ACA陽性的SS、SLE、RA和PBC等自身免疫性疾病對照血清。橫坐標為個血清組，縱坐標為以cutoff值為100個單位的血清雜交信號。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例I著絲粒蛋白質晶片的製備將經釀酒酵母表達純化的16種重組著絲粒蛋白質以及陽性對照探針(流感病毒的核心蛋白質和人血清IgG)和陰性對照探針(酵母表達GST標籤蛋白，重組蛋白緩衝液(晶片點樣buffer))點制到環氧基片上，每張基片上點制12個矩陣，每個矩陣呈9列X7排的排列方式，每一排有三種靶標抗原，每個靶標抗原並列重複三次點制。如圖IA是晶片上每個矩陣中著絲粒蛋白質靶標的模式圖。點制好的晶片放入晶片盒內抽真空處理，4°C保存過夜直到使用。表I UniProt資料庫收錄的人著絲粒蛋白質
UniProt數據 UniProt資料庫錄入蛋甘^ *
庫錄入編號)白質名稱H
P49450CENP-A—HUMANCENPA140
P07199CENP-B—HUMANCENPB599
Q03188CENP-C I—HUMANCENPCl943
Q9H3R5CENP-H—HUMANCENPH247
Q92674CENP-I—HUMANCENPI756
Q9HC77CENP-J—HUMANCENPJ1338
Q9BS16CENP-K—HUMANCENPK269一
Q8N0S6CENP-L—HUMANCENPL344
Q9NSP4-1CENP-M—HUMANCENPM180
Q9NSP4-2CENP-M—HUMANCENPM132
Q96H22-1CENP-N—HUMANCENPN339
Q96H22-2CENP-N—HUMANCENPN204
Q9BU64CENP-O HUMANCENPO300
Q6IPU0CENP-P—HUMANCENPP288
Q7L2Z9CENP-QHUMANCENPQ268
Q96BT3CENP-T—HUMAN_CENPT_561由於晶片上所有純化的重組著絲粒蛋白質均帶有GST標籤，因此我們用抗GST抗體檢測該晶片，以確保晶片上每個靶標蛋白質能夠被檢測。同時在晶片的構建上還加入了點樣buffer作為陰性對照，加入了 GST標籤蛋白質減少GST對自身抗體的檢測以及統計結果的影響，加入AIV-NP蛋白(流感病毒核心蛋白)和人血清IgG作為監測血清雜交和螢光標記抗人二抗的陽性對照。抗GST抗體檢測著絲粒蛋白質晶片的結果如下圖IB所示。如圖IB所示，晶片上所有16個重組蛋白質均能夠被檢測到，且3個點之間有很好的平行性(如圖1C)，故自製的著絲粒蛋白質晶片適合後續的著絲粒蛋白質自身抗原的篩選與鑑定工作。實施例2 ACA陽性SSc血清雜交著絲粒蛋白質晶片篩選新的著絲粒自身抗原本實施例共使用了 35份ACA陽性SSc血清和20份ACA陰性健康人血清。ACA陽性血清的判定本研究使用間接免疫螢光技術(Indirectimmunofluorescence, HF)和免疫印跡技術(immunoblot)兩種技術判斷ACA的陽性。兩種檢測技術的操作均是按照歐蒙公司提供的相關產品說明書要求操作的。間接免疫螢光技術使用的基質是商品化固定H印2細胞，當血清滴度大於160的情況下，免疫螢光檢測結果為ACA典型的螢光圖譜(即在分裂間期的細胞中呈現散在顆粒狀螢光，而在分裂中期的細胞中呈現聚集在細胞平板上的姐妹染色單體配對點狀螢光)的時候，該血清判為ACA陽性血清。免疫印跡技術使用的是歐蒙公司生產的細胞核相關抗原免疫膜條(SystemicSclerosis Profile (Nucleoli)),每根膜條含有CENP-A和CENP-B的重組抗原,在血清稀釋度為I : 100的情況下，雜交信號大於等於10的血清即可判為ACA陽性血清。當兩種技術中的任何一種判定ACA陽性的時候，該血清即為ACA陽性血清。將所選的血清與著絲粒蛋白質晶片雜交，部分SSc患者血清雜交效果圖如圖ID-I所示。從圖2中可以看出幾乎所有的SSc血清能夠識別CENP-B蛋白質探針，絕大多數能夠識別CENP-A和CENP-C蛋白質探針。對於每個蛋白質探針點來說，以20份健康人血清雜交的信號值加上其3倍的標準差為判斷探針點陽性的cutoff值，當每個探針的3個重複點中至少2個被判為陽性的時候，認為血清與該蛋白質探針的反應為陽性。經統計後得知，所有健康人血清與晶片上所有16個著絲粒蛋白質探針都呈陰性反應。與晶片上每一種著絲 粒蛋白質呈陽性反應的ACA陽性SSc血清的數量如圖2所示。每份血清與晶片上每個著絲粒蛋白質抗原的反應結果如圖3所示。從圖2和圖3中得知，所有35份血清中34份血清中存在抗CENP-B抗體，與CENP-C和CENP-A陽性反應的血清數分別為27份和25份，明顯高於其他的著絲粒抗原。除了CENP-B，CENP-A 和 CENP-C 外，還發現分別有 14、12、10、4、4、4、3、2 份血清與晶片上的 CENP-H、CENP-P, CENP-Q, CENP-J, CENP-M(亞型 I)、CENP-T, CENP-O 和 CENP-I 等著絲粒抗原雜交呈陽性反應。在這8個著絲粒蛋白質中，有報導顯示抗CENP-H與CENP-O自身抗體分別在SS和SSc患者血清中發現，其餘6個為新發現的。實施例3 ELISA方法檢測抗CENP-P和CENP-Q自身抗體I.抗CENP-P自身抗體的檢測 重組CENP-P蛋白質以50ng/孔的濃度包被聚苯乙烯的96孔板，4度過夜，然後I %BSA封閉過夜。待檢測血清稀釋度為I : 100，HRP標記小鼠抗人IgG抗體以I : 10000稀釋使用，加TMB顯色液，顯色I. 5min後終止。酶標儀檢測0D450信號值。ELISA檢測ACA陽性SSc血清、ACA陰性血清SSc血清、ACA陰性血清健康人血清、以及ACA陽性的SS、RA、SLE, PBC等自身免疫性疾病對照血清中抗CENP-P的信號值分布如圖4所示。從圖中可以看出，抗CENP-P抗體可以在部分ACA陽性的血清組中檢測出。此外在ACA陰性組的SSc血清組中仍然可以檢測出抗CENP-P抗體，而在健康人血清組中無法檢出。以健康人血清雜交信號的平均值加其5倍標準差(standard deviation, SD)為cutoff值，定為數值100。如圖4所示，所有血清雜交信號值對cutoff值的百分數即為該血清中自身抗體的單位值。統計各血清組中抗CENP-P陽性血清的比例以及各對照血清組與ACA陽性的SSc血清組的顯著性差異計算如下表2所示。表2基於重組CENP-P蛋白質的ELISA檢測各個血清組中抗CENP-P自身抗體陽性血清的個數
權利要求
1.抗著絲粒抗體自身抗原，其為CENP-P、CENP-Q、CENP-J、CENP-M(亞型I)、CENP-T和CENP-I。
2.權利要求I所述的自身抗原作為生物標誌物在製備自身免疫性疾病檢測試劑中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述的自身免疫性疾病為系統性硬皮病。
4.根據權利要求2或3所述的應用，其特徵在於，所述的檢測試劑為包被有一種或多種權利要求I所述的自身抗原的抗著絲粒抗體檢測晶片。
5.根據權利要求2或3所述的應用，其特徵在於，所述的檢測試劑為含有包被一種或多種權利要求I所述的自身抗原的酶標板的ELISA檢測試劑盒。
6.根據權利要求2或3所述的應用，其特徵在於，所述的檢測試劑為一種或多種權利要求I所述的自身抗原的Western blot檢測試劑盒。
7.一種抗著絲粒抗體檢測晶片，其包被一種或多種權利要求I所述的自身抗原。
8.根據權利要求7所述的檢測晶片，其特徵在於，還包被CENP-B，CENP-A,CENP-C,CE NP-H和CENP-O中的一種或多種抗著絲粒抗體自身抗原。
9.一種抗著絲粒抗體ELISA檢測試劑盒，其特徵在於，其含有酶標板，所述酶標板包被一種或多種權利要求I所述的自身抗原。
10.一種抗著絲粒抗體Western blot檢測試劑盒,其含有一種或多種權利要求I所述的自身抗原。
全文摘要
本發明公開了抗著絲粒抗體自身抗原，其為CENP-P、CENP-Q、CENP-J、CENP-M(亞型I)、CENP-T和CENP-I。本發明還提供所述的自身抗原作為生物標誌物在製備自身免疫性疾病檢測試劑中的應用。本發明通過構建著絲粒蛋白質晶片並與SSc血清雜交篩選到11個著絲粒蛋白質抗原，其中6個為新發現的，它們是CENP-P、CENP-Q、CENP-J、CENP-M(亞型I)、CENP-T和CENP-I。抗CENP-P和CENP-Q自身抗體在新發現的自身抗體中的陽性率較高，且與SSc患者的一些臨床症狀存在顯著相關性，這些自身抗原可作為SSc檢測的生物標誌物。
文檔編號C07K14/47GK102675447SQ20121010721
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者吳 琳, 宋光 , 李永哲, 胡朝軍 申請人:中國醫學科學院北京協和醫院, 中國科學院北京基因組研究所