甘藍型油菜顯性核不育恢復系的分子標記及其製備方法與應用的製作方法

2023-05-22 22:44:31

專利名稱：：甘藍型油菜顯性核不育恢復系的分子標記及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於油菜分子育種
技術領域：
，具體涉及一種甘藍型油菜顯性核不育恢復系的分子標記，其製備方法與應用。
背景技術：
：甘藍型油菜顯性核不育是一類由核基因突變而形成的雄性不育類型，具有敗育徹底、不育性穩定、其育性受環境因素影響較小且不存在細胞質效應等特點(周永明，甘藍型油菜輪迴選擇研究.作物學報，1993，1(19):70-75)。不同來源的甘藍型油菜顯性核不育材茅鬥的遺傳基石出存在差異。Mathias(MathiasR.Anewdominantgeneformalesterilityinrapeseed(BrassicaNapusL.)ZPflanzenziichtg，1985，94:170-173)曾報導過一種受單個顯性基因控制的油菜顯性核不育材料。李樹林等通過對宜3A及其衍生系(23A、204A、6A、9A)、川七A和05A等材料的遺傳分析，提出這類甘藍型油菜雄性核不育受一對顯性基因Ms控制，但同時存在一對顯性抑制基因Rf能恢復顯性核不育的育性，首次提出了油菜顯性核不育性受兩對互作基因控制的遺傳模式(李樹林等，甘藍型油菜細胞核雄性不育的遺傳規律探討及其應用，上海農業學報，1985，1(2):1-12;李樹林等.甘藍型油菜細胞核雄性不育性的遺傳驗證.上海農業學報，1986，2:1-8;李樹林等，顯性核不育油菜的遺傳，上海農業學報，1987，3:l-8)。之後，其他研究者以不同的材料也得到類似的結果(王通強等，甘藍型雙低油菜細胞核顯性核不育系黔油2AB的選育，貴州農業科學，1999，27:14-18;胡勝武等，甘藍型油菜核不育材料Shaan-GMS恢復基因的篩選及其遺傳分析；西北農林科技大學學報，2004，32:9-12.)。顯性核不育基因抑制基因(恢復基因)的發現，使得油菜顯性細胞核雄性不育系統用於雜交種生產成為可能。宋來強等採用臨保系測驗法和測交後代可育株自交與回交等方法發現甘藍型油菜不育系609AB可育株的抑制基因(Mf)與不育基因(Ms)等位，即Ms為顯性雄性不育基因，Mf為Ms的等位顯性抑制位點，ms為正常可育位點，並且具有Mf>Ms>ms的顯性遺傳效應，從而提出不育系609AB育性符合1對復等位基因遺傳模式(宋來強等，1對復等位基因控制的油菜(Brassican即usL.)顯性核不育系609AB的遺傳驗證.作物學報，2005，7(31):869-875)。洪登峰等的試驗表明甘藍型油菜不育系RS1046AB的遺傳也符合上述一對復等位基因遺傳的模式(HongDengfeng等，DevelopmentandcharacterizationofSCARmarkersassociatedwithadominantgeniemalesterilityinrapeseed，PlantBreeding(2008)127:69-73)。上述兩種遺傳模式控制的顯性核不育材料的等位性尚未見相關的研究報導。李樹林等首先提出了利用兩對基因互作控制的顯性核不育進行"三系"法生產雜交種的步驟。即將純合不育(MsMsrfrf)與雙隱性可育株(msmsrfrf，臨保系)雜交得到的100%不育株(Msmsrfrf)群體，再與帶有RfRf位點的可育株(恢復系)雜交得到群體育性完全恢復的&種子(李樹林等，甘藍型油菜細胞核雄性不育的遺傳規律探討及其應用，上海農業學報，1985，1(2):1-12)。按照類似的思路，受一對復等位基因模式控制的顯性核不育材料也可以實現"三系"法生產雜交種(宋來強等，一對復等位基因控制的油菜(Brassican即usL.)顯性核不育系609AB的遺傳驗證，作物學報，2005，7(31):869-875)。目前，已利用顯性核不育材料育成了一批油菜雜交種。如周熙榮等選育的核雜3號和核雜7號等(周熙榮等，甘藍型(Brassican即usL)顯性核不育雙低油菜雜交新品種核雜3號的選育，上海交通大學學報(農業科學版)，2003，21:304-308;周熙榮，甘藍型油菜顯性核不育三系雜交種"核雜7號"，農業科技通訊，2005，33:62.);石華娟等育成的川油15號等雜交種(石華娟等，川油15核不育三系制種技術的應用研究，西南農業學報，2004，17:12-15)。Song等以甘藍型油菜純合兩型系609AB為材料，構建了4個群體(包括3個BC1群體，一個DH群體)。通過分離群體分組分析法(BSA法)篩選到4個與Ms連鎖的AFLP標記，其中最近的兩個標記與Ms基因的遺傳距離分別O.3cM和1.6cM;通過克隆測序和PCR步行的方法，將上述兩個最近的標記成功轉化為SCAR標記SC6與SC9，並將SC9轉化成與Rf基因連鎖的SCAR標記SC9f(Lai-QiangSong等，MolecularvalidationofmultiplealleleinheritancefordominantgeniemalesterilitygeneinBrassican即usLTheorApplGenet(2006)113:55-62)。Hong等以甘藍型油菜純合兩型系RS1046AB為材料，通過構建近等基因系(NIL)和BSA法等獲得6個與Rf連鎖的AFLP標記，最近的3個標記與Rf基因的遺傳距離均為0.7cM，同樣採用通過克隆測序和PCR步行的方法將所得的3個AFLP標記轉化成2個與Ms連鎖的SCAR標記SP6和SCE3，遺傳距離分別均為0.7cM;3個Rf連鎖的SCAR標記SCHDA、SCHDC和SCHDF，遺傳距離分別均為0.7cM(HongDengfeng等.AFLPandSCARmarkerslinkedtothesuppressorgene(Rf)ofadominantgeniemalesterilityinr即eseed(Brassican即usL).E卯hytica，2006，151:401-409;HongDengfeng等，DevelopmentandcharacterizationofSCARmarkersassociatedwithadominantgeniemalesterilityinr即eseed.PlantBreeding,2008，127:69_73)。油菜顯性核不育恢復系的選育是利用此類材料生產雜交種的關鍵。在選育恢復系過程中，需要通過當代測交和下一代鑑定的交替程序，來確定恢復基因的存在與否和位點的純合狀態，育種周期較長。因此，開發能有效用於恢復基因鑑定的分子標記十分必要。儘管已有對不育基因和恢復基因定位的報導，迄今尚未見將甘藍型油菜顯性核不育恢復系的分子標記應用到恢復基因鑑定和選擇的報導。
發明內容本發明的目的在於製備一種適用於甘藍型油菜顯性核不育恢復系選育的分子標記，為甘藍型油菜顯性核不育恢復系的鑑定和輔助選育提供一種新的分子標記，從而加速甘藍型油菜顯性核不育恢復系的選育進程，提高育種的準確性和選擇效率。本發明是通過以下方案實現申請人:通過試驗獲得一種適用於選育甘藍型油菜顯性核不育恢復系共顯性SCAR分子標記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDN0:5和SEQIDN0:6所示。申請人:提供了一種適用於選育甘藍型油菜顯性核不育恢復系的顯性SCAR分子標記的製備方法，其步驟如下利用發明人設計的引物對YQ-Rfl、YQ-Rf2擴增甘藍型油菜顯性核不育材料純合兩型系GMS3種植後第一代分離的不育株(編號為甘藍型油菜4185A，其來源如實施例1所述)和甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2(該4185B-2材料的種子已於2009年11月20日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏(見CCTCC的臨時保藏收據)，其保藏號為CCTCC-P200907)基因組DNA，得到4個DNA擴增片段，然後對所述的4個DNA擴增片段進行克隆，測序。得到如下所述的引物對引物對YQ-Rfl從甘藍型油菜顯性核不育系4185A、甘藍型油菜顯性核不育系4185B-2中擴增得到如SEQIDN0:1和SEQIDN0:2所示的核苷酸序列；利用引物對YQ-Rf2從甘藍型油菜顯性核不育系4185A、甘藍型油菜顯性核不育系4185B-2中擴增得到如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示的核苷酸序列。與序列表SEQ1DN0:1相比，在序列表SEQIDNO:2的第63_64bp處有1個15bp的插入突變，插入鹼基是CGAAGAAGAAGAAGA;在第199_208bp處有一個10bp的缺失突變，缺失鹼基是AGAGTTCCTT(見附圖2)，因第63-64bp處的15bp的插入鹼基為簡單重複序列，而第199-208bp處突變直接導致序列特異擴增區域多態性，申請人根據SEQIDNO:1和SEQIDNO:2在該位點的差異設計引物對YQ-Rfa。SEQIDNO:4與SEQIDNO:3相比，在SEQIDN0:4的第1688-1689bp處有一個26bp的插入突變，插入鹼基是GTCTATTAGATTTTATTTGTGACATT(見附圖3)，該突變導致序列特異擴增區域多態性，申請人根據這一差異設計引物對YQ-Rfb。將引物對YQ-Rfa和YQ-Rfb進行PCR擴增，得到與甘藍型油菜顯性核不育恢復基因連鎖的共顯性SCAR分子標記(即本發明的目標分子標記)，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。在上述方法中，所用引物對的核苷酸序列如下所示引物對(1)，編號為YQ-Rfl:正向引物5'-GCAAGATTCCTAGGATTGTAGA-3'，反向引物5'-TGGGACCTATTGCGAAC-3'。引物對(2)編號為YQ-Rf2:正向引物5'-TTAAGCAAGTTTGGAGGG-3'，反向引物5'-GAAGATCAAATCACAAAGTAACG-3'。引物對(3)編號為YQ-Rfa:正向引物5'-AAGGTTTCTTTAGAGTTCC-3'，反向引物5'AAAAAAAGCAGGTCCTAG-3'。引物對(4)編號為YQ-Rfb:正向引物5'-CACTTCGGTGACCTTACA-3'，反向引物5'GTTAATGTCACAAATAAAATC-3'。其中，引物對YQ-Rfl用於擴增序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列;引物對YQ-Rf2用於擴增序列表中SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示的核苷酸序列；引物對YQ-Rfa、YQ-Rfb分別用於擴增序列表中SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。更詳細的技術方案參見《具體實施方式》。本發明的積極效果本發明成功得到與前人不同的甘藍型油菜顯性核不育恢復基因的共顯性SCAR分子標記，運用該標記可鑑別具備顯性核不育恢復性的甘藍型油菜基因型，從而可以克服傳統育種中依靠表型進行選擇的缺點。利用本發明製備的分子標記作為甘藍型油菜顯性核不育恢復系分子標記輔助選擇，可以明顯減少育種工作量，縮短育種年限，加快甘藍型油菜顯性核不育恢復系育種的進程。序列表SEQIDN0:l-4是本發明擴增的甘藍型油菜顯性核不育材料純合兩型系GMS3種植後第一代分離的不育株4185A和甘藍型油菜顯性核恢復系4185B-2的基因組DNA獲得的四段核苷酸序列；序列表SEQIDN0:5-6是本發明製備的甘藍型油菜顯性核不育恢復系共顯性SCAR分子標記的核苷酸序列。圖1:利用引物對YQ-Rfl、YQ-Rf2在甘藍型油菜顯性核不育系4185A和甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2以及F工的基因組DNA中的擴增結果。圖中^代表4185A;P2代表4185B代表4185AX4185B-2;M代表DNAmarker(片段大小依次為3000，2600，2050，1650，1000，700，500和278bp)。圖2:利用引物對YQ-Rfl在甘藍型油菜顯性核不育系4185A和甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2基因組中的擴增的DNA片段序列比對，圖中三角形表示序列的第63-64位的15核苷酸插入突變和第199-208位10bp的缺失突變，缺失鹼基是AGAGTTCCTT;設計的引物位置(即引物對YQ-Rfa的正向引物序列)參見下劃線處。圖3:利用引物對YQ-Rf2在甘藍型油菜顯性核不育系4185A和甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2基因組中的擴增的DNA片段序列比對，圖中三角形表示序列第在1688-1689位的26核苷酸的插入突變；設計的引物位置(即引物對YQ-Rfb的反向引物序列)參見下劃線處。圖4:本發明獲得的引物對YQ-Rfa、YQ-Rfb在甘藍型油菜顯性核不育系4185A、甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2、(4185AX4185B-2)F工的檢測結果。圖中^代表4185A;P2代表4185B-2代表4185AX4185B;M代表DNAmarker(片段大小依次為1500，1200，1000，900，800，700，600，500，400，300，200和100bp)，箭頭所示為分子量大小。圖5:本發明獲得的多重PCR標記YQ-Rfa和YQ-Rfb檢測甘藍型油菜顯性核不育系4185A、甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2、(4185AX4185B-2)以及甘藍型油菜顯性核不育的恢復系、不育系和臨保繫結果。圖中A代表4185A;P2代表4185B-2A代表(4185AX4185B-2);1_6、7_12、13-18分別代表甘藍型油菜顯性核不育材料的不同來源的恢復系；不育系(其中7-9為純合不育單株、10-12為雜合不育單株)和臨保系；M代表DNAmarker(片段大小依次為1500，1200，1000，900，800，700，600，500，400，300，200和100bp)。圖6:是本發明的技術流程圖。圖7:是兩種遺傳模式下恢復系與臨保系雜交可育株自交(I)和回交(II)的育性分離比較圖。圖中，MA代表一對復等位基因控制模式，UD兩對基因互作模式。圖8:兩種遺傳模式下F2群體的育性分離比較圖。圖中，MA代表一對復等位基因控制模式，UD兩對基因互作模式。圖9:兩種遺傳模式下測交群體育性分離的比較比較圖。圖中，MA代表一對復等位基因控制模式，UD兩對基因互作模式。具體實施例方式實施例1:甘藍型油菜顯性核不育材料遺傳特性分析本發明所用材料之一(即用於甘藍型油菜不育系提取基因組DNA材料之一即親本4185A來自於周永明報導的甘藍型油菜顯性核不育材料純合兩型系GMS3(參見周永明，甘藍型油菜輪迴選擇研究，作物學報，1993，1(19):70-75)，該系內植株呈可育株與不育株為l:l分離(由於甘藍型油菜純合的核不育材料是無法收穫種子的，每代需通過系內兄妹交保持不育系，換言之就是保存該純合兩型系GMS3，每年通過一個常用的前述的雜交和簡單的選擇方法就可以得到用於製備基因組DNA的不育株(參見周永明，甘藍型油菜輪迴選擇研究，作物學報，1993，1(19):70-75)，該方法為本領域用於保存甘藍型油菜顯性核不育材料的常用方法和常識性知識，只要得到該甘藍型油菜顯性核不育材料純合兩型系GMS3的種子就可以利用上述報導的方法得到上述的甘藍型油菜不育系材料即本發明所述的親本4185A，為便於敘述該4185A是申請人自己編號命名的，以便於區分其他育種材料，下同)。本發明利用甘藍型油菜顯性核不育純合兩型系GMS3種植後第一代分離的不育株(編號為4185A，獲得該甘藍型油菜顯性核不育第一代分離的不育株的方法為本領域獲公知方法和常識性知識)，甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2(該材料的種子已於2009年11月20日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心保藏，其保藏號為CCTCC-P200907)以及甘藍型油菜顯性核不育臨保系4187(其為育性正常的油菜品種華油8號，見周永明，甘藍型油菜輪迴選擇研究，作物學報，1993,1(19):70-75)進行甘藍型油菜顯性核不育遺傳特性分析和基因組DNA的提取。1、甘藍型油菜不育性表型的鑑定鑑於甘藍型油菜顯性核不育系雄蕊退化明顯，花絲不能伸長，花葯萎縮乾癟，無花粉，本發明採用定期肉眼觀察甘藍型油菜顯性核不育系育性來判斷分離群體中單株的育性情況。具體作法是當甘藍型油菜顯性核不育系植株的主枝上有1015朵花開放時，開始觀察花朵中雄蕊是否退化，花絲是否伸長，每隔7d記錄一次，共記錄3次，依3次觀察到情況對甘藍型油菜植株的育性做出判斷。2、甘藍型油菜顯性核不育材料遺傳模式和遺傳特性分析如上所述，甘藍型油菜顯性核不育性的遺傳控制主要有兩對基因互作控制模式和復等位基因互作控制模式。為便於描述，本發明中將兩對基因互作控制模式簡寫為UD模式，將復等位基因互作控制模式簡寫為MA模式。為確認本發明所用材料的遺傳模式，發明人首先利用甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2進行不育位點基因型的鑑定。本發明中甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2與臨保系4187雜交F2群體的育性表現見表1。如果4185B-2的基因型是MsMsRfRf，與臨保系4187(msmsrfrf)雜交F2群體會有13F:3S的育性分離(見附圖7(1))。如果恢復系的基因型是MsmsRfRf，其與臨保系雜交種自交後代有一半出現13F:3S的育性分離。如果恢復系中不攜帶不育基因，那麼其與臨保系雜交F2群體表現為全可育，其基因型可能是msRf(MA模式)或msmsRfrf(UD模式)。本發明中13個F2群體育性觀察結果顯示全部群體表現可育(見表1)，說明恢復系4185B-2中不攜帶不育基因，其可能的基因型為msRf(MA模式)或msmsRfrf(UD模式)。表1甘藍型油菜顯性核不育系4185B-2與臨保系4187雜交F2代育性分離情況tableseeoriginaldocumentpage8注df=1;x2。。5=3.84，x2。01=6.63;下同；為進一步驗證上述觀察得出的結論，同時採用恢復系與臨保系雜交^與臨保系4187回交判別恢復系4185B-2是否攜帶不育基因。對於復等位基因遺傳模式，測交後代中所有可育單株的基因型只有一種即msRf，與臨保系4187回交後代同自交後代一樣無育性分離；而對於兩對顯性基因遺傳模式，在已經確定恢復基因位點為純合的情況下，巳與臨保系4187測交後代中的可育株存在2種基因型MsmsRfrf和msmsRfrf，對可育株與臨保系回交，理論上有所有(恢復系帶純合不育基因)或1/2單株(恢復系帶雜合不育基因)回交群體有育性分離(見附圖7(n))。本發明的恢復系與臨保系測交回交結果見表2，其結果也表現為全可育，再次表明恢復系4185B-2中不攜帶不育基因。表2甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2與臨保系4187回交後代育性分離情況tableseeoriginaldocumentpage8注:08SF1505-1506為4187自交種，下同在確定了恢復系4185B-2的基因型後，進一步對本發明中所有甘藍型油菜顯性核不育材料的遺傳控制進行了分析。如附圖8所示，不育系與恢復系雜交&的育性分離，在復等位基因的模式下，可育不育是3:i分離；而在兩對基因互作模式下則是13:3和3:i分離。本實施例中，在同一Fi單株的後代的3個&群體中，在0.05水平下進行適合性oa測驗，全部接受3:l分離，兩個接受i3:3分離，如果將三個相同來源的F2群體作為一個整體分析，在0.05水平下僅接受3:1分離而拒絕13:3分離(表3)。表3甘藍型油菜顯性核不育系4185A與恢復系4185B-2雜交F2代育性分離情況lfi合名稱F2代宵性(F:S》F:sx2(3:1)x:(13:3)(4185AX4腳-2》-1120',80.0481.187(概5AX抓鄰-2)-12,0謂:111.9435-SO1(4版AX4185B-2)-i317:-t0.143o,漏S5:230.8385.903表4甘藍型油菜顯性核不育系與恢復系雜交Fj4185AX4185B-2)與臨保系4187測交後代育性分離組合名稱Fi育性F2像性(F:S〉P:s(4185Ax輔5B-2)-1x,F,-1:18160扁8,824(4185Ax4185B-2)-2x08SF1506442:0雄'8333J00(41§5Ax4185B-2)-3x郎sn505-4雄:扁〗,7501,714小計S4:382.條U,W3在確定恢復系4185B-2中不攜帶不育基因的前提下，根據宋來強等(宋來強等，一對復等位基因控制的油菜(Brassican即usL.)顯性核不育系609AB的遺傳驗證.作物學報，2005，7(31):869-875))提出的利用不育系與恢復系雜交^代與臨保系測交的方法，可採用如附圖9所示方法根據測交當代的分離比確定兩種遺傳模式。將不育系4185A與恢復系4185B-2雜交的巳與臨保系測交，將後代育性分離情況進行x2測驗，在0.05水平下進行，全部接受l:l分離，兩個接受3:l分離，如果將三個相同來源的測交群體作為一個整體分析，在0.05和0.01水平下僅接受1:l分離而拒絕3:l分離(見表4)。因此，申請人認定本發明中所有甘藍型油菜顯性核不育材料的遺傳符合一對復等位基因控制模式，其具有如下遺傳特徵Ms為顯性雄性不育基因，Rf為Ms的等位顯性抑制位點，ms為正常可育位點，抑制基因(Rf)均與不育基因(Ms)等位，並且具有Rf>Ms>ms的顯性遺傳效應。為了便於本發明的描述，分別將甘藍型油菜顯性核不育材料不育表型的顯性遺傳位點命名為Ms，基因型為MsMs;將甘藍型油菜顯性核不育材料不育表型的恢復基因遺傳位點命名為Rf，基因型為RfRf;將甘藍型油菜顯性核不育材料不育表型的隱性遺傳位點命名為ms，基因型為msms。根據該命名，將甘藍型油菜顯性核不育材料不育系4185A、恢復系4185B-2和臨保系4187的基因型分別為MsMs、RfRf、msms。4、構建甘藍型油菜不育系分離群體及分離群體的育性調查以甘藍型油菜顯性核不育材料純合兩型系GMS3種植後第一代分離的不育株4185A為母本，以甘藍型油菜顯性核恢復系4185B-2為父本進行雜交，得到&種子。將上述步驟得到的巳種子在自然條件下播種(本領域的常識)，得到巳植株。在^植株上套袋自交得到(4185AX4185B-2)&種子，同時取巳植株的花粉分別與上述步驟所述的甘藍型油菜的母本4185A以及臨保系4187雜交，獲得1份BQ種子和1份測交種子。將獲得的3份種子(其中包括1份種子、1份F2種子和1份測交種子)，在自然條件下種植，得到3個分離群體。共獲得(4185AX4185B-2)F2群體690個單株，4185AX(4185AX4185B-2)群體148個單株，(4185AX4185B-2)X4187群體198個單株。調查上述步驟中得到的3個甘藍型油菜分離群體的育性表型，其育性分離結果見表5所示。對甘藍型油菜育性分離數據進行適合性(x2)測驗(參見南京農業大學主編，田間試驗和統計方法，中國農業出版社，1985，第二版)。表5是本發明中3個甘藍型油菜育性分離群體的育性分離結果。其中，(4185AX4185B-2)F2群體共獲得690個單株，包括519個可育單株和171個不育單株，可育與不育的比值符合3:1的分離比例。4185AX(4185AX4185B-2)群體中，全部148個單株中可育、不育的單株分別為71、77，可育與不育的比值符合1:1的分離比例。(4185AX4185B-2)X4187群體有198個單株，包括102可育單株和96個不育單株，可育與不育的比值符合1:l的分離比例。表5本發明中3個甘藍型油菜育性分離群體的育性分離tableseeoriginaldocumentpage10實施例2:甘藍型油菜顯性核不育恢復系共顯性SCAR標記開發1、提取甘藍型油菜基因組DNA從上述實施例1獲得的三個分離群體以及雙親(即上述步驟所述的甘藍型油菜顯性核不育系4185A及甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2和Fj4185AX4185B-2)的鮮嫩葉片中提取基因組DNA，具體製備方法參照李佳等(李佳等，一種有效提取油菜葉片總DNA的方法，華中農業大學學報，1994，13(5):521-523)報導的方法進行，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA樣品的質量，並用紫外分光光度計(型號PharmaciaBiotech，GeneQuantII)檢測DNA樣品濃度。2、利用引物對YQ-Rfl、YQ-Rf2擴增分析雙親和F工的基因組DNA利用本申請人設計的引物對YQ-Rfl、YQ-Rf2(引物序列見表6所示)來擴增分析甘藍型油菜顯性核不育系4185A、甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2和巳的基因組DNA。PCR反應體系如下:1XPCRbuffer,1.35mMMgCl2，0.08mMdNTPs，1.OUTaqDNA聚合酶(四者均購自MBIFermentas，Lithuania公司)，100ngDNA，正、反向引物各0.45iiM，ddH20補充至終體積20iil。熱循環參數為94。C3min;94。C30sec，復性溫度58°C30sec，72°C60sec，28個循環；72。C10min，1個循環;4。C保存，反應是在PTC-ALD1244PCR儀上完成。兩個材料均進行兩次重複。擴增產物在水平電泳槽上1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用1XTAE緩衝液(0.04MTris-acetate，0.OOIMEDTA，pH8.0)，電壓8V/cm，電泳30min。電泳完畢，凝膠成像系統(UVP)拍照保存。本發明中引物對YQ-Rfl在雙親和的基因組DNA中擴增產物均為lOOObp左右的單一亮帶，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段長度無差異；引物對YQ-Rf2在雙親和巳的基因組DNA中擴增產物均為2000bp左右的單一亮帶，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段長度無差異(見附圖1)。表6本發明設計的引物對的編號及其核苷酸序列tableseeoriginaldocumentpage113、回收、克隆、測序引物YQ-Rf1、YQ-Rf2在雙親中擴增的DNA片段回收上述步驟中獲得的引物對YQ-Rfl、YQ-Rf2在甘藍型油菜顯性核不育系4185A和甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2中擴增的DNA片段。操作程序按GenClean柱式DNA膠回收試劑盒(購自上海捷瑞生物工程公司)並按照試劑盒提供的說明書介紹的方法操作，具體是用刀片從1.2X的瓊脂糖膠上挖出擴增的DNA片段，放入1.5ml的離心管，按每lOOmg瓊脂糖凝膠加入300illBindingSolutionB，置於55。C水浴中加熱10min，每隔2min混勻一次；將融化的膠溶液轉移至套在收集管內的GenCleanColumn中，室溫放置2min，3，OOOrpm離心30sec;倒掉收集管中的廢液，加入500ii1WashSolution,8，OOOrpm室溫離心30sec，此步驟重複一次；倒掉收集管中的廢液，將GenCleanColumn放入同一個收集管中，10，OOOrpm離心lmin;將GenCleanColumn放入一根新的1.5ml的離心管中，在柱子膜中央加30ii1ElutionBuffer,室溫放置2min;10，OOOrpm離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存於_201:備用。取上述回收的目標DNA片段2iU作模板，用引物YQ-Rfl按照上述步驟進行PCR擴增，在1.OX的瓊脂糖膠檢測擴增的DNA片段。如果擴增的DNA片段長度與上述步驟中擴增的結果不相同，需要重新擴增回收；如果擴增的DNA片段長度與上述步驟中擴增的結果相同，說明回收得到的DNA片段即是目標DNA片段，可用於下一步的T-A克隆。將回收的目標DNA片段連接在pMDT-18載體上(該載體購自TaKaRa公司，即寶生物工程(大連)有限公司代理)。操作程序按該試劑盒說明書介紹的方法試劑在使用前先短暫離心將其收集在管底部；在O.5ml的離心管中進行連接反應，連接反應體系為DNA2.0iil，pMDT-18載體0.5ill和SolutionI2.5iU。用移液管來回吸幾次混勻，置4°C冰箱進行過夜連接反應；準備LB液體培養基和LB固體培養基(含100mg/ml氨苄青黴素，24mg/ml的異丙基-硫代P-D_半乳糖苷和20mg/ml的5-溴-4-氯-3-噴哚-a-D_半乳糖苷)；從-7(TC冰箱中取出感受態細胞放在冰上待它慢慢解凍(約5min);離心收集連接反應液，取2iU反應液加入到一個已經滅菌的1.5ml離心管(放在冰上預冷)；用手指輕彈裝有感受態細胞的管底以混勻，取501感受態細胞加入裝有21連接反應液的1.5ml離心管，用手指輕彈混勻，放在冰上20min;在42t:水浴中熱激90sec(勿搖動)，然後在冰上放置5min;加500ill的LB液體培養基後在37。C振蕩培養lh(150rmp/min);吸取振蕩培養後的轉化液200ill塗在無菌的LB固體培養基上，在37t:放置16-20h;進行藍、白斑篩選，挑選24個陽性克隆進行編號，並在無菌的液體LB培養基(含50ug/ml的氨苄青黴素)振蕩培養16_20h;取振蕩培養後的菌液2iU作PCR模板，用M13作引物(正向引物5'-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3';反向引物5'-CGGATAACAATTTCACACAGGA-3')擴增，PCR反應如上述步驟所述。擴增結果在1.0%的瓊脂糖凝膠上檢測。如果所得的DNA片段比目標DNA片段大200bp左右，說明轉化成功，選5份轉化成功的菌液各吸取100y1送華大基因科技股份有限公司進行序列測定。剩餘4001渾濁菌液加400150%無菌的甘油在2ml無菌的離心管中於_701:編號保存。本發明中，引物對YQ-Rfl、YQ-Rf2在甘藍型油菜顯性核不育系4185A和甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2中擴增的DNA片段各5次重複測序，其中序列結果一致。引物YQ-Rfl在甘藍型油菜顯性核不育系4185A、甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2中的擴增DNA片段長分別為975bp、979bp，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:l和SEQIDNO:2所示；引物對YQ-Rf2在甘藍型油菜顯性核不育系4185A、甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2中的擴增DNA片段長分別為1940bp、1948bp，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示4、製備甘藍型油菜中與顯性核不育恢復基因連鎖的SCAR標記對上述步驟得到的引物對YQ-Rfl、YQ-Rf2在甘藍型油菜顯性核不育系4185A和甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2中擴增的片段序列用EBIToolsClustalW軟體(http:〃www.ebi.ac.uk/)在線分析進行序列比對。比對結果顯示，SEQIDNO:2與SEQIDNO:1相比，除部分單鹼基差異外，學列表SEQIDNO:2在63-64bp處有一個15bp的插入突變，插入鹼基是CGAAGAAGAAGAAGA;在第199_208bp處有一個10bp的缺失突變，缺失鹼基是AGAGTTCCTT(見附圖2)。序列表SEQIDNO:4與SEQIDNO:3相比，其最大的差異部分在於SEQIDN0:4在第在1688-1689bp處有一個26bp的插入突變，插入鹼基是GTCTATTAGATTTTATTTGTGACATT;除此處外，在其他區域還存在若干2_6bp的插入或缺失突變(見附圖3)。根據引物對YQ-Rfl、YQ-Rf2在甘藍型油菜顯性核不育系4185A和甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2中擴增DNA片段的核苷酸序列(如序列表SEQIDN0:l-4所示)，利用PrimerPremier5.0軟體(http://www.PremierBiosoft.com)，在序列SEQIDNO:1中的第188-206bp之間的位置設計一條正向引物。設計時要求引物長度為1722bp，復性溫度5062t:，GC含量為4050%。篩選得到一對目標引物，將其命名為YQ-Rfa(序列見表6中引物對YQ-Rfa，正向引物位置見圖2中下劃線所示)，預期在4185A的基因組DNA中擴增出441bp的片段，而在甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2的基因組DNA中無任何擴增產物；按照相同的方法，在序列SEQIDN0:4中的第1684_1704bp之間的位置設計一條反向引物。按上述要求篩選得到一對目標引物(序列見表6中引物對YQ-Rfb，反向引物位置見附圖3中下劃線所示)，預期在甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2的基因組DNA中擴增出1100bp的片段，而在甘藍型油菜4185A的基因組DNA中無任何擴增產物。本發明利用上述步驟設計的引物對進行PCR，PCR反應體系同上所述，復性溫度均為52t:。擴增結果在1.2%的瓊脂糖膠上檢測。其中引物YQ-Rfa組合在甘藍型油菜顯性核不育系4185A和巳的基因組DNA中擴增出441bp的目標片段，而在甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2無任何擴增產物，引物對YQ-Rfb組合在甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2和F工的基因組DNA中擴增出1100bp的目標片段，而在甘藍型油菜顯性核不育系4185A無任何擴增產物(見附圖4)，因此該擴增片段可作為甘藍型油菜顯性核不育恢復系的顯性SCAR分子標記，因引物對YQ-Rfb組合在作為顯性核不育恢復系選擇的時候無法區分其是否攜帶純合或雜合的恢復基因，這就要求其與引物對YQ-Rfa共同使用，為簡化檢測程序，本發明利用上述步驟設計的引物組合進行多重PCR，具體操作步驟如下在同一PCR反應體系中，以100ngDNA為模板，1XPCRbuffer,1.35mmol/LMgCl2，0.08mmol/LdNTPs，1.0UTaqDNA聚合酶(四者均購自MBIFermentas，Lithuania公司)，SCAR引物YQ-Rfa、YQ-Rfb正反向引物各O.40iimol/L，(1朋20補充至終體積20ii1。熱循環參數為94。C3min;94。C30s，52°Clmin，72°C90s，35個循環；72°C10min，1個循環；4"C保存。擴增結果在1.2%的瓊脂糖膠上檢測。其中引物對YQ-Rfa、YQ-Rfb組合在甘藍型油菜顯性核不育系4185A和^的基因組DNA中擴增出441bp的目標片段，而在甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2和^的基因組DNA中擴增出1100bp的目標片段(見附圖5)，在不同來源的6個甘藍型油菜顯性核不育系4185A的恢復系中均出現與甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2—致的1100bp的目標片段(附圖5中l-6)，而在純合型不育系(附圖5中7-9)和雜合型不育系(附圖5中10-12)以及不同來源的臨保系(附圖5中13-18)擴增產物均與4185A—致，因此該擴增片段可作為甘藍型油菜顯性核不育恢復系的共顯性SCAR分子標記，可作為篩選攜帶顯性核不育純合恢復基因甘藍型油菜(即恢復系)的共顯性分子標記。實施例3:共顯性SCAR標記的應用效果驗證將上述步驟中獲得的甘藍型油菜顯性核不育恢復系的共顯性SCAR標記分析本發明中的三個分離群體，分析結果見表7。在(4185AX4185B-2)&群體中，所有171個不育單株與親本不育系4185A—樣僅有441bp擴增片段。在4185AX(4185AX4185B-2)回交群體中，71個可育單株出現與4185B-2—樣的DNA片段，而77個不育單株出現與4185A—樣DNA片段。在(4185AX4185B-2)X4187群體中，102個可育單株出現與4185B-2—樣的DNA片段單株100個，另外兩個單株與4185A—樣DNA片段，而96個不育單株出現與4185A—樣的DNA片段。這些數據說明該標記是與甘藍型油菜顯性核不育恢復系高度緊密連鎖的。表7本發明的共顯性SCAR標記在三個甘藍型油菜顯性核不育系分離群體中的分析分離群體慈*數可育單株I*幽緣，醫寧體AABB(疆5A一認5B-2)F2--1714185Ax(4185Ax4185B-2)剛0710《4185A,85B-2)4譜W82102096說明表7中的"A、B、AB"分別表示具有與4185A、4185B-2、(4185AX4185B-2)F丄一樣的擴增片段的單株，"_"表示未進行試驗，下同。本發明的基本出發點是用於簡便、快速篩選和鑑定甘藍型油菜顯性核不育恢復系，為檢測本發明中標記的選擇效率。申請人選取了33份不同來源的材料進行分析，並以甘藍型油菜顯性核不育系4185A為母本，被檢測的33份材料作父本進行雜交，通過測交&代育性表現檢測來確認這些材料中是否攜帶純合或雜合的恢復基因，其分析結果見表8。如表8所示，在被檢測與甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2帶型一致(即"B帶型")的17份材料中，其中14份材料100X恢復4185A的育性，另外3份出現1-2個單株仍表現為不育，其產生可能的原因是機械混雜或假雜種。在被檢測與甘藍型油菜顯性核不育系4185A帶型一致(即"A帶型")的5份材料中，其中3份材料表現為100X保持4185A育性，說明其不攜帶恢復基因，另外兩份材料分別出現3/45、16/41的可育株，對於3/45的可育株產生可能的原因是機械混雜或假雜種，但對於16/41的可育株，其原因很可能是本發明中所使用的甘藍型油菜不育系4185A存在其他來源的恢復基因，該類恢復基因不能使用本發明所獲標記檢測出。在被檢測與甘藍型油菜顯性核不育不育系與恢復系巳帶型一致(S卩"AB帶型")的9份材料中，其測交後代育性全部接受不育比可育1:1分離，說明上述14份材料中攜帶雜合恢復基因。綜上所述，本發明所獲得標記在不考慮機械混雜或假雜種等情況下，對於甘藍型油菜顯性核不育恢復系的選擇效率可以達到97%以上，這將大大簡化和加快甘藍型油菜顯性核不育恢復系的選育效率。表8本發明的共顯性SCAR標記在33個甘藍型油菜油菜中分析及選擇結果父*編號帶型測交Fl期望比值x2P值總株數可育株不育株可育-不育甲2662-3A葡0400:，甲2663-3A4116250;1甲2664-1A300300:1甲2665-5A45342￡hI甲2669-5A440440:I小計2聽19籠o'1甲2662-1AB392316，0.9230.34甲2663-2扁411724，0.8780.35甲26644AB4021191'10.0250.87甲2665-1AB20191;10.0001.00甲26654AB3924151:i,細0.20甲2666-5AB3717201,i0.1080.74甲2667-1AB3623131:12.2500,13甲2668-1AB4125161:11.5610.21甲2669-3AB4319241:10.3720.54小計355l明篇11,3630.24甲26624B404001:0甲26634B403821:0甲26-lB434301:0099]父本編號帶變溪!交Fl期望比值(1:i)P值總株數可宵株不育株可育:不育甲2666-4B40疆00甲2667-2B44440甲2667-4B424201:0甲2668-3B424201:0甲26684B42420150甲2669-1B444401:甲3654-1B353501;0甲3655-1B45450〗0甲3657-1B45450Is0甲3658-〗B383801:0甲3672-1B414101:0甲3681-B525201:0甲3687-1B393811:0甲369"B383621:0小計麵TO551'0序列表〈110〉華中農業大學〈120〉甘藍型油菜顯性核不育恢復系的分子標記及製備方法與應用〈130〉〈141>2009-ll-08〈160>6〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>975〈212>DNA〈213〉甘藍型油菜(Brassican即us)〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)(975)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(959).(975)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(611).(628)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(188).(206)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(1)(22)〈223〉〈400>1gcaagattcctgggattgteagaagtettggatgggttgtgtgttgatttccctggggaatcatcggaaggtttctttagagctgtttcttgataatgttcagatgctteagaagtetccatgattgatggaaatgatctcagttcttgtttctctcagaggratggtgg皿gtgatctg60cttegagctg皿tctgacgagagtggt雄gttgatttga120cgcgctgagcctectcatctagtcgtcatggtcaacggtc180agttccttttgttgtgtgtgtttggttgtettcgatttga240ttgtgtgtgcactggagatttgctgcteag300tcaggatctcatcgttcactgtgagtccttttctctctcc360ttg皿gg皿gactttegattcttegagctt420tctttectgaagatccaactctegatcttgtteccateat■g3gtettg3g3tttgg卿g皿tggtttgtg3tg3tttgg皿cccttttgcagg皿gteg5403cgg朋ccattctecac3g3cgtttgatggagttgatgtt600agaggtetgacteggacctgcttttttttgttctctctgcttgagttttgttttgcagct660g朋gteagatttgtgtttteggtteggatggtgatc皿3cgtcacccaagtcttcagaag720atttcctttgtgggacattcttteggtggcttgattgcteggtetgcagttgcctgtctt780tetgagcaagatcttccaca皿3C3gCg3gg皿CCg皿3g皿3g皿tcggtggattggag840cctgtgtgtttteteacttctgcaacgccacaccttggttc皿gagg3C3teagcaggtg■agtttegagc3gagtegactttgatgttgagttetgaatc3tgg皿3Ctg3C皿tttggt960tcgcatteggtccca975〈210>2〈211>979〈212>DNA〈213〉甘藍型油菜(Brassica卿us)〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)(979)〈223〉〈220〉〈221>mutation〈222>(64).(78)〈223〉〈220〉〈221>mutation〈222〉(213).(214)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(963)(979)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(1)(22)〈223〉〈400>2gcaagattcctgggattgtega卿卿tgggratggtgg皿gtg3tctg3Cg皿g皿g3603g3Cg朋g朋g朋g朋g朋gtettggatgggttgtcttegagctg皿tctgacg3gagtg120gaaacgttgatttgagtgttgagttccctgggg皿cgcactgagcctectcacctegtcg180tcatggtcaacggtctcatcggcaggttctttgttgttgtgtgtttgattatetttcgat240ttgaagctgtttctteateatgttttgtgtgtgcagtgctC3g皿ctggagatttgctgc300teagcagatgctteag朋gtatcctcaggatctcatcgttcactgtgagtccttttctct360ctccatgattgEltgg腿tgatctttgaagccacactttegattcttega420gcttcagttcttgtttctctcagatctttectgaagatccaactctegatcttgttecca■teatgagtettg卿tttgg卿g皿tggtttgtgatgatttggaacccttttgcaggca540gtegacgg朋ccattctecacagacgtttgtgttetgggtc皿3gatteg600C3g朋g3ggtatgacteggacctgcttttttttgttctctctgcttgagttttgttttgc660agctg朋gteagatttgtgtttteggttegg3tggtg3tCaaacgtcacccaagtcttca720gaagatttcctttgtgggacattcttteggtggcttgattgcteggtetgcagttgcctg780tctttetgagcaagatcttccgagg皿ccgtcggtggatt840ggagcctgtgtgtttteteacttctgcaacgccacaccttggttra卿ggacateagca■ggtgagtttegagcagagtegactttgatgttgagttetgactgacaatt960tggttcgcattaggtccca979〈210>3〈211>1940〈212>DNA〈213〉甘藍型油菜(Brassica卿us)〈220〉〈221>gene〈222〉(1)(1940)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(1918)(1940)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(1)(19)〈223〉〈400>3tc朋gc朋gtttgg郷gcggtttgtcaagggaactccactcccagagcatccacacaat60cgaggtgcctgttcaatecaate^agatctg皿tggc皿cgcaacctec120atg朋ctgattggatec朋g皿tgatgteaatgtetggtgattgcteccaagccatecct180gca朋g朋ggccacggttgag卿ttggctatggtratggtetggteg皿gaggtettca240gtC3gg3朋tggccteaggcgtegate皿tg卿g腿ggtegcc皿gteteacggtttg300ttgtcagggttg朋tgC3C3卿gtgc郷tcaategtgtccatectccg360aatgtecgtccatgaacttcactcactgcaagaacatctt420gggtegtg3gg郷gtectettettgteatgagccatcactega皿ccte■朋gttegacacctcaagttcaactetetctagateatctttttttttccctettctcaaa540ttgttcatetgatgca朋gttgctectectttggttetca600tcggtgacctaacaatgttccateatecttcctttgtcga660gatgg^^aacatcaagttgcttctgttc720teatecatctacatcatctgaatctgatecacttcacctggtcattgacttecttcaaca780gtettgtetc皿c皿g皿皿皿ggttetgcattggactctgte皿ctgteaccaattcte840gatcca^tectttcccccttccteaaatctegcg皿tggtggtccacttcctea皿gte■gttccttcacteteagattecteagatttcatetctttcttggatgtgtg960cttcggtctgctgtctetggtectegctegtctctttctctecatetcatgtetgttgat1020gggatractgC3g3CC3g皿tcctcaatga1080皿gteactgccteagttg皿ctteggg郷atcatgcacaategccagtcatgtgacttg1140ttettecgaggttcteatetcccaaacattcacatcatteteacttg皿g1200caactectccggggacg咖atctgteaatteateatctc1260a^gacteattttggag卿皿gccateat1320caactegctcaactttgcaattegagg皿catteag皿cc13803gc皿ctegaatetgtetgtaaccattgac1440cttecagattc皿tggacteCC3g皿3gCCccatgttcte1500catctcatectgcttegggatcccaaattggatccateacC3Cgg皿皿C1560teag皿cctegttcctctgaacgtggcattatcatttecatecatgcact1620gaca^tgtetgacteggaggatctcagagacteagg皿gtcaattggat1680tctcaagteateagcaccattteateg皿c1740tggatetteag郷郷gagg雄tggtggtctgagag皿1800gacggcg卿cg皿gagcccC皿3CCg皿gctegtctcag1860tgaaccaaccaccattegccccccttccacttcctcctcgtttgcttegt1920tectttgtgatttgatcttc1940〈210>4〈211>1948〈212>DNA〈213〉甘藍型油菜(Brassica卿us)〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)(18)〈223〉〈220〉〈221〉mutation〈222〉(1676)(1701)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(1926)(1948)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(1684)(1704)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(605).(622)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(1)(18)〈223〉〈400>4tc朋gc朋gtttgg郷gcggtttgtcaagcgaggtgcctgttcaatecaate^agatcatg朋ctgattggatec朋g皿tgatgteagca朋g朋ggccacggttgag卿ttggcggtcag朋朋tggccteaggcgtegate皿tttttcggggttg朋tgC3C3aatgttcgtccatgaacttcactcactgcag3gtegtg3gg郷gtecteteattgcaat朋gttegacagacacctcaagttcaactetttcacaaattgttcatetgatgca皿gttgteaacacttcggtgacctteC皿tC3C3ggtttgtcgaaatcaagcaccaC3皿ctecg3ttctgttcteatecatctecatcatctgatcagtettgtetc朋c朋g朋皿gaggttettegatcc朋3tactttcccccttccteaaategttccttcac朋tg朋ttgteteag皿ttgcttcggtctgctgctctetgtectegctC3tg3C3gg3tcactgag朋atgtcgacaggccteggttg朋cttegggaggatcatgccagcgatteag朋gcttca朋tg朋c朋cteactecttgggg3C3C皿3CCttgc朋ga朋gacteatcttggagagateaactegctcaactttgcaattc朋ctega朋g￡lgC￡ltgg￡lt朋tggacteggcttegggatcccaaattggatccateactggaactccactcccagagcatccacacaat60tg皿tggc皿cgcaacctec120atgtetggtgattgcteccaagccatecct180atggtratggtetggteg皿gaggtettca240g卿g腿ggtegcc皿gteteacggtttg300卿gtgc郷tcaategtgtccatectccg360agaacatcct420gagccatcactega皿ccte■atctegateatcttttttttttgtttccte540ctectecttttgttetcaaa600caatgttccateatecttcc660g皿皿皿皿catcaagttgc720acacttcacctggtcattgacttecttcaa780gcattggactctgteaactgteaccaattc840tctegcgaatggtggtccacttccteaaag■tecteagattgcatetctttcttggatgtg960agtctctttctctecatetcatgtetgtet1020tgtcctcaagg^agteact1080caategcccgtcatgtgacttgtteatecg1140tettcacatcatcateactt1200a^gateatt1260gccateatga1320teag皿cc皿1380accattggcattecagattc1440C3g皿3gCCCcatgttctecatctcategt1500acgg皿皿ct皿g皿ccteg1560ttcctcteaacgtegcattetcttttecacaaaacacagttgaccag朋tctc3gagact朋gg朋gtcaattggateg3ttegattttetttgtgacatteac朋cgga3gteacg朋3朋c朋ttgtea朋tggatette朋朋朋朋ggagggaggatgagag朋g3cggcgagacg朋gagccc朋atgttg朋gaagtctcagtgacccteccaccattegccaatecccteacgtgcttcgttectttgtgatttgttcttc〈210>5〈211>441〈212>DNA〈213〉甘藍型油菜(Brassica卿us)〈220〉〈221〉gene〈222〉(1)(441)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(424)(441)〈223〉〈220〉〈221>primer_bindacatgccacttttteagcacccttcatcttgacc朋tgtecaagtgtctecagtteategactggtggtc朋ccg朋gctcctcctegtt〈210>6〈211>1100〈212>DNA〈213〉甘藍型油菜(Brassica卿us)〈220〉〈221〉gene.(1100)1620168017401800186019201948〈222〉(1)(29)〈223〉〈400>5aaggtttctttegagttccttttgttgtgtgtgtttggttgtettcgatttgaagctgtt60tcttgateatgttttgtgtgtgcagtgctc3g皿Ctgg3gatttgctgct皿gcagatgc120tteag朋gtetcctcaggatctcatcgttcactgtgagtccttttctctctccatgattg1803tgg3朋tgatctttgaaggcacactttegattcttegagcttcagttct240tgtttctctcagatctttecactctegatcttgtteccat300g卿tttgg3g卿atggtttgtgatgatttggaaccctttegacgg皿c360cattctecactgg3gttgatgttetgggtc3皿gattegc3g皿gaggte420tgacteggacctgcttttttt441〈223〉〈220〉〈221>gene〈222〉(1080)(1100)〈223〉〈220〉〈221>primer_bind〈222〉(1)(18)〈223〉〈400>6cacttcggtgaccttecaattcga朋tc朋gC3CC3C皿3ctecgatg皿gttcteatecatctecatcatctgatecacattgtetcaaggttetgcattccaaatectttcccccttctccttcacaatgaattgtettcggtctgctgctctetgtectegctegtc3C3gg3tC3Ctgaga皿tgtCg3C3g皿3Caggttg朋ctteggg郷atcatgcccaatatteag朋gcccteaatettcttgggg織皿tcttggaggctcaactttteg朋3gagcatggatetgtgactegc朋33ggg3tCCC3aattggatcctcteaacgtegcattetcttcagaatctcagagacteaggattttetttgtgacatteacgttccateatacttcctttg60agttgcttct120ttcacctggtcattgacttecttcaacagt180tggactctgt3皿ctgteaccaattctega240gcg皿tggtggtccacttcctea皿gtegt300atctttcttggatgtgtgct360tctttctctecatetcatgtatgtetcatg420aaacattgtcgteactgcct■agcccgtcatgtgacttgtt皿tecgagcg540cacatcatcateactteteg600ctcaaattgc660teatgatc^720g皿catteagatteagc皿c780ttggcattec840aagccccatgttctecatctcategtgctt■g皿gtcacggacctegttcc960cacagtecatgccactgacc皿tgtetgac1020gateg皿teaatctetcaagtgtctetteg10801100權利要求一種甘藍型油菜顯性核不育恢復系的SCAR分子標記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO5和SEQIDNO6所示。2.擴增甘藍型油菜顯性核不育恢復系SCAR分子標記的引物對，它的核苷酸序列如下所示引物對(l)YQ-Rfa:正向引物5'-AAGGTTTCTTTAGAGTTCC-3'，反向引物5'-AAAAAAAGCAGGTCCTAG-3';引物對(2)YQ-Rfb:正向引物5'-CACTTCGGTGACCTTACA-3'，反向引物5'-GTTAATGTCACAAATAAAATC-3'。3.—種甘藍型油菜顯性核不育恢復系的共顯性SCAR分子標記的製備方法，按照以下步驟(1)用引物YQ-Rfl、YQ-Rf2分別擴增甘藍型油菜顯性核不育材料純合兩型系GMS3種植後第一代分離的不育株4185A和甘藍型油菜顯性核恢復系4185B-2的基因組DNA，獲得4個DNA片段；回收測序，獲得如序列表SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3禾PSEQIDN0:4所示的核苷酸序列；(2)分析比較所述SEQIDNO:1禾PSEQIDNO:2與SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示核苷酸的差異，設計得到如權利要求2所示的引物對YQ-Rfa和YQ-Rfb;(3)用步驟(2)所述的引物對在甘藍型油菜顯性核不育不育系4185A及其恢復系4185B-2中進行PCR擴增，得到甘藍型油菜顯性核不育恢復系共顯性SCAR標記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。4.權利要求1所述的分子標記在甘藍型油菜顯性核不育恢復系輔助選擇中的應用。5.權利要求2所述的引物對在甘藍型油菜顯性核不育恢復系輔助選擇中的應用。全文摘要本發明屬於油菜分子育種
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，具體涉及一種甘藍型油菜顯性核不育恢復系的共顯性SCAR分子標記的製備，及其作為標記輔助選擇在選育甘藍型油菜顯性核不育恢復系中的應用。本發明利用引物對YQ-Rf1、YQ-Rf2擴增顯性核不育系甘藍型油菜材料純合兩型系GMS3種植後第一代分離的不育系4185A和甘藍型油菜顯性核不育恢復系4185B-2基因組DNA，分別得到4個擴增的DNA片段，然後對所述的DNA擴增片段進行克隆、測序、核苷酸序列比對，根據序列的差異設計引物對YQ-Rfa、YQ-Rfb，PCR擴增和選擇效果檢驗，進而獲得甘藍型油菜顯性核不育恢復系的共顯性SCAR分子標記，本發明為油菜分子育種提供了一種新標記。本發明還公開了製備所述分子標記的方法及應用。文檔編號C12N15/11GK101701263SQ200910272868公開日2010年5月5日申請日期2009年11月25日優先權日2009年11月25日發明者周永明,楊慶勇申請人:華中農業大學