用於治療中風的非神經毒性纖溶酶原激活因子的製作方法

2023-05-03 19:37:31

專利名稱：用於治療中風的非神經毒性纖溶酶原激活因子的製作方法
技術領域：
本發明與非神經毒性纖溶酶原激活劑的治療用途有關，特別是源自Desmodus rotundus唾液的非神經毒性纖溶酶原激活劑(DSPA)，優選治療中風。
將臨床症狀相關的不同臨床現象概括為術語「中風」。根據各自的發病機理，這些臨床現象可能會首先分化為所謂的缺血性和出血性損傷。
缺血性損傷(缺血)的特徵是，因動脈血供應匱乏而導致腦中血液循環的減弱或中斷。這常常是由因動脈硬化而變窄的血管的血栓形成，或動脈或心栓塞引起的。
出血性損傷主要以因動脈壓過高而損傷形成的腦供應動脈穿孔為基礎。然而，在所有腦損傷中僅有大約20％是由出血性損傷引起的。因此，由血栓形成引起的中風更為相關。
與其它組織缺血相比，神經組織缺血普遍伴隨著受影響細胞的壞死。神經組織中較高的壞死發生率可以用對「興奮性中毒」現象的新理解來解釋，該現象是一種包括眾多反應步驟的複雜級聯反應。該級聯反應由因缺氧而瞬間丟失ATP並去極化的缺血神經元引發。它導致突觸後釋放神經遞質穀氨酸的增加，該神經遞質激活調控陽離子通道的膜結合穀氨酸受體。然而，由於該穀氨酸釋放的增加使得穀氨酸受體被過度激活。
穀氨酸受體調控由穀氨酸與受體的結合而開啟的電壓依賴型陽離子通道。它導致Na+和Ca2+大量流入細胞從而幹擾Ca2+依賴型細胞代謝。Ca2+依賴型分解代謝酶的激活尤其可以解釋隨後的細胞死亡(Lee，Jin-Mo等，″The changing landscape of ischaemic brain injurymechanisms″；Dennis W.Zhol″Glutamate neurotoxicity and diseasesof the nervous system″)。
儘管穀氨酸介導的神經毒性機制還未被完全了解，但是人們都同意其在很大程度上促成了腦缺血後的神經細胞死亡(Jin-Mo Lee，等)。
除保護重要功能和穩定生理參數外，在急性腦缺血的治療中，重新疏通封閉的血管也具有極大的重要性。可以經不同的方法實現重新疏通。單純的機械重新疏通方法，例如心臟病發作後的PTCA，迄今為止仍未獲得令人滿意的效果。只有實現成功纖維蛋白溶解作用才能使病人的物理狀況得到令人滿意的改善。這可以通過導管的局部應用來實現(PROCAT，一項用尿激酶前體進行的研究)。然而，儘管已經獲得了陽性結果，該方法作為一種藥物治療方法還未獲得官方批准。
自然發生的纖維蛋白溶解作用是以絲氨酸蛋白酶纖溶酶的蛋白水解活性為基礎的，該酶由其失活前體經催化(激活)形成。體內天然存在的纖溶酶原激活劑u-PA(尿激酶型纖溶酶原激活劑)和t-PA(組織纖溶酶原激活劑)催化纖溶酶原的天然激活。與u-PA相反，t-PA與纖維蛋白和纖溶酶原一起形成一個所謂的激活劑複合體。因此，t-PA的催化活性是纖維蛋白依賴的，並且在其存在下增強約550倍。除纖維蛋白外，纖維蛋白原也能刺激由t-PA介導的纖溶酶原向纖溶酶轉變的催化作用——即使程度較低一些。在纖維蛋白原存在下，t-PA活性僅增強25倍。纖維蛋白的切割產物也(纖維蛋白降解產物(FDP))能刺激t-PA。
對急性中風進行血栓溶解治療的早期嘗試可以追溯至二十世紀五十年代。用鏈激酶，一種源自β溶血性鏈球菌的纖維蛋白溶解劑，進行的首次廣泛臨床試驗於1995年才開始。鏈激酶與纖溶酶原一起形成催化其它纖溶酶原分子轉變為纖溶酶的複合體。
由於鏈激酶是一種細菌蛋白酶從而能激發機體的變態反應，因此採用鏈激酶的療法存在嚴重缺陷。此外，由於之前包括抗體產生的鏈球菌感染使病人可能出現所謂的鏈激酶抗性從而使得該療法更難進行。除此之外，歐洲(Multicenter Acute Stroke Trial of Europe(MAST-E)，Multicenter Acute Stroke Trial of Italy(MAST-I))和澳大利亞(Australian Streptokinase Trial(AST))的臨床試驗表明，用鏈激酶治療病人後呈現上升的死亡率風險以及更高的腦內流血(腦內出血(intracerebral haemorrhage)ICH)風險。這些試驗不得不在早期就被終止。
作為選擇，也可以採用尿激酶——它也是一種經典的纖維蛋白溶解劑。與鏈激酶相反，由於它是一種天然存在於不同機體組織的酶，因此它不具有抗原特性。它是一種纖溶酶原激活劑，且不依賴於輔助因子。尿激酶由腎細胞培養物產生。
已經獲得用產生自重組倉鼠細胞的組織型纖溶酶原激活劑——所謂的rt-PA——(參見EP 0 093 619，US 4 766 075)進行的治療性血栓溶解的廣泛經驗。九十年代用t-PA在全世界範圍內完成了幾個臨床試驗——以急性心肌梗死為主要症狀——得到部分無法了解且矛盾的結果。在所謂的歐洲急性中風試驗中(ECASS)，在病人出現中風症狀後6小時內於靜脈內使用rt-PA進行治療。90天後檢查死亡率和Barthel指數作為病人的殘疾或獨立生活力指標。未報導生活力的顯著改善，但是報導了——儘管不顯著——死亡率的上升。因此可以推斷，對根據各自病史個別選擇出的病人在中風發作後立即用rt-PA進行的血栓溶解治療可能是有利的。然而，不推薦rt-PA在中風發作後6小時內的普遍使用，因為在這段時間內的應用會增加腦內出血(ICH)的危險(C.Lewandowski C和Wiliam Barsan，2001Treatment ofAcute Stroke；inAnnals of Emergency Medicine 372；S.202 ff.)。
中風的血栓溶解治療也是美國National Institute of NeurologicDisorder and Stroke進行的臨床試驗(所謂的NINDS rtPA中風試驗)課題。該試驗的重點集中在出現症狀後3小時內用rt-PA靜脈內治療的效果上。治療後三個月檢查病人。由於觀察到該治療對病人生活力的積極效果，因此推薦在三個小時的時間段內用rt-PA進行治療，儘管作者發現了更高的ICH風險。
兩項進一步的研究(ECASS II TrialAlteplase Thrombolysis forAcute Noninterventional Therapy in Ischaemic Stroke(ATLANTIS))調查了中風發作後三小時內用rt-PA治療的積極效果是否能在六小時內的治療中重現。然而，由於未曾觀察到臨床症狀的改善或死亡率的任何降低，這個問題並不能得到肯定回答。其仍具有更高的ICH風險。
那些部分矛盾的結果使得對rt-PA的使用需要高度謹慎。在1996年美國心臟協會(American Heart Association)的一份出版物中已經指出醫生們對血栓溶解治療中風的嚴重多疑癖；而對心肌梗死治療中的纖維蛋白溶解物卻沒有這樣的多疑癖(van Gijn J，MD，FRCP，1996-Circulation 1996，931616-1617)。
一份1997年出版的綜述首先給出了這一多疑癖背後的合理性(更新於2001年3月)。根據該綜述，當在中風發作後六小時內應用血栓溶解物時，所有的血栓溶解物治療(尿激酶、鏈激酶、rt-PA或重組尿激酶)都導致中風後第一個10天內顯著更高的死亡率，儘管死亡或殘廢病人的總數降低了。這一效果主要是由ICH導致的。因此並不推薦血栓溶解物在治療中風中的廣泛應用。
甚至之前，這樣的結果使得其它一些作者給出了純粹的諷刺言論中風病人必須選擇要麼死亡要麼殘廢地活著(SCRIP 19972265，26)。
不過迄今為止使用rt-PA的療法仍然是美國食品和藥物管理局(FDA)唯一批准的急性腦缺血的治療方法。然而，其被限制於在中風後三小時內使用rt-PA。
對rt-PA的批准是在1996年。之前在1995年，公開了關於t-PA消極副作用的第一份聲明，其中為在三小時之外將t-PA應用於中風治療時產生的劇烈效果提供了說明性依據。相應地，海馬小膠質細胞和神經細胞產生促進穀氨酸介導的興奮性中毒的t-PA。該結論是從一項關於t-PA缺陷型和野生型小鼠的研究推導得出的，其中將穀氨酸激動劑分別注射入它們的海馬。t-PA缺陷型小鼠對外源(inthrathecal)施用的穀氨酸表現出顯著更高的抗性(Tsirka SE等，Nature，Vol.377，1995，″Excitoxin-induced neuronal degeneration and seizure aremediated by tissue plasminogen activator″)。這些結果在1998年得到證實，當時Wang等證明當靜脈內注射t-PA時t-PA缺陷型小鼠中出現幾乎兩倍量的壞死神經組織。在野生型小鼠中外源t-PA的這一消極結果僅為約33％(Wang等，1998，Nature，″Tissue plasminogenactivator(t-PA)increases neuronal damage after focal cerebralischaemia in wild type and t-PA deficient mice″)。
2001年初Nicole等發表了對由t-PA引起的興奮性中毒的進一步研究結果(Nicole O.，Docagne F Ali C；Margaill I；Carmeliet P；MacKenzie ET，Vivien D和Buisson A，2001The proteolytic activityof tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediatedsignaling；inNat Med 7，59-64)。他們證明由去極化皮質神經元釋放的t-PA會與所謂的NMDA型穀氨酸受體的NR1亞單位相互作用從而導致NR1的裂解。它增強受體活性從而導致施用穀氨酸激動劑NMDA後出現更大的組織破壞。NMDA激動劑誘導興奮性中毒。因此，t-PA通過激活NMDA型穀氨酸受體表現出神經毒性。
根據進一步的說明性概念，t-PA的神經毒性由纖溶酶原向纖溶酶的轉變間接導致。根據該模型，纖溶酶是神經毒性的效應物(Chen ZL和Strickland S，1997Neuronal Death in the hippocampus ispromoted by plasmin-catalysed degradation of laminin.Cell91，917-925)。
附圖9給出了t-PA的時間依賴性神經毒性效應的總結。其中，與內源t-PA相比重組t-PA增強的毒性變得明顯。這可能是由於rt-PA能以更高的濃度進入組織。
儘管t-PA具有神經毒性副作用以及上升的死亡率效應，它仍然得到了FDA的批准。這是因為缺乏無害但卻有效的替代物——因此這得感謝非常實際的成本效益分析。所以，仍然需要安全的療法。然而，如果它們仍然以血栓溶解物為基礎——在不能找到血栓溶解作用的替代方式的情況下——那就要考慮神經毒性問題(參見如Wang等a.a.O.；Lewandowski和Barson 2001 a.a.O.)。
因此儘管幾乎所有血栓溶解物都是潛在適用的，也還是終止了為開發中風治療新藥物而進行的對包括DSPA(Desmodus rotundus)纖溶酶原激活劑)在內的已知血栓溶解物的進一步研究。尤其是就DSPA來說，較早期就已經指出了它對這一醫藥用途的潛在適用性(Medan P；Tatlisumak T；Takano K；Carano RAD；Hadley SJ；Fisher MThrombolysis with recombinant Desmodus saliva plasminogenactivator(rDSPA)in a rat embolic stroke model；inCerebrovascDis 19966；175-194(4th International Symposium on ThrombolicTherapy in Acute Ischaemic Stroke)。DSPA是一種與t-PA高度同源(相似)的纖溶酶原激活劑。因此——且加上由於t-PA的神經毒性副作用導致的希望破滅——對將DSPA作為中風治療的適宜藥物沒有更多的指望。
相反，近期旨在改進已知血栓溶解療法的策略試圖不再於靜脈內使用血栓溶解物質，而經導管於動脈內使用血栓溶解物質，從而直接接近血管內的血栓。首次試驗是用重組產生的尿激酶進行的。因此，可能可以降低血栓溶解作用的必需劑量以及隨之產生的消極副作用。然而，這一應用需要高的技術花費，而且並不是任何地方都可以進行的。此外，病人不得不經費時的過程進行準備。然而時間常常是有限的。因此，這一準備過程又導致了附加的危險。
目前，新的思想指向了抗凝血劑，例如肝素、阿司匹林或安克洛酶——馬來蝰蛇(malayan pit viper)毒液中的活性物質。然而兩個檢驗肝素效果的進一步臨床試驗(International Stroke Trial(IST)和Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment(TOAST))並未顯示出對死亡率的顯著改善或對中風的預防。
一種進一步的新療法的焦點既非集中於血栓也非稀釋血液或抗凝結作用，而是嘗試提高因中斷血液供應而受損的細胞的生命力(WO01/51613 A1和WO 01/51614 A1)。為達到該目的，使用了源自醌類、氨基糖苷類或氯黴素類的抗生素。基於相似原因，進一步建議從中風發作後立即應用胞磷膽鹼(citicholin)開始。胞磷膽鹼在體內被切割為胞苷和膽鹼。切割產物形成神經元細胞膜的一部分並因此支持受損組織的再生(US 5,827,832)。
近期對安全治療的研究以下面新發現為基礎的，即，中風的致命後果部分是僅僅由中斷的血液供應間接導致或由包括過度激活的穀氨酸受體在內的興奮性中毒或神經毒性直接導致的。t-PA加強這一效應(參見上述)。因此一種降低興奮性中毒的思想是應用所謂的神經保護劑(neuroprotectives)。它們可以個別使用或與纖維蛋白溶解劑一起使用以減小神經毒性效應。它們能夠或者作為例如穀氨酸受體拮抗劑直接地降低興奮性中毒、或者通過抑制電壓依賴型鈉或鈣離子通道間接地導致興奮性中毒降低(Jin-Mo Lee等a.a.O.)。
可以用例如2-氨基-5膦醯戊酸鹽(2-amino-5-phosphonovalerate，APV)或2-氨基-5-膦醯庚酸(2-amino-5-phosphonoheptanoate，APH)產生對NMDA型穀氨酸受體的競爭性抑制(拮抗作用)。可以用例如結合於通道苯環利定的物質來實現非競爭性抑制。這樣的物質可以是苯環利定、MK-801、右啡烷或cetamine。
迄今為止，採用神經保護劑的治療還未表現出所期望的成功，可能因為神經保護劑要表現它們的保護效應必須與血栓溶解劑結合。這適用於其它物質(同時參見附

圖10)。
甚至t-PA和神經保護試劑的組合也僅導致有限的損傷。儘管如此，也未避免此類纖維蛋白溶解試劑的神經毒性缺陷。
因此當前的發明的一個目的是為人類中風治療提供一種新的治療理念。
根據本發明，如權利要求1所概括，建議在中風治療中使用非毒性纖溶酶原激活因子。進一步的有利用途分別作為獨立權利要求以及進一步的從屬權利要求主題。
本發明的中心思想是纖溶酶原激活劑在中風治療中的用途，其成熟酶表現出選擇性由纖維蛋白增強許多倍的活性，即大於650倍。
根據本發明，纖溶酶原激活劑的用途以下列發現為基礎血腦屏障由於因中風導致的腦內組織損傷而受到損傷或破壞。因此，在腦中循環的纖維蛋白原能進入腦神經組織。它在此處激活導致——通過激活穀氨酸受體或纖溶酶原——進一步組織損傷的t-PA。為避免該效應，本發明建議使用呈高度纖維蛋白選擇性且——作為對討論的反駁——具有降低的被纖維蛋白原激活的潛力的纖溶酶原激活劑。因此，該纖溶酶原激活劑並非——至少與t-PA相比而言程度較低——由因血腦屏障受損而從血液進入神經組織的纖維蛋白原激活，因為t-PA的激活劑纖維蛋白由於其大小而不能進入神經組織。因此根據本發明的纖溶酶原激活劑是非神經毒性的。
根據本發明的一個優選實施方式，使用了非毒性纖溶酶原激活劑，其包括至少一種所謂的cymogene三聯體(cymogene triade)元件。一個類似的已知三聯體是來自胰凝乳蛋白酶家族的絲氨酸蛋白酶的催化中心，它由三個互作的胺基酸即天門冬氨酸194、組氨酸40和絲氨酸32組成。然而，該三聯體並不存在於與絲氨酸蛋白酶一樣同屬於胰凝乳蛋白酶家族的t-PA中。不過，已知向天然t-PA的適宜位點導入至少一個上述胺基酸的定向誘變導致在纖維蛋白存在下前體酶活性(單鏈t-PA)減弱和成熟酶活性(雙鏈t-PA)增強。因此，三聯體中至少一個胺基酸——或具有與三聯體中對應功能的胺基酸——的導入能增強t-PA的cymogenity(也就是成熟酶活性與前體酶活性的比率)。結果導致纖維蛋白特異性顯著提高。這是由所導入的胺基酸殘基和/或野生型序列胺基酸殘基之間的構象互作引起的。
已知t-PA中用His取代Phe 305(F305H)和用Ser取代Ala 292(A292S)的誘變使cymogenity增強20倍，而單純的F305H突變使cymogentity增強5倍(EL Madison，Kobe A，Gething M-J；SambrookJF，Goldsmith EJ 1993Converting Tissue Plasminogen Activator to aZymogenA regulatory Triad of Asp-His-Ser；Science262，419-421)。存在纖維蛋白時，這些t-PA突變活性分別增強30.000倍(F305H)和130.000倍(F305H，A292S)。另外，這些突變包括將Arg275置換為R275E以防止纖溶酶在切割位點Aug275-Ile276的切割，從而將單鏈t-PA轉變為雙鏈形式。單一的突變部位R275E使t-PA的纖維蛋白特異性增強6.900倍(K Tachias，Madison EL 1995Variants ofTissue-type Plasminogen Activator Which Display SubstantiallyEnhanced Stimulation by Fibrin，inJournal of Biological Chemistry270，3118319-18322)。
t-PA的位點305和292與胰凝乳蛋白酶中絲氨酸蛋白酶的已知三聯體的位點His40和Ser32同源。通過分別導入組氨酸或絲氨酸的相應取代，這些胺基酸能與t-PA的天門冬氨酸477互作從而在t-PA突變體中產生有功能的三聯體(Madison等，1993)。
根據本發明，由於這些t-PA突變體因增強的纖維蛋白特異性而不表現或——與野生型t-PA相比——表現顯著降低的神經毒性，因此可將它們用於治療中風。為公開已述及的t-PA單純F305H；F305H；A292S突變體或與R275E的組合突變，我們引入Madison等(1993)的出版物，以及將Tachias和Madison(1995)全文引作參考。
作為替代，纖溶酶原激活劑纖維蛋白特異性的增強可通過Asp194(或同源位點的天門冬氨酸)的點突變實現。纖溶酶原激活劑屬於胰凝乳蛋白酶家族中絲氨酸蛋白酶組，且因此它包含負責成熟蛋白酶的催化活性構象穩定性的保守胺基酸Asp194。已知在絲氨酸蛋白酶的cymogenic形式中Asp194與His40相互作用。Cymogene經切割激活後該特異性互作被打斷，Asp194側鏈旋轉約170°以與Ile16形成一個新鹽橋。該鹽橋本質上促進絲氨酸蛋白酶催化中心氧陰離子穴(oxyanione pocket)的穩定性。它也存在於t-PA中。
引入替換Asp194的點突變似乎分別阻礙絲氨酸蛋白酶催化構象的形成或穩定性。儘管這樣，該突變的纖溶酶原激活劑在它們的輔助因子纖維蛋白的存在下顯示出顯著增強的活性——特別是與成熟野生形式相比——這只能解釋為與纖維蛋白的互作允許促進催化活性的構象變化(L Strandberg，Madison EL，1995Variants of Tissue-typePlasminogen Activator with Substantially Enhanced Response andSelectivity towards Fibrin co-factors，inJournal of BiologicalChemistry 270，402344-2349)。
總之，纖溶酶原激活劑的Asp194突變體在纖維蛋白存在下其活性高度增強，因此根據本發明可對其進行利用。
在根據本發明的一個優選實施方式中，使用了t-PA突變體，該突變體中Asp194被穀氨酸(D194E)或天冬醯胺(D194N)取代。這些突變體中的t-PA活性在無纖維蛋白時減少1～2000倍，而當纖維蛋白存在時其活性增強可達到498.000～1.050.000倍。這些突變體可進一步包含Arg15至R15E的取代，它防止纖溶酶在肽鍵Arg15-Ile16處切割單鏈t-PA，從而導致形成雙鏈形式的t-PA。該單一突變將纖維蛋白對t-PA的激活增強12.000倍。為公開在位點194和15的t-PA突變，引入Strandberg和Madison(1995)全文作為參考。
也可以通過在所謂的「自溶環(autolysis loop)」中導入點突變來增強纖溶酶原激活劑對纖維蛋白的依賴性。該成分已知源於胰蛋白酶；在絲氨酸蛋白酶的同源部分中也能發現該成分，且其尤以三個疏水胺基酸(Leu、Pro和Phe)為特徵。纖溶酶原激活劑中的自溶環負責與纖溶酶原的相互作用。該區域中的點突變使纖溶酶原與纖溶酶原激活劑間不再有效形成蛋白質-蛋白質相互作用。這些突變僅在缺少纖維蛋白時是功能相關的。相反在存在纖維蛋白時，它們負責纖溶酶原激活劑活性的增強(K Song-Hua，Tachias K，Lamba D，Bode W，MadisonEL，1997Identification of a Hydrophobic exocite on Tissue TypePlasminogen Activator That Modulates Specificity for Plasminogen，inJournal of Biological Chemistry 272；3，1811-1816)。
在一個優選實施方式中，使用在位置420至423具有點突變的t-PA。若這些殘基經定向誘變取代，其使得t-PA的纖維蛋白依賴性增強高達61.000倍(K Song-Hua等)。Song-Hua等檢測了點突變L420A、L420E、S421G、S421E、P422A、P422G、P422E、F423A和F423E。為公開根據本發明的用途將這些出版物全文引入作為參考。
根據進一步的有利實施方式，使用具有根據SEQ ID NO.1(附圖13)所示胺基酸序列的改良組織纖溶酶原激活劑。該改良t-PA與野生型t-PA的區別在於，其自溶環中位點420至423的疏水胺基酸改變如下His420、Asp421、Ala422和Cys423。該t-PA優選在位點194具有一個苯丙氨酸。進一步，位點275可為穀氨酸。有利的是，位點194為苯丙氨酸。
進一步，根據本發明可以使用尿激酶。根據本發明，尿激酶可以具有根據SEQ ID NO.2(附圖14)所示的胺基酸序列，其中自溶環的疏水胺基酸被Val420、Thr421、Asp422和Ser423取代。有利的是，尿激酶帶有一個Ile275和一個Glu194。該突變體具有——與野生型尿激酶相比——增強500倍的纖維蛋白特異性。
兩種突變體——尿激酶與t-PA——都進行了半定量試驗分析，且與野生型t-PA相比都顯示增強的纖維蛋白特異性。
源自吸血蝙蝠(vampire bat)(Desmodus rotundus)唾液的纖溶酶原激活劑(DSPA)在纖維蛋白存在時也表現出高度增強的活性——特異增強100.000倍。因此，根據本發明優選可以使用它。術語DSPA包括四種不同的蛋白酶，它們完成吸血蝙蝠的主要功能，即獵物傷口流血時間的延長(Cartwright，1974)。這四種蛋白酶(DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ、DSPAγ)彼此間以及與人t-PA呈現高度的相似性(同源性)。它們也表現出相似的生理活性，因此同分類於術語DSPA下。DSPA公開於專利EP 0 352 119 A1和US 6 008 019和5 830 849中，因此為滿足公開將它們全文引入作為參考。
迄今為止DSPAα是該組中最徹底分析的蛋白酶。其胺基酸序列與已知的人t-PA胺基酸序列具有大於72％的同源性(Krtzschmar等人，1991)。然而，t-PA和DSPA間有兩個本質區別。首先，所有的DSPA作為單鏈分子時具有完全蛋白酶活性，因為——與t-PA相反——它不轉變為雙鏈形式(Gardell等，1989；Krtzschmar等，1991)。其次，DSPA的催化活性幾乎完全依賴於纖維蛋白(Gardell等，1989；Bringmann等，1995；Toschie等，1998)。例如，在纖維蛋白存在下，DSPAα1的活性增強100.000倍而t-PA的活性僅增強550倍。相反，纖維蛋白原對DSPA活性的誘導顯著較弱，因為其活性僅增強7～9倍(Bringmann等，1995)。總之，DSPA比僅被纖維蛋白激活550倍的野生型t-PA顯著更依賴於纖維蛋白且更為纖維蛋白特異性的。
由於其纖維蛋白溶解特性以及與t-PA極大相似，DSPA成為血栓溶解試劑開發中一種令人感興趣的候選物。儘管如此，DSPA作為血栓溶解物試劑的醫療用途過去被限制於對心肌梗死的治療，因為——由於t-PA對穀氨酸誘導的神經毒性的促進——人們不能合理預測與t-PA有關的纖溶酶原激活劑可被合理應用於急性中風的治療。
令人驚訝的是，即使DSPA顯示出與t-PA高度相似(同源)並且其分子的生理效應在很大程度上也類似，DSPA卻沒有神經毒性效應。上述結論導致產生這樣一種思想，DSPA也許可以在中風治療中成功用作血栓溶解試劑而不造成神經組織損傷的嚴重危險。特別有趣的是這樣一個事實，DSPA也可以在出現中風症狀3小時後使用。
由上述發現發展而來的本發明的進一步教導是以顯示DSPA的本質特徵(尤其是缺乏t-PA的神經毒性)的方式來改良和生產進一步的纖溶酶原激活劑。其基礎是研究獲得的結構與生化效應間的關係，這使得根據已知或新發現的神經毒性纖溶酶原激活劑將神經毒性纖溶酶原激活劑轉化為非神經毒性纖溶酶原激活劑從而生產非神經毒性纖溶酶原激活劑成為可能。
該新教導是以通過使用所謂的紅藻氨酸模型和NMDA誘導的紋狀體損傷檢測模型完成的對一側使用t-PA和另一側使用DSPA的神經變性效應的體內比較試驗為基礎的。
紅藻氨酸模型(也稱為紅藻氨酸損傷模型)以通過外部應用紅藻氨酸(KA)作為紅藻氨酸型(KA型)穀氨酸受體以及NMDA和AMPA穀氨酸受體的激動劑所產生的對神經毒性穀氨酸級聯反應的刺激為基礎。以t-PA缺陷型小鼠腦幹為試驗模型，可以顯示只有在補加外源t-PA後實驗動物對紅藻氨酸的敏感性才能達到野生型小鼠的水平。相反，相同實驗條件下輸入等摩爾濃度的DSPA不能恢復對紅藻氨酸(KA)的敏感性。得出結論，t-PA的神經毒性效應不是由DSPA誘導的。這些結果的總結於表2。
表2
*P＜0.0001基於該模型的定量研究顯示，甚至10倍的DSPA濃度增長也不能恢復t-PA缺陷型小鼠對KA處理的敏感性而降低10倍的t-PA濃度就已經導致KA誘導的組織損傷。由此得出結論，就KA處理後的神經變性刺激來說，DSPA具有比t-PA至少低100倍的神經毒性潛力(同時參見附圖11和12)。
在第二個神經變性模型中，用野生型小鼠比較了t-PA以及DSPA對NMDA依賴型神經變性刺激的可能效應。為此目的，向野生型小鼠單獨注射NMDA，或者與t-PA或DSPA組合注射NMDA(用作NMDA型穀氨酸受體的激動劑)。該模型可以在因血腦屏障被破壞而始終導致神經變性或血漿蛋白質流入的條件下比較這些蛋白酶的效果(Chen等，1999)。
用該模型工作時，NMDA注射導致小鼠紋狀體的可重複性損傷。t-PA和NMDA的聯合注射使損傷量增加至少50％。相反，與DSPAα1的共注射不會導致由NMDA引起的損傷的增強或延伸。甚至在能夠自由擴散於由NMDA引起的損傷區域的血漿蛋白質存在下，DSPA也不會導致神經變性的增強(同時參見表3)。
表3 **不顯著這些結果顯示，無纖維蛋白的DSPA——與t-PA相反——表現得類似哺乳動物以及人神經系統中的一種惰性蛋白酶——且因此不促進由KA或NMDA引起的神經毒性效應。儘管存在對類t-PA蛋白質在中風治療用途中的偏見，無神經毒性使DSPA成為一種適宜治療急性中風的血栓溶解物試劑。
首個臨床試驗結果也顯示這些結果也適用於人類中風治療。已經發現成功灌輸後病人可以得到顯著改善(改善8個點NIHSS或NIHSS值0到1)。表1列出這些數據。
表1
DSPA和其它非神經毒性纖溶酶原激活劑的神經毒性缺乏特性(參見上述)為中風治療提供了特別的優勢，這些纖溶酶原激活劑的使用——與野生型t-PA相反——並不受限於中風發作後最長為3小時的時間段。相反，治療可以遲些開始——例如6小時後或甚至更遲，因為幾乎不存在刺激興奮性中毒反應的危險。首次用DSPA進行的臨床試驗證明了中風發作後在甚至超過6至9小時的時間範圍對病人的安全治療。
用非神經毒性激活劑進行的這一無時間限制的治療特別重要，因為它第一次允許甚至在診斷被延誤或不能足夠肯定地確定中風發作時安全地治療呈急性中風症狀的病人。現有技術中，這組病人由於不利的風險評估而是被排除在採用纖溶酶原激活劑的血栓溶解療法之外的。因此，消除了血栓溶解試劑用於中風治療的禁忌。
DSPA和其它的非神經毒性纖溶酶原激活劑不表現組織損傷副作用。然而，為限制由天然存在於人體的穀氨酸誘導的組織損傷，將它們與神經保護試劑聯合應用於中風治療是有利的。可以使用競爭性或非競爭性抑制穀氨酸受體的神經保護試劑。有效的組合是使用例如已知的NMDA型、紅藻氨酸型或使君子酸型穀氨酸受體抑制劑，例如APV、APH、苯環利定、MK-801、右啡烷或cetamine。
進一步，與陽離子聯用是有利的，因為陽離子尤其是Zn離子會阻斷由穀氨酸受體調控的陽離子通道從而能夠降低神經毒性效應。
在進一步有利的實施方式中，非神經毒性纖溶酶原激活劑可以與至少一種進一步的治療性試劑或與藥學可接受載體聯用。尤其有利的是與通過活化細胞來支持組織損傷降低的治療性試劑的聯用，因為它促進已受損組織的再生或在防止進一步發生中風中起作用。有利的例子是與抗生素如醌類、抗凝血劑如肝素或水蛭素以及與胞磷膽鹼或乙醯水楊酸的組合。
與至少一種凝血酶抑制劑的聯用也是有利的。優選，也可以使用血栓調節蛋白和血栓調節蛋白類似物例如solulin、triabin或pallidipin。進一步與抗炎症物質的聯用是有利的，因為它們影響白細胞浸潤。
t-PA和DSPA的比較檢測方法如下1.動物野生型小鼠(c57/Black 6)和t-PA缺陷型小鼠(t-PA-/-mice)(c57/Black 6)(Carmeliet等，1994)由Dr.Peter Carmeliet，Leuven，Belgium提供。
2.腦組織蛋白質抽提t-PA或DSPAα1灌注後用酶譜分析進行腦組織中蛋白水解活性的評估(Granelli-Piperno和Reich，1974)。對海馬進行七天灌注後麻醉小鼠，然後用PBS經心臟灌流，取腦。切下海馬區域，轉入eppendorf管並培養於等體積(w/v)(約30-50μm)不含蛋白酶抑制劑的0.5％NP-40裂解緩衝液(0.5％NP-40，10mM Tris-HCl pH7.4，10mMNaCL，3mM MgCl2，1mM EDTA)中。用手動式玻璃勻漿機勻漿腦提取物並將其置於冰上30分鐘。隨後離心樣品，取得上清。檢測存在的蛋白質含量(Bio-Rad-reagent)。
3.蛋白酶的酶譜分析根據Granelli，Piperno和Reich(1974)的方法用酶譜分析檢測樣品和腦組織提取物中的蛋白水解活性。在非還原條件下對含重組蛋白質(至多100nM)的樣品或腦組織提取物(20μg)進行(10％)SDS-PAGE。將膠從盤中取出，在1％triton×100中洗滌2小時，之後覆蓋在一塊含有聚合纖維蛋白原和纖溶酶原的瓊脂糖凝膠上(Granelli，Piperno和Reich，1974)。於37C下將膠在溼潤容器中溫育直到出現蛋白水解條帶。
4.t-PA、DSPA向海馬內的灌注及隨後的紅藻氨酸注射紅藻氨酸損傷模型是以Tsirka等的研究(1995)為基礎的。向動物腹腔內(i.p.)注射阿託品(4mg/kg)，之後通過腹腔注射戊巴比妥鈉(70mg/kg)麻醉。然後將小鼠置於腦立體定位框架(stereotaxicframe)中，並將一個含有100μl PBS或重組人t-PA(0.12mg/ml，1.85μM)或DSPAα1(1.85μM)的微滲泵(Alzet型號1007D，AlzetCA.USA)皮下植入肩胛骨間。為了在中線附近導入液體，將泵經無菌管與腦插管連接，並從穿越顱骨且坐標為前囪-2.5mm、midiolateral0.5mm和背腹側1.6mm的銼孔插入。將插管固定在合適的位置，且使泵能以每小時0.5μl的速率灌注相應溶液共7天。
灌注蛋白酶兩天後，再次麻醉小鼠並再將其置於腦立體定位框架中。然後，向海馬單側注射溶於0.3μl PBS中的1.5nmol紅藻氨酸(KA)。坐標為前囪-2.5mm、內側1.7mm和背腹側1.6mm。將excitotoxin(KA)持續30秒注入。紅藻氨酸處理後，為防止液體倒流將注射針頭在這些坐標再保持2分鐘。
5.腦處理程序KA注射5天後，麻醉動物並用30ml PBS經心臟灌流，接著用70ml 4％的多聚甲醛液經心臟灌流，用相同的固定劑固定，隨後在30％的蔗糖中進一步浸泡24小時。之後在冷凍切片機上切制冠狀腦片(40μm)，然後或者用硫堇(BDH，Australia)復染或者如下述進行免疫組織化學檢測處理。
6.海馬內神經元丟失的定量根據前人所述(Tsirka等，1995；Tsirka等，1996)完成對海馬CA1-CA3子域神經元丟失的定量。從所有處理組製備背側海馬的五個連續部分，注意確保它們帶有CA注射和損傷區域。根據海馬的照相掃描作圖(camera lucida drawings)對這些切片的海馬子域(CA1-CA3)進行作圖。與相同放大倍數下作圖的1mm標準進行比較以測定出子域全長。測定了含有有活力錐體神經元(呈正常形態)的組織長度和無神經元(不含細胞，無硫堇染色)的組織長度。對這些代表各海馬子域完整神經元和神經元丟失的長度取腦片平均值，並計算標準差。
7.用或不用t-PA或DSPA產生的紋狀體內NMDA興奮性中毒損傷麻醉野生型小鼠(c57/Black 6)並將其置於腦立體定位框架內(參見上述)。單獨或與46μM rt-PA或46μM DSPAα1聯合用50nmolNMDA單側注射小鼠左側紋狀體。同時單獨注射t-PA和DSPA作為對照(濃度均為46μM)。注射坐標為前囪-0.4mm、midiolateral 2.0mm和背腹側2.5mm。以0.2μl/分鐘的速率轉移溶液(對於全部處理組總體積均為1μl)5分鐘並在注射後將針頭在原位再保留2分鐘以使液體回流降到最少。24小時後麻醉小鼠，用30ml PBS經心臟灌注，接著用70ml 4％多聚甲醛液經心臟灌注，用相同的固定劑固定24小時，之後在30％的蔗糖中進一步浸泡24小時。然後在冷凍切片機上切制腦片(40μm)，並置於明膠包被的玻片上。
8.對注射NMDA後損傷體積的定量用Callaway等(2000)描述的方法完成對紋狀體損傷體積的定量。製備跨越損傷區域的連續冠狀切片。根據Callaway的方法使損傷區域可視化，並通過使用一臺微電腦成像裝置來定量損傷體積(MCID，Imaging Research Inc.，Brock University，Ontario，Canada)。
9.免疫組織化學根據標準方法完成免疫組織化學。將冠狀切片在3％H2O2和10％甲醇中浸泡5分鐘，之後在5％正常山羊血清中浸泡60分鐘。將切片與抗-GFAP抗體(1∶1.000；Dako，Carpinteria，CA，USA)孵育過夜以檢測星形膠質細胞、或與抗-MAC-1抗體(1∶1.000；Serotec，Raleigh，NC，USA)孵育過夜以檢測小膠質細胞或與抗-DSPA多克隆抗體(Schering AG，Berlin)孵育過夜。漂洗後，將切片與適當的生物素化第二抗體(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)一起孵育。接著在用3，3′-Diaminebebcidine/0.03％H2O2可視化之前用抗生物素蛋白/生物素-複合體(Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)最後孵育60分鐘。然後將切片置於明膠包被的玻片上、乾燥、脫水以及封上蓋玻片。
B.結果1.灌注的t-PA或DSPA擴散進入t-PA-/-小鼠的海馬，並保持蛋白水解活性最初的試驗是為證實DSPA和t-PA在7天灌注期間都保持它們的蛋白水解活性而設計的。為該目的，將等分量的t-PA和DSPA(100nmol)在37℃和30℃水浴中孵育7天。為檢測蛋白水解活性，在非還原條件下將探針的5倍連續稀釋液進行SPS-PAGE，用酶譜分析來評估蛋白水解活性。用一份冷凍保存7天的等分量t-PA和DSPA作對照。正如可從附圖1看到的，在30℃或37℃下孵育這一段時間僅造成較小的DSPA或t-PA活性喪失。
2.t-PA和DSPA活性在灌注後從t-PA-/-小鼠製備的海馬提取物中被恢復首先不得不證實所灌注的蛋白酶出現在被灌注動物腦中，且儘管處在該區室中也仍然保持它們的蛋白水解活性。為證實這一點用t-PA或DSPA灌注t-PA-/-小鼠7天(參見上述)。然後用PBS經心臟灌注小鼠，並切除腦。分離海馬同側和對側區以及小腦區(用作陰性對照)。將組織樣品(20μg)進行SDS-PAGE，以及根據方法部分的說明作酶譜分析。正如可從附圖2看到的，t-PA和DSPA活性在海馬同側區都被檢測到了，但在對側區也檢測到了一些活性。這表明，所灌注的蛋白酶不僅在腦中保持了它們的活性，而且還擴散進了海馬區。作為對照，從小腦製備的提取物中沒有檢測到活性。
3.DSPA的免疫組織化學評價為進一步證實DSPA確實已經擴散進入了海馬區，灌注DSPA後對t-PA-/-小鼠的冠狀腦片進行免疫組織化學分析。在海馬區檢測到了DSPA-抗原，其中灌注區域的染色最深。結果證實所灌注的DSPA是可溶的並確實出現在海馬中。
4.DSPA灌注不能體內恢復由紅藻氨酸介導的神經變性。
t-PA-/-小鼠特徵性表現對紅藻氨酸(KA)介導的神經變性的抗性。然而，rt-PA在海馬內的灌注完全恢復對KA-介導的損傷的敏感性。為判定該模型中DSPA是否可以替代t-PA，用微滲泵將t-PA或DSPA灌注至t-PA-/-小鼠海馬內。兩組都測試了12隻小鼠。2天後給動物注射紅藻氨酸，然後讓它們恢復。5天後殺死動物，取腦並處理(參見上述)。作為對照，用KA處理前對t-PA-/-小鼠進行了PBS灌注(N＝3)。
製備冠狀腦切片，並用Nissl染色法檢測神經元。如附圖4所示，用PBS灌注的t-PA-/-小鼠對之後的KA刺激有抗性。然而，灌注重組t-PA恢復了對KA處理的敏感性。相反，海馬區中灌注相同濃度的DSPA不改變動物對KA的敏感性。
那些結果的定量是以獲自各組12隻小鼠的數據為基礎的。在DSPA灌注的12隻小鼠中有兩隻觀察到了輕微的神經變性擴展。其原因尚不清楚，可能與DSPA的存在無關。綜合數據已考慮了這兩隻動物中觀察到的這一輕微效應。用t-PA處理的所有12隻小鼠都對KA處理敏感。這些結果顯示，當灌注等摩爾濃度的t-PA或DSPAα1時，只有t-PA給藥導致對KA誘導的神經變性的敏感性的恢復。
5.DSPA灌注不導致小膠質細胞激活由t-PA灌注產生的t-PA-/-小鼠KA敏感性的修復也導致小膠質細胞激活(Rogove等，1999)。為評估在t-PA或DSPA灌注及隨後的KA處理後小膠質細胞激活的程度，用Mac-1抗體對小鼠冠狀切片進行免疫組織化學染色以確定激活的小膠質細胞。t-PA灌注後對KA敏感性的修復導致Mac-1陽性細胞的明顯增多。在用DSPA灌注的小鼠中未觀察到該現象。因此，KA處理後DSPA的存在不導致小膠質細胞的激活。
6.小鼠海馬區的DSPA和t-PA滴定。
用於灌注的t-PA濃度是以Tsirka等(1995)所述濃度為基礎的(100μl 0.12 mg/ml[1.85μM])。用低10倍量的t-PA(0.185μM)和高10倍量的DSPA(18.5μM)重複KA損傷試驗。較低的t-PA濃度仍然能夠恢復對KA處理的敏感性(n＝3)。這一發現尤其值得注意，即KA處理後灌注濃度提高10倍的DSPA僅導致少量神經元的丟失。這些數據有力地表明，DSPA不導致對KA敏感性的增強。
7.t-PA和DSPA對野生型小鼠中NMDA-依賴型神經變性的效應還檢測了t-PA和DSPA在野生型小鼠神經變性模型中的效應。向這些小鼠紋狀體中注射t-PA確定地導致由穀氨酸類似物NMDA引起的神經變性效應的增強(Nicole等，2001)。
在t-PA或DSPA(各46μM)存在下向野生型小鼠紋狀體區注射總體積為1μl的NMDA。24小時後取腦，並根據Callaway的方法(Callaway等，2000)對損傷大小進行定量(參見上述)。正如可從附圖7看到的，單獨注射NMDA在所有處理小鼠(N＝4)中產生可重複性損傷。當聯合使用t-PA和NMDA時，損傷大小提高大約50％(P＜0.01，n＝4)。明顯相反的是，NMDA和相同濃度的DSPA的共同注射與單獨注射NMDA相比不導致損傷大小的增加。
單獨注射t-PA或DSPA不導致可檢測的神經變性。單獨給藥時t-PA缺乏效應與Nicole等(2001)的結果一致。這些數據顯示，DSPA的存在甚至在神經變性事件過程中也不增強神經變性。
為證實DSPA注射確實已經擴散進入了海馬區，用DSPA抗體對冠狀切片進行了免疫組織化學分析。檢測表明，DSPA確實進入了紋狀體區。
用間接色原測試進行的纖溶酶原激活的動力學分析根據Madisan E.L.，Goldsmith E.J.，Gerard R.D.，Gething M.-J.，Sambrook J.E.(1989)Nature 339 721-724；Madison E.LO.，Goldsmith E.J.，Gething M.J.，Sambrook J.F.和Bassel-Duby R.S.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci U.SA 87，3530-3533以及MadisonE.L.，Goldsmith E.J.，Gething M.J.，Sambrook J.F.和Gerard R.D.(1990)J.Biol.Chem 265，21423-21426用底物Lys-纖溶酶原(American Diagnostica)和spectrocyme PL(American Diagnostica)完成了對t-PA活性的間接色原測試。在有或無輔助因子DESAFIB(American Diagnostica)存在下都進行了測試。DESAFIB是一種通過用蛋白酶蛇毒凝血酶(batroxobin)對高純度人纖維蛋白原進行切割獲得的可溶性纖維蛋白單體製劑。蛇毒凝血酶切割在纖維蛋白原Aα-鏈中的Arg16-Gly17結合位點從而釋放纖維蛋白原肽鏈A。無肽Gly-Pro-Arg-Pro存在時，所產生的代表纖維蛋白I單體的des-AA-纖維蛋白原是可溶的。Lys-纖溶酶原的濃度變化範圍在DESAFIB存在時為0.0125～0.2μM以及在無輔助因子存在時為0.9～16μM。
不同刺激物存在下的間接色原測試。
根據上述引用的出版物完成標準間接色原測試。使用了含有0.25～1ng酶、0.2μM Lys-纖溶酶原和0.62mM spectrocyme PL且總體積為100μl的探針。測試在存在緩衝液、25μg/ml DESAFIB、100μg/ml纖維蛋白原溴化氰片段(American Diagnostica)或100μg/ml刺激性13胺基酸肽P368下完成的。在微量滴定板中進行分析，並持續1小時在「Molecular Devices Thermomax」中于波長405nm處每30秒檢測一次光學密度。反應溫度為37℃。
權利要求
1.纖溶酶原激活因子用於中風治療的用途，其中纖溶酶原激活因子的活性在纖維蛋白存在下增強超過650倍。
2.根據權利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子至少含有組氨酸或絲氨酸殘基，所述組氨酸或絲氨酸殘基與天冬氨酸殘基一起形成cymogene三聯體的至少一部分。
3.根據權利要求2的纖溶酶原激活因子的用途，其中絲氨酸殘基位於與t-PA的位置292至少部分同源的位點、組氨酸殘基位於與t-PA的位置305至少部分同源的位點和天冬氨酸殘基位於與t-PA的位置447至少部分同源的位點。
4.根據權利要求3的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子選自以下t-PA突變體組t-PA/R275E；t-PA/R275E，F305H；t-PA/R275E，F305H，A292S。
5.根據權利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子帶有Asp194上的點突變或在同源位置上的天冬氨酸的點突變，致使在纖維蛋白不存在下纖溶酶原激活因子催化活性構象穩定性降低。
6.根據權利要求5的用途，其中Asp194被穀氨酸或天冬醯胺取代。
7.根據權利要求6的用途，其中t-PA中Asp194被Glu194或Asn194所取代。
8.根據權利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子在自溶環中含有至少一個突變，該突變導致在不存在纖維蛋白的情況下纖溶酶原與纖溶酶原激活因子間的功能性相互作用降低。
9.根據權利要求8的用途，其中在自溶環中的至少一個突變影響野生型t-PA的胺基酸位置420至423或同源位置。
10.根據權利要求9的用途，其中突變選自由以下突變組成的組I420A、I420E、S421G、S421E、P422A、P422G、P422E、F423A和F423E。
11.根據權利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子是含有至少一個防止纖溶酶催化的點突變的cymogene。
12.根據權利要求11的纖溶酶原激活因子的用途，其中點突變位於t-PA的位置15或275或在與之同源的位置上。
13.根據權利要求12的用途，其中穀氨酸在位置15或275處。
14.根據權利要求1的纖溶酶原激活因子的用途，其中纖溶酶原激活因子分離自吸血蝙蝠唾液(DSPA)。
15.根據上述權利要求中至少一項的纖溶酶原激活因子的用途，用於中風發作後至少3小時治療人類中風。
16.根據上述權利要求中至少一項的纖溶酶原激活因子的用途，用於中風發作後至少6小時治療人類中風。
17.根據上述權利要求中至少一項的纖溶酶原激活因子的用途，用於中風發作後至少9小時治療人類中風。
18.根據上述權利要求中至少一項的纖溶酶原激活因子的用途，用於治療中風發作暫時未確診的中風病人。
19.根據上述權利要求中至少一項的纖溶酶原激活因子的用途，其在避免野生型t-PA神經毒性的情況下用於中風治療。
20.具有含有His420、Asn421、Ala422和Cys423的自溶環的組織纖溶酶原激活因子。
21.根據權利要求20的組織纖溶酶原激活因子，其特徵在於具有位置194的點突變，該點突變導致在不存在纖維蛋白的情況下纖溶酶原激活因子催化活性構象穩定性的降低。
22.根據權利要求21的組織纖溶酶原激活因子，其特徵在於Phe194。
23.根據權利要求20至22中至少一項的組織纖溶酶原激活因子，其特徵在於具有防止纖溶酶催化的至少一個點突變。
24.根據權利要求23的組織纖溶酶原激活因子，其特徵在於Glu275。
25.具有根據Seq ID No 1所示胺基酸序列的組織纖溶酶原激活因子。
26.具有含有Val420、Thr421、Asp422和Ser423的自溶環的尿激酶。
27.根據權利要求26的尿激酶，其特徵在於具有位置194的點突變，該點突變導致在不存在纖維蛋白的情況下尿激酶的催化活性構象的穩定性降低。
28.根據權利要求27的尿激酶，其特徵在於Glu194。
29.根據權利要求26至28中至少一項的尿激酶，其特徵在於具有防止纖溶酶催化的至少一個點突變。
30.根據權利要求29的尿激酶，其特徵在於Ile275。
31.具有根據Seq ID No 2所示胺基酸序列的尿激酶。
32.含有根據上述權利要求中至少一項的纖溶酶原激活因子以及至少一種額外藥學活性成分或其藥學可接受鹽的藥物組合物。
33.根據權利要求32的藥物組合物，其特徵在於含有神經保護試劑。
34.根據權利要求33的藥物組合物，其特徵在於含有穀氨酸受體拮抗劑。
35.根據權利要求34的藥物組合物，其特徵在於含有競爭性或非競爭性拮抗劑。
36.根據權利要求33的藥物組合物，其特徵在於含有至少一種凝血酶抑制劑，優選選自下列血栓調節蛋白、血栓調節蛋白類似物、triabin、pallidipin或solulin。
37.根據權利要求33的藥物組合物，其特徵在於含有至少一種抗凝血試劑，優選選自下列抗凝血試劑水蛭素、肝素、乙醯水楊酸或ancrod。
38.根據權利要求33的藥物組合物，其特徵在於含有抗炎症物質。
39.根據權利要求33的藥物組合物，其特徵在於含有抗生素試劑。
40.根據權利要求33的藥物組合物，其特徵在於含有胞磷膽鹼。
41.根據權利要求36至45中至少一項的藥物組合物應用於根據權利要求1至19中至少一項的用途。
42.生產用於中風治療的含有一種非神經毒性纖溶酶原激活因子的藥物的方法，包括以下改良纖溶酶原激活因子的步驟中的至少一步——導入cymogenic三聯體的至少一部分；——Asp194或同源天冬氨酸的取代以降低在不存在纖維蛋白的情況下催化活性構象的穩定性；——自溶環或與之同源的肽段中的疏水胺基酸殘基的取代；——向cymogene中導入突變以防止纖溶酶對cymogene的催化。
43.根據權利要求42生產的藥物。
全文摘要
本發明涉及非神經毒性纖溶酶原激活因子的生產及其在治療人類中風中的用途，例如源自常見的Desmodus rotundus的非神經毒性纖溶酶原激活因子(DSPA)。本發明也提供了治療人類中風的新的治療基礎。
文檔編號A61P7/02GK1592634SQ02823478
公開日2005年3月9日 申請日期2002年10月31日 優先權日2001年11月2日
發明者M·索恩根, W·索恩根, W-D·施洛伊寧, R·邁德卡夫 申請人:帕昂有限公司