抑制蛋白激酶Cα用於治療糖尿病和心血管病的組合物的製作方法

2023-04-28 13:55:06

專利名稱：抑制蛋白激酶Cα用於治療糖尿病和心血管病的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及降低或抑制蛋白激酶C-α(PKC-α)表達和/或活性的試劑在治療和/或預防下列疾病中的用途冠心病、心肌梗塞、周邊阻塞性疾病(peripheral occlusivedisease)、中風、涉及蛋白尿的腎病、糖尿病遠期效應和/或糖尿病患者中的心血管併發症、高血壓患者中的心血管併發症，以及高膽固醇血症患者中的心血管併發症。
糖尿病是西方國家最常見的疾病之一，約5％的人群都受到該病的折磨。糖尿病可以進一步分為I型和II型，其中I型糖尿病通常發生在青年人中，而II型糖尿病還稱作成年發生的或成熟期發生的糖尿病。由於兩種類型的糖尿病中葡萄糖代謝紊亂，血糖水平永久性升高，因此受糖尿病折磨的患者數年後出現不同的併發症。最常見、同時最嚴重的併發症是導致失明的糖尿病性視網膜病、導致足或腿截除的糖尿病性神經病和糖尿病性腎病。
所有糖尿病患者中約40％會發生糖尿病性腎病，其是全球導致慢性腎衰和透析治療的最常見的誘因。所有新透析的患者中約30-40％表現為糖尿病性腎病。由於糖尿病性腎病損傷發展較慢，因此對發生腎機能不全危險性較高的患者的早期鑑定對啟動適當治療步驟來說具有極大的臨床重要性。開始腎損傷的一個首要臨床症狀是發生所謂的微白蛋白尿(microalbuminuria)。其涉及在24小時收集的尿中排出30-300mg的白蛋白。正常情況下，每天排出少於30mg的白蛋白。在目前的治療條件下，微白蛋白尿發生在患有I型和II型糖尿病的約25％糖尿病患者中(Alzaid，diabetes Care，19(1996)，79-89；Klein et al.，Diabetes Care，22(1999)，743-751；Valjnadrid et al.，Arch.Intern.Med.，160(2000)，1093-1100)。與排正常白蛋白的患者相比，微白蛋白尿患者發生腎機能不全的危險性高約10倍。每年在患有糖尿病和微白蛋白尿的所有患者中約5-10％將發生特徵為超過300mg/天的蛋白尿和/或腎功能受限制的糖尿病性腎病(Vigstrup and Mogensen，Acta Ophthalmol.(Copenh)，63(1985)，530-534)。
10餘年跟蹤檢查的長期研究表明，與未伴隨有微白蛋白尿的糖尿病患者相比，已經處於微白蛋白尿階段的II型和I型糖尿病患者的心血管死亡率增加約2倍，對常規危險因素如膽固醇和高血壓進行校正後也是如此(Rossing et al.，Bmj，313(1996)，779-784；Gerstein et al.，Diabetes Care，23(2000)，Suppl.2B35-39；Valmadrid et al.，2000)。在患有微白蛋白尿但不患有糖尿病的患者中也可檢測到心血管死亡率增加(Gerstein et al.，Jama，286(2001)，421-426)。
對於微白蛋白尿為何是糖尿病患者中形成併發症的極重要標誌物，存在有多種假說。根據所謂的「速記假說」(Deckert，Feldt-Rasmussen et al.，Diabetologia，32(1989)，219-226)，細胞外間質中帶負電荷的陰離子型分子的喪失是發生白蛋白尿、糖尿病性視網膜病和心血管併發症如冠心病的原因。人類和動物模型系統中獲得的數據支持該假說，近年來其他工作小組獲得的結果已證實了該假說。
在腎臟中，尿分泌在稱作腎小球的腎小體中。為了防止諸如白蛋白的蛋白質通過，血液側和尿側由稱作基底膜的膜隔開。基底膜具有允許較小分子通過基底膜的小孔，而蛋白質分子由於其尺寸較大不能通過該膜。在患有微白蛋白尿的患者中，即使孔尺寸最初並不增加，諸如白蛋白的小蛋白質仍然能通過該膜。為了解釋該現象，人們指出在孔中和孔的邊緣存在有排斥同樣帶負電荷蛋白質的帶負電荷的分子(Kverneland，Feldt-Rasmussen et al.，Diabetologia，29(1986)，634-639；Deckert，Feldt-Rasmussen et al.，Kidney Int.，33(1988)，100-106；Kverneland，Welinder et al.，Diabetologia，31(1988)，708-710)。這些帶負電荷的分子是蛋白聚糖。蛋白聚糖是由共價結合有多糖鏈的蛋白質組成的複合大分子。多糖鏈主要由硫酸乙醯肝素組成，具有高的負電荷。體內最常見的蛋白聚糖是基底膜聚糖。基底膜聚糖是460kD的蛋白質，具有多個多糖側鏈(Murdoch and Iozzo，Virchows Arch.A.Pathol.Anat.Histoathol.，423(1993)，237-242；Iozzo，Cohen et al.，Biochem.J.，302(1994)，625-639；Murdoch，Liuet al.，J.Histochem.Cytochem.，42(1994)，239-249)。在糖尿病和微白蛋白尿患者中，腎小球基底膜中幾乎不存在硫酸乙醯肝素。在患有晚期糖尿病性腎病的患者中，即使仍存在蛋白鏈的情況下，在基底膜中也檢測不到硫酸乙醯肝素。該效應可以通過糖尿病患者中高糖血症狀況下硫酸乙醯肝素合成下降來解釋(Parthasarathy and Spiro，Diabetes，31(1982)，738-741；Deckert，Feldt-Rasmussen et al.，1988；Nakamura and Myers，Diabetes，37(1988)，1202-1211；Nerlich and Schleicher，Am.J.Pathol.，139(1991)，889-899；Makino，Ikeda et al.，Nephron，61(1992)，415-421；Scandling and Myers，KidneyInt.，41(1992)，840-846；Vernier，Steffes et al.，Kidney Int.，41(1992)，1070-1080；Tamsma，van den Born et al.，Diabetologia，37(1994)，313-320；Iozzo and San Antoniom，J.Clin.Invest.，108(2001)，349-355)。另外，還可表明硫酸乙醯肝素蛋白聚糖不僅可以通過其負電荷防止白蛋白的腎小球濾過，還可能負責基底膜內孔尺寸的整體性(Deckert，Kofoed-Enevoldsen et al.，Diabetologia，36(1993)，244-251)。因此，隨著腎機能不全的發生，硫酸乙醯肝素蛋白聚糖的喪失導致基底膜微結構的破壞。這些變化能夠解釋為何糖尿病性腎病的過程中出現大量的非選擇性蛋白尿，喪失較大的蛋白質，如免疫球蛋白。硫酸乙醯肝素還是腎小體中腎小球繫膜擴張的強抑制劑。由於腎小球繫膜結締組織的擴張通常發生在糖尿病患者中，因此這一點很有意思。所以，將糖尿病患者中硫酸乙醯肝素的喪失作為腎小球繫膜擴張的重要誘因並不令人奇怪。
但是，糖尿病患者中硫酸乙醯肝素的喪失不僅發生在腎臟中，還發生在幾乎所有的其他器官。因此，在視網膜、骨骼肌、動脈血管壁和皮膚的結締組織中與紅細胞上硫酸乙醯肝素都有明顯的下降。內皮細胞也表現出硫酸乙醯肝素合成下降(Yokoyama，Hoyer，et al.，Diabetes，46(1997)，1875-1880；van der pijl，daha et al.，Diabetologia，41(1998)，791-798)。由於硫酸乙醯肝素蛋白聚糖具有重要的抗血栓形成特徵，硫酸乙醯肝素蛋白聚糖的喪失還有助於在例如腎血管中形成微血栓，從而促進形成糖尿病性視網膜病(Marcum，Fritze et al.，Am J.Physiol.，245(1983)，H275-33；Marcum，McKenney et al.，J.Clin.Invest.，74(1984)，341-350；Marcum and Rosenberg，Biochemistry，23(1984)，1730-1737；Marcum，Atha et al.，J.Biol.Chem.，261(1986)，7507-7517)。硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(HSPG)的另一重要抗動脈硬化功能包括HSPG對血管平滑肌細胞增殖的抑制作用，其導致形成動脈血管損害。HSPG還抑制單核細胞(炎性細胞)與內皮下結締組織的結合。HSPG還抑制在形成動脈硬化中起關鍵作用的脂蛋白a和氧化LDL的內皮下結合和沉積。HSPG還是血管形成，即受損身體區域內新血管生成中的重要調控因子(Rosenberg，Shworak et al.，J.Clin.Invest.，100(1997)，p.67-75；Pillarisetti，Trens Cardiovasc.Med.，10(2000)，60-65；Iozzo and SanAntonio，2001)。因此，硫酸乙醯肝素蛋白聚糖的喪失不僅對於糖尿病性腎病和糖尿病性視網膜病的發生重要，在心血管併發症的發生中也是重要的。
另一個方面是微蛋白尿發生在高血壓患者中。迄今為止，該現象通過腎小體中血壓增加從而使白蛋白分泌增加來解釋。但是，如果這樣的話，患有持續高動脈血壓的患者必然也具有高心血管危險性，和它們是否表現出微白蛋白尿無關。但是，多項預期研究表明情況並非如此。與伴隨有其他相當危險如高膽固醇血症、吸菸史和糖尿病的類似高血壓患者相比，伴隨有微白蛋白尿的高血壓患者的心血管發病率和死亡率是其2倍(Sleight，J.Renin Angiotensin Aldosterone Syst.1(2000)，18-20；Crippa，J.Hum.Hypertens.，16(Suppl.1)(2002)，p.74-7；Diercks，van Boven et al.，Can.J.Cardiol.，18(2002)，525-535)。因此，微白蛋白尿是不依賴於心血管病發生和預後的危險參數。這只能通過微白蛋白尿患者中整個血管系統的變化來解釋。但是，迄今為止，尚不清楚高血壓患者中何種紊亂是微白蛋白尿的基礎。
本發明的目的是提供可以用於治療微白蛋白尿的試劑，尤其是治療糖尿病患者和高血壓患者中微白蛋白尿的試劑，以治療和/或預防與糖尿病相關的遠期效應，具體是糖尿病性視網膜病、糖尿病性腎病和糖尿病性神經病，和心血管併發症以及高血壓相關的心血管併發症。
本發明通過使用能夠減低或抑制蛋白激酶C-α(PKC-α)表達和/或活性的試劑來治療和/或預防血管病、心血管病、涉及蛋白尿的腎病、糖尿病遠期效應和/或糖尿病患者中的心血管併發症、高血壓患者中的心血管併發症和/或高膽固醇血症患者中的心血管併發症，實現了該目的。
在現有技術中，至今都認為蛋白激酶C的β2亞型負責糖尿病性併發症的發生。一方面，在糖尿病動物的組織中β2亞型的生成水平升高(Inoguchi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(1992)，11059-11063)，另一方面，蛋白激酶C-β特異性抑制劑LY333531導致蛋白尿減輕，表現為患有I型和II型糖尿病的嚙齒類動物的腎損傷減輕(Ishii et al.，J.Mol.Med.，76(1998)，21-31；Koya et al.，Faseb J.，14(2000)，439-447)。
令人奇怪的是，根據本發明的、不能形成蛋白激酶C-α的蛋白激酶C-α「敲除」小鼠通過鏈脲黴素誘導糖尿病後並不發生白蛋白尿。相比之下，除了蛋白激酶C-α表達變化外遺傳上基本相同的對照動物發生明顯的白蛋白尿。根據本發明，「敲除」動物的進一步驗證完全驚人地顯示該動物在糖尿病狀況下形成正常水平的硫酸乙醯肝素。相比之下，對照動物在糖尿病狀況下幾乎不形成硫酸乙醯肝素。
根據本發明進行的組織學檢查導致蛋白激酶C-α「敲除」小鼠的其他顯著變化。根據本發明，使用免疫組化方法，可以表明蛋白激酶C-α的缺失還導致VEGF(血管內皮生長因子)和相關受體(VEGF-R II)表達的顯著變化。在糖尿病對照動物中可以檢測到VEGF和VEGF-R II受體的表達量顯著增加，而蛋白激酶C-α「敲除」動物中發現VEGF和VEGF-R II受體的表達量有顯著較低的增加。該結果至關重要，因為VEGF表達增加是糖尿病性視網膜病發生的最重要調控因子之一(Aiello and Wong，Kidney Int.Suppl.，77(2000)，p.113-9；Benjamin，Am.J.Pathol.，158(2001)，1181-1184)。
從根據本發明的結果可以看出蛋白激酶C-α在調節硫酸乙醯肝素蛋白聚糖形成和蛋白尿出現中起著關鍵的作用。根據本發明的結果還表明與蛋白激酶C-β相比，蛋白激酶C-α在蛋白尿的出現中明顯起到更重要的作用，其中蛋白激酶C-β明顯能夠起到蛋白激酶C-α的至少部分功能。根據本發明的結果還表明蛋白激酶C-α亞型的抑制劑選擇性地預防糖尿病遠期效應如糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病和/或心血管併發症的發生以及伴隨有蛋白尿的疾病的發生。
因此，根據本發明，提供了降低或抑制蛋白激酶C-α(PKC-α)表達和/或活性的試劑用於治療和/或預防下列疾病的用途血管病、心血管病、涉及蛋白尿的腎病、糖尿病遠期效應和/或糖尿病患者中的心血管併發症、高血壓患者中的心血管併發症和/或高膽固醇血症患者中的心血管併發症。
在本發明的上下文中，「疾病」指器官或整個生物有機體中重要過程的紊亂，其導致主觀感覺或客觀可檢測的生理、心理或精神變化。「併發症」或「遠期效應」指隨之發生的疾病或繼發性疾病，即原發性臨床指徵之外發生的繼發性疾病。
根據本發明，要治療的疾病具體是血管病、心血管病、涉及蛋白尿的腎病、伴隨有和未伴隨有相關遠期效應和/或心血管併發症的糖尿病、伴隨有和未伴隨有相關心血管併發症的高血壓和/或伴隨有和未伴隨有相關心血管併發症的高膽固醇血症。
在本發明的上下文中，「血管病」具體指導致功能或器官循環障礙的動脈疾病。在本發明的一個優選實施方案中，血管病是周邊動脈阻塞性疾病。「動脈阻塞性疾病」指由動脈變狹窄或管腔閉塞變化所致的、導致依賴其血液供應的組織或器官中循環性缺血紊亂的疾病。具體地說，糖尿病導致由導致管腔閉塞的動脈硬化以及血管病與血管神經病等所致的慢性阻塞性疾病。
「心血管病」指影響心臟和循環功能的疾病，例如影響循環系統充血狀態和緊張性、心臟輸出機能、心臟和循環之間神經和體液偶聯機制等的疾病。在本發明的一個優選實施方案中，心血管病是冠心病、心肌梗塞和中風。
「冠心病」指原發性冠狀動脈供血不足的臨床表現，其中管狀脈管的收縮或阻塞使循環下降，從而使向心肌的運能基質供應和氧氣供應減少。
「心肌梗塞」指心肌局部區域的壞死，其最常發生為慢性冠心病的併發症。心肌梗塞的誘因是冠狀動脈供血不足中連續臨界循環不足和冠性痙攣延長。心肌梗塞經常表現為因心肌需氧增加而引起的肉體或精神壓力，或表現為血液供應的急性中斷。
「中風」(stroke或apoplex)指因腦動脈循環紊亂而引起的缺血性腦梗塞。中風是由栓塞引發的，所述栓塞來自顱外脈管的動脈硬化變化或心臟，較少由狹窄或腦微血管病變引發。
在本發明的上下文中，「涉及蛋白尿的腎病」具體指以尿中存在蛋白質為特徵的實質性腎病。蛋白尿可以是腎小球性蛋白尿、腎小管性蛋白尿或混合的腎小球-腎小管性蛋白尿。白蛋白和轉鐵蛋白的排他性腎排洩是例如微小病變性腎病中發生的選擇性蛋白尿的特徵。在非選擇性的蛋白尿中，尿中可以檢測到IgG。例如可以在腎澱粉樣變性病中發現這種類型的蛋白尿，在糖尿病性腎病的晚期階段也發現有這種類型的蛋白尿。腎小管性蛋白尿基於tubolo-間質病，其影響重吸收過程，導致排出低分子量蛋白質。臨床上，腎小管性蛋白尿是重要的，尤其與近端腎小管的其他缺陷相關時更是如此。其中，腎小管性蛋白尿發生在諸如遺傳性腎小管病、腎小管azidosis、細菌或藥物誘發的問質性腎炎、急性腎衰、重金屬中毒、Bence-Jones腎病的疾病中和腎移植的術後階段。混合的腎小球-腎小管蛋白尿經常基於伴隨有明確繼發性間質病變的原發性腎小球疾病。
因此，在本發明的一個實施方案中，涉及蛋白尿的腎病具體是微小病變性腎病、其他腎小球病、腎臟澱粉樣變性病、遺傳性腎小管病、腎小管azidosis、細菌或藥物誘發的間質性腎炎、急性腎衰、Bence-Jones腎病和腎移植的術後階段。
在本發明的上下文中，「糖尿病」指具有不同病因和症狀的各種形式單糖(glycose)代謝紊亂。共同的特徵是相對或絕對的胰島素缺乏。糖尿病特徵是永久性的血液葡萄糖水平增加(高血糖症)或不合時宜地利用所供應的葡萄糖。糖尿病可以進一步分為I型(胰島素依賴型；IDDM)和II型(非胰島素依賴型；NIDDM)。
糖尿病特異的和糖尿病相關的慢性併發症包括微血管病，諸如視網膜病、腎病和神經病、多發性神經病、糖尿病足(diabetic foot)、骨骼、支持組織和結締組織的病症以及微血管病，尤其是冠心病、腦循環病和周邊動脈阻塞性疾病。
「糖尿病性視網膜病」指糖尿病中發生的眼周微血管病。糖尿病性視網膜病的類型包括諸如視網膜出血、微觀動脈瘤、硬脂質沈積(hard exudate)、伴隨視力喪失的視網膜腫的非增殖性視網膜病(背景性視網膜病)和增殖性視網膜病，其中在視網膜上或視網膜前還出現還出現棉絮狀斑點(cotton-wool spot)和新血管生成(angioneogenesis)，伴隨有由血管阻塞所致視網膜缺血引起的玻璃體出血。增殖性視網膜病還導致牽引性視網膜剝落、新生血管性青光眼和失明。
在本發明的上下文中，「糖尿病性腎病」還稱作糖尿病性腎血管球硬化症，指對腎小球腎毛細血管的損傷。臨床上，糖尿病性腎病表現為蛋白尿、高血壓、水腫、基底膜的擴散變寬(diffuse widening)、腎小球繫膜肥大和伴隨血管腔收縮的腎小球曲的後期結節狀腫脹，以及毛細管壁與微觀動脈瘤中的纖維蛋白樣沉積。
在本發明的上下文中，「糖尿病性神經病」指周圍神經的疾病。具體地說，它是指系統性末稍感覺運動多發性神經病以及自主性神經病。周圍神經病通常表現在下肢，從腳開始，行至身體的近中心，雖然不經常但也影響手臂。症狀變化明顯，諸如疼痛、麻木和感覺錯亂的疾患經常導致惡化。
根據本發明，「糖尿病中的心血管併發症」指糖尿病誘發的心血管和血管病，尤其是周邊阻塞性疾病、冠心病、心肌梗塞和中風。
在本發明的上下文中，「高血壓」指以心臟收縮壓永久性增加至高於140mm Hg、心臟舒張壓永久性增加至高於90mm Hg為特徵的高血壓或高血壓性心臟病。根據本發明，「高血壓相關的心血管併發症」指高血壓誘發的心血管和血管病，尤其是周邊阻塞性疾病、冠心病、心肌梗塞和中風。
在本發明的上下文中，「高膽固醇血症」指血液中膽固醇水平增加，其中高膽固醇血症可以是原發性的，或者是因糖尿病而生的繼發性的。高膽固醇血症是動脈硬化的危險因素。根據本發明，「高膽固醇血症相關的心血管併發症」指高膽固醇血症誘發的心血管或和血管病，尤其是周邊阻塞性疾病、冠心病、心肌梗塞和中風。
在本發明的上下文中，「蛋白質激酶C」或「PKC」指在信號傳導中起重要作用的蛋白質家族，PKC蛋白通過使諸如酶、轉錄因子和/或細胞骨架蛋白的底物磷酸化而行使細胞內調節功能。例如，PKC蛋白的活化導致包括分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)在內的其他蛋白激酶的活化，這些蛋白激酶因此是PKC蛋白的底物。蛋白激酶C蛋白是主要的佛波酯受體。在哺乳動物細胞中，蛋白激酶C蛋白質家族包括至少12個亞型，進一步分為3個不同的亞家族。所謂的傳統蛋白質C亞型(cPKC)包括PKC-α、PKC-βI和其剪切變體βII以及PKC-γ亞型。所謂的新的蛋白激酶亞型(nPKC)包括PKC-δ、PKC-ε、PKC-η(eta)和PKC-θ亞型。所謂的非典型蛋白激酶C亞型(aPKC)包括PKC-ζ(zeta)和PKC-λ(還稱作PKC-iota)。其他的亞型有PKC-μ(還稱作蛋白激酶D)和PKC相關的激酶(PPK)，其可以是單獨的亞家族(Toker，Frontiers in Biosciences，3(1998)，d1134-1147)。PKC亞型在其胺基酸序列和編碼胺基酸序列的核酸序列上有區別(Coussens et al.，Sciences，233(1986)，859-866)。所有的PKC蛋白都具有一個域結構。其細胞表達模式、其活化機制及其底物特異性也不同。
多數蛋白激酶C亞型在活化之前都是非膜結合型的，瀰漫性地分布在胞漿中。通過用佛波醇化合物12-O-十四烷醯佛波醇-13-乙酸酯處理細胞激活每種亞型的活性，導致細胞形態的同工酶特異性變化和不同PKC同工酶向不同亞細胞結構中的快速且有選擇的重新分布。具體地說，蛋白激酶C-α亞型富集在內質網和細胞周緣，而PKCβII亞型富集在細胞骨架的富含肌動蛋白的微絲中。PKC亞型的底物特異性至少部分由活化的蛋白激酶C同工酶的亞細胞分布來介導。
「蛋白激酶C-α」指由鈣離子和二脂醯甘油活化的蛋白質，活化的蛋白激酶C-α具體富集在內質網中和細胞周緣。PKC-α的胺基酸序列和編碼PKC-α的核酸序列描述在Coussens et al.，Sciences，233(1986)，859-866中。PKC-α蛋白具有與其他cPKC蛋白類似的域結構。該蛋白質包括假底物結構域、富含半胱氨酸的區域、鈣結合結構域和催化結構域。PKC-α可以由二脂醯甘油、佛波酯、磷脂醯絲氨酸和鈣活化。
在本發明的上下文中，「降低或抑制蛋白激酶C-α表達的試劑」指體外和體內條件下能完全阻礙或至少降低功能性PKC-α蛋白合成的試劑，所述的降低或抑制涉及到編碼PKC-α的DNA序列轉錄成互補的mRNA序列、mRNA的加工、mRNA翻譯成多肽鏈、多肽的加工和/或多肽的翻譯後修飾。因此，使用降低或抑制蛋白激酶C-α表達的試劑可以導致產生無功能如不可活化的PKC-α；或者產生僅部分功能性的PKC-α蛋白。
在本發明的上下文中，「降低或抑制蛋白激酶C-α活性的試劑」指在體外和體內條件下能夠完全或部分消除功能性PKC-α蛋白生物學活性的試劑。例如，可以通過使所用試劑直接與PKC-α蛋白相互作用來實現PKC-α的完全或部分滅活。例如，可以通過共價或非共價結合來實現試劑和PKC-α蛋白之間的直接相互作用。例如，試劑和PKC-α蛋白之間的相互作用還導致蛋白激酶中的化學變化，從而使蛋白激酶的生物學活性喪失。舉例來說，所述的相互作用還導致PKC-α的特異性降解。但是，降低或抑制蛋白激酶C-α活性的試劑還可以是以一種方式修飾或消除或結合PKC-α的特異底物、靶結構或靶分子以使PKC-α的生物活性降低或完全抑制的試劑。降低或抑制PKC-α活性的試劑還可以是阻礙PKC-α在活化後，例如通過佛波醇處理而活化後轉移至內質網或細胞周緣、從而使PKC-α不能和其特異底物、靶結構或靶分子相互作用的試劑。
在本發明的一個具體實施方案中，根據本發明所用的試劑是特異性降低或抑制PKC-α表達和/或活性、但不降低或抑制其他PKC亞型如PKC-β表達和/或活性的試劑。
根據本發明，特異性降低或抑制PKC-α表達和/或活性的試劑選自降低或抑制蛋白激酶C-α基因表達的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述載體的宿主細胞、抑制或降低蛋白激酶C-α表達的物質、抑制蛋白激酶C-α轉位的物質、蛋白激酶C-α活性拮抗劑和蛋白激酶C-α活性抑制劑。
根據本發明，所用的核酸優選選自a)編碼人蛋白激酶C-α的核酸或其片段；b)與a)中核酸互補的核酸或其片段；c)通過替換、添加、易位和/或刪除a)或b)中核酸的一個或多個鹼基獲得的核酸或其片段；和d)與a)至c)中核酸具有高於80％同源性的核酸，或其片段。
在本發明的上下文中，「編碼蛋白激酶C-α的核酸或其片段」指編碼PKC-α蛋白或包含天然蛋白激酶C-α的功能結構域尤其是假底物結構域、富含半胱氨酸的區域、鈣結合結構域和催化結構域的片段的核酸。在本發明的一個優選實施方案中，根據本發明使用的核酸編碼人PKC-α或其部分。
在本發明的上下文中，「同源性」指至少80％、優選至少85％、更優選高於90％、95％、97％和99％的序列相同性。因此，技術人員公知的術語「同源性」指兩個或多個核酸分子之間的相關程度，其可以通過序列之間的一致性確定。
根據本發明使用的核酸可以是DNA或RNA序列，尤其是線形的DNA或RNA序列。核酸可以分離白天然來源，例如分離自真核組織，優選哺乳動物組織，更優選分離自人類組織，或合成製備。
根據本發明，具體提出如果用作試劑的核酸插入到載體中，尤其是表達載體中，可以在宿主細胞中以相對於啟動子的反義取向抑制人蛋白激酶C-α基因的表達。當根據本發明使用的核酸以反義取向插入到載體時，即當使用本發明所用核酸的反義構建體時，該核酸將作為反義核酸轉錄。隨後，當細胞中的天然PKC-α基因轉錄時，本發明所用核酸的反義轉錄產物可以通過Watson-Crisk鹼基配對與天然蛋白激酶C-α基因的、正義取向的mRNA轉錄物結合，形成雙聯體結構。通過這種方式，選擇性地抑制天然PKC-α基因的mRNA翻譯成多肽，特異性抑制天然PKC-α的表達，而不抑制其他細胞PKC亞型的表達。
在本發明的一個優選實施方案中，用於生成反義構建體的核酸不包含編碼PKC-α的完整序列，只是其片段。這種片段包含至少10個核苷酸，優選至少50個核苷酸，更優選至少200個核苷酸，其中選擇編碼PKC-α的序列中片段所涵蓋的核苷酸區域，使該片段在細胞中以反義取向表達時能特異性抑制PKC-α尤其是人PKC-α的表達，而不抑制其他PKC亞型如PKC-β亞型的表達。
根據本發明，上述核酸或其合適片段插入到位於至少一種表達調控元件控制之下的載體中，其中核酸和其片段以相對於所述表達調控元件的反義取向插入。這樣，將載體導入細胞，如哺乳動物細胞，尤其是人細胞後，核酸或其片段可以以反義取向表達，從而有效地抑制細胞中天然PKC-α的表達。優選的是，載體是質粒、粘粒、噬菌體或病毒。
因此，本發明還涉及包含編碼PKC-α的核酸序列或其片段的、位於至少一個表達調控元件功能控制之下的載體，其中核酸和其片段以相對於所述表達調控元件的反義取向插入。所述的表達調控元件具體是啟動子、核糖體結合位點、信號序列或3』轉錄終止子。
本發明的另一個實施方案涉及含有上述載體的宿主細胞。具體地說，宿主細胞是哺乳動物細胞，優選為人類細胞。在特別優選的形式中，人類細胞是成人幹細胞。
在本發明的一個優選實施方案中，使用合成製備的、包含至少10個核苷酸、優選至少50個核苷酸、更優選至少200個核苷酸的反義寡核苷酸來抑制PKC-α的表達。這種反義寡核苷酸可以直接用於抑制PKC-α表達，即不需要插入到載體中並在細胞環境下表達。在一個特別優選的實施方案中，這些PKC-α特異性反義寡核苷酸是IsisPharmaceuticals的產品ISIS 3521，其是蛋白激酶α表達的強選擇性抑制劑。在本發明的一個特別優選的實施方案中，本發明所用的PKC-α特異性反義寡核苷酸是Busutti etal.，J.Surg.Pathol.，63(1996)，137-142中所述的反義寡聚脫氧核苷酸。
根據本發明，例如在基因治療的範疇內，上述的核酸、含有這種核酸的載體或含有這種載體的宿主細胞同樣可以用作治療和/或預防下列疾病的試劑血管病、心血管病、涉及蛋白尿的腎病、遠期效應和/或糖尿病相關的心血管併發症、高血壓相關的心血管併發症和/或高膽固醇血症相關的心血管併發症。
在本發明的另一個優選的實施方案中，提到使用蛋白激酶C-α的活化因子抑制或降低蛋白激酶α的表達。優選的是，所述的活化因子是佛波醇化合物，尤其是12-O-十四烷醯佛波醇-13-乙酸酯(TPA)或佛波醇-12，13-二丁酸酯(PDBu)。已知細胞與PDBu孵育16h-24h的時間導致PKC-α的完全下調(Busutti et al.，J.Surg.Res.，63(1996)，137-142)。另外，還已知用高TPA濃度如1.6μM處理能完全抑制PKC-α的表達。因此，根據本發明，提出用濃度優選超過1.6μM的佛波酯對受折磨組織處理至少15h的時間，以部分或完全阻斷各組織或器官中PKC-α的表達。
在另一個優選的實施方案中，提出使用抑制劑來抑制或降低蛋白激酶α活性。在本發明的上下文中，「抑制劑」指競爭性抑制蛋白激酶C-α生物活性、變構改變PKC-α空間結構或通過底物抑制作用抑制PKC-α的物質。
在本發明的一個優選的實施方案中，抑制劑是與蛋白激酶C-α特異反應的抗體。「抗體」指基本由一種或多種免疫球蛋白基因或其片段編碼的、能夠特異性結合併識別分析物即抗原的多肽。抗體與PKC-α的結合抑制後者的生物活性。根據本發明，抗蛋白激酶C-α的抗體可以使用完整的免疫球蛋白，或使用通過各種肽酶切割產生的多種片段。本發明所用的術語「抗體」還涉及修飾的抗體，例如寡聚的抗體、還原的抗體、氧化的抗體和標記的抗體。術語「抗體」還包括抗體片段，其通過修飾整個抗體製備或使用重組DNA方法從頭合成。因此，術語「抗體」包括能與表位決定簇結合的完整分子及其片段，如Fab、F(ab』)2和FV。這些抗體片段保留與相應抗原選擇性結合的能力。製備抗體及其片段的方法是現有技術中公知的。
在本發明的優選實施方案中，根據本發明使用的、抑制蛋白C-α活性的抗體是單克隆或多克隆抗體。根據本發明，抗體還可以是人源化抗體。在本發明的一個特別優選的實施方案中，用於抑制蛋白激酶C-α活性的抗體是Goodnight et al.，J.Biol.Chem.，270(1995)，9991-10001中所述的抗體。
在本發明進一步優選的一個實施方案中，提出根據本申請使用的、用於抑制PKC-α的抑制劑改變蛋白激酶C-α的磷酸化狀態，從而抑制或至少降低PKC-α的活性。從Tasinato et al.，Biochem.J.，334(1998)，243-249中可以了解α-生育酚可以通過改變PKC-α的磷酸化狀態滅活細胞蛋白激酶C-α。因此，在本發明一個特別優選的實施方案中，提出使用α-生育酚抑制PKC-α的活性，從而治療和/或預防血管病、心血管病、涉及蛋白尿的腎病、糖尿病遠期效應和/或糖尿病患者中的心血管併發症、高血壓患者中的心血管併發症和/或高膽固醇血症患者中的心血管併發症。
在本發明進一步優選的一個實施方案中，提出使用PKC-α拮抗劑治療和/或預防血管病、心血管病、涉及蛋白尿的腎病、糖尿病遠期效應和/或糖尿病患者中的心血管併發症、高血壓患者中的心血管併發症和/或高膽固醇血症患者中的心血管併發症。在本發明的上下文中，「拮抗劑」指和PKC-α競爭與PKC-α特異性底物的結合、但與底物結合後不導致PKC-α相同效應的物質。術語「拮抗劑」還包括結構與PKC-α特異性底物的非活化構象相適應、從而阻礙PKC-α對底物的活化的物質。
在本發明的一個優選實施方案中，使用能與天然PKC-α的底物結合、但與之結合後不導致天然PKC-α相同效應的PKC-α衍生物作為拮抗劑來抑制PKC-α活性。
在本發明的上下文中，「衍生物」指蛋白激酶C-α的功能等同物或衍生物，其可以通過替換原子或分子基團或殘基、同時保留PKC-α的基本結構而獲得，和/或其胺基酸序列在至少一個位置上與天然存在的人或動物PKC-α分子序列不同，但是其在胺基酸水平上具有高度的胺基酸同源性。根據本發明，術語「衍生物」還包括融合蛋白，其中另一個蛋白質例如另一個PKC-α抑制因子的功能結構域存在於N-末端或C-末端部分。
例如，衍生物和天然PKC-α之間的差異可以緣自編碼PKC-α胺基酸序列的核苷酸序列的突變，如缺失、替換、插入、增加、鹼基互換和/或重組。當然，這些差異還可以是天然存在的序列變異，例如另一生物有機體的序列或以天然方式突變的序列；或者通過本領域中常見的手段如化學試劑和/或物理試劑引入相應序列中的突變。
在本發明的另一個優選實施方案中，使用PKC-α的類似物作為拮抗劑抑制PKC-α的活性。在本發明的上下文中，蛋白激酶C的「類似物」指不具有與蛋白激酶C-α相同的胺基酸序列、但三維結構與蛋白激酶C-α高度類似的化合物。根據本發明使用的PKC-α的類似物優選具有與PKC-α相似的底物特異性特徵，即它們能與PKC-α特異的底物結合，但是優選不具有PKC-α的催化特徵。因此，舉例來說，根據本發明使用的蛋白激酶C-α類似物可以是含有負責蛋白激酶C-α與PKC-α底物以合適構象結合的胺基酸殘基、能夠模擬蛋白激酶C-α結合區域基本特徵、但不具有蛋白激酶C-α相同催化活性的化合物。
在本發明的另一個實施方案中，提出對於治療和/或預防血管病、心血管病、涉及蛋白尿的腎病、遠期效應和/或糖尿病患者中的心血管併發症、高血壓患者中的心血管併發症和/或高膽固醇血症患者中的心血管併發症來說，使用不僅能同時降低或抑制蛋白激酶C-α(PKC-α)表達和/或活性、還能同時降低或抑制蛋白激酶C-β(PKC-β)表達和/或活性的試劑。在J.Invest.Dermatol.，117(2001)，605-611中，Takahashi和Kamimura描述免疫抑制劑環孢菌素A同時降低蛋白激酶Cα、βI和βII亞型的表達。因此，在本發明一個特別優選的實施方案中，提出使用環孢菌素A降低PKC-α和PKC-β的表達，從而治療上述疾病。
在本發明的另一個優選實施方案中，提出將特異性降低或抑制蛋白激酶C-α表達和/或活性的試劑和特異性降低或抑制蛋白激酶C-β表達和/或活性的試劑聯用。根據本發明，「蛋白激酶C-β」包括蛋白激酶C-βI和移接變體βII。
根據本發明，提出降低或抑制蛋白激酶C-β表達和/或活性的試劑選自降低或抑制蛋白激酶C-β基因表達的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述載體的宿主細胞、抑制或降低蛋白激酶C-β表達的物質、抑制蛋白激酶C-β轉位的物質、蛋白激酶C-β活性拮抗劑和蛋白激酶C-β活性抑制劑。
根據本發明，用作試劑的核酸選自
a)編碼人蛋白激酶C-β的核酸或其片段；b)與a)中核酸互補的核酸或其片段；c)通過替換、添加、易位和/或刪除a)或b)中核酸的一個或多個鹼基獲得的核酸或其片段；和d)與a)至c)中核酸具有高於80％同源性的核酸，或其片段。
在本發明的一個優選實施方案中，根據本發明所用的核酸編碼人PKC-α或其部分。
根據本發明使用的核酸可以是DNA或RNA序列，尤其是線形的DNA或RNA序列。核酸可以分離自天然來源，例如分離自真核組織，優選哺乳動物組織，更優選分離自人類組織，或合成製備。
根據本發明，具體提出如果用作試劑的核酸插入到載體中，尤其是表達載體中，可以在宿主細胞中以相對於啟動子的取向反義抑制人蛋白激酶C-β基因的表達。當根據本發明使用的核酸以反義取向插入到載體時，即當使用本發明所用核酸的反義構建體時，該核酸將作為反義核酸轉錄。隨後，當細胞中的天然PKC-β基因轉錄時，本發明所用核酸的反義轉錄產物可以通過Watson-Crisk鹼基配對與天然蛋白激酶C-α基因的、正義取向的mRNA轉錄物結合，形成雙聯體結構。通過這種方式，選擇性地抑制天然PKC-β基因的mRNA翻譯成多肽，特異性抑制天然PKC-β的表達，而不抑制其他細胞PKC亞型的表達。
在本發明的一個優選實施方案中，提出用於生成反義構建體的核酸不包含編碼PKC-β的完整序列，只是其片段。這種片段包含至少10個核苷酸，優選至少50個核苷酸，更優選至少200個核苷酸，其中選擇編碼PKC-β的序列中片段所涵蓋的核苷酸區，使該片段在細胞中以反義取向表達時能特異性抑制PKC-β尤其是人PKC-β的表達，而不抑制其他PKC亞型的表達。
根據本發明，提出上述核酸或其合適片段插入到位於至少一種表達調控元件控制之下的載體中，其中核酸和其片段以相對於所述表達調控元件的反義取向插入。這樣，將載體導入細胞後，核酸或其片段可以以反義取向表達，從而有效地抑制細胞中天然PKC-β的表達。優選的是，載體是質粒、粘粒、噬菌體或病毒。
因此，本發明還涉及包含編碼PKC-β的核酸序列或其片段的、位於至少一個表達調控元件功能控制之下的載體，其中核酸和其片段以相對於所述表達調控元件的反義取向插入。所述的表達調控元件具體是啟動子、核糖體結合位點、信號序列或3』轉錄終止子。
本發明的另一個實施方案涉及含有上述載體的宿主細胞。具體地說，宿主細胞是哺乳動物細胞，優選為人類細胞。在特別優選的形式中，人類細胞是成人幹細胞。
在本發明的一個優選實施方案中，使用合成製備的、包含至少10個核苷酸、優選至少50個核苷酸、更優選至少200個核苷酸的反義寡核苷酸來抑制PKC-β的表達。這種反義寡核苷酸可以直接用於抑制PKC-α表達，即不需要插入到載體中並在細胞環境下表達。
在本發明的另一個優選的實施方案中，提出使用與蛋白激酶C-β或其片段特異反應的抗體來抑制PKC-β的活性。根據本發明，抗體可以是單克隆或多克隆抗體。根據本發明使用的抗體還可以是人源化抗體。
在本發明進一步優選的一個實施方案中，提出使用改變PKC-β磷酸化狀態的物質來抑制蛋白激酶C-β的活性。
在本發明的另一個優選實施方案中，提出使用作為PKC-β拮抗劑的蛋白激酶C-β衍生物或類似物來抑制PKC-β活性。優選的是，根據本發明使用的蛋白激酶C-β衍生物或類似物是和天然PKC-β競爭與PKC-β特異性底物的結合、但與底物結合後不導致PKC-β相同效應的物質。
在本發明一個特別優選的實施方案中，使用文獻US 5,491,242、US 5,661,173、US 5,481,003、US 5,668,152、US 5,672,618、WO 95/17182、WO 95/35294和WO 02中所述的化合物特異性抑制和降低蛋白激酶C-β的表達和/或活性。
本發明的另一個優選的實施方案涉及特異性降低或抑制蛋白激酶C-α(PKC-α)表達和/或活性的試劑在製備用於治療和/或預防下列疾病的藥用組合物中的用途冠心病、心肌梗塞、周邊阻塞性疾病、中風、涉及蛋白尿的腎病、糖尿病遠期效應和/或糖尿病患者中的心血管併發症、高血壓患者中的心血管併發症和/或高膽固醇血症患者中的心血管併發症。根據本發明，心血管併發症優選為冠心病、心肌梗塞、周邊阻塞性疾病和中風。糖尿病遠期效應具體是糖尿病性視網膜病、糖尿病性神經病和糖尿病性腎病。
在本發明的上下文中，「藥用組合物」或「藥物」指用於診斷、治療和/或預防目的的混合物，即能夠促進或恢復人體或動物體健康的混合物，其包含至少一種天然或合成製備的、產生治療效果的活性成分。藥用組合物可以是固體和液體混合物。例如，包含活性成分的藥用組合物可含有一種或多種藥學上可接受的組分。另外，藥用組合物可以包含本領域中常用的添加劑，例如穩定劑、production agent、分離劑、崩解劑、乳化劑或常用於製備藥用組合物的其他物質。
根據本發明，具體提出使用特異性降低或抑制蛋白激酶C-α(PKC-α)表達和/或活性的試劑作為活性成分來製備治療和/或預防上述疾病的藥物。在本發明的一個優選實施方案中，用於製備藥用組合物的試劑選自降低或抑制蛋白激酶C-α基因表達的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述載體的宿主細胞、抑制或降低蛋白激酶C-α表達的物質、抑制蛋白激酶C-α轉位的物質、蛋白激酶C-α活性拮抗劑和蛋白激酶C-α活性抑制劑。
更優選的，用於製備根據本發明的藥用組合物的試劑是編碼蛋白激酶C-α的基因的反義寡核苷酸、生育酚、佛波醇化合物、蛋白激酶C-α衍生物或蛋白激酶C-α類似物。
在本發明的一個優選實施方案中，提出使用藥用組合物進行腸道外施用，尤其是靜脈內、肌肉內、皮內或皮下施用。優選的是，含根據本發明使用的試劑的藥物是注射或灌注劑型。
在本發明的另一個實施方案中，提出含根據本發明使用的試劑的藥用組合物是口服給藥。例如，藥物以液體劑型如溶液、懸液或乳液形式施用，或以固體劑型如片劑形式施用。
因此，本發明還涉及治療和/或預防下列疾病的藥用組合物冠心病、心肌梗塞、周邊阻塞性疾病、中風、涉及蛋白尿的腎病、糖尿病遠期效應和/或糖尿病患者中的心血管併發症、高血壓患者中的心血管併發症和/或高膽固醇血症患者中的心血管併發症，所述藥用組合物包含特異性降低或抑制蛋白激酶C-α(PKC-α)表達和/或活性的至少一種試劑作為活性成分。
在一個優選的實施方案中，包含在藥用組合物中的試劑選自降低或抑制蛋白激酶C-α基因表達的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述載體的宿主細胞、抑制或降低蛋白激酶C-α表達的物質、抑制蛋白激酶C-α轉位的物質、蛋白激酶C-α活性拮抗劑和蛋白激酶C-α活性抑制劑。
更優選的，用於製備根據本發明的藥用組合物的試劑是編碼蛋白激酶C-α的基因的反義寡核苷酸、生育酚、佛波醇化合物、蛋白激酶C-α衍生物或蛋白激酶C-α類似物。
在本發明的另一個優選的實施方案中，根據本發明的藥用組合物包含至少一種其他活性成分。具體地說，所述的活性成分是特異性降低或抑制蛋白激酶C-β表達和/或活性的試劑。
優選的，特異性降低或抑制蛋白激酶C-β表達和/或活性的試劑選自降低或抑制蛋白激酶C-β基因表達的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述載體的宿主細胞、抑制或降低蛋白激酶C-β表達的物質、抑制蛋白激酶C-β轉位的物質、蛋白激酶C-β活性拮抗劑和蛋白激酶C-β活性抑制劑。
本發明其他有利的實施方案可以從從屬權利要求中看出。
通過附圖和實施例進一步說明本發明。


圖1說明患有糖尿病和未患有糖尿病(對照)的PKC-α「敲除」小鼠、患有糖尿病和未患有糖尿病(對照)的SV129小鼠的尿中白蛋白的排洩。使用間接的ELISA分析法確定白蛋白濃度。非糖尿病性SV129和PKC-α-/-小鼠具有通常低於10g/mol的相當白蛋白/肌酸酐(Creatinin)比例。相比之下，糖尿病性SV129小鼠的比例明顯較高(p＝0.004)。糖尿病性PKC-α-/-小鼠的值比糖尿病性SV129小鼠的值明顯較低(p≤0.001)。橫槓(transverse bar)表示中值。通過Mann-Whitney U檢驗計算顯著性。
圖2說明患有糖尿病和未患有糖尿病(對照)的PKC-α「敲除」小鼠、患有糖尿病和未患有糖尿病(對照)的SV129小鼠中的腎小球VEGF表達。對於每個動物組，通過免疫組化方法半定量評價40個腎小球，並將值分成弱、中等和強免疫螢光。通過Mann-Whitney U檢驗計算顯著性。與對照動物相比，糖尿病動物中VEGF表達明顯較高(p＜0.001)。但是，糖尿病SV129動物中VEGF表達比糖尿病性PKC-α-/-動物明顯較高(p＜0.001)。
圖3說明患有糖尿病和未患有糖尿病(對照)的PKC-α「敲除」小鼠、患有糖尿病和未患有糖尿病(對照)的SV129小鼠中的腎小球VEGF受體II表達。對於每個動物組，通過免疫組化方法半定量評價40個腎小球，並將值分成弱、中等和強免疫螢光。通過Mann-Whitney U檢驗計算顯著性。與對照動物相比，糖尿病動物中VEGF受體II表達明顯較高(p＜0.001)。但是，糖尿病SV129動物中VEGF受體II表達比糖尿病性PKC-α-/-動物明顯較高(p＜0.001)。
圖4說明患有糖尿病和未患有糖尿病(對照)的PKC-α「敲除」小鼠、患有糖尿病和未患有糖尿病(對照)的SV129小鼠中的腎小球基底膜聚糖表達。對於每個動物組，通過免疫組化方法半定量評價40個腎小球，並將值分成弱、中等和強免疫螢光。通過Mann-Whitney U檢驗計算顯著性。與SV129對照動物相比，糖尿病SV129動物中基底膜聚糖表達明顯較低(p＜0.001)。
實施例1實驗性糖尿病誘導將小鼠於22℃、自由攝食和飲水的標準條件下飼養，經Lower Saxony動物保護管理機構的批准進行下述實驗。
在開始實驗之前，測定所有動物的血清血糖水平。結果如表1所示。在16隻SV129對照小鼠和14隻SV129蛋白激酶C-α敲除(PKC-α-/-)小鼠中，通過注射鏈脲黴素(streptozotozin)誘導糖尿病。鏈脲黴素破壞胰腺中生成胰島素的胰島細胞。所導致的胰島素缺陷致使永久性的血糖水平增加，即高血糖症，從而導致糖尿病。為了產生高血糖症，在第1天和第4天，給動物腹腔注射125mg鏈脲黴素/kg體重。為此，將鏈脲黴素溶解於pH值為4.5的50mM的檸檬酸鈉溶液中。對於對照來說，在第1天和第4天僅腹腔注射溶劑。然後，每2天從小鼠尾部取出一滴血，以檢測血糖水平。通過Bayer Glucometer Elite測定裝置進行血糖測定。使用Glucometer EliteSensor測試條加以確定。
在第7-10天，施用鏈脲黴素的動物發生糖尿病，血糖水平在350mg/dl之上。鏈脲黴素注射之前的起始值平均為200mg/dl。僅注射溶劑的動物未表現出血糖水平的增加，不發生糖尿病。首次注射後10天，繼續對動物觀察8周。在此期間，每2天檢測血糖水平，以確保糖尿病動物仍患有糖尿病。在此期間，糖尿病動物的血糖水平在平均約500-550mg/dl之間變動，非糖尿病動物的血糖水平平均約200mg/dl。
8周後，用麻醉性阿佛丁將動物麻醉。然後在麻醉狀態下，從眼靜脈叢取出400μl血液，用27G針頭進行穿刺從膀胱中取出全部膀胱尿。接著，通過腹側大動脈用林格乳酸鹽溶液對腎臟進行灌注，摘除腎臟。緊接著在麻醉狀態下將動物處死。然後，測定血清中的血糖水平。血糖水平如表1所示。從中可以看出，與實驗開始時和非糖尿病對照動物相比，糖尿病動物具有高出約2.5-3倍的葡萄糖水平。
表1實驗開始前和實驗結束時糖尿病和非糖尿病小鼠中的血清葡萄糖
與非糖尿病對照動物相比*p≤0.001實施例2測定白蛋白濃度糖尿病患者中白蛋白尿的發生是已知的現象。因此，測定了患有糖尿病和未患有糖尿病(對照)的PKC-α「敲除」小鼠、患有糖尿病和未患有糖尿病(對照)的SV129小鼠中的白蛋白排洩。為此，測定了所收集尿液中的白蛋白濃度。為了測定白蛋白濃度，使用間接的ELISA分析法(Exocell Inc.的Albuwell M，Philadelphia，USA)。這種ELISA分析對於小鼠白蛋白是特異的。根據生產商的指導進行這種測定。為了解決排尿的差異，根據尿液中的肌酸酐水平測定白蛋白值。結果如圖1所示。結果發現非糖尿病SV129和PKC-α-/-小鼠具有通常低於10g/mol的相當白蛋白/肌酸酐比例。相比之下，糖尿病SV129小鼠的比例明顯較高(p＝0.004)。非糖尿病SV129對照動物的中值是21.5g/mol和7.48g/mol。相比之下，糖尿病PKC-α-/-小鼠的白蛋白尿沒有顯著增加。白蛋白/肌酸酐比例總是低於20g/mol，中值為10.2g/mol。非糖尿病PKC-α-/-對照小鼠的中值為8.5g/mol。糖尿病PKC-α-/-小鼠的值顯著低於糖尿病SV129小鼠的值(p＜0.001)。結果如圖1所示。
實施例3測定VEGF和VEGF受體II表達如實施例1所述，實驗結束時處死所有動物。緊接著，摘除腎臟並凍於-70℃。對所摘除腎臟的進一步分析表明糖尿病對照動物的腎小體(腎小球)中「血管內皮生長因子」(VEGF)和VEGF受體II(VEGFR-II)的表達顯著增加。通過免疫組化方法進行VEGF和VEGFR-II表達的檢測。因此，將凍於-70℃的腎臟冷凍切割成6nm的厚度並風乾。然後，將冷凍切片(cryo-slice)用冰醋酸固定，風乾並用tris緩衝液(TBS0.05M tris緩衝液，0.15M NaCl，pH 7.6)洗滌。接著將冰凍切片在保溼室中與抗小鼠VEGF(Santa Cruz，A-20)或VEGFR-II(Santa Cruz，C-1158)的一級多克隆「兔」抗體孵育60分鐘。再次用TBS洗滌後，將切片與Cy3-標記的二級「抗兔」抗體(Jackson Immunresearch Laboratories，711-165-152)於室溫下孵育30分鐘，再次用TBS洗滌。隨後，通過Zeiss Axioplan-2顯微鏡(Zeiss，Jena，德國)對標本進行評價和照相。在所有動物中，對40個腎小球中的每一個進行評價，將螢光強度分為強、中等和弱。與非糖尿病對照動物相比，發現糖尿病SV129對照動物中VEGF和VEGFR-II表達顯著增加(p＜0.001)。相比之下，糖尿病SV129小鼠和PKC-α-/-小鼠中表達的增加明顯較小(p＜0.001)。結果示於圖2和3。
實施例4測定基底膜聚糖表達由於所測定的單獨VEGF表達差異並不能說明白蛋白尿的差異，因此還通過免疫組化方法驗證了糖尿病和非糖尿病動物中硫酸乙醯肝素蛋白聚糖基底膜聚糖的表達。如實施例3所述製備和包埋腎臟的冷凍切片。使用抗小鼠基底膜聚糖的單克隆大鼠抗體(RDI Systems，A7L6)作為一抗。使用Cy-3標記的驢抗大鼠抗體(JacksonImmunresearch Laboratories，712-165-153)作為二抗。切片的免疫組化檢驗得出完全令人驚奇的結果糖尿病對照動物中檢測不到或幾乎檢測不到基底膜聚糖(參見圖4)。在腎小球和細動脈血管壁中都檢測不到基底膜聚糖。相比之下，SV129小鼠和PKC-α-/-小鼠中基底膜聚糖的表達沒有變化，或稍有下降。由於硫酸乙醯肝素的缺乏是蛋白尿發生中的主要介質之一，因此認為該結果可以說明不存在蛋白尿。
權利要求
1.降低或抑制蛋白激酶C-α(PKC-α)表達和/或活性的試劑在治療和/或預防下列疾病中的用途血管病、心血管病、涉及蛋白尿的腎病、糖尿病遠期效應和/或糖尿病患者中的心血管併發症、高血壓患者中的心血管併發症，和/或高膽固醇血症患者中的心血管併發症。
2.根據權利要求1的用途，其中所述的血管病和心血管病選自周邊阻塞性疾病、冠心病、心肌梗塞和中風。
3.根據權利要求1的用途，其中所述的心血管併發症是周邊阻塞性疾病、冠心病、心肌梗塞和/或中風。
4.根據權利要求1的用途，其中所述的糖尿病遠期效應是糖尿病性視網膜病、糖尿病性神經病和/或糖尿病性腎病。
5.根據權利要求1的用途，其中所述涉及蛋白尿的腎病是實質性腎病。
6.根據權利要求5的用途，其中所述的蛋白尿是腎小球性蛋白尿、腎小管性蛋白尿或混合的腎小球-腎小管性蛋白尿。
7.根據權利要求5或6的用途，其中所述的腎病是微小病變性腎病、其他腎小球病、腎臟澱粉樣變性病、遺傳性腎小管病、腎小管azidosis、細菌或藥物誘發的間質性腎炎、急性腎衰、Bence-Jones腎病或腎移植。
8.根據權利要求1-7中任意一項的用途，其中所述試劑特異性降低或抑制蛋白激酶C-α(PKC-α)的表達和/或活性。
9.根據權利要求8的用途，其中所述試劑選自降低或抑制蛋白激酶C-α基因表達的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述載體的宿主細胞、抑制或降低蛋白激酶C-α表達的物質、抑制蛋白激酶C-α轉位的物質、蛋白激酶C-α活性拮抗劑和蛋白激酶C-α活性抑制劑。
10.根據權利要求9的用途，其中所述核酸在宿主細胞中以相對於啟動子的反義取向來抑制人蛋白激酶C-α基因的表達。
11.根據權利要求9或10的用途，其中所述的核酸選自a)編碼人蛋白激酶C-α的核酸或其片段；b)與a)中核酸互補的核酸或其片段；c)通過替換、添加、易位和/或刪除a)或b)中核酸的一個或多個鹼基獲得的核酸或其片段；和d)與a)至c)中核酸具有高於80％同源性的核酸，或其片段。
12.根據權利要求11的用途，其中所述的核酸片段包含至少10個核苷酸，優選至少50個核苷酸，更優選至少200個核苷酸。
13.根據權利要求9-12中任意一項的用途，其中所述的核酸是DNA或RNA。
14.根據權利要求9-13中任意一項的用途，其中所述的核酸或其片段以反義取向插入到位於至少一個表達調控元件控制之下的載體中。
15.根據權利要求14的用途，其中所述的載體是質粒、粘粒、噬菌體或病毒。
16.根據權利要求14或15的用途，其中所述的表達調控元件是啟動子、核糖體結合位點、信號序列或3』轉錄終止子。
17.根據權利要求14-16中任意一項的用途，其中所述的載體包含在宿主細胞中。
18.根據權利要求17的用途，其中所述的宿主細胞是哺乳動物細胞，尤其是人類細胞。
19.根據權利要求9的用途，其中所述的抑制或降低蛋白激酶C-α表達的物質是蛋白激酶C-α的活化因子。
20.根據權利要求19的用途，其中所述的活化因子是佛波醇化合物。
21.根據權利要求20的用途，其中所述的佛波醇化合物是12-O-十四烷醯佛波醇-13-乙酸酯(TPA)或佛波醇-12，13-二丁酸酯(PDBu)。
22.根據權利要求9的用途，其中所述的抑制劑是與蛋白激酶C-α反應的抗體。
23.根據權利要求22的用途，其中所述的抗體是單克隆或多克隆抗體。
24.根據權利要求22或23的用途，其中所述的抗體是人源化抗體。
25.根據權利要求9的用途，其中所述的抑制劑改變蛋白激酶C-α的磷酸化狀態。
26.根據權利要求25的用途，其中所述的抑制劑是生育酚。
27.根據權利要求9的用途，其中所述的拮抗劑是蛋白激酶C-α的衍生物或類似物。
28.根據權利要求1-7中任意一項的用途，其中所述的降低或抑制蛋白激酶C-α表達和/或活性的試劑是同時降低或抑制蛋白激酶C-β表達和/或活性的試劑。
29.根據權利要求28的用途，其中所述的試劑是環孢菌素A。
30.根據權利要求1-27中任意一項的用途，其中將特異性降低或抑制蛋白激酶C-α表達和/或活性的試劑與特異性降低或抑制蛋白激酶C-β表達和/或活性的試劑聯用。
31.根據權利要求30的用途，其中所述的降低或抑制蛋白激酶C-β表達和/或活性的試劑選自降低或抑制蛋白激酶C-β基因表達的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述載體的宿主細胞、抑制或降低蛋白激酶C-β表達的物質、抑制蛋白激酶C-β轉位的物質、蛋白激酶C-β活性拮抗劑和蛋白激酶C-β活性抑制劑。
32.根據權利要求31的用途，其中所述的核酸選自a)編碼人蛋白激酶C-β的核酸或其片段；b)與a)中核酸互補的核酸或其片段；c)通過替換、添加、易位和/或刪除a)或b)中核酸的一個或多個鹼基獲得的核酸或其片段；和d)與a)至c)中核酸具有高於80％同源性的核酸，或其片段。
33.根據權利要求32的用途，其中所述的核酸片段包含至少10個核苷酸，優選至少50個核苷酸，更優選至少200個核苷酸。
34.根據權利要求31-33中任意一項的用途，其中所述的核酸是DNA或RNA。
35.根據權利要求31-34中任意一項的用途，其中所述的核酸或其片段以反義取向插入到位於至少一個表達調控元件控制之下的載體中。
36.根據權利要求35的用途，其中所述的載體是質粒、粘粒、噬菌體或病毒。
37.根據權利要求35或36的用途，其中所述的表達調控元件是啟動子、核糖體結合位點、信號序列或3』轉錄終止子。
38.根據權利要求35-37中任意一項的用途，其中所述的載體包含在宿主細胞中。
39.根據權利要求38的用途，其中所述的宿主細胞是哺乳動物細胞，尤其是人類細胞。
40.根據權利要求31的用途，其中所述的抑制劑是與蛋白激酶C-β反應的抗體。
41.根據權利要求40的用途，其中所述的抗體是單克隆或多克隆抗體。
42.根據權利要求40或41的用途，其中所述的抗體是人源化抗體。
43.根據權利要求31的用途，其中所述的抑制劑改變蛋白激酶C-β的磷酸化狀態。
44.根據權利要求31的用途，其中所述的拮抗劑是蛋白激酶C-β的衍生物或類似物。
45.降低或抑制蛋白激酶C-α(PKC-α)表達和/或活性的試劑在製備用於治療和/或預防下列疾病的藥用組合物中的用途冠心病、心肌梗塞、周邊阻塞性疾病、中風、涉及蛋白尿的腎病、糖尿病遠期效應和/或糖尿病患者中的心血管併發症、高血壓患者中的心血管併發症，以及高膽固醇血症患者中的心血管併發症。
46.根據權利要求45的用途，其中所述的心血管併發症是冠心病、心肌梗塞、周邊阻塞性疾病或中風。
47.根據權利要求45的用途，其中所述的糖尿病遠期效應是糖尿病性視網膜病、糖尿病性神經病和糖尿病性腎病。
48.根據權利要求45-47中任意一項的用途，其中所述的試劑選自降低或抑制蛋白激酶C-α基因表達的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述載體的宿主細胞、抑制或降低蛋白激酶C-α表達的物質、抑制蛋白激酶C-α轉位的物質、蛋白激酶C-α活性拮抗劑和蛋白激酶C-α活性抑制劑。
49.根據權利要求48的用途，其中所述的試劑是編碼蛋白激酶C-α的基因的反義寡核苷酸、生育酚、佛波醇化合物、蛋白激酶C-α的衍生物或蛋白激酶C-α的類似物。
50.一種用於治療和/或預防下列疾病的藥用組合物冠心病、心肌梗塞、周邊阻塞性疾病、中風、涉及蛋白尿的腎病、糖尿病遠期效應和/或糖尿病患者中的心血管併發症、高血壓患者中的心血管併發症，以及高膽固醇血症患者中的心血管併發症，所述的組合物包含降低或抑制蛋白激酶C-α(PKC-α)表達和/或活性的至少一種試劑作為活性成分。
51.根據權利要求50的藥用組合物，其中所述的試劑選自降低或抑制蛋白激酶C-α基因表達的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述載體的宿主細胞、抑制或降低蛋白激酶C-α表達的物質、抑制蛋白激酶C-α轉位的物質、蛋白激酶C-α活性拮抗劑和蛋白激酶C-α活性抑制劑。
52.根據權利要求51的藥用組合物，其中所述的試劑是編碼蛋白激酶C-α的基因的反義寡核苷酸、生育酚、佛波醇化合物、蛋白激酶C-α的衍生物或蛋白激酶C-α的類似物。
53.根據權利要求50-52中任意一項的藥用組合物，包括至少一種其他活性成分。
54.根據權利要求53的藥用組合物，其中所述的其他活性成分是特異性降低或抑制蛋白激酶C-β表達和/或活性的試劑。
55.根據權利要求54的藥用組合物，其中所述的降低或抑制蛋白激酶C-β表達和/或活性的試劑選自降低或抑制蛋白激酶C-β基因表達的核酸、包含所述核酸的載體、包含所述載體的宿主細胞、抑制或降低蛋白激酶C-β表達的物質、抑制蛋白激酶C-β轉位的物質、蛋白激酶C-β活性拮抗劑和蛋白激酶C-β活性抑制劑。
全文摘要
本發明涉及阻礙蛋白激酶Cα(PKC－)表達和/或活性的試劑的用途，尤其是用於治療患有糖尿病及諸如糖尿病性腎病、視網膜病或神經病的併發症的患者的用途。
文檔編號A61K31/355GK1684694SQ03822801
公開日2005年10月19日 申請日期2003年9月23日 優先權日2002年9月24日
發明者揚·梅內, 赫爾曼·哈勒爾 申請人:菲諾斯有限公司