編碼可被掃描探針顯微鏡術(spm)讀取的特定信息的納米條形碼的可控排列的製作方法
2023-05-22 22:24:26
專利名稱：編碼可被掃描探針顯微鏡術(spm)讀取的特定信息的納米條形碼的可控排列的製作方法
技術領域：
本發明所述方法、組合物和儀器涉及分子生物學和生物分子分析的領域，包括但不限於核酸、蛋白質、脂類和多糖。尤其是，本發明涉及，使用納米條形碼和掃描探針顯微鏡(SPM)，對核酸和/或其它生物分子進行檢測、鑑定和/或測序的方法、組合物和儀器。
背景技術：
生物分子的鑑定和/或測序，如核酸或蛋白質的鑑定和/或測序，對於醫學診斷、法醫學、毒理學、病理學、細菌戰、公眾健康和許多其它領域是必不可少的。儘管目前已經針對核酸或蛋白質的鑑定和/或測序進行了大量研究，但其它生物分子，如碳水化合物、多糖、脂類、脂肪酸等等，也可能是重要的。此處公開的方法、組合物和儀器不限於核酸的鑑定和/或測序，也可以用於其它類型生物分子的分析，包括但不限於蛋白質、脂類和多糖。
用於核酸檢測的標準分析方法，如Southern印跡(DNA印跡)或與核酸晶片的結合，依賴於螢光或放射性探針分子與靶核酸分子的雜交。已知的核酸測序方法，通常或者利用Sanger雙脫氧技術或者利用雜交到核酸晶片上。
基於寡核苷酸雜交的測定方法被廣泛用於靶核酸的檢測。與靶核酸在序列上互補的探針寡核苷酸附著在螢光、放射性或其它部分上，並且允許通過Watson-Crick(沃森-克裡克)鹼基配對的形成與核酸雜交。關於該技術的許多變化是已知的。最近，已經設計出可以含有數百或甚至數千個寡核苷酸探針的DNA晶片(DNA chips)。靶核酸與寡核苷酸在晶片上的雜交可以使用螢光光譜學、放射性等等來檢測。不精確互補的序列間的核酸雜交可能導致與靈敏度和/或特異性有關的問題。樣品中靶核酸的低水平的存在可能不被檢測到。
用於Sanger雙脫氧核酸測序的方法受到可以被測序的核酸長度的限制，該方法基於對已經按照大小分開的四色螢光性或放射性核酸的檢測。通常，每次可以確定僅有500到1000個鹼基的核酸序列。使用當前的方法，對完整基因序列的確定，要求產生基因的許多拷貝，切割成重疊片段並且測序，在此之後，裝配重疊的DNA序列。該過程是很艱苦、昂貴、低效率並且很耗時的。通常也需要使用螢光或放射性部分，這些部分潛在地具有安全和廢物處理問題。使用與寡核苷酸晶片雜交的用於核酸測序的更新的方法，可以被用來推斷短的核酸序列，或者被用來檢測樣品中特定核酸的存在，但是不適合於鑑別長的核酸序列。
多種技術可以用於鑑別蛋白質、多肽和肽。通常，這些技術涉及可以識別蛋白質上的一個或多個表位結構域的抗體的結合和檢測。儘管基於抗體的蛋白質鑑定是相當快速的，但這樣的測試方法可能有時會顯示出不可接受的高水平的假陽性或假陰性結果，這是由於抗體與不同抗原的交叉反應性，靶分析物的低抗原性(導致該測試方法的低靈敏度)，抗體與各種表面的非特異性結合，等等。它們也需要製備可以識別單一蛋白質或肽的抗體。同樣地，它們不適合於鑑定先前還沒有被表徵的新穎蛋白質。
存在一種對生物分子，如核酸或蛋白質，進行檢測、鑑定和/或測序的快速、準確和靈敏的方法的需求。
附圖簡述 下述附圖構成本發明說明書的一部分，這些附圖被包括到說明書中，以便對本發明公開的實施方案的某些方面做進一步的說明。參考一個或多個附圖，同時結合此處給出的、對特定實施方案的詳細描述，本發明的實施方案將更易於理解。
圖1示意性說明了一種例證性的方法，該方法用於排列編碼探針130(coded probes 130)，每一個探針包括一個或多個納米條形碼(nano-barcodes)，附著到表面100(surface 100)上的探針分子上。(A)將表面100浸漬到含有編碼探針130的溶液110(solution 110)中。(B)從溶液110中移出含有排列的編碼探針130的表面100。
圖2示意性說明了一種替代性的例證性方法，用於在表面220上排列編碼探針230。(A)一滴含有編碼探針230的溶液210被夾心在蓋玻片200和載玻片220之間。當蓋玻片200被保持在原來位置時，載玻片220被移動，從而導致編碼探針230的排列。
圖3示意性說明了另一種替代性的例證性方法，用於在表面300上排列編碼探針340。
圖4示意性說明了一種例證性的編碼探針400(coded probe400)，包括附著在探針分子410上的納米條形碼420(nano-barcode420)。單一納米條形碼420可以包括一個或多個部分，正如下面更詳細的討論。
圖5顯示了一種用於合成編碼探針的例證性方案。(A)轉化例證性納米-標記單元(nano-tag element)成為含有R1和R2功能部分的雙功能分子(bi-functional molecule)。(B)保護一個功能部分和激活另一個功能部分。(C)在可控聚合作用中，逐步加入構件(buildingblocks)。
圖6示意性說明了主鏈介導納米條形碼合成(backbone mediatednano-barcode synthesis)的一種通用方案。(A)標記單位的單功能化。(B)轉化為胺基酸類似物(amino acid analog)。(C)轉化為核苷酸類似物(nucleotide analog)。
圖7顯示了雙功能富勒烯二醇的一種例證性修飾，用於整合進編碼探針中。
圖8顯示了雙功能富勒烯的一個例證性結構，具有在編碼探針合成中的用途。
圖9顯示了消化的λDNA的一個例證性圖象，是通過原子力顯微鏡所獲得的。
圖10顯示了通過微型流控分子梳(microfluidic molecularcombing，MMC)排列的DNA分子的一個實例。
圖11顯示了通過微型流控分子梳(MMC)排列的DNA分子的另一個實例。
圖12示意性說明了一種基於例證性寡核苷酸的納米條形碼，由雜交在一起的13個單一寡核苷酸鏈構成。
圖13顯示了圖12的納米條形碼的單一寡核苷酸組件。應該注意的是，正如圖12所示，有9個片段(按順序，標記為PT1到PT9)用來構成納米條形碼的上鏈(top strand)，有4個片段(標記為#1到#4)用來構成下鏈(bottom strand)。雜交的納米條形碼錶現出可通過掃描探針顯微鏡檢測的分支點(branch points)。
圖14羅列了PT1到PT9的完整序列，包括分支點。
圖15顯示了圖12和圖13的納米條形碼(nano-barcode)，通過原子力顯微鏡成像(箭頭，圖右上角)。為了比較，也顯示了2.8kb線性質粒DNA。
例證性實施方案的描述 所公開的方法、組合物和儀器是用於生物分子如核酸的檢測、鑑定和/或測序。在本發明的特定實施方案中，所述方法、組合物和儀器適合於獲得非常長的核酸分子的序列，其鹼基長度大於1000，大於2000，大於5000，大於10000，大於20000，大於50000，大於100000或甚至更多個鹼基。優點包括在單一測序循環中讀出長核酸序列的能力，獲得序列數據的高速率，低測序成本，以及按照每單位序列數據所需操作時間數量來說的高效率。其它優點包括以低發生率的假陽性結果，靈敏並且準確地檢測和/或鑑定核酸。
下述詳細描述包括許多特定詳細資料，以便對本發明所公開的實施方案提供更徹底的理解。然而，對於本技術領域的技術人員而言，顯而易見的是，本發明的實施方案不需要這些特定細節就可以實踐。在其他情形中，沒有對本技術領域熟知的設備、方法、程序和單一組分在此處進行更詳細的描述。
定義 正如此處所用，「一個(a)」或「一個(an)」表示一個或不止一個條目。
正如此處所用，「大約(about)」表示在一個值的百分之十的範圍內。例如，「大約100」將表示在90到110之間的某個數值。
「核酸(nucleic acid)」包括DNA、RNA(核糖核酸)、單鏈、雙鏈或三鏈，和它們的任意化學修飾。實際上，考慮到了核酸的任意修飾。一個「核酸」可以是幾乎任何長度，從由2個或更多個鹼基組成的寡核苷酸到全長染色體DNA分子。核酸包括，但不限於，寡核苷酸和多核苷酸。
「編碼探針(coded probe)」指附著在一個或更多個納米條形碼上的探針分子(probe molecule)。探針分子是表現出選擇性和/或特異性結合到一個或多個靶分子上的任何分子。在本發明的多個實施方案中，每一個不同的探針分子可以附著在一個可區別的納米條形碼上，以便可以檢測到來自不同探針分子群體的特定探針的結合。關於可以使用的探針分子的類型，本發明的實施方案沒有限制。可以使用本技術領域已知的任何探針分子，包括但不限於寡核苷酸、核酸、抗體、抗體片段、結合蛋白、受體蛋白、肽、外源凝集素、底物、抑制劑、激活劑、配體、激素、細胞因子等等。在本發明的某些實施方案中，編碼探針可以包括已經共價或非共價附著到一個或多個納米條形碼上的寡核苷酸和/或核酸，其中納米條形碼用於鑑別寡核苷酸和/或核酸的序列。在本發明的多個實施方案中，線性系列的編碼探針可以被連接在一起。被連接的分子中的每一編碼探針可以被連接到可區別的納米條形碼上，以允許鑑定它的序列。由於連接分子中編碼探針的序列也可以被確定，所以可以鑑定整個連接分子的序列。在另外的實施方案中，寡核苷酸探針中的每一核苷酸可以被附著在可區別的納米條形碼上，從而允許從核苷酸序列中鑑定編碼探針的序列。
「納米條形碼(nano-barcode)」指可以被用來檢測和/或鑑定編碼探針的組合物。在下面更詳細討論的非限定性實例中，納米條形碼可以包括一個或更多個亞微米金屬條形碼(submicrometer metallicbarcodes)，碳納米管(carbon nanotubes)，富勒烯或任何其它可以通過掃描探針顯微鏡檢測和鑑定的納米級部分。納米條形碼不限於單一部分，在本發明的某些實施方案中，納米條形碼可能包括，例如，兩個或多個彼此連接在一起的富勒烯。例如，富勒烯可能包括以特定順序連接在一起的一系列大的富勒烯和小的富勒烯。納米條形碼中的不同長短的富勒烯的順序，可以通過掃描探針顯微鏡(scanning probemicroscopy)來檢測，例如，被用於鑑定所附著的寡核苷酸探針的序列。
「靶(target)」或「分析物(analyte)」分子是可以結合到編碼探針上的任何分子，包括但不限於核酸、蛋白質、脂質和多糖。在本發明的一些實施方案中，編碼探針對靶分子的結合可以被用來檢測樣品中靶分子的存在。
分子梳(Molecular Combing) 在本發明的不同實施方案中，納米條形碼、編碼探針和/或結合到編碼探針上的靶分子可以被附著到一個表面上，並且被排列用於分析。編碼探針的排列，提供了編碼探針鑑定的增高的準確度和/或速度。以無組織模式放置在表面上的編碼探針或納米條形碼，可能會彼此重疊在一起，或者被部分地遮掩起來，這增加了它們的檢測和/或鑑定的複雜性。在一些實施方案中，編碼探針可以在表面上排列，並且所整合的納米條形碼按照如下討論被檢測。在另外的替代性實施方案中，納米條形碼可以與探針分子分離，在表面上排列並且被檢測。在某些實施方案中，結合到單一靶分子上的編碼探針的順序可能被保留和檢測，例如通過掃描探針顯微鏡(scanning probe microscopy)。在其它實施方案中，一個靶分子的多個拷貝可能存在在樣品中，靶分子的鑑定和/或測序可以通過將結合到多個拷貝上的編碼探針的所有序列裝配到重疊的靶分子序列上來確定。裝配方法，例如將部分重疊的核酸或蛋白序列裝配成一個連續序列的方法在本技術領域是已知的。在不同實施方案中，納米條形碼可以在它們被附著到探針分子上時被檢測，或者可選擇性地，可以在檢測之前從探針分子上被分離下來。
將分子，如核酸、寡核苷酸探針和/或納米條形碼，附著到表面上並予以排列的方法和儀器在本技術領域是已知的。(例如參見Bensimon等人，Phys.Rev.Lett.744754-57，1995；Michalet等人，Science2771518-23，1997；美國專利號5,840,862；6,054,327；6,225,055；6,248,537；6,265,153；6,303,296和6,344,319。)納米條形碼、編碼探針和/或靶分子可以附著到表面上，使用空氣-水彎月面或其它類型界面中固有的物理力量進行排列。該技術通常已知為分子梳(molecularcombing)。溶解在水介質中的納米條形碼、編碼探針和/或靶分子可以在任意一端或兩個端附著到表面上，如矽烷化載玻片、生物素化表面、金塗覆表面或本技術領域已知能結合這些分子的任何其它表面。表面可以慢慢地從水介質中抽出。極性或帶電靶分子、納米條形碼和/或編碼探針分子將優選地分配到親水(含水)介質中。因此，從水介質中拿出表面導致結合的靶分子、納米條形碼和/或編碼探針的延伸，與液面的運動方向平行。延伸分子的測量長度和其實際大小之間存在直接相關性，1μm的延伸長度相當於大約2000個鹼基的核酸序列(Herrick等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97222-227，2000)。
一旦表面已經從水介質中完全拿出，附著的納米條形碼和/或編碼探針以可能更容易和更準確分析的平行式樣被排列。在本發明的某些實施方案中，其中編碼探針的兩端附著在表面上，排列的編碼探針將以U型構型被安置，該構型也更容易分析。該技術不受將要被排列的靶分子、納米條形碼和/或編碼探針大小的限制，並且可以在長至全長染色體的核酸上發揮作用(例如，Michalet等人，1997；Herrick等人，2000)。在液面運動的適當速率下，所產生的剪切力相對較低，這導致數十萬鹼基或更多鹼基的排列DNA片段(Michalet等人，1997)。
分子梳受到分子和被處理表面之間的強大的非特異性吸附的抑制(Bensimon等人，1995)。因此，在本發明的多個實施方案中，表面經過了處理，以便靶分子或編碼探針的僅僅一端或更多個端將結合到表面上。核酸和其它類型的編碼探針結合到表面上的方法在本技術領域是已知的，下面將對這些方法進行概述。在非限定性實例中，靶分子、納米條形碼和/或編碼探針可以用生物素殘基在分子的一個端或兩個端進行共價修飾。一旦暴露給抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白包被的表面，將只有生物素化端結合到表面上。可以通過使用本質上疏水的表面，如矽烷化表面，來降低到表面的非特異性吸附。
本發明的實施方案不受可以使用的表面類型的限制。表面的非限定性實例包括玻璃、功能化玻璃、陶瓷製品、塑料、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、PTFE(聚四氟乙烯，polytetrafluoroethylene)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮，polyvinylpyrrolidone)、鍺、矽、石英、砷化鎵、金、銀、尼龍、硝化纖維或本技術領域已知的能使靶分子、納米條形碼和/或編碼探針附著在表面上的任何其它材料。附著或者可以是共價相互作用或者非共價相互作用。儘管在本發明的某些實施方案中，表面是玻璃的載玻片或者蓋玻片的形式，但是表面的形狀是沒有限制的，表面可以是處於任何形狀下。在本發明的一些實施方案中，表面是平面的。
在表面上排列靶分子、納米條形碼和/或編碼探針的可替代性的方法，在本技術領域是已知的。(例如，Bensimon等人，1995；Michalet等人，1997；美國專利號5,840,327；6,054,327；6,225,055；6,248,537；6,265,153；6,303,296和6,344,319)。應該預期到，在權利要求所要求的主題範圍內，可以使用任何已知的排列方法。在本發明的某些實施方案中，當溶解在水介質中的靶分子、納米條形碼和/或編碼探針被牽引通過運動著的彎月面時，就會發生排列。液面運動的原理並不重要，例如，可以通過將表面浸入到緩衝溶液中，並且慢慢地從溶液中將它取出來實現。替代地，表面可以被浸入到溶液中，可以通過蒸發或通過移出液體，慢慢地降低液面的水平面。在本發明的另一個替代性實施方案中，可以將一滴溶液放置到蓋玻片和表面之間，如載玻片。將表面慢慢地拖離蓋玻片。由於溶液粘附在蓋玻片上，這導致在蓋玻片與表面接觸的邊緣上形成了一個空氣-水界面。移動該界面，在表面上排列了靶分子、納米條形碼和/或編碼探針。下面將更詳細討論的另一個替代性的用於排列納米條形碼和/或編碼探針的方法，涉及使用自由流動電泳(free-flow electrophoresis)，或者用於替換分子梳或者在分子梳的過程中使用。正如下面實施例中將討論的，可以選擇地，編碼探針和/或納米條形碼可以通過微流控分子梳(microfluidic molecularcombing)來排列。
核酸(Nucleic Acids) 將要檢測、鑑定和/或測序的核酸分子可以通過本技術領域已知的任何技術來製備。在本發明的某些實施方案中，核酸是天然發生的DNA或RNA分子。實際上，可以通過公開的方法來檢測、鑑定和/或測序任何自然發生的核酸，包括但不限於染色體的、線粒體的和葉綠體DNA，和，核糖體的、轉運、不均一核以及信使RNA。在一些實施方案中，將要分析的核酸可能存在於細胞、組織或器官的粗勻漿或提取物中。在其它實施方案中，核酸可以在分析之前被部分地或完全地純化。在可選擇性的實施方案中，將被分析的核酸分子可以通過化學合成或本技術領域已知的多種核酸擴增、複製和/或合成方法來製備。
純化細胞核酸的各種各樣形式的方法是已知的。(例如，參見Guide to Molecular Cloning Techniques，Berger和Kimmel編著，Academic Press，New York，NY，1987；Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版，Sambrook，Fritsch和Maniatis編著，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，NY，1989)。所引述文獻中公開的方法僅僅是例證性的，可以使用本技術領域已知的任何變化形式。在分析單鏈DNA(ssDNA)的情況下，ssDNA可以通過任何已知方法從雙鏈DNA(dsDNA)來製備。這樣的方法可能涉及加熱dsDNA，並且允許這些鏈分離，或者可能涉及通過已知擴增或複製方法從dsDNA製備ssDNA，如克隆到M13中。任何這樣的已知方法可以被用來製備dsDNA或ssDNA。
儘管本發明的某些實施方案包括分析自然存在的核酸，實際上可以使用任何類型的核酸。例如，可以分析通過多種擴增技術製備的核酸，如聚合酶鏈式反應(PCRTM)擴增的核酸。(參見美國專利4,683,195；4,683,202和4,800,159。)將被分析的核酸可以選擇性地被克隆到標準載體中，如質粒、粘粒、BACs(細菌人工染色體)或YACs(酵母人工染色體)。(例如參見Berger和Kimmel，1987；Sambrook等人，1989。)核酸插入物可以從載體DNA分離，例如通過用適當的限制性內切核酸酶切割，隨後用瓊脂糖凝膠電泳分離。分離核酸插入物的方法在本技術領域是已知的。所公開的方法對將被分析的核酸的來源沒有限制，任意類型的核酸，包括原核的、細菌的、病毒的、真核的、哺乳動物的和/或人的可以在權利要求所要求的主題範圍內進行分析。
在本發明的多個實施方案中，單一核酸的多個拷貝可以通過編碼探針雜交來分析，如下面的討論中。單一核酸的製備和多個拷貝的形成，例如通過多個擴增和/或複製方法，在本技術領域是已知的。可以選擇地，單一克隆，如BAC、YAC、質粒、病毒或含有單一核酸插入物的其它載體，可以被分離、培養，並且插入物可以被拿出、被純化用於分析。克隆和獲取純化的核酸插入物的方法，在本技術領域是已知的。
本技術領域的熟練技術人員將意識到，權利要求所要求保護的主題範圍不限於核酸的分析，但也包括其它類型生物分子的分析，包括但不限於蛋白質、脂類和多糖。製備和/或純化各種各樣類型的生物分子的方法，在本技術領域是已知的，可以使用任何這樣的方法。
編碼探針文庫(Coded Probe Libraries) 在本發明的某些實施方案中，編碼探針可能包括探針分子的一個文庫，每一個不同的探針附著在一個可以辨識的納米條形碼上。在給定文庫範圍內，特定探針分子的拷貝多於一個是可能的。在這種情況下，相同探針的每一拷貝將被結合到相同的納米條形碼上。所用的探針和納米條形碼的類型沒有限制，可以使用任何已知類型的探針分子，包括但不限於寡核苷酸、核酸、抗體、抗體片段、結合蛋白、受體蛋白、肽、外源凝集素、底物、抑制劑、激活劑、配體、激素、細胞因子等等。進一步，可以使用任何類型的可以辨識的納米條形碼。
寡核苷酸文庫(Oligonucleotide Libraries) 在本發明的多個實施方案中，編碼探針可能包括寡核苷酸探針，如具有既定序列的寡核苷酸。寡核苷酸可以結合到可以辨識的納米條形碼上，雜交到將要分析的核酸上，和被連接在一起的相鄰編碼探針上。正如上面所討論的，從核酸分離後，連接的編碼探針可以附著到一個表面上，並且被排列。然後，排列的編碼探針可以通過掃描探針顯微鏡(scanning probe microscopy，SPM)進行分析。SPM分析允許編碼探針的納米條形碼部分的檢測和鑑定，以及允許確定編碼探針結合核酸的序列。這一信息可以被用於鑑定核酸和/或用於確定核酸序列。熟練技術人員將意識到，權利要求所要求的主題不限於SPM檢測方法，可以使用能檢測和鑑定在表面上排列的納米條形碼和/或編碼探針的任何分析方法。熟練技術人員也將意識到，SPM分析不限於檢測和鑑定基於寡核苷酸的編碼探針，而是可以在任何類型的編碼探針和/或納米條形碼上使用。
在本發明的可選擇性實施方案中，不需要連接相鄰編碼探針，編碼探針(coded probes)就可以被檢測。編碼探針可以與同一靶分子的多個拷貝雜交。未雜交的編碼探針可以被去除，雜交的編碼探針可以被檢測。在一些實施方案中，當仍然與靶分子雜交時，編碼探針可以被檢測。可以選擇地，編碼探針可以與靶分子分離，例如通過加熱樣品，然後進行檢測。在這樣的實施方案中，在檢測之前，納米條形碼組分能或者不能從編碼探針的探針組分上去除。
在本發明的某些實施方案中，當仍然附著在靶分子上時，編碼探針可以被檢測到。假定短寡核苷酸探針和靶核酸之間的結合相互作用是相對較弱強度時，這樣的方法可能更適合，例如使用交聯試劑將編碼探針已經共價結合到靶分子上的情況下，或者在探針分子和靶物質之間的結合相互作用較強的情況下，正如抗體-抗原相互作用。
在本發明的多個實施方案中，寡核苷酸型編碼探針可以是DNA、RNA或其任何類似物，如肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)，它可以被用來在一個核酸中鑑定特定互補序列。在本發明的某些實施方案中，可以製備一個或多個編碼探針文庫，來與一個或多個核酸分子雜交。例如，可以使用一組含有所有4096或大約2000個非互補6-mers(6-聚體)，或所有16384或大約8000個非互補7-mers(7-聚體)的編碼探針。如果將要使用的是寡核苷酸編碼探針的非互補子集，可以進行多重性雜交和序列分析，分析的結果通過計算方法合併為一個單一數據集合。例如，如果使用僅含有非互補6-mers的文庫用於雜交和序列分析時，可以適用與那些第一個文庫所不包括的編碼探針序列雜交的同一靶核酸分子進行第二次雜交和分析。
在本發明的一些實施方案中，編碼探針文庫可以包括對於給定寡核苷酸長度所有可能的序列(例如，六聚體文庫將包括4096個編碼探針)。在這樣的情況下，某些編碼探針將與互補編碼探針序列形成雜化物。這樣的雜化物，以及未雜交的編碼探針，可以使用已知方法與雜交到靶分子上的編碼探針分離，如高效液相層析(HPLC)、凝膠滲透層析、凝膠電泳、超濾和/或羥基磷灰石層析。對於給定長度，選擇和產生所有可能序列的寡核苷酸的完整集合或特定子集的方法是已知的。在各種實施方案中，可以使用長度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個核苷酸的編碼探針。
在本發明的某些實施方案中，編碼探針文庫可以包括隨機核酸序列，位於與恆定核酸序列在一個端或兩個端結合的編碼探針的中間部位。例如，12-mer(12-聚體)編碼探針的子集可以包括在每一端與恆定2-mers結合的隨機8-mer序列的完整集合。這些編碼探針文庫可以根據它們的恆定部分進行細分，並且分別地與核酸雜交，隨後使用每一不同編碼探針文庫的聯合數據，通過分析來確定核酸序列。熟練技術人員將意識到，所需的子文庫的數量是結合到隨機序列上的恆定鹼基數量的函數。另一個替代性實施方案可以使用多元雜交和分析，一個單一編碼探針文庫含有結合到隨機寡核苷酸序列上的一個特定恆定部分。對於在核酸上的任何給定位點，具有不同的但是是重疊的序列的多個編碼探針與該位點以稍微偏移的方式結合是可能的。因此，採用單一文庫使用多個雜交和分析，可以通過編輯重疊、偏移編碼探針序列獲得核酸的完整序列。
在本發明涉及寡核苷酸文庫的實施方案中，寡核苷酸可以通過任何已知方法製備，如通過在Applied Biosystems 381A DNA synthesizer(Foster City，CA)或類似設備上合成。可以選擇地，可以從多個賣方購買寡核苷酸(例如Proligo，Boulder，CO；Midland Certified Reagents，Midland，TX)。在寡核苷酸是化學合成的情況下，納米條形碼可以共價連接到一個或多個用於合成的核苷酸前體上。可以選擇地，納米條形碼可以在已經合成寡核苷酸之後被結合。在其它可選擇的形式中，可以隨著寡核苷酸合成，納米條形碼被同時附著上去。
在本發明的某些實施方案中，編碼探針可以包括肽核酸(peptidenucleic acids，PNAs)。PNA是具有腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞核嘧啶(C)單體單元的聚醯胺型DNA類似物。PNAs是從公司通過商業途徑獲得的，如PE Biosystems(Foster City，CA)。可以選擇地，在存在叔胺、N，N-二異丙基乙胺(DIEA)的情況下，PNA合成可以如此進行，用9-氟甲氧基羰基(Fmoc)單體激活，用O-(7-氮雜苯並三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(O-(7-azabenzotriazol-1-y1)-1，1，3，3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate，HATU)偶聯。PNA可以通過反相高效液相層析(reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)純化，通過基質輔助雷射解吸電離-時間飛行質譜(MALDI-TOF)分析來檢驗。
納米條形碼(Nano-barcodes) 每一編碼探針可以結合至少一個共價或非共價附著的納米條形碼。納米條形碼可以被用來檢測和/或鑑定個體編碼探針。在本發明的某些實施方案中，每一編碼探針可以具有兩個或多個附著的納米條形碼，它們的組合對於特定編碼探針是獨特的。納米條形碼的組合可以被用來擴展可以用於在文庫中特定地鑑定編碼探針的可辨識納米條形碼的數量。在本發明的其它實施方案中，編碼探針可以每一個具有一個結合的單一的獨特納米條形碼。唯一的要求是，從每一個編碼探針所檢測的信號必須能區別性地從不同的編碼探針鑑定該編碼探針。
在本發明的某些實施方案中，納米條形碼可以在合成編碼探針之前被整合到前體中。對於基於寡核苷酸的編碼探針，可以預期到在腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)位置處的共價附著的內部氨基修飾。內部附著也可以使用可通過商業途徑獲得的亞磷醯胺(phosphoramidite)在胸腺嘧啶(T)位置處進行。在一些實施方案中，在A和G位置具有正丙胺連接子的文庫片段可以被用來將納米條形碼附著到編碼探針上。內部氨烷基尾部的引入允許納米條形碼的合成後附著(post-synthetic attachment)。連接子(linkers)可以從賣主處購買，例如Synthetic Genetics(San Diego，CA)。在本發明的一個實施方案中，也應該預期到使用納米條形碼的適當的亞磷醯胺衍生物進行的自動偶聯。這樣的納米條形碼可以在寡核苷酸合成中被偶聯到5』-末端。
一般而言，納米條形碼將以如此一種方式被共價附著到探針上，此方式以便最小化納米條形碼的位阻，目的在於有助於編碼探針結合到靶分子上，如雜交到核酸上。可以使用連接子，以便對編碼探針提供一定程度的柔韌性。均相和非均相雙功能連接子可以從多個商業來源獲得。
到寡核苷酸鹼基上的附著位點將隨著鹼基有所變化。儘管在任何位置的附著是可能的，但在某些實施方案中，附著發生在不涉及與互補鹼基進行氫鍵結合的位置。因此，例如附著可以在嘧啶的第5或第6位置，如尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶。對於嘌呤如腺嘌呤和鳥嘌呤，鍵合可以通過第8位置。權利要求所要求的方法和組合物不限於任何特定類型的探針分子，如寡核苷酸。納米條形碼到其它類型探針如肽、蛋白質和/或抗體探針的連接方法，在本技術領域是已知的。
關於可以使用的納米條形碼的類型，本發明的實施方案沒有限制。應該預期到，可以使用本技術領域已知的任何類型的納米條形碼。非限定性實施例包括碳納米管、富勒烯和亞微米金屬條形碼。
金屬條形碼(Metallic Barcodes) 可以潛在用作納米條形碼的亞微米金屬條形碼的實例，在本技術領域是已知的(例如Nicewarner-Pena等人，Science 294137-141，2001)。Nicewarner-Pena等人(2001)公開了製備採用亞微米條帶編碼的多金屬微棒(multimetal microrod)的方法，由多同類型的金屬構成。該系統允許產生大量可區別的納米條形碼——使用兩種類型的金屬，可以高達4160；使用三種不同類型的金屬，多達8×105。這樣的納米條形碼可以被整合到編碼探針中，通過SPM技術讀出。將金屬顆粒如金和銀附著到寡核苷酸和其它類型的探針分子的方法，在本技術領域是已知的(例如美國專利5,472,881)。金屬性納米條形碼(MetallicnanobarcodesTM)可以從商業來源獲得(例如Nanoplex Technologies，Mountain View，CA)。
量子點微珠(Quantum Dot Microbeads) 納米條形碼也可以包括量子點標記微珠，正如Han等人所公開的(Nature Biotech.19631-635，2001)。通過將不同大小的量子點(硫化鋅-封端的硒化鎘納米晶體)以精確控制的定量嵌入到聚合微珠中，產生多色光學編碼微珠。儘管2001出版物涉及使用微珠用於螢光標記和檢測，但是熟練技術人員將意識到這樣的珠子也可以以其它檢測形態使用，如SPM成像。可以選擇地，已經提議了多孔矽光子晶體(poroussilicon photonic crystals)，通過恆電流陽極蝕刻編碼(Cunin等人，NatureMaterials 139-41，2002)。這樣的微米大小的、納米結構的顆粒也可以用於納米條形碼的SPM檢測。
碳納米管(Carbon Nanotubes) 在公開的方法中使用納米條形碼的另一個例證性，包括單壁納米碳管(SWNTs)。納米管可以製成多種形狀和大小，它們是可以通過SPM方法區分的。(例如參見Freitag等人，Phys.Rev.B62R2307-R2310，2000；Clauss等人，Europhys.Lett.47601-607，1999；Clauss等人，Phys.Rev.B.58R4266-4269，1998；Odom等人，Ann.N.YAcad.Sci.960203-215，2002)。Odom等人(2002)公開了一種STM(scanning tunneling microscope，掃描隧道顯微鏡)技術，該技術能檢測大小為10nm或更小的SWNTs的隧道光譜中的離散峰值。這樣的峰值可以代表碳納米管的電子態密度(density of electronic states，DOS)中的van Hove奇異性。
碳納米管的電子特性被通過管的長度進行調節。電子的波函數對於長度的靈敏度是通過管長度L的能級分裂的估計值表示的。
ΔE＝hvF/2F(Eq.1)其中h是普朗克常數，vF是費米速率(8.1×105米/秒)(Venema等人，「Imaging Electron Wave Functions of Carbon nanotubes，」Los AlamosPhysics Preprintscond-mat/9811317，1996年11月23。)電子能級之間的差異與納米管的長度成反比，對於更長的管子觀察到了更精細的分裂。
對於本發明的某些實施方案，被用作納米條形碼的納米管的管子長度為大約10到200nm，直徑為大約1.2到1.4nm。被用作納米條形碼的納米管的長度或直徑沒有限制，應該預期到實際上任何長度或直徑的納米管。
應該預期到，納米管可以通過已知方法製備，或者從商業來源獲得，例如CarboLex(Lexington，KY)，NanoLab(Watertown，MA)，Materials and Electrochemical Research(Tucson，AZ)或者Carbon NanoTechnologies Inc.(Houston，TX)。在使用之前，對或者合成或者購買的納米管進行一些處理是適當的。處理可以包括從其它汙染物中純化納米管，將混合直徑和/或長度的納米管分離為離散直徑和長度的納米管，去除納米管端帽和/或共價修飾，以促進納米管附著到探針上，從而形成編碼探針。
在本發明的某些實施方案中，變化長度和/或直徑的納米管可以通過本技術領域已知的多種技術來產生，包括但不限於碳弧放電、通過碳氫化合物的催化高溫分解所進行的化學汽相澱積，等離子體輔助化學汽相澱積，含有催化金屬的石墨靶物質的雷射燒蝕，或者凝聚相電解。(例如參見美國專利6,258,401，6,283,812和6,297,592。)在一些實施方案中，納米管可以通過質譜分析對大小進行分類(參見Parker等人，J.Am.Chem.Soc.1137499-7503，1991)。可以選擇性地，可以用AFM(atomic force microscope，原子力顯微鏡)或STM(scanningtunneling microscope，掃瞄隧道顯微鏡)對納米管進行分類，以便在將納米管整合到編碼探針之前精確地測量個體納米管的幾何形狀。應該預期到，本技術領域已知的其它大小分級方法，如氣相層析、時間飛行質譜、超濾或等價技術。一旦分類完畢，可以對碳納米管進行衍生，並且共價附著到已知序列的寡核苷酸探針或任何其它類型探針上。
對於一個碳納米管，可能的長度最小增量變化是碳碳鍵的長度，或者大約0.142nm。對於200nm的管長度範圍，將允許大約1400個離散納米條形碼。然而，該方法不限於每個編碼探針的單一納米管。在可以選擇的實施方案中，多個不同長度和直徑的納米管可以被連接到一個單一編碼探針上。使用不同長度納米管的組合，可能可區別的納米條形碼的數量成指數增加。在一些實施方案中，為了簡化分析，單一納米管可以被附著到單一探針分子上。
本發明的其它實施方案涉及產生具有已知長度和直徑的碳納米管。在非限定性的例證性實施方案中，一個晶片可能含有具有預選厚度的SiC層，該層覆蓋了另一個層，例如由矽或摻雜了催化劑的矽組成的層(例如金屬原子，如鎳)。使用標準晶片處理方法，如光刻和蝕刻或雷射燒蝕，SiC層可以被劃分為任何長度、寬度、厚度和形狀的SiC沉積物。隨後晶片可以在真空下加熱，例如在大約1400℃大約10-7託(Torr)下，或者可以選擇地從大約10-3到10-12託，10-4到10-10託，或者10-5到10-9託，和從1200℃到2200℃或者1400℃到2000℃。在這些條件下，SiC晶體發生自然分解，失去矽原子(美國專利6,303,094)。剩餘的碳原子自然裝配成碳納米管。可以對SiC沉澱物的大小和形狀進行精確控制，以產生任意長度和直徑的碳納米管。
上面所討論的本發明的例證性實施方案沒有限制，可以使用任何產生選定長度和直徑的碳納米管(例如美國專利6,258,401；6,283,812和6,297,592)的方法。在一些實施方案中，可以使用雷射束、電子束、離子束、氣體等離子束調節納米管的長度，以修正末端。可以選擇地，納米管的末端可以在含有氧氣的環境下與熱刀接觸，以氧化地去除管的末端。含有納米管的坯料也可以被分割，或者磨光以截平納米管。
在本發明的某些實施方案中，碳納米管可以用活性基團衍生以有助於對探針分子的附著(attachment)。在非限定性實施例中，納米管可以被衍生化，以含有羧酸基團(美國專利6,187,823)。羧酸鹽衍生納米管可以通過標準化學附著到探針分子上，例如通過碳二亞胺介導形成與位於探針上的伯胺或仲胺基團的醯胺鍵合。衍生和交聯的方法沒有限制，可以使用本技術領域已知的任何活性基團或交聯方法。
富勒烯(Fullerenes) 在本發明的可以選擇的實施方案中，富勒烯可以被用作納米條形碼(nanobarcodes)。產生富勒烯的方法是已知的(例如美國專利6,358,375)。富勒烯可以通過與上面所公開的碳納米管類似的方法衍生並且連接到探針分子上。含有富勒烯的編碼探針可以通過SPM技術來鑑定，這類似於上面那些對於納米管所公開的方法。
在本發明的某些實施方案中，富勒烯可以被連接到寡核苷酸編碼探針中的個體核苷酸上。在這樣的情況下，只需要兩種不同類型的可區別的富勒烯，這是由於在寡核苷酸中僅存在有四種類型的核苷酸，兩種類型的富勒烯可以組合出四種不同的組合(例如AA、BB、AB和BA)。在個體核苷酸被附著到納米條形碼上的情況下，使用核苷酸和富勒烯之間的已知連接基團是適當的，以避免雜交到靶核酸時的位阻。
熟練技術人員將意識到，所公開的方法中所用的納米條形碼不限於此處公開的實施方案，而是可以包括可以連接到探針並且被檢測的任何其它類型的已知納米條形碼。具有潛在用途的納米條形碼的其它非限定性實施例包括量子點(例如Schoenfeld等人，Proc.7thInt.Conf.on Modulated Semiconductor Structures，Madrid，605-608頁，1995；Zhao等人，1stInt.Conf. on Low Dimensional Structure and Devices，Singapore，467-471頁，1995)。量子點和其它類型的納米條形碼可以通過已知方法合成和/或從商業來源獲得(例如Quantum Dot Corp.，Hayward，CA)。其它具有潛在用途的納米條形碼包括納米顆粒(nanoparticles)，例如可以從Nanoprobes Inc.(Yaphank，NY)和Polysciences，Inc.(Warrington，PA)獲得的納米顆粒。
基於寡核苷酸編碼探針的雜交和連接(Hybridization and Ligation of Oligonucleotide-Based Coded Probes) 在本發明的多個實施方案中，靶核酸與基於寡核苷酸的編碼探針文庫的雜交，可以在僅允許完全互補核酸序列之間發生雜交的嚴格條件下發生。低嚴格雜交條件通常在0.15M到0.9M NaCl和在20℃到50℃的溫度範圍下進行。高嚴格雜交條件通常在0.02M到0.15MNaCl和在50℃到70℃的溫度範圍下進行。應該理解到，適當嚴格性的溫度和/或離子強度部分地是通過寡核苷酸探針的長度，靶序列的鹼基含量，以及雜交混合物中存在甲醯胺、氯化四甲銨或其它溶劑來確定的。上面提及的範圍是例證性的，對於特定雜交反應的適當嚴格性，通常是根據經驗，依據與陽性和/或陰性對照組進行比較來確定。本技術領域的普通技術人員，能按照常規程序調節雜交條件，以允許僅僅發生完全互補的核酸序列之間的嚴格雜交。
一旦短的編碼探針已經與核酸雜交，可以使用已知方法將相鄰編碼探針連接在一起(例如參見美國專利6,013,456)。短至6到8個鹼基的寡核苷酸序列，可以有效地與靶核酸雜交(美國專利6,013,456)。可以使用長度至少為6到8個鹼基的寡核苷酸實現不依賴於引物的連接(Kaczorowski和Szybalski，Gene 179189-193，1996；Kotler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA904241-45，1993)。連接與核酸模板雜交的寡核苷酸編碼探針，在本技術領域是已知的(美國專利6,013,456)。相鄰寡核苷酸編碼探針的酶促連接，可以使用DNA連接酶，如T4、T7或Taq連接酶，或大腸桿菌DNA連接酶。酶促連接的方法是已知的(例如Sambrook等人，1989)。
分子的固定化(Immobilization of Molecules) 在本發明的多個實施方案中，將要分析的靶分子可以被固定化，在編碼探針結合之前、之後和/或過程中。例如，靶分子固定化可以被用來促進結合的編碼探針從未結合的編碼探針中的分離。在某些實施方案中，靶分子固定化(target molecule immobilization)也可以，在編碼探針檢測和/或鑑定之前，被用來從靶分子上分離結合的編碼探針。儘管下述討論針對核酸的固定化作用，但本技術領域的熟練技術人員將意識到固定各種各樣類型的生物分子的方法在本技術領域是已知的，並且可以在權利要求所要求保護的方法中使用。
可以運用核酸固定，例如來促進靶核酸從連接的編碼探針以及從未雜交的編碼探針或彼此雜交在一起的編碼探針中的分離。在一個非限定性的實施例中，靶核酸可以被固定化，並且允許與編碼探針雜交，然後，雜交的相鄰編碼探針被連接在一起。徹底地洗滌含有結合核酸的基質，以去除未雜交的編碼探針以及與其它編碼探針雜交的編碼探針。在洗滌之後，通過加熱到大約90到95℃並維持幾分鐘，從固定化的靶核酸中去除雜交和連接的編碼探針。正如上面所公開的，連接的編碼探針可以被連接到表面，並且通過分子梳來排列。然後排列的編碼探針可以通過SPM來分析。
核酸的固定化，可以通過本技術領域已知的多種方法來實現。在本發明的一個例證性實施方案中，可以通過用鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包被基質，隨後通過生物素化的核酸附著來實現固定(Holmstrom等人，Anal.Biochem.209278-283，1993)。固定也可以通過用聚-L-Lys(1ysine，賴氨酸)包被矽、玻璃或其它基質、隨後使用雙功能交聯試劑通過氨基或者巰基修飾核酸的共價連接而發生(Running等人，BioTechniques8276-277，1990；Newton等人，Nucleic Acids Res.211155-62，1993)。氨基殘基可以通過使用用於交聯的氨基矽烷被引入到基質上。
固定化作用可以通過5』-磷酸化核酸到化學修飾基質上的直接共價連接而發生(Rasmussen等人，Anal.Biochem.198138-142，1991)。核酸和基質之間的共價鍵是通過水溶性碳二亞胺或其它交聯試劑的縮合作用形成的。該方法有助於核酸通過它們的5』-磷酸主要實現5』-附著。例證性的修飾基質將包括載玻片或蓋玻片，所述載玻片或蓋玻片已經在酸浴中處理過，暴露出玻璃上的SiOH基團(美國專利5,840,862)。
DNA通常結合到玻璃上，通過首先矽烷化玻璃基質，然後用碳二亞胺或戊二醛活化實現。在可以替代的程序中，可以使用如下試劑，如3-環氧丙氧丙基三甲氧基矽烷(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane，GOP)，乙烯基矽烷，或氨丙基三甲氧基矽烷(aminopropyltrimethoxysilane，APTS)，具有通過在分子的3』或5』端引入的氨基連接子連接的DNA。DNA可以使用紫外線輻射直接附著在基質上。用於核酸的固定技術的其它非限定性實例公開在美國專利5,610,287；5,776,674和6,225,068中。用於核酸結合的可以通過商業途徑獲得的基質是可以使用的，如Covalink、Costar、Estapor、Bangs和Dynal。熟練技術人員將意識到，所公開的方法不限於核酸的固定，並且具有潛在用途，例如用於將寡核苷酸編碼探針的一端或兩端附著到基質上。
用於固定核酸或其它靶分子的基質類型沒有限制。在本發明的多個實施方案中，固定基質可以是磁珠、非磁性珠、平面基底或幾乎包括任何材料的固體基底的任何其它結構。可以使用的基質的非限定性實例包括玻璃、矽土、矽酸鹽、PDMS(聚二甲基矽氧烷)、銀或其它金屬塗覆基底、硝化纖維、尼龍、活性石英、活性玻璃、聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、聚丙烯醯胺，其它聚合物如聚氯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯，和含有光活性種類的光聚合物，如氮賓、卡賓，以及能與核酸分子形成共價鍵的羰遊基基團(參見美國專利5,405,766和5,986,076)。
雙功能交聯劑(bifunctional cross-linking reagents)可以在本發明的多個實施方案中使用。雙功能交聯劑可以根據它們的功能基團的特異性劃分，如氨基、胍基、吲哚、或羧基特異性基團。在這些交聯劑中，針對游離氨基基團的試劑是受歡迎的，這是由於這些試劑的商業實用性、易於合成以及可以應用它們的溫和反應條件。交聯分子的例證性方法，公開在美國專利5,603,872和5,401,511中。交聯試劑包括，戊二醛(GAD)、雙功能環氧乙烷(OXR)、己二醇二縮水甘油醚(EGDE)和碳二亞胺，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。
掃描探針顯微鏡(Scanning Probe Microscopy) 掃描探針顯微鏡(SPM)是用來測量處在微米和/或納米數量級的物體的物理性能的一組設備。可以獲得不同模式的SPM技術，下面對這些技術進行了更詳細的討論。任何形式的SPM分析可以被用於編碼探針檢測和/或鑑定。一般而言，SPM設備，在非常接近表面的地方，使用非常小的、尖端探針，以測量物體的性能。在一些類型的SPM設備中，探針可以被安裝在懸臂上，該懸臂的長度可以是數百微米，厚度介於大約0.5到5.0微米之間。典型地，探針尖端，以xy模式，光柵掃描表面，以便繪製表面特性中的局部變化。用於成像生物分子和/或檢測用作納米條形碼的分子的SPM方法，在本技術領域是已知的(例如Wang等人，Amer.Chem.Soc.Lett.，121697-98.1996；Kim等人，Appl.Surface Sci.130，230，340-132602-609，1998；Kobayashi等人，Appl.Surface Sci.157228-32，2000；Hirahara等人，Phys.Rev.Lett.855384-87，2000；Klein等人，Applied Phys.Lett.782396-98，2001；Huang等人，Science 291630-33，2001；Ando等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA12468-72，2001)。
掃描隧道顯微鏡(Scanning Tunneling Microscopy，STM) 掃瞄隧道顯微鏡是二十世紀八十年代早期開發的第一個SPM技術。STM依賴於探針尖端和樣品表面之間存在的量子機械電子隧道(quatum mechanical electron tunneling)。尖端被尖銳為單一原子點，光柵掃描通過表面，保持探針-表面間隙距離為數埃，使其不實際接觸到表面。在探針尖端和樣品之間施加小的電壓差(在毫伏數量級到幾個伏特)，測定尖端和樣品之間的隧道電流。當尖端掃描過表面時，樣品的電性和局部形態特性的差異引起在隧道電流的量上的變化。在本發明的某些實施方案中，尖端的相對高度可以通過具有反饋控制的壓電元件來控制，與計算機連接。計算機可以實時監控電流強度，將尖端向上或向下移動以保持相對恆定的電流。在不同的實施方案中，尖端的高度和/或電流強度通過計算機處理，以顯示掃描表面的圖像。
由於STM測量樣品和樣品外形的電特性，所以它可以區分不同類型的導電材料，如在金屬條形碼中的不同金屬類型。STM也能測量局部電子密度。由於隧道電導與局部態密度(DOS)成比例，所以STM也可以被用來區分碳納米管，它們的電學特性依賴於納米管的直徑和長度而有所變化。STM也可以被用來檢測和/或鑑定任何納米條形碼，它們在其電特性是不同的。
STM探針尖端可以掃描過含有排列編碼探針的表面，以檢測和鑑定表面上的每一個編碼探針。也可以鑑定連接的編碼探針(ligatedcoded probes)。通過確定與靶分子結合的編碼探針來鑑定靶分子。在本發明的實施方案中，編碼探針顯示特定序列(如寡核苷酸序列)的存在，可以從與靶分子結合的編碼探針的序列來確定生物分子的序列。
原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy) 另一種形式的SPM是原子力顯微鏡(AFM)。通過AFM進行的生物分子分析方法，在本技術領域通常是已知的(例如Uchihashi等人，「Application of Noncontact-Mode Atomic Force Microscopy toMolecular Imaging，」http//www.foresight.org/Conferences/ MNT7/Abstracts/Uchihashi)。在AFM顯微鏡中，探針被連接到與將被分析的表面接觸的彈簧加載或彈性懸臂上。接觸在分子力範圍內進行(即在範德華力的相互作用範圍內)。在AFM內，不同操作模式是可能的，包括接觸模式、非接觸模式和TappingModeTM。
在接觸模式中，探針尖端和樣品表面之間的原子力通過保持-樣品距離常數、並且測量懸臂的偏差來測量，通常通過將懸臂的雷射偏轉到位置敏感檢測器上來測量。懸臂偏轉導致反射雷射束位置發生了變化。正如在STM中，探針尖端的高度可以使用具有反饋控制的壓電元件進行計算機控制。在本發明的一些實施方案中，通過提高或降低探針尖端來維持相對恆定的偏轉程度。由於探針尖端可以與樣品實際(範德華)接觸，接觸模式AFM趨向於使非剛性樣品變形。在非接觸模式中，尖端被保持在樣品表面上的大約50到150埃之間，並且尖端是振蕩的。尖端與樣品之間的範德華相互作用反映在尖端擺動的相位、振幅或頻率的變化上。非接觸模式中獲得的解析度相對較低。
在TappingModeTM中，使用壓電元件，懸臂以它的共振或接近共振頻率振動。AFM尖端周期性地接觸(或輕打)樣品表面，在空氣中的頻率為每秒大約50000到500000個周期，在液體中的頻率較低。當尖端開始接觸樣品表面時，振動的振幅有所降低。振幅的變化被用來確定樣品的拓撲特性。由於AFM分析不依賴於電導率，所以該分析可以被用來分析非導電材料的拓撲特性。某些類型的納米條形碼，包括但不限於碳納米管、富勒烯和納米顆粒，它們在其拓撲特性是不同的，可以通過AFM技術來檢測和/或鑑定。
在可以替代的AFM模式中，除了樣品的拓撲圖之外，可以獲得額外的信息。例如，在側向力顯微鏡(lateral force microscopy，LFM)中，探針在與它的長度垂直的方向進行掃描，並且懸臂的扭轉程度被測定。懸臂扭轉將依賴於表面的摩擦特性。由於編碼探針的摩擦特性可能依賴於其組成而有所變化，所以LFM可以用於檢測和鑑定不同的編碼探針。
另一個變化形式是化學力顯微鏡(chemical force microscopy，CFM)，其中探針尖端用化學物質功能化，並且掃描樣品以檢測化學物質和樣品之間的粘附力(例如Frisbie等人，Science 2652071-2074，1994)。對於納米條形碼材料具有不同親合力的化學品，如金或銀，可以被整合進AFM探針尖端，並且掃描表面以檢測和鑑定納米條形碼。另一個具有潛在用途的SPM模式是力調製成像(force modulationimaging)(Maivald等人，Nanotechnology 2103，1991)。Uchihashi等人(http//www.foresight.org/Conferences/MNT7/Abstracts/Uchihashi)公開了一種以非接觸模式AFM、使用頻率調製的生物分子成像方法。
其它可以被潛在地用於檢測和/或鑑定編碼探針的SPM模式包括，磁力顯微鏡(magnetic force microscopy，MFM)，高頻率MFM，磁阻敏感影像(magnetoresistive sensitivity mapping，MSM)，電力顯微鏡(electric force microscopy，EFM)，掃描電容顯微鏡(scanningcapacitance microscopy，SCM)，掃描延伸電阻顯微鏡(scanning spreadingresistance microscopy，SSRM)，隧道AFM和導電AFM。在這些類型的一些之中，可以測定樣品的磁性。熟練技術人員將意識到，可以設計金屬條形碼和其它類型的納米條形碼，可以通過它們的磁性以及通過它們的電特性來鑑別。
用於編碼探針檢測和/或鑑定的SPM設備可以通過商業途徑獲得(例如Veeco Insruments，Inc.，Plainview，NY；Digital Instruments，Oakland，CA)。替代性地，可以使用客戶定製設計的SPM設備。
納米條形碼(Nano-barcodes)和掃描探針顯微鏡(Scaning ProbeMicroscopy) 圖1到圖4示意性說明了本發明的例證性實施方案。圖1A和圖1B示意性說明了用於在表面100上排列編碼探針130的非限定性方法。表面100，例如已經通過已知方法用鏈黴抗生物素蛋白包被的玻璃顯微鏡載玻片100，被浸入到溶液110中，例如含有生物素化編碼探針130的溶液。溶液110可以被包括在容器120中。
在非限定性實施例中，編碼探針130包括已經與靶核酸分子雜交的寡核苷酸探針(oligonucleotide probes)。核酸分子可以通過與尼龍膜、96孔微量滴定平板或其它固定基質附著而被固定化。例如包括所有4096個可能的6-聚體序列的生物素化寡核苷酸，可以從商業來源獲得(例如，Midland Certified Reagents，Midland，TX)。生物素化寡核苷酸可以被連接，例如連接到亞微米金屬條形碼上(Nicewarnar-Pena等人，2001)，從而形成編碼探針130。編碼探針130允許與靶核酸雜交。在雜交後，相鄰編碼探針130使用連接酶連接在一起。未雜交的編碼探針130和彼此雜交在一起的編碼探針130通過粗放洗滌來去除，僅剩下與核酸雜交的編碼探針130。編碼探針130是通過將溶液110加熱到95℃、維持5分鐘而去除。與固定基質附著的核酸被去除，僅將連接的編碼探針留在溶液110中。
溶液110中保留的生物素化編碼探針130在一個端與鏈黴抗生物素蛋白塗覆表面100連接。表面100從溶液110中被慢慢去除。可以選擇地，來自溶液110的液體從容器120中慢慢地被去除，例如通過蒸發或慢慢抽吸。當空氣-水界面的彎月面慢慢地移動通過表面100時，附著的編碼探針130在表面100上被排列。排列的編碼探針130可以通過AFM、STM或其它掃描探針方法來分析。
圖2對本發明的另一個例證性實施方案進行了示意性說明。將一滴含有編碼探針230的溶液210放置在表面220上，如玻璃載玻片上。在某些實施方案中，玻片220可以如上所公開地進行處理，以結合編碼探針230的一個或兩個端。溶液滴210被夾心在表面220和蓋玻片200之間。在多個實施方案中，當表面220從蓋玻片200上被慢慢地拖走時，蓋玻片200可以保持在一個恆定位置。這在蓋玻片200的邊緣產生了液面，其有助於排列編碼探針230。
在本發明的多個實施方案中，編碼探針130、230可以在兩個端而不是一個端被附著到表面100、220上。在這種情況下，編碼探針130、230的排列將導致U型分子，而不是線性分子(例如美國專利5,840,862)。圖1和圖2中示意性說明的例證性實施方案，也可以通過將編碼探針130、230的兩個端與表面100、220附著來進行(未顯示出)。
在圖3中，示意性說明的是另一個例證性實施方案，編碼探針340可以在表面300上通過自由流動電泳進行排列。表面300可以包括導電和非導電材料的交互帶，如塗覆到玻璃板320上的金膜帶310。在存在交流電場330下，含有帶電殘基如寡核苷酸上的磷酸基團的編碼探針340將與電場330對齊。自由流動電泳可以與分子梳聯合使用，或者可以代替分子梳，以便在表面300上對齊編碼探針340。進行自由流動電泳的方法是已知的(例如Adiari and Prost，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.884468-71，1991)。然而，本應用提出了在表面上對齊分子的自由流動電泳的第一用途。
實施例實施例1納米標記元件(Nano-tag Elements) 表1顯示了納米標記元件的例證性列表，其分子結構可以用於納米條形碼的生產。大部分所羅列的元件具有納米大小特徵。納米標記元件通過母結構來分組，被劃分為富勒烯分子，POSS(多面體寡聚矽倍半氧化物，含籠型矽氧烷，polyhedral oligomeric silseqquioxane)分子，和有機金屬化合物。POSS分子是相對新型的雜交結構，基於矽倍半氧化物的籠形結構。富勒烯和POSS分子是相對對稱的三維結構，而有機金屬化合物或者是平面的，或者是非對稱的三維結構。富勒烯在任何溶劑中表現出相對低的可溶性。POSS分子在塑料聚合物中被用作添加劑，在單個沉積中往往表現出集結。有機金屬化合物的優點在於巨大的多樣性，這是由於金屬中心和有機配對物間的組合配對。此外，這些分子的三維多樣性可以在3D不對稱到2D對稱的範圍中變化。許多有機金屬化合物可以被雙功能化，以便對元件進行下遊處理，成為條形碼。有機金屬分子是大量成像研究的對象，並且具有可以容易地通過分子成像觀察的特徵。熟練技術人員將意識到，表1中羅列的納米標記元件僅僅是例證性的。本技術領域已知有多種納米標記元件，這些元件可以被用於製成納米條形碼，包括但不限於量子點和碳納米管。任何這樣已知的納米標記元件可以被用於產生納米條形碼和編碼探針。
實施例2合成方案(Synthetic Schemes)雙功能中間體(Bifunctional Intermediates) 圖5示意性說明了用於納米標記介導的條形碼合成的一個例證性方案，涉及產生雙功能化納米標記元件，該元件可以被用作結構單元(構件，building block)，用於個體單位的可控制逐步頭對尾裝配，形成特定聚合物序列。該方法已經在分子生物化學中用於在自動固相合成儀器上製備肽和寡核苷酸。圖5A顯示了一種例證性的納米標記元件初始轉化成雙功能分子。兩個雙功能部分(R1和R2)被示出，它們附加到到標記元件的相對端。圖5B示意性說明了選擇性和暫時保護一個基團，同時激活另一個功能基團。這些技術是眾所周知的，例如在固相肽合成中。圖5C示意性說明了在可控聚合中逐步加入結構單元。典型地，將暫時保護基團從生長聚合物的端點去除，下一個結構單元被偶合到新的脫保護端點。多個循環引起條形碼聚合物的長度有所增加。
示例性R1功能基團包括CH2OH和CONHC3H6NH2。示例性R2功能基團包括CH2OH和COOH。其中當CH2OH被用作R1和R2基團時，R1基團可以用二甲氧基三苯甲基結構進行保護，該結構可以通過酸處理來去除。然後R2基團通過氰乙基-N，N-二異丙基亞磷醯胺來活化。其中當R1基團是CONHC3H6NH2和R2基團是COOH時，R1基團可以通過三苯甲基結構來保護，該部分可以通過酸處理來去除。R2基團可以被活化，例如通過碳二亞胺處理。其它保護/脫保護化學是熟知的，例如在固相肽或寡核苷酸合成中，任何這樣的已知方法可以被用於產生納米條形碼。
骨架介導合成(Backbone Mediated Synthesis) 在標準肽或寡核苷酸固相合成後，骨架介導納米條形碼合成是根據模型製作的。納米標記的元件被轉化為單功能化類似物，然後或者連接到胺基酸，或者連接到核苷酸亞磷醯胺上。結構單元將被適當地構建並活化，用於標準自動固相合成。圖6示意性說明了整個模式。標記單位通過加入適當的R基團被初始單功能化(圖6A)。或者使用基於肽或者使用基於寡核苷酸的聚合作用，功能化標記基團被轉化為共價標記的胺基酸亞單位(圖6B)或核苷酸亞單位(圖6C)。
在這種模式中，一個考慮是骨架的選擇，以及自然存在的聚合分子的已知物理和化學特性，如多肽和寡核苷酸。標記元件化學附著到胺基酸或寡核苷酸類似物上，應該具有相等的難易程度。亞磷醯胺聚合化學比肽化學強烈10倍，並且與編碼探針的下遊合成更兼容。然而，肽可以產生二級結構如α螺旋，α螺旋可以給編碼探針提供結構熵(structural entropy)。表2概括了基於可商業途徑獲得的起始產物的候選者。熟練技術人員將意識到，所羅列的候選者亞單位僅僅是例證性的，本技術領域已知有多種其它潛在的亞單位，並且可以使用。
採用納米標記元件的聚合物裝飾(Polymer Decoration) 另一個編碼探針合成的替代性方法需要產生聚合物支架結構(scaffolds)，納米標記元件(nano-tag elements)通過聚合物後裝配(post-polymer assembly)附加到該聚合物支架上。例如，肽和寡核苷酸提供線性支架分子，納米標記元件可以通過後裝配附著到該支架分子上。有利地，產生肽或寡核苷酸的方法在本技術領域是熟知的。然而，其它形式的納米結構可以提供多維支架。該方法的一個困難在於，將多於一種的標記元件(不包括間隔物)放入到聚合物中是困難的。保護/脫保護的高特異性也限制了這樣的模式。位阻也阻止了完全裝飾。該工藝用於產生編碼探針的例證性實例中是最少遇到困難的方法，這是由於該模式的聚合物合成部分被很好地表徵了，肽和寡核苷酸的翻譯後修飾是已知的。基於寡核苷酸的編碼探針的非限定性實例提供在下面的實施例中。基於例證性寡核苷酸的編碼探針上的分支點，可以通過SPM技術檢測，或者可以作為納米顆粒或其它類型納米標記元件的附著位點。
在特定的適當隔開的位點上具有活性基團的肽或寡核苷酸，可以從商業來源購買。然後，聚合物被暴露給單功能化的納米標記元件，所有活性位點將被修飾。依賴於該策略，固相化學技術可以被採用，用於用納米標記元件進行的裝飾，從而阻止不需要的分子間的聚合反應。
表3羅列了例證性的單功能化標記元件以及它們用於裝飾的相關聚合物。所羅列的所有組分，目前都可以通過商業途徑獲得，並且裝飾化學是已知的。完全的標記和溶解性是重要的。由於分子被裝飾，它們的溶解性受到了影響，這通常導致沉澱。而且，這些結構符合二級和三級結構特性，從而導致複雜的摺疊模式(folding patterns)。摺疊可以受到沉澱到平坦表面的影響。因此，更剛性的骨架可能表現出某些優點。熟練技術人員將意識到所羅列的功能化納米標記元件是沒有限制的，多種其它功能化納米標記元件，如量子點或碳納米管，是已知的，並且可以使用。
聚合物亞單位的直接讀出(Direct read) 第四個策略是基於某些胺基酸或核苷酸類似物的電荷密度的STM成像。該方法可以通過商業途徑獲得特定序列的肽或寡核苷酸合成來實現，隨後打點和成像。表4羅列了幾個例證性的亞單位，以及將它們整合到聚合物序列中。當設計這些聚合物時，可以考慮二級結構和成像表現。
正如在下面實施例中所公開的，例證性的編碼探針亞單位是確定的，並且它們的特徵是確定的。
實施例3例證性編碼探針亞單位的合成肽聚合物(Peptide Polymers) 製備例證性的肽聚合物，其潛在用途在於或者產生裝飾聚合物，或者產生直接的聚合物成像(SEQ ID NO1)。進行5mg數量級固相肽合成。所得到的肽用HPLC純化到大約98％純度。用質譜來證明全長產物的存在。肽的羧基末端被修飾，以形成醯胺末端基團。
AAMAAKAMAAMAKAVAMAAKAVAAMAKAAA(SEQ ID NO1) 基於與角蛋白、Rop蛋白和聚丙氨酸的序列類似性，該序列被預測是α-螺旋，氨基末端和來自賴氨酸的仲胺面向螺旋的同一側。這些胺對於任何具有活化羧基基團的單功能化分子產生了極好的附著點，使用了標準二環己基碳二亞胺(DCC)或水溶性碳二亞胺交聯。羧基末端上的醯胺保護基團被用於防止肽彼此聚合在一起。
潛在的四級結構形成為螺旋束(例如4-螺旋束)，可以通過裝飾賴氨酸側鏈予以消除或最小化。肽濃度也在影響高級結構的形成中起著重要作用。
第二個合成肽序列(SEQ ID NO2)是通過固相肽合成製備的，如上所討論的。設計該序列以檢驗不同胺基酸及它們的成像能力。通過在一側加載螺旋優選胺基酸並且用其它胺基酸的側鏈裝飾另外一側，設計α-螺旋結構。因此，丙氨酸和甲硫氨酸殘基被放置在螺旋的一側，而剩餘胺基酸的代表被放置在螺旋的另一側上。
GALYAMARAVHAMAEAACQAAWAMG(SEQ ID NO2)雙功能富勒烯(Bi-functional Fullerenes) 在修飾的C70富勒烯的周圍，設計例證性的雙功能納米條形碼亞單位，該亞單位與固相寡核苷酸合成是可相容的。在本發明的某些實施方案中，伯醇被用於兩個功能基團，從而產生了二醇-富勒烯類似物。也可以使用仲醇和叔醇，儘管它們的活性相對低一些，位阻相對大一些。合成的第一部分涉及形成雙功能化富勒烯分子，其中功能基團可以是OH、CH2OH或COOH。在可以選擇的實施方案中，製備二羧基化富勒烯，在存在縮合劑(例如DCC)的情況下，羧基基團與試劑反應，如1-氨基3-丙醇試劑反應，以產生兩種醇。胺基基團與羧基縮合，導致烴鏈的附著在羥基殘基上終止。該途徑可以導致烴鏈長度不同的幾種有用產物，最終在富勒烯鏈的可控裝配上影響了富勒烯的間隔。使用羧基化富勒烯的一個告警是所涉及的其它反應，從而導致較少的產物和較低產率。
在衍生後，純化雙功能化產物。為了從雙功能化亞單位有效地形成編碼探針，兩個功能基團被放置在分子的相對端。去除具有一個官能度或具有兩個相鄰修飾的雜質。儘管兩個功能基團的位置在不到180°分離的情況下可能是可行的，兩個功能基團的位置在不到150°的情況下對於編碼探針形成是不可接受的。
正如圖7中所公開的，純化的二醇產物被進一步修飾成用於合成的結構單元。三苯甲基化反應是很簡單的，涉及二醇修飾的富勒烯與二甲基-三苯甲基-氯化物的反應。用DMT-Cl衍生產生了期望的單-DMT和雙-DMT的混合物。純化單三苯甲基化產物，並且將其與雙-三苯甲基化產物分離。單三苯甲基化產物的亞磷醯胺化通過標準反應在惰性條件下發生。氯-2氰乙基-N，N二異丙基-亞磷醯胺試劑可以通過商業途徑獲得，並且最好新鮮使用且僅使用一次。反應很快地進行，得到高產率。在該反應中的產物，將在矽膠層析上得到增加的流動性，從而允許簡單的純化。最終產物通常使用一小塊矽土墊來清潔。在真空下乾燥最終產物，並且在氬氣下乾燥儲存。使用標準亞磷醯胺化學，將該產物整合到聚合物序列中。
設想由於兩個相對的極性端上集中的局部電子分布，充分利用C(70)非完美球形，設計雙功能C(70)亞單位。選擇C(70)富勒烯來提供在相對位點上具有兩種類型的最高活性鍵的支架。預期到五個雙取代的異構體，包括兩對對映異構體。整合兩種類型的羥基基團的設計，允許使用寡核苷酸合成的普通程序，其中羥基存在於核苷中。伯醇主要通過DMT-Cl衍生，剩下仲醇適合於亞磷酸酯化(phosphitylation)。通過C2-C8連接子從C(70)支架上分離醇基團。
圖8示意性說明了雙功能富勒烯的例證性結構，其含有一個伯醇和一個仲醇。為了形成伯醇，可以使用有機鋅反應物通過Reformatsky反應，或使用如琥珀酸半醛通過Prato加成反應引入單羧酸部分，產生取代的吡咯烷衍生物。期望產率為15-30％。用Dibal-H以及羰基基團一起還原C(70)酯。仲醇部分的前體，一種酮，可以使用Prato加成反應或Diels-Alder方法被引入，使用可通過商業途徑獲得的甲基乙烯基酮的三甲矽烷基烯醇。產率為35％和50％。
實施例4例證性雙功能富勒烯的產生 在本發明的例證性實施方案中，產生C70富勒烯二醇，其被轉化為DMTr(二甲氧基三苯甲基)保護的和亞磷醯胺活化的化合物。該產物被用於納米條形碼的合成。通過亞磷醯胺部分的縮合產生的磷酸酯骨架可以增強富勒烯的水溶性，從而有助於隨後使用所得到的編碼探針。
從New England Peptide synthesis division(Fitchburg，MA)獲得用於雙功能富勒烯合成的C70-二醇中間體。中間體產物在適當溶劑中具有有限的溶解性，用於封閉激活和聚合反應。產物顯示出自發逆轉為母體化合物，具有半衰期估計在～1.0年。
也產生了基於寡核苷酸和肽核酸的編碼探針，使用上面所討論的模式，通過Midland Certified Reagents(Midland，TX)、AppliedBiosystems(Foster City，CA)或者QIAGEN Operon(Alameda，CA)合成。
實施例5基質製備和分子附著 多種基質可以被用於編碼探針的成像。成像較慢(在分鐘級)，分子運動較快(若干分之幾秒)。因此，為了限制分子運動，樣品必須被吸收到基質上，成為晶體晶格的一部分。通過AFM使用雲母的DNA成像例證了這一概念。DNA，使用二價金屬如Ni2+或Mg2+通過磷酸酯骨架，結合雲母。DNA和雲母都帶負電，所以必須使用抗衡離子如Mg2+或Ni2+來將DNA吸收到雲母上(Biophys.J.701933，1996；PNAS94496，1997；Biochemistry 36461，1997)。二價陽離子作為帶負電DNA骨架上的抗衡離子，也提供額外的電荷來結合雲母。AP-雲母(功能化氨丙基雲母)已經被用於結合用於AFM的DNA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA94496，1997)。
金塗覆雲母基質的退火(Annealing Gold-on-Mica Substrates) 石英毛細管火焰噴槍是通過在Sutter Instruments P-2000毛細管拔出器中拉出一條1.00mm o.d.，0.75mm i.d.的石英毛細管來製備。刻劃玻璃，在毛細管的ID為大約200μm的位置斷開。然後將表面打磨平坦，用3M特大研磨膜磨光。在加熱單元上，以130℃將石英片加熱5分鐘。使用離石英尖端1.5英寸的火焰，用氫氣火焰噴槍火焰處理該片。用鑷子將新生的金基質放置(焊膏面朝上)在該片狀物的中央。用預先火焰處理的1cm×1cm×1mm石英塊支持基質，該石英塊僅接觸雲母表面，將其加熱5分鐘。將石英毛細管火焰噴槍保持與片狀物平面成30°的角度，這樣火焰的尖端恰好接觸到金表面。使用兩英寸焊道，以1秒為周期，將火焰重複地通過金表面(45次)。在氬氣下將基質保存在其原始容器中，直到使用。
DNA在底物上的沉積 將DNA沉積在雲母上，並且用AFM掃描。使用一群不同大小的質粒分子(在長度上，以1000鹼基進行變化)，其大小範圍在1-10Kb，獲得AFM圖像(沒有示出)。
到金的直接附著 將要成像的分子被直接或非直接連接到基質上。直接附著(direct attachment)涉及用功能基團修飾納米標記，其與底物特異性反應以產生共價鍵。在含水條件下，硫在還原金上的親核攻擊在本技術領域是已知的。該方法已經被最優化，在溫和條件下顯示出可行性。直接附著的氧化還原動力學可以用pH來控制。該反應是特異的，不應該與其它納米標記交叉反應。另一個方法可以使用更活性的攻擊基團，如基於自由基的機理或光催化反應。一般而言，自由基反應動力學是快速並且強烈的，但通常缺乏控制。最後的一個方法使用籠式硫類似物，該類似物用光或pH去保護。該方法將使用與第一個方法類似的機制，但增加了一個特異性元件，用於起始並且局部化反應。共價附加到金表面的例證性反應部分包括巰基基團、氧自由基、碳自由基和光活化試劑，如本技術領域已知的多種硫化合物。在這些化合物中，巰基修飾的寡核苷酸到金表面的附著是研究最廣泛的，已經在多種出版物上公開。此外，硫醇修飾的寡核苷酸探針可以通過商業途徑從標準來源獲得(例如Midland Certified Reagents，Mildland TX)。
到金的非直接連接 靶物質到底物的非直接連接涉及一個「連接子」分子，來提供到基質以及到納米條形碼的連接點。在該策略中，使用了雙功能連接子分子。連接子分子具有一個用於連接到金的功能基團，和另一個連接到條形碼的功能基團。該方法的一個優點是，通過第二次反應，在連接到條形碼之前，可以以期望密度用連接子分子修飾基質，通過成像進行驗證。
0124在一個非限定性實施例中，連接子分子可以使用巰基基團被連接到金，在連接子的相對端使用另一個功能基團。一個非限定性實例是羧基基團。氨基化間隔條形碼可以與末端羧基特異性(但不可逆地)反應。碳二亞胺介導的胺與羧基基團的縮合反應是一個已經很好的理解了的化學路徑。
實施例7.STM成像(STM Imaging)金納米顆粒(Gold Nanoparticles)0125用金納米顆粒和λDNA獲得AFM圖像。所用的基質是聚L-賴氨酸塗覆的蓋玻片和氨基處理的雲母(AP-雲母)。AP-雲母是通過用3-氨丙基三乙氧基矽烷汽相處理最新裂解的雲母獲得的。50nm、10nm、5nm和2nm的金納米顆粒是從Ted-pella Inc.(Redding，CA)購買的。對於聚L-賴氨酸蓋玻片基質，讓10μm的金膠體溶液在蓋玻片上乾燥。對於AP-雲母，將100μm金膠體溶液在基質上放置15分鐘。然後用Kimwipe通過毛細作用帶走過量溶液。使用Digital IustrumentsNanoScope，以tapping mode AFM，對AP-雲母基質進行AFM成像，顯示出光滑的、無特徵表面。AP-雲母證明是很好的用於固定金納米顆粒的表面。50nm金納米顆粒可以容易地通過AFM成像(沒有示出)。5和10nm金納米顆粒也可以由AFM清楚地看見(沒有示出)。2nm金納米顆粒個別地是可以區分的，儘管圖象清晰度沒有較大納米顆粒清晰(沒有示出)。
0126在10、5和2nm金納米顆粒的混合物中，區分不同大小的納米顆粒是可能的(沒有示出)。2和5nm納米顆粒可以使用分連接子模式AFM(tapping mode AFM)，通過測量的高度來區分。這些結果顯示基於不同大小納米顆粒的納米條形碼可以通過SPM成像技術區分。
0127在另一個例證性實施例中，將20μl聚-L-賴氨酸溶液(0.01％，來自Sigma Chemicals，St.Louis，MO)在雲母基質上放置大約5分鐘，然後用納米純水(18MΩ)衝洗，並且在過濾後的N2氣下乾燥。將金納米顆粒(來自Polysciences或者Ted-Pella Inc.)超聲波處理30秒。將25μl未稀釋納米顆粒的樣品放置到聚-L-賴氨酸包被的雲母上大約10分鐘，然後用納米純水衝洗，並且在過濾後的N2氣下乾燥。用以分連接子模式AFM用Digital Instruments NanoScope獲得圖像(沒有示出)。
0128也可以通過AFM對Hind III消化的λDNA成像。在HEPES緩衝液中，製備1μg/ml消化的λDNA溶液(40mM HEPES，5mMNiCl，pH6.8)。30μl的DNA溶液樣品沉積到處理的雲母基質上10分鐘，用納米純水衝洗，在N2氣下乾燥。圖9所示為消化的λDNA的AFM圖像。雙鏈DNA分子可以通過AFM成像清楚地看見。
富勒烯(Fullerenes)0129通過STM成像，獲得沉積在石墨表面的單一富勒烯分子的圖像，使用具有14.46nm掃描尺寸的Digital Instruments NanoScope(沒有示出)。多個富勒烯通過肽連接在一起，並且成像。四個富勒烯被附加到SEQ ID NO1的肽上，通過STM掃描獲得圖像，顯示了四個富勒烯中的每一個(沒有示出)。
實施例8核酸的排列0130通過微型流體分子梳排列λDNA。在覆蓋在基質上的PDMS層上，製備微型流體渠道(microfluidic channels)。根據Anderson等人的(「Fabrication of topologically complex three0dimensional microfluidicsystems in PDMS by rapid prototyping，」Anal.Chem.723158-3164，2000)，通過模塑聚二甲基矽氧烷(PDMS)製備微型流體渠道。基質可以包括，例如如上所討論的製備的AP-雲母或金包被基質。樣品可以在微型流體渠道的一端被引入腔室中，在渠道的另一端對貯存器應用真空。在渠道內加入一個或多個柱子，允許通過分子梳進行分子排列。
去除PDMS層，用納米純水衝洗基質，用N2氣乾燥。用多個腔室和/或微型流體渠道、不同模式的微型流體組分、不同的微型流體流和渠道內的不同結構，形成各種各樣的排列。
0131圖10和圖11顯示了λDNA分子的實施例，通過MMC方法排列。完全伸展和排列的λDNA的長度是大約17μm。正如所期望的，分子在與微觀流體流動方向平行的方向排列。該結果說明了在表面上排列編碼探針的可行性，或者與靶物質雜交或者要不然雜交且然後釋放。編碼探針分子的排列，有助於通過SPM成像技術進行它們的成像和鑑定。
實施例9基於寡核苷酸的編碼探針的AFM成像0132正如圖12所示意性說明的，在另一個非限定性實施例中，編碼探針可以作為一組雜交在一起的短寡核苷酸序列而產生。圖中的每一條線代表一個單一的合成寡核苷酸，頂層鏈上有9個和底層鏈上有4個。雜交產生了可以通過SPM技術成像的分支點。可以選擇地，如上所討論的，分支點可以作為金屬納米顆粒或其它標記元件的附著點。圖13提供了一個例證性的寡核苷酸編碼探針序列，顯示了彼此雜交在一起的頂層鏈和底層鏈的序列。為了清楚，圖13沒有給出分支序列。圖14顯示了形成編碼探針頂層鏈的9個分離寡核苷酸的完整序列。指出了彼此雜交在一起形成分支點的部分。例如，PT1(SEQ ID NO3)的3』端，標記為「A」，與PT2(SEQ ID NO4)的5』端雜交，標記為「A』」。同樣地，B與B』結合，C與C』結合，等等。
0133如上所討論的，通過AFM技術，對例證性的編碼探針進行了成像。圖15的箭頭指出了編碼探針的一個AFM圖像。為了比較，在編碼探針的相鄰處給出了線性2.8kb質粒雙鏈DNA分子。
**************************************************0134根據本發明的公開內容，此處所公開以及權利要求所要求的所有方法、組合物和儀器可以製造和使用，不要求過度的試驗。對於本技術領域的普通技術人員而言顯而易見，可以對此處描述的方法、組合物和儀器進行修改，只要不背離權利要求所要求主題的概念、精神和範圍。更特別地，顯而易見，可以用某些相關的因素代替此處描述的因素，而同時得到相同或類似的結果。對於本技術領域普通技術人員來說是顯而易見的所有這樣的類似替代和修飾，被認為在權利要求所要求的主題的精神、範圍和概念內。
表1例證性的納米標記元件
表1(續)
通過使SNMP管理器(由控制臺205所表示的功能)將不同的OID分配給每個事件來區分不同的系統事件或系統操作。通過使用與設備相對應的MIB或向SNMP管理器或代理提供查找作為所接收到的PDU命令的一部分的OID的能力的參考資料庫，來獲得這些事件的定義。
通過控制臺205對系統事件的登記用於對位於網絡200上的設備的應用程式或功能的定義。這種操作將使用具有由與適當的SNMP代理進行通信的SNMP管理器所設置的相應OID的「setrequest」命令。在進行通信時，SNMP代理將「trap」消息返回SNMP管理器，以指示這表2.用於骨架介導合成的潛在亞單位
表3.用於聚合物裝飾的例證性亞單位
表4.用於直接聚合物成像的例證性亞單位
權利要求
1.一種方法，包括a)獲得一個或多個編碼探針，每一個編碼探針包括一個附著到至少一個納米條形碼上的探針分子；b)用一個或多個靶分子接觸編碼探針；c)組織結合到一個或多個靶分子上的編碼探針；d)鑑定所組織的編碼探針；和e)基於結合的編碼探針，檢測一個或多個靶分子。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述每一個探針包括一個寡核苷酸。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述靶分子是核酸。
4.如權利要求3所述的方法，其中用靶分子接觸所述編碼探針的文庫，該文庫包括特定長度的寡核苷酸的所有可能的序列。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述納米條形碼選自碳納米管、富勒烯、亞微米金屬條形碼、納米顆粒和量子點。
6.如權利要求3所述的方法，其中所述核酸被附著到一個表面上。
7.如權利要求6所述的方法，進一步包括連接與核酸雜交的相鄰的編碼探針。
8.如權利要求7所述的方法，進一步包括將連接的編碼探針與核酸和未連接的編碼探針分離。
9.如權利要求1所述的方法，進一步包括通過分子梳在表面上排列編碼探針。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述編碼探針是通過掃描探針顯微鏡被鑑定的。
11.如權利要求10所述的方法，其中掃描探針顯微鏡技術選自原子力顯微鏡、掃描隧道顯微鏡、側向力顯微鏡、化學力顯微鏡、力量調製成像、磁力顯微鏡、高頻磁力顯微鏡、磁阻敏感影像、電力顯微鏡、掃描電容顯微鏡、掃描伸展電阻顯微鏡(scanning spreadingresistance microscopy)、隧道原子力顯微鏡和導電原子力顯微鏡。
12.如權利要求9所述的方法，其中所述在表面上排列的編碼探針是通過掃描探針顯微鏡來鑑定的。
13.如權利要求12所述的方法，進一步包括確定與核酸結合的寡核苷酸的序列。
14.如權利要求13所述的方法，進一步包括從與核酸結合的寡核苷酸的序列確定核酸的序列。
15.如權利要求3所述的方法，進一步包括從與核酸結合的編碼探針鑑定核酸。
16.如權利要求1所述的方法，其中所述靶分子是蛋白質、肽、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多核苷酸、寡核苷酸、脂類、糖脂類或多糖。
17.如權利要求16所述的方法，其中兩個或多個靶分子存在於樣品中，同時分析樣品中的所有靶分子。
18.如權利要求16所述的方法，其中兩個或多個靶分子存在於樣品中，同時分析樣品中的所有相同類型的靶分子。
19.一種方法，包括a)獲得一個或多個編碼探針，每一個編碼探針包括一個附著到至少一個納米條形碼上的探針分子；b)用編碼探針接觸一個或多個靶分子；c)在一個表面上，排列與一個或多個靶分子結合的編碼探針；d)用掃描探針顯微鏡鑑定排列的表面探針；和e)從鑑定的編碼探針，檢測一個或多個靶分子。
20.如權利要求19所述的方法，其中通過分子梳在表面上排列編碼探針。
21.如權利要求19所述的方法，其中掃描探針顯微鏡技術選自原子力顯微鏡、掃描隧道顯微鏡、側向力顯微鏡、化學力顯微鏡、力量調製成像、磁力顯微鏡、高頻磁力顯微鏡、磁阻敏感影像、電力顯微鏡、掃描電容顯微鏡、掃描伸展電阻顯微鏡、隧道原子力顯微鏡和導電原子力顯微鏡。
22.如權利要求19所述的方法，其中靶分子是核酸。
23.如權利要求22所述的方法，進一步包括從結合的編碼探針確定至少部分的核酸序列。
24.如權利要求19所述的方法，進一步包括，在表面上排列表面探針之前，從靶分子分離結合的編碼探針。
25.一種用於核酸測序的系統，包括a)掃描探針顯微鏡；b)表面；和c)至少一個附著到表面上的編碼探針。
26.如權利要求25所述的系統，其中通過分子梳在表面上排列所述編碼探針。
27.如權利要求25所述的系統，其中編碼探針包括連接的寡核苷酸。
28.如權利要求25所述的系統，其中掃描探針顯微鏡是原子力顯微鏡或掃描隧道顯微鏡。
全文摘要
此處公開的方法、儀器和組合物涉及生物分子的檢測、鑑定和/或測序，如核酸或蛋白質。在本發明的某些實施方案中，允許包括連接到一個或多個納米條形碼上的探針分子的編碼探針與一個或多個靶分子結合。在結合和從未結合的編碼探針分離之後，在表面上排列結合的編碼探針，並且用掃描探針顯微鏡進行分析。納米條形碼可以是通過SPM可以進行識別的任何分子或複合體，如碳納米管、富勒烯(fullerenes)、亞微米金屬條形碼、納米顆粒或量子點。在探針是寡核苷酸的情況下，在排列和SPM分析之前，與靶核酸雜交的相鄰編碼探針可以被連接起來。此處也公開了包括編碼探針的組合物。用於生物分子分析的系統包括一個SPM裝置和連接到一個表面上的至少一個編碼探針。
文檔編號G06F19/00GK1682237SQ03822310
公開日2005年10月12日 申請日期2003年9月22日 優先權日2002年9月20日
發明者S·陳, X·蘇, M·山川 申請人:英特爾公司