被分析物的電化學分析方法

2023-05-22 18:48:11 1

專利名稱：被分析物的電化學分析方法
技術領域：
本發明涉及被分析物的電化學檢測方法以及該方法中所使用的感應電極。
用生物傳感器對生物流體中的被分析物如各種抗原、抗體、DNA分子等的電化學分析，是最有前途和吸引力的儀器分析方法之一。對該領域持續不減的興趣和大量的出版物是由於該方法有許多基本優點，即高靈敏度、簡便，以及採用相對簡單而廉價的設備。
本領域眾所周知，生物傳感器裝置的設計是基於採用導電聚合物膜，如聚吡咯或聚噻吩，這種膜將與被分析物的存在相關的化學信號變成可測量的電信號(參見[1]和[2])。
EP-A-0193154描述了一種電化學檢測使用的電極，該電極的表面被塗以聚吡咯或聚噻吩膜。與待測的被分析物互補的生物受體被吸附到聚合後的導電聚合物膜表面上。WO 8911649描述了另一種生產電化學分析中所用的聚合物電極的方法。在該方法中，含有所需結合特異性的生物受體分子在聚合期間被引入導電聚合物膜中。採用EPA-0193154和WO 89/11649中所描述的方法，對於每個給定的分析，必須合成不同的感應電極，在該電極上含有能夠特異性結合欲測被分析物的固定化生物受體。
PCT申請人公開的申請PCT/GB98/00548描述了一種電化學分析的電勢測定方法，該方法使用的電化學感應電極包括金屬電勢電極又覆以包含與受測被分析物特異性結合的固定化生物受體分子的導電聚合物層。該被分析物的存在是通過被分析物結合至該固定化生物受體時，該感應電極表面電荷的變化而顯示出來的。被分析物的檢測是通過下列過程進行的首先安裝包括感應電極和參比電極的電化學電池，將這兩個電極通過浸於固定pH值的工作緩衝溶液中的測量裝置相連。首先記錄感應電極和參比電極之間電勢差的基值，然後將感應電極和參比電極與包含被分析物、具有較高離子強度但與工作緩衝溶液相同pH值的溶液相接觸，並再次記錄電勢差。最後將該感應電極和參比電極轉至乾淨的工作緩衝溶液中，並再次記錄電勢。在恆定的pH值下，由於被分析物存在，離子強度變化引起的感應電極和參比電極之間電勢差的變化與被分析物的濃度成正比。
如參考文獻[13、14、15、16]和[3]中所示，具有含生物受體聚合物膜的感應電極對周圍溶液離子強度的階段變化(所謂「離子階段」步驟)的響應(電勢變化的大小和比率)，在很大程度上是由聚合物膜上的電荷決定的。除構成膜的材料之外，該聚合物膜電荷是由結合於其上的受體分子的電荷決定的。如果受體電荷隨其與特異性被分析物的親合性反應而變化，由於在感應電極與測試流體接觸之後進行的離子階段步驟，感應電極的響應也發生變化。應當注意，由於大多數被分析物的兩性性質，受體電荷取決於溶液的pH值，所以在離子階段步驟中保持溶液的pH值恆定是非常重要的。
因此在前述方法中，基於感應電極對該感應電極與測試流體接觸前後進行的離子階段過程響應的變化的測定，有可能確定與結合於感應電極的受體特異性結合的被分析物在測試流體中的存在。在理想的情況下，膜中受體電荷的變化以及由此感應電極響應的變化直接與結合於該感應電極的受體特異性結合的被分析物在測試流體中的濃度成正比。然而，在真實的條件下，相同被分析物的電荷能夠顯著地變化，產生不一致的定量結果。此外，親合性反應並不總是伴隨著受體電荷變化。這在測試小的或非荷電的抗原時經常發生[14]。
總之，以前基於使用導電聚合物電極的電化學檢測方法的缺點包括複雜性，感應電極製造工藝工業化受限制，所得的感應電極特性的不一致性，無性能損失存放感應電極的能力受限制。此外，前述的電化學檢測規程，特別是在PCT/GB98/00548中所述方法，限制了對小分子、非荷電的分子或其等電點接近於固定在感應電極表面上受體的等電點的分子的檢測。
本發明提供一種分析樣品中被分析物的電化學分析方法，該方法很大程度上沒有上述方法所固有的缺點，由於能夠分析小分子和非荷電的分子，拓寬了其適用範圍，提供嚴格的定量結果，使該電極製造工藝更適應工業生產方法，增加分析效率，改善重現性，因此提高了所得結果的可靠性。
因此，本發明的第一方面是提供一種用於電化學檢測被分析物方法的感應電極，該感應電極包括一種塗有含銜接分子的導電聚合物的導電電極，這些銜接分子選自抗生物素蛋白質、抗生蛋白鏈菌素、抗-FITC抗體和一種能夠結合到至少一類被固定於其中的或被吸附於其上的受體分子的分子。
使用感應電極的電化學分析方法所固有的主要問題之一是長時間保持固定於感應電極上受體的天然性質。該領域已經實現的相關進展僅僅是有限的酶感應電極[7]。對大多數在文獻[8、9、10]中使用提純受體的電化學感應電極，根本沒有說明其有效的保存期限。保持固定化受體之天然性質在將抗體用作受體時特別關鍵，這可歸因於它們固有的高度構型可變性。
相反，眾所周知，當將抗體及其他生物分子以濃溶液形式保存時，經過長久時間仍保持其有用的性質；所以，在使用前乃至在電化學檢測過程中，可能通過受體的快速固定來解決在無損工作特性的情況下延期儲存感應電極的問題。
在本公開發明中，該問題是通過利用被固定在或被吸附至導電聚合物上的所謂銜接分子來解決的。銜接分子的作用是將對受檢被分析物特異性的受體分子連接至感應電極的表面上。正如將在下面所討論的那樣，藉助於使用銜接分子，有可能在感應電極生產中暫時分離工序。因此，下面方法是可行的，製造出含有被固定的/被吸附的銜接分子的電極，將其長時間儲存，然後在電化學分析之前或者在電化學分析期間將特異性受體固定在該電極上。選擇適當的銜接分子，也可能製造包含能夠結合整個系列不同受體分子的銜接分子的通用感應電極。僅僅通過將適當特異性的受體結合到銜接分子上，就可在賦予「通用的」感應電極對受測被分析物的特異性。所以在電沉積過程中，不再需要引入所需的特異性的受體。
抗生物素蛋白和抗生蛋白鏈菌素優選用作銜接分子。抗生物素蛋白質，一種從生雞蛋中獲得的蛋白質，是由四種同樣的肽亞單位組成，其中每一種都具有一個能夠與輔助因子生物素分子結合的位點。生物素(維生素H)是一種存在每種活細胞中的極微量輔酶，並被發現主要結合在蛋白質或多肽上。生物素分子進入與抗生物素蛋白質或抗生蛋白鏈菌素(從某些細菌溫育物(例如鏈黴菌屬aviation)中分離的一種抗生物素蛋白質)的結合反應，並在該反應期間形成事實上非解離的「生物素-抗生物素蛋白質」(絡合物常數約10-15mol/l)的能力是眾所周知的[11、12]。
由本公開發明的發明人進行的調查表明，被固定在導電聚合物膜中抗生物素蛋白質和抗生蛋白鏈菌素在延長的時間內保持其原來的天然性質(至少一年並可能更長)，並在此期間一直能夠用於與生物素綴合受體連接。生物素與許多不同分子綴合的技術在本領域是眾所周知的。因此，僅僅通過結合適當的生物素化的受體，就能夠製造出對給定的被分析物特異性的含有固定化抗生物素蛋白質或抗生蛋白鏈菌素的感應電極。
雖然抗生物素蛋白質和抗生蛋白鏈菌素是優選的銜接分子，但使用替代性銜接分子，特別是那些能夠與至少一類受體分子特異性結合的分子屬於在本發明的範疇。替代性銜接分子中包括蛋白質A、蛋白質G和外源凝集素。這些分子均可結合至少一類受體分子，即表明它們能特異性結合位於一組受體分子中每個成員的共同結合位點，其結合相互作用的離解常數為小於10-8mol/l。例如，蛋白質A(一種42kD的多肽，分離於金黃色葡萄球菌或通過DNA重組技術得到)可在Fc區域結合免疫球蛋白，特別是多種哺乳動物的IgG分子；而且蛋白質G(IgG的Ⅲ型Fc受體，參見Bjorck,L.和Kronvall,G.,J.Immunol.,(1984)133,969)也可在Fc區域結合多種哺乳動物的IgG。外源凝集素是結合在糖蛋白或碳水化合物的糖部分的蛋白質。每種類型的外源凝集素對一定的糖部分具有特異性，因此將能結合多種帶有恰當的糖部分的糖蛋白或複合碳水化合物。
在更進一步的實施方案中，抗-FITC抗體能被用作銜接分子。在這一實施方案中，針對被分析物的感應電極的特異性能夠通過結合具有適度特異性的抗FITC抗體標記的受體而確定。
在導電聚合物膜中或其上使用銜接分子，在與感應電極接觸時通過減少測試溶液中組分的非特異性的相互作用，也可顯著地改進在電化學中所得分析的結果的可靠性，這與銜接分子阻滯該導電聚合物的自由表面有關。銜接分子的使用同樣增加該感應電極製造工藝的技術效率，例如消除了對另外的表面阻滯過程的需要。
本發明的電勢測定感應電極製造成本低，因此為了方便起見，能夠以一次性使用的形式生產，意指被用來進行單個電化學檢測實驗或一系列檢測實驗，然後丟棄。本發明更進一步提供一種包括電化學檢測需要的感應電極和參比電極的電極裝置。如以下將討論的那樣，合適的參比電板包括銀/氯化銀和甘汞電極。該電極裝置能夠方便地作為一種一次性使用的部件提供，其包括一種裝有連接感應電極和參比電極電觸點的、由廉價材料製造的容器或支架。
本發明的感應電極可被用於各類的電化學分析過程，包括(而不限定於)對抗原的雙抗體夾層結構分析法、對抗體的雙抗原夾層結構分析法、對抗原的競爭性分析法、對抗體的競爭性分析法、測定人體抗體血清的血清分析法(如使用標記的抗人類抗體的風疹IgG抗體)和IgM分析法(如IgM風疹抗體)。
因此，本發明的第二方面是提供一種用於電化學檢測被分析物方法的感應電極的製備方法，該感應電極包括一種用含有銜接分子的導電聚合物塗制的導電電極，這些銜接分子選自抗生物素蛋白質、抗生蛋白鏈菌素和一種能夠與至少一類被固定於其中的受體分子結合的分子，該方法包括下列步驟(a)製備一種含有導電聚合物單體和銜接分子的電化學聚合溶液，(b)將欲塗制的電極浸入該電化學聚合溶液中，和(c)在該電極和該電化學聚合溶液之間施加一種循環電勢，通過該溶液聚合物的電化學合成來塗制該電極，所述被施加的循環電勢為至少一全循環。
本發明進一步提供一種用於樣品中被分析物的電化學檢測方法之感應電極的製備方法，該感應電極包括一種塗有含銜接分子的導電聚合物的導電電極，這些銜接分子選自抗生物素蛋白質、抗生蛋白鏈菌素和一種能夠與至少一類被吸附於其上的受體結合的分子。該方法包括下列步驟(a)製備一種含有導電聚合物單體的電化學聚合溶液，(b)將欲塗制的電極浸入在該電化學聚合溶液中，(c)在該電極和該電化學聚合溶液之間施加一種循環電勢，通過該溶液的聚合物電化學合成塗制該電極，所述被施加的循環電勢為至少一全循環；和(d)將該塗制過的電極與一種含有銜接分子的溶液接觸，以使該銜接分子被吸附在該電極的導電聚合物塗層上。
按照本發明的方法，通過單體溶液的電化學合成，一種導電聚合物膜被沉積在導電的電極表面上。該導電電極優選是一種具有金屬或準金屬導電性，在水介質中穩定的標準電勢電極。正如將在本文實施例中說明的那樣，導電聚合物膜電沉積的實施是通過使用一種包含單體、極性溶劑和本底電解質的溶液中進行的。吡咯、噻吩、呋喃或苯胺為優選單體。去離子水優先作為極性溶劑使用。
如所屬技術領域的專業人員眾所周知的那樣，為了改變該聚合物的結構和/或傳導性質，該導電聚合物往往在電化學合成階段被摻雜。通常摻雜的陰離子是在聚合步驟引入硫酸根(SO42-)，以中和該聚合物骨架上的正電荷。硫酸根不易於由離子交換釋放，因此有助於保持該聚合物的結構。在本發明中，優選使用具有與聚合物周圍溶液最大離子交換容量的摻雜陰離子，以增加電極的靈敏性。當製備電化學溶液時，通過將一種其陰離子具有大離子半徑的鹽用作本底電解質即可達到此目的。具有大離子半徑的合適鹽類包括十二烷基硫酸鈉和葡聚糖硫酸鹽。這些電化學聚合溶液中鹽類的濃度按測試類型在0.005-0.05M範圍內變化。
如同許多論文中報導的那樣[4、5]，對於浸於溶液中的導電聚合物，與其發生離子交換的容易程度和與其達到離子平衡的快速性基本上取決於在電沉積階段引入的抗-離子的大小抗-離子的離子半徑越大，越易於發生離子交換反應，越快達到平衡狀態。這與「金屬電極-導電聚合物」體系應答溶液中離子組分改變時電勢變化的數值和速率直接關聯[6]。
該導電聚合物膜完成雙重職能，既結合感應電極表面的受體，又表示該感應電極對緩衝溶液中成分變化的敏感性。特別是影響導電聚合物氧化還原組成的緩衝溶液組成的變化導致感應電極的穩態電勢發生相應的變化。
銜接分子可以通過在電化學合成階段將銜接分子添加至電化學聚合溶液中而被固定在導電聚合物膜上，或者在電化學聚合之後被吸附在導電聚合物膜的表面。在前一種情況下，銜接分子的溶液可在澱積過程之前被迅速加到電沉積溶液中。如果配製的溶液的存儲時間不超過30分鐘，沉積過程運行最佳。根據測試的特定類型，在該溶液中銜接分子的濃度可在5.00-100.00μg/ml的範圍內變化。自包含銜接分子的溶液中電沉積導電聚合物的過程在本文包括的實施例中描述。在完成電沉積步驟時，所得的感應電極可用去離子水和0.01M磷酸鹽緩衝溶液依次衝洗，根據測試的類型，可將其放置在一種包含微生物生長抑制劑或殺菌劑(如慶大黴素)的特定存儲緩衝溶液中，或在室溫下的無塵空氣中乾燥。
在完成電沉積步驟之後，可使用下列規程(雖然在此陳述該規程，但本發明決不局限於應用該特定的方法)將銜接分子吸附到膜上，首先將感應電極用去離子水衝洗，並放入新製備的0.02M碳酸鹽緩衝液中，將它在其中保持15-60分鐘。然後通過將感應電極浸入一個充滿新製備的含有1.00-50.00μg/ml濃度銜接分子的0.02M碳酸鹽緩衝溶液的容器中，或通過在感應電極的表面上滴一滴該溶液，使該感應電極與該溶液相接觸。該感應電極一般在+4℃與銜接分子溶液共同溫育1-24小時。在溫育之後，將該感應電極用去離子水衝洗，並在0.01M的磷酸鹽緩衝溶液中放置1-4小時。根據測試的類型，該感應電極既可放置在含有微生物生長抑制劑或殺菌劑的特定存儲緩衝溶液中，也可在室溫下的無塵空氣中乾燥。
當銜接分子是抗生物素蛋白質或抗生蛋白鏈菌素時，本發明上述的用於生產感應電極的製備方法可任選進一步將塗制的電極與一種含有與生物素綴合的特異性受體溶液接觸，以使所述生物素化的受體通過生物素/抗生物素蛋白質或生物素/抗生蛋白鏈菌素結合相互作用結合到被固定於或被吸附至電極的導電聚合物塗層上的抗生物素蛋白質或抗生蛋白鏈菌素分子上。
由本發明的作者和他人[12]進行的研究表明，在最佳條件下，與它們的非生物素化的等價物相比，生物素化的受體並不改變其性質(親合性、存儲質量等等)。
生物素與相應受體的綴合，作為本領域技術人員所熟知的生物素化的方法，可以應用已知的步驟之一進行，如[12]中所述。此外，許多製備好的特異性不同的生物素化受體有市售產品，例如由美國Calbiochem-Novabiochem製備的抗人IgG或抗人IgA羊生物素標記的抗體。
應用生物素化受體的重要的優點之一是通過結合於感應電極上的抗生物素蛋白質或抗生蛋白鏈菌素與相應生物素化受體之間所產生的反應，能夠改變感應電極的特異性。如前所述，與抗生物素蛋白質/抗生蛋白鏈菌素所結合的感應電極實際上是一種「通用的感應電極」，對受檢目的分子的特異性是通過結合適當的生物素化受體所確定的。為了製備含對受檢被分析物有特異性的抗生物素蛋白質或抗生蛋白鏈菌素的感應電極，需要完成結合在感應電極上的抗生物素蛋白質或抗生蛋白鏈菌素與生物素化受體之間的反應，為此，感應電極與後者的溶液在室溫下接觸，既可將該感應電極浸入一個充滿該溶液的容器中，也可將該溶液滴在感應電極表面(溶液中生物素化受體的濃度通常為0.1-100μg/ml；接觸時間3-15分鐘)。
這些受體分子可以是任何一種能夠特異性結合另一種分子(被分析物)的分子。適當類型的受體包括單克隆和多克隆抗體、嵌和體抗體、保留能夠識別抗原的抗體片段(如Fab和Fab2碎片)、重組蛋白質和其片段、合成肽、抗原、單股DNA、RNA或者PNA分子、激素、激素受體、酶、化合物等。
如上所述，在本領域已知的使用電勢感應電極的電化學檢測方法在檢測小的和非荷電的抗原時，其用途受到限制。為了克服這個問題，並為了得到嚴格定量的結果，可以使用與電荷標記物綴合的次級受體或者競爭分子。
所以，本發明更進一步地提供一種檢測樣品中被分析物的電化學檢測方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種含有導電聚合物塗層的感應電極，該塗層含有被固定於其中或者被吸附於其上的特異性結合樣品中目的待測被分析物的受體；(b)將感應電極浸入一種含有樣品的試液中，以使所述目的被分析物與所述被固定的或者被吸附的受體結合；(c)將該感應電極與一種含有次級受體的溶液接觸，該次級受體能夠與該被分析物在空間上不同於與被固定或者被吸附的受體的結合位點的位點上結合，並且該次級受體與一種電荷標記物綴合；(d)當處理過的感應電極與參比電極浸入一種電解液中時，監測兩者之間的電勢差；和(e)在恆定pH值下，電解液的離子強度改變之後，監測感應電極與參比電極之間的電勢差。
上述方法的親合性反應步驟等價於一種本領域技術人員所眾所周知的標準夾層結構分析。該夾層結構的分析程序對多價抗原的檢測特別有用，在測試中所用的受體和被標記的次級受體是其結合在抗原上不同的、空間上不同的抗原決定簇的抗體。該夾層結構形式還可用於攜帶兩個或更多同樣的抗原決定簇，其在空間上是分開的抗原。在後者的情況下，受體與標記的次級受體被用於測試同樣特異性的抗體。
在競爭性分析形式中完成電化學分析同樣在本發明的範疇之內。所以，本發明還提供一種樣品中被分析物的電化學檢測方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種含有導電聚合物塗層的感應電極，該塗層含有被固定於其中或者被吸附於其上的能夠結合樣品中目的待測被分析物的受體；(b)將感應電極浸入一種含有樣品的溶液中，以使該目的被分析物與所述被固定的或者被吸附的受體結合；(c)將感應電極與含有能夠與被固定或被吸附的受體結合的競爭分子的溶液接觸，該競爭分子與一種電荷標記物綴合；(d)當處理過的感應電極與參比電極浸入一種電解液中時，監測兩者之間的電勢差；並且(e)在恆定pH值下，電解液的離子強度改變之後，監測感應電極與參比電極之間的電勢差。
在這一競爭性的電化學分析中，競爭分子可以是能夠結合在被固定的/被吸附的受體上相同的被分析物結合部位的被標記的被分析物，或者是被標記的被分析物的結構類似物(參見圖5B和圖7B)。為了檢測小的被分析物分子(如地高新，如在本發明所包括的實施例中所述的)，使用被標記的被分析物作為競爭分子是特別優選的。作為一種替代方案，競爭分子可以與固定/被吸附的受體上不同的位點結合。例如，如果被固定的受體是抗體，競爭分子可以是抗免疫球蛋白的抗體(優選是Fab特異性的)或一種具有適度特異性的抗遺傳型抗體(參見圖5A和圖7A)。
正如將易於被所屬技術領域的專業人員所理解的那樣，參考本申請的圖5A、5B、7A和7B，競爭性的檢測方法通常取決於該感應電極表面上的過剩受體位點。那些不結合被分析物的受體將可用於結合競爭分子。假定受體位點的總額保持恆定，結合競爭分子的數量將與被分析物存在的數量成反比。
為了將與被分析物濃度有關的化學信號轉換為一種可測量的電信號，與次級受體或者競爭分子綴合的電荷標記物可以是任何具有下列性質的電荷(ⅰ)在(d)部分電解液pH值下攜帶一種淨電荷(正電或者負電)；和(ⅱ)在恆定pH值下，該電荷數量的變化相應於該電解液離子強度的變化。
優選該電荷標記物帶有大量電荷，即在(d)部分電解液的pH值下具有大於一個靜電單位(e)的淨電荷。合適的電荷標記物包括金、二茂鐵和膠乳微球。電荷標記物上的電荷大小影響感應電極上導電聚合物塗層的氧化還原組分，致使步驟(d)和(e)之間的離子強度的階段變化在感應電極和參比電極之間的電勢差可以被檢測到。在形成受體/被分析物/次級受體複合物(夾層結構分析法)或者受體/競爭分子複合物(競爭分析法)時，電荷標記物是唯一最接近導電聚合物的成分。由於能夠測試小的和非荷電的被分析物，因此使用電荷標記物可以獲得正確的定性結果，並顯著擴展可測試的被分析物的範圍。
與次級受體或者競爭分子綴合的膠乳微球體是優選的電荷標記物。與膠乳微球體的綴合可使用已知技術之一進行，例如，如[17]或者[18]所描述的那樣，或者遵循由該廠家提供的規程，使用特定的用於抗體與膠乳微球體綴合的市售試劑盒，例如由Polysciences Inc.,USA製造的「用於羧化珠的碳化二亞胺試劑盒」。某些製成的膠乳綴合體是由專業製造廠家市售的，如Polysciences Inc.,USA。
作為使用電荷標記物的可替代的方案，為將與被分析物濃度有關的化學信號轉換成一種可測量的電信號，還可以採用相當於上述的那些方法，使用次級受體或者競爭分子與一種酶標物綴合來完成電化學檢測過程。
所以，本發明更進一步提供一種在樣品中的被分析物的電化學檢測方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種具有導電聚合物塗層的感應電極，該塗層含有被固定於其中或者被吸附於其上的能夠結合在樣品中目的被待測分析物的受體；(b)通過將該感應電極浸入一種含有樣品的溶液中，以使所述的被分析物結合到所述的被固定的或者被吸附的受體上；(c)將該感應電極與一種含有次級受體的溶液接觸，該次級受體能夠與該被分析物在空間上不同於被固定或者被吸附的受體的結合位點的位點上結合，並且該次級受體與一種酶綴合；(d)將處理過的感應電極與參比電極浸在在一種電解液之中，監測兩者之間的電勢差；並且(e)在接觸一種含有所述酶作用底物的電解液後，監測該感應電極與參比電極之間的電勢差。
在本發明範疇內的還有相應的競爭性的電化學檢測方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種含有導電聚合物塗層的感應電極，該塗層含有被固定於其中或者被吸附於其上的能夠結合在樣品中目的待測被分析物的受體；(b)通過將該感應電極浸入一種含有樣品的溶液中，以使該目的被分析物結合到所述被固定的或者被吸附的受體上；(c)將感應電極與一種含有能夠結合到被固定的或者被吸附的受體上的競爭分子的溶液接觸，該競爭分子與一種酶綴合；(d)將處理過的感應電極與參比電極浸在一種電解液之中，記錄兩者之間的電勢差；並且(e)在接觸一種含有所述酶作用底物的電解液之後，記錄該感應電極與參比電極之間的電勢差。
在上述方法的一個實施方案中，與次級受體或者競爭分子綴合的酶能夠將一種直接影響感應電極的導電聚合物塗層的氧化還原組成的底物，轉換成一種對導電聚合物的氧化還原組成沒有可檢測作用的產物。
在一種可替代的實施方案中，與次級受體或者競爭分子綴合的酶能夠將一種對電化學聚合物的氧化還原組成沒有可檢測作用的底物，轉換成一種能夠直接或者間接影響該導電聚合物的氧化還原組成的產物。這樣一種酶的實例是辣根過氧化酶。一種酶促反應的產物可間接影響該導電聚合物的氧化還原組成的方法是造成電解液的pH值變化(因為該實施方案電解液的pH值不是緩衝的)。一種產生這類產物的酶的實例是脲酶。
在一種更進一步實施方案中，與次級受體或者競爭分子綴合的酶能夠將一種對導電聚合物感應電極的導電聚合物塗層的氧化還原組成沒有可檢測作用的產物，轉化成作為第二種酶的底物的產物，該第二種酶的作用是產生一種直接或者間接影響該導電聚合物的氧化還原組成的第二種產物。
在所有的實施方案中，綴合酶通過形成受體/被分析物/次級受體絡合物(夾層結構分析法)或者通過形成受體/競爭分子絡合物(競爭形式法)進入導電聚合物的近程。
次級受體或者競爭分子與酶標記物的綴合可以通過本領域任何已知的技術完成(參見例如[19])。也可以使用不同酶標記物與不同特異性受體的綴合體的廣泛市售製劑。
上述所有電化學檢測的方法可以使用能夠特異性結合至另一種分子(被分析物)的任何類型的受體完成。適當的受體類型包括單克隆和多克隆的抗體、嵌和體抗體、保持能夠辨認抗原的抗體碎片(如Fab和Fab2碎片)、重組體蛋白質和其碎片、合成肽、抗原、單股DNA、RNA或者PNA分子、激素、激素受體、酶、化合物等。
無論次級受體還是競爭分子與電荷或酶標記物綴合，對本發明所有檢測方法的最大程度的特異性和靈敏度是通過親合性反應(即(a)至(c)步驟)以一種「順序的」形式實現的，特別是當受檢被分析物是一種多價抗原(即夾層結構分析)時。在該順序的形式中，含結合受體的感應電極首先與含有待測被分析物存在的樣品的試液接觸。本文所用的術語「樣品」包括此範圍內所要檢測被分析物存在的任何材料，包括生物學流體如全血、血清、血漿、尿、淋巴、腦脊髓液流體或者精液、環境的流體、在飲食工業使用或者生產的材料，或者上述所有的被分析物的稀釋或者提取物。該樣品也可以包括固體物料的溶液或者提取物。用於該試液的容器可以是一種微量滴定板的澆口窩、微離心管或者任何其它適當大小的容器。根據感應電極的幾何的尺寸，試液的體積通常是5-200μl。在15-40℃、有或者無連續混合下，通常將感應電極和試液接觸3-30分鐘。
與試液接觸後，該感應電極被轉入一種裝有標記的次級受體溶液的容器中。所用的容器和溶液的體積與用於感應電極和試液接觸的容器和體積類似。依賴於檢測所需要的靈敏度，標記的次級受體或者標記的競爭分子在溶液中的濃度通常為1-100μg/ml。在15-40℃、有或者無連續混合下接觸3-30分鐘。
作為一種「順序的」形式可替代的方案，可以通過將感應電極與已經添加適當標記的次級受體或者標記的競爭分子的試液接觸，接觸時間為大約5-60分鐘，同時完成(b)和(c)步驟，以大大減少總的測試時間和簡化測試步驟。根據其類型、特異性和檢測所需要的靈敏度，加到試液中的標記的次級受體或者標記的競爭分子的濃度通常為1-100μg/ml。
為了消除使所得結果失真的在受檢生物學流體和感應電極的表面之間可能的非特異性相互作用，以及標記的次級受體或者標記的競爭分子在該感應電極上的非特異性吸附，可向標記的次級受體或者標記的競爭分子的溶液中加入各種阻滯劑。合適的阻滯劑包括牛血清白蛋白(0.5％-5％)，人血清白蛋白(0.5-5wt.％)，稀釋的正常人或者動物血清(5-10vol％)，白明膠(10-50vol.％)等等。在這種情況下，標記的次級受體或者標記的競爭分子與感應電極的相互作用同時伴隨有對感應電極任何自由表面的阻滯。
在本發明的全部檢測方法中，可以使用包含被固定的/被吸附的銜接分子的感應電極。特別是受體分子可通過生物素/抗生物素蛋白質、生物素/抗生蛋白鏈菌素、蛋白質A/抗體、蛋白質G/抗體、FITC、抗-FITC或者外源凝集素/糖的結合相互作用附著於感應電極的表面上。
使用包含銜接分子的「通用」感應電極允許該檢測方法以「一鍋」的形式完成。在這一實施方案中，親合性反應在一種使相互作用分子之間最大接觸，並保證了最高靈敏度和最短的檢測時間的均勻溶液中完成。在這種情況下，將受體溶液和標記的次級受體或者標記的競爭分子的溶液同時或者順序加到在單個反應容器中含有假定包含被分析物樣品的試液中。在試液中受體和標記的次級受體或者標記的競爭分子的濃度通常分別為0.1-100μg/ml和1-100μg/ml。然後將試液在15-40℃、有或者沒有連續混合的情況下溫育5-60分鐘，以使結合反應發生。然後將包含適當銜接分子的感應電極或者通過浸入包含試液的容器或者通過在該感應電極表面上滴一滴試液使之與試液接觸。在15-40℃下，感應電極和試液之間的接觸時間通常為3-30分鐘。然後用「離子步驟」程序，或者根據次級受體或者競爭分子是否已用電荷或者酶標物所標記，通過加入適當的酶底物，測量被分析物結合於感應電極的數量。
一旦該親合性反應全部完成，通過將感應電極和參比電極連接到測量儀器來安裝電化學電池，與電解質溶液接觸(此處同樣指工作溶液)，在固定時間內用測量裝置記錄感應電極相對於參比電極的電極電勢。市售的適當大小的參比電極或者為實現本發明特定目的設計的電極可用作參比。測量儀器是一種標準電勢測定的測量儀或者電勢穩定器。還可以使用為實現本發明目的而設計的並通過常規軟體控制的PC兼容電子測量儀器。
為了方便起見，可以通過一種為連接感應電極和參比電極的裝有電觸點的專用刀杆，將該感應電極和參比電極與測量儀器連接，並通過電纜或者其他設備連接到測量儀器上。還可以使用與測量儀器一體的支架，從而使該測量系統的總尺寸能夠小型化。
水性緩衝液用作工作溶液磷酸鹽-鹽水、Tris-HCl、碳酸鹽、碳酸氫鹽、乙酸鹽、硼酸鹽等等。按照感應電極的幾何的尺寸，電化學電池的工作溶液的體積在50至5000μl之間。緩衝溶液的容器可以是具有最小吸附作用性質材料的任何合適尺寸的容器，如標準微量滴定板的澆口窩。本公開的發明的另一個實施方案是一種變體，其中一種小體積的(＜1cm3)流通池用於與該感應電極和參比電極的整體支架連接，緩衝溶液可以通過蠕動泵或者通過其他設備泵送。
使用一種連接到電勢測定的測量裝置或者電壓穩定器的圖表記錄儀，或者通過一種使用PC-兼容電子儀器的特定程序，在固定時間記錄感應電極相對於參比電極的電勢。在後者的情況下，該程序在預定時段測量感應電極相對於參比電極的電勢(通常為每3-5秒，總共10-100秒)並以「感應電極信號-時間」為坐標點的形式顯示結果。記錄感應電極電勢相對於參比電極電勢，以測定感應電極的本底電勢值V1，並評估該感應電極的本底電勢漂移(γ)，其通過對「感應電極-時間」獲得的曲線使用最小二乘法的線性回歸計算。
如果該次級受體或者競爭分子與一種電荷標記物綴合，在恆定pH值下，在所謂的「離子-步驟」程序中，通過改變電解質溶液離子強度的來評估結合至該感應電極的被分析物的量。
在該離子步驟程序中，可以通過將支架與感應電極和參比電極從初始工作溶液轉移到具有相同組成只是離子強度不同的第二種工作溶液中，或者通過將不同離子強度的緩衝溶液(更高或者更低的)加到感應電極和參比電極被浸入其中的工作溶液中，改變電解質溶液的離子強度(增加或者減少)。如果使用流動池，可以通過使用一種不同離子強度的緩衝溶液排出池中初始工作溶液來改變電解質溶液的離子強度。
不同的離子強度工作溶液可以通過配製不同濃度的鹽類溶液得到，例如KCl、Na2SO4等，其使用是根據當它們被加到溶液中時完全離解並不改變溶液pH值的事實。工作溶液中鹽類的濃度為0.01M至0.1M。
如果該次級受體或者競爭分子與一種酶綴合，則沒有必要進行「離子步驟」程序。反而，工作溶液的組成通過加入一種該酶的適當底物而改變。為此，或者將支架與感應電極和參比電極一同從裝有初始工作溶液的容器轉移至裝有工作溶液加底物的容器中，或者將底物溶液直接加入感應電極和參比電極浸入其中的原始工作溶液中。如果使用流動池，工作溶液的組成可以通過用一種包含底物的工作溶液排出池中初始工作溶液來改變。
可以使用的底物包括ABTS({2,2′-偶氮基-雙[3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸]})、TMB(3,3,5,5′-四乙基聯苯胺)、DAB(3,3′-二氨基聯苯胺)(其中的酶標記物是過氧化酶)、尿素(其中的酶標記物是脲酶)、p-NPP(磷酸對-硝基苯酯)、BCIP(5-溴代-4-氯代-3-吲哚磷酸酯)(其中的酶標記物是鹼性磷酸酶)。
使用一種測量儀器，在固定時間段記錄該感應電極電勢相對於參比電極電勢響應於工作溶液的離子強度階段變化或添加酶底物的變化。此外，使用一種連接到電勢測定的測量裝置或者電壓穩定器的圖表記錄儀，或者通過使用PC-兼容電子儀器的特定程序來進行記錄。在後者的情況下，該程序在預定時段測量感應電極電勢相對於參比電極電勢(通常為每3-5秒)並以「感應電極信號-時間」為坐標的點的形式顯示結果。依檢測的具體類型，用於記錄感應電極相於參比電極的電勢變化的時間間隔在30到600秒之間變化。
在其中緩衝溶液的離子強度被改變的情況下，感應電極電勢相對於參比電極電勢的變化所得的曲線通常為拋物線的形式，並表示感應電極對緩衝溶液在離子強度方面變化的響應，其通過導電聚合物膜的電荷總數(等電點)來調節。
如果該分析是作為夾層結構分析進行的，聚合物膜的總電荷變化與受檢被分析物的數量成正比。然而，如果該分析是作為競爭分析進行的，聚合物膜的總電荷變化通常與受檢被分析物的數量成反比。
在完成這一程序階段時，測定感應電極電勢相對於參比電極電勢的最終電勢V2。因此可以計算感應電極電勢相對於參比電極電勢變化的下列定量特性1．感應電極電勢相對於參比電極電勢變化所得曲線的(積分)面積S2S2=T1T2f2(t)dt]]>其中T2-T1=記錄本底電勢漂移或者相對於參比電極電勢的總時間周期；f2-「以毫伏計的感應電極電勢-時間」的曲線；t-當前記錄時間；和2．該感應電極基礎與最後的電勢之間以毫伏計的差值
δ=V2-V1基於感應電極電勢響應於在工作溶液的離子強度或者組成方面的變化而變化的數量特徵，可測定在試液中目標被分析物的定量含量。
使用上述所得的γ、S2和/或δ，將基線漂移計算在內，再計算這些數值，得到S2γ和/或δγ，以此為基礎，測定目標被分析物在試液中的量。該校正值S2γ和δγ可與「分析結果對目標被分析物量」校準曲線相比。正如將對所屬技術領域的專業人員而言是易於顯而易見的，用於繪製校準曲線的數據可以類似於如上所述的方式，使用一定範圍的包含已知量的目標被分析物的試液得到。
本發明更進一步提供一種電化學檢測樣品中的被分析物的方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種包括塗有含被固定其中或者被吸附其上的抗生物素蛋白質或者抗生蛋白鏈菌素的導電聚合物的導電電極的感應電極，經由生物素/抗生物素蛋白質或者生物素/抗生蛋白鏈菌素結合相互作用，該抗生物素蛋白質或者抗生蛋白鏈菌素分子被附著在能夠結合待測被分析物的受體分子上；(b)將感應電極與含有樣品的試液接觸，以使該被分析物結合至所述被固定的或者被吸附的受體分子上；(c)將該感應電極與參比電極浸在電解液之中，記錄兩者之間相對的電勢差；和(d)在恆定pH值下，電解液的離子強度或者組成改變之後，監測感應電極相對於參比電極的電勢差。
這種電化學檢測方法用於目標被分析物結合到受體上造成感應電極表面足以被測量的電荷變化，而不需要單獨的電荷或者酶標記物。特別是，本方法可用於核酸的電化學檢測。目標核酸結合到附著於電極表面的核酸探針(如低聚核苷酸)上伴隨有足夠大的電荷變化，可通過「離子-步驟」程序檢測。因此不需要使用與電荷標記物綴合的次級受體或者競爭分子。在進行檢測過程之前，疑有包含特異性核酸的材料(如生物學流體)可通常經歷一种放大步驟(如PCR)。因此對經歷了放大步驟的特異性核酸樣品進行電化學檢測是在本發明的範疇之內的。
參考下列非限定實施例與描繪其主要實施階段的附圖，本發明將得到更進一步理解。


圖1A圖示說明由電勢電極組成的感應電極(1)，該電極上塗有導電聚合物層(2)，抗生物素蛋白質或者抗生蛋白鏈菌素分子(3)被固定在該聚合物層中。
圖1B圖示說明由電勢電極組成的感應電極(1)，該電極上塗有導電聚合物層(2)，抗生物素蛋白質或者抗生蛋白鏈菌素分子(3)被吸附在該聚合物層表面上。
圖2A通過被固定在聚合物層的抗生物素蛋白質或者抗生蛋白鏈菌素和與生物素(5)綴合的抗體(4)之間的結合反應，說明感應電極特異性結合被分析物(假定為抗原、介質或高分子量物質)的過程。
圖2B通過被固定在聚合物層中的抗生物素蛋白質或者抗生蛋白鏈菌素和與生物素(5)綴合的抗原(6)之間的結合反應，說明測試過程中感應電極特異性結合被分析物(假定為抗體)的過程。
圖2C通過被固定在聚合物層中的抗生物素蛋白質或者抗生蛋白鏈菌素和與生物素(5)綴合的DNA探針(7)之間的結合反應，說明測試過程中感應電極特異性結合被分析物(假定為DNA分子)的過程。
圖3A表明感應電極與包含對被固定在該感應電極上的生物素化抗體特異性的抗原(6)的試液接觸的過程。
圖3B表明感應電極與包含對被固定在該感應電極上的生物素化抗原特異性的抗體(4)的試液接觸的過程。
圖3C表明感應電極與包含對被固定在該感應電極上的生物素化DNA探針特異性的DNA分子(8)的試液接觸的過程。
圖4A表明感應電極與和電荷標記物(10)綴合併對待測抗原特異性的次級受體(9)的溶液接觸的過程(血清的分析方式，其中如自身抗體是通過利用與電荷標記物綴合的抗異型抗體測定的)。
圖4B表明感應電極與和電荷標記物(10)綴合併對待測抗體特異性的次級受體(11)的溶液接觸的過程(夾層結構分析方式，在次級受體是抗異型抗體的情況下)。
圖5A表明感應電極與和電荷標記物(10)綴合併對生物素化的抗體特異性的競爭分子(12)的溶液接觸的過程(競爭分析方式)。
圖5B表明感應電極與和電荷標記物(10)綴合併對生物素化的抗原特異性的競爭分子(13)的溶液接觸的過程(競爭分析方式)。
圖6A表明感應電極與和一種酶(14)綴合併對受檢抗原特異性的次級受體(9)的溶液接觸的過程(夾層結構分析方式)。
圖6B表明感應電極與和一種酶(14)綴合併對受檢抗體特異性的次級受體(11)的溶液接觸的過程(血清的分析方式，其中如自身抗體是通過利用與一種酶綴合的抗異型抗體測定的)。
圖7A表明感應電極與和一種酶(14)綴合併對生物素化的抗體特異性的競爭分子(12)的溶液接觸的過程(競爭分析方式)。
圖7B表明感應電極與和一種酶(14)綴合併對生物素化的抗原特異性的競爭分子(13)的溶液接觸的過程(競爭分析方式)。
圖8A舉例說明一種感應電極以「順序的」的形式與[圖8A1]生物素化受體、[圖8A2]試液、[圖8A3]標記的次級受體溶液順序接觸，並隨後測量感應電極電勢相對於參比電極電勢[圖8A4]的電化學分析步驟。
圖8B舉例說明電化學分析步驟，其中首先將感應電極浸入生物素化的受體溶液中[圖8B1]，然後將感應電極浸入加有適當標記的次級受體的測試液中[圖8B2]，測量感應電極電勢相對於參比電極電勢[圖8B3]。
圖8C舉例說明在「一鍋」形式中的電化學分析步驟，其中將生物素化的受體和標記的次級受體加到試液中[圖8C1]，然後將感應電極放入與該試液接觸[圖8C2]，並隨後測量感應電極電勢相對於參比電極電勢[圖8C3]。
圖9舉例說明在工作溶液的離子強度或者組成階梯式的變化時，感應電極電勢變化曲線的典型形狀(以「毫伏-時間」雙坐標)，隨後將感應電極與不含任何被分析物的試液溫育(曲線2)，以及隨後將感應電極與包含對生物素化的受體特異性被分析物的試液溫育(曲線2)。
圖10表明所測得的感應電極相對於參比電極的本底電勢與最後電勢的電勢差以毫伏計相對於血清樣品中HBsAg濃度的校準曲線。
圖11表明所測得的感應電極相對於參比電極的本底電勢與最後電勢的電勢差以毫伏計相對於HbsAg-陽性血清稀釋液的電勢差曲線。
在實施例中所用的試劑、材料和設備見如下試劑和材料吡咯(＞98％)購自Merck公司，使用前使用真空蒸餾法提純兩次，然後在氮氣下在不透明的容器中在+4℃下存放；下列試劑全部購自美國Sigma Chemical公司氫氧化鉀(KOH,ACS試劑)、氫氧化鈉(NaOH,ACS試劑)、疊氮化鈉(SigmaUltra)、硫酸高鈰(ACS試劑)、氯化鉀(SigmaUltra)、氯化鈉(SigmaUltra)、三[羥甲基]氨基甲烷(SigmaUltra)、十二烷基硫酸鈉(SDS,＞99％)、萄聚糖硫酸鈉(分子量約8000)、異丙醇(ACS試劑)、丙酮、鹽酸(ACS試劑)、氯酸(ACS試劑)，N,N-二甲基甲醯胺(ACS試劑)、甘氨酸緩衝溶液(0.2M)、「三鹽緩衝片」、「磷酸鹽緩衝片」、「鄰苯二胺二氫氯化物片」、牛血清白蛋白(RIA等級，級分V)、冰凍牛血清、抗生蛋白鏈菌素(來自鏈黴菌屬avidinii),NHS-d-生物素，二甲基亞碸(DMS0、ACS試劑)、生物素-X-X-NHS、牛白蛋白的兔多克隆抗體、小鼠IgG的羊多克隆抗體與脲酶的綴合物、地高新、小鼠單克隆抗-地高新克隆DI-22生物素複合物、過氧化酶(每一毫克固體100單位)、一次性的透滲析袋(MWCO1,000)；除非另有說明，磷酸鹽緩衝溶液(PBS)一直在pH值7.4使用。
B型肝炎表面抗原(HBsAg)的小鼠單克隆抗體(5.7mg/ml含0.01％疊氮化鈉的磷酸鹽緩衝溶液)，小鼠IgG的羊多克隆抗體(10.0毫克/ml含0.01％疊氮化鈉的磷酸鹽緩衝溶液)和HBsAg的小鼠單克隆抗體與過氧化酶的綴合物(2.5毫克/ml含0.01％疊氮化鈉的磷酸鹽緩衝溶液)購買自Sorbent-ServiceLtd.(俄國)；冷凍胰島素(牛的，約20IU/mg)和胰島素的小鼠單克隆抗體(1.2mg/ml磷酸鹽緩衝溶液)，由附屬於俄國醫藥科學院的心臟病學研究中心會員惠贈；冷凍的雙股DNA-探針製劑(長度約lkb)通過缺口移位生物素化[20]，與生物素化DNA探針互補的冷凍雙股DNA製劑、與生物素化DNA探針非互補的冷凍雙股DNA製劑、來自鮭魚精液的冷凍DNA製劑和用於DNA雜化反應的緩衝溶液，都由附屬於衛生部的科學研究學會成員惠贈。
Polybead硫酸鹽微球體(2.5％固體-膠乳，0.2μm)，購買自PolysciencesInc公司；LavsanTM薄膜(約500μm厚)，購買自Vladimir化工廠(俄國)；分散在真空和光致抗蝕劑中的鉻靶《FP-383》，購買自NIIPIK研究所(俄國)；去離子水(試劑等級，電阻＞18Ω)使用Millipore Milli-RO/Milli-Q系統得到；鉑絲，厚度約0.5mm；有關英國第二工作標準的B型肝炎表面抗原(HBsAg濃度0.50iU/ml)，由英國北方倫敦輸血中心惠贈；HBsAg陽性的人類血清樣品，由北方倫敦輸血中心惠贈；設備
UVN真空沉積裝置(俄國)；《PNF-6Ts》光致抗蝕應用裝置(俄國)；自製光-模板(在WO 96/02001的圖1、圖3或者圖4中所示的其給予電極設計的光-模板是適用的)；《STP-300》曝光裝置(俄國)；自製的索格利特抽提器；EU18乾熱櫃(Jouan，法國)；《PI-50.1》帶標準積分器和雙坐標記錄器的電壓穩定器-恆流器(俄國)；雙道記錄器2210(LKB-Pribori，瑞典)；帶標準複合電極的Checkmate pH計(Mettler，瑞士)；自製Ag/AgCl半-微參比電極，直徑約2.5mm，充滿飽和的KCl溶液；AgCl參比電極N°476370(Corning)；針對用途設計的PC兼容測量儀器，包括放大器和模擬-數字轉換器，由常規軟體控制；針對用途設計的感應電極和參比電極支架。
實施例1HBsAg測定；競爭性分析；樣品-稀釋性樣本；受體-生物素化的單克隆小鼠抗-HBsAg；競爭分子-標記的羊多克隆抗小鼠免疫免疫球蛋白G；電荷標記物-膠乳。
1.1．電極基材由60×48mm Lavsan薄膜製備，然後在熱異丙醇中洗滌並在異丙醇蒸汽中乾燥。0.05μm鉻層通過磁控管沉澱塗敷到該基材上。通過離心作用將光致抗蝕劑塗敷在鉻層上並在+80℃下乾燥20分鐘。將該光致抗蝕劑層用紫外光通過圖形光模板曝光。將該光致抗蝕劑層在KOH溶液中顯影，然後+100℃下乾燥20分鐘。該鉻圖形通過在硫酸高鈰溶液中刻蝕得到。使用二甲基甲醯胺將光致抗蝕劑除去，然後衝洗並在熱異丙醇蒸汽中乾燥。通過在氯化金溶液的電沉積，將0.50μm黃金層塗敷於鉻圖形上，隨後衝洗並在異丙醇蒸汽中乾燥。
1.2．將如此得到的電極在2-5％KOH溶液中洗滌兩次30分鐘，用去離子水衝洗並在丙酮中洗滌兩次5分鐘，然後在室溫下風乾20分鐘。將電極插在氟塑料支架上，並放入索氏抽提器中，在熱異丙醇中洗滌0.5-2小時。然後將支架與電極一同從索氏抽提器中移開，並在異丙醇蒸汽中乾燥。以上過程完成後，將電極置於密封的玻璃容器中。
1.3．用於感應電極的存儲溶液是通過將8.0克氯化鈉、12.2克三(羥甲基氨基甲烷)、0.2克氯化鉀和0.1克疊氮化鈉溶解在1升去離子水配製的。
1.4．HBsAg的小鼠單克隆抗體按如下生物素化包含疊氮化鈉的0.01M三鹽緩衝溶液(pH值8.0)，是通過將20片三鹽緩衝片和0.15g疊氮化鈉溶解在1.50升去離子水中製備的；將1.0mg的NHS-d-生物素溶於1ml的DMSO中；將176μl購買的HBsAg的小鼠單克隆抗體(5.7mg/ml)加至一個包含824μl 0.01M磷酸鹽緩衝溶液的微管中；將50μl的NHS-d-生物素的DMSO溶液加至所得的溶液中；將包含該混合物的微管放置在熱混合器中並在+22℃溫度下連續混合4小時；然後將該混合物置於含疊氮化鈉且體積500倍過量的0.01M三鹽的緩衝溶液中，在+4℃下透析過夜；將該生物素化抗體的產物溶液等分成多個小包裝(約10μl)並在+4℃儲存。
1.5．小鼠IgG的羊多克隆抗體與膠乳微球按如下方法綴合含疊氮化鈉的甘氨酸緩衝液(pH值8.2)將500ml 0.2M甘氨酸緩衝溶液加到500ml去離子水中，加入8.5g氯化鈉和0.1g疊氮化鈉，並用0.1M NaOH溶液將pH值調至8.2；將60μl購買的小鼠IgG的羊多克隆抗體(10mg/ml)加到包含940μl甘氨酸緩衝鹽水溶液的微管中(優選該多克隆抗體在標記之前進行親合性純化)；將200μl 2.5％ Polybead硫酸鹽微球懸浮液加到所得溶液中；將包含該混合物的微管放置在熱混合器中並在37±1℃溫度下連續混合30分鐘；然後將包含該混合物的微管冷卻至室溫，並加入0.01g牛血清白蛋白；將所得標記的抗體溶液等分成多個小包裝(約5μl)並在+4℃儲存。
1.6．在聚合之前，將單體(如吡咯)在標準水冷式的儀器中在大氣壓力、135-140℃下蒸餾，並在N2氣氛、-20至-5℃下保存在一種密封的不透明容器中。根據測試的類型，單體在電化學聚合溶液中的濃度在0.3-1.0M的範圍內變化。
在該實施例中用於吡咯電化學聚合的溶液按如下製備
將2.5ml新近蒸餾的吡咯和0.02g的SDS溶於20.0ml的去離子水中；將磷酸鹽緩衝片溶於200ml的去離子水中，4.0mg的抗生蛋白鏈菌素溶於2ml的PBS中；將1ml抗生蛋白鏈菌素的PBS溶液加到吡咯和SDS的溶液中；將最後的溶液放入軌道式混合器中，並混合10分鐘。
1.7．電沉積步驟在一種三電極電化學電池中進行，該三電極包括工作電極、參比電極和輔助(計數器)電極。工作電極是如上所述製備的金屬電勢電極，輔助電極是一段金或者鉑絲，參比電極是銀/氯化銀電極。
使用電壓穩定器，在工作電極上連續施加電壓掃描進行沉積。根據所需聚合物膜的厚度和性質，改變較低電勢的掃描邊界、較高電勢的掃描邊界、電壓掃描速率和掃描循環數目，它們通常分別為-500mV至+800mV,+1000mV至+2000mV(相對於Ag/AgCl參比電極)、25-200mV/秒與3-30。
在該實施例中聚吡咯膜由電化學沉積形成，抗生蛋白鏈菌素結合在該電極上，步驟如下將200μl電化學聚合溶液放入微量滴定板的澆口窩中；將連接電壓穩定器上的電極、鉑絲和半微參比電極浸入該澆口窩中；相對於參比電極的電極電勢在+800至+1800mV範圍內進行循環掃描，電壓掃描速率150mV/秒；形成聚吡咯膜的過程用一種連接電壓穩定器的相應輸出的雙坐標圖表記錄儀，參考伏安曲線，並使用一種連接電壓穩定器的相應輸出的積分儀和圖表記錄儀，參考經過電極的總電量進行監測。對該沉積的整個過程進行檢查，以保證第一次經過工作電極的電量和後來的循環相差不超過15％；當聚吡咯膜達到規定厚度時(電勢掃描循環數約為8，通過電極的總電量為約750mC)，該過程停止。
1.8．將塗有含結合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應電極從澆口窩處移走，用去離子水衝洗，隨後用0.01M磷酸鹽緩衝溶液(pH值7.4)衝洗，並放入含300μl存儲溶液的微管中，在+4℃下儲存。
1.9．重複步驟1.7-1.8，以得到需要數量的感應電極。
1.10．用預先解凍的牛血清稀釋英國第二應用標準的B型肝炎表面抗原，稀釋倍數為2、4、8和10，向裝有100、50、25和20μl英國第二應用標準的B型肝炎表面抗原的不同的微管中，分別加入100、150、175和180μl牛血清，製備一系列200μl已知HBsAg濃度的樣品。純牛血清用作不含HBsAg的樣品。
1.11．將0.2mlHBsAg之生物素化的小鼠單克隆抗體的合適滴定量的溶液加到19.8ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中。在一種軌道式搖動器中完全混合，然後以每份200μl等分至微管中。
1.12．將0.1ml(膠乳綴合)標記的小鼠IgG之羊多克隆抗體的合適滴定量的溶液加到19.9ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，在一種軌道式混合器中完全混合，然後以每份200μl等分至微管中。
1.13．工作緩衝溶液N°1配製如下將磷酸鹽緩衝片溶解於200ml的去離子水中；將2g牛血清白蛋白和0.37g KCl溶於所得的溶液中。
1.14．通過在200ml的去離子水中溶解磷酸鹽緩衝片配製N°2工作緩衝溶液。
1.15．將適當數量的塗有含結合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應電極從存儲緩衝溶液中移開，並將每個電極放入包含生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體溶液(來自步驟1.11)的微管中，在室溫下溫育10分鐘。
1.16．當完成1.15時，將感應電極從包含生物素化抗體溶液的微管中移開，並將每個電極放入一個包含已知的HBsAg濃度樣品(來自1.10)的微管中，然後將帶感應電極的微管放入熱混合器中並在37±1℃下不斷混合15分鐘。
1.17．當完成1.16時，將感應電極從包含樣品的微管中移開，並放入包含膠乳綴合的小鼠IgG之羊多克隆抗體的微管中(來自1.12)，然後放入旋轉搖動器中並在室溫下連續混合5分鐘。
1.18．當完成1.17時，將感應電極從微管移開，在0.01M磷酸鹽緩衝溶液中衝洗3-5秒，並將每個電極放入充滿工作緩衝溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
1.19．將感應電極和參比電極連接到與PC控制的測量裝置相連的支架的電觸點上，並將該支架固定在充滿N°1工作緩衝溶液微量滴定板澆口窩的上方。
1.20．啟動常規軟體，並用來記錄30秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢的毫伏數。
1.21．完成1.20後，以類似於在1.19所述的方式，將該支架固定在充滿N°2工作緩衝溶液的微量滴定板澆口窩之上。
1.22．啟動常規軟體，並用來記錄100秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢變化的毫伏數。
1.23．使用常規軟體，計算該感應電極的本底電勢和最後電勢之差δ的毫伏數。
1.24．使用在1.10過程中製備的已知濃度的HBsAg樣品，順序重複在1.19-1.21中所述的操作。
1.25．將在1.24步驟所得的結果，用常規軟體繪製「δ對樣品中HBsAg的濃度」曲線(圖10)，並根據該曲線測定該感應電極系統絕對靈敏度的下閾。
實施例2HBsAg測定；競爭性分析；樣品-稀釋性樣本；受體-生物素化單克隆小鼠抗HBsAg；競爭分子-標記的羊多克隆抗小鼠免疫免疫球蛋白G；電荷標記物-膠乳。
2.1．進行在1.1-1.5中所述的過程。
2.2．用於吡咯電化學聚合的溶液按如下製備將2.5ml新蒸餾的吡咯和0.05g的SDS溶於20.0ml去離子水中。
2.3．聚吡咯膜按如下方法由電化學沉積形成將200μl的電化學聚合溶液放入微量滴定板的澆口窩中；將連接到電壓穩定器上的電極、鉑絲和半微參比電極浸入該澆口窩中；相對於參比電極的電極電勢的循環掃描在+800至+2200mV範圍內，掃描速率100mV/秒；參照用連接到電壓穩定器相應輸出的X-Y圖表記錄儀記錄的伏-安曲線，和用連接到電壓穩定器的相應輸出的積分器和圖表記錄儀記錄的通過電極的總電量，監測聚吡咯膜形成的過程；當聚吡咯膜達到規定厚度時(電勢掃描循環數6；通過該電極的總電量約為750mC)，停止該過程。
2.4．將塗有聚吡咯膜的感應電極從澆口窩處移走，用去離子水衝洗，隨後用0.01M磷酸鹽緩衝溶液(pH值7.4)衝洗，並放入含300μl存儲溶液的微管中，在+4℃下儲存。
2.5．重複在2.1-2.4中所述的過程，以得到需要數量的感應電極。
2.6．將磷酸鹽緩衝片溶解在200ml的去離子水中，並用所得溶液溶解1.0mg抗生蛋白鏈菌素，配製抗生蛋白鏈菌素溶液。
2.7．按如下步驟將抗生蛋白鏈菌素結合至覆在感應電極的聚吡咯膜的表面上將抗生蛋白鏈菌素溶液等分至200μl並置於微管中；將塗有聚吡咯膜的感應電極從存儲緩衝溶液中移開，將每個電極放入帶抗生蛋白鏈菌素溶液的微管中，並在+4℃下溫育18小時；將感應電極從包含抗生蛋白鏈菌素溶液的微管中移出，用0.01M的磷酸鹽緩衝溶液洗滌，並將每個電極放入存儲緩衝溶液中，然後在+4℃下儲存。
2.8．一系列已知濃度的HBsAg樣品如1.10中所述製備。
2.9．將0.1ml合適滴定量的生物素化HBsAg之小鼠單克隆抗體溶液加到19.9ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中。在旋轉搖動器中完全混合，然後以200μl等分至微管中。
2.10．將0.1ml合適滴定量的標記(綴合膠乳)小鼠IgG之羊多克隆抗體的溶液加到19.9ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，在軌道式混合器中完全混合，然後以200μl等分至微管中。
2.11．工作緩衝溶液N°1如1.13中的描述配製。
2.12．工作緩衝溶液N°2如1.14中的描述配製。
2.13．將塗有含結合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應電極從存儲緩衝溶液中移出，並將每個電極放入包含生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體溶液的微管中，並在室溫下溫育10分鐘。
2.14．當完成2.13時，將感應電極從包含生物素化抗體溶液的微管中移開。並將每個電極放入包含已知的HBsAg濃度樣品的微管中(來自步驟2.8)，然後將帶感應電極的微管放入熱混合器中並在37±1℃下連續混合15分鐘。
2.15．當完成2.14時，將感應電極從包含樣品的微管中移出，並放入包含膠乳綴合小鼠IgG之羊多克隆抗體的微管中(來自步驟2.10)，然後放入旋轉的搖動器中，並在室溫下連續混合5分鐘。
2.16．當完成2.15時，將感應電極從微管移出，在0.01M磷酸鹽緩衝溶液中衝洗3-5秒，並將每個電極放入充滿工作緩衝溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
2.17．將感應電極和參比電極連接到與PC控制的測量儀器相連的支架的電觸點上，並將該支架固定在裝有N°1工作緩衝溶液微量滴定板澆口窩的上方，以使該感應電極和參比電極浸入該溶液中。
2.18．啟動該常規軟體，並用來記錄30秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢的毫伏數。
2.19．完成2.18後，以類似於在2.17中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩衝溶液的微量滴定板澆口窩之上。
2.20．該常規軟體用來記錄100秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢變化的毫伏數。
2.21．使用該常規軟體，計算該感應電極的本底電勢和最後電勢之差(δ)的毫伏數。
2.22．使用在2.8步驟中製備的已知濃度的HBsAg樣品，順序重複在2.17-2.20中所述的操作。
2.23．將步驟2.22所得的結果，使用該常規軟體繪製「δ對樣品中HBsAg濃度」的校準曲線。
2.24．將若干HBsAg-陽性的血清樣品(包含一種未知濃度的HBsAg)在預先解凍的牛血清中分別連續稀釋，以製備一系列稀釋倍數為10、100、1000、5000和10000的樣品。將分成200μl等分的每種稀釋液放入分開的微管中。
2.25．使用在2.13-2.21中所述的步驟測定每一稀釋液的HBsAg濃度，使用這些結果和在步驟2.23中所得的校準曲線，計算在血清樣品中初始的(未稀釋的)HBsAg濃度(圖11)。
實施例3抗白蛋白抗體測定；競爭性分析法；樣品-白蛋白的兔多克隆抗體；受體-生物素化的牛血清白蛋白；競爭分子-標記的白蛋白之兔多克隆抗體；電荷標記物-膠乳。
3.1．進行在1.1-1.3中所述的過程。
3.2．牛血清白蛋白(BSA)按1.4.中所述進行生物素化。將所得生物素化的BSA溶液等分成小包裝(約10μl)並在+4℃儲存。
3.3．按1.5中所述的步驟，使牛白蛋白的兔多克隆抗體與膠乳微球體綴合。將所得的標記抗體溶液等分成小包裝(約5μl)，並在+4℃儲存。
3.4．如2.2.中所述配製吡咯的電化學聚合溶液。
3.5．如在2.3中所述電化學沉積形成聚吡咯膜。
3.6．將塗有聚吡咯膜的感應電極從澆口窩處移走，用去離子水衝洗，隨後用0.01M磷酸鹽緩衝溶液(pH值7.4)衝洗，並放入含300μl存儲溶液的微管中，在+4℃下儲存。
3.7．重複在3.1-3.6中所述的過程，得到需要數量的感應電極。
3.8．抗生蛋白鏈菌素的溶液如2.6中所述配製。
3.9．如2.7中所述，抗生蛋白鏈菌素被結合於覆蓋感應電極的聚吡咯膜的表面上。
3.10．一系列已知的濃度的未標記的牛白蛋白之兔多克隆的抗體製備如下購買的牛白蛋白之兔多克隆抗體在500倍過量的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中在+4℃下透析過夜；將所得牛白蛋白之兔多克隆抗體的0.01M磷酸鹽緩衝溶液順序用0.01M磷酸鹽緩衝溶液以10、20、50、100、1000和5000的稀釋倍數稀釋；將每一稀釋樣品的200μl等分溶液分別放入微管中。
3.11．將0.8ml生物素化BSA的適當稀釋溶液加到19.2ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，在旋轉搖動器中完全混合，將每一稀釋樣品的200μl等分溶液分別放入微管中。
3.12．將0.1ml合適滴定量的標記(膠乳綴合的，如上所述)的牛白蛋白之兔多克隆抗體的溶液加到19.9ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，在軌道式混合器中完全混合，然後以200μl等分至微管中。
3.13．工作緩衝溶液N°1配製如下將一磷酸鹽緩衝片溶解於200ml的去離子水中；將0.37gKCl溶於所得溶液中。
3.14．工作緩衝溶液N°2如1.14中所述配製。
3.15．將塗有含結合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應電極從存儲緩衝溶液中移開，並將每個電極放入一個含有200μl生物素化BSA的溶液(來自步驟3.11)的微管中，並在室溫下溫育25分鐘。
3.16．當完成3.15時，將感應電極從包含生物素化BSA的溶液的微管中移開，並將每個電極放入一個包含已知濃度的未標記的牛白蛋白之兔多克隆抗體樣品的微管中，然後將帶感應電極的微管放入熱混合器中，並在37±1℃下連續混合25分鐘。
3.17．當完成3.16時，將感應電極從包含樣品的微管中移開，並轉入包含膠乳綴合的牛白蛋白之兔多克隆抗體(來自步驟3.12)的微管中，然後放入旋轉搖動器中，並在室溫下連續混合10分鐘。
3.18．當完成3.17時，將感應電極從微管中移開，在0.01M磷酸鹽緩衝溶液中衝洗3-5秒，並將每個電極放入裝有工作緩衝溶液N°1微量滴定板的澆口窩。
3.19．將感應電極和參比電極連接到與基於PC的測量儀器相連支架的電觸點上，並將該支架定位在充滿N°1工作緩衝溶液微量滴定板澆口窩的上方，以使感應電極和參比電極浸入該溶液中。
3.20．啟動常規軟體用來記錄100秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢的毫伏數。
3.21．當完成3.20時，以類似於在3.19所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩衝溶液的微量滴定板澆口窩之上。
3.22．啟動該常規軟體用來記錄200秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢變化的毫伏數。
3.23．使用該常規軟體，通過感應電極電勢變化對參比電極電勢的所述曲線，計算(積分)面積S2。
3.24．用在3.10過程中用已知濃度的未標記的牛白蛋白之兔多克隆抗體製備的樣品，順序重複在3.19-3.23中所述的操作。
3.25．基於步驟3.24所得的結果，使用常規軟體繪製「S2對樣品中未標記的牛白蛋白之兔多克隆抗體的濃度」的校準曲線。
實施例4HBsAg測定；夾層結構分析法；樣品-已知HBsAg濃度的樣品；受體-生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體；標記的HBsAg之小鼠單克隆抗體；標記物-過氧化酶。
4.1．進行在1.1-1.4中所述的過程。
4.2．用於吡咯電化學聚合的溶液如2.2中所述製備。
4.3．聚吡咯膜如在2.3中所述由電化學沉積形成。
4.4．將塗有聚吡咯膜的感應電極從澆口窩處移走，用去離子水衝洗，隨後用0.01M磷酸鹽緩衝溶液(pH值7.4)衝洗，並放入含300μl存儲溶液的微管中，將其在+4℃下儲存。
4.5．重複在4.1-4.4中所述的過程，得到需要數量的感應電極。
4.6．抗生蛋白鏈菌素的溶液如2.6中所述配製。
4.7．如2.7中所述，將抗生蛋白鏈菌素結合於覆在該感應電極的聚吡咯膜的表面上。
4.8．一系列已知HBsAg濃度的樣品如1.10中所述製備。
4.9．將0.2ml合適滴定量的生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液加到19.8ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，在一種旋轉搖動器中完全混合，然後以200μl等分至微管中。
4.10．將5ml預先解凍的牛血清加到15ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，0.4ml合適滴定量的購買的過氧化綴合HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液加到19.6ml的產物溶液中，將其在旋轉搖動器中完全混合，並以200μl等分至微管中。
4.11．通過在200ml的去離子水中溶解磷酸鹽緩衝片配製N°1工作緩衝溶液。
4.12．工作緩衝溶液N°2配製如下將一片鄰-苯二胺二氫氯化物片和一片尿素過氧化氫/緩衝片溶於20ml的去離子水中；將0.1ml所得的溶液加至19.9ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，在旋轉搖動器中完全混合，放入不透明玻璃容器中在+4℃下儲存，直到開始測試。
4.13．將塗有含結合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應電極從存儲緩衝溶液中移開，並將每個電極放入包含200μl生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體溶液(來自步驟4.9)的微管中，並在室溫下溫育5分鐘。
4.14．當完成4.13時，將感應電極從包含生物素化抗體的溶液的微管中移開，並將放入包含已知的HBsAg濃度樣品的微管中(來自步驟4.8)，然後將帶感應電極的微管放入熱混合器中並在37±1℃下連續混合10分鐘。
4.15．當完成4.14時，將感應電極從包含樣品的微管中移開，並放入包含過氧化酶-綴合HBsAg之小鼠單克隆抗體的微管中(來自步驟4.10)，然後放入旋轉搖動器中並在室溫下連續混合5分鐘。
4.16．當完成4.15時，將感應電極從微管移開，在0.01M磷酸鹽緩衝溶液中衝洗3-5秒，並將每個電極放入充滿工作緩衝溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
4.17．將感應電極和參比電極連接到與基於PC的測量儀器相連的支架的電觸點上，並將該支架定位在充滿N°1工作緩衝溶液微量滴定板澆口窩的上方，以使感應電極和參比電極浸入該溶液中。
4.18．啟動該常規軟體，並用來記錄50秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢的毫伏數。
4.19．完成4.18後，以類似於在4.17中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩衝溶液的微量滴定板澆口窩之上。
4.20．用該常規軟體記錄100秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢變化的毫伏數。
4.21．使用該常規軟體，計算該感應電極的本底電勢和最後電勢之差(δ)。
4.22．使用在4.8步驟中製備的已知濃度的HBsAg樣品，順序重複在4.17-4.21中所述的操作。
4.23．基於在步驟4.22所得的結果，使用該常規軟體繪製「δ相對於樣品中HBsAg濃度」的校準曲線。
4.24．如2.24中所述，製備一系列稀釋的血清樣品。
4.25．使用在4.13-4.21步驟中所述的步驟測定在4.24中所製備每個稀釋樣品的HBsAg濃度，使用這些結果加之在步驟4.23中所得的校準曲線，計算在血清樣品中原有的(未衝淡的)HBsAg濃度。
實施例5HBsAg測定；夾層結構分析法；樣品-已知HBsAg濃度的樣品；受體-生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體；標記的HBsAg之小鼠單克隆抗體；標記物-過氧化酶；「順序分析」。
5.1．進行在1.1-1.4中所述的過程。
5.2．用於吡咯電化學聚合的溶液如2.2中所述製備。
5.3．聚吡咯膜如在2.3中所述由電化學沉積形成。
5.4．將塗有聚吡咯膜的感應電極從澆口窩處移走，用去離子水衝洗，隨後用0.01M磷酸鹽緩衝溶液(pH值7.4)衝洗，並放入含300μl存儲溶液的微管中，將其在+4℃下儲存。
5.5．重複在5.1-5.4中所述的過程，得到需要數量的感應電極。
5.6．抗生蛋白鏈菌素的溶液如2.6中所述配製。
5.7．如2.7中所述，將抗生蛋白鏈菌素結合於覆在該感應電極的聚吡咯膜的表面上。
5.8．一系列已知HBsAg濃度的樣品如1.10中所述製備。
5.9．將0.5ml生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液加到19.5ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，在一種旋轉的搖動器中完全混合，然後以200μl等分至微管中。
5.10．將1.7ml過氧化酶標記的HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液加到18.3ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，在一種軌道式搖動器中完全混合，然後以200μl等分至微管中。
5.11．工作緩衝溶液N°1如4.11中所述的配製。
5.12．工作緩衝溶液N°2如4.22中所述的配製。
5.13．將塗有含結合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應電極從存儲緩衝溶液中移開，並將每個電極放入包含生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體溶液(來自步驟5.9)的微管中，並在室溫下溫育5分鐘。
5.14．與步驟5.13同時，將10μl適當滴定量購買的過氧化酶-標記的HBsAg之小鼠單克隆抗體加到包含已知的HBsAg濃度樣品的樣品中(來自步驟5.8)，首先從樣品中移走10μl，然後將微管和樣品放入熱混合器中，並在37±1℃下保持5-10分鐘。
5.15．當完成5.13-5.14時，將感應電極從包含生物素化抗體的溶液中移開，並放入包含已知HBsAg濃度樣品的微管中(來自步驟5.14)，然後將其放入熱混合器中，並在37±1℃下連續混合15分鐘。
5.16．當完成5.15時，將感應電極從微管移開，在0.01M磷酸鹽緩衝溶液中衝洗3-5秒，並將每個電極放入充滿工作緩衝溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
5.17．將感應電極和參比電極連接到與基於PC的測量儀器相連的支架的電觸點上，並將該支架定位在充滿N°1工作緩衝溶液微量滴定板澆口窩的上方，以使感應電極和參比電極浸入該溶液中。
5.18．啟動該常規軟體，並用來開始記錄50秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢的毫伏數。
5.19．當完成5.18時，以類似於在5.17中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩衝溶液的微量滴定板澆口窩之上。
5.20．用該常規軟體記錄200秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢變化的毫伏數。
5.21．使用該常規軟體，通過感應電極電勢變化對參比電極電勢的所述曲線，計算S2(積分的)面積。
5.22．使用在步驟5.8中製備的已知濃度的HBsAg樣品，順序重複在5.17-5.21中所述的操作。
5.23．基於在步驟5.22所得的結果，使用該常規軟體繪製「S2對樣品中HBsAg濃度」的校準曲線。
5.24．如2.24中所述，製備一系列稀釋的血清樣品。
5.25．使用在5.13-5.21步驟中所述的步驟，測定在5.24中所製備每個稀釋樣品的HBsAg濃度，使用這些結果加之在步驟5.23中所得的校準曲線，計算在血清樣品中原有的(未衝淡的)HBsAg濃度。
實施例6HBsAg測定；夾層結構分析法；樣品-已知HBsAg濃度的樣品；受體-生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體；標記的HBsAg之小鼠單克隆抗體；標記物-過氧化酶；「一鍋分析法」。
6.1．進行在1.1-1.4中所述的過程。
6.2．用於吡咯電化學聚合的溶液如2.2中所述製備。
6.3．聚吡咯膜如在2.3中所述由電化學沉積形成。
6.4．將塗有聚吡咯膜的感應電極從澆口窩處移走，用去離子水衝洗，隨後用0.01M磷酸鹽緩衝溶液(pH值7.4)衝洗，並放入含300μl存儲溶液的微管中，將它在+4℃下儲存。
6.5．重複在6.1-6.4中所述的過程，得到需要數量的感應電極。
6.6．抗生蛋白鏈菌素的溶液如2.6中所述配製。
6.7．如2.7中所述，將抗生蛋白鏈菌素結合於覆在該感應電極的聚吡咯膜的表面上。
6.8．一系列已知HBsAg濃度的樣品如1.10中所述製備。
6.9．將2.5ml合適滴定量的生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液加到17.5ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，在一種旋轉搖動器中完全混合，然後以200μl等分至微管中。
6.10．將1.7ml適當滴定量的購買的過氧化酶標記的HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液加到18.3ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，在一種旋轉搖動器中完全混合，然後以200μl等分至微管中。
6.11．工作緩衝溶液N°1如4.11中所述的配製。
6.12．工作緩衝溶液N°2如4.22中所述的配製。
6.13．將10μl生物素化的HBsAg之小鼠單克隆抗體的溶液(來自步驟6.9)和10μl過氧化酶標記的HBsAg之小鼠單克隆抗體(來自步驟6.10)加到每個包含已知HBsAg濃度的樣品中，首先從樣品中移走20μl，然後將微管和樣品放入熱混合器中，並在37±1℃下連續混合溫育10分鐘，。
6.14．當完成6.13時，將塗有含結合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應電極從存儲緩衝溶液中移開，並將每個電極放入包含已知的HBsAg濃度樣品的微管中(來自步驟6.13)，然後放入熱混合器中，並在37±1℃下連續混合5分鐘。
6.15．當完成6.14時，將感應電極從微管移開，在0.01M磷酸鹽緩衝溶液中衝洗3-5秒，並將每個電極放入充滿工作緩衝溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
6.16．將感應電極和參比電極連接到與基於PC的測量儀器相連的支架的電觸點上，並將該支架定位在充滿N°1工作緩衝溶液微量滴定板澆口窩的上方，以使感應電極和參比電極浸入該溶液中。
6.17．啟動該常規軟體，並用來開始記錄100秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢的毫伏數。
6.18．當完成6.17時，以類似於在6.16中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩衝溶液的微量滴定板澆口窩之上。
6.19．用該常規軟體記錄200秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢變化的毫伏數。
6.20．使用該常規軟體，通過感應電極電勢變化對參比電極電勢的所述曲線，計算S2(積分的)面積。
6.21．使用在步驟6.8中製備的已知濃度的HBsAg樣品，順序重複在6.16-6.20中所述的操作。
6.22．基於在步驟6.21所得的結果，使用該常規軟體繪製「S2對樣品HBsAg濃度」的校準曲線。
6.23．如2.24中所述，製備一系列稀釋的血清樣品。
6.24．使用在6.13-6.21步驟中所述的過程，測定在6.23中所製備的每個稀釋樣品的HBsAg濃度，使用這些結果加之在步驟6.22中所得的校準曲線，計算在血清樣品中原有的(未衝淡的)HBsAg濃度。
實施例7胰島素測定；競爭分析法；樣品-已知胰島素濃度的樣品；受體-生物素化的胰島素之小鼠單克隆抗體；競爭分子-標記的多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白G抗體；標記物-脲酶。
7.1．進行在1.1-1.3中所述的過程。
7.2．胰島素之小鼠單克隆抗體的生物素化如1.4中所述進行。將該生物素化的胰島素之小鼠單克隆抗體的產物溶液分成小容量等分(約10μl)，並在+4℃下儲存。
7.3．用於吡咯電化學聚合的溶液如2.2中所述製備。
7.4．聚吡咯膜如在2.3中所述由電化學沉積形成。
7.5．將塗有聚吡咯膜的感應電極從澆口窩處移走，用去離子水衝洗，隨後用0.01M磷酸鹽緩衝溶液(pH值7.4)衝洗，並放入含300μl存儲溶液的微管中，將其在+4℃下儲存。
7.6．重複在7.4-7.5中所述的過程，得到需要數量的感應電極。
7.7．抗生蛋白鏈菌素的溶液如2.6中所述配製。
7.8．如2.7中所述，將抗生蛋白鏈菌素結合於覆在該感應電極的聚吡咯膜的表面上。
7.9．一系列已知胰島素濃度的樣品製備如下將1.12g氯化鉀和1.0g牛血清白蛋白溶於100ml的去離子水中；將100μl冷凍的胰島素溶於200μl所得的溶液中；將所得的胰島素溶液順序地用含氯化鉀的去離子水和牛血清白蛋白以10、20、50、100、1000、5000和10000倍的稀釋倍數稀釋；每一稀釋樣品放入分開的200μl等分微管中。
7.10．將0.8ml合適滴定量的生物素化的胰島素之小鼠單克隆抗體的溶液加到19.2ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，在一種旋轉搖動器中完全混合，然後以200μl等分至微管中。
7.11．將0.02ml購買的脲酶綴合的小鼠免疫球蛋白G之山羊多克隆抗體加到19.98ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液中，在一種旋轉的搖動器中完全混合，並以200μl等分至微管中。
7.12．通過在200ml的去離子水中溶解2.24g氯化鈉配製N°1工作緩衝溶液。
7.13．通過在20mlN°1工作緩衝溶液中溶解0.012g尿素配製工作緩衝溶液N°2。
7.14．將塗有含結合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應電極從存儲緩衝溶液中移開，並將每個電極放入含生物素化的胰島素之小鼠單克隆抗體溶液(來自步驟7.10)的微管中，並溫育10分鐘。
7.15．當完成7.14時，將感應電極從包含生物素化抗體的溶液中移開，並放入包含已知胰島素濃度樣品的微管中(來自步驟7.9)，然後放入熱混合器中，並在37±1℃下連續混合15分鐘，。
7.16．當完成7.15時，將感應電極從包含樣品的微管中移開，並放入包含脲酶綴合小鼠免疫球蛋白G之山羊多克隆抗體溶液(來自步驟7.11)的微管中，然後放入旋轉搖動器中，並在室溫下連續混合10分鐘。
7.17．當完成7.16時，將感應電極從微管移開，在含氯化鉀的去離子水和牛血清白蛋白中衝洗3-5秒，並將每個電極放入充滿工作緩衝溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
7.18．將感應電極和參比電極連接到與基於PC的測量裝置相連的支架的電觸點上，並將該支架定位在充滿N°1工作緩衝溶液微量滴定板澆口窩的上方。
7.19．啟動該常規軟體，並用來開始記錄200秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢的毫伏數。
7.20．當完成7.19時，以類似於在7.18中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩衝溶液的微量滴定板澆口窩之上。
7.21．用該常規軟體記錄400秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢變化的毫伏數。
7.22．使用該常規軟體，通過感應電極電勢變化對參比電極電勢的所述曲線，計算S2(積分的)面積。
7.23．使用在步驟7.9中製備的已知濃度的胰島素樣品，順序重複在7.18-7.22中所述的操作。
7.24．基於在步驟7.23所得的結果，使用該常規軟體繪製「S2對樣品中胰島素濃度」的校準曲線。
實施例8核酸雜化反應。
8.1．進行在1.1-1.3中所述的過程。
8.2．用於吡咯電化學聚合的溶液如2.2中所述製備。
8.3．聚吡咯膜如在2.3中所述由電化學沉積形成。
8.4．將塗有聚吡咯膜的感應電極從澆口窩處移走，用去離子水衝洗，隨後用0.01M磷酸鹽緩衝溶液(pH值7.4)衝洗，並放入含300μl存儲溶液的微管中，將其在+4℃下儲存。
8.5．重複在8.3-8.4中所述的過程，得到需要數量的感應電極。
8.6．通過在200ml的去離子水中溶解一片磷酸鹽緩衝片，並在所得溶液中溶解5.0mg抗生蛋白鏈菌素，配製抗生蛋白鏈菌素溶液。
8.7．如下所述，將抗生蛋白鏈菌素結合於覆在該感應電極的聚吡咯膜的表面上將抗生蛋白鏈菌素溶液等分至300μl微管中；將塗有聚吡咯膜的感應電極從存儲緩衝溶液中移開，將每個電極放入包含抗生蛋白鏈菌素溶液的微管中，並在+4℃下溫育24小時；將感應電極從包含抗生蛋白鏈菌素溶液的微管中移開，用0.01M的磷酸鹽緩衝溶液衝洗，並用含0.01％疊氮化鈉的去離子水衝洗兩次，然後將每個感應電極放入存儲緩衝溶液中，並在+4℃下儲存。
8.8．單股DNA探針溶液製備如下將1mg冷凍的生物素化雙股DNA探針製劑(長度約1kb)溶於1ml去離子水中，並將所得的溶液放入微管中；將包含DNA探針溶液的微管放入水浴中，將其在+100℃下溫育5-8分鐘；將包含DNA探針溶液的微管轉入含有冰的容器中，將其迅速冷卻至0℃；然後將包含DNA探針溶液的微管轉入冰箱中，將其在-20℃下冷凍儲存。
8.9．與生物素化的DNA探針互補的單股DNA的溶液製備如下將10mg冷凍的與生物素化DNA探針互補的雙股DNA製劑溶於1ml去離子水中，並將所得的溶液放入微管中；將包含DNA溶液的微管放入水浴中，將其在+100℃下溫育5-8分鐘；將包含DNA溶液的微管轉入含有冰的容器中，將其迅速冷卻至0℃；然後將包含DNA溶液的微管轉入冰箱中，將其在-20℃下冷凍儲存。
8.10．與生物素化DNA探針非互補的單股DNA溶液如8.9所述製備。
8.11．工作緩衝溶液N°1配製如下將一片磷酸鹽緩衝片溶解於200ml的去離子水中；將2g牛血清白蛋白、0.37g氯化鉀和0.12g檸檬酸鈉溶於所得的溶液中。
8.12．工作緩衝溶液N°2配製如下將一片磷酸鹽緩衝片溶解於200ml的去離子水中；將2g牛血清白蛋白和1g葡聚糖硫酸鈉溶於所得的溶液中。
8.13．將塗有含結合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應電極從包含0.01％疊氮化鈉和0.15M氯化鉀的去離子水移開，並將20μl預先解凍並溫至室溫的單股DNA探針溶液塗敷至每個感應電極工作表面上。
8.14．當完成8.13時，將感應電極放入可調溼度室，在+44℃下溫育60分鐘。
8.15．當完成8.14時，將感應電極從可調溼度室移開，並將每個電極放入包含200μl用於DNA雜化反應的初始緩衝溶液的微管中，將它們在+4℃下保持一個短時期。(DNA雜化反應緩衝液可以是本領域已知的任何標準雜化反應緩衝液，參見Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY，美國)8.16．包含與生物素化DNA探針互補的單股DNA的樣品製備如下將10mg冷凍的來自鮭魚精液DNA製劑溶於10ml用於DNA雜化反應的初始緩衝溶液中；將10μl預先解凍並溫至室溫的與生物素化DNA-探針互補的單股DNA溶液加至0.99ml所得的溶液中；將所得溶液在旋轉搖動器中完全混合，並等分至200μl微管中。
8.17．包含與生物素化DNA探針非互補的單股DNA樣品製備如下將10mg來自鮭魚精液的冷凍DNA製劑溶於10ml用於DNA雜化反應的初始緩衝溶液中；將100μl預先解凍並溫至室溫的與生物素化DNA探針非互補的單股DNA溶液加至0.9ml所得的溶液中；將所得溶液在旋轉搖動器中完全混合，並等分至200μl微管中。
8.18．將半數含被固定的生物素化單股DNA探針的感應電極從包含用於DNA雜化反應初始的緩衝溶液的微管中移開，並放入含有包含DNA互補至生物素化DNA-探針的樣品的微管中；然後將包含感應電極的微管放入熱混合器中，並在+42℃下連續混合120分鐘。
8.19．當完成8.18時，將感應電極從微管移開，在工作緩衝溶液N°1中衝洗3-5秒，並將每個電極放入充滿工作緩衝溶液N°1的澆口窩中。
8.20．將感應電極和參比電極連接到與基於PC的測量裝置相連的支架的電觸點上，並將該支架定位在充滿N°1工作緩衝溶液微量滴定板澆口窩的上方，以使感應電極和參比電極浸入該溶液中。
8.21．啟動該常規軟體，並用來開始記錄200秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢的毫伏數。
8.22．當完成8.21時，以類似於在8.20中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩衝溶液的微量滴定板的澆口窩之上。
8.23．使用該常規軟體記錄600秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢變化的毫伏數。
8.24．使用該常規軟體，計算本底電勢和最後電勢之差(δ)。
8.25．使用在步驟4.8中製備的與生物素化DNA探針互補的DNA樣品，順序重複在8.20-8.24中所述的操作。
8.26．將另外半數含被固定的生物素化單股DNA探針的感應電極從包含用於DNA雜化反應初始的緩衝溶液的微管中移開，並放入含有包含與生物素化DNA探針非互補的DNA樣品的微管中，然後將包含感應電極的微管放入熱混合器中，並在+42℃下連續混合120分鐘。
8.27．使用包含與生物素化DNA探針非互補的DNA樣品，順序重複在8.19-8.25中所述的過程。
8.28．基於在8.19-8.26中所得的結果，使用該常規軟體繪製由與生物素化DNA探針互補和非互補的DNA樣品得到的δ值的統計分布曲線。
實施例9地高新測定；競爭分析法；樣品-已知濃度的地高新樣品；受體-生物素化的地高新之小鼠單克隆抗體；競爭分子-標記的地高新；標記物-過氧化酶。
9.1．進行在1.1-1.4中所述的過程。
9.2．用於吡咯電化學聚合的溶液如2.2中所述製備。
9.3．聚吡咯膜如在2.3中所述由電化學沉積形成。
9.4．將塗有聚吡咯膜的感應電極從澆口窩處移走，用去離子水衝洗，隨後用0.01M磷酸鹽緩衝溶液(pH值7.4)衝洗，並放入含300μl存儲溶液的微管中，將其在+4℃下儲存。
9.5．重複在9.1-9.4中所述的過程，得到需要數量的感應電極。
9.6．抗生蛋白鏈菌素的溶液如2.6中所述配製。
9.7．如2.7中所述，將抗生蛋白鏈菌素結合於覆在該感應電極的聚吡咯膜的表面上。
9.8．一系列已知地高新濃度的樣品製備如下將250ml乙醇加至750ml的去離子水中；將250mg地高新溶於1000ml所得的乙醇溶液中；將一片磷酸鹽緩衝片和10.0g牛血清白蛋白溶解於200ml的去離子水中；在含牛血清白蛋白的PBS溶液中，將所得的地高新溶液以250、2500、25000、50000、125000、250000和500000倍的稀釋比例順序稀釋；將每一稀釋樣品放入分開的200μl等分微管中。
9.9．將20μl購買的生物素綴合地高新之小鼠單克隆抗體的溶液加到19.98ml的0.01M磷酸鹽緩衝溶液(pH值7.4)中，在旋轉搖動器中完全混合，然後以200μl等分至微管中。
9.10．根據前述規程，參見[21]，將地高新用過氧化酶綴合。將過氧化酶標記的地高新的產物溶液(最後濃度約0.1mg/ml)用0.01M磷酸鹽緩衝溶液(pH值7.4)以10倍的稀釋比稀釋，然後將其分為小體積等分(10μl)，並在+4℃下儲存。
9.11．工作緩衝溶液N°1如4.11中所述的配製。
9.12．工作緩衝溶液N°2如4.22中所述的配製。
9.13．將塗有含結合抗生蛋白鏈菌素的聚吡咯膜的感應電極從存儲緩衝溶液中移開，並將每個電極放入包含生物素綴合的地高新之小鼠單克隆抗體溶液(來自步驟9.9)的微管中，並在室溫下溫育10分鐘。
9.14．與步驟9.13同時，首先從樣品中移出2μl，然後將2μl過氧化酶標記的地高新溶液(來自步驟9.10)加至每一已知的地高新濃度(來自步驟9.8)的樣品中。
9.15．當完成9.13和9.14後，將感應電極轉入包含過氧化酶標記的和未標記的地高新的試管(來自步驟9.14)；將這些試管加感應電極放入熱混合器中，並在37±1℃下連續混合10分鐘。
9.16．當完成9.15時，將感應電極從微管移開，在0.01M的PBS中衝洗3-5秒，並將每個電極放入充滿工作緩衝溶液N°1的微量滴定板的澆口窩中。
9.17．將感應電極和參比電極連接到與基於PC的測量儀器相連的支架的電觸點上，並將該支架定位在充滿N°1工作緩衝溶液的微量滴定板澆口窩之上，以使感應電極和參比電極浸入該工作緩衝溶液中。
9.18．啟動該常規軟體，並用來開始記錄30秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢的毫伏數。
9.19．當完成9.18時，以類似於在9.17中所述的方式，將該支架定位在充滿N°2工作緩衝溶液的微量滴定板澆口窩之上。
9.20．用該常規軟體記錄100秒的時間感應電極電勢相對於參比電極電勢變化的毫伏數。
9.21．使用該常規軟體，通過感應電極電勢變化對參比電極電勢的所述曲線，計算S2(積分的)面積。
9.22．使用在步驟9.8中製備的已知濃度的地高新樣品，順序重複在9.17-9.21中所述的操作。
9.23．基於在步驟9.22所得的結果，使用該常規軟體繪製「S2對樣品中地高新濃度」的校準曲線。
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權利要求
1．一種用於被分析物的電化學檢測方法的感應電極，該感應電極包括一種塗有含銜接分子的導電聚合物層的導電電極，這些銜接分子選自抗生物素蛋白質、抗生蛋白鏈菌素、抗-FITC抗體和一種能夠特異性結合在至少一類被固定在其中或被吸附在其上的受體分子上的分子。
2．如權利要求1的感應電極，其中的導電聚合物層已經摻雜大離子半徑的陰離子。
3．如權利要求1或2的感應電極，其中的銜接分子是抗生物素蛋白質或者抗生蛋白鏈菌素，經由生物素/抗生物素蛋白質或者生物素/抗生蛋白鏈菌素結合相互作用能與所述被分析物結合的生物素化受體附著其上。
4．如權利要求1或2的感應電極，其中的銜接分子是蛋白質A或者蛋白質G，經由蛋白質A/抗體或者蛋白質G/抗體結合相互作用能與所述被分析物結合的抗體附著其上。
5．如權利要求1或2的感應電極，其中的銜接分子是外源凝集素，經由外源凝集素/碳水化合物結合相互作用能與所述被分析物結合的受體附著其上。
6．如權利要求1或2的感應電極，其中的銜接分子是抗-FITC抗體，經由FITC/抗-FITC結合相互作用能與所述被分析物結合的受體附著其上。
7．一種包括權利要求1至6中任一項的感應電極和參比電極的電極裝置。
8．一種用於電化學檢測被分析物方法的感應電極的製備方法，該感應電極包括一種塗有含銜接分子的導電聚合物層的導電電極，這些銜接分子選自抗生物素蛋白質、抗生蛋白鏈菌素、抗-FITC抗體和一種能夠特異性結合在至少一類被固定在其中的受體分子上的分子，該方法包括下列步驟(a)製備一種含有導電聚合物單體和銜接分子的電化學聚合溶液，(b)將欲塗制的電極浸入該電化學聚合溶液中，和(c)在該電極和該電化學聚合溶液之間施加一種循環電勢，通過該溶液中聚合物的電化學合成塗制該電極，所施加的循環電勢至少為一個全循環。
9．一種用於電化學檢測被分析物方法的感應電極的製備方法，該感應電極包括一種塗有含銜接分子的導電聚合物層的導電電極，這些銜接分子選自抗生物素蛋白質、抗生蛋白鏈菌素、抗-FITC抗體和一種能夠特異性結合在至少一類被固定在其中或被吸附在其上的受體分子上的分子，該方法包括下列步驟(a)製備一種含有導電聚合物單體的電化學聚合溶液，(b)將欲塗制的電極浸入該電化學聚合溶液中，(c)在該電極和該電化學聚合溶液之間施加一種循環電勢，通過該溶液中聚合物的電化學合成來塗制該電極，所施加的循環電勢至少為一個全循環；和(d)將該塗制電極與一種含有銜接分子的溶液接觸，以使該銜接分子被吸附在該電極的導電聚合物塗層上。
10．如權利要求8或9的方法，其中的銜接分子是抗生物素蛋白質或者抗生蛋白鏈菌素，以及該方法更進一步包括將該感應電極與一種含受體分子的溶液接觸，該受體分子與生物素綴合，以使該生物素化的受體經由生物素/抗生物素蛋白質或者生物素/抗生蛋白鏈菌素結合相互作用，與被固定在或被吸附至該電極的導電聚合物塗層上的抗生物素蛋白質或抗生蛋白鏈菌素分子結合。
11．如權利要求10的方法，其中的受體分子是單克隆抗體、多克隆的抗體、抗體碎片、抗體仿製品、嵌合抗體病毒溶菌產物、重組蛋白質、合成肽、激素、激素受體、單股核酸、低分子量分子、與半抗原蛋白質綴合的化學化合物、細菌碎片、植物或者動物細胞、外源凝聚素、糖蛋白或者碳水化合物。
12．如權利要求8或9的方法，其中的銜接分子是蛋白質A、蛋白質G或者外源凝集素。
13．如權利要求8至12中任一項的方法，其中的循環電勢具有一種鋸齒形式。
14．如權利要求8至13中任一項的方法，其中所施加的循環電勢至少為2個循環。
15．如權利要求8至14中任一項的方法，其中施加在電極的循環電勢的峰值小於或等於+2伏特。
16．如權利要求8至13中任一項的方法，其中具有大離子半徑的陰離子的鹽類被加至該電化學聚合溶液中。
17．如權利要求16的方法，其中的鹽類是十二烷基硫酸鈉或者葡聚糖硫酸鈉。
18．如權利要求8至17中任一項的方法，其中的導電聚合物單體是苯胺、噻吩、呋喃或吡咯。
19．一種樣品中的被分析物的電化學檢測方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種具有導電聚合物塗層的感應電極，該塗層含有被固定於其中或者被吸附於其上的能夠與樣品中待測的目的被分析物結合的受體；(b)將該感應電極與含有樣品的試液接觸，以使該目的被分析物與所述被固定或者被吸附的受體結合；(c)將該感應電極與一種含有次級受體的溶液接觸，該次級受體能夠與該被分析物在空間上不同於被固定或者被吸附的受體的結合位點的位點上結合，並且該次級受體與一種電荷標記物綴合；(d)當處理過的感應電極與參比電極浸入一種電解液中時，監測兩者之間的電勢差；和(e)在恆定pH值下，該電解液的離子強度改變之後，監測該感應電極與參比電極之間的電勢差。
20．一種樣品中的被分析物的電化學檢測方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種具有導電聚合物塗層的感應電極，該塗層具有被固定於其中或者被吸附於其上的能夠與樣品中目的待測的被分析物結合的受體；(b)將該感應電極與含有樣品的試液接觸，以使該被分析物與所述被固定的或者被吸附的受體結合；(c)將該感應電極與一種含有競爭分子的溶液接觸，該競爭分子能夠與被固定的或者被吸附的受體結合，並與一種電荷標記物綴合；(d)當處理過的感應電極與參比電極浸入一種電解液中時，監測兩者之間的電勢差；和(e)在恆定pH值下，改變電解液的離子強度之後，監測感應電極與參比電極之間的電勢差。
21．如權利要求19或20的方法，其中的電荷標記物具有下列性質(ⅰ)它在(d)部分電解液的pH值下攜帶淨電荷；和(ⅱ)在恆定pH值下，該電荷數量隨該電解液離子強度的變化而變化。
22．如權利要求21的方法，其中的電荷標記物是二茂鐵、膠乳微球體或金。
23．如權利要求19至22中任一項的方法，其中的步驟(b)和(c)是通過將感應電極與已經加入與電荷標記物綴合的次級受體或者競爭分子的試液接觸而同時進行。
24．一種樣品中的被分析物的電化學檢測方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種具有導電聚合物塗層的感應電極，該塗層含有被固定於其中或者被吸附於其上的能夠與樣品中目的待測被分析物結合的受體；(b)將該感應電極與含有樣品的試液接觸，以使所述被分析物與所述被固定的或者被吸附的受體結合；(c)將該感應電極與一種含有次級受體的溶液接觸，該次級受體能夠與該被分析物在空間上不同於與被固定或者被吸附的受體的結合位點的位點上結合，並且該次級受體與一種酶綴合；(d)當處理過的感應電極與參比電極浸入一種電解液中時，監測兩者之間的電勢差；和(e)在暴露於一種含有所述酶的底物的電解液之後，監測該感應電極與參比電極之間的電勢差。
25．一種樣品中的被分析物的電化學檢測方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種具有導電聚合物塗層的感應電極，該塗層含有被固定於其中或者被吸附於其上的能夠與樣品中的目的待測被分析物結合的受體；(b)將該感應電極與含有樣品的試液接觸，以使該目的被分析物與所述被固定的或者被吸附的受體結合；(c)將該感應電極與一種含有競爭分子的溶液接觸，該競爭分子能夠與被固定的或者被吸附的受體結合，並與一種酶綴合；(d)當處理過的感應電極與參比電極浸入一種電解液中時，監測兩者之間的電勢差；和(e)在暴露於一種含有所述酶的底物的電解液之後，監測該感應電極與參比電極之間的電勢差。
26．如權利要求24或者25的方法，其中的酶能夠將一種直接影響感應電極的導電聚合物塗層的氧化還原組成的底物轉換成一種對所述導電聚合物塗層的氧化還原組成沒有可測影響的產物。
27．如權利要求26的方法，其中的酶是過氧化酶。
28．如權利要求24或者25的方法，其中的酶能夠將一種對感應電極的導電聚合物塗層的氧化還原組成沒有可檢測影響的底物轉換成能夠直接或者間接影響所述導電聚合物塗層的氧化還原組成的產物。
29．如權利要求28的方法，其中能夠間接影響導電聚合物膜的氧化還原組成的產物導致(e)部分電解液的pH值變化。
30．如權利要求29的方法，其中的酶是脲酶。
31．如權利要求24或者25的方法，其中酶能夠將一種對感應電極的導電聚合物塗層的氧化還原組成沒有可檢測作用的底物轉換成第二種酶的底物，第二種酶的作用是產生一種直接或者間接影響該導電聚合物塗層的氧化還原組成的第二種產物。
32．如權利要求24至31中任一項的方法，其中的步驟(b)和(c)是通過將感應電極與已經添加與一種酶標記物綴合的次級受體或者競爭分子的試液接觸而同時進行。
33．如權利要求19至32中任一項的方法，其中能夠與待檢測的被分析物結合的受體是被生物素化的並附著於經由生物素/抗生物素蛋白質或者生物素/抗生蛋白鏈菌素結合相互作用固定在或者吸附至感應電極的導電聚合物塗層上的抗生物素蛋白質或者抗生蛋白鏈菌素上。
34．如權利要求19至32中任一項的方法，其中能夠與待檢測的被分析物結合的受體是抗體，並附著於經由蛋白質A/抗體或者蛋白質G/抗體結合相互作用固定在或者吸附至感應電極的導電聚合物塗層上的蛋白質A或者蛋白質G上。
35．如權利要求19至32中任一項的方法，其中能夠與待檢測的被分析物結合的受體包含糖部分，並附著於經由外源凝集素/糖結合相互作用固定在或者吸附至感應電極的導電聚合物塗層上的外源凝集素上。
36．如權利要求19至32中任一項的方法，其中能夠與待檢測的被分析物結合的受體是用FITC標記的，並附著於經由FITC/抗-FITC結合相互作用固定在或者吸附至感應電極的導電聚合物塗層上的抗-FITC抗體上。
37．如權利要求19至36中任一項的方法，其中的感應電極是根據權利要求8至18中任一項的方法生產的。
38．如權利要求33的方法，其中的步驟(b)和(c)與接觸含有生物素化受體的感應電極的步驟同時進行，該含有生物素化受體的感應電極是通過將感應電極與已經添加與電荷標記物或者酶綴合的生物素化受體和次級受體或者競爭分子的試液接觸而得到的。
39．如權利要求19的方法，其中的次級受體是多克隆抗體或者單克隆抗體。
40．如權利要求19至39中任一項的方法，其中的生物學流體如全血、血清、淋巴、尿、唾液、腦脊髓液流體和精液被用作試液。
41．一種樣品中的被分析物的電化學檢測方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種含有導電聚合物塗層的導電電極的感應電極，該塗層含有被固定在其中或者被吸附在其上的抗生物素蛋白質或者抗生蛋白鏈菌素分子，經由生物素/抗生物素蛋白質或者生物素/抗生蛋白鏈菌素相互作用而附著於受體分子上，被附著於受體分子上的抗生物素蛋白質或者抗生蛋白鏈菌素分子能夠與待測的被分析物結合；(b)將該感應電極與含有樣品的試液接觸，以使該目的被分析物與所述被固定或者被吸附的受體分子結合；(c)當將感應電極與參比電極浸入電解液之中時，監測感應電極相對於參比電極的電勢差；和(d)在恆定pH值下，改變電解液的離子強度或者組成之後，監測該感應電極相對於參比電極的電勢差。
42．權利要求41的方法，其中的待測被分析物是核酸，並且受體分子是低聚核苷酸。
全文摘要
一種用於電化學檢測被分析物方法的感應電極,該感應電極包括一種塗有含一種被固定在其中或被吸附在其上的銜接分子的導電聚合物膜的導電電極,這些銜接分子選自抗生物素蛋白質、抗生蛋白鏈菌素、抗－FITC抗體。通過該銜接分子與對被分析物特異性受體的結合,可將該感應電極製成對受測被分析物特異性的。
文檔編號G01N33/535GK1325490SQ9981254
公開日2001年12月5日 申請日期1999年8月24日 優先權日1998年8月24日
發明者D·A·法馬科夫斯基, Y·Y·米拉諾夫斯基, V·R·徹爾卡索夫, Y·S·比爾於科夫, O·萊奧納多瓦 申請人:傳感技術有限公司