核酸構建體的製作方法

2023-05-04 04:02:46 2

專利名稱：核酸構建體的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和免疫學領域，一般還涉及用於核酸免疫接種的試劑。更具體地，本發明涉及表達抗原多肽的核酸構建體，還涉及使用這類試劑進行核酸免疫接種的方法。
背景技術：
基因治療和核酸免疫接種在治療和預防獲得性和遺傳性疾病上是頗有發展前景的方法。這類技術能將所需核酸轉移到受試者內，並隨後在體內表達。轉移可通過離體轉染來自受試者的細胞或組織，並將轉化物質再導入宿主中完成。或者，可將核酸直接給藥到受試者體內。
這類技術中的每種技術均要求核酸在轉染細胞中高效表達，以提供足量的治療基因產物或抗原基因產物。已知幾種因子影響到表達水平，包括轉染率，以及所研究基因或序列轉錄和mRNA翻譯的效率。
本領域已描述多種表達系統，每種表達系統一般都由含所研究基因或核苷酸序列的載體組成，該基因或核苷酸序列與表達調控序列有效連接。這類調控序列包括轉錄啟動子序列和轉錄起始和終止序列。一般用於哺乳動物細胞表達系統的啟動子包括SV40早期啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子，如CMV立即早期啟動子(Chapman et al(1991)Nucl.Acids Res.193979-3986)、小鼠乳腺癌病毒長末端重複(LTR)啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)以及單純皰疹病毒(HSV)啟動子等。通常也使用非病毒啟動子，如來源於鼠金屬硫蛋白基因的啟動子。
表達系統通常包括轉錄調製元件，即指「增強子」。增強子被廣義定義為順式作用序列(cis-acting agent)，它在同啟動子/基因序列有效連接時，將會提高該基因序列的轉錄。增強子離所研究序列的有效作用距離比其他表達調控元件(如啟動子)要遠很多，並且可位於所研究序列的任何方向(Banerji et al.(1981)Cell27299-308，deVilleirs etal.(1981)Nucl.Acids Res.96251-6264)。增強子已從多種病毒源中被識別出來，包括多形瘤病毒(polyoma virus)、BK病毒(BK virus)、巨細胞病毒(cytomegalovirus virus，CMV)、腺病毒(adenovirus)、猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)、莫洛尼肉瘤病毒(Moloney sarcomavirus)、牛乳頭狀瘤病毒(bovine papilloma virus)和勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(deVilleirs et al同上，Rosenthal et al.(1983)Science222749-755，Hearing et al.(1983)Cell33695-703，Weeks et al.(1983)Mol.Cell.Biol.31222-1234，Levinson et al.(1982)Nature295568-572，和Luciw et al.(1983)Cell33705-716)。
許多用於核酸免疫接種和基因治療的表達系統均使用hCMV立即早期啟動子。見如授權予Stinski的美國專利No.5168062和5385839，和歐洲專利說明書0323997B1。使用hCMV立即早期啟動子的表達載體包括，例如pWRG7128(Roy et al，Vaccine19，764-778，2001)和pBC12/CMV和pJW4303(在WO95/20660中提及)。Chapman et al(1991)已報導不含hCMV內含子A時，hCMV立即早期啟動子表達量降低。

發明內容
使用可控(manipulated)病毒啟動子/表達序列已開發出一種核酸構建體，它使宿主細胞中的異源編碼序列表達得以提高。該構建體適合抗原編碼基因的高效表達，因此能使用於核酸免疫接種中。特別地，該構建體能提供到載體顆粒上，用於顆粒介導的核酸免疫接種。
因此，本發明提供一種核酸構建體，它包含嵌合啟動子序列和插入與嵌合啟動子有效連接的編碼序列的克隆位點，其中，該嵌合啟動子序列包括(a)hCMV立即早期啟動子序列；(b)hCMV主要立即早期基因的外顯子1和至少一部分外顯子2；和(c)置換hCMV主要立即早期基因的內含子A區的異源內含子。
本發明還提供—一種核酸構建體，其包括
(i)嵌合啟動子序列，其包括(a)hCMV立即早期啟動子序列；(b)hCMV主要立即早期基因的外顯子1和至少一部分外顯子2；和(c)置換hCMV主要立即早期基因的內含子A區的異源內含子；和(ii)插入與嵌合啟動子有效連接的編碼序列的克隆位點；和(iii)(a)非翻譯前導序列，其來源於HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，並與嵌合啟動子有效連接；和/或(b)增強子序列，其來源於HBsAg序列的3′非翻譯區(UTR)，或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，並與嵌合啟動子有效連接，其中，增強子序列位於克隆位點下遊；—一種核酸構建體，其包括(i)啟動子序列；(ii)非翻譯前導序列，其來源於HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列；和(iii)有效連接於(i)和(ii)的編碼序列其中，編碼序列對非翻譯前導序列是異源的；—一種核酸構建體，其包括(i)啟動子序列；(ii)編碼序列，其與啟動子序列(i)有效連接；和(iii)增強子序列，位於編碼序列(ii)的3′端，並與之有效連接；其中，增強子序列(iii)來源於HBsAg序列的3′UTR或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，並且編碼序列(ii)對3′端增強子序列是異源的；—一種在哺乳動物細胞中表達所研究多肽的方法，該方法包括將本發明的核酸構建體轉移到所述細胞中，該構建體包括編碼所述多肽的編碼序列；—適合於由顆粒介導的釋放裝置釋放的包被顆粒，該包被顆粒包括由本發明的核酸構建體包被的載體顆粒，該構建體包括編碼所述多肽的編碼序列；—用於顆粒介導的釋放裝置的劑量容器，包含包被顆粒；—一種負載包被顆粒的顆粒介導的釋放裝置；—一種核酸免疫接種的方法，包括給予受試者有效劑量的包被顆粒，在顆粒中編碼序列編碼抗原；—一種經純化、分離的嵌合啟動子序列，其包括(a)hCMV立即早期啟動子序列；(b)hCMV主要立即早期基因的外顯子1和至少一部分外顯子2；和(c)置換hCMV主要立即早期基因的內含子A區的異源內含子。
由於在此公開，本發明上述和其他主題、方面、實施方案和優點易於呈現給本領域普通技術人員。


圖1示出使用多種質粒表達載體獲得的B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的表達水平。
圖2示出加入內含子對SCC15細胞中HBsAg和B16細胞中β-gal表達的影響(三次實驗的平均值)。
圖3示出大鼠胰島素內含子A和HBV3′UTR對SCC15細胞中β-gal表達的影響(三次實驗的平均值)。
圖4示出大鼠胰島素內含子A和HBV3′UTR對SCC15細胞中HSVgD表達的影響(三次實驗的平均值)。
圖5示出大鼠胰島素內含子A和HBV3′UTR對SCC15和B16細胞中SEAP表達的影響(每個細胞系重複三次)。
圖6示出異源信號肽指導B16細胞中SEAP或hFc片段分泌的能力。
圖7示出使用包含於多種質粒表達載體的抗原編碼核酸免疫接種的小鼠血清中檢測到的抗體水平。
圖8是pJV表達載體的示意圖。
圖9是pJV7389的示意圖。
圖10是pJV7400的示意圖。
圖11是pJV7468的示意圖。
圖12是pJV7563的示意圖。
圖13列出pJV7563的鹼基組成。
序列說明SEQ ID NO1是hCMV立即早期啟動子序列(GenBank#M60321，X17403)。
SEQ ID NO2是hCMV主要立即早期基因的外顯子1和2的序列(GenBank#M60321，X17403)。
SEQ ID NO3是大鼠胰島素內含子A的序列(GenBank#J00748)。
SEQ ID NO4是本發明的嵌合啟動子的序列。
SEQ ID NO5是HBV preS2抗原5′UTR序列的前導序列(GenBank#M54923)。
SEQ ID NO6是HSV型2gD 5′UTR序列的前導序列(GenBank#Z86099)。
SEQ ID NO7是HBV e抗原5′UTR序列的前導序列(GenBank#M54923)。
SEQ ID NO8是HBVenh 3′UTR的序列(GenBank#AF143308)。
SEQ ID NO9是猿立即早期基因3′UTR的序列(GenBank#M16019)。
SEQ ID NO10是兔β-珠蛋白的聚腺苷酸序列(GenBank#K03256)。
SEQ ID NO11是猿sCMV立即早期基因的聚腺苷酸序列(GenBank#M16019)。
SEQ ID NO12是HSV2 gB基因的聚腺苷酸序列(GenBank#Z86099)。
SEQ ID NO13是HPV16早期基因的聚腺苷酸序列(GenBank#K02718)。
SEQ ID NO14是pJV表達載體的序列SEQ ID NO15是PCR引物JF93SEQ ID NO16是PCR引物F110SEQ ID NO17是PCR引物GW1
SEQ ID NO18是PCR引物JF254SEQ ID NO19是PCR引物GW150SEQ ID NO20是PCR引物JF255SEQ ID NO21是PCR引物DS1SEQ ID NO22是PCR引物DA1SEQ ID NO23是PCR引物JF301SEQ ID NO24是PCR引物JF302SEQ ID NO25是PCR引物JF84SEQ ID NO26是PCR引物JF225SEQ ID NO27是PCR引物JF335SEQ ID NO28是PCR引物JF336SEQ ID NO29是PCR引物JF357SEQ ID NO30是PCR引物JF365SEQ ID NO31是PCR引物JF393SEQ ID NO32是PCR引物JF406SEQ ID NO33是PCR引物JF256SEQ ID NO34是PCR引物JF257SEQ ID NO35是PCR引物JF320SEQ ID NO36是PCR引物JF321SEQ ID NO37是PCR引物JF386EQ ID NO38是PCR引物FcASSEQ ID NO39是寡核苷酸JF354SEQ ID NO40是PCR引物JF355SEQ ID NO41是PCR引物JF356SEQ ID NO42是寡核苷酸JF348SEQ ID NO43是PCR引物JF349SEQ ID NO44是PCR引物JF350SEQ ID NO45是寡核苷酸JF351SEQ ID NO46是PCR引物JF352SEQ ID NO47是PCR引物JF353SEQ ID NO48是PCR引物JF430SEQ ID NO49是PCR引物JF442
SEQ ID NO50是PCR引物JF421SEQ ID NO51是PCR引物JF444SEQ ID NO52是偽狂犬病病毒(PRV)啟動子序列SEQ ID NO53是勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子序列發明內容在詳細描述本發明前，應該理解的是本發明並不限定於特別示例的分子或者方法參數，因其毫無疑問地可有多種變化形式。同樣應該理解的是本文所用術語只是出於描述本發明具體實施方案的目的，而非意在限制。另外，若無另外指出，本發明的實施將採用病毒學、微生物學、分子生物學、重組DNA技術和免疫學中的常規方法，所有這些方法為本領域普通技術人員所熟知。這些技術在文獻中有完整的描述，見如Sambrook等人編著的《分子克隆實驗室手冊》(第二版，1989)(Sambrook，et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd Edition，1989))，《DNA克隆一種實驗方法》第I卷和II卷(DNACloningA Practical Approach，vol.I II(D.Glover，ed.))，《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，ed.，1984))，《分子克隆實驗指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning(1984))和《基礎病毒學》第二版第I卷和II卷(Fundamental Virology，2nd Edition，vol.I II(B.N.Fields and D.M.Knipe，eds.))。
本文所引用的全部出版物、專利和專利申請，不管是上文還是下文，均在此通過引用全文納入本說明書中。
必須注意的是如在說明書和所附權利要求書中使用的，單數形式的「一」、「一種」和「該」包括複數指代對象，除非上下文中另外明確指出。
A.定義若無另外定義，本文所使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬技術領域普通技術人員通常理解的相同含義。儘管許多與本文所描述的相似或等同的方法和材料可用於本發明的實施，但本文只描述了優選的材料和方法。
在描述本發明中將使用如下術語，並被定義為具有如下含義。
在本文中，術語「核酸免疫接種」用來指將編碼一個或多個所選抗原的核酸分子導入宿主細胞中，以實現抗原在體內表達。核酸分子可直接導入受試者，如通過標準的肌肉注射或皮內注射、透皮顆粒釋放、吸入、局部給藥、或通過口服、鼻腔或黏膜方式給藥。或者，分子也可在體外導入從受試者取出的細胞中。在後一種情況下，含有所研究核酸分子的細胞被再導入受試者，這樣針對核酸分子編碼抗原的免疫應答得以啟動。在該免疫接種中所使用的核酸分子在本文中一般指「核酸疫苗」。
術語「佐劑」是指能特異性或非特異性改變、提高、引導、再引導、增強或啟動抗原特異的免疫應答的物質或組合物。因此，佐劑和抗原的共同給藥能使給予抗原的受試者獲得所需免疫應答必要的抗原劑量降低或減少，或者，共同給藥也能在受試者內產生在定性和/或定量上不同的免疫應答。特別地，佐劑的給予能增強免疫應答，如增大強度和/或延長持續時間。通過以下方法測定佐劑效果將佐劑和疫苗組合物，以及疫苗組合物本身給予動物，並且通過使用標準檢測方法如放射免疫法、ELISA，和CTL分析，比較兩組抗體和/或細胞介導的免疫性。
「核心載體」是指被客體核酸(guest nucleic acid)(如DNA、RNA)包被的載體，是為給予規定的顆粒大小和足夠高的密度，以獲得穿入細胞膜所需動量。因此客體分子能使用顆粒介導的技術被釋放(見如美國專利No.5,100,792)。核心載體一般包括如鎢、金、鉑、鐵氧體、聚苯乙烯和乳膠的物質。見如《基因轉移的粒子轟擊技術》(ParticleBombardment Technology for Gene Transfer，(1994)Yang，N.ed.，OxfordUniversity Press，New York，NY pages 10-11)。
「無針注射器」是指一種儀器，它不藉助於常規的針來穿刺皮膚就能透皮釋放微粒組合物。本發明所使用的無針注射器會在本文中詳細說明。
術語「透皮」釋放是指皮內(如進入真皮或表皮)、透皮(如「經皮膚的」)和跨黏膜給藥，如，通過將試劑注入或穿過皮膚或黏膜組織釋放。見，如Transdermal Drug DeliveryDevelopmental Issues and ResearchInitiatives，Hadgraft and Guy(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug DeliveryFundamentals and Applications，Robinson andLee(eds.)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；和Transdermal Delivery of Drugs，Vols.1-3，Kydonieus and Berner(eds.)，CRC Press，(1987)。因此，本術語包括從無針注射器釋放(在美國專利No.5,630,796中描述)和顆粒介導的釋放(在美國專利No.5,865,796中描述)中釋放。
「多肽」在最廣義上被用來指兩個或多個胺基酸亞基、胺基酸類似物，或其它假肽(peptidomimetics)的化合物。該亞基可通過肽鍵或其它鍵，如脂鍵、醚鍵等連接。在本文中使用的術語「胺基酸」指天然的和/或非天然的或合成的胺基酸，包括甘氨酸和兩種D型或L型旋光異構體，和胺基酸類似物和假肽。如果肽鏈較短，三個或多個胺基酸的肽一般被稱為寡肽。如果肽鏈較長，該肽一般被稱為多肽或蛋白。
「抗原」指任何物質，一般指大分子，它能在個體中引發免疫應答。該術語可用來指單個大分子或指一組同質或異質的抗原大分子。本文中使用的「抗原」一般用來指包含一個或多個表位的蛋白分子或其一部分。基於本發明的目的，抗原可從任何合適的來源中獲得或得到。另外，基於本發明的目的，「抗原」包括經修飾的蛋白，如天然序列的缺失、插入和置換(一般在本質上是保守的)，只要蛋白保持足夠的免疫原性。這些修飾可是刻意的，如通過定向誘變，或者也可是偶然的，如通過產生抗原的宿主的突變。
針對所研究抗原的「免疫應答」是在個體中產生針對該抗原的體液和/或細胞免疫應答。基於本發明的目的，「體液免疫應答」是指由抗體分子介導的免疫應答，而「細胞免疫應答」是指由T-淋巴細胞和/或其它白細胞介導的免疫應答。
術語「核酸分子」和「多核苷酸」在本文中互換使用，指任何長度的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物)的聚合形式。多核苷酸可具有任何三維結構，並能發揮任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性實例包括基因、基因片段、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA，核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分枝多核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離DNA、任何序列的分離RNA、核酸探針和引物。
多核苷酸一般由四種核苷酸鹼基(腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鳥嘌呤(G)，和胸腺嘧啶(T)(當多核苷酸是RNA時為尿嘧啶(U)))的特定序列組成。因此，術語核酸序列是多核苷酸分子的字母表示。這種字母表示能輸入具有中央處理單元的計算機的資料庫中，用於生物信息學應用，如功能基因組學和同源性查詢。
「載體」能將核酸序列轉移到靶細胞(如病毒載體、非病毒載體、微粒載體和脂質體)。一般地，「載體構建體」「表達載體」和「基因轉移載體」指任何能指導所研究基因的表達的核酸構建體，它能將基因序列轉移到靶細胞。因此，該術語包括克隆和表達載體，以及病毒載體。「質粒」是由染色體外的遺傳因子構成的載體。
「編碼」所選抗原的核酸序列是指在合適的調節序列的調控下，在體內轉錄(在DNA的情況下)和翻譯(在mRNA的情況下)成為多肽的核酸分子。編碼序列的邊界由5』端(氨基端)的起始密碼子和3』端(羧基端)的翻譯終止密碼子決定。基於本發明的目的，這些核酸序列包括，但不限於病毒cDNA、原核或真核mRNA、病毒基因組序列或原核DNA或RNA，甚至還包括合成DNA序列。轉錄終止序列可位於編碼序列的3』端。
「啟動子」是啟動和調節編碼多肽的多核苷酸的轉錄的核苷酸序列。啟動子包括誘導型啟動子(與啟動子有效連接的多核苷酸序列的表達被分析物、輔助因子、調節蛋白等誘導)、阻抑型啟動子(與啟動子有效連接的多核苷酸序列的表達被分析物、輔助因子、調節蛋白等阻抑)、和組成型啟動子。術語「啟動子」或「調控元件」包括全長啟動子區和這些區域的功能(如調控轉錄或翻譯)片段。
「有效連接」指元件的排列，其中以該術語描述的組分被裝配以執行其一般功能。因此，與核酸序列有效連接的指定啟動子在恰當的酶存在時能影響該序列的表達。啟動子無需與該序列毗鄰，只要其能指導該序列表達即可。因此例如，間隔的非翻譯但被轉錄的序列可出現在啟動子序列和核酸序列間，並且啟動子序列仍然被認為與編碼序列「有效連接」。
本文中「重組」是用來描述基因組、cDNA、半合成或合成來源的核酸分子(多核苷酸)，根據其來源或操作法，該核酸分子不與自然狀態下與其連接的全部或部分多核苷酸連接，和/或與自然狀態下不與其連接的多核苷酸連接。單個重組核酸分子中的兩個核酸序列自然狀態下一般彼此沒有關聯時，它們相對於彼此而言是「異源的」。
本文提到了多核苷酸的同源物。一般地，與另一多核苷酸同源的多核苷酸至少與該多核苷酸70％同源，優選至少80％或90％，並更優選至少與其95％、97％或99％同源。檢測同源性的方法為本領域所熟知，並且本領域普通技術人員應該理解的是在本文上下文中，同源性是以核酸的同一性為基礎來計算的。該同源性可能存在於至少15個，優選至少30個，比如至少40個、60個或100個或更多個連續核苷酸的區域。
檢測多核苷酸的同源性或同一性的方法已為本領域所熟知。如，UWGCG程序包提供了BESTFIT程序，它可用於計算同源性(如以默認設置使用)(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12.p387-395)。
PILEUP和BLAST算法也可用於計算同源性或比對序列(一般以默認設置)，如在Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36290-300；Altschul，S，F etal(1990)J Mol Biol 215403-10中描述。
執行BLAST分析的軟體通過美國國家生物技術信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公開獲得。該算法首先要識別高比值序列對(high scoring sequence pair，HSP)，這通過識別待查詢的序列中長度為W的短欄位實現，該欄位在與資料庫序列中相同長度的欄位比對時，匹配或滿足某些正值的閾得分T。T指相鄰欄位得分閾(Altschul etal，同上)。這些最初的相鄰欄位命中結果作為啟動檢索的種子，以查找含有它們的HSPs。欄位命中結果沿每個序列的兩個方向延伸，使累積比對得分儘量增加。出現以下情形即停止欄位命中結果沿兩個方向的延伸當累積比對得分為零或小於零時，這是由於一個或多個負分殘基比對的累積，或到達了任一序列的末端。BLAST算法參數W、T和X決定了比對的敏感性和速度。BLAST程序使用默認值欄位長度(W)為11，BLOSUM62得分矩陣(見Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919)比對值(B)為50，期望值(E)為10，M＝5，N＝4，兩條鏈比較。
BLAST算法進行兩個序列間相似性的統計分析，見如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl，Acad.Sci.USA 905873-5787。由BLAST算法提供的相似性的一個量度是最小和概率(smallest sum probability(P(N)))，它提供了兩個核苷酸或胺基酸序列之間隨機出現匹配的概率的指標。例如，若一個序列和另一個序列相比較時，最小和概率小於大約1，優選小於大約0.1，更優選小於大約0.01，最優選小於大約0.001，則第一個序列被認為同第二個序列是相似的。
同源物一般與相關的多核苷酸以顯著高於本底的水平雜交。由同源物和多核苷酸間的相互作用所形成的信號水平一般強於「本底雜交」至少10倍，優選至少100倍。相互作用的強度可使用諸如放射性標記的探針來檢測，如32P。選擇性雜交一般通過使用中度到高度嚴格條件來實現，如，在大約50℃到大約60℃的0.03M氯化鈉和0.003M檸檬酸鈉的條件下。
嚴格雜交條件包括50％甲醯胺、5×Denhardt溶液、5×SSC、0.1％SDS和100μg/ml變性鮭精DNA，洗滌條件包括在37℃下2×SSC，0.1％SDS洗滌，隨後在68℃下1×SSC，0.1％SDS洗滌。確定的合適的雜交條件已為本領域普通技術人員所熟知，見如Sambrook，et al.，同上.
同源物與相關多核苷酸中的序列不同在於少於3、5、10、15、20或更多個突變(每一種均可為置換、缺失或插入)。這些突變可在同源物的至少30，比如至少40、60或100或更多個連續核苷酸的區域測定。在多核苷酸編碼多肽處，優選地，置換在所編碼的胺基酸中形成「保守」變化。保守變化根據下表定義。在保守變化中，第二列的同一區域的胺基酸，優選第三列的同一行的胺基酸彼此置換。

在本文中互換使用的術語「個體」和「受試者」是指脊椎動物亞門(subphylum chordata)中的任一成員，包括但不限於人和其它靈長類，包括非人靈長類如黑猩猩以及其它猿和猴種；家畜如牛、綿羊、豬、山羊和馬；馴養哺乳動物如狗和貓；實驗動物包括嚙齒類如小鼠、大鼠和豚鼠；鳥類，包括馴養鳥類，野生鳥類和諸如雞、火雞的獵鳥和其它鶉雞類，鴨，鵝等等。本術語並不指特定年齡。因此，成年和新生個體均包括在內。由於所有這些脊椎動物的免疫系統作用方式相似，因此本文中所描述的方法用於上述的脊椎動物種中的任一動物。
B.概述本發明涉及核酸構建體，它為宿主細胞中的異源編碼序列，特別是抗原編碼基因的高效表達提供了可能。更具體地，本發明提供了核酸構建體，它包含嵌合啟動子序列和克隆位點，或在某些具體實施方案中基本由嵌合啟動子序列和克隆位點組成，因此在克隆序列插入克隆位點時，克隆序列與嵌合啟動子有效連接。
嵌合啟動子包括，或在某些具體實施方案中基本由下列元件組成(a)hCMV立即早期啟動子序列；(b)hCMV主要立即早期基因的外顯子1和至少一部分外顯子2；和(c)置換hCMV主要立即早期基因的內含子A區的異源內含子。
hCMV立即早期啟動子序列(a)可包括(i)天然hCMV立即早期啟動子序列；(ii)其功能同源變體；或(iii)(i)或(ii)的功能片段。
一般地，序列(a)包括大約100到600，優選200到600，例如400到600個核苷酸。一般地，序列(a)包括出現在(i)中的序列，它與轉錄因子或RNA聚合酶連接，或能與相同轉錄因子和RNA聚合酶連接的這些序列的同源物，而非這些序列。一般地，這些序列或其同源物以與(i)相同的順序和/或基本相同的相對位置出現在啟動子序列(a)中。
一般地，(i)包括hCMV主要立即早期基因至少從-100到-1，一般-150到-1，如-500到-1或-600到-1的核苷酸。序列(i)一般包括hCMV核心啟動子序列，並且還包括hCMV立即早期啟動子中的一個或多個增強子元件。例如，(i)可包括從-118到-1，或-524到-1的核苷酸(US6218140)或從-62到-1，或-465到-1的核苷酸(US 538 5839)。
一般地，(i)包括一般出現於啟動子序列的TATA框或CAAT框。優選地，該序列包括hCMV立即早期啟動子中的一個或多個重複序列。
在一個優選的實施方案中，(i)包括SEQ ID NO1。
使用已知方法可獲得hCMV立即早期啟動子序列。使用標準技術，可直接從病毒樣本中分離出天然的hCMV立即早期啟動子，例如US5385839描述了hCMV啟動子區的克隆。hCMV立即早期啟動子序列可從Genebank#M60321(hCMV Towne株)和X17403(hCMV Ad169株)獲得。因此，天然序列可通過使用基於已知序列的PCR引物，採用PCR分離得到。見如Sambrook et al，同上中用於獲得和分離DNA的技術的描述。合適的hCMV啟動子序列也可從現存質粒載體分離得到。啟動子序列也可通過合成產生。
功能變體(ii)或片段(iii)一般可維持和/或補充天然啟動子(i)的活性。一般地，這種活性是指引起(包括啟動和調控)有效連接的多核苷酸，特別是hCMV主要立即早期基因的轉錄的能力。在一個實施方案中，片段的變體能補充hCMV病毒中的天然啟動子的活性，比如允許病毒維持在細胞內感染和/或複製的能力。
可檢測同源變體(ii)或片段(iii)維持和/或補充(i)的活性的能力。例如，可檢測變體或片段恢復突變體hCMV功能(如感染和/或複製能力)的能力，在突變體中，天然hCMV立即早期啟動子是缺損的。
同源變體(ii)或片段(iii)可使用下面的差異表達分析(ComparativeExpression Assay)檢測其可用性。待測啟動子序列被導入基本載體(basevector)中，置換天然hCMV立即早期啟動子。一般地，功能變體或片段允許使用基本載體所提供的表達的至少50％，如，60％、70％、80％、90％或更高。一般地，表達發生在至少一種，但優選兩種參照細胞類型中。一般地，參照細胞為哺乳動物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS細胞。
另外或者作為另一種選擇，下面的差異免疫原性分析(ComparativeImmunogenicity Assay)可檢測啟動子序列。待測啟動子序列被導入基本載體中，置換天然hCMV立即早期啟動子。功能啟動子序列提供較基本載體獲得的抗體滴度相同或較高的抗體滴度，其中該基本載體具有至少一個、優選兩個抗原。優選地，抗體滴度較基本載體至少高5％、10％、20％、30％或40％。優選的抗原是HBsAg，HSV 2gD和flu-M2抗原。根據本檢測，天然啟動子序列(i)的功能同源變體(ii)或功能片段(iii)允許天然序列獲得的最高抗體滴度。
如上所述，構建體可包括外顯子序列(b)，它包括來源於hCMV主要立即早期基因的外顯子1和外顯子2的序列。外顯子是編碼序列，它們天然狀態下一般被內含子分隔。在天然hCMV主要立即早期基因中，外顯子1和2一般被天然內含子A分隔。在本發明的嵌合構建體中，外顯子2序列一般位於外顯子1序列3』端，沒有內含子序列間隔，因此外顯子1和外顯子2序列是連續的。
外顯子序列(b)可包括(i)天然外顯子序列，一般為外顯子1和(全部或部分)外顯子2；(ii)(i)的功能同源變體；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
序列(i)可包括大約50％到100％的天然hCMV主要立即早期基因外顯子1序列，如，60％到90％，或70％到80％。一般至少有50％的天然外顯子1序列，如60％、70％、80％、90％或更多。外顯子序列(b)也包括至少部分外顯子2序列。在序列(i)中，一般有天然外顯子2的兩個或多個鹼基，如2到9、2到7、或3到5個鹼基。有最高達並且包括100％的天然外顯子2序列，如5％到95％、20％到80％或40％到60％的天然外顯子2序列。一般地，同源變體具有上面就天然序列所提到的任何長度。
優選地，(i)包含SEQ ID No.2。
通過已知方法能獲得合適的外顯子序列(b)。見如Sambrook et al.，同上，關於用於獲得和分離DNA的技術的描述。通過使用標準技術(見，例如，Maclean，A(1998)「Preparation of HSV-DNA and Production ofInfectious Virus」in Herpes Simplex Virus Protocols(在單純皰疹病毒試驗方案中的「感染病毒的HSV-DNA和產物的製備」)S.Brown，A Maclean，editors，Humana Press，Totowa，NJ，pp.19-26)，天然hCMV主要立即早期基因序列能直接從病毒樣本中分離得到。hCMV主要立即早期基因的序列，包括外顯子1和外顯子2的位置，可在Genebank#M60321，X17403獲得。因此，天然外顯子1和2序列能通過在合適的限制酶切位點切去天然主要基因序列，或通過使用基於已知序列的PCR引物採用PCR分離得到。或者，合適的外顯子序列可從現存的質粒載體中分離得到，如pWRG7128。外顯子序列也可通過合成，而非克隆製備。變體序列易於通過常規方法，如定向誘變構建得到。
一般地，當外顯子存在於本發明的構建體中時，它能提高表達，一般能引起與上述天然外顯子1和外顯子2序列相當的提高。
可使用下面的差異表達分析檢測外顯子序列的功能性。待測外顯子序列被導入基本載體中，置換已有外顯子序列。一般地，與基本載體相比，若外顯子序列在至少一種、優選兩種參照細胞類型中其表達非但不停止，反而進一步提高，則該序列是功能性的。一般地，參照細胞是哺乳動物的HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS細胞。優選地，表達提高了至少5％、10％、20％、30％或40％。根據本檢測，天然外顯子序列(i)的功能同源變體(ii)或功能片段(iii)為天然序列表達至少提高50％提供了可能。
另外或者作為另一種選擇，可使用下面的差異免疫原性分析檢測外顯子序列。待測外顯子序列被導入基本載體，置換已有外顯子序列。功能外顯子序列提供較基本載體所獲得的抗體滴度相等或者較高的抗體滴度，其中該基本載體具有至少一個、優選兩個抗原。優選地，抗體滴度較基本載體至少高5％、10％、20％、30％或40％。優選的抗原是HBsAg、HSV 2gD和flu-M2抗原。根據本檢測，天然外顯子序列(i)的功能同源變體(ii)或功能片段(iii)允許由天然序列獲得的最高抗體滴度。
嵌合啟動子構建體包括異源內含子(c)，它置換hCMV主要立即早期基因的天然內含子A區。內含子是從由基因轉錄得到的hnRNA剪接得到的非編碼序列。天然狀態下異源內含子不存在於編碼序列中。
異源內含子(c)全部或部分置換hCMV主要立即早期基因的天然內含子(A)。一般地，不存在天然內含子A。
一般地，異源內含子(c)為外顯子序列(b)3』端。
一般地，異源內含子(c)包括(i)天然內含子；(ii)(i)的功能同源變體；或(iii)(i)或(ii)的功能片段。
異源內含子(c)一般為病毒或真核生物的內含子。優選地，內含子是哺乳動物的內含子，特別是非人類的內含子，如大鼠或雞的內含子。優選地，內含子為內含子A，如，大鼠胰島素內含子A，雞角蛋白內含子A或雞心臟的肌動蛋白內含子A。
一般地，內含子(c)長度為大約50個核苷酸到大約1000個核苷酸，如大約100到大約500個核苷酸。例如，內含子(c)可包括50到500個核苷酸，如高達100、200、300或400個核苷酸。優選地，內含子包括天然大鼠胰島素內含子A的第50到133位的核苷酸，或該序列的同源物。
優選地，異源內含子(c)能從真核宿主細胞的RNA轉錄產物中剪接。一般地，內含子包括一個或多個供體序列(如GT)、受體序列(如AG)、3』嘧啶富集區和分枝點序列。若含嘧啶富集區，該區可包括，如至少5、8、10或更多嘧啶。優選地，內含子包括至少一個供體序列、一個受體序列和一個分枝點序列。一般地，在嵌合構建體中，內含子(c)包括來源於外顯子序列的非內含子側翼序列，該外顯子序列發現於天然內含子(i)的內含子/外顯子邊界。側翼外顯子序列可為天然外顯子序列或該序列的同源物，該同源物基本保持天然序列相同活性，如保持剪接功能。一般在內含子的兩端均包括外顯子序列的5到10、優選7到10個鹼基。
內含子(c)可是人工內含子，只要內含子是功能性的。例如，可使用重組或嵌合內含子。這種內含子可包括一個以上天然內含子的序列。
一般地，內含子(c)包括存在於hCMV內含子A的序列，它與轉錄因子或調控蛋白結合，或能與相同轉錄因子或蛋白結合的這些序列的同源物，而非這些序列。一般地，這些序列或其同源物以與hCMV內含子A中相同的順序和/或基本相同的相對位置出現在內含子(c)中。
內含子(c)包括同源變體(ii)，其中天然內含子(i)的序列經修飾以除去內部的限制酶切位點。如，可使用大鼠胰島素內含子A的同源變體，其內部的Nhel位點已被破壞。
優選地，內含子(c)包括(i)SEQ ID No.3；(ii)(i)的功能同源變體；或(iii)(i)或(ii)的功能片段。
內含子序列(c)可使用標準克隆技術獲得。例如，大鼠胰島素內含子A序列在GeneBank J00748，雞角蛋白內含子序列在GeneBankJ00847以及雞心臟的(肌動蛋白)內含子A序列在GeneBank X02212中可得。內含子序列可使用基於已知序列的引物從天然來源中分離得到。序列也可合成製備。變體序列可通過突變獲得。
一般地，諸如功能變體(ii)或功能片段(iii)的功能內含子序列基本具有與天然內含子(i)相同的活性，和/或補充其活性。在一個實施方案中，該活性是指剪接活性。
可使用常規剪接分析檢測內含子(c)序列的剪接活性。一般地，在該檢測中，功能同源物(ii)或功能片段(iii)顯示出至少50％，如60％、70％、80％、90％到高達100％或更高天然內含子(i)的剪接率。
一般地，異源內含子序列出現在本發明的構建體中時，它能提高表達。一般地，變體(ii)或片段(iii)內含子較天然內含子(i)能產生相當的提高。
潛在的內含子序列(c)的功能可使用下面的差異表達分析檢測。異源內含子被導入基本載體中。一般地，在與基本載體進行比較時，若異源內含子序列在至少一種、優選兩種參照細胞類型中其表達提高25％或更高，則該序列是功能性的。一般地，參照細胞是哺乳動物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS細胞。表達提高至少35％、45％、55％或更高。根據本檢測，天然內含子序列(i)的功能變體(i)或功能片段(ii)為天然序列表達提高50％以上提供了可能。
另外或者作為另一種選擇，可使用下面的差異免疫原性分析檢測異源內含子(c)序列的功能性。內含子(c)序列被導入基本載體中。功能內含子(c)序列提供與基本載體所獲得的抗體滴度相同或者較高的抗體滴度，該基本載體具有至少一個、優選兩個抗原。優選地，抗體滴度較基本載體至少提高5％或10％，如20％、30％或40％。優選的抗原是HBsAg、HSV2gD和flu-M2抗原。根據本檢測，天然內含子序列(i)的功能變體(ii)或功能片段(iii)允許由天然序列獲得的最高抗體滴度。
可使用標準克隆技術獲得合適的異源內含子序列。例如，大鼠胰島素內含子A序列在GeneBank J00748，雞角蛋白內含子A在GeneBankJ00847以及雞心臟的肌動蛋白內含子A序列在GeneBank X02212中可得。內含子序列可使用基於已知序列數據的引物從天然來源中分離得到。合適的序列還可通過合成製備。
可使用標準克隆或分子生物學技術，將組成序列(a)、(b)和(c)適當地連接在一起以形成嵌合啟動子。優選地，內含子序列(c)位於外顯子序列(b)的3』端。嵌合啟動子構建體與克隆位點相連接，在有合適的酶參與下，通過這種方式啟動子會影響插入到該位點的編碼序列的表達。合適的克隆位點，包括多克隆位點，已為本領域所熟知，如pUC19，pBC SK，pBluescript II KS，cDNA3.1，pSP72，pGEM 7Z多克隆位點。
一般地，用於插入(或已經插入)克隆位點的核酸編碼與治療相關的多肽。優選編碼序列適用於核酸免疫接種或基因治療中。因此，核酸插入序列可包括能提供免疫性的序列，例如免疫原性序列，它在釋放給受試者時能引起體液和/或細胞免疫應答。或者，核酸可包括一個或多個編碼治療性多肽(如靶細胞基因組缺損或缺少的蛋白，或具有所需生物或治療效應(如抗病毒功能)的非天然蛋白)的基因。對於遺傳病的治療，能將對應於已知在具體病症中缺失的基因的功能性基因給予受試者。優選地，核酸是DNA。
用於插入的合適的核酸包括那些用於治療炎性疾病、自身免疫疾病、慢性病和傳染病的核酸，包括病症如愛滋病、癌症、神經系統疾病、心血管系統疾病、高膽固醇血症(hypercholestemia)；各種血液病包括各種貧血(anemias)、地中海貧血(thalassemia)和血友病(hemophilia)；遺傳缺陷如囊腫性纖維化(cystic fibrosis)、Gaucher疾病、腺苷脫氨酶(ADA)缺乏症(adenosine deaminasedeficiency)、肺氣腫(emphysema)等。
例如，在治療實體瘤(solid tumor)的方法中，如下基因可在腫瘤位點或其附近插入表達編碼毒性肽的基因(即諸如篦麻毒素(ricin)、白喉毒素(diphtheria toxin)和眼鏡蛇毒因子(cobra venomfactor)的化學治療劑)、諸如p53的腫瘤抑制基因，編碼轉化癌基因的反義鏈的mRNA序列的基因，編碼抗腫瘤肽如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和其它細胞因子的基因，或轉化癌基因的反式顯性陰性突變體(transdominant negative mutant)。
同樣，也包括編碼多肽的核酸，已知該多肽表現出抗病毒和/或抗細菌活性、或刺激宿主免疫系統。核酸可編碼多種細胞因子(或其功能片段)中的一種，如白細胞介素(interleukin)、幹擾素(interferon)和集落刺激因子(colony stimulating factor)。核酸可編碼治療或預防許多疾病的抗原，包括但不限於癌症、過敏、中毒和被病原體感染。該病原體包括但不限於真菌、病毒；病毒包括人乳狀瘤病毒(HumanPapilloma virus，HPV)、HIV、HSV2/HSV1，流感病毒(influenza virus，甲型、乙型和丙型)、脊髓灰質炎病毒(Polio virus)、RSV病毒(RSVvirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、輪狀病毒(Rotavirus)、A型肝炎病毒(Heptatitis A virus)、諾瓦克病毒組(Norwalk Virus Group)、腸道病毒(Enterovirus)、星狀病毒(Astrovirus)、麻疹病毒(Measlesvirus)、Par流感病毒(Par Influenza Virus)，腮腺炎病毒(MumpsVirus)、水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus)、巨細胞病毒(cytomegalovirus)、非洲淋巴細胞瘤病毒(Epstein-Barr Virus)、腺病毒(Adenovirus)、德國麻疹病毒(Rubella virus)、人T細胞淋巴瘤I型病毒(Human T-cell Lymphoma type I virus，HTLV-I)、B型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)、C型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)、丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus)、痘病毒(Pox virus)、馬爾病毒和伊波拉病毒(Marburg and Ebola)；細菌包括結核桿菌(M.tuberculosis)、衣原體(Chlamydia)、淋病菌(N.gonorrhoeae)、志賀氏桿菌(Shigella)、沙門氏菌(Salmonella)、霍亂弧菌(VibrioCholera)、蒼白密螺旋體(Treponema Pallidua)、假單胞菌(Pseudomonas)、百日咳桿菌(Bordetella Pertussis)、布魯氏菌(Brucella)、土拉熱弗朗西施氏菌(Franciscella tularensis)、幽門螺旋菌(Meningococcus)、問號鉤端螺旋體(Leptospria interrogaus)、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)、鏈球菌(Streptococcus)(A和B型)、肺炎球菌(Pneumococcus)、腦膜炎球菌(Meningococcus)、流感嗜血桿菌(Hemophilus influenza)(b型)、剛地弓形蟲(Toxoplama gondic)、Complybacteriosis、黏膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、腹股溝肉芽腫(Donovanosis)和放線菌(Actinomycosis)；真菌病原體包括念珠菌(Candidiasis)和麴黴(Aspergillosis)；寄生蟲病原體包括絛蟲(Taenia)、吸蟲(Flukes)、蛔蟲(Roundmorms)、變形蟲(Amebiasis)、賈第蟲(Giardiasis)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)、血吸蟲(Schitosoma)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)，匐滴蟲(Trichomoniasis)和旋毛蟲(Trichinosis)。該核酸也可用來針對多種畜禽疾病提供合適的免疫應答，如口蹄疫(Foot and MouthDisease)、冠狀病毒(Coronavirus)、出血敗血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、纏繞桿菌屬(Helicobacter)、尋常圓線蟲(Strongylus vulgaris)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumonia)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌(E.Coli)、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)、副百日咳桿菌(Bordetellaparapertussis)和支氣管敗血性博德特氏菌(Bordetella brochiseptica)。因此，一方面，本發明的核酸構建體可在疫苗中使用。
在一些實施方案中，核酸構建體編碼佐劑。因此，插入克隆位點(用於插入編碼序列)的序列可編碼作為佐劑的多肽。在優選的實例中，所編碼佐劑可為ADP-核糖基化的細菌毒素。這些毒素包括白喉毒素(diphtheria toxin，DT)、百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、霍亂毒素(cholera toxin，CT)、大腸桿菌不耐熱腸毒素(E.coli heat labile toxins，LT1和LT2)、假單胞桿菌內毒素A(Pseudomona endotoxin A)、假單胞菌外毒素S(Pseudomonas extoxin S)、仙人掌桿菌胞外酶(B cereusexoenzyme)、球形芽孢桿菌毒素(B.sphaericus toxin)、肉毒梭菌C2和C3毒素(C botulinum C2 and C3 toxin)，泥渣梭菌胞外酶(C.limosumexoenzyme)，以及來自產氣莢膜梭菌(C.perfringens)、螺狀梭菌(Cspiroforma)和艱難梭菌(C difficile)的毒素和金黃色葡萄球菌EDIN(Staphylococcus aureus EDIN)。大部分ADP-核糖基化的細菌毒素包含A亞基和B亞基。構建體可表達A亞基、B亞基和/或兩個亞基一起表達。
在一個優選的實例中，核酸構建體可編碼大腸桿菌不耐熱毒素和/或霍亂毒素，並特別表達大腸桿菌不耐熱毒素。CT的A亞基和B亞基基因的完整序列的GenBank條目見於基因位點(Locus)VIBCTXABB(基因存取號No.D30053)，而LT的A亞基和B亞基基因的完整序列的GenBank條目見於基因位點AB0116677(基因存取號No.AB011677)。
構建體能表達特定佐劑的活性變體或片段。若變體或片段保持所來源多肽的至少部分佐劑活性，則說其具有活性。因此，與沒有佐劑同抗原一起給藥時觀察到的免疫應答相比，變體和/或片段仍然能增強針對特定抗原的免疫應答。被編碼序列可是CT的A亞基和/或B亞基的活性片段或變體，並特別為LT的A亞基和/或B亞基的活性片段。
毒素亞基可缺失天然存在的信號序列。天然存在的外毒素亞基可被修飾以將毒素解毒。A亞基可被修飾以幹擾ADP-核糖基轉移酶的活性或將該酶失活。
因此，本發明的佐劑構建體可用於提高針對特定抗原的免疫應答。增強的免疫應答包括強度更大或時間更長的免疫應答。這意味著當再次遇到抗原時，免疫應答比未給予佐劑時更強。增強的免疫應答可產生更高的抗體滴度。在一些構建體中，特別是在那些表達外毒素亞基的構建體中，佐劑可產生針對所研究抗原的放大的細胞應答，和T輔助細胞1樣免疫應答。
插入克隆位點的核酸可包括聚腺苷酸化(polyA)序列。這種PolyA序列一般來源於編碼序列。或者，異源polyA序列出現在本發明的核酸構建體中。一般地，polyA序列可位於克隆位點下遊，這樣可有效連接於插入克隆位點的編碼序列。使用標準克隆技術可將任何合適的polyA序列導入構建體中。該polyA序列為本領域所熟知。
polyA序列可為(i)天然polyA序列；(ii)(i)的功能同源變體；或(iii)(i)或(ii)的功能片段。
天然polyA序列(i)可為，例如兔β-珠蛋白基因polyA，人乳頭狀瘤病毒(HPV)早期或晚期基因polyA，HSV-2gB基因polyA，猿CMV立即早期基因polyA或HSVgD晚期基因polyA。
優選地，天然polyA序列(i)選自SEQ ID No.10(GenBankK03256)、SEQ ID No.11(GenBank M16019)、SEQ ID No.12(GenBankZ80699)和SEQ ID No.13(GenBank K02718)。
一般地，功能polyA序列是保留聚腺苷酸化活性的序列。
可使用常規表達分析檢測polyA序列將RNA轉錄產物聚腺苷化的能力。在檢測中發現功能同源變體(ii)或功能片段(iii)一般具有天然polyA序列的至少50％，例如60％、70％、80％或更高polyA活性。
一般地，在polyA序列出現在本發明的構建體中時，會提高表達，一般會產生相對於上述天然polyA序列(i)相當的提高。
可使用下述差異表達分析檢測polyA序列的功能性。待測polyA區被導入基本載體，以置換RBGpA。和基本載體相比，若polyA在至少一種(優選兩種)參照細胞類型中非但不停止表達，反而(優選)提高表達，則認為待測polyA是功能性的。優選地，表達提高至少5％、10％、20％、30％、40％或50％或更高。優選的細胞類型為哺乳動物的HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS細胞。根據本檢測，若同源變體(ii)或片段(iii)能獲得高於天然polyA序列(i)表達量的50％，則認為其是功能性的。
另外或者作為另一種選擇，可使用如下差異免疫原性分析檢測polyA序列的活性。polyA序列被導入基本載體中，以置換RBCpA。功能性polyA序列提供較基本載體所獲得的抗體滴度至少相同或更高的抗體滴度，該基本載體含至少一個、優選含兩個抗原。優選地，該抗體滴度至少高於基本載體所獲得的抗體滴度的至少5％、10％，如20％、30％或40％。優選的抗原是HBsAg、HSV2gD和Flu-M2抗原。若同源變體(ii)或片段(iii)能獲得天然polyA序列所獲得的最高抗體滴度，則認為其是功能性的。
核酸構建體還包括另外的調控序列，它影響插入克隆位點的編碼序列的表達。該構建體可包括非翻譯前導序列。該序列在構建體中與嵌合啟動子有效連接，因此它同樣與插入克隆位點的編碼序列有效連接。前導序列提供表達插入編碼序列的翻譯起始位點，並一般含Kozak序列。
一般地，非翻譯前導序列包括(i)天然非翻譯前導序列；(ii)(i)的功能同源變體；或(iii)(i)或(ii)的功能片段。
一般地，天然序列(i)是真核生物的序列或病毒序列，特別是感染真核生物的病毒。優選地，天然序列(i)是HBV或HSV序列，如HBV preS2抗原序列，HBV e-抗原序列，或HSV型2gD抗原序列。特別優選地，(i)選自SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7。
一般地，前導序列包括(i)中的序列，它能結合轉錄元件或調節蛋白，或者能結合相同元件或蛋白的這些序列的同源物。一般地，這些序列或其同源物以與(i)中相同的順序和/或基本相同的相對位置出現在前導序列中。一般地，前導序列包含表達插入的編碼序列的翻譯起始位點。一般地，前導序列包含Kozak序列。
一般地，非翻譯前導序列長為大約10個到大約200個核苷酸，例如大約15個到150個核苷酸，優選15個到大約130個核苷酸的長度。例如，可使用含15、50、75或100個核苷酸的前導序列。
一般地，功能性非翻譯前導序列可提供編碼序列表達的翻譯起始位點，所述編碼序列與前導序列有效連接。一般地，功能變體(ii)或片段(iii)具有基本與天然序列(i)相同的活性和/或補充其活性，該天然序列通常促進或增強與該序列有效連接的編碼序列的表達。
使用標準方法可檢測變體(ii)或片段(iii)作為非翻譯前導序列相對於天然前導序列的活性。例如，可製備含與天然編碼序列有效連接的天然前導序列(i)的表達載體，並且在合適的宿主細胞，如哺乳動物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS細胞中監測其表達。可製備待測構建體，其中天然前導序列被同源變體或片段置換，並再監測在相同宿主細胞中的表達。一般地，變體(ii)或片段(iii)具有天然序列表達量的至少50％，如60％、70％、80％、90％或100％或更高。
可在下面的差異表達分析中檢測潛在的前導序列的可利用性。待測前導序列被導入基本載體，以置換HBV preS2 5』UTR。與基本載體相比，功能性前導序列在至少一種(並優選二種)參照細胞類型中非但不停止表達，反而(優選)提高表達。一般地，表達提高了至少5％、10％、20％、30％、40％或50％。優選的細胞類型是哺乳動物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS細胞。根據本檢測，若同源變體(ii)或片段(iii)較天然前導序列所獲得的表達高過50％，則認為其是功能性的。
另外或者作為另一種選擇，可在下面的差異免疫原性分析中檢測前導序列的活性。前導序列被導入基本載體，以置換HBV preS2 5』UTR。功能性前導序列提供與基本載體獲得的抗體滴度至少相同或更高的抗體滴度，該基本載體含有至少一個、優選兩個抗原。優選地，抗體滴度至少高於基本載體的5％、10％、20％、30％或40％。優選的抗原是HBsAg、HSV 2gD和Flu-M2抗原。若同源變體(ii)或片段(iii)具有天然前導序列(i)所具有的最高抗體滴度，則認為其是功能性的。
使用標準方法可獲得合適的前導序列。例如，HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列和HSV型2gD抗原序列分別可在GenBank M54923、M54923和Z86099獲得。可基於該已知序列設計引物，並用於分離同源序列。前導序列可基於已知序列合成。
核酸構建體可包括增強子序列。一般地，增強子序列位於克隆位點的3′端，並與嵌合啟動子和插入編碼序列有效連接，並起到提高插入序列的轉錄水平的作用。
一般地，增強子包括(i)天然增強子；(ii)(i)的功能同源變體；或(iii)(i)或(ii)的功能片段。
一般增強子序列包括大約50到大約850個核苷酸，如大約75個到大約500個核苷酸。可使用大約100、200、300或400個核苷酸的增強子。
一般地，(i)是真核生物的增強子或病毒的增強子，特別是感染真核生物的病毒的增強子。通常這種增強子出現在基因的3』非翻譯區(3』UTR)。優選地，(i)是HBV或CMV增強子，如HBs Ag 3』UTR或猿CMV立即早期基因3』UTR。優選地，(i)含有SEQ ID No.8或SEQID No.9。
一般地，構建體中的增強子含有(i)中的序列，它結合轉錄元件或調節蛋白如轉錄因子，或者結合相同元件或蛋白的該序列的同源物。優選地，這些序列以與(i)中相同的順序和/或基本相同的相對位置存在。
一般地，功能性增強子可增強或提高多核苷酸的表達，如與增強子序列有效連接的編碼序列。一般地，功能同源變體(ii)或片段(iii)具有與天然增強子(i)基本相同的活性(如增強表達)或補充其活性。
使用增強子捕獲分析(enhancer trap assay)可檢測增強子活性。實驗方法已為本領域所熟知。在該分析中，功能同源變體(ii)或片段(iii)優選具有天然增強子所具有的至少50％的增強子活性。一般地，該活性為天然增強子的至少60％、70％、80％、90％、100％或更高。一般地，在該分析中功能變體(ii)或片段(iii)能補充天然增強子(i)的活性。
使用下述差異表達分析可檢測增強子的可利用性。待測3』UTR序列被導入基本載體中。在本分析中，與基本載體相比，若3』UTR在至少一種(更優選兩種)參照細胞類型中非但不停止表達，反而(優選)提高表達，則認為其具有可利用性。優選地，表達提高了至少5％、10％、20％、30％、40％或50％。優選的細胞類型為哺乳動物的HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS細胞。根據本分析，若同源變體(ii)或片段(iii)較天然增強子序列(i)所獲得的表達提高了50％以上，則認為其具有功能性。
另外或者作為另一種選擇，可在下述差異免疫原性分析中檢測增強子序列的活性。3』UTR被導入基本載體中。功能性增強子序列具有較基本載體所獲得的抗體滴度相同或更高的抗體滴度，該基本載體含至少一個、優選兩個抗原。優選地，該抗體滴度較基本載體提高至少5％、10％、20％、30％或40％。優選的抗原是HBs Ag、HSV2gD和Flu-M2抗原。若同源變體(ii)或片段(iii)具有天然增強子序列(i)的最高抗體滴度，則認為其是功能性的。
使用標準克隆方法可獲得合適的增強子序列。例如，可在GenBankAF143308和M16019獲得HBs Ag 3』UTR序列、或猿CMV立即早期基因3』UTR序列。引物可基於已知序列設計，並用於分離同源序列。
在一個優選的實施方案中，核酸構建體包括異源polyA序列，異源前導序列和異源增強子，均與嵌合啟動子有效連接，以高效表達插入的編碼序列。
在另外一方面，本發明還提供一種核酸構建體，包括如下元件或基本由如下元件組成(i)啟動子序列；(ii)非翻譯前導序列，其來源於HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列；和(iii)與(i)和(ii)有效連接的編碼序列其中，該編碼序列對非翻譯前導序列是異源的。
一般地，啟動子序列(i)來源於病毒或真核生物的啟動子序列。該啟動子序列可為天然的啟動子序列、天然序列的功能性同源物或兩者的功能片段。合適的天然啟動子包括，如，hCMV立即早期啟動子、偽狂犬病病毒(PRV)啟動子或勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子。優選地，該天然啟動子包括SEQ ID NO52或SEQ ID NO53。
可使用諸如上述嵌合啟動子的人工啟動子構建體，只要該啟動子是功能性的。
一般地，功能性啟動子序列可引起(包括啟動和調控)適當的宿主細胞中有效連接的編碼序列的轉錄。
可使用常規表達分析檢測啟動子序列的啟動子活性。一般地，在此分析中，天然啟動子序列的功能性同源物或片段具有天然序列的表達量的至少50％，例如至少60％、70％、80％或90％。
非翻譯前導序列(ii)如上所述。合適的編碼序列(iii)包括已在嵌合啟動子構建體中描述的編碼序列。但是，在本發明的此方面，編碼序列對非翻譯前導序列是異源的。一般地，本構建體包括polyA序列(已描述)可來自編碼序列，或在構建體中作為異源polyA序列。已描述了合適的polyA序列。該構建體還包括位於編碼序列3』端的增強子序列。在嵌合啟動子構建體中已描述了合適的增強子序列。
在另一方面，本發明提供了一種核酸構建體，包括下述組分或在某些實施方案中基本由下述組分組成(i)啟動子序列；(ii)編碼序列，其與啟動子序列(i)有效連接；和(iii)增強子序列，位於編碼序列(ii)的3』端，並與之有效連接。
其中，增強子序列(iii)來源於HBsAg序列的3』UTR或猿CMV立即早期基因序列的3』UTR，並且編碼序列(ii)對增強子序列是異源的。
構建體可包括非翻譯前導序列，如在嵌合啟動子構建體中已經描述的那些前導序列。
一般地，啟動子序列(i)來源於病毒或真核生物的啟動子序列。啟動子序列可為天然啟動子序列、天然序列的功能性同源物或兩者的功能片段。例如，合適的天然啟動子包括hCMV立即早期啟動子、偽狂犬病病毒(PRV)啟動子或勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子。優選地，天然啟動子包括SEQ ID NO52或SEQ ID NO53。
可使用諸如上述嵌合啟動子的人工啟動子構建體，只要該啟動子是功能性的。
功能性啟動子序列一般可引起(包括啟動和調節)合適的宿主細胞中有效連接的編碼序列的轉錄。
使用常規表達分析可檢測啟動子序列的啟動子活性。一般地，在該分析中，天然啟動子序列的功能性同源物或片段具有天然序列的表達的至少50％，例如至少60％、70％、80％或90％。
合適的編碼序列(ii)包括已在嵌合啟動子構建體中提及的序列。但是，在此方面，編碼序列與對3′增強子序列是異源的。該構建體的增強子序列(iii)如上所述。一般地，本構建體也包括polyA序列。如在嵌合啟動子構建體中一樣，該polyA區可來自編碼序列(ii)或可作為該構建體中的異源polyA元件。
根據本發明的任何一方面的構建體可包括信號肽序列。插入與啟動子有效連接的信號肽序，這樣信號肽就能表達，並輔助由編碼序列(也與啟動子有效連接)編碼的多肽的分泌。
一般地，信號肽序列編碼10到30個胺基酸的肽，如15到20個胺基酸。通常胺基酸主要為疏水的。通常情況下，信號肽將帶有該信號肽的正在合成的多肽鏈引導至表達細胞的內質網中。該信號肽在內質網中被切除，並通過高爾基體分泌多肽。
用於本發明的信號肽可包括(i)天然信號肽序列；(ii)(i)的同源變體，它保留信號肽活性；或(iii)(i)或(ii)的片段，它保留信號肽活性。
例如，序列(i)可為人組織纖溶酶原激活劑信號肽(hTPAsp)(GenBank L00141)、抑肽酶信號肽(GenBank AAD13685)、菸草伸展蛋白信號肽(GenBank JU0465)、或雞溶菌酶信號肽(GenBankAF410481)。
適用於本發明的信號肽是能分泌異源蛋白的信號肽。功能性信號肽可在下述分析中被鑑定比較待測信號肽的效果和已知信號肽的效果-如人組織纖溶酶原激活劑信號肽(hTPAsp)-和沒有信號肽的效果。可使用下述差異表達分析，但需要有如下修改。構建分泌表達載體，其包括具有待測信號肽、hTPAsp或沒有信號肽的基本載體。缺少天然信號肽的多肽編碼序列被插入載體，並將該載體轉化進入參照宿主細胞中。優選的細胞是哺乳動物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS細胞。細胞培養液用於分析多肽表達水平。與缺少信號肽，具有至少一種、優選兩種多肽的載體相比，功能性信號肽能使多肽在較高水平上分泌。一般地，分泌量提高5％，或更優選提高10％或更高，如提高20％或50％或更高。一般地，分泌水平與使用hTPAsp獲得的分泌水平相當。
編碼蛋白能在表達細胞外分泌具有諸多優點，特別是在該蛋白為抗原時。比如，抗原分泌量提高為由免疫細胞(巨噬細胞、Langehan細胞、B細胞、T細胞等)引起的更高抗原攝入和應答提供了可能，使抗原具有到達血流和信號分子(細胞因子)的能力、使抗原能找到細胞配體並發揮作用(抗體，毒素如霍亂毒素、大腸桿菌LT)，並參與普通的細胞生物化學過程(細胞受體)。
本發明的核酸構建體可為質粒表達載體的形式。因此該載體可包括其它元件，如複製起點或選擇子基因。這些元件為本領域所熟知，並可通過使用標準技術被納入其中。在一個實施方案中，質粒載體具有SEQ ID NO14的序列。或者，該構建體可包括在病毒載體構建體中。
在某些實施方案中，本發明的核酸構建體可包括在此定義的兩個或多個嵌合啟動子。因此，構建體可包括多個嵌合啟動子，並且特別地，該構建體可具有兩個、三個、四個、五個或多個嵌合啟動子。優選地，嵌合啟動子分別與用於插入編碼序列的克隆位點有效連接。因此，該構建體可表達兩個、三個、四個、五個或多個編碼序列。所表達的編碼序列可為在此具體描述的任何序列。在一個優選的實例中，構建體具有兩個嵌合啟動子，它們分別具有與它們有效連接的編碼序列。特別地，這兩種啟動子可彼此獨立地轉錄。
特別地，具有兩個啟動子的構建體可表達ADP-核糖基化細菌毒素的A亞基和B亞基，包括本文所述的任何一種，並優選LTA亞基和B亞基。
在構建體具有多個嵌合啟動子的情況下，每個啟動子均包括，或有效連接到本文提及的任何序列。在一個特別優選的實例中，一個或多個啟動子的異源內含子可為大鼠胰島素基因內含子A序列。一個或多個嵌合啟動子也可優選包括HSV-2gB pre-S2的5』UTR。一個或多個啟動子可包括大鼠β珠蛋白基因的聚腺苷酸化序列。
在一優選的實例中，本發明的核酸構建體可包括兩個嵌合啟動子序列，且每個啟動子序列有效連接到插入編碼序列的克隆位點，其中，每個嵌合啟動子包含(a)hCMV立即早期啟動子序列；(b)hCMV主要立即早期基因的外顯子1和至少一部分外顯子2；和(c)置換hCMV主要立即早期基因的內含子A區的異源內含子。
與一個嵌合啟動子有效連接的編碼序列編碼LTA亞基，與另一啟動子連接的編碼序列編碼LTB亞基。因此，構建體能表達兩種亞基。優選地—每個啟動子的異源內含子是大鼠胰島素基因內含子A序列；—編碼每個LT亞基的序列有效連接到HBV pre-S2的5』UTR；和/或—每個LT編碼序列與大鼠β珠蛋白基因聚腺苷酸化序列有效連接。
本發明的多核苷酸構建體基本不含細胞或細胞物質或與其一起存在。它可以是基本分離的形式，或基本純化的形式，在每種形式下，它在製劑中一般包括至少90％，如至少95％、98％或99％的多核苷酸或乾物質。
本核酸分子可被釋放到適合的宿主細胞中，以表達與啟動子有效連接的多核苷酸。優選地，宿主細胞是哺乳動物細胞，特別是人的細胞。釋放核酸到這些細胞中的適合的方法為本領域所熟知，包括，如葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉澱、電穿孔和直接顯微注射到細胞核。
如上所述，構建體中的核酸編碼序列可編碼治療相關的多肽。因此，使用標準基因釋放方法，本構建體可用於核酸免疫接種或基因治療。用於基因釋放的合適方法已為本領域所熟知，如下所詳細說明。核酸分子可直接釋放到受試者，或者，離體釋放到來自受試者的細胞，然後將細胞重新植入受試者。
就在核酸免疫接種或基因治療中的使用方法而言，核酸構建體能如常規藥物製劑那樣製備。可使用本領域普通技術人員可得的標準藥理配方化學和方法製備。例如，含有一個或多個核酸序列(如以合適的載體形式如DNA質粒形式存在)的組合物能與一種或多種藥理學上可接受的賦形劑或載體聯合，以提供一種液體製劑。
輔助物質，如溼潤劑或乳化劑，pH緩衝物質等等，可存在於賦形劑或載體中。這些賦形劑、載體和輔助物質一般是藥劑，它可給藥，沒有異常毒性，並且在作為疫苗組合物時不會在接受該組合物的個體內引起免疫應答。藥理學上可接受的賦形劑包括，但不限於液體，如水、鹽水、聚乙二醇、透明質酸、丙三醇和乙醇。其中還可包括藥理學上可接受的鹽，例如，無機酸鹽，如氫氯化物、氫溴化物、磷酸鹽、硫酸鹽等，有機酸鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、安息香酸鹽等。儘管沒有要求，但優選製劑包括起著穩定劑的作用的、在藥理學上可接受的賦形劑，特別是針對肽、蛋白或其它分子，如果它們包括在組合物中。同樣起著肽的穩定劑作用的合適的載體的實例包括，但不限於藥品級的葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、纖維醇、葡聚糖等。其它合適的載體還包括，但不限於澱粉、纖維素、磷酸鈉或磷酸鈣、檸檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(PEG)和其組合。在REMINGTON』S PHARMACEUTICAL SCIENCES(MarkPub.Co.，N.J.1991)中非常詳細地描述了藥理學上可以接受的賦形劑、載體和輔助物質，在此通過引用被納入本申請中。
在組合物中也可包括核酸攝入和/或表達的某些促進劑(facilitator)(「轉染促進劑」，transfection facilitating agent)，例如促進劑如布比卡因(bupivacaine)、心臟毒素(cardiotoxin)和蔗糖，轉染易化載體如一般用於釋放核酸分子的脂質體製劑或脂質製劑。陰離子脂質體和中性脂質體來源廣泛，並且其可釋放核酸分子是廣為人知的(見如LiposomesA practical Approach，(1990)RPC New Ed.，IRL Press)。陽離子脂質製劑也是公知的用於釋放核酸分子的載體。合適的脂質製劑包括DOTMA(N-[1-(2，3-二油醯氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化胺，N-[1-(2，3-dioleyloxy)propyl]-N，N，N-trimethylammonium chloride)，其商品名為LipofectinTM，和DOTAP(1，2-二(油醯氧)-3-(三甲銨基)丙烷，1，2-bis(dioleoyloxy)-3-(trimethylammonio)propane)，見如Felgneret al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA847413-7416；Malone et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA866077-6081；美國專利No 5,283,185和5,527,928，和國際公布No WO90/11092、WO91/15501和WO95/26356。這些陽離子脂質可優選與中性脂質聯合使用，如DOPE(二油醯磷脂醯乙醇胺，dioleoyl phosphatidylethanolamine)。可加入上述脂質或脂質體製劑中的其他轉染促進組合物包括精胺衍生物(見如國際公布No.WO93/18759)和透膜化合物如GALA、短桿菌肽(Gramicidine S)和陽離子膽鹽(見如國際公布No.WO93/19768)。
或者，本發明的核酸分子可被包入、被吸入或結合至微粒載體。合適的微粒載體包括來源於聚甲基丙烯酸甲酯聚合物(polymethylmethacrylate polymer)的微粒載體，和來源於聚(丙交酯)(poly(lactide))和聚(丙交酯-乙交酯)(poly(lactide-co-glycolide))的PLG微粒。見如Jeffery et al.(1993)Pharm.Res.10362-368。也可使用其它微粒系統和聚合物，如聚合物如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸、精胺、亞精胺，和這些分子的綴合物。
組合物一旦形成，能通過諸多已知方法和技術釋放至受試者體內。例如，液體製劑可為可注射溶液、懸浮液或乳液，並使用普通針頭和注射器、或液體噴射注射系統，通過非腸道注射、皮下注射、皮內注射、肌肉注射、靜脈注射給藥。液體製劑也可局部給藥至皮膚或黏膜組織，或為磨碎的噴霧劑，適合用於呼吸或肺部給藥。其它給藥方式包括口服給藥、栓劑和主動或被動透皮釋放技術。
或者，組合物可離體給藥，如已知將轉化細胞釋放和重新植入受試者內(如葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉澱、電穿孔和直接顯微注射到細胞核)。
組合物以與藥劑相容劑量給藥給受試者，該劑量在預防和/或治療上是有效的。合適的有效劑量將會落入相對較寬的範圍內，但容易為本領域普通技術人員採用常規試驗測定。就測定所需劑量的目的而言，《醫師藥學參考書》(Physicians Desk Reference)和Goodman和Gilman的《治療的藥理學基礎》(The Pharmacological Basis ofTherapeutic)是有用的。例如，一般地，多核苷酸的有效劑量在大約0.001到1000μg，更優選在0.01到10.0μg的範圍內。
在一個實例中，本發明的核酸構建體可與另一個核酸構建體聯合使用。在某種情況下，核酸構建體可為本文所描述的一種表達佐劑的構建體，另外一種構建體可為編碼一個或多個抗原的構建體。在一個優選的實例中，兩種構建體均採用本發明的嵌合啟動子。
在一種構建體表達佐劑，另一種構建體表達一個抗原或多個抗原時，抗原可特別來自HSV或肝炎病毒(特別是B型肝炎病毒)。特別地，抗原可為HSV ICP0、ICP4、ICP22和/ICP 27抗原，並優選所有這四種。在這種抗原表達時，佐劑構建體特別表達LTA和/或LTB，並特別共同表達。
兩種構建體可分別、同時或連續給藥。這兩種構建體可在同一組合物或不同組合物中給藥。特別地，在一種構建體具有佐劑效應時，兩種構建體將被釋放，這樣可觀察到佐劑效應，即和若佐劑不與抗原一起給藥相比，佐劑和抗原一起給藥所形成的免疫應答增強和/或時間延長。在一個優選的實例中，兩種構建體在同一組合物中釋放，優選在相同的載體顆粒上。
在一個優選的實施方案中，使用顆粒介導的釋放技術將本發明的核酸構建體釋放給靶細胞。釋放核酸製劑的顆粒介導的方法為本領域所熟知。
採用各種本領域已熟知的技術，通過將本發明的核酸分子包被到載體顆粒(如核心載體)上可形成用於顆粒介導的釋放系統的顆粒。載體顆粒選自在顆粒大小範圍內具有合適密度的物質，該顆粒大小一般用於從顆粒介導的釋放裝置的細胞內釋放。一般地，載體顆粒的直徑為0.1到5μm，如0.5到3μm，優選1到2μm。最佳載體顆粒大小當然取決於靶細胞的直徑。或者，可使用膠體金顆粒，其中包被的膠體金被給藥(如注射)到組織(如皮膚或肌肉)，隨後被具有免疫能力的細胞攝入。
通常，載體顆粒選自惰性金屬。該金屬是惰性的是因為他們沒有生理學活性。基於本發明的目的，可使用鎢、金、鉑和銥載體顆粒。優選鎢和金顆粒。平均直徑為0.5到2.0μm的鎢顆粒易於得到。儘管這種顆粒在用於顆粒加速釋放方法中有著最佳密度，並為使用DNA進行高效包被提供可能，但是，鎢對於某些細胞類型具有潛在的毒性。金顆粒或微晶金(microcrystalline gold)(如金粉A1570，可從EngelhardCorp.獲得，East Newark，NJ)也發現可採用本方法使用。金顆粒大小均一(從Alpha Chemicals獲得，顆粒大小為1-3μm，或從Degussa，South Plainfield，NJ獲得，顆粒大小在一定範圍內，包括0.95μm)，並且降低了毒性。微晶金具有不同的顆粒大小分布，一般在範圍0.1-5μm間。但是，微晶金(microcrystalline gold)的不規則表面積為使用核酸高效包被提供了可能。
將DNA或RNA包被或沉澱在金或鎢顆粒上的多種方法為公知，並且已經進行了描述。一般地，其中大部分方法將質粒DNA、CaCl2和亞精胺結合在定量的金或鎢上。在包被處理過程中將產生的溶液一直攪拌以確保反應混合物的均一性。在核酸沉澱後，包被顆粒可轉移到合適的膜上並在使用前乾燥，然後包被到樣本模塊(sample module)或樣本盒(cassette)的表面，或負載到特別是用於顆粒介導的釋放裝置的釋放盒(delivery cassette)中。
或者，本發明的多核苷酸可製備成微粒組合物。使用上述標準藥理配方化學進行製備。例如，多核苷酸可結合一種或多種在藥理學上可接受的賦形劑或載體，以提供合適的組合物。然後，使用標準技術，如通過簡單蒸發(風乾)、真空乾燥、噴霧乾燥、冷凍乾燥(凍幹)、噴霧-冷凍乾燥、噴霧包被、沉澱、超臨界流體顆粒製備等，將製備得到的組合物製備成顆粒。如果需要，可使用在國際公布No.WO97/48485(通過引用納入本發明)中描述的技術將得到的顆粒緻密。
這些方法可用來獲得核酸顆粒，該核酸顆粒大小範圍在大約0.01到大約250μm，優選大約10到大約150μm，並最優選大約20到大約60μm；並且顆粒密度範圍在大約0.1到大約25g/cm3，堆密度在大約0.5到大約3.0g/cm3，或更大。
含核酸分子的顆粒一旦形成，可包裝到一單位劑量或多單位劑量的容器中。該容器可包含裝有合適量顆粒的密封緊密的容器。該顆粒可包裝成無菌製劑，因此，該密封緊密的容器可經專門設計，以使製劑在釋放給受試者之前保持其無菌性。該容器優選經改裝，以直接用於顆粒介導的釋放裝置。一般地，該容器為膠囊、鋁箔包裝(foil pouches)、囊劑、藥盒等形式。含合適劑量顆粒的顆粒釋放裝置可以預負載的形式提供。然後，預負載裝置也可在緊密封閉的容器中預先安裝。
包裝顆粒的容器可進一步標記，以識別組合物，並提供相關劑量信息。另外，容器可用標籤標記，該標籤的形式由政府機關，如食品藥品管理局規定，該標籤表明其中所裝的人用核酸製劑的使用或銷售得到製造業的聯邦法律下屬機構的許可。
適用於顆粒介導的釋放裝置的顆粒加速裝置已為本領域所熟知。例如，現在的基因槍裝置使用爆發性的、電的或氣體的釋放方法推進包被載體顆粒到靶細胞。包被載體顆粒能以可釋放的方式附著在可移動載體片層上，或以可除去的方式附著在氣流通過的表面上，將該顆粒抬離表面並加速到靶標。氣體釋放裝置的實例在美國專利No.5,204,253中描述。爆發型裝置在美國專利No.4,945,050中描述。適用於本文的電釋放裝置的實例在美國專利No.5,120,657中描述。另外一種電釋放裝置在美國專利No.5,149,655種描述。所有這些專利的公開以引用的方式全文納入本文。
顆粒也可使用無針注射裝置給藥，如在授權給Bellhouse等人的美國專利No.5,630,796(「the powderJectneedleless syringe device」)和國際公布No.WO 94/24263，WO 96/04947，WO 96/12513和WO96/20022中描述，並全部以引用的方式納入本文。
如在美國專利No.5,630,796中描述的裝置可為筆狀裝置，以從上到下的線性順序依次包括貯氣筒、顆粒盒或顆粒包，和與消聲器相連的超聲噴嘴。顆粒在合適的容器中，如由兩張可破聚合膜形成的盒，該聚合膜被熱封閉成一墊圈狀隔圈以形成完備的封閉單位。可選擇膜材料以獲得特定的開口模式和破裂壓力，這指明了超音流啟動的條件。
運行時，促使裝置將壓縮氣體從貯氣筒釋放到裝置內的膨脹室。被釋放的氣體與顆粒盒接觸，並在達到足夠壓力時，突然突破盒膜將顆粒導入超聲噴嘴用以隨後的釋放。噴嘴被設計以獲得特定的氣體速度和流動方式以釋放一定量顆粒到靶表面的預定區域。消聲器用來減弱由超聲氣流所產生的噪音。
國際公布No.WO 96/20022中所描述的釋放系統也使用壓縮氣體源的能量來加速和釋放粉狀組合物。但是，不同於美國專利No.5,630,796中的系統，它採用衝擊波代替氣體流加速顆粒。更具體地說，由衝擊波在彈性圓頂(flexible dome)後面所形成的瞬時壓力的升高撞擊圓頂的背部，在沿靶表面方向引起彈性圓頂的突然外翻。這種突然外翻效應以足夠的速度和動量發射出粉狀組合物(其位於圓頂的外側)，以穿透靶組織，如口腔黏膜組織。粉狀組合物在圓頂完全外翻瞬間釋放。該圓頂也完全包含高壓氣流，因此它並不與組織相接觸。由於氣體在該釋放操作中並不釋放，因此該系統在本質上是安靜的。這種設計可在其它密閉或其它非常敏感的應用中使用，例如以將顆粒釋放到最小受損的手術部位。
顆粒可在體內直接釋放給受試者，或體外釋放給來自受試者的細胞，然後將轉化細胞重新植入受試者。就在體內釋放而言，顆粒注射一般是皮下注射、表皮注射、皮內注射、黏膜內注射(如鼻腔注射、直腸注射和/或陰道注射)、腹膜內注射、靜脈注射、口腔注射或肌肉注射。優選地，釋放到最終分化的細胞；但是，顆粒也可釋放到未分化，或部分分化的細胞如血液和皮膚成纖維細胞的幹細胞。最優選地，釋放到皮膚表皮細胞。
顆粒以與劑量製劑相容的方式、並以在預防和/或治療上有效的劑量被釋放給受試者。該微粒組合物的「治療有效劑量」是指足夠治療或預防疾病或病症症狀，並將落入採用常規方法可測定的相對寬的範圍內。一般地，顆粒以每單位劑量0.001到1000μg，更優選0.01到10.0μg的核酸劑量釋放。但是，所需精確劑量根據接受治療的個體的年齡和全身狀況以及所選擇的具體核酸序列，以及其它因素的不同而不同。通過臨床檢測可非常容易確定合適的有效劑量。就確定所需含量而言，《醫師藥學參考書》和Goodman和Gilman的《治療的藥理學基礎》是有用的。
分析差異表達分析適當的元件有效性試驗可確定元件對多肽表達的影響。檢測元件有效性的比較基礎是「基本載體」，一般(除非另外提及)是指質粒，它含hCMV啟動子、hCMV外顯子1、hCMV外顯子2的9個鹼基、HBVpreS2的5』UTR和兔β-珠蛋白_聚腺苷酸化區，它位於驅動編碼序列表達處。一般地，基本載體是pJV7384、pJV7401、pJV7450或pJV7533。導入異源內含子和3』UTR，或將啟動子序列、外顯子、5』UTR和polyA位點導入基本載體中形成待測表達載體。因此，可檢測功能變體或片段。
基本載體和待測載體被轉化進入合適的宿主細胞和用於分析多肽表達水平的細胞中。優選地，使用哺乳動物宿主細胞。合適的細胞包括哺乳動物HEK 293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS細胞。
一般地，功能元件會產生與基本載體相當的表達量，如至少相同或更高。優選地，在一種以上細胞類型並使用一個以上編碼序列檢測表達。
提供了合適的實驗方法，例如下面的實施例1到13。
差異免疫原性分析若所表達的多肽為抗原，進行另一檢測以鑑定功能性構建體元件或特別優選的構建體元件。在此分析中，元件對免疫應答的影響在將表達載體釋放到待測機體後測定。針對抗原的抗體水平是判斷免疫應答的最為簡單的方式。將不同組次的小鼠用如上構建的基本載體或待測載體接種。在恰當的時間後收集血清並分析抗體水平。
該實驗進行了兩次，並用兩次實驗所有組次中獲得的抗體水平作坐標圖。和基本載體相比，在兩次實驗中，功能元件針對一特定抗原將產生至少相同或更高的抗體滴度。優選地，可使用一個以上抗原觀察到該結果，表明了在該表達系列中元件有效性的寬度。
提供了合適的實驗方法，如下面的實施例14。
C.實驗下面是實施本發明的具體實施方案的實施例。這些實施例僅供說明，並非意在以任何方式限制本發明的範圍。
已努力確保所使用的數字(如含量、溫度等)的準確性，但是毫無疑問也應允許某些實驗誤差和偏差。
方法標準PCR條件下面是用於構建載體的標準PCR條件1×PCR核心緩衝液w/1.5mM MgCl2(Promega Corporation，Madison，WI)，每種引物各0.400μM，每種dNTP(USB，Inc，Cleveland，OH)各200μM，2.5μTaq聚合酶(Promega Corporation，Madison，WI)，1.0ng模板DNA，加水到100μl，並用礦物油(Aldrich Chemical，Inc，Milwaukee，WI)覆蓋。PTC-200熱循環器(thermocycler)(MJ Research，Inc.Waltham，MA)被編程執行如下程序4』@95℃，30個循環(1』@95℃/1』15」@55℃/1』@72℃)，10』@72℃，4℃保持)。在限制性內切酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)剪切前，使用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen Inc，Valencia，CA)從PCR反應中取出擴增產物。
所有PCR產物在克隆後被測序以確定擴增的保真度。
實施例1.B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)載體系列的構建構建了許多表達HBsAg的質粒表達載體。
原材料(i)pWRG7128(Roy，M，et.al.Vaccine(2001)19764-778)，它含有hCMV立即早期啟動子序列，hCMV主要立即早期基因的第一外顯子、第一內含子和部分第二外顯子，含側翼區(來源於HBV preS25』UTR的序列和3′轉錄後應答元件)的HBsAg編碼序列和牛生長激素聚腺苷酸化區(BGHpA)。
(ii)pJV7284，pWRG7128的衍生物，它用兔β珠蛋白聚腺苷酸化區(RBGpA)替換BGHpA。
(a)pJV7384(CMV(無內含子)、HBV preS2 5』UTR和RBGpA)採用標準條件，用JF93(SEQ ID NO15)和F110(SEQ ID NO16)擴增pWRG7128，Sal 1和BamH 1剪切，以分離含CMV啟動子、外顯子1和部分外顯子2序列的插入片段。BamH 1和BstX 1剪切pAM6(ATCC，Mannassas，VA)，以分離含HBsAg 5』UTR和大概70％HBsAg編碼區的插入片段。Sal 1和BstX 1剪切pJV7284，以形成一載體片段，將兩個插入片段連接到該載體片段，得到pJV7293。
用引物GW1(SEQ ID NO17)和JF254(SEQ ID NO18)PCR擴增pWRG7128，並用BstX 1和Bgl2剪切以分離含HBsAg編碼區3』端的插入片段。BstX 1和Bgl2剪切pJV7293，以形成一載體片段，將插入片段連接到載體片段，得到載體pJV7384。
(b)pJV7382(CMV(無內含子)、HBsAg 3』UTR、HBV preS2 5』UTR和RBGpA)Xho 1和Xba 1剪切pJV7293，以形成含CMV啟動子/外顯子和具有HBsAg編碼序列5』端的5』-UTR的插入片段。Xba 1和Bcl 1剪切pWRG7128，以形成含大部分HBsAg編碼序列和其3』-UTR的插入片段。Xho 1和Bgl 2剪切pJV7284，以形成一載體片段，將兩個插入片段連接到該載體片段，得到載體pJV7382。
(c)pJV7389(CMV(RIA))、HBsAg 3』UTR、HBV preS2 5』UTR和RBGpA)使用引物GW150(SEQ ID NO19)和JF255(SEQ ID NO20)將大鼠胰島素內含子A(RIA)從質粒p5』rlns(來源未知)PCR擴增。BamH 1剪切PCR產物，並插入經BamH 1線性化的pJV7382，得到pJV7389。
(d)pJV7387(CMV(RIA))、HBV preS2 5』UTR和RBGpA)BstX 1和EcoR 1剪切pJV7384，以形成含HBsAg編碼區的3』端和RBGpA的插入片段。BstX 1和EcoR 1剪切pJV7389，以形成一載體片段，將插入片段連接到該載體片段，得到載體pJV7387。
實施例2.單純皰疹病毒糖蛋白D抗原(HSVgD)載體系列的構建構建了許多表達HSVgD的質粒表達載體。
原材料(a)pJV7334，pWRG7284(pJV 7284)的衍生物，緊鄰ATG起始密碼子下遊的框內Nhe 1置換HBsAg編碼序列，後繼帶有BamH1的填充片段，緊接HBC Enh的5』端。
(b)pWRG7202，含填充片段的pGem3Z(Promega)的衍生物，該填充片段為編碼序列融合到Nhe 1位點下遊的人組織纖溶酶原激活劑(TPA)信號肽提供了可能。
(a)pJV7392(CMV(天然內含子)、HBsAg 3』UTR、HBsAg 5』UTR和RBGpA)用引物DS1(SEQ ID NO21)和DA1(SEQ ID NO22)從病毒DNA原種(Adcanced Biotech，Inc，Columbia，MD)PCR擴增HSV2gD的編碼區，並用Nhe 1和EcoR 1剪切，以形成一插入片段。Nhe 1和EcoR 1剪切pJV7202，以形成一載體片段，將插入片段連接到該載體片段，產生載體pJV7391。
Nhe 1和Bgl 2剪切pJV7391，以形成含HSV2gD編碼序列的插入片段。Nhe 1和BamH 1剪切pJV7334，以形成一載體片段，將插入片段連接到該載體片段，產生載體pJV7392。該載體由下列表達元件組成hCMV立即早期啟動子序列，hCMV主要立即早期基因的第一外顯子、第一內含子和部分第二外顯子，HBsAg 5』-UTR、HSV2gD基因的編碼序列、HBsAg 3』-UTR和RBGpA。
(b)pJV7399(CMV(無內含子)、HBsAg 3』UTR、HBsAg 5』UTR和RBGpA)按如下方法構建無內含子的pJV7392。Hind 3和Nde 1剪切pJV7384，以分離含卡那黴素抗性基因5』端和CMV啟動子的插入片段。Nde 1和Ssp 1剪切pJV7384，以分離含CMV啟動子3』端、CMV外顯子1/2和HBsAg 5』-UTR的5』端的插入片段。該插入片段插入pJV7392中，並且除去Hind 3-Ssp 1片段，得到pJV7399。
(c)pJV7400(CMV(RIA)、HBsAg 3』UTR、HBsAg 5』UTR和RBGpA)按如下方法構建含RIA的pJV7392。Hind 3和Nde 1剪切pJV7384，以分離含卡那黴素抗性基因5』端和CMV啟動子的插入片段。Nde 1和Ssp 1剪切pJV7387，以分離含CMV啟動子3』端、CMV外顯子1/2(部分)、RIA和HBsAg 5』-UTR 5』端的插入片段。該插入片段插入pJV7392中，並且除去Hind 3-Ssp 1片段，得到pJV7400。
(d)pJV7401(CMV(無內含子)、HBsAg 5』UTR和RBGpA)按如下方法構建無3』-UTR的pJV7399。Bsp 120I和Bgl 2剪切pJV7391，以分離含HSV2 gD基因的3』端的插入片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7284，以分離RBGpA信號。該插入片段插入pJV7399中，並且除去Bsp 120I-EcoR 1片段，得到pJV7401。
(e)pJV7402(CMV(RIA)、HBsAg 5』UTR和RBGpA)按如下方法構建無3』-UTR的pJV7400。Bsp 1201和Bgl 2剪切pJV7391，以分離含HSV2 gD基因3』端的插入片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7284，以分離RBGpA信號。該插入片段連接到pJV7400中，並且除去Bsp 120I-EcoR 1片段，得到pJV7402。
實施例3.Flu M2抗原載體系列的構建(a)pJV7450(CMV(無內含子)、HBsAg 5』UTR和RBGpA)使用引物JF301(SEQ ID NO23)和JF302(SEQ ID NO24)從質粒pFL-M2(Joel Haynes，PJV)PCR擴增Flu M2編碼區，並用Nhe 1和Bgl2剪切，以形成一插入片段。Nhe 1和Bgl2剪切pJV7401，以形成一載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7450。
(b)pJV7452(CMV(無內含子)、HBsAg 3』UTR、HBsAg 5』UTR和RBGpA)
使用引物JF84(SEQ ID NO25)和JF225(SEQ ID NO26)從pJV7389 PCR擴增3』UTR片段，Bsp 120I剪切、T4 DNA聚合酶填充，Bgl 2接頭(cat# 1036，New England Biolabs)連接。Bgl2和EcoR1剪切該片段，以分離含HBsAg 3』UTR和RBGpA區的插入片段。Bgl2和EcoR1剪切pJV7450，以形成一載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7452。
(c)pJV7458(CMV(RIA)、HBsAg 5』UTR和RBGpA)按如下方法構建含RIA的pJV7450BamH 1剪切pJV7389，以分離含RIA的插入片段。BamH 1剪切pJV7450，以形成載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7458。
(d)pJV7468(CMV(RIA)、HBsAg 3』UTR、HBsAg 5』UTR和RBGpA)按如下方法構建含HBsAg 3』UTR的pJV7458。Bgl2和EcoR1剪切pJV7452，以製備含HBsAg 3』UTR和RBGpA的插入片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7458，以形成一載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7468。
實施例4.β-gal載體系列的構建(a)pJV7488(CMV(無內含子)、HBsAg 3』UTR、HBsAg 5』UTR和RBGpA)使用引物JF335(SEQ ID NO27)和JF336(SEQ ID NO28)擴增CMV-(Clontech)，並用Nhe 1和Bgl 2剪切，以分離編碼β-半乳糖苷酶的插入片段。Nhe 1和Bgl 2剪切pJV7452，以形成一載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7488。
(b)pJV7533(CMV(無內含子)、HBsAg 5』UTR和RBGpA)Bgl2和EcoR 1剪切pJV7450，以分離含RBGpA的插入片段。Bgl2和EcoR 1剪切pJV7488，以形成一載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7533。
(c)pJV7551(CMV(RIA/Nhel)、HBsAg 3』UTR、HBsAg 5』UTR和RBGpA)Xho 1和BamH 1剪切pJV7530(見實施例5)，以分離含穿過RIA的CMV啟動子的插入片段。Xho 1和BamH 1剪切pJV7488，以形成一載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7551。
(d)pJV7552(CMV(RIA/Nhel)、HBsAg 5』UTR和RBGpA)Xho 1和BamH 1剪切pJV7530，以分離含穿過RIA的CMV啟動子的插入片段。Xho 1和BamH 1剪切pJV7533，以形成一載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7552。
實施例5.pJV表達載體(pJV7563)的構建(a)pJV7496使用引物JF357(SEQ ID NO29)和JF365(SEQ ID NO30)PCR擴增pJV7389，T4 DNA聚合酶處理鈍化末端，Sal 1剪切，以分離編碼卡那黴素抗性基因的插入片段。Ava 1剪切pJV7389，T4 DNA聚合酶處理鈍化末端，Sal 1剪切，以分離一載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7496。
(b)pJV7530使用引物JF393(SEQ ID NO31)和JF406(SEQ ID NO32)PCR擴增pJV7389，Bgl2和BamH 1剪切，以分離含RIA(缺失內部Nhe1位點)的插入片段。BamH 1剪切pJV7496，以製備一載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7530。
(c)pJV7549BamH 1和EcoR5剪切pJV7468，以分離含M2和部分HBV 3』ENH的插入片段。BamH 1和EcoR5剪切pJV7530，以製備一載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7549。
(d)pJV7563將引物JF256(SEQ ID NO33)和JF257(SEQ ID NO34)退火以製備由多克隆位點組成的插入片段。Nhe 1和Bgl2剪切pJV7549，以製備一載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7563。圖12示出pJV7563質粒圖譜。圖13給出質粒pJV7563的鹼基組成。質粒pJV7563中的元件及其位置如下所示1-44轉座子903序列45-860來自轉座子903的卡那黴素抗性編碼序列861-896轉座子903序列897-902 Sal1位點903-1587 CMV啟動子1588-1718來自CMV立即早期基因的非翻譯前導序列1719-1724 BamH1和Bglll限制性酶的融合1725-1857大鼠胰島素內含子A1858-1863 BamH1位點1864-1984 HBV表面抗原5』非翻譯前導序列1985-1993合成起始密碼子/Nhe1克隆位點1994-2011合成克隆位點2012-2544 HBV增強子2545-2555原載體序列。NCBI資料庫中沒有命中結果2556-2686兔β-珠蛋白聚腺苷酸化區2687-3759 pUC19載體序列實施例6.使用人分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)和人IgG Fc片段(hFc)作為模型抗原，構建信號肽表達載體系列(i)pJV7507(hTPAsp和SEAP)使用引物JF320(SEQ ID NO35)和JF321(SEQ ID NO36)PCR擴增pSEAP-Basic(Clontech)，Nhe 1和Bgl 2剪切，以分離由人SEAP片段組成的插入片段。Nhe 1和Bgl 2剪切pJV7079(Macklin，et.al.)，以製備一載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7507。
(ii)pJV7508(hTPAsp和hFc)使用引物JF386(SEQ ID NO37)和FcAS(SEQ ID NO38)PCR擴增人DNA，Nhe 1和Bgl 2剪切，以分離由人IgG Fc片段組成的插入片段。Nhe 1和Bgl 2剪切pJV7079，以製備一載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7508。
(iii)抑肽酶信號肽編碼序列的製備使用引物JF355(SEQ ID NO40)和JF356(SEQ ID NO41)PCR擴增合成的寡核苷酸JF354(SEQ ID NO39)，以形成抑肽酶信號肽的編碼序列。
(iv)菸草伸展蛋白信號肽編碼序列的製備使用引物JF349(SEQ ID NO43)和JF350(SEQ ID NO44)PCR擴增合成的寡核苷酸JF348(SEQ ID NO42)，以形成菸草伸展蛋白信號肽的編碼序列。
(v)雞溶菌酶信號肽編碼序列的製備使用引物JF352(SEQ ID NO46)和JF353(SEQ ID NO47)PCR擴增合成的寡核苷酸JF351(SEQ ID NO45)，以形成雞溶菌酶信號肽的編碼序列。
(a)Flu M2抗原信號肽系列pJV7499(CMV(無內含子)、HBsAg5』UTR、RBGpA、抑肽酶信號肽)pJV7497(CMV(無內含子)、HBsAg5』UTR、RBGpA、菸草伸展蛋白信號肽)pJV7500(CMV(無內含子)、HBsAg5』UTR、RBGpA、雞溶菌酶信號肽)SPe 1和Nhe 1剪切信號肽編碼序列，以分離插入片段。Nhe 1剪切pJV7450，以製備載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7499(抑肽酶)、pJV7497(菸草伸展蛋白)和pJV7500(雞溶菌酶)。
(b)SEAP信號肽系列pJV7513(CMV(無內含子)、HBsAg5』UTR、RBGpA、抑肽酶信號肽)pJV7512(CMV(無內含子)、HBsAg5』UTR、RBGpA、菸草伸展蛋白信號肽)pJV7510(CMV(無內含子)、HBsAg5』UTR、RBGpA、雞溶菌酶信號肽)Xho 1和Nhe 1剪切pJV7499、7497和7500，以分離由穿過質粒的信號肽編碼序列的CMV啟動子組成的插入片段。Xho 1和Nhe 1剪切pJV7507，以製備載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7513(抑肽酶)、pJV7512(菸草伸展蛋白)和pJV7510(雞溶菌酶)。
(c)hFc信號肽系列pJV7524(CMV(無內含子)、HBsAg5』UTR、RBGpA、抑肽酶信號肽)pJV7525(CMV(無內含子)、HBsAg5』UTR、RBGpA、菸草伸展蛋白信號肽)pJV7526(CMV(無內含子)、HBsAg5』UTR、RBGpA、雞溶菌酶信號肽)Xho 1和Nhe 1剪切pJV7499、7497和7500，以分離由穿過質粒的信號肽編碼序列的CMV啟動子組成的插入片段。Xho 1和Nhe 1剪切pJV7508，以製備載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7524(抑肽酶)、pJV7525(菸草伸展蛋白)和pJV7526(雞溶菌酶)。
實施例7.人分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)系列的構建(a)pJV7531(CMV(無內含子)、HBsAg5』UTR、RBGpA、雞溶菌酶信號肽)Sal 1和Bgl 2剪切pJV7510，以分離含穿過溶菌酶信號肽的CMV啟動子的插入片段。Sal 1和Bgl 2剪切pJV7450，以形成載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7531。
(b)pJV7554(CMV(RIA/Nhe1)、HBsAg5』UTR、RBGpA、雞溶菌酶信號肽)Xho 1和BamH 1剪切pJV7530，以分離含穿過RIA的CMV啟動子的插入片段。Xho 1和BamH 1剪切pJV7531，以形成載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7554。
(c)pJV7568(CMV(無內含子)、HBsAg 3』UTR、HBsAg5』UTR、RBGpA、雞溶菌酶信號肽)Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7563，以分離含HBV 3』UTR和RBGpA的插入片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7531，以形成載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7568。
(d)pJV7572(CMV(RIA/Nhel)、HBsAg 3』UTR、HBsAg5』UTR、RBGpA、雞溶菌酶信號肽)Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7563，以分離含HBV 3』UTR和RBGpA的插入片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7554，以形成載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7572。
實施例8.使用雞角蛋白和雞心臟的肌動蛋白內含子構建β-gal和HBsAg載體(a)pJV7557(β-gal、CMV(cA內含子)、HBsAg3』UTR、HBsAg5』UTR和RBGpA)使用引物JF430(SEQ ID NO48)和JF442(SEQ ID NO49)PCR擴增雞DNA，Bgl 2和BamH 1剪切，以分離由雞心臟的肌動蛋白的內含子和側翼外顯子序列組成的插入片段。BamH 1剪切pJV7488，以製備載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7557。
(b)pJV7558(β-gal、CMV(cK內含子)、HBsAg3』UTR、HBsAg5』UTR和RBGpA)使用引物JF421(SEQ ID NO50)和JF444(SEQ ID NO51)PCR擴增雞DNA，Bgl 2和BamH 1剪切，以分離由雞角蛋白基因的內含子和側翼外顯子序列組成的插入片段。BamH 1剪切pJV7488，以製備載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7558。
(c)pJV7578(HBsAg、CMV(cA內含子)、HBsAg3』UTR、HBsAg5』UTR和RBGpA)Sal 1和BamH 1剪切pJV7557，以分離由穿過內含子區的CMV啟動子組成的插入片段。Sal 1和BamH 1剪切pJV7496，以製備載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7558。
(d)pJV7579(HBsAg、CMV(cA內含子)、HBsAg3』UTR、HBsAg5』UTR和RBGpA)Sal 1和BamH 1剪切pJV7558，以分離由穿過內含子區的CMV啟動子組成的插入片段。Sal 1和BamH 1剪切pJV7496，以製備載體片段，插入片段連接到其中，得到pJV7579。
實施例9.HBsAg載體系列抗原表達的離體分析在第一天，SCC15(ATCC)或B16(來源未知，ATCC可得)細胞以20％-40％匯合(confluency)接種到6孔組織培養板，並在培養箱中過夜生長。宿主細胞在ATCC推薦的培養液中增殖。
在第二天，實施轉染反應。對每種待測載體而言，將20μlLipofectin試劑(Life Technologies Inc，Grand Island，NY)加入180μl Optimem培養液(Life Technologies Inc，Grand Island，NY)，並在室溫下孵育45min。對每種待測載體，在40min時，2μg載體與200μl Optimem混合。在45min時，將載體和Lipofection溶液混合在一起，並在室溫下再靜置10分鐘。在最後孵育期間，將接種的宿主細胞從培養箱中取出並用Optimem培養液洗滌兩次。在10min時，將1.6mlOptimem加入Lipofectin/載體混合物，並將1ml所得混合物加到兩個細胞孔中。將宿主細胞再次放入培養箱並靜置5小時，在5小時時，去除Lipofectin/載體混合物，並換上標準細胞生長液。
在更換培養液後18到24小時，從組織培養板中取出從50到100μl的細胞生長液，將該樣本放入AUSZYMEMonoc Ional診斷試劑盒(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)中的反應池，分析抗原表達水平。待測樣本的體積用PBS調至200μl，然後每個樣本中加入50μl綴合物和反應微球。反應池在40℃孵育80min，此後，洗去孔中所有液體反應組分。將反應微球轉移到新的試管中，此後加入300μl顯色反應緩衝液。30分鐘後加入1M硫酸終止顯色反應，並在490nm測定反應的吸光度。圖1中示出的數據是兩次實驗中兩個孔的平均吸光度。
如圖1所示，將RIA、HBV 3』UTR或兩者共同導入基本載體(CMV啟動子、外顯子和聚腺苷酸化區)提高了SCC15細胞中HBsAg的表達。如圖2所示，將雞角蛋白或雞心臟的肌動蛋白內含子導入基本載體(CMV啟動子、外顯子、HBV 3』UTR和聚腺苷酸化區)提高了SCC15細胞中HBsAg的表達。
實施例10.β-gal載體系列抗原表達的離體分析如實施例9所述，轉染SSC-15或B16宿主細胞。
在更換培養液後的18到40小時，去除培養液上清，並用PBS洗滌細胞。去除洗滌液後，用500μl裂解緩衝液(50mM NaPO4、0.1％Triton X-100，pH7)孵育細胞5min，以裂解細胞，然後採用物理方法將細胞刮離塑料皿。將裂解液離心兩分鐘以除去細胞碎片，並將10到25μl澄清裂解液加入到500μl反應緩衝液(80ug/ml鄰硝基苯-吡喃半乳糖苷(o-nitrophenyl galactopyranoside)、50mM NaPO4，pH7)並在37℃孵育10到20分鐘。加入500μl 1M Na2CO3中止反應並在405nm讀取吸光度。數據用增強載體(含有內含子、HBVenh或兩者均含有)的表達量與基本載體的表達量的比率表示。
RIA、HBV 3』UTR或兩者共同加入基本載體(CMV啟動子、外顯子和聚腺苷酸化區)提高了β-gal在兩種細胞系中的表達。圖3示出了SCC15細胞得到的結果。將雞角蛋白或雞心臟的肌動蛋白內含子加到基本載體(CMV啟動子、外顯子、HBV 3』UTR和聚腺苷酸化區)提高了β-gal在兩種細胞系中的表達。圖2示出了B16細胞得到的結果。
實施例11.HSV gD載體系列抗原表達的離體分析如實施例9所述，轉染SSC15或B16宿主細胞。轉染18小時後，將板冰浴15min。然後用2ml PBS(Biowhittaker，Walkwille，MD)洗滌各孔。0.05％ PBS稀釋的戊二醛(Polysciences Inc，Warrington，PA)固定細胞，並在室溫下孵育30min。隨後所有的孵育在室溫下持續1小時並在每次孵育之間，進行如上所述的洗滌。用2ml 5％奶粉(溶於PBS)(Bio Rad Laboratories，Melville，NY)封閉板中的細胞。隨後用2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20(Sigma，St.Louis，MO)1∶1000稀釋的抗gD單克隆抗體(ABI，Columbia，MD)1ml和用PBS/0.1％Tween-20 1∶2500稀釋的山羊抗小鼠HRP(KPL，Gaithersburg，MD)1ml孵育。用1ml TMB微孔底物(BioFX，OwingsMills，MD)進行顯色反應。1M H2SO4終止反應，將液體轉移到塑料比色皿中並在450nm讀取光密度值。數據用增強載體(含有內含子、HBVenh或兩者均含有)的表達量與基本載體的表達量的比率表示。
將含或不含HBV 3』UTR的RIA導入到基本載體(CMV啟動子、外顯子和聚腺苷酸化區)，提高了HSV gD在兩種細胞中的表達。圖4示出了SC15得到的結果。
實施例12.SEAP載體系列抗原表達的離體分析如實施例9所述，轉染SSC-15或B16宿主細胞。在更換培養液後18到40小時，去除培養液上清，並將上清在70℃加熱30min。將10-25μl熱滅活的上清與1/10體積的100mM I-高精氨酸一起孵育5min。將500μl鹼性磷酸酶反應緩衝液(cat#172-1063，Bio-Rad，根據說明書製備)加入該裂解液並在37℃孵育10到20min。加入500μl 1M NaOH終止反應並在405nm讀取吸光度。數據用增強載體(含有內含子、HBVenh或兩者均含有)的表達量與基本載體的表達量的比率，或實驗組信號肽的表達量與人TPA信號肽載體的表達量的比率表示。
如圖5所示，RIA、HBV 3』UTR或兩者一起導入基本載體(CMV啟動子、外顯子和聚腺苷酸化區)提高了SEAP在B16細胞中的表達。出乎意料的是，僅僅將HBV 3』UTR導入基本載體(CMV啟動子、外顯子和聚腺苷酸化區)提高了SEAP在SCC15細胞中的表達。
將牛抑肽酶、雞溶菌酶或菸草伸展蛋白的信號肽加入到成熟的SEAP的N端，為SEAP有效分泌進入兩種細胞系的細胞培養液上清提供了可能。圖6示出B16細胞的結果。
實施例13.人IgG Fc片段信號肽系列抗原表達的離體分析如實施例9所述，轉染SSC-15或B16宿主細胞。在更換培養液後的18到40小時，去除培養液上清。
ELISA板(Costar)每孔加入100μl山羊抗人IgG(Sigma#I3382，用碳酸鹽包被緩衝液1/1000稀釋)，並在4℃過夜孵育。隨後所有的孵育均在室溫下持續1小時，並在每次孵育之間用洗滌液(10mM Tris、150mM NaCl、0.1％Brij-35，pH8.0)洗滌。然後用100μl 5％奶粉(溶於PBS)封閉，隨後與用稀釋緩衝液(2％奶粉、PBS、0.05％Tween-20)系列稀釋的培養液上清一起孵育。然後與100μl每孔的山羊抗人IgG/HRP(Sigma#A6029，稀釋緩衝液1/5000稀釋)一起孵育，然後用100μl TMB微孔底物進行顯色反應。用100μl 1M H2SO4終止反應，並在405讀取吸光度。數據用實驗組信號肽的表達量與人TPA信號肽載體的表達量的比率表示。
將牛抑肽酶、雞溶菌酶或菸草伸展蛋白的信號肽加入到人Fc片段的N端，為hFc有效分泌進入兩種細胞系的細胞培養液上清提供了可能。圖6示出B16細胞的結果。
實施例14.HBsAg、HSVgD和Flu-M2質粒表達載體在小鼠的免疫接種中的應用a.免疫接種藥筒的製備對每個待測質粒而言，稱取25mg 2微米金粉到離心管中，在加入250μl等份50mM亞精胺(Aldrich Chemical，Inc，Milwaukee，WI)後，振蕩試管並經短時間的超聲破碎。離心去除金粉，換上100μl新鮮的亞精胺。振蕩使金粉重新懸浮，然後將25μg DNA加入試管中混合。邊輕輕振蕩試管，邊加入100μl 10％CaCl2(Fujisawa USA，Inc，Deerfield，IL)，以在金珠上沉澱DNA。沉澱反應可在工作檯面上進行10min，隨後通過短時間離心收集金珠並用無水乙醇(SpectrumQuality Products，Inc，Gardena，CA)洗滌三次，以除去過量的沉澱試劑。然後用溶於無水乙醇的3.6ml 0.05mg/ml聚乙烯吡咯烷酮(360KD，Spectrum Quality Products，Inc，Gardena，CA)重懸洗滌後的金珠/DNA複合物。然後將此漿液注入位於旋管器(tube turner，PowderJect Vaccines)中的Tefzel管(McMaster-Carr，Chicago，IL)中，用金珠/DNA複合物包被Tefzel管內側。在旋管過程完成後，試管被切成0.5」的疫苗「針劑」，該針劑被負載於XR1裝置(PowderJectVaccines)中，以釋放給小鼠。
b.接種程序用Ketaset(Fort Dodge)和Rompun(Bayer)的混合物麻醉4到6周齡的小鼠。用電動剪毛機剃腹部以除去體毛，通過XR1裝置(450psi)將兩個疫苗「針劑」無交疊地釋放到剃毛區。將動物放回籠中並在接種後6周採血。Balb/c小鼠用於評估HBsAg表達載體，SwissWebster小鼠用於評估HSV-gD和Flu M2表達載體。
血清中抗-HBsAg抗體的分析在第六周從接種動物獲取血樣。將從血樣中分離的血清放入AUSABEIA診斷試劑盒(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)的反應池的孔中。所加血清的體積取決於樣本的抗體滴度，將樣本用樣本稀釋緩衝液稀釋以落入用定量分析板可獲得的值內。從AUSAB定量分析板(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)每個小瓶中取出200μl加入到反應池的孔中。每孔中加入一個微球，隨後密封反應池並在40℃孵育二小時，然後洗去孔中所有的液體反應組分。每孔加入200μl綴合物混合物，隨後密封反應池並在40℃孵育二小時，然後洗去孔中所有的液體反應組分。珠被轉移到新的試管，隨後加入300μl顯色反應緩衝液。30分鐘時加入1M硫酸終止顯色反應，並用Quantum II分光光度計(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)490nm檢測反應物的吸光度。通過將樣本的吸光度與由定量板產生的標準曲線相比較，分光光度計可以計算樣本的抗體水平。然後用稀釋因子矯正抗體水平。圖7所示數據是用某一特定載體接種的所有動物的幾何平均滴度。
血清中抗Flu M2抗原抗體的分析用濃度為1μg/ml的合成Flu M2肽(QCB/Biosource，Hopkinton，MA)(溶於PBS(Biowhittaker，Walkerville，MD))包被96孔Costar培養液結合ELISA板(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，並在4℃過夜孵育。10mM Tris(Sigma，St.Louis，MO)/150mM NaCl(FisherScientific)/0.1％Brij-35(Sigma)將板洗滌三次，然後用5％奶粉(BioRad Laboratories，Melville，NY)(溶於PBS)室溫封閉1小時。隨後所有的孵育均在室溫下進行1小時，並如上所述在每次孵育之間洗滌。2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20(Sigma)稀釋樣本小鼠血清、標準品(高滴度，抗M2小鼠血清)和陰性對照(抗HBsAg小鼠血清)，並在ELISA板中孵育。用2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20 1∶8000稀釋山羊抗小鼠IgG(H+L)生物素綴合的抗體(Southern BiotechnologyAssociate，Birmingham，AL)，隨後用PBS/0.1％Tween-20 1∶8000稀釋鏈黴親和素-辣根過氧化物酶綴合物(Southern Biotechnology)。用底物TMB(BioFX，Owings Mills，MD)進行顯色反應。用1M H2SO4終止反應並用超精酶標儀(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在450nm讀取吸光度。使用SoftMax Pro 4.1軟體(Molecular Devices)，四參數分析計算端點滴度，並將滴度根據具有已知滴度的標準血清進行標準化，以將組間和組內的變異最小化。結果如圖7所示。
血清中抗HSV gD抗原抗體的分析用濃度為1μg/ml的HSV gD(Viral Therapeutics，Ithaca，NY)蛋白(溶於PBS(Biowhittaker，Walkerville，MD))包被96孔Costar培養液結合ELISA板(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，並在4℃過夜孵育。10mM Tris(Sigma，St.Louis，MO)/150mM NaCl(FisherScientific)/0.1％Brij-35(Sigma)將板洗滌三次，然後用5％奶粉(BioRad Laboratories，Melville，NY)(溶於PBS)室溫封閉1小時。隨後所有的孵育均在室溫下進行1小時，並如上所述在每次孵育之間洗滌。2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20(Sigma)稀釋樣本小鼠血清、標準品(高滴度，抗gD小鼠血清)和陰性對照(抗HBsAg小鼠血清)，並在ELISA板中孵育。用2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20 1∶8000稀釋山羊抗小鼠IgG(H+L)生物素綴合的抗體(Southern BiotechnologyAssociate，Birmingham，AL)，隨後用PBS/0.1％Tween-20 1∶8000稀釋鏈黴親和素-辣根過氧化物酶綴合物(Southern Biotechnology)。用底物TMB(BioFX，Owings Mills，MD)進行顯色反應。用1M H2SO4終止反應並用超精酶標儀(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在450nm讀取吸光度。使用SoftMax Pro 4.1軟體(Molecular Devices)，四參數分析計算端點滴度，並將滴度根據具有已知滴度的標準血清進行標準化，以將組間和組內的變異最小化。結果如圖7所示。
因此，描述了新的核酸構建體、含有這些構建體的組合物以及使用這些組合物的核酸免疫接種技術。儘管本發明的優選的實施方案已經詳細描述，應該理解的是可進行明顯的修改，但並不背離本發明的宗旨以及所附權利要求書中所定義的本發明的範圍。
序列表110寶德傑克特疫苗有限公司等120核酸構建體130N.90070A GCW/DP140PCT/GB2004/0042791412004-10-11150US 60/509,9361512003-10-1016053170PatentIn version 3.12101211685212DNA213人巨細胞病毒4001aatattggct attggccatt gcatacgttg tatctatatc ataatatgta catttatatt60ggctcatgtc caatatgacc gccatgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa120tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg180gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg240tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta300cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtcc gccccctatt360gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttacgggac420tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt480tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac540cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt600cgtaataacc ccgccccgtt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat660ataagcagag ctcgtttagt gaacc 6852102211131212DNA213人巨細胞病毒4002gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc60gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg120actcaccgtc c 1312103211135212DNA213大鼠(Rattus rattus)4003atcagcaagc aggtatgtac tctccagggt gggcctggct tccccagtca agactccagg60gatttgaggg acgctgtggg ctcttctctt acatgtacct tttgctagcc tcaaccctga120ctatcttcca ggtca 1352104211955212DNA213人工序列
220
223嵌合啟動子序列4004aatattggct attggccatt gcatacgttg tatctatatc ataatatgta catttatatt60ggctcatgtc caatatgacc gccatgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa120tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg180gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg240tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta300cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtcc gccccctatt360gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttacgggac420tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt480tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac540cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt600cgtaataacc ccgccccgtt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat660ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt720gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg gccgggaacg gtgcattgga780acgcggattc cccgtgccaa gagtgactca ccgtccggat ctcagcaagc aggtatgtac840tctccagggt gggcctggct tccccagtca agactccagg gatttgaggg acgctgtggg900ctcttctctt acatgtacct tttgcttgcc tcaaccctga ctatcttcca ggtca 9552105211121212DNA213B型肝炎病毒4005cagagtcagg ggtctgtatt ttcctgctgg tggctccagt tcaggaacag taaaccctgc60tccgaatatt gcctctcaca tctcgtcaat ctccgcgagg actggggacc ctgtgacgaa120c121210621157212DNA213單純皰疹病毒4006ataagctgca ttgcgaacca ctagtcgccg tttttcgtgt gcatcgcgta tcacggc 57210721148212DNA213B型肝炎病毒4007ctttgtacta ggaggctgta ggcataaatt ggtctgttca ccagcacc 482108211533212DNA213B型肝炎病毒4008taacaaaaca aaaagatggg gttattccct aaacttcatg ggttacgtaa ttggaagttg60ggggacattg ccacaagatc atattgtaca aaagatcaaa cactgtttta gaaaacttcc120tgtaaacagg cctattgatt ggaaagtatg tcaaaggatt gtgggtcttt tgggctttgc180tgctccattt acacaatgtg gatatcctgc cttaatgcct ttgtatgcat gtatacaagc240taaacaggct ttcactttct cgccaactta caaggccttt ctaagtaaac agtacatgaa300
cctttacccc gttgctcggc aacggcctgg tctgtgccaa gtgtttgctg acgcaacccc360cactggctgg ggcttggcca taggccatca gcgcatgcgt ggaacctttg tggctcctct420gccgatccat actgcggaac tcctagccgc ttgttttgct cgcagccggt ctggagcaaa480gctcatagga actgacaatt ctgtcgtcct ctcgcggaaa tatacatcgt ttc 5332109211158212DNA213猿巨細胞病毒4009gtcagacaga cagacagtta tatgggctgg tccctataac tctgccattg taaccccata60tagccagaca gttagcattg catctattga tgatgtacta atgtattgta acccccccta120tgccattgtc taactgtact aatgtatgat attatacc15821010211131212DNA213家兔(Oryctolagus cuniculus)40010gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact60tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc120tcactcggaa g 13121011211204212DNA213猿巨細胞病毒40011atatatactc tatgttatac tctatgatat acaatatata ctcatgaaca ctatgtactt60ggtgtatgac tcattattgt ctgggacttg gttgggactt ggttggttgg gaagaatgtt120gtgcctgtac ttgtgctgtg ctgtggatct caataaatgt gactatgttc aaaacactaa180gtgcccccgt gtcttcttta acta 20421012211163212DNA213單純皰疹病毒240012gaagacgagc tctaagggag gggaggggag ctgggcttgt gtataaataa aaagacaccg60atgttcaaaa atacacatga cttctggtat tgttttgcct tggtttttat ttgggggggg120gggggcgtgt gactagaaaa acaaatgcag acatgtgcta acg 16321013211191212DNA213人乳頭狀瘤病毒16型40013aattgttaca tataattgtt gtataccata acttactatt ttttcttttt tattttcata60tataattttt ttttttgttt gtttgtttgt tttttaataa actgttatta cttaacaatg12cgacacaaac gttctgcaaa acgcacaaaa cgtgcatcgg ctacccaact ttataaaaca180tgcaaacagg c 191
210142113759212DNA213人工序列220
223pJV表達載體220
221內含子222(1725)..(1857)223大鼠胰島素內含子A220
221misc_feature222(1)..(44)223Tn903，pUC4K殘餘220
221misc_feature222(861)..(896)223Tn903，pUC4K殘餘220
221misc_feature222(897)..(902)223pUC19 MCS220
221聚腺苷酸化—信號222(2556)..(2686)223rGLOB pA220
221聚腺苷酸化_位點222(2647)..(2647)223聚腺苷酸化_位點_1220
221啟動子222(903)..(1587)223CMV Pro220
2213』UTR222(2012)..(2544)223HBVenh220
2215』UTR222(1864)..(1984)223HBV pre-S2 5』-UTR220
221misc_feature222(1719)..(1724)223Bam/Bgl融合物220
221misc_feature222(1985)..(1987)223ATG-Nhe
220
221misc_feature222(1988)..(2011)223CDS插入位點220
221misc_feature222(2545)..(2555)223未知220
221外顯子222(1588)..(1718)223CMV外顯子1/2220
221misc_feature222(2693)..(3759)223pUC19220
221misc_feature222(45)..(860)223KanR(Tn903)互補物40014ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg60agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa120agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc180tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg240tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat300ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca360tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga420aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg480aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg540aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata600aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca660tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg720ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat780ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt840tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacaggtcg900acaatattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata960ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt1020aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta1080cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga1140cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt1200tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta1260ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg1320actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt1380tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc1440accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat1500gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct1560atataagcag agctcgttta gtgaacc gtc aga tcg cct gga gac gcc atc cac1614Val Arg Ser Pro Gly Asp Ala Ile His1 5gct gtt ttg acc tcc ata gaa gac acc ggg acc gat cca gcc tcc gcg 1662Ala Val Leu Thr Ser Ile Glu Asp Thr Gly Thr Asp Pro Ala Ser Ala10 15 20 25
gcc ggg aac ggt gca ttg gaa cgc gga ttc ccc gtg cca aga gtg act 1710Ala Gly Asn Gly Ala Leu Glu Arg Gly Phe Pro Val Pro Arg Val Thr30 35 40cac cgt cc ggatctcagc aagcaggtat gtactctcca gggtgggcct ggcttcccca1768His Arggtcaagactc cagggatttg agggacgctg tgggctcttc tcttacatgt accttttgct1828tgcctcaacc ctgactatct tccaggtcag gatcccagag tcaggggtct gtattttcct1888gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgctccga atattgcctc tcacatctcg1948tcaatctccg cgaggactgg ggaccctgtg acgaacatgg ctagcgggcc cagatctggg2008ccctaacaaa acaaaaagat ggggttattc cctaaacttc atgggttacg taattggaag2068ttgggggaca ttgccacaag atcatattgt acaaaagatc aaacactgtt ttagaaaact2128tcctgtaaac aggcctattg attggaaagt atgtcaaagg attgtgggtc ttttgggctt2188tgctgctcca tttacacaat gtggatatcc tgccttaatg cctttgtatg catgtataca2248agctaaacag gctttcactt tctcgccaac ttacaaggcc tttctaagta aacagtacat2308gaacctttac cccgttgctc ggcaacggcc tggtctgtgc caagtgtttg ctgacgcaac2368ccccactggc tggggcttgg ccataggcca tcagcgcatg cgtggaacct ttgtggctcc2428tctgccgatc catactgcgg aactcctagc cgcttgtttt gctcgcagcc ggtctggagc2488aaagctcata ggaactgaca attctgtcgt cctctcgcgg aaatatacat cgtttcgatc2548tacgtatgat ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc cccttgagca2608tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt2668gtgtctctca ctcggaagga attctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg2728gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc2788ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag2848gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa2908aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc2968gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc3028ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg3088cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt3148cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc3208gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc3268cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag3328agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg3388ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa3448ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag3508gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact3568cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa3628attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt3688accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag3748ttgcctgact c 37592101521142212DNA213人工序列220
223引物40015ggaggatccg gacggtgagt cactcttggc acggggaatc cg 422101621121212DNA213人工序列
220
223引物40016ggtgaatatg gctcataaca c 2l2101721123212DNA213人工序列220
223引物40017ccgccgaaca tggagaacat cgc232101821133212DNA213人工序列220
223引物40018cacagatctt ttgttagggt ttaaatgtat acc 332101921129212DNA213人工序列220
223引物40019ggaggatcct gacctggaag atagtcacc 292102021126212DNA213人工序列220
223引物40020ggaggatcca tcagcaagca ggtatg 262102121133212DNA213人工序列220
223引物
40021ggagctagcg ggcgtttgac ctccggcgtc ggg 332102221137212DNA213人工序列220
223引物40022ggagaattca gatctcctct agtaaaacaa tggctgg 372102321125212DNA213人工序列220
223引物40023ggagctagcc ttctaaccga ggtcg 252102421130212DNA213人工序列220
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223引物40025ggcgaattcc ttccgagtga gagacac272102621143212DNA213人工序列220
223引物40026
ggagtataca tttaaagggc cctaacaaaa caaaaagatg ggg 432102721131212DNA213人工序列220
223引物40027ggagctagct cgtttacttt gaccaagaac g 312102821136212DNA213人工序列220
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223引物40034gatctgggcc cg122103521128212DNA213人工序列220
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223引物40036ggtagatctc ctcatgtctg ctcgaagc 2821037
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223引物40037ccaagctagc gacaaaactc acacatgcc 292103821145212DNA213人工序列220
223引物40038ggaagatctc gtttacccct gtcatttacc cggagacagg gagag452103921157212DNA213人工序列220
223寡核苷酸40039aagatgtcca gactctgtct ctccgtggcc ctcctcgtgc tcctcgggac actcgcc 572104021124212DNA213人工序列220
223引物40040ggaactagta agatgtccag actc 242104121125212DNA213人工序列220
223引物40041ggaagctagc ggcgagtgtc ccgag 252104221175212DNA
213人工序列220
223寡核苷酸40042ggaaagatgg ccagcctctt tgccacattt ctcgtggtgc tcgtgagcct cagcctcgcc60agcgaaagca gcgcc 752104321124212DNA213人工序列220
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223引物40044ggaagctagc ggcgctgctt tcgctg 262104521151212DNA213人工序列220
223寡核苷酸40045aggtctttgc taatcttggt gctttgcttc ctgcccctgg ctgctctggg g 512104621124212DNA213人工序列220
223引物40046ggaactagta ggtctttgct aatc 242104721125212DNA213人工序列
220
223引物40047ggaagctagc ccccagagca gccag 252104821131212DNA213人工序列220
223引物40048ggagctagct cgtttacttt gaccaagaac g 312104921125212DNA213人工序列220
223引物40049ggaagatctc cggtgagtgg tgctg 252105021132212DNA213人工序列220
223引物40050gcaggatcca gtagacctgg agagaggaca ag 322105121129212DNA213人工序列220
223引物40051ggaagatcta caaggtgagc tgctgtggc 2921052211490212DNA213偽狂犬病病毒40052tggccgcaga gcgggccggg catgcaaatc agaggcgcgc gggagacgcc tccgcgcgcc60
cattggcccg ggcgagccga gatggccgcc gcgggggccg gacatgcaaa gtagacgcga120gaggaagtag ggagagaaat cccattggcc gtcgaggggc caagatggcg ccctcggggc180cggacatgca aagtagacgc gagaggaagt gggcgagaga aatcccattg gccgtcgatg240gggcaagatg gccgccgcgg gggccgggca tgcaaatggt cctcgcgagg aagttcctcg300cgaaatccca ttggccggcg gccgccatct tgggccgggc atgcaaagca gacggcagag360gaagcgggcg agaaaaatcc cattggccgg ccgtcgggga agtccgcggc gaaaatcggc420cattggtccg cttacctggg ggcgggctct cctcggggcg cttataagcg cggtctccat480cgtagcactt 49021053211495212DNA213勞氏肉瘤病毒40053ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg cgagcaaaat ttaagctaca60acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg120ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgtatctgag gggactaggg tgtgtttagg180cgaaaagcgg ggcttcggtt gtacgcggtt aggagttccc tcaggatata gtagtttcgc240ttttgcatag ggagggggaa atgtagtctt atgcaataca cttgtagtct tgcaacatgg300taacgatgag ttagcaacat gccttacaag gagagaaaaa gcaccgtgca tgccgattgg360tggaagtaag gtggtacgat cgtgccttat taggaaggca acagacaggt ctgacatgga420ttggacgaac cactgaattc cgcattgcag agataattgt atttaagtgc ctagctcgat480acaataaacg ccatt 49權利要求
1.一種核酸構建體，含有嵌合啟動子序列和用於插入與嵌合啟動子有效連接的編碼序列的克隆位點，其中，所述嵌合啟動子序列包括(a)hCMV立即早期啟動子序列；(b)hCMV主要立即早期基因的外顯子1和至少一部分外顯子2；和(c)置換hCMV主要立即早期基因的內含子A區的異源內含子。
2.根據權利要求1所述的核酸構建體，其中，所述hCMV立即早期啟動子序列(a)是SEQ ID No.1。
3.根據權利要求1所述的核酸構建體，其中，所述外顯子序列(b)是SEQ ID No.2。
4.根據權利要求1所述的核酸構建體，其中，所述異源內含子(c)包括選自大鼠胰島素基因內含子A序列、雞角蛋白基因內含子A序列和雞心臟的肌動蛋白基因內含子A序列中的序列。
5.根據權利要求4所述的核酸構建體，其中，所述大鼠胰島素基因內含子A序列包括SEQ ID No.3。
6.根據權利要求1所述的核酸構建體，其中，所述嵌合啟動子序列為SEQ ID No.4。
7.根據權利要求1所述的核酸構建體，包括聚腺苷酸化序列。
8.根據權利要求7所述的核酸構建體，其中，所述聚腺苷酸化序列來源於選自兔β-珠蛋白基因、人乳頭狀瘤病毒(HPV)早期或晚期基因、HSV-2gB基因、猿CMV立即早期基因和HSVgD晚期基因中的基因的聚腺苷酸化序列。
9.根據權利要求8所述的核酸構建體，其中，所述聚腺苷酸化序列選自SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13中。
10.根據權利要求1所述的核酸構建體，進一步包括信號肽。
11.根據權利要求10所述的核酸構建體，其中，所述信號肽選自人組織纖溶酶原激活劑信號肽(hTPAsp)、抑肽酶信號肽、菸草伸展蛋白信號肽和雞溶菌酶信號肽。
12.根據權利要求1所述的核酸構建體，其中，編碼序列位於所述克隆位點。
13.根據權利要求12所述的核酸構建體，其中，所述編碼序列編碼抗原。
14.根據權利要求13所述的核酸構建體，其中，所述抗原是病毒、細菌、寄生蟲或真菌病原體的抗原。
15.根據權利要求14所述的核酸構建體，其中，所述抗原是HBsAg。
16.根據權利要求1所述的核酸構建體，所述核酸構建體是質粒載體。
17.根據權利要求1所述的核酸構建體，其中，所述核酸是DNA。
18.一種核酸構建體，包括(i)嵌合啟動子序列，包括(a)hCMV立即早期啟動子序列；(b)hCMV主要立即早期基因的外顯子1和至少一部分外顯子2；和(c)置換hCMV主要立即早期基因的內含子A區的異源內含子；和(ii)克隆位點，用於插入與嵌合啟動子有效連接的編碼序列；和(iii)(a)非翻譯前導序列，來源於HBVpreS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，並與嵌合啟動子有效連接；和/或(b)增強子序列，來源於HBsAg序列的3』非翻譯區(UTR)，或猿CMV立即早期基因序列的3』UTR，並與嵌合啟動子有效連接，其中，所述增強子序列位於克隆位點下遊。
19.根據權利要求18所述的核酸構建體，其中，所述hCMV立即早期啟動子序列(a)是SEQ ID No.1。
20.根據權利要求18所述的核酸構建體，其中，所述外顯子序列(b)是SEQ ID No.2。
21.根據權利要求18所述的核酸構建體，其中，所述異源內含子(c)包括選自大鼠胰島素基因內含子A序列、雞角蛋白基因內含子A序列和雞心臟的肌動蛋白基因內含子A序列中的序列。
22.根據權利要求21所述的核酸構建體，其中，所述大鼠胰島素基因內含子A序列包括SEQ ID No.3。
23.根據權利要求18所述的核酸構建體，其中，所述嵌合啟動子序列是SEQ ID No.4。
24.根據權利要求24所述的核酸構建體，所述核酸構建體包括聚腺苷酸化序列。
25.根據權利要求24所述的核酸構建體，其中，所述聚腺苷酸化序列來源於選自兔β-珠蛋白基因、人乳頭狀瘤病毒(HPV)早期或晚期基因、HSV-2gB基因、猿CMV立即早期基因和HSVgD晚期基因中的基因的聚腺苷酸化序列。
26.根據權利要求25所述的核酸構建體，其中，所述聚腺苷酸化序列選自SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ IDNO13。
27.根據權利要求18所述的核酸構建體，所述核酸構建體進一步包括信號肽。
28.根據權利要求27所述的核酸構建體，其中，所述信號肽選自人組織纖溶酶原激活劑信號肽(hTPAsp)、抑肽酶信號肽、菸草伸展蛋白信號肽和雞溶菌酶信號肽。
29.根據權利要求18所述的核酸構建體，其中，編碼序列位於所述克隆位點。
30.根據權利要求29所述的核酸構建體，其中，所述編碼序列編碼抗原。
31.根據權利要求30所述的核酸構建體，其中，所述抗原是病毒、細菌、寄生蟲或真菌病原體的抗原。
32.根據權利要求31所述的核酸構建體，其中，所述抗原是HBsAg。
33.根據權利要求18所述的核酸構建體，所述核酸構建體是質粒載體。
34.根據權利要求33所述的核酸構建體，所述核酸構建體具有SEQID No.14中的序列。
35.根據權利要求18所述的核酸構建體，其中，所述核酸為DNA。
36.根據權利要求18所述的核酸構建體，其中，所述非翻譯前導序列選自SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7。
37.根據權利要求18所述的核酸構建體，其中，所述增強子序列選自SEQ ID No.8和SEQ ID No.9。
38.一種獲得在哺乳動物細胞中表達所研究多肽的方法，所述方法包括將核酸構建體轉移到所述細胞中，所述核酸構建體含有嵌合啟動子序列和與嵌合啟動子有效連接的編碼多肽的編碼序列，其中，所述嵌合啟動子序列包括(a)hCMV立即早期啟動子序列；(b)hCMV主要立即早期基因的外顯子1和至少一部分外顯子2；和(c)置換hCMV主要立即早期基因的內含子A區的異源內含子。
39.根據權利要求38所述的方法，其中，所述構建體直接釋放給受試者。
40.根據權利要求39所述的方法，其中，所述構建體通過注射、透皮顆粒釋放、吸入、局部、口服、鼻腔或跨黏膜釋放。
41.根據權利要求40所述的方法，其中，所述構建體通過無針注射釋放。
42.根據權利要求38所述的方法，其中，所述構建體離體釋放給來自受試者的細胞，並且所述細胞再導入受試者。
43.根據權利要求38所述的方法，其中，所述核酸構建體包被在載體顆粒上。
44.包被顆粒，適合於由顆粒介導的釋放裝置釋放，所述包被顆粒包括核酸構建體包被的載體顆粒，其中，所述構建體包括嵌合啟動子序列和與嵌合啟動子有效連接的編碼序列，並且其中，所述嵌合啟動子序列包括(a)hCMV立即早期啟動子序列；(b)hCMV主要立即早期基因的外顯子1和至少一部分外顯子2；和(c)置換hCMV主要立即早期基因的內含子A區的異源內含子。
45.根據權利要求44所述的包被顆粒，其中，所述載體顆粒為金或鎢。
46.劑量容器，用於含根據權利要求44所述的包被顆粒的顆粒介導的釋放裝置。
47.一種顆粒介導的釋放裝置，所述裝置負載根據權利要求44所述的包被顆粒。
48.根據權利要求47所述的顆粒介導的釋放裝置，所述裝置是無針注射器。
49.一種核酸免疫接種的方法，包括給予受試者有效劑量的包被顆粒，所述包被顆粒適合由顆粒介導的釋放裝置釋放，所述顆粒包括核酸構建體包被的載體顆粒，其中，所述構建體包括嵌合啟動子序列和與嵌合啟動子序列有效連接的編碼抗原的編碼序列，並且其中，所述嵌合啟動子序列包括(a)hCMV立即早期啟動子序列；(b)hCMV主要立即早期基因的外顯子1和至少一部分外顯子2；以及(c)置換hCMV主要立即早期基因的內含子A區的異源內含子。
50.一種核酸構建體，包括(i)啟動子序列；(ii)非翻譯前導序列，來源於HBVpreS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列；和(iii)有效連接於(i)和(ii)的編碼序列，其中，所述編碼序列對非翻譯前導序列是異源的。
51.根據權利要求50所述的核酸構建體，其中，所述啟動子序列(i)選自hCMV立即早期啟動子序列、偽狂犬病病毒啟動子序列和勞氏肉瘤病毒啟動子序列。
52.根據權利要求50所述的核酸構建體，其中，所述編碼序列編碼抗原。
53.根據權利要求52所述的核酸構建體，其中，所述抗原是病毒、細菌、寄生蟲或真菌病原體的抗原。
54.根據權利要求50所述的核酸構建體，所述核酸構建體是質粒載體。
55.一種在哺乳動物細胞中表達所研究多肽的方法，所述方法包括將核酸構建體轉移到所述細胞中，所述核酸構建體包括(i)啟動子序列；(ii)非翻譯前導序列，來源於HBVpreS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列；和(iii)有效連接於(i)和(ii)的編碼多肽的編碼序列，其中，所述編碼序列對所述非翻譯前導序列是異源的。
56.根據權利要求55所述的方法，其中所述構建體直接釋放給受試者。
57.根據權利要求56所述的方法，其中，所述構建體通過注射、透皮顆粒釋放、吸入、局部、口服、鼻腔或跨黏膜給藥。
58.根據權利要求57所述的方法，其中，所述構建體通過無針注射給藥。
59.根據權利要求55所述的方法，其中，所述構建體離體釋放給來自受試者的細胞，並且所述細胞再導入受試者。
60.根據權利要求55所述的方法，其中，所述核酸構建體包被在載體顆粒上。
61.包被顆粒，適合於從顆粒介導的釋放裝置釋放，該顆粒包括由核酸構建體包被的載體顆粒，所述核酸構建體包括(i)啟動子序列；(ii)非翻譯前導序列，來源於HBVpreS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列；和(iii)有效連接於(i)和(ii)的編碼所研究多肽的編碼序列，其中，所述編碼序列對所述非翻譯前導序列是異源的。
62.根據權利要求61所述的包被顆粒，其中，所述載體顆粒為金或鎢。
63.劑量容器，用於含根據權利要求61所述的包被顆粒的顆粒介導的釋放裝置。
64.一種顆粒介導的釋放裝置，所述裝置負載根據權利要求61所述的包被顆粒。
65.根據權利要求64所述的顆粒介導的釋放裝置，所述裝置為無針注射器。
66.一種核酸免疫接種的方法，包括給予受試者有效劑量的包被顆粒，所述包被顆粒適合由顆粒介導的釋放裝置釋放，所述顆粒包括核酸構建體包被的載體顆粒，其中，所述核酸構建體包括(i)啟動子序列；(ii)非翻譯前導序列，來源於HBVpreS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列；和(iii)有效連接於(i)和(ii)的編碼抗原的編碼序列，其中，所述編碼序列對所述非翻譯前導序列是異源的。
67.一種核酸構建體，包括(i)啟動子序列；(ii)編碼序列，與所述啟動子序列(i)有效連接；和(iii)增強子序列，位於編碼序列(ii)的3』端，並與之有效連接；其中，所述增強子序列(iii)來源於HBsAg序列的3』UTR或猿CMV立即早期基因序列的3』UTR，並且所述編碼序列(ii)對3』端增強子序列是異源的。
68.根據權利要求67所述的核酸構建體，其中，所述啟動子序列(i)選自hCMV立即早期啟動子序列、偽狂犬病病毒啟動子序列和勞氏肉瘤病毒啟動子序列。
69.根據權利要求67所述的核酸構建體，其中，所述編碼序列編碼抗原。
70.根據權利要求69所述的核酸構建體，其中，所述抗原是病毒、細菌、寄生蟲或真菌病原體的抗原。
71.根據權利要求67所述的核酸構建體，所述核酸構建體是質粒載體。
72.一種在哺乳動物細胞中表達所研究多肽的方法，其中，所述方法包括將核酸構建體轉移到所述細胞中，其中所述核酸構建體包括(i)啟動子序列；(ii)編碼多肽的編碼序列，與所述啟動子序列(i)有效連接，和(iii)增強子序列，位於編碼序列(ii)的3』端，並與之有效連接；其中，所述增強子序列(iii)來源於HBsAg序列的3』UTR或猿CMV立即早期基因序列的3』UTR，並且所述編碼序列(ii)對所述3』增強子序列是異源的。
73.根據權利要求72所述的方法，其中，所述構建體直接釋放給受試者。
74.根據權利要求73所述的方法，其中，所述構建體通過注射、透皮顆粒釋放、吸入、局部、口服、鼻腔或跨黏膜給藥。
75.根據權利要求74所述的方法，其中，所述構建體通過無針注射釋放。
76.根據權利要求72所述的方法，其中，所述構建體離體釋放給來自受試者的細胞，並且所述細胞再導入受試者。
77.根據權利要求72所述的方法，其中，所述核酸構建體包被在載體顆粒上。
78.包被顆粒，適合於由顆粒介導的釋放裝置釋放，所述顆粒包括由核酸構建體包被的載體顆粒，所述核酸構建體包括(i)啟動子序列；(ii)編碼所研究多肽的編碼序列，與所述啟動子(i)有效連接；和(iii)增強子序列，位於編碼序列(ii)的3』端，並與之有效連接。其中，所述增強子序列(iii)來源於HBsAg序列的3』UTR或猿CMV立即早期基因序列的3』UTR，並且所述編碼序列(ii)與所述3』增強子序列是異源的。
79.根據權利要求78所述的包被顆粒，其中所述的載體顆粒為金或鎢。
80.劑量容器，用於含根據權利要求78所述的包被顆粒的顆粒介導的釋放裝置。
81.一種顆粒介導的釋放裝置，所述裝置負載根據權利要求78所述的包被顆粒。
82.根據權利要求81所述的顆粒介導的釋放裝置，所述裝置為無針注射器。
83.一種核酸免疫接種的方法，包括給予受試者有效量的包被顆粒，所述顆粒適合由顆粒介導的釋放裝置給藥，所述顆粒包括核酸構建體包被的載體顆粒，其中，所述構建體包括(i)啟動子序列；(ii)編碼抗原的編碼序列，與所述啟動子序列(c)有效連接；和(iii)增強子序列，位於編碼序列(iii)的3』端，並與之有效連接；其中，所述增強子序列(iii)來源於HBsAg序列的3』UTR或猿CMV立即早期基因序列的3』UTR，並且所述編碼序列(ii)對所述3』增強子序列是異源的。
84.一種經純化、分離的嵌合啟動子序列，包括(a)hCMV立即早期啟動子序列；(b)hCMV主要立即早期基因的外顯子1和至少一部分外顯子2；和(c)置換hCMV主要立即早期基因的內含子A區的異源內含子。
全文摘要
一種核酸構建體，含有嵌合啟動子序列和用於插入與嵌合啟動子有效連接的編碼序列的克隆位點，其中，嵌合啟動子序列包括(a)hCMV立即早期啟動子序列；(b)hCMV主要立即早期基因的外顯子1和至少一部分外顯子2；(c)置換hCMV主要立即早期基因的內含子A區的異源內含子。
文檔編號C12N15/36GK1890375SQ200480036787
公開日2007年1月3日 申請日期2004年10月11日 優先權日2003年10月10日
發明者J·富勒 申請人:寶德傑克特疫苗有限公司