苦豆雙黃酮苷在製備抗病毒或/和抗腫瘤藥物中的應用的製作方法

2023-04-28 03:24:21

專利名稱：苦豆雙黃酮苷在製備抗病毒或/和抗腫瘤藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及從植物中提取分離的化學成分作為藥物的應用技術領域，是一種抗病 毒或/和抗腫瘤藥物及其製備方法、苦豆雙黃酮苷在製備抗病毒或/和抗腫瘤藥物中的應 用，本發明首次提出苦豆子中的化學成分苦豆雙黃酮苷作為藥物的用途，並首次將苦豆雙 黃酮苷應用於製備抗病毒藥物和抗腫瘤藥物。
背景技術：
病毒性傳染病的發病率很高，死亡率也很高，其傳播不僅造成嚴重的社會影響和 經濟損失，而且隨時隨地象惡魔般殺死無數生靈。在人類已發現眾多病毒中，流感病毒堪 稱元老，由於其變異性極高，科學家們至今還沒有弄清其變異規律，當針對流行株的疫苗 研製成功後，往往又出現新的傳播性更強的變異株，使人類無法獲得終身免疫。在這種形 勢下，應用抗病毒藥物對人群進行保護，或控制感染者的病情就顯得十分重要。B型肝炎也是世界性的流行病，我國屬高地方流行區，在全球3. 5億B肝病毒感 染者中，中國人佔三分之一，每年有數百萬人死於由B型肝炎導致的肝硬化和原發性肝 癌。由於社會和經濟方面的原因，計劃免疫在我國還無法全面普及，B型肝炎的流行已成為 我國最大的公共衛生問題之一。由於抗B肝藥物的開發在國際上一直未取得理想的進展， 目前臨床上可選擇的有效藥物寥寥無幾，而且都存在治療周期長、反彈率高、副作用大、價 格昂貴等種種無法克服的問題。愛滋病自被發現後，其傳播速度驚人，在短短20年時間裡，已擴散到了全球各個 角落。目前，我國HIV感染每年增加人數列世界第1位，感染人數已超過100萬。新疆為我 國愛滋病重災區之一，於1995年發現第一例愛滋病病毒感染者，截至2005年，已累計報 告愛滋病病毒感染者11303人，愛滋病病毒感染者人數居全國第4位。愛滋病的防治已成 為我區不容忽視的社會問題和重大科研課題。近年來，雖然政府一直在不斷加強各級醫療 部門防控愛滋病的能力，全面推進愛滋病的預防與控制仍是一項極其艱巨的工程。由於為世人矚目的HIV疫苗研製工作在眾多科學家付出了 20年的艱辛努力之後， 成功的希望依然「非常渺茫」，使抗愛滋病毒藥物的研發在國際上備受矚目，許多發達國家 一直在努力通過藥物篩選爭取實質性的進展。隨著對HIV病毒及其感染機制的研究不斷深 入，積極運用現代技術手段，進行抗HIV藥物的篩選及評價，促使更多高效、低毒的抗AIDS 藥物問世，是攻克愛滋病防治的這一世紀性難題的有效途徑。惡性腫瘤也是目前危害人類生命健康的嚴重疾病之一。世界衛生組織的統計資料 表明，癌症每年發病1000萬人，死亡700萬人，是僅次於心血管病的人類第2殺手。目前， 化療、放療和手術治療是臨床治療惡性腫瘤的主要手段。通常，對於有轉移淋巴結癌灶的早 期癌症及全部進展期癌症，均需進行化學藥物治療，合理的化療能最大限度地通過細胞毒 作用抑制腫瘤擴散，消滅殘存癌灶，防止復發和轉移，晚期癌症患者也可通過化療延長生存 期，改善生存質量。但現有的化學抗癌藥均存在療效有限、價格昂貴、毒副作用大等缺點， 天然藥物在癌症治療中的作用受到備受關注。能否找到既能殺傷腫瘤細胞，毒副作用又比較小的藥物及治療方法，對腫瘤的臨床治療意義重大。從天然產物中發現的抗腫瘤活性物質具有作用廣泛，副作用小和調節免疫功能等 特性，對很多常規化療效果欠佳的腫瘤有較好療效。據研究報導，我國傳統中藥中存在許 多抗癌有效成分，如黃酮類、生物鹼類、多糖類成分，作為抗腫瘤活性物質都具有廣闊的開 發前景。許多研究表明，黃酮類化合物具有廣泛的抗腫瘤活性，可抑制多種腫瘤細胞的生 長，如人結腸癌細胞、人胃癌細胞和人肝癌細胞等的增殖。通過對該類物質抗腫瘤作用機 理的研究，發現黃酮類化合物可通過多種機制發揮抗腫瘤效應，如細胞生長抑制，影響信號 轉導，凋亡誘導，抑制基質金屬蛋白酶分泌，抑制腫瘤侵襲行為等。這些研究結果為黃酮類 化合物在抗腫瘤領域的應用提供了依據。目前，針對黃酮類化合物抗腫瘤作用的基礎和應 用研究仍在積極進行，發達國家在此方面作了大量的工作。在我國現有國情下，應當充分發 揮中草藥資源豐富的優勢，加快該領域的研究，儘早開發出高效的抗腫瘤新藥。苦豆子Sophora alopecuroides L.為豆科槐屬植物，藥用全草或種子，主產於我 國西北地區。苦豆子中含有生物鹼、黃酮、有機酸和多糖等多種化學成分。苦豆雙黃酮苷為 從苦豆子中提取分離的雙黃酮苷類化合物，為苦豆子中含量較高的一種黃酮類成分，其化 學結構式如下
有關苦豆雙黃酮苷在製備抗病毒及抗腫瘤藥物的應用在國內外均未見研究報導，也未 檢索到有相關的文獻。本發明首次提出苦豆雙黃酮苷作為藥物的用途，並首次將苦豆雙黃酮苷用於製備 抗病毒藥物和抗腫瘤藥物。

發明內容
本發明提供了一種抗病毒或/和抗腫瘤藥物及其製備方法、苦豆雙黃酮苷在製備 抗病毒或/和抗腫瘤藥物中的應用，本發明首次提出苦豆子中的化學成分苦豆雙黃酮苷作 為藥物的用途，並首次將苦豆雙黃酮苷應用於製備抗病毒藥物和抗腫瘤藥物。本發明的技術方案之一是通過以下方式得到的一種抗病毒或/和抗腫瘤藥物， 其為含有苦豆雙黃酮苷的單位劑量形式，單位劑量中含苦豆雙黃酮苷按重量計為45毫克 至220毫克。下面是對上述技術方案之一的進一步優化和/或選擇
5上述抗病毒或/和抗腫瘤藥物採用片劑或硬膠囊劑劑型。上述的抗病毒或/和抗腫瘤藥物按以下方法得到
第一步，苦豆子種子或全草以水或乙醇粗提，其中水粗提為將苦豆子的種子或全草加 8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液； 乙醇粗提為將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C至80°C 提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；
第二步，將上述粗提物濃縮液加相當於1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24 小時，濾除沉澱得到乙醇溶液，濃縮乙醇溶液並回收乙醇得濃縮液；
第三步，將上述第二步中的濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個 層析柱體積的去離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱， 每濃度洗脫劑的用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集 乙醇洗脫液並合併，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；
第四步，取上述提取物浸膏加3倍量至8倍量的水溶解後，以體積百分比濃度為10%的 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，萃取液合併後減壓濃縮， 回收正丁醇，得流浸膏；
第五步，將上述流浸膏用2倍量至10倍量的水溶解後上聚醯胺層析柱吸附， 以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以40%至60%濃度的乙醇梯 度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；
第六步，將上述第五步中的濃縮液上S印hadex LH-20層析柱吸附，以30%至50%的甲 醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，於50°C至60°C減壓濃縮成流浸膏，再以3倍量至 5倍量的甲醇或無水乙醇溶解，放置24小時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即 得淡黃色苦豆雙黃酮苷粉末；
第七步，取上述苦豆雙黃酮苷粉末與賦形劑混合後，按單位劑量中含苦豆雙黃酮苷45 毫克至220毫克製成片劑或硬膠囊劑。本發明的技術方案之二是通過以下方式得到的一種上述的抗病毒或/和抗腫瘤 藥物的製備方法，其按以下方法製備
第一步，苦豆子種子或全草以水或乙醇粗提，其中水粗提為將苦豆子的種子或全草加 8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液； 乙醇粗提為將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C至80°C 提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；
第二步，將上述粗提物濃縮液加相當於1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24 小時，濾除沉澱得到乙醇溶液，濃縮乙醇溶液並回收乙醇得濃縮液；
第三步，將上述第二步中的濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個 層析柱體積的去離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱， 每濃度洗脫劑的用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集 乙醇洗脫液並合併，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；
第四步，取上述提取物浸膏加3倍量至8倍量的水溶解後，以體積百分比濃度為10%的 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，萃取液合併後減壓濃縮， 回收正丁醇，得流浸膏；第五步，將上述流浸膏用2倍量至10倍量的水溶解後上聚醯胺層析柱吸附， 以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以40%至60%濃度的乙醇梯 度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；
第六步，將上述第五步中的濃縮液上S印hadex LH-20層析柱吸附，以30%至50%的甲 醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，於50°C至60°C減壓濃縮成流浸膏，再以3倍量至 5倍量的甲醇或無水乙醇溶解，放置24小時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即 得淡黃色苦豆雙黃酮苷粉末；
第七步，取上述苦豆雙黃酮苷粉末與賦形劑混合後，按單位劑量中含苦豆雙黃酮苷45 毫克至220毫克製成片劑或硬膠囊劑。本發明的技術方案之三是通過以下方式得到的苦豆雙黃酮苷在製備抗病毒或 /和抗腫瘤藥物中的應用。下面是對上述技術方案之三的進一步優化和/或選擇
上述苦豆雙黃酮苷在製備治療流感和/或B型肝炎和/或愛滋病或/和肝癌和/或胃 癌和/或腸癌和/或肺癌和/或宮頸癌藥物中的應用。本發明首次提出苦豆雙黃酮苷作為藥物的用途，並首次將苦豆雙黃酮苷片或苦豆 雙黃酮苷膠囊應用於治療病毒性疾病和惡性腫瘤。體內、外實驗研究表明，本發明苦豆雙 黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊具有顯著的抗流感病毒作用，其抗流感藥效優於現有西藥利 巴韋林片。苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊在體外實驗中還顯示了較強的抗B肝病毒 作用及抗愛滋病毒作用。苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊對肝癌、胃癌、腸癌、肺癌及 宮頸癌細胞均有明顯的抗增殖作用，其抗腫瘤作用優於現有化學成分製劑羥基喜樹鹼注射 液。本發明苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊可作為抗病毒藥物治療流感、B肝和愛滋 病，並可作為抗腫瘤藥物用於治療肝癌、胃癌、腸癌、肺癌及宮頸癌。
具體實施例方式本發明不受下述實施例的限制，可根據上述本發明的技術方案和實際情況來確定 具體的實施方式。下面結合實施例對本發明作進一步論述
實施例1 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至10(TC下提取兩次，每 次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮液1倍 量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮液；濃 縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗上述 層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2至8 個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至80°C 下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀鹽酸 調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮，回收 正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以3至 8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以40%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析柱， 收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上S印hadex LH-20層析柱 吸附，以30%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結晶，將 所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬 脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得苦豆雙黃 酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例2 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取兩 次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮液 1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮液； 濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗上 述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2 至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至 80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮， 回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以 3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以40%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析 柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Si^phadex LH-20層 析柱吸附，以40%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃 縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結 晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱 粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得 苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例3 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取兩 次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮液 1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮液； 濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗上 述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2 至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至 80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮， 回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以 3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以40%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析 柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Si^phadex LH-20層 析柱吸附，以50%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃 縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結 晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱 粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得 苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例4 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取兩 次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮液 1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮液；
8濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗上 述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2 至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至 80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮， 回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以 3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以50%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析 柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Si^phadex LH-20層 析柱吸附，以30%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃 縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結 晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱 粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得 苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例5 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取兩 次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮液 1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮液； 濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗上 述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2 至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至 80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮， 回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以 3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以50%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析 柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Si^phadex LH-20層 析柱吸附，以40%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃 縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結 晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱 粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得 苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例6 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取兩 次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮液 1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮液； 濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗上 述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2 至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至 80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮， 回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以 3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以50%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Si^phadex LH-20層 析柱吸附，以50%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃 縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結 晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱 粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得 苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例7 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取兩 次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮液 1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮液； 濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗上 述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2 至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至 80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮， 回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以 3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以60%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析 柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Si^phadex LH-20層 析柱吸附，以30%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃 縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結 晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱 粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得 苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例8 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取兩 次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮液 1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮液； 濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗上 述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2 至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至 80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮， 回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以 3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以60%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析 柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Si^phadex LH-20層 析柱吸附，以40%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃 縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結 晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱 粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得 苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例9 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮液 1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮液； 濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗上 述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2 至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至 80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮， 回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以 3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以60%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析 柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Si^phadex LH-20層 析柱吸附，以50%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃 縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結 晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱 粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得 苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例10 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取 兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮 液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮 液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗 上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2 至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至 80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮， 回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以 3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以40%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析 柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Si^phadex LH-20層 析柱吸附，以30%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃 縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結 晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱 粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得 苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例11 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取 兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮 液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮 液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗 上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2 至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至 80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以 3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以50%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析 柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Si^phadex LH-20層 析柱吸附，以30%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃 縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結 晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱 粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得 苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例12 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取 兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮 液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮 液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗 上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2 至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至 80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮， 回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以 3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以60%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析 柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Si^phadex LH-20層 析柱吸附，以30%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃 縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結 晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱 粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得 苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例13 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取 兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮 液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮 液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗 上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2 至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至 80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮， 回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以 3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以60%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析 柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Si^phadex LH-20層 析柱吸附，以40%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃 縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結 晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱 粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例14 苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取 兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮 液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收乙醇得濃縮 液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去離子水衝洗 上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的用量相當於2 至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至 80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取物浸膏後，以稀 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取液並減壓濃縮， 回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以 3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以60%濃度的乙醇梯度洗脫上述層析 柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Si^phadex LH-20層 析柱吸附，以50%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於50°C至60°C減壓濃 縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結 晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶纖維素、羧甲基澱 粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入硬膠囊殼，即得 苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例15 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於 粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去 離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液併合 並，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺 層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以40%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上 Sephadex LH-20層析柱吸附，以30%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小 時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例16 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於 粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去 離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺 層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以40%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上 Sephadex LH-20層析柱吸附，以40%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小 時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例17 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於 粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去 離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液併合 並，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺 層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以40%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上 Sephadex LH-20層析柱吸附，以50%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小 時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例18 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於 粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去 離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液併合 並，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺 層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以50%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上 Sephadex LH-20層析柱吸附，以30%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例19 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於 粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去 離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液併合 並，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺 層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以50%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上 Sephadex LH-20層析柱吸附，以40%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小 時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例20 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於 粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去 離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液併合 並，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺 層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以50%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上 Sephadex LH-20層析柱吸附，以50%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小 時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例21 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於 粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去
15離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液併合 並，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺 層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以60%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上 Sephadex LH-20層析柱吸附，以30%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小 時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例22 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於 粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去 離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液併合 並，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺 層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以60%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上 Sephadex LH-20層析柱吸附，以40%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小 時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例23 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於 粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去 離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液併合 並，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺 層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以60%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上Sephadex LH-20層析柱吸附，以50%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小 時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例24 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於 粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去 離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液併合 並，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺 層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以40%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上 Sephadex LH-20層析柱吸附，以30%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小 時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例25 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於 粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去 離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液併合 並，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺 層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以50%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上 Sephadex LH-20層析柱吸附，以30%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小 時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例26 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去 離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液併合 並，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺 層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以60%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上 Sephadex LH-20層析柱吸附，以30%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小 時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例27 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於 粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去 離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液併合 並，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺 層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以60%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上 Sephadex LH-20層析柱吸附，以40%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小 時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。實施例28 將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C 至80°C提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；加相當於 粗提物濃縮液1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮並回收 乙醇得濃縮液；濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個層析柱體積的去 離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱，每濃度洗脫劑的 用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液併合 並，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；加5倍量至10倍量的水溶解提取 物浸膏後，以稀鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，合併萃取 液並減壓濃縮，回收正丁醇得流浸膏；用3倍量至8倍量的水溶解流浸膏後，上聚醯胺層析柱吸附，以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以60%濃度的乙醇 梯度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；濃縮液上 Sephadex LH-20層析柱吸附，以50%的甲醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，並於 50°C至60°C減壓濃縮成浸膏，再以3倍量至5倍量的甲醇或無水乙醇溶解浸膏，放置24小 時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即得苦豆雙黃酮苷；取苦豆雙黃酮苷與微晶 纖維素、羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂按重量比1比0. 3比1比0. 2配比製成顆粒，壓片或裝入 硬膠囊殼，即得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊。將上述實施例所得苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊進行藥效學試驗，其過程 和結果如下
苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊的規格為每片或每粒含苦豆雙黃酮苷按重量計 為45毫克至220毫克，臨床用量為每次1至2片或粒，每天2至3次。試驗例1 本發明苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊抗流感病毒作用
實驗材料流感甲型病毒(H3N2亞型粵防72243株)、流感乙型病毒(濟防97-13株)及狗 腎傳代細胞MDCK，分別購自中國預防醫學科學院病毒學研究所，自行傳代後備用。陽性對照 藥利巴韋林片，江西匯仁藥業有限公司生產，批號0911025。 樣品苦豆雙黃酮苷片或 苦豆雙黃酮苷膠囊，由新疆藥物研究所藥理室提供，實驗時將片劑粉碎或取膠囊內容物配 成所需要濃度的溶液或混懸液給藥，給藥濃度或劑量均按苦豆雙黃酮苷原料計。苦豆雙黃酮苷片樣品對MDCK細胞毒性的測定苦豆雙黃酮苷片用營養液配成2毫 克/毫升原液，以營養液作2倍稀釋，取1000微克/毫升至62. 5微克/毫升6個濃度；陽 性對照利巴韋林片配成400微克/毫升原液，以營養液作2倍稀釋，取200微克/毫升至 6. 25微克/毫升6個濃度，分別加到接種MDCK和Hela細胞並已長成單層的培養板中，100 微升/孔，每濃度4個平行孔，同時設細胞對照。將培養板置37°C、5% CO 2條件培養四天， 每日觀察細胞生長情況，以細胞不出現明顯退變的最小稀釋倍數為最大無毒濃度(TCtl)15並 按Reed-Muench法計算50%有毒濃度(TC5tl)。詳見表一。苦豆雙黃酮苷片樣品對病毒致細胞病變的影響取接種後已長成單層的MDCK細 胞培養板，吸棄上清液，設細胞對照組、病毒對照組、陽性對照利巴韋林片(取25微克/毫升 至0. 8微克/毫升共六個2倍稀釋度)組和不同濃度苦豆雙黃酮苷片給藥組(取62. 5微克 /毫升至2. 0微克/毫升共六個2倍稀釋度)，每組4個平行孔。病毒對照組、陽性對照組和 給藥組每孔接種病毒液100微升，細胞對照組加等體積的維持液，置35°C吸附2小時後吸 棄上清液，以不含血清的維持液洗細胞表面2次，給藥組加入相應稀釋度的苦豆雙黃酮苷 片樣品溶液，細胞對照組、病毒對照組加等體積的維持液。於37° (、5%0)2條件培養，每日 觀察細胞病變情況，細胞病變程度按六級標準判斷(一無病變；士 細胞病約佔整個單層 的10%以下；1 細胞病變約佔整個單層的25%以下；2 細胞病變約佔整個單層的50%以 下；3:細胞病變約佔整個單層的75%以下；4:細胞病變約佔整個單層的75%以上)。當病毒對照組細胞病變為4時記錄實驗結果。按Reed-Muench法計算半數有效濃 度IC5。，並計算苦豆雙黃酮苷片樣品的選擇指數SI (TC50/IC50)，結果如表二所示。苦豆雙黃酮苷片抑制甲、乙型流感病毒的選擇指數SI均大於利巴韋林，表明苦豆 雙黃酮苷片對流感病毒的抑制作用優於利巴韋林。以苦豆雙黃酮苷膠囊進行上述實驗，所 得結果與苦豆雙黃酮苷片相符。
試驗例2 本發明苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊對小鼠流感病毒性肺炎模 型的保護作用
測定流感病毒鼠肺適應株PR8 -M5的毒力，取感染後15天內小鼠死亡率在90%以 上的濃度作為實驗濃度。取小鼠100隻，隨機分為病毒感染對照組、利巴韋林對照組(劑量為40毫克/千克) 和苦豆雙黃酮苷片20、40、80毫克/千克三個劑量的給藥組，每組20隻。按劑量灌胃給藥， 每天一次，連續7天，病毒感染對照組灌胃等體積的蒸餾水。於第二天給藥後，各組小鼠以 乙醚吸入法麻醉，流感病毒鼠肺適應株PR8 - M5以上述實驗濃度滴鼻感染小鼠，0. 05毫升/ 只。觀察記錄小鼠死亡情況，計算死亡保護率、平均存活天數及生命延長率，結果如表三所
7J\ ο苦豆雙黃酮苷片20毫克/千克、40毫克/千克和80毫克/千克劑量對感染小鼠 均有明顯的保護作用，可明顯降低感染小鼠的死亡率並延長存活時間。從上述實驗所測得 的死亡保護率和生命延長率數據可知，在臨床等效劑量下，苦豆雙黃酮苷片對小鼠流感病 毒性肺炎模型的保護作用優於利巴韋林。以苦豆雙黃酮苷膠囊進行上述實驗，所得結果與 苦豆雙黃酮苷片相符。試驗例1和試驗例2的研究結果表明，苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊的抗 流感病毒作用明顯優於西藥利巴韋林。由於利巴韋林是臨床治療流感的經典藥物，而苦豆 雙黃酮苷膠囊作為中藥化學成分製劑，其的抗流感病毒作用超過等劑量的利巴韋林，因而 該製劑作為抗病毒藥物在治療流感方面比現有藥物具有突出的優勢。試驗例3 本發明苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊抗B肝病毒作用
實驗材料B型肝炎病毒(HBV)DNA克隆轉染人肝癌細胞Ofep G2)的2. 2. 15細胞，購 自北京大學人民醫院肝病中心，以含穀氨醯胺的MEM培養液於37°C，5 % CO2條件下培養， 大約一周傳代一次。MEM培養基，GiBco, Invitrogen Corporation ；胰酶，北京三博遠志生 物技術有限公司；小牛血清、HEPES，中國醫科院生物醫學工程研究所；B肝病毒核酸定量 檢測試劑盒、cPCR —螢光探針，中山大學達安基因股份有限公司。陽性對照藥苦參素膠囊， 寧夏博爾泰力藥業股份有限公司生產，批號20030901。實驗前取苦豆雙黃酮苷片樣品配成4毫克(原料)/毫升原液，苦參素膠囊配製成 1毫克(原料)/毫升原液，過濾除菌後於4°C保存，臨用時以培養液稀釋成所需濃度給藥。細胞毒性的測定取2. 2. 15細胞接種96孔培養板，待細胞長成單層時，吸棄上 清，設細胞對照組和苦豆雙黃酮苷六個2倍稀釋濃度(2000微克/毫升至62. 5微克/毫升) 的給藥組，每組4孔，分別加樣，200微升/孔，細胞對照組加等體積的培養液，於37°C、5 % CO2條件培養，第4天各組換相應濃度的藥液，第8天於顯微鏡下觀察，以細胞病變CPE為指 標，程度分為五級完全破壞為4;75%為3;50%為2; 25%為1;無病變為0。計算每濃度 藥液平均細胞病變程度和抑制百分率。觀察最大無毒濃度TCtl,並按Reed&Muench法計算半 數有毒濃度TC5。，結果如表四所示。對B肝病毒DNA複製的抑制作用取2.2. 15細胞接種96孔細胞培養板，每 孔200微升，37°C、5% CO2條件培養，待細胞長成單層後，吸棄上清，設細胞對照組、苦參素 (100微克/毫升)組、苦豆雙黃酮苷四個濃度(取100微克/毫升至6. 25微克/毫升共五 個2倍稀釋度)的給藥組，每濃度4孔，分別加樣，200微升/孔，於37°C、5 % CO2條件培
20養，第4天換一次藥液，繼續培養，於第8天收集細胞培養上清液，以螢光定量PCR法測定乙 肝病毒DNA表達量(拷貝/毫升)，計算苦豆雙黃酮苷片樣品的抑制率。按Reed&Muench法 計算半數有效濃度IC5tl，並計算選擇指數Si，結果如表五所示。苦豆雙黃酮苷片抑制B肝病毒DNA複製的選擇指數SI達86. 8，其100微克/毫升 濃度對B肝病毒DNA的抑制率高於等濃度的苦參素膠囊。以苦豆雙黃酮苷膠囊進行上述實 驗，所得結果與苦豆雙黃酮苷片相符。本研究結果表明苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠 囊對B肝病毒有顯著的抑制作用，其抗B肝病毒作用優於等濃度的苦參素膠囊，臨床可用 於B型肝炎的抗病毒治療。試驗例4 本發明苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊在人類嗜T淋巴細胞病毒I 型感染的T細胞系MT-4細胞中對愛滋病毒HIV-I P24抗原的抑制作用
MT-4細胞懸液計數，用IOOCCID5q的HIV-1 III B感染細胞，在37°C，5%C02培養箱中吸 附1. 5小時。用無血清的1640培養液洗去未吸附病毒，用培養液將感染病毒的細胞配成 2 X IO5個細胞/毫升，接種於96孔細胞培養板內，每孔100微升；再分別加入3倍稀釋的苦 豆雙黃酮苷片樣品溶液和5倍稀釋的陽性對照藥齊多夫定(AZT)溶液100微升。每個稀釋 度重複3個孔，同時設細胞對照組和病毒對照組。培養板置於37°C、5%C02飽和溼度培養箱 內培養。4天後吸出上清，-20°C凍存，待測HIV-I P24抗原滴度。細胞加MTT染色測藥物 對細胞的毒性。染色測定細胞毒性每孔加5毫克/毫升MTTlO微升染色，37°C、5%C02飽和溼度 培養箱內培養4小時後，每孔加入100微升50% DMF-17%Triton X-IOO脫色液，37°C過夜， 酶標儀上波長為570納米處測定OD值，計算苦豆雙黃酮苷片樣品的半數有毒濃度(TC5(I)。測定苦豆雙黃酮苷片樣品在細胞培養內抑制HIV-I P24抗原的EC5tl 將凍存的感 染病毒的MT-4上清液融化後進行稀釋，按預實驗結果調整稀釋比例。按照HIV-I P24抗原 檢測試劑盒說明測定HIV-I P24抗原滴度，加樣組與病毒對照組比較，計算苦豆雙黃酮苷片 樣品的EC5tl及選擇指數SI (CC50/ EC50)o結果見表六所示。本實驗中苦豆雙黃酮苷片抑制HIV-I P24抗原的選擇指數SI高於齊多夫定，以苦 豆雙黃酮苷膠囊進行上述實驗，所得結果與苦豆雙黃酮苷片相符。說明本發明苦豆雙黃酮 苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊的抗愛滋病毒作用優於已上市西藥齊多夫定片，提示苦豆雙黃酮 苷膠囊還可用於抗愛滋病治療。試驗例5 苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊抗腫瘤作用
實驗材料人肝癌細胞HepG2、人胃癌細胞BGC823、直腸癌細胞HCT-8、人大細胞肺癌 H460、人宮頸癌Hela細胞，均由中國醫科院北京藥物研究所腫瘤室提供。RPMI1640培養 基，L-穀氨醯氨，Sigma出品；DMSO、HEPES，中國醫科院生物醫學工程研究所；MTT、胰蛋 白酶(1:25)，Amresco，北京三博遠志生物技術有限公司分裝。對照藥羥基喜樹鹼(規格 5mg/2ml)，批號050601，湖北美升藥業有限公司。苦豆雙黃酮苷片樣品及對照藥實驗時均 以營養液配成所需濃度的溶液，過濾除菌後加樣。細胞培養及接種 H印G2、HCT_8、BGC823、H460和Hela均為貼壁細胞，用含10 % 小牛血清的RPMI1640培養液於37°C、5 %C02條件下培養。取生長活躍、形態良好的單層培 養細胞用0. 25 %的胰酶消化後，以RPMI1640培養液配成濃度為4. 5X 105/ml的細胞懸液， 接種於無菌96孔板，200 μ 1/hole, 24小時後，吸棄上清，苦豆雙黃酮苷片樣品以培養液配成1000、500、250、1251^/1111四個濃度加藥，每濃度4個復孔，培養48小時後，加入以PBS 配製的MTT (5mg/ml) 10 μ 1/hole，繼續培養4小時，吸棄上清，加DMSO 100 μ Ι/hole，振搖 後在酶標儀上於570nm測定OD值。實驗重複三批。計算苦豆雙黃酮苷片樣品對細胞生長的 抑制率CT，並用SPSS軟體16. 0計算苦豆雙黃酮苷片樣品對腫瘤細胞的半數抑制濃度IC5tl， 三批實驗結果如表七所示。實驗結果表明，苦豆雙黃酮苷片對肝癌細胞IfepG2、胃癌細胞BGC823、腸癌細胞 HCT-8、宮頸癌Hela細胞和肺癌細胞H46tl細胞均有明顯的抗增殖作用，其0. 5毫克/毫升濃 度對上述五腫瘤細胞的抑制率均達50 %以上；在0. 5毫克/毫升濃度下，苦豆雙黃酮苷片 對上述五種腫瘤細胞增殖的抑制率均高於羥基喜樹鹼注射液。以苦豆雙黃酮苷膠囊進行上 述實驗，所得結果與苦豆雙黃酮苷片相符。結論體外實驗表明，苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊對人癌傳代細胞 HepG2, BGC823、HCT-8、Hela和H46tl的抗腫瘤作用優於等濃度的化學成分製劑羥基喜樹鹼注 射液，提示其作為中藥化學成分製劑在肝癌、胃癌、腸癌、宮頸癌及肺癌的化學治療中有較 高的應用價值。根據以上試驗例，苦豆雙黃酮苷可應用於製備廣譜抗病毒藥物苦豆雙黃酮苷片 或苦豆雙黃酮苷膠囊的抗病毒作用優於現有藥物，抗流感病毒作用優於西藥利巴韋林，其 抗B肝病毒作用優於化學成分製劑苦參素膠囊，其抗愛滋病毒作用優於西藥齊多夫定片。 根據以上實驗例，苦豆雙黃酮苷還可應用於製備抗腫瘤藥物苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃 酮苷膠囊對肝癌、胃癌、腸癌、宮頸癌和肺癌的抗腫瘤作用優於已上市的化學成分製劑羥基 喜樹鹼注射液。綜上所述，苦豆雙黃酮苷應用於製備抗病毒藥物和抗腫瘤藥物，苦豆雙黃酮苷片 和苦豆雙黃酮苷膠囊具有廣譜抗病毒作用，可治療流感、B型肝炎和愛滋病；苦豆雙黃酮苷 片和苦豆雙黃酮苷膠囊還具有抗腫瘤作用，可治療肝癌、胃癌、腸癌、宮頸癌和肺癌。實驗研 究證明，苦豆雙黃酮苷片和苦豆雙黃酮苷膠囊針對上述疾病的抗病毒藥效或抗腫瘤藥效優 於現有藥物，有良好的臨床應用前景。
權利要求
一種抗病毒或/和抗腫瘤藥物，其特徵在於是含有苦豆雙黃酮苷的單位劑量形式，單位劑量中含苦豆雙黃酮苷按重量計為45毫克至220毫克。
2.根據權力要求1所述的抗病毒或/和抗腫瘤藥物，其特徵在於該藥物採用片劑或硬 膠囊劑劑型。
3.根據權利要求1或2所述的抗病毒或/和抗腫瘤藥物，其特徵在於按以下方法得到 第一步，苦豆子種子或全草以水或乙醇粗提，其中水粗提為將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液； 乙醇粗提為將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C至80°C 提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；第二步，將上述粗提物濃縮液加相當於1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24 小時，濾除沉澱得到乙醇溶液，濃縮乙醇溶液並回收乙醇得濃縮液；第三步，將上述第二步中的濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個 層析柱體積的去離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱， 每濃度洗脫劑的用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集 乙醇洗脫液並合併，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；第四步，取上述提取物浸膏加3倍量至8倍量的水溶解後，以體積百分比濃度為10%的 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，萃取液合併後減壓濃縮， 回收正丁醇，得流浸膏；第五步，將上述流浸膏用2倍量至10倍量的水溶解後上聚醯胺層析柱吸附， 以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以40%至60%濃度的乙醇梯 度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；第六步，將上述第五步中的濃縮液上S印hadex LH-20層析柱吸附，以30%至50%的甲 醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，於50°C至60°C減壓濃縮成流浸膏，再以3倍量至 5倍量的甲醇或無水乙醇溶解，放置24小時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即 得淡黃色苦豆雙黃酮苷粉末；第七步，取上述苦豆雙黃酮苷粉末與賦形劑混合後，按單位劑量中含苦豆雙黃酮苷45 毫克至220毫克製成片劑或硬膠囊劑。
4.一種根據權利要求1或2所述的抗病毒或/和抗腫瘤藥物的製備方法，其特徵在於 按以下方法製備第一步，苦豆子種子或全草以水或乙醇粗提，其中水粗提為將苦豆子的種子或全草加 8倍量至10倍量水，在80°C至100°C下提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液； 乙醇粗提為將苦豆子的種子或全草加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在60°C至80°C 提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液並濃縮得粗提物濃縮液；第二步，將上述粗提物濃縮液加相當於1倍量至2倍量體積的無水乙醇，放置沉澱24 小時，濾除沉澱得到乙醇溶液，濃縮乙醇溶液並回收乙醇得濃縮液；第三步，將上述第二步中的濃縮液上AB-8型大孔樹脂層析柱吸附，以相當於2至5個 層析柱體積的去離子水衝洗上述層析柱除去雜質，再以50%的乙醇為洗脫劑洗脫層析柱， 每濃度洗脫劑的用量相當於2至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集 乙醇洗脫液並合併，在50°C至80°C下濃縮，回收乙醇，得提取物浸膏；第四步，取上述提取物浸膏加3倍量至8倍量的水溶解後，以體積百分比濃度為10%的 鹽酸調節PH值為2至3，用等體積的飽和正丁醇萃取3至5次，萃取液合併後減壓濃縮， 回收正丁醇，得流浸膏；第五步，將上述流浸膏用2倍量至10倍量的水溶解後上聚醯胺層析柱吸附， 以3至8個柱體積的水洗脫聚醯胺層析柱除去雜質，再以40%至60%濃度的乙醇梯 度洗脫上述層析柱，收集乙醇洗脫液並合併，減壓濃縮，回收乙醇得濃縮液；第六步，將上述第五步中的濃縮液上S印hadex LH-20層析柱吸附，以30%至50%的甲 醇梯度洗脫層析柱，收集洗脫液並合併，於50°C至60°C減壓濃縮成流浸膏，再以3倍量至 5倍量的甲醇或無水乙醇溶解，放置24小時，析出淡黃色結晶，將所得結晶真空乾燥，即 得淡黃色苦豆雙黃酮苷粉末；第七步，取上述苦豆雙黃酮苷粉末與賦形劑混合後，按單位劑量中含苦豆雙黃酮苷45 毫克至220毫克製成片劑或硬膠囊劑。
5.苦豆雙黃酮苷在製備抗病毒或/和抗腫瘤藥物中的應用。
6.根據權力要求5所述的苦豆雙黃酮苷在製備抗病毒或/和抗腫瘤藥物中的應用，其 特徵在於所述苦豆雙黃酮苷在製備治療流感和/或B型肝炎和/或愛滋病或/和肝癌和/ 或胃癌和/或腸癌和/或肺癌和/或宮頸癌藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種抗病毒或/和抗腫瘤藥物及其製備方法，苦豆雙黃酮苷在製備抗病毒或/和抗腫瘤藥物中的應用，本發明首次提出苦豆子中的化學成分苦豆雙黃酮苷作為藥物的用途，並首次將苦豆雙黃酮苷應用於製備抗病毒藥物和抗腫瘤藥物。體內、外實驗研究表明，本發明苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊具有顯著的抗流感病毒作用，其抗流感藥效優於現有西藥利巴韋林片。苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊的抗B肝病毒作用優於苦參素膠囊，其抗愛滋病毒作用優於齊多夫定片。苦豆雙黃酮苷片或苦豆雙黃酮苷膠囊對肝癌、胃癌、腸癌、肺癌及宮頸癌細胞均有明顯的抗增殖作用，其抗腫瘤作用優於現有化學成分製劑羥基喜樹鹼注射液。
文檔編號A61P35/00GK101982171SQ20101053359
公開日2011年3月2日 申請日期2010年11月6日 優先權日2010年11月6日
發明者史玉柱, 姚華, 楊巧麗, 王林林, 王雪, 趙軍, 黃華 申請人:新疆維吾爾自治區藥物研究所