對抗核糖核苷酸還原酶的r1與r2組分的抗腫瘤反義序列的製作方法

2023-05-03 21:38:36 1

專利名稱：：對抗核糖核苷酸還原酶的r1與r2組分的抗腫瘤反義序列的製作方法
背景技術：
：發明領域本發明的領域涉及控制贅生性細胞的致瘤性和/或轉移的方法。具體而言，本發明涉及對抗哺乳動物核糖核苷酸還原酶的R1與R2組分的反義序列的應用。參考文獻本申請引用下列公開出版物、專利申請和專利美國專利No.5,034,5061991年6月11日頒布的美國專利No.5,023,252國際專利申請No.PCT/US98/00540Agarwaletal.，(1995)Oncogene，11427-438Akhteretal.，(1991)″InteractionsofantisenseDNAoligonucleotideanalogswithphospholipidmembranes(liposomes)″.NucleicAcidsRes.195551-5559Alessietal.，(1995)Meth.Enzyymol.255279-290Altschul，etal.，(1990)″Basiclocalalignmentsearchtool″，J.Mol.Biol.215403-410Amaraetal.，(1994)″Phorbolestermodulationofanovelcytoplasmicproteinbindingactivityatthe3』-untranslatedregionofmammalianribonucleotidereductaseR2mRNAandroleinmessagestability″.J.Biol.Chem.2696709-7071Amaraetal.，(1995B)″Defininganovelciselementinthe3』-untranslatedregionofmammalianribonucleotidereductasecomponentR2mRNARoleintransforminggrowthfactor-βinductedmRNAstabilization″.NucleicAcidsRes.231461-1467Anazodoetal.，(1995)″Sequence-SpecificInhibitionofGeneExpressionbyaNovelAntisenseoligodeoxynucleotidePhosphonothioateDirectedAgainstaNonregulatoryRegionoftheHumanImmunodeficiencyVirusType1Genome″.J.Virol.691794-1801Anazodoetal.，(1996)″RelativeLevelsofInhibitionofp24GeneExpressionbydifferent20-merAntisenseOligonucleotideSequencesTargetingNucleotides+1129to+1268oftheHIV-1gagGenomeAnAnalysisofMechanism″.Biochem.Biophys.Res.Commun.229305-309AshiharaandBeserga，(1979)″CellSynchronization″.MethodsEnzymol.58248-262Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileyandSons，BaltimoreMd.(1989)Blaesse，(1997)″GeneTherapyforCancer″ScientificAmerican276(6)111-115Bjorklundetal.，(1993)"Structureandpromotercharacterizationofthegenecodingthelargesubunit(R1Protein)ofmouseribonucleotidereductase″Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011322-11326BlinandStafford，(1976)″AgeneralmethodofisolationofhighmolecularweightDNAfromeukaryotes".NucleicAcidsRes.，32303-2308.Blosmanisetal.，(1987)CancerRes.471273-1277.Bradleyetal.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA835277-5281.Buchardt，deceased，etal.，美國專利No.5,766,855Buchardt，deceased，etal.，美國專利No.5,719,262Calabretta，etal.，(1996)″Antisensestrategiesinthetreatmentofleukemias″.Semin.Oncol.2378Caras，(1985)″ClonedMouseRibonucleotideReductaseSubunitM1cDNARevealsAminoAcidSequenceHomologywithEscherichiacoliandHerpesvirusRibonucleotideReductases″BiolChem.2607015-7022Chadeeetal.，(1995)J.Biol.Chem27020098-20105Chanetal.，(1993)Biochemistry3212835-12840Changetal.，(1978)″PhenotypicexpressioninE.coliofaDNAsequencecodingformousedihydrofolatereductase″Nature，275617-624Changetal.；(1995)SomaticGeneTherapy，CRCPress，AnnArborMIChenetal.，(1993)″MammalianribonucleotidereductaseR1mRNAstabilityundernormalandphorbolesterstimulatingconditionsinvolvementofacis-transinteractionatthe3』-untranslatedregion″EMBOJ.，123977-3986Chenetal.，(1994B).″DefininganovelribonucleotidereductaseR1mRNAciselementthatbindstoanuniquecytoplasmictrans-actingprotein″NucleicAcidsRes.224796-4797Choyetal.(1989)BiochemBiophysResCommun1621417-1424Choyetal.，(1988)″Molecularmechanismsofdrugresistanceinvolvingribonucleotidereductasehydroxyurearesistanceinaseriesofclonallyrelatedmousecelllinesselectedinthepresenceofincreasingdrugconcentrations″CancerRes.482029-2035Crooke，(1995)″Progressinantisensetherapeutics″，Hematol.Pathol.259Damenetal.，(1989)″Generationofmetastaticvariantsinpopulationsofmutatorandamplificatormutants″J.Natl.CancerInst.81628-631Damenetal.，(1991)″TransformationandamplificationoftheK-fgfProtooncogeneinNIH-3T3cells，andinductionofmetastaticpotential″BiochemBiophys.Acta1097103-110Davisetal.，(1994)″Purification，Characterization，andLocalizationofSubunitInteractionAreaofRecombinantMouseRibonucleotideReductaseR1Subunit″Biol.Chem.26923171-23176DevereuxJ.etal.，(1984)″AcomprehensivesetofsequenceanalysisprogramsfortheVAX″，NucleicAcidsRes.12387-395Dreeleyetal.，(1992)Science，2581650-1654Edwardsetal.，(1985)MolCellBiol.53280-3288Egan，etal.，(1987A)″ExpressionofH-rasCorrelareswithMetastaticPotentialEvidenceforDirectRegulationoftheMetastaticPhenotypein10T1/2andNIH3T3Cells″Mol.Cell.Biol.7830-837Eganetal.，(1987B)″Transformationbyoncogenesencodingproteinkinasesinducesthemetastaticphenotype″Science238202-205Erikssonetal.，(1984)″Cellcycle-dependentregulationofmammalianribonucleotidereductase.TheSphase-correlatedincreaseinsubunitM2isregulatedbydenovoproteinsynthesis″J.Biol.Chem.25911695-11700Fanetal.，(1996A)″RibonucleotidereductaseR2componentisanovelmaiignancydeterminantthatcooperateswithactivatedoncogenestodeterminetransformationandmalignantpotential″Proc.Natl.AcadSci.USA9314036-14040Fanetal.，(1996B)″AlinkbetweenferritingeneexpressionandribonucleotidereductaseR2cDNA″FEBSLett.382145-148Felgneretal.，美國專利No.5,580,859Flintoff，(1989)Methotrexate，InGupta，R.S.(ed.)，DrugResistanceinMammalianCells，BocaRaton，Fla.CRCPress，1-14.Gannonetal.，(1990)″Activatingmutationsinp53produceacommonconformationaleffect.Amonoclonalantibodyspecificforthemutantfrom″EMBOJ.，91595-1602Gewirtz，(1993)″Oligodeoxynucleotide-basedtherapeuticsforhumanleukemias″StemCellsDayt.1196GoodandNielsen；(1998)″InhibitionoftranslationandbacterialgrowthbypeptidenucleicacidtargetedtoribosomalRNA″，P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量可以是不足以抑制腫瘤細胞生長的。另一方面是通過使腫瘤與包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]的反義低聚核苷酸接觸，增加哺乳動物贅生性細胞對化療藥物的敏感性的方法。另一方面是抑制哺乳動物腫瘤細胞轉移的方法，該方法包括將足以抑制腫瘤細胞生長的量的、包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]的反義低聚核苷酸對所述哺乳動物給藥。另一方面是一種分離的DNA，它具有包含轉錄引發區的序列和編碼小於約50個核苷酸的反義低聚核苷酸的序列，該低聚核苷酸包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]。附圖簡要說明圖1A-C是凝膠(A和B)和二維掃描(C)的照片，顯示利用單克隆抗-Myc表位抗體9E10(A)、多克隆兔抗-R2血清(B)通過蛋白質印跡分析、和在細胞周期期間利用抗體9E10通過流動細胞計數法(C)所得，來自穩定感染體的定向Myc-表位R2表達的分析。圖2A-C是測量轉化灶的實驗照片(A和B)和圖形(C)，其中(A)顯示BALB/c3T3(a)和NIH3T3(b)細胞被SH/mR2感染不引起轉化灶形成。(B)用T24H-ras質粒轉染之後，與B3/SH(a)和N3/SH(c)相比，B3/mR2(b)和N3/mR2(d)的轉化灶形成增加。(C)繪出三項獨立的ras轉染實驗中所形成的轉化灶數。圖3A-C是軟瓊脂生長的照片(A)和圖形(B和C)，其中(A)顯示在ras-轉染細胞中導致軟瓊脂中的生長效率增加的Myc-R2的表達。所示實例是r-3/mR2和未感染的r-3細胞(見表4)。(B)與C1/SH對照細胞相比，Cl/mR2顯示腫瘤潛伏期縮短，生長速率增加，其中從對數生長培養物中收集3×105個細胞，皮下注射到五隻同基因的C3H/HeN小鼠/細胞系/實驗中。列出的結果得自兩個獨立的試驗。顯示了腫瘤生長速率的t檢驗分析的p值，說明兩種細胞系的生長速率是顯著不同的。(C)C1/mR2細胞表現出轉移的潛在性升高。圖4A-C是圖形，其中(A)顯示在R2過度表達的細胞中，與膜締合的Raf-1蛋白的增加量。將重組R2表達細胞系B3/mR2、N3/mR2、C1/mR2、r-2/mR2、r-3/mR2和NR4/mR2(R2)與它們各自的對照系B3/SH、N3/SH、Cl/SH、r-2/SH、r-3和NR4(對照)進行比較。在所有情況下，表達重組R2的細胞表現出與膜締合的Raf-1蛋白增加，並且當比較這兩組細胞系時，發現它們的t檢驗分析是顯著不同的(p＜0.001)。(B)顯示在R2過度表達的細胞中分裂素活化蛋白激酶(MAPK-2)的活性增加。將重組R2表達系B3/mR2、N3/mR2、10T/mR2、C1/mR2、r-2/mR2和NR4/mR2(R2)與它們各自的用LXSH感染的對照系(對照)進行比較。在所有情況下，表達重組R2的細胞顯示酶活性增加，兩組之間的差異是非常顯著的(p＜0.001)。(C)顯示用活化的V12Rac-1質粒轉染之後，與N3/SH細胞相比，N3/mR2細胞的轉化灶形成增加。所示轉化灶數表示來自兩項獨立實驗的平均±SE。圖5A-B是凝膠的照片，顯示利用小鼠L細胞進行CAD(A)和DHFR(B)DNA的DNA印跡分析實例。圖5A.作為對照的未暴露在藥物下的H-4細胞(a)，和在50μMPALA的存在下(b)或者在60μMPALA的存在下(c)發育的集落中的H-4細胞。DNA用Xbal消化完全。圖5B作為對照的未暴露在藥物下的SC2細胞(a)，和在80nM甲氨蝶呤(MTx)的存在下發育的集落中的SC2細胞(b)和(c)。DNA用Pstl消化完全。圖6A-B是凝膠的照片，顯示利用BALB/c3T3細胞進行CAD(A)和DHFR(B)DNA的DNA印跡分析實例。DNA用PstI消化完全。圖6A.未暴露在PALA下的B3/mR2細胞，和在40μMPALA的存在下(b)或者在50μMPALA的存在下(c)發育的集落中的B3/mR2細胞。圖6B.未暴露在MTX下的B3/mR2細胞，和在60nMMTX的存在下(b)或者在80nMMTX的存在下(c)發育的集落中的B3/mR2細胞。圖7是N/R2-4(a)和N/R2+ASR2(b)細胞中R2蛋白水平的蛋白質印跡分析照片。為了區分載體R2蛋白與被轉染細胞中的內源基因產物，將編碼十個胺基酸加甲硫氨酸的人c-myc表位放置在R2的cDNA5』端。在a欄中可觀察到重組的(上面的帶)與內源的(下面的帶)R2蛋白，它們在含有R2反義的細胞(b欄)中明顯減少。兩種細胞系的生長具有大約相同的加倍時間，約16小時。圖8是凝膠的照片，顯示在PALA、MTX或羥基脲的存在下發育的集落細胞中的p53-DNA結合活性。(a)為對照的p53-裸1B細胞，(b)為在20μMPALA的存在下生長的B3/mR2細胞，(c)為在40μMPALA的存在下生長的B3/R2c2細胞，(d)為在40nMMTX的存在下生長的B3/mR2細胞，(e)為在60nMMTX的存在下生長的B3/R2c2細胞，(f)為在0.20mM羥基脲的存在下生長的B3/mR2細胞，(g)為在0.30mM羥基脲的存在下生長的B3/R2c2細胞。在活化p53與DNA結合的抗體421的存在下，將細胞與32P-標記的p53共有結合序列進行培養。注意除了對照的p53-裸細胞1B以外，在所有細胞系中都存在複合物。低分子量複合物的形成由p53-DNA結合所引起，高分子量複合物的形成由抗體超級移位的p53-DNA結合所引起。圖9是圖形，顯示在(a)含有H-ras致癌基因的NIH-3T3小鼠細胞、(b)含有H-ras致癌基因和R2反義序列的NIH-3T3小鼠細胞和(c)含有H-ras致癌基因和R2編碼區序列的NIH-3T3小鼠細胞中的轉化灶數。結果是三次實驗的平均值。圖10A-B是L60小鼠腫瘤細胞中，核糖核苷酸還原酶R2蛋白水平被AS-II-626-20抑制(A)和被各種R2反義低聚核苷酸抑制(B)的蛋白質印跡分析照片。圖10A小鼠腫瘤細胞(a)；具有AS-II-626-20的小鼠細胞(b)；具有混雜AS-II-626-20的小鼠細胞(c)；具有錯配AS-II-626-20的小鼠細胞(d)。圖10B小鼠腫瘤細胞(a)；用AS-II-667-20(b)、AS-II-816-20(c)、AS-II-1288-20(d)、AS-II-1335-20(e)、AS-II-1338-20(f)處理的小鼠腫瘤細胞。圖11是圖形，顯示各種反義低聚核苷酸抑制MDA-MB-231人乳腺癌細胞集落形成的百分率。圖12是顯示AS-I-618-20抑制集落形成的圖形。細胞系是HepG2(肝)、SK-OV-3(卵巢)、U87(腦)、A2058(黑素瘤)、H460(肺)、MDA-MB-231(乳腺)和AsPC-1(胰腺)。圖13是MDA-MB-231人乳腺癌細胞用各種反義低聚核苷酸處理後，R1蛋白表達的蛋白質印跡照片。圖14A是用AS-I-618-20處理後，R1蛋白表達的蛋白質印跡照片。對照＝未處理的細胞，混雜—用混雜型AS-I-618-20(相同的GTAC比例但又完全不同的序列)處理的細胞，錯配—突變型AS-I-618-20，有4個鹼基錯配。圖14B是利用ImageQuant程序(MolecularDynamics)量化的蛋白質印跡中的R1蛋白水平圖，該水平以任意單位表示(相對強度)。圖15是免疫沉澱凝膠的照片。SRC—混雜型AS-I-618-20；MIS—錯配型AS-I-618-20。圖16是未用AS-I-618-20處理或者用AS-I-618-20處理的各種細胞的mRNA的RNA印跡的自體放射造影照片。HT-29是人結腸腺癌細胞系，MDA-MB-231是人乳腺癌細胞系。圖17是顯示用各種反義低聚核苷酸處理後，小鼠中人肺癌(H460)腫瘤的重量的圖形。圖18是顯示用AS-I-618-20處理後的小鼠中各種腫瘤的重量的圖形。淺色條是未處理的對照鼠所得結果，深色條是用AS-I-618-20處理的動物所得結果。圖19是顯示用或不用1mg/kgAS-I-618-20處理的裸鼠中，人肺癌腫瘤的生長速率的圖形。圖20是用AS-I-618-20處理後的小鼠中，HT-29人結腸腫瘤中的核糖核苷酸還原酶R1mRNA的RNA印跡的自體放射造影照片。圖21是顯示用各種反義低聚核苷酸處理後，CD-1裸鼠中的人結腸癌(HT-29)腫瘤的重量的圖形。圖22是顯示用各種反義低聚核苷酸處理後，CD-1裸鼠中的人黑素瘤(A2058)腫瘤的重量的圖形。圖23是顯示用各種反義低聚核苷酸處理後，CD-1裸鼠中的人肺癌腫瘤的重量的圖形。發明詳述定義本文所用的下列術語具有下列含義本文所用的術語「反義低聚核苷酸」是指與所需的mRNA互補的核苷酸序列。優選地，反義低聚核苷酸與核糖核苷酸還原酶mRNA互補。可以預期，所述反義低聚核苷酸可以與mRNA的5′未轉譯區、編碼區或mRNA的3′未轉譯區中的任何一個互補。術語「低聚核苷酸」指的是核苷酸或核苷單體的低聚物或聚合物，由天然存在的鹼、糖和糖間(主鏈)連接組成。該術語也包括修飾或取代的低聚物，包含功能類似的非天然存在的單體或其部分。這些修飾或取代的低聚物可能優選於天然存在的形式，因為其具有例如提高了的細胞攝取，或者在核酸酶存在下的增加了的穩定性之類的性能。該術語還包括嵌合的低聚核苷酸，含有兩個或更多化學不同的區域。例如，嵌合的低聚核苷酸可以含有至少一個帶來有益性質(例如增加核酸酶耐受性、增加細胞攝取)的修飾核苷酸區，或者兩個或更多本發明的低聚核苷酸連接形成嵌合的低聚核苷酸。本發明的反義低聚核苷酸可以是核糖核酸或脫氧核糖核酸，並且可以含有天然存在的或合成的單體鹼，包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。低聚核苷酸還可以含有修飾的鹼，例如黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其他烷基腺嘌呤、5-滷代尿嘧啶、5-滷代胞嘧啶、6-氮雜尿嘧啶、6-氮雜胞嘧啶和6-氮雜胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、8-滷代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-硫代腺嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤、8-羥基腺嘌呤和其他8-取代的腺嘌呤、8-滷代鳥嘌呤、8-氨基鳥嘌呤、8-硫代鳥嘌呤、8-硫代烷基鳥嘌呤、8-羥基鳥嘌呤和其他8-取代的鳥嘌呤、其他氮雜和去氮雜的尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鳥嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。修飾還可以包括將其他化學基團，例如甲基、乙基或丙基連接到低聚核苷酸的各個部分，包括糖、鹼或主鏈組分。本發明的反義低聚核苷酸還可以包含修飾性的在磷酸酯主鏈中的磷氧雜原子，短鏈烷基或環烷基糖間連接或短鏈雜原子或雜環糖間連接。例如反義低聚核苷酸可以含有膦酸甲酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯和嗎啉代低聚物。在本發明的一個實施方案中，反義低聚核苷酸包含連接4至6個3』-末端核苷酸的硫代磷酸酯鍵。在另一個實施方案中，硫代磷酸酯鍵連接所有的核苷酸。反義低聚核苷酸還可以具有擬糖物。本發明的反義低聚核苷酸還可以包含核苷酸類似物，其中核苷酸的結構發生根本改變。這樣的低聚核苷酸類似物的一個實例是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脫氧核糖(或核糖)磷酸酯主鏈被類似於肽中所發現的聚醯胺主鏈代替(Nielsen等，1991；Good和Nielsen，1998；Buchardt，已故，等，美國專利N0.5,766,855；Buchardt，已故，等，美國專利No.5,719,262)。PNA類似物已經顯示出耐受酶的降解作用，並且具有延長了的體內和體外壽命。PNA與互補的DNA序列的結合能力也強於天然存在的核酸分子，因為在PNA鏈與DNA鏈之間缺少電荷排斥。本發明的低聚核苷酸還可以包括其他包含聚合物主鏈、環狀主鏈或無環主鏈的核苷酸。例如，核苷酸可以包含嗎啉代主鏈結構(美國專利No.5,034,506)。當本發明的低聚核苷酸經過修飾而對DNA和RNA核酸酶的降解作用不敏感，或者被放置在保護低聚核苷酸不受DNA或RNA核酸酶的作用的釋放媒介中時，其是「耐核酸酶的」。耐核酸酶的低聚核苷酸包括例如膦酸甲酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯和嗎啉代低聚物。賦予耐核酸酶性的合適的釋放媒介包括例如脂質體。本發明的低聚核苷酸還可以含有基團，例如用於改善低聚核苷酸的藥動學性質的基團，或用於改善低聚核苷酸的藥效學性質的基團。反義低聚核苷酸優選地選自與核糖核苷酸還原酶mRNA或基因序列互補的序列，這樣該序列表現出最小的顯示雙鏈體形成、發針形成和均低聚物/序列重複的可能性，但是具有高至中等的結合核糖核苷酸還原酶mRNA或基因序列的可能性。這些性質可以利用計算機建模程序OLIGO引物分析軟體3.4或5.0版(由NationalBiosciences，Inc.，Plymouth，MN發布)測定。這種電腦程式可以進行這五種參數的定性測定。或者，反義低聚核苷酸還可以在這樣的基礎上加以選擇，即所述序列與兩種或更多哺乳動物種類的核糖核苷酸還原酶基因之一是高度相反的。這些性質可以利用威斯康星大學計算機小組(GCG)軟體(DevereuxJ.等.1994)的BLASTN程序(Altschul等)以及國家生物技術信息中心(NCBI)資料庫加以測定。反義低聚核苷酸可以包括突變，例如取代、插入和缺失。優選地，具有突變的序列低於10％。反義低聚核苷酸一般包含至少約3個核苷酸或核苷酸類似物，更優選地它們是至少約5個核苷酸，更優選地它們是至少約7個核苷酸，更優選地它們是至少約9個核苷酸，最優選地它們是至少約12個核苷酸。反義低聚核苷酸優選為少於約100個核苷酸或核苷酸類似物，更優選為少於約50個核苷酸或核苷酸類似物，最優選為少於約35個核苷酸或核苷酸類似物。優選地，反義低聚核苷酸包含表1、2和3所列序列(見下)。表1設計用來定向R2信息的反義序列表1腳註名稱包括如下內容AS＝反義II＝R2第一個數字表示R2mRNA序列中第一個核苷酸的位置。第二個數字表示序列片段的長度。表中所示序列AS-II-2229A和文中所述序列AS-II-2229B是交替的序列，2229A選自GENBANK中的R2型(由Pavloff提交)，2229B選自Pavloff等1992年公開的型式。除非另外指出為部分硫代，所述序列被完全硫代。TM℃＝所形成的低聚核苷酸雙鏈體的解鏈溫度。dG＝低聚核苷酸-補體二聚物形成的自由能值。除了上述分析以外，還估計了二聚物形成的可能性(D)、自補相互作用的可能性(H)和與R2信息中不同於目標序列的序列結合的可能性(B)。上述分析和估計是利用計算機建模程序OLIGO引物分析軟體3.4版(由NationalBiosciences發布)得到的。該程序可以測定Tm℃和dG值，還提供對D、H和B參數的定性評估，表示為「沒有可能」、「有可能」或者本質上「完全可能」。在選擇低聚核苷酸序列時，本發明人非常優選表現出高Tm℃和dG值的序列，這些對反義分子與它們的互補鏈緊密結合來說是很重要的，還非常優選D、H和B評估為沒有可能的反義序列。在三類(D，H，B)中，最重要的是D和H，因為B(也就是與R2mRNA中除了精確的目標序列以外的其他區域結合)可以增強而不是有損於低聚核苷酸活性。表1所示的大多數序列的D和H類沒有可能，有些序列的D或H表現為「有可能」，在後面的腫瘤細胞生長抑制研究中發現是有效的(表13)，因此也包括在表1中。本發明人發現這種選擇反義低聚核苷酸抑制劑的方法是極為有效的，因為如表13所示，絕大多數所選擇的序列表現出抗腫瘤性質。表2設計用來定向R1信息的反義序列表2腳註名稱包括如下內容AS＝反義I＝R1第一個數字表示R1mRNA序列中第一個核苷酸的位置。第二個數字表示序列片段的長度。TM℃＝所形成的低聚核苷酸雙鏈體的解鏈溫度。dG＝低聚核苷酸-補體二聚物形成的自由能值。除了上述分析以外，還估計了二聚物形成的可能性(D)、自補相互作用的可能性(H)和與R1信息中不同於目標序列的序列結合的可能性(B)。如表1腳註所述進行分析，用於選擇表2所示序列的標準同表1腳註所述標準。表3具有與人核糖核苷酸還原酶R1基因互補的序列的反義低聚核苷酸表3中，″Tm″是按照最接近的熱力學值計算的低聚核苷酸雙鏈體的解鏈溫度。在該溫度下，50％核酸分子在雙鏈體中，50％變性。″dG″是低聚核苷酸的自由能，它是低聚核苷酸雙鏈體穩定性的量度。使用計算機建模程序OLIG0引物分析軟體5.0版。術語「烷基」指的是一價烷基，優選具有1至20個碳原子，更優選具有1至6個碳原子。該術語的實例是諸如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、正己基等基團。術語「芳基」指的是6至14個碳原子的不飽和芳香碳環基團，具有單一的環(例如苯基)或多個稠合(稠)環(例如萘基或蒽基)。優選的芳基包括苯基、萘基等。術語「環烷基」指的是3至20個碳原子的環狀烷基，具有單一的環或多個稠合環。這樣的環烷基的實例包括單環結構，如環丙基、環丁基、環戊基、環辛基等，或多環結構，如金剛烷基等。術語「滷」或「滷素」指的是氟、氯、溴和碘，優選為氟或氯。術語「巰基」指的是基團-SH。至於任何含有一個或多個取代基的上述基團，當然不言而喻的是這樣的基團並不含有任何空間上不能實現的和/或合成上不可行的取代或取代模式。另外，本發明化合物包括由這些化合物的取代而產生的所有立體化學異構體。術語「藥學上可接受的鹽」指的是這樣的鹽，它們保留本發明的反義低聚核苷酸的生物學效力和性質，並且不是生物學或者其它方面所不希望的。在很多情況下，由於氨基和/或羧基或與之類似基團的存在，本發明的反義低聚核苷酸能夠形成酸和/或鹼鹽。藥學上可接受的鹼加成鹽可以從無機和有機鹼製備。僅作為實例，從無機鹼衍生的鹽包括鈉、鉀、鋰、銨、鈣和鎂鹽。從有機鹼衍生的鹽包括但不限於伯、仲和叔胺的鹽，例如烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、取代的烷基胺、二(取代的烷基)胺、三(取代的烷基)胺、烯基胺、二烯基胺、三烯基胺、取代的烯基胺、二(取代的烯基)胺、三(取代的烯基)胺、環烷基胺、二(環烷基)胺、三(環烷基)胺、取代的環烷基胺、二(取代的環烷基)胺、三(取代的環烷基)胺、環烯基胺、二(環烯基)胺、三(環烯基)胺、取代的環烯基胺、二(取代的環烯基)胺、三(取代的環烯基)胺、芳基胺、二芳基胺、三芳基胺、雜芳基胺、二雜芳基胺、三雜芳基胺、雜環基胺、二雜環基胺、三雜環基胺、混合的二-與三-胺，其中胺上的至少兩個取代基是不同的，並選自由烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、環烷基、取代的環烷基、環烯基、取代的環烯基、芳基、雜芳基、雜環基等。還包括這樣的胺，其中兩個或三個取代基和氨基氮一起形成雜環基或雜芳基。僅作為舉例，合適的胺的實例包括異丙胺、三甲胺、二乙胺、三(異丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、三羧甲基氨甲烷、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、哈胺(hydrabamine)、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可鹼、嘌呤、哌嗪、哌啶、嗎啉、N-乙基哌啶等。還應當明白，其他羧酸衍生物在本發明的實施中也將是有用的，例如羧酸醯胺，包括氨甲醯、低級烷基氨甲醯、二烷基氨甲醯等。藥學上可接受的酸加成鹽可以從無機和有機酸製備。從無機酸衍生的鹽包括氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的鹽。從有機酸衍生的鹽包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等的鹽。術語「核糖核苷酸還原酶基因」指的是任何這樣的基因，其產物單獨或者作為複合物的一部分，能夠催化核糖核苷酸還原為脫氧核糖核苷酸。術語「與……互補」是指反義低聚核苷酸序列能夠與目標序列，即核糖核苷酸還原酶mRNA或基因結合。優選地，反義低聚核苷酸序列與目標序列具有至少約75％的同一性，優選至少約90％的同一性，考慮到若干鹼的裂隙或錯配，最優選與目標序列具有至少約95％的同一性。同一性例如可以利用威斯康星大學計算機小組(GCG)軟體的BLASTN程序加以測定。優選地，反義低聚核苷酸序列與核糖核苷酸還原酶mRNA雜交，該核糖核苷酸還原酶mRNA的解鏈溫度至少為40℃，更優選至少約50℃，最優選至少約53℃，這是用本文所述的OLIGO程序3.4或5.0版測定的。術語「抑制生長」是指至少一種腫瘤細胞類型的生長可以減少至少10％，更優選至少50％，最優選至少75％。對於腫瘤細胞，生長的減少可以通過測量小鼠內腫瘤的大小或腫瘤細胞體外形成集落的無能力加以確定。術語「哺乳動物」或「哺乳動物的」是指所有哺乳動物，包括人、羊、牛、馬、豬、犬、貓和鼠等。「懷疑患有腫瘤的哺乳動物」是指，哺乳動物可能患有增殖性機能紊亂或腫瘤，或者已被診斷為增殖性機能紊亂或腫瘤，或者以前被診斷為增殖性機能紊亂或腫瘤，所述腫瘤已經通過手術方法摘除，並且該哺乳動物被懷疑隱匿一些殘餘的腫瘤細胞。反義低聚核苷酸的製備本發明的反義低聚核苷酸可以通過常規的和眾所周知的工藝製備。例如，低聚核苷酸可以利用固相合成加以製備，特別是利用商業上可得到的設備，例如可從加拿大應用生物系統公司(AppliedBiosystemsCanadaInc.，Mississauga，Canada)得到的設備製備。低聚核苷酸還可以通過本領域已知的方法，用酶消化天然存在的核糖核苷酸還原酶R1或R2基因加以製備。反義低聚核苷酸的離析和純化如果需要，本文所述的反義低聚核苷酸的離析和純化可以通過任何適合的分離或純化方法進行，例如過濾、萃取、結晶、柱色譜、薄層色譜、厚層色譜、製備型低或高壓液相色譜或這些方法的組合。不過當然地，也可以使用其它相當的分離或離析方法。包含反義低聚核苷酸序列的表達載體，可以根據低聚核苷酸的序列，利用本領域已知的操作加以構建。本領域技術人員可以將載體構建為含有所有實現所需反義低聚核苷酸序列轉錄所要求的表達組件。因此，本發明提供包含轉錄控制序列的載體，該序列可有效連接到編碼反義低聚核苷酸的序列上。適合的轉錄和轉譯組件可以得自各種來源，包括細菌、真菌、病毒、哺乳動物或昆蟲的基因。適當的組件的選擇依賴於所選擇的宿主細胞。信息基因可以包括在載體內。適合的信息基因包括β-半乳糖苷酶(例如lacZ)、氯黴素、乙醯轉移酶、螢火蟲螢光素酶或免疫球蛋白或其部分。通過監測信息基因的表達，可以監測反義低聚核苷酸的轉錄。載體可以通過本領域中各種已知方法的任何一種引入到細胞或組織中。這樣的方法一般公開於Sambrook等；Ausubel等；Chang等，1995；Vega等；和《VectorsASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses》，並且包括例如穩定或瞬變的轉染、1ipofection、電穿孔和被重組病毒載體感染。適合實現本發明的宿主細胞包括但不限於CHO、COS、BHK、293和HeLa。用於哺乳動物細胞轉染的規程是本領域所熟知的，包括磷酸鈣介導的電穿孔和逆轉錄酶病毒(retroviral)與原生質體融合物介導的轉染。感染核酸的引入賦予若干優點。可以獲得更高的效率和組織類型特異性。病毒通常感染特殊的細胞類型並在其中繁殖。因此，病毒特異性可以用於在體內或者在組織或混合的細胞培養物中，使載體瞄準特殊的細胞類型。病毒載體還可以用特殊的受體或配體進行修飾，以通過以受體為媒介的事件來改變定向特異性。可以使本發明的低聚核苷酸成為不溶物。例如，低聚核苷酸可以結合到適合的載體上。合適的載體的實例是瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、交聯葡聚糖、瓊脂糖凝膠、羧甲基纖維素聚苯乙烯、濾紙、離子交換樹脂、塑料膜、塑料管、玻璃珠、聚胺-甲基乙烯基醚-馬來酸共聚物、胺基酸共聚物、乙烯-馬來酸共聚物、尼龍、絲等。載體的形狀可以是例如管形、試驗板、珠粒碟、球形等。不溶解的低聚核苷酸可以利用已知的化學或物理方法，例如溴化氰偶聯，使物料與適合的不溶性載體反應來製備。可以預期，本發明的低聚核苷酸可以是裂解mRNA的核酶。所述核酶優選地具有與本發明低聚核苷酸序列同源的序列和必要的用於裂解mRNA的催化中心。例如，可以選擇破壞核糖核苷酸還原酶mRNA的同源性核酶序列。本發明所採用的核酶類型可以從本領域已知的類型中選擇。已經鑑定了若干核酶結構家族，包括I組基因內區、RNA酶P、肝炎δ病毒核酶、錘頭核酶，和最初從菸草環斑病毒隨體RNA負鏈(sTRSV)衍生的發針核酶(Sullivan1994，美國專利No.5,225,347)。錘頭和發針核酶基序通常在基因療法中最適合於mRNA的反式裂解(Sullivan1994)。發針核酶優選用於本發明中。一般地，核酶長度為30至100個核苷酸。藥物製劑當用作藥物時，反義低聚核苷酸通常以藥物組合物的形式給藥。這些化合物可以通過各種途徑給藥，包括口服、直腸、透皮、皮下、靜脈內、肌內和鼻內給藥。這些化合物作為可注射的和口服的組合物都是有效的。這樣的組合物按藥學領域熟知的方式製備，並包含至少一種活性化合物。藥物組合物是例如靜脈內給藥的。可以預期，藥物組合物可以直接給藥到所治療的腫瘤。本發明還包括藥物組合物，該藥物組合物含有一種或多種反義低聚核苷酸作為活性成分，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。在製備本發明的組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合、用賦形劑稀釋或者包封在這樣的一種載體中，該載體可以是膠囊、小藥囊、紙或其他容器的形式。當賦形劑充當稀釋劑時，它可以是固體、半固體或液體物料，充當活性成分的媒介、載體或介質。因此，所述組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、錠劑、小藥囊、扁囊劑、酏劑、懸浮液、乳劑、溶液、糖漿劑、氣霧劑(作為固體或者在液體介質中)、軟膏劑(例如含有高達10％(重量)的活性化合物)、軟和硬膠囊劑、栓劑、無菌的可注射溶液和無菌的包裝粉劑。在製備製劑時，在與其他成分混合之前研磨活性化合物以提供適當的顆粒大小可能是必要的。如果活性化合物基本上是不溶性的，通常研磨至粒徑小於200目。如果活性化合物基本上是水溶性的，粒徑通常通過研磨調整到基本上均勻分布在製劑中的程度，例如約40目。一些適合的賦形劑實例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃芪膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿和甲基纖維素。製劑可以另外包括潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；溼潤劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑，例如甲基-和丙基羥基-苯甲酸酯；甜昧劑；和增香劑。本發明的組合物經過配製，可以在採用本領域已知的方法對患者給藥之後，提供活性成分的快速、持續或延遲釋放。優選將組合物配製成單位劑型，每劑含有約1.5mg至約3g、更通常為約10mg至約3.0g的活性成分。術語「單位劑型」是指物理學上不連續的單位，適合作為單一的劑量給人類受治療者和其他哺乳動物，每個單位含有經過計算可產生所需治療效果的預定劑量的活性物質以及適合的藥物賦形劑。反義低聚核苷酸在廣泛的劑量範圍內都是有效的，一般按藥學上的有效量給藥。有效量是給藥後減輕症狀的量。優選地，有效量是能夠抑制腫瘤細胞生長的量。優選地，有效量為約0.02mg/kg體重至約20mg/kg體重。不過應該明白，反義低聚核苷酸的實際給藥量將由醫師決定，要考慮有關的環境因素，包括所治療的疾病、所選擇的給藥途徑、實際給藥的化合物、各患者的年齡、體重和反應、患者症狀的嚴重性等。治療過程可以持續數天至數月，或者直到實現疾病減輕時為止。關於製備固體組合物，例如片劑，將主要的活性成分/反義低聚核苷酸與藥物賦形劑混合，形成固體的製劑前組合物，其中含有本發明化合物的均勻混合物。當稱這些製劑前組合物為均勻時，這表示活性成分平均分散在組合物中各處，這樣組合物可以被輕易地細分為同樣有效的單位劑型，例如片劑、丸劑和膠囊劑。本發明的片劑或丸劑可以是包衣的，或者被複合以提供具有長效優點的劑型。例如，片劑或丸劑可以包含內部劑量與外部劑量組分，後者是前者封套的形式。這兩種組分可以被腸溶層隔開，腸溶層的作用是抵抗胃中的崩解，允許內部組分完整進入十二指腸，或者延遲釋放。多種材料可以用作這樣的腸溶層或包衣，這些材料包括許多聚合的酸和聚合的酸與諸如蟲膠、鯨蠟醇和乙酸纖維素等材料的混合物。其中可以結合本發明的新型組合物的、用於口服或注射給藥的液體劑型包括水溶液、經過適當矯味的糖漿劑、水或油懸浮液、和經過矯味的採用食用油，例如玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的乳劑，以及酏劑和類似的藥物媒介。吸入或噴入用組合物包括在藥學上可接受的水或有機溶劑或其混合物中的溶液和懸浮液，及粉劑。液體或固體組合物可以含有本文所述的合適的藥學上可接受的賦形劑。優選地，該組合物通過口服或鼻呼吸途徑給藥，用於發揮局部或全身效果。在優選為藥學上可接受的溶劑中的組合物，可以利用惰性氣體霧化。經過霧化的溶液可以直接從霧化裝置中吸入，或者霧化裝置可以連接在面罩或間歇式正壓呼吸機上。溶液、懸浮液或粉劑組合物，可以優選通過口服或鼻部給藥，給藥裝置以適當的方式釋放製劑。本發明方法採用的另一種優選製劑採用透皮釋放裝置(「貼劑」)。這樣的透皮貼劑可以用於提供本發明反義低聚核苷酸的連續或不連續輸入，輸入量是受到控制的。用於藥劑釋放的透皮貼劑的構造和使用是本領域熟知的。例如參見美國專利5,023,252，該專利結合在此作為參考。這樣的貼劑可以構造成使藥劑連續、脈動或按需釋放。另一種優選的釋放方法涉及裸露的反義低聚核苷酸穿越真皮層的「散彈式」釋放。「裸露的」反義低聚核苷酸的釋放是本領域熟知的。例如參見Felgner等，美國專利No.5,580,859。可以預期，反義低聚核苷酸可以在反義低聚核苷酸的「散彈式」釋放之前包裝在液體媒介中。下列製劑實例用來舉例說明本發明的代表性藥物組合物。製劑例1製備含有下列成分的硬膠囊劑成分量(mg/粒膠囊)活性成分30.0澱粉305.0硬脂酸鎂5.0將上述成分混合，裝填在硬膠囊中，總量為340mg。製劑例2利用下列成分製備片劑成分量(mg/片)活性成分25.0微晶纖維素200.0膠體二氧化矽10.0硬脂酸5.0將各成分摻合在一起，壓製成片，每片重240mg。製劑例3製備含有下列組分的乾粉吸入製劑成分重量％活性成分5乳糖95將活性成分與乳糖混合，並將混合物加入到乾粉吸入器中。製劑例4如下製備片劑，每片含有30mg活性成分成分量(mg/片)活性成分30.0mg澱粉45.0mg微晶纖維素35.0mg聚乙烯基吡咯烷酮(10％無菌水溶液)4.0mg羧甲基澱粉鈉4.5mg硬脂酸鎂0.5mg滑石1.0mg總計120mg使活性成分、澱粉和纖維素通過No.20目U.S.篩，並充分混合。將聚乙烯基吡咯烷酮的溶液與所得粉末混合，然後通過16目U.S.篩。所形成的顆粒在50至60℃下乾燥，並通過16目U.S.篩。然後將預先通過No.30目U.S.篩的羧甲基澱粉鈉、硬脂酸鎂和滑石加入到顆粒中，混合後，在壓片機上壓製成片，每片重120mg。製劑例5如下製備膠囊劑，每粒膠囊含有40mg藥劑成分量(mg/粒膠囊)活性成分40.0mg澱粉109.0mg硬脂酸鎂1.0mg總計150mg將活性成分、澱粉和硬脂酸鎂摻合在一起，通過No.20目U.S.篩，裝填在硬膠囊中，總量為150mg。製劑例6如下製備栓劑，每枚含有25mg活性成分成分量活性成分25mg飽和脂肪酸甘油酯，至2000mg使活性成分通過No.60目U.S.篩，並懸浮在預先用最小必需熱量加熱熔化的飽和脂肪酸甘油酯中。然後將混合物倒在標稱容量為2.0g的栓劑模具中，並使其冷卻。製劑例7如下製備懸浮液，每5.0ml含有50mg藥劑成分量活性成分50.0mg黃原膠4.0mg羧甲基纖維素鈉(11％)微晶纖維素(89％)50.0mg蔗糖1.75g苯甲酸鈉10.0mg香料和色素適量純淨水，至5.0ml將活性成分、蔗糖和黃原膠摻合在一起，通過No.10目U.S.篩，然後與預先製備的微晶纖維素和羧甲基纖維素鈉的水溶液混合。將苯甲酸鈉、香料和色素用一些水稀釋，並在攪拌下加入。然後加入足量的水，達到所需體積。製劑例8成分量(mg/粒膠囊)活性成分15.0mg澱粉407.0mg硬脂酸鎂3.0mg總計425.0mg將活性成分、澱粉和硬脂酸鎂摻合在一起，通過No.20目U.S.篩，並裝填在硬膠囊內，總量為425.0mg。製劑例9如下製備一種製劑成分量活性成分5.0mg玉米油1.0ml製劑例10如下製備一種局部製劑成分量活性成分1-10g乳化蠟30g液體石蠟20g白軟石蠟至100g將白軟石蠟加熱至熔化。加入液體石蠟和乳化蠟，攪拌直至溶解。加入活性成分並繼續攪拌，直至分散。混合物然後冷卻為固體。其他可用於本發明的合適製劑可以在《Remington氏藥物科學》(Remington’sPharmaceuticalSciences)中找到。反義低聚核苷酸或包含所述反義低聚核苷酸的藥物組合物，可以包裝在方便的試劑盒中，其中還提供包裝在適合容器內的必要材料。本發明的低聚核苷酸和核酶調節腫瘤細胞的生長。因此提供了用於幹擾或抑制哺乳動物腫瘤細胞生長的方法，包括使腫瘤或腫瘤細胞與本發明的反義低聚核苷酸接觸。術語「接觸」是指將低聚核苷酸、核酶等加入到細胞懸浮液或組織樣本中，或者是指將低聚核苷酸等直接或間接對動物內的細胞或組織給藥。所述方法可以用於治療增殖性機能紊亂，包括各種形式的癌症，例如白血病、淋巴瘤(何杰金氏與非何杰金氏)、肉瘤、黑素瘤、腺瘤、實體組織癌、低氧腫瘤、口、咽、喉和肺的鱗狀細胞癌、泌尿生殖癌症例如宮頸癌和膀胱癌、造血癌症、結腸癌、乳癌、胰腺癌、腎癌、腦癌、皮膚癌、肝癌、頭頸癌和神經系統癌症，以及良性損害，例如乳突淋瘤。還包括其他增殖性機能紊亂，例如牛皮癬和涉及關節硬化、血管生成和病毒感染的那些增殖性機能紊亂。本發明的低聚核苷酸還可以用於治療耐藥性腫瘤。耐藥性腫瘤的實例是耐受化療劑的腫瘤，所述化療劑是例如5-氟尿嘧啶、絲裂黴素C、甲氨蝶呤或羥基脲，和表達高水平P-糖蛋白的腫瘤，已知P-糖蛋白帶來對多種抗癌藥，例如秋水仙鹼、長春花鹼和阿黴素的耐受性；或者表達多種耐藥蛋白的腫瘤，如Dreeley等所述。因此，可以設想，本發明的低聚核苷酸可以結合已知的抗癌化合物或化療劑給藥，或者除已知的抗癌化合物或化療劑外另外給藥。化療劑是可以抑制腫瘤生長的化合物。這樣的試劑包括但不限於5-氟尿嘧啶、絲裂黴素C、甲氨蝶呤和羥基脲。可以設想，化療劑的量既可以是有效量，即足以抑制腫瘤生長的量，也可以是小於有效量。可以想到，本發明的低聚核苷酸也可以與其他抗致瘤性的療法結合使用，例如放射療法，以增加放射療法的功效。已經發現，本發明的低聚核苷酸可減少轉移性腫瘤的生長，例如MDA-MB-231乳腺癌、HT-29結腸腺癌、H460肺癌和A2058黑素瘤的癌細胞。在發明的一個實施方案中，提供了用於減少哺乳動物轉移瘤生長的方法，該方法包括將一定量的與核糖核苷酸還原酶mRNA互補的低聚核苷酸，或表1、2和3所示的低聚核苷酸給藥。低聚核苷酸可以利用病毒或非病毒載體釋放。序列可以結合在彈夾或構成物內，以便本發明的低聚核苷酸在細胞中被表達。優選地，所述構成物含有適當的轉錄控制區，以允許低聚核苷酸在細胞中被轉錄。因此，本發明提供包含轉錄控制序列的載體，該轉錄控制序列可連接到編碼本發明低聚核苷酸的序列上。本發明進一步提供宿主細胞，選自適合的真核生物和原核生物細胞，將它們用這些載體轉化。適合的載體是已知的，並優選含有實現所需的序列轉錄所必要的所有表達組件。噬菌粒是這類有益載體的具體實例，因為它們既可以用作質粒，也可以用作噬菌體載體。載體的實例包括病毒，例如噬菌體、杆狀病毒、逆病毒、DNA病毒、脂質體和其他重組載體。所述載體還可以含有適用於原核生物或真核生物宿主系統的組件。本領域的普通技術人員將知道哪些宿主系統與特定的載體是相容的。所述載體可以通過穩定或瞬變的轉染、lipofection、電穿孔和被重組病毒載體感染而被引入到細胞內。可以向所述載體加入其他特徵，以確保它的安全性和/或提高它的療效。這樣的特徵包括例如標記物，可以用於被動地選擇被重組病毒感染的細胞。這樣的被動選擇標記物的一個實例是TK基因，它帶來對抗病毒藥更昔洛韋的敏感性。還可以包括限制特定細胞類型表達的特徵。這些特徵包括例如啟動子和調節組件，它們對所需的細胞類型是特異性的。逆病毒載體是可用於體內引入所需核酸的載體的另一個實例，因為它們賦予諸如側向感染和定向特異性等優點。側向感染是這樣一種過程，通過該過程，單一被感染的細胞產生很多後代病毒體，感染相鄰的細胞。結果是大面積細胞被迅速感染。用在本發明方法中的載體，可以根據所要針對的所需細胞類型加以選擇。例如，如果所要治療的是乳癌，那麼可以使用對上皮細胞專一的載體。類似地，如果所要治療的是造血系統的細胞，那麼優選對血液細胞專一的病毒載體。實用性本發明的反義低聚核苷酸可以用於各種目的。它們可以用於抑制哺乳動物細胞中核糖核苷酸還原酶基因的表達，導致抑制該細胞的生長。低聚核苷酸可以用作雜交探針，用於檢測哺乳動物細胞中核糖核苷酸還原酶mRNA的存在。當如此使用時，低聚核苷酸可以用合適的可檢測基團(例如放射性同位素、配體、特異性結合對的另一組分，例如生物素)標記。最後，低聚核苷酸可以用作分子量標記物。為了進一步闡述本發明及其優點，給出下列具體的實施例，但是無論如何也不表示它們限制權利要求書的範圍。實施例在下列實施例中，所有溫度均為攝氏度(除非另外指出)，所有百分率均為重量百分率(除非另外指出)。在下列實施例中，下列縮寫具有下列含義。如果縮寫是沒有經過定義的，它具有一般所接受的含義μM＝微摩爾mM＝毫摩爾M＝摩爾ml＝毫升μl＝微升mg＝毫克μg＝微克PAGE＝聚丙烯醯胺凝膠電泳rpm＝每分鐘的轉數ΔG＝自由能，低聚核苷酸雙鏈體穩定性的一個量度kcal＝千卡FBS＝牛胎血清DTT＝二硫蘇糖醇SDS＝十二烷基硫酸鈉PBS＝磷酸鹽緩衝鹽水PMSF＝苯甲基磺醯氟通用方法本領域已知的標準分子生物技術一般遵照Sambrook等(1989，1992)、Ausubel等(1989)和Perbal，(1988)中的敘述，不再贅述。聚合酶鏈反應(PCR)一般按照《PCR規程方法和應用指南》(PCRProtocolsAGuideToMethodsAndApplications)，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)進行。通用的免疫學方法本領域已知的標準免疫學方法一般遵照Stites等(eds)《基礎與臨床免疫學》(BasicandClinicalImmunology)(第8版)，AppletonLange，Norwalk，CT(1994)和MishellandShugi(eds)《細胞免疫學中的精選方法》(SelectedMethodsinCellularImmunology)，W.H.FreemanandCo.，NewYork(1980)，不再贅述。致瘤性和轉移的測定如前人所報導的方法測定惡性腫瘤潛在性(Wright，1989a；Egan等，1987a，1987b；Damen等，1989；Taylor等，1992；Stokoe等，1994)。六至八周齡C3H/HeN同基因小鼠(CharlesRiver，Quebec)用於評價細胞的致瘤性和轉移的潛在性。細胞是從次匯合的對數生長的培養物中製備的，通過小心地用胰島素/EDTA溶液處理加以收集，並在平衡鹽溶液中調節至適當的濃度。關於致瘤性(腫瘤潛伏期)測定，將體積為0.1ml的1×105個細胞皮下注射到小鼠背部，並記錄形成可被觸診檢測到的腫瘤(2×2mm)所需的時間。通過在腫瘤出現後每天測量腫瘤直徑並估計腫瘤基本面積，評價腫瘤的生長[Damen等，1989]。乘以腫瘤橫切面的大小，測定腫瘤大小。21天後摘除小鼠中的腫瘤，記錄腫瘤重量。在沒有腫瘤形成的情況下，注射後餵養小鼠2個月，然後處死。關於實驗性轉移測定(轉移潛在性的測定)，將體積為0.2ml的1×105個細胞注射到6-8周齡C3H/HeN同基因小鼠尾靜脈中，21天後估計肺腫瘤數。處死小鼠，氣管內注射布安氏液(Bouin’ssolution，苦味酸、甲醛、乙酸(15∶5∶1))進行肺染色[Egan等，1987b；Damen等，1989]。藉助解剖顯微鏡計數肺腫瘤。為了確認所注射的試驗細胞與對照細胞數量相等，在含有生長培養液的培養平皿副本中接種大約100個細胞/平皿。培養10天後，平皿用亞甲基藍染色，評價集落。核糖核苷酸還原酶測定如前人所報導的方法，測定細胞粗提取物中核糖核苷酸還原酶活性[Lewis等，1978；Hurta和Wright，1992；Hurta和Wright1995A]。從對數生長的細胞中獲得酶製劑，所述細胞通過三次冷凍-融化循環，溶解在pH7.2的磷酸鹽緩衝鹽水中，該鹽水中含有lmm二硫蘇糖醇和lmM蛋白酶抑制劑，AEBSF(Calbiochem，SanFrancisco，CA)。離心後，如前人所詳述的方法，用含[14C]-CDP(MoravekBiomedical，Brea，CA)的上層清液，進行酶活性測定[Lewis等，1978；Hurta和Wright1992；Fan等，1996A；Choy等，1988]。蛋白質印跡分析所採用的操作已有報導[Fan等，1996a；1996b；Choy等，1988]。簡言之，製備細胞提取物後，測定總蛋白含量，並在10％線性SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分析等分試樣。蛋白質轉移和封閉後，將膜與抗-R2兔多克隆抗體培養[Fan等，1996A]。使用與鹼性磷酸酶共軛的山羊抗-兔IgG(Sigma)檢測R2蛋白。低聚核苷酸反義低聚核苷酸選自與核糖核苷酸還原酶mRNA互補的序列，以便該序列表現出最小的顯示雙鏈體形成、發針形成和均低聚物/序列重複的可能性，但是具有高的結合核糖核苷酸還原酶mRNA序列的可能性。另外，消除使人或動物對人和小鼠中其他經常出現的或重複的序列具有易感性的錯誤。這些性質利用計算機建模程序OLIGO引物分析軟體3.4或5.0版(NationalBiosciences，Inc.，Plymouth，MN)加以測定。低聚核苷酸序列在合成時被完全硫代酸化，表1和2中用(s)表示的部分硫代酸化除外。細胞系從美國典型培養物保藏中心(ATCC)可以得到不同的人癌細胞系，包括肺癌(H460)、卵巢腺癌(SK-OV-3)、肝細胞癌(HepG2)、乳腺癌(MDA-MB-231)、轉移性胰腺癌(AsPC-1)、結腸腺癌(HT-29)、人黑素瘤細胞系(A2058)、人腦癌(U87)細胞。在補充有10％牛胎血清(FBS)的α-MEM培養液(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)中供養細胞系。實施例1R2與活化致癌基因的協同性為了測定核糖核苷酸還原酶的決速性R2組分的反常表達的惡性潛在性，本發明人研究了攜帶小鼠R2組分的逆病毒表達載體(SH/mR2)(Fan等，1996b)穩定感染的細胞的性質。本發明人進一步探究了R2與活化致癌基因之間的相互作用。表達載體如Fan等[1996b]所述，構建和包裝用於人Myc表位-標記的小鼠R2組分的逆病毒表達載體SH/mR2。病毒儲備溶液的感染性＞1×104集落形成單位/ml。表達T-24H-ras的質粒pHO6Ti和選擇性標記物neo，用於惡性轉化[Egan等，1987a，1987b；Taylor等，1992]。M.Symons提供了活化的Rac-1質粒(V12Rac-1)[Stokoeetal.，1994]。細胞和細胞培養物小鼠細胞系BALB/c3T3、NIH3T3，和四種名為Cl、NR4、r-2與r-3的T24H-ras轉化10T1/2細胞系，以前已經用作R2逆病毒載體的受體[Fan等，1996b]。將細胞在補充有10％小牛血清(FetalcloneIII，Hyclone，Logan，UT)的α-最低必需培養液(α-MEM)(Gibco，GrandIsland，NY)中進行常規培養。在聚凝胺的存在下，用SH/mR2或對照病毒LXSH感染細胞[Miller等，1993]，藉助潮黴素的選擇性得到穩定的感染體(＞1×104克隆)，並將之匯集在一起[Fan等，1996b；Miller等，1993]。如前人所述方法[Lewis等，1978；Egan等，1987a；Hards和Wright，1981]，測定細胞分化時間、平板接種效率(platingefficiency)，通過估計相對集落形成效率測定對羥基脲細胞毒性的相對敏感性。在含有15ml基本瓊脂(含0.5％Bacto-瓊脂的加10％小牛血清的α-MEM)和10ml生長瓊脂(含0.33％瓊脂的α-MEM，含有10％小牛血清)的10cm組織培養板中，估計在軟瓊脂中的生長。從次匯合的培養物中獲得細胞，10-15天後評價集落[Egan等，1987a，1987b；Hards和Wright，1981]。在細胞用SH/mR2或LXSH感染或者用T-24Ras或V12Rac-1質粒轉染之後，通過用磷酸鈣沉澱法測定轉化灶形成，進行轉化分析[Taylor等，1992]。感染或轉染後40小時，將細胞分盛在三個10cm組織培養板中，每日供應20ml新鮮的完全培養液(α-MEM加10％小牛血清)達10-14天，用亞甲基藍染色，評價轉化灶[Taylor等，1992]。對所有實驗的轉染效率進行常規測定，系通過用T-24Ras或V-12Rac-1質粒共轉染來自大腸埃希氏桿菌(Esherichiacoli)的β-半乳糖苷酶的哺乳動物表達質粒，然後將細胞用X-gal處理，計數藍色細胞數[Price等，1987]。在某些情況下，選擇T-24Ras質粒轉染的板使用遺傳黴素(geneticin)，大約14天後，在用亞甲基藍染色，評價耐藥性集落。致瘤性和轉移測定如上所述測定惡性潛在性。R2蛋白分析蛋白質印跡分析操作以前已有描述，例如使用抗-myc小鼠單克隆9E10抗體(ATCC，Rockville，MD)[Fan等，1996b]或抗-R2兔多克隆抗體[Chan等，1993]。為了測定細胞周期期間的重組R2蛋白表達，如前人所述[Blosmanis等1987；Chadee等，1995]，在9E10/螢光素異硫氰酸酯抗體標記之後，進行流動血細胞計數分析。膜締合的Raf-1蛋白測定如Qui等所述製備膜部分，在用標準Bio-Rad分析法測定蛋白質含量後，與Raf-1蛋白特異性多克隆抗體(SantaCruzBiotechnologyInc.，SantaCruz，CA)用於蛋白質印跡分析。進行Raf-1帶的光密度測量分析，藉助用考馬斯藍(Coomassieblue)染色的平行凝膠上很好分離的帶的光密度分析，校正每個樣品中的Raf-1蛋白含量。核糖核苷酸還原酶測定如上所述進行測定。在某些實驗中，將純化的重組R1蛋白[Salem等，1993]與9E10抗體-沉澱的R2蛋白[Hurta和Wright，1992]結合，進行酶的測定。在本例中，將20μg9E10抗體和50μl葡萄球菌蛋白A-瓊脂糖(SigmaChem.Co.，St.Louis，MO)加入到1ml離心的溶解細胞上層清液中，在4℃搖動器上放置2小時。將葡萄球菌蛋白A瓊脂糖-免疫複合物用含有1mg/ml牛血清白蛋白的1ml冷磷酸鹽緩衝液洗滌三次。然後測定免疫複合物的核糖核苷酸還原酶活性[Lewis等，1978；Hurta和Wright，1992；Fan等，1996b；Choy等，1988].MAPK活性測定將匯合率＞90％的培養物壓在不含血清的培養液中[Stokoe等，1994；Jelinek等，1994]，如前人所述方法進行提取[Alessi等，1995]。利用與蛋白質的非中和抗體共軛結合的瓊脂糖珠粒(SantaCruzBiotechnology，Inc.)對MAPK-2蛋白進行免疫沉澱，並通過利用得自UpstateBiotechnology，Inc.(LakePlacid，NY)的MAPK測定試劑盒測量磷酸化髓磷脂鹼性蛋白的能力，測定免疫複合物的激酶活性。結果生物學活性R2蛋白的表達為了測定核糖核苷酸還原酶的限速性R2組分的反常表達的惡性潛在性，研究了攜帶小鼠R2組分的逆病毒表達載體(SH/mR2)[Fan等，1996b]穩定感染的細胞的性質。這種表達載體的使用可以實現R2蛋白的高效感染和穩定表達。為了區分載體基因產物與內源性R2，將編碼10個胺基酸加甲硫氨酸的人c-Myc表位，加入到R2cDNA的5』端。圖1A顯示，特異性識別Myc-表位序列的9E10抗體的蛋白質印跡分析，在SH/mR2穩定感染的BALB/c3T3和NIH3T3細胞(分別稱之為B3/mR2和N3/mR2)中檢測到大約45kDa的R2蛋白，但是在對照載體(LXSH)感染的B3/SH或N3/SH細胞中沒有檢測到。R2特異性抗體在表達載體感染的細胞中檢測到內源性以及重組R2蛋白，而正如預期的那樣，在對照載體感染的細胞中僅觀察到內源性蛋白質(圖1B)。9E10/螢光素異硫氰酸酯抗體標記之後的流動血細胞計數分析證明，重組R2蛋白基本上在整個細胞周期內被表達(圖1C)。利用9E10抗體所進行的間接顯微鏡分析指出，B3/mR2和N3/mR2種群中基本上每個細胞都表達了Myc-表位標記的R2蛋白。本發明人進行了若干實驗，證明載體表達的R2是生物學活性的。首先，在集落形成實驗中，觀察到與B3/SH和N3/SH細胞[Fan等，1996b]相比，B3/mR2和N3/mR2細胞耐受羥基脲的細胞毒作用，所述羥基脲是一種R2蛋白抑制劑[Wright，1989A；Wright等，1989B]。其次，測定了核糖核苷酸還原酶的活性，並在三個獨立的實驗中發現，B3/mR2和N3/mR2細胞中的CDP還原酶活性分別為1.96±0.32和1.71±0.11納摩爾/mg蛋白質/小時，這是利用B3/SH和N3/SH細胞所觀察到的結果(分別為0.74±0.14和0.83±0.08納摩爾/mg/小時)的2.6和2.1倍。最後，將純化的重組R1蛋白[Salem等，1993]與9E10抗體沉澱的R2蛋白結合，進行了酶測定。當使用B3/mR2和N3/mR2細胞作為Myc-表位標記的R2來源時，檢測到顯著水平的活性(15至20納摩爾/mg/小時)，而如預測的那樣，當使用B3/SH或N3/SH細胞時，沒有發現活性。通過異常R2基因表達測定Ras轉化的潛在性上述結果說明，可以改變細胞的生物學活性R2蛋白的調節作用。因此，試驗改變R2表達，看它是否進一步轉化象BALB/c3T3或NIH3T3那樣的細胞。類似於對照的B3/SH和N3/SH細胞以及非感染的母細胞系，B3/mR2和N3/mR2培養物在組織培養板上保持平坦的非轉化形態，並表現接觸性與密度抑制性生長。在用逆病毒SH/mR2載體感染後，在BALB/c3T3或NIH3T3細胞中沒有觀察到轉化灶(圖2A，a和b)。結果表明，R2基因表達的反常並不獨自轉化BALB/c3T3或NIH3T3纖維原細胞。為了驗證反常R2表達可能與象H-ras那樣的致癌基因起協同作用這一假設，將含有T24H-ras的表達質粒轉染到從BALB/c3T3或NIH3T3衍生的已建立的重組R2表達細胞種群中。與N3/SH對照細胞相比，在H-ras轉染的N3/mR2細胞中觀察到所形成的轉化灶數有一貫的和顯著的增加(3.4倍)(圖2B，c和d和圖2C)。在將H-ras轉染的B3/mR2細胞與B3/SH細胞比較時，甚至觀察到更明顯的增加，約為70倍(圖4B，a和b和圖2C)。即使N3/mR2和B3/mR2細胞的轉染效率事實上比N3/SH和B3/SH細胞低約50％也是如此，所述轉染效率是這樣測定的用大腸埃希氏桿菌β-半乳糖苷酶的表達質粒共轉染H-ras後，評價G418選擇的集落和/或計數藍色細胞[Price等，1987]。通過異常R2基因表達測定Ras惡性腫瘤潛在性由於改變了的R2基因表達和活化的H-ras的組合，在ras被轉染到改變了的R2表達細胞中的轉化灶形成實驗中起協同作用，所以如下進一步試驗這種基因組合用逆病毒載體SH/mR2感染四種獨立的H-ras轉化10T1/2細胞系，即C1、NR4、r-2和r-3，它們以前已被鑑定過[Egan等，1987a，1987b；Taylor等，1992；Stokoe等，1994]。用潮黴素選擇穩定的感染體，蛋白質印跡分析和酶活性測定證實，這些感染體表達生物學活性的Myc-標記的R2蛋白。軟瓊脂生長實驗揭示，含有重組R2序列的H-ras轉化細胞，在半固體生長瓊脂中產生集落的效率，大大高於未感染的母體種群(例如r-3)或對照載體感染的細胞(C1，NR4，r-2)(表4)。表4含有重組R2載體的ras-轉化細胞在軟瓊脂中的集落形成的增加a所代表的集落數是三次獨立實驗所得結果，但是r-2/SH和r-2/mR2細胞所得的結果，是來自單一實驗的一式三份平皿的結果。ND＝未檢測到。另外，很多由重組R2感染的細胞所形成的集落在尺寸上更大(圖3A)。當在固體表面上生長時，由於每對重組R2表達和對照細胞種群具有幾乎相同的生長速率(C1/SH為12.9小時，C1/mR2為12.2小時，r-2/SH為13.5小時，r-2/mR2為13.9小時，r-3為11.6小時，r-3/mR2為11.9小時，NR4/SH為14.1小時，NR4/mR2為14.3小時)、平板接種效率(C1/SH為58％，C1/mR2為55％，r-2/SH為59％，r-2/mR2為63％，r-3為91％，r-3/mR2為88％，NR4/SH為73％，NR4/mR2為75％)，和細胞周期相分布(數據沒有顯示)，在軟瓊脂和轉化灶形成實驗中所觀察到的變化表明，反常R2表達與活化H-ras的組合，在體內可以導致更大的惡性潛在性。因此，在同基因的C3H/HeN小鼠中，比較C1/mR2和C1/SH細胞的致瘤性與轉移可能性。觀察到在惡性潛在性上有明顯差異。與C1/SH細胞相比，C1/mR2細胞表現出更短的腫瘤潛伏期和更大的腫瘤生長(圖3B)。此外，轉移瘤測定清楚地揭示，C1/mR2細胞比C1/SH細胞更為惡性，並產生顯著更多的肺腫瘤(圖3C)。R2基因表達與致癌基因的協同性上述結果說明，改變了的R2表達與活化的H-ras在體外轉化和體內惡性腫瘤測定中起協同作用。由於沒有發現可以解釋這種協同作用的，生長速率或細胞周期相分布隨著例如細胞周期調節作用的變化而有明顯差異，驗證了下列想法。反常R2表達與ras是通過提高Ras信號途徑的活性而起協同作用嗎？這與顯示ras表達與惡性潛在性之間的直接相關性的研究是一致的[Egan等，1987a，1987b；Wright等，1993；Bradley等，1986]。用於調節基因表達的主要Ras途徑涉及Raf-1蛋白激酶。活化的Ras將Raf聚集到質膜處，在此Raf和象MAPK那樣的下遊信號分子被活化[Stokoe等，1994；Jelinek等，1994；Leevers等，1994]。利用Raf-1特異性抗體，比較了在含有反常R2表達的六種BALB/c3T3、NIH3T3和10T1/2派生細胞系與僅含有內源性R2蛋白的對照細胞中，與膜締合的Raf-1水平(圖4A)。在所有六種情況下，含有反常R2的細胞系均顯示與膜締合的Raf-1增加，平均增加約30％，這是非常顯著的(p＜0.001)。與上述觀察結果一致的是，具有反常R2表達的細胞系的MAPK-2活性表現出一貫的和顯著的增加，增加約70％(p＜0.001)(圖4B)。致癌基因Ras也活化了Rac途徑，後者與Raf途徑是平行的，因此活性Rac-1基本上與膜-定向的Raf-1在惡性轉化中起協同作用[Qiu等，1995]。如果由Raf-1易位與活化調節的MAPK活化對本例中的上述R2/ras協同作用具有重要意義，那麼異常R2表達應當與活化的Rac-1在細胞轉化中起協同作用，因為以前已經顯示，活化的Raf-1與Rac-1在轉化機理上是協同的[Qiu等，1995]。圖4C顯示這種預測是正確的，因為在活化的Rac-1與R2之間觀察到正的轉化協同作用，其方式類似於Ras與R2，正如用活化V12Rac-1轉染的N3/mR2和N3/SH細胞的轉化灶形成所測量到的[Qiu等，1995]。這些觀察結果與如下見解是一致的，即反常R2基因表達與象ras和rac那樣的致癌基因，是通過增量調節Raf易位和MAPK途徑活性而起協同作用的，但是它們不排除這樣的可能性，即也可能涉及其他涉及活化Raf的轉導途徑，因為有證據表明，Raf能夠通過不涉及MAPK的途徑調節某些細胞的活性[Lenormand等，1996；Koong等，1994；Agarwal等，1995]。本實施例第一次指出，哺乳動物核糖核苷酸還原酶的R2組分是新的惡性腫瘤決定子，它能夠與活化的致癌基因起協同作用，以改變惡性潛在性。重要的是注意到在本實施例之前，R2在細胞中的唯一角色是核糖核苷酸還原酶的限速性組分。本實施例證明，R2還能參與其他關鍵的細胞功能，並且通過與致癌基因的協同作用，在決定惡性潛在性中起到直接的作用。實施例2R2基因表達與藥物敏感性和基因組穩定性的變化細胞系和培養條件羥基脲耐受性小鼠細胞系H-2、H-4、LHF和SC2是從小鼠L細胞衍生的，已經被Choy等和McClarty等表徵。使用BALB/c3T3細胞作為R2逆病毒表達載體(B3/mR2和B3/R2c2細胞系)或缺少R2序列的相同逆病毒載體(B3/SH細胞)的受體[Fan等，1996a；1996b]。還使用NIH-3T3細胞作為R2逆病毒表達載體(N/R2-4細胞系)或缺少R2序列的這種逆病毒載體(N/SH細胞)的受體，如前人所述[Fan等，1996a；1996b]。通過用LipofectAmine(LifeTechnologies，N.Y)進行共轉染[Damen等，1991]，N/R2±ASR2細胞系是含有R2編碼序列和反義取向的R2序列的逆病毒載體的受體。RP3和RP6細胞是已經用T-24H-ras致癌基因和p53基因的突變致癌基因形式轉染的10T1/2小鼠細胞[Taylor等，1992]，通過用LipofectAmine試劑轉染，它們也被用作含有反義取向的R2編碼區的逆病毒載體的受體[Fan等，1996b]，得到RP3/ASR2和RP6/ASR2細胞。1B細胞是p53-/-，是從胚胎期纖維原細胞衍生的[Lowe等，1994]。所有細胞在37℃下，在含有5％CO2的潮溼大氣中，在α-最低必需培養液(Gibco，GrandIsland，NY)中培養，培養液中含有10％牛胎血清(Intergen，Purchase，NY)和抗生素(100單位/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素)。藥物選擇在有或沒有藥物的存在下，將500至1-2×105個細胞加入到100mm組織培養皿中的生長培養液中，培養液含有10％透析過的牛胎血清[Huang等，1995a；Choy等，1988]。培養液每周用新鮮的培養液代替，培養二至三周。通過亞甲基藍染色，用肉眼觀察存活的細胞，並記錄有約50個或更多個細胞的集落[Huang等，1995a]。相對集落形成率定義為在藥物的存在下產生集落的能力除以在沒有藥物存在下的這種能力。基因擴增測定通過苯酚-氯仿萃取法，從對數生長的細胞中提取基因組DNA[Blin和Stafford，1976]，並如文獻所述[Huang等，1995a；Choy等，1988]，用DNA印跡分析測定潛在的基因擴增事件，使用cDNA片段作為探針，見下文注釋。使用編碼CAD蛋白複合物的、含有CADcDNA的pCAD142質粒[Shigesada等，1985]，得到作為探針的6.3KbHindIII片段。含有小鼠二氫葉酸鹽還原酶基因的pLTRDHFR26質粒[Chang等，1978]提供作為探針的1.3KbBamH1片段。從cDNA克隆10製備核糖核苷酸還原酶R2的探針1487bpSalI/PstI[Huang等，1995a；Choy等，1988]。由泳凝膠移動性轉移測定(EMSA)EMSA用於測定野生型p53的存在。基本上如文獻所述方法進行測定[Price和Calderwood，1993]，並作下列修改。將150mm平板上的細胞用冰冷的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌一次，倒在1mlPBS中。在1300g、4℃下離心10分鐘使細胞形成顆粒狀物，貯存在-80℃下。在冰上，使顆粒狀物在300μl緩衝液A(20mMHEPES{pH7.6}，20％甘油，10mMNaCl，1.5mMMgCl2，0.2mMEDTA和0.1％TritonX-100)中溶解20分鐘，製備細胞核。緩衝液A還含有1mM苯甲基磺醯氟(PMSF)和10mM二硫蘇糖醇(DTT)。在1300g、4℃下離心10分鐘分離細胞核。通過將含有500mMNaCl、1mMPMSF和10mMDTT的20-40μl緩衝液A加入到細胞核顆粒狀物中，並在冰上培養20分鐘，製備細胞核溶解物。在16000g、4℃下離心，使所提取的細胞核形成顆粒狀物；除去上層清液，利用Biorad蛋白質測定程序(Biorad)，測定等分試樣中的蛋白質。使用T4多核苷酸激酶(Boehringer)，將細胞核溶解物與末端用[γ32P]-ATP標記的過量雙鏈p53一致結合序列(GGACATGCCCGGGCATGTCC)(SEQIDNo162)培養。在含有20mMHEPES(pH7.6)、20％甘油、1.5mMMgCl2、0.2mMEDTA、1mMPMSF和10mMDTT的緩衝液中進行DNA結合。每個結合反應含有5μg細胞溶解物、10μg雙鏈poly(dI-dC)(Pharmacia)、1.4ng經過標記的一致探針和100ng單克隆抗體421(SantaCruz)，總體積為20μl。DNA結合可以在室溫下進行30分鐘，通過5％非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離混合物。電泳是在室溫下進行的，直到二甲苯苯胺跟蹤染料已經運動到凝膠底部且自由探針已經離開凝膠時為止。統計學分析採用協方差分析比較不同細胞系組之間的劑量反應數據，顯著性水平設置在α＝0.05[Huang等，1995a]。結果羥基脲耐受性細胞系對非選擇性藥物的敏感性降低H-2、H-4、LHF和SC2是所選擇的耐受抗腫瘤劑羥基脲細胞毒作用的小鼠L細胞系。這四種細胞系在集落形成率實驗中表現出對羥基脲的耐受性，是作為它們衍生來源的野生型小鼠L細胞系的大約18(H-2)至30(SC2)倍[Choy等，1988；McClarty等，1988]。它們還含有高水平的核糖核苷酸還原酶活性，為2.2倍(H-2)至17倍(LHF和SC2)，這主要由於核糖核苷酸還原酶的限制酶活性的R2組分增加，和增殖中的小鼠細胞的細胞分化作用增加。表5通過相對集落形成率所測定的藥物敏感性×104A.PALAB.MTX相對集落形成率以±SE表示，所示數值來自4至8次測定。當將用H2(p＝0.0004)、H4(p≤0.0001)、LHF(p≤0.0001)和SC2(p≤0.0001)所得數據分別與用母體野生型(W.T.)細胞系所得數據進行比較時，觀察到統計學上的顯著性差異。表5顯示，與母體野生型小鼠L細胞相比，四種羥基脲耐受性細胞系在集落形成實驗中，也對N-(膦乙醯基)-L-天冬氨酸酯(PALA)和甲氨蝶呤(MTX)的細胞毒作用不太敏感。這些藥物敏感性上的差異是非常顯著的，與母體野生型小鼠細胞相比，每種細胞系的p值都＜0.0001。儘管已經公開了很多可以解釋耐藥性的機理[Wright，1989；Kohn，1996]，不過對MTX和PALA的耐受性經常伴有藥物定向基因產物水平的增加，所述產物分別是二氫葉酸酯還原酶(DHFR)或CAD(含有氨基甲醯基磷酸酯合成酶、天冬氨酸酯氨基甲醯基轉移酶和二氫乳清酸酶的多功能多肽)，這通常通過基因擴增的機理發生[Huang等，1995a；Livingston等，1992；Yin等，1992；Mai，1994；Stark，1993]。的確，小鼠細胞中PALA耐受性的首要的、並且也許是唯一的機理是經由CAD基因擴增而發生[Stark，1993]。因此，檢查在這兩種藥物以正常的對細胞有毒的濃度存在下，發育的集落是否發生可能的基因擴增事件。圖5顯示，在PALA或MTX存在下增殖的細胞表現出CAD或DHFR基因複製數量增加。與以前的研究[Stark，1993；Huang等，1995b；0tto等，1989；Stark等，1990]一致的是，所有在PALA中發育並檢測的集落(10/10)顯示CAD基因擴增。另外正如前人所報導的[Huang等，1995b]，某些但不是所有在MTX的存在下發育的集落(3/6)顯示DHFR基因擴增。直接驗證R2基因表達與藥物敏感性降低之間的關係由於除了核糖核苷酸還原酶的變化以外，羥基脲耐受性小鼠細胞還含有其他生物化學改變[Wright等，1989B]，利用含有編碼小鼠R2序列的逆病毒表達載體的細胞和含有相同逆病毒載體但是缺少R2序列的細胞，可直接驗證藥物敏感性與R2水平增加之間的關係。由於編碼R2的逆病毒表達載體的存在，B3/mR2是含有高R2蛋白的BALB/c3T3細胞種群，B3/SH是作為對照物的具有野生型水平R2蛋白並且含有空白載體的細胞種群。B3/R2c2是從B3/mR2種群中選擇的具有高R2蛋白的克隆系。以前的報導顯示，R2基因表達的增加導致羥基脲的耐受性，與之一致，表6顯示B3/mR2和B3/R2c2細胞在一定濃度範圍內，比B3/SH細胞明顯更加耐受羥基脲的細胞毒作用。這些結果進一步證明，B3/mR2和B3/R2c2細胞表達的核糖核苷酸還原酶的活性R2組分的水平提高。B3/mR2和B3/R2c2細胞對PALA和MTX的細胞毒作用也顯著不敏感，所述藥物作用於除核糖核苷酸還原酶以外的位點(表6)。對這兩種藥物的耐受性範圍為，在100nMMTX下的大約10倍，至在最大試驗濃度的PALA下的超過100倍。表6通過相對集落形成率所測定的藥物敏感性×104A.羥基脲B.PALAC.MTX相對集落形成率以±SE表示，所示數值來自4至12次測定。當將用B3/mR2或B3/R2c2所得數據與用B3/SH所得數據進行比較時，觀察到統計學上的顯著性差異(在羥基脲、PALA或MTX的存在下，所得數據的所有p值都≤0.0001)。此外，DNA印跡分析顯示，在PALA或MTX存在下發育的集落含有擴增的CAD或DHFR基因(圖6)，儘管如用小鼠L細胞所觀察到的(圖5)和已經在其他研究中所報導的那樣[Hurta和Wright，1992；Hurta等，1991]，不是所有在含MTX培養液中發育的集落都表現DHFR基因擴增。與PALA耐受性不同，小鼠細胞中的MTX耐受性可以通過各種機理發生。使用含有R2表達逆病毒載體的NIH-3T3細胞，進一步驗證了由含有高水平核糖核苷酸還原酶R2組分的細胞所表現出來的對化療化合物的敏感性變化(表7)。與含有缺少R2編碼序列的逆病毒載體的細胞(N/SH)相比，這些細胞(N/R2-4)耐受羥基脲。N/R2-4細胞也顯著更耐受MTX。儘管與N/SH細胞相比，N/R2-4細胞顯示耐受PALA的趨勢，但是這種趨勢在統計學上是不顯著的。後一觀察結果表明，除了R2水平增加以外，本研究所用細胞系之間的基因差異所固有的其他因素，也能夠影響藥物敏感性反應。表7通過相對集落形成率測定的藥物敏感性×104A.羥基脲B.PALAC.MTX相對集落形成率以±SE表示，所示數值來自4至6次測定。當表示為0時，每次試驗使用1×105個細胞的測定次數如所示為4(n＝4)。當將N/SH在PALA的存在下所得數據與N/R2-4或N/R2+ASR2在羥基脲的存在下(兩者均p＝0.0001)或者在MTX的存在下(分別地，p＝0.0002和0.032)所得數據進行比較時，觀察到統計學上的顯著性差異。當將N/SH在PALA的存在下所得數據與N/R2+ASR2所得數據進行比較時，也觀察到統計學上的顯著性差異(p＝0.002)，但是沒有與N/R2-4所得數據相比。因此，通過引入到N/R2-4細胞中的R2反義構造物的表達，產生N/R2+ASR2種群，這樣研究了降低R2水平之後的藥物敏感性，驗證了R2水平對決定藥物敏感性特徵具有重要意義這一假設。圖7顯示，R2蛋白水平在N/R2+ASR2細胞中比N/R2-4細胞中明顯降低。N/R2+ASR2細胞比N/R2-4細胞對羥基脲、PALA和MTX顯著更敏感(表7)。此外，R2反義表達細胞對這三種藥物的敏感性，比含有空白載體的對照N/SH細胞顯著增加(表7)。用活化ras和p53的突變致癌基因形式轉染的小鼠10T1/2細胞對化療劑是非常耐受的[Huang等，1995b]。R2反義表達能夠增加NIH-3T3細胞對羥基脲、PALA和MTX的敏感性這一觀察結果，引導我們驗證這樣一種可能性，即在R2反義序列的存在下，含有ras和突變p53的細胞也可能表現出耐藥性特徵降低。表8顯示這是正確的。與含有相同載體但是沒有反義取向的R2的細胞相比，含有R2反義序列的細胞對羥基脲、PALA和MTX顯著更敏感。這些觀察結果表明，與這些高度轉化和惡性細胞的藥物敏感性相關的決定因素中，至少一個決定因素是核糖核苷酸還原酶R2水平。表8通過相對集落形成率測定的藥物敏感性×104A.羥基脲B.PALAC.MTX相對集落形成率以±SE表示，所示數值來自4至10次測定。當將RP6/SH所得數據與RP6/ASR2所得數據進行比較時，觀察到統計學上的顯著性差異(在羥基脲、PALA和MTX的存在下，分別為p＝0.0001、0.0001和0.0001)。當將RP3/SH所得數據與RP3/ASR2所得數據進行比較時，也觀察到顯著性差異(在羥基脲、PALA和MTX的存在下分別為p＝0.04、0.0001和0.004)。R2-介導的耐藥性和基因擴增不需要p53蛋白功能喪失這一證據p53的失活或喪失，是與在惡性細胞中所觀察到的腫瘤發育及伴隨的基因穩定性降低有關的常見事件，包括經歷自發的基因擴增的能力[Livingston等，1992；Yin等，1992；Takenaka等，1995]。因此，我們驗證了如下可能性，即由過度產生R2的B3/mR2和B3/R2c2細胞所表現出來的耐藥性的增加，可能通過一種使野生型p53活性喪失的機理發生。已經證明，p53是一種轉錄因子，野生型p53而非p53突變型的轉活化作用是序列特異性的，並與其對共有DNA序列的結合相關[Takenaka等，1995；Kern等，1992]。為了確定在PALA、MTX或羥基脲的存在下發育的耐藥性集落中野生型p53功能的存在與否，在電泳凝膠移動性轉移測定法(EMSA)[Price和Calderwood，1993]中使用細胞提取物，來試驗序列特異性p53結合活性。圖8顯示，從過度表達R2的細胞衍生的耐藥性集落表現出野生型p53結合活性。這些觀察結果與我們在利用Pab240單克隆抗體所進行的，專一檢測普通型突變p53的免疫沉澱測定法[Gannon等，1990]中，不能在耐藥性集落細胞中檢測到突變的p53蛋白也是一致的。實施例3目標為核糖核苷酸還原酶並且對人腫瘤細胞是細胞毒性的反義脫氧核糖核苷酸序列如上述實施例所示，R2的全長反義構造物影響腫瘤細胞的致瘤性和/或轉移能力及對化療劑的敏感性。本申請人因此研究了R1和R2的更短的反義構造物對腫瘤細胞作用的潛力。集落形成率及用反義構造物處理細胞集落形成率如前人所報導的方法加以測定[Huang和Wright，1994]。將細胞在37℃下、在含有10％牛胎血清的生長培養液中培養24小時。細胞用5mlpH7.2的磷酸鹽緩衝鹽水洗滌一次，然後進行lipofectin+/-低聚核苷酸處理。在2.5μgDOTMA/DOPE(Lipofectin；LifeTechnologies，Inc.)的存在下，將供試驗的低聚核苷酸加入到細胞培養物中達四小時。低聚核苷酸在0.2μM下進行試驗，另有指示除外。對照物是用lipofectin處理但是不用低聚核苷酸處理的培養物。4小時後，除去含有低聚核苷酸的培養液，並用5ml生長培養液洗滌。然後將細胞在含有10％牛胎血清的生長培養液中培養七至十天。通過亞甲基藍染色，用肉眼觀察存活的細胞，評價集落。在某些實驗中，從培養物中除去細胞等分試樣，利用錐蟲藍排除試驗測定生存能力[Phillips，1973]。結果表示為存活細胞相對於對照細胞的百分率。結果將以核糖核苷酸還原酶為目標的化合物定義為反義分子。如下文所述，它們對各種人腫瘤細胞是細胞毒性的。發現這些序列促進對耐藥性腫瘤細胞的藥物-細胞毒性。也就是說，在非常低的非細胞毒性濃度下，以核糖核苷酸還原酶為目標的反義序列能夠使腫瘤細胞對臨床上重要的化療化合物的細胞毒活性敏感。在最初的研究中，製備和研究了兩種20-mer的反義序列，它們被稱為AS-II-336-20和AS-II-2229B-20，是針對R2mRNA的。第一個即AS-II-336-20的序列為5』-TCCTGGAAGATCCTCCTCGC-3』(SEQIDNo1)，定向人核糖核苷酸還原酶在核苷酸336-355(基於R2核苷酸的編號)上的R2信息[Pavloff等，1992]。AS-II-2229B-20序列是5』-TCCCACATATGAGAAAACTC-3』(SEQIDNo2)，定向核苷酸2229-2248上的R2信息。AS-II-336-20和AS-II-2229B-20都是作為硫代磷酸酯序列而被構建的，以保護不受核酸酶活性的作用[Anazodo等，1995]。在如上所述的相對集落形成率試驗中，試驗反義構造物AS-II-336-20抑制人腫瘤細胞(Hela)增殖的能力。試驗了HelaS3細胞(美國典型培養物保藏中心，Rockville，Maryland，ATCC)和Hela細胞系(Hela1mM)，它們以前因耐抗腫瘤劑羥基脲而被挑選出來[Wright等，1987](表9)。用HelaS3細胞進行了兩次實驗。用0.2μM反義構造物AS-II-336-20處理4小時，在兩次實驗中，集落形成率的抑制率分別為92％和82％。用Hela1mM細胞系和不同濃度的反義構造物AS-II-336-20重複相同的實驗(表9)，得到相似的結果，抑制集落形成的有效濃度是0.2μM。這些數據顯示，AS-II-336-20是非常有效的人腫瘤細胞集落形成能力的抑制劑，它既對抑制人腫瘤細胞集落形成能力的增殖有效，也對抑制對另一種化療化合物表現出耐受性的人腫瘤細胞的增殖有效。同樣，如表9所示，反義構造物AS-II-336-20在利用小鼠腫瘤細胞系SC2所進行的實驗中是有效的抗腫瘤化合物，該細胞系是高度耐羥基脲的小鼠L細胞系[McClarty等，1988]。還在相對集落形成率實驗中，試驗了反義序列AS-II-2229B-20抑制人Hela腫瘤細胞增殖的能力，如表9所示，結果與AS-II-336-20相似。這些數據顯示，當用HelaS3細胞和耐藥性Hela1mM細胞系進行試驗時，AS-II-2229B-20是有力的抗腫瘤劑。表9用R2反義構造物處理後，集落形成率降低細胞系HeLaS3細胞系HeLa1mM細胞系小鼠SC2還試驗了反義構造物AS-II-2229B-20抑制人乳癌細胞系MDA435增殖的能力，並發現其是非常有效的(表10)。表10用R2反義構造物處理通過比較人腫瘤與非腫瘤細胞種群所得結果，試驗了核糖核苷酸還原酶R2反義構造物AS-II-2229B-20對腫瘤細胞的細胞毒性。使用HelaS3腫瘤細胞和WI38正常非致瘤性的人細胞。發現腫瘤細胞比正常的非致瘤性細胞對AS-II-2229B-20的細胞毒作用要敏感得多。例如，反義接觸後三天的細胞分析表明，按4-8次測定的平均結果，腫瘤細胞對AS-II-2229B-20的細胞毒作用的敏感性是正常的非致瘤性細胞的大約5倍。這些結果說明，反義取向的短的低聚脫氧核糖核苷酸序列是優異的抗腫瘤劑，並表明其他定向R2信息的反義構造物可能具有相似的性質。最好的抗腫瘤劑將是表現出適當的能量相關特徵的那些反義構造物，這些特徵對於反義構造物與它們的互補模板形成低聚核苷酸雙鏈體來說具有重要意義，並且所述反義構造物顯示較低的自二聚或自互補的可能性[Anazodo等，1996]。利用電腦程式(OLIGO引物分析軟體3.4版)分析R2mRNA，以確定一系列其他的設計用來定向R2信息的反義序列(表1，SEQ.ID.NOS.3-102)的反義序列解鏈溫度、自由能性質，並估計可能的自二聚體形成和自互補性質[Anazodo，等，1996]。表1列出了具有適當性質的其他R2反義抑制劑。為了試驗很多這些序列作為硫代磷酸酯脫氧核糖核苷酸的反義作用，在用一系列人腫瘤細胞系所進行的相對集落形成實驗中試驗這些序列。正如所預測的，很多這些反義構造物是有力的人腫瘤細胞增殖抑制劑。用來自膀胱、乳房、肺、結腸、胰腺、前列腺、肝和子宮頸的癌細胞所得結果參見表13。另外，在C3H/HeN小鼠中用AS-II-626-20進行體內研究，結果報告在表14中，結果顯示在反義治療過的小鼠中轉移瘤顯著減少。基於實施例2，試驗了用非常低濃度的短反義序列治療人腫瘤細胞，以確定這些構造物是否能夠使腫瘤細胞對其他化療藥物的抑制作用敏感。如表9所示，所用濃度本身是非細胞毒性的。如表11所示，用0.02μM的AS-II-2229B-20反義構造物處理HelaS3和Hela1mM細胞，增加了這些細胞對N-(膦乙醯基)-L-天冬氨酸酯(PALA)和甲氨蝶呤(MTX)的敏感性。這些觀察結果說明，定向R2信息的反義化合物能夠與眾所周知的化療劑起協同作用。表11AS-II-2229B-20作為反義構造物的協同作用PALA＝N-(膦乙醯基)-L-天冬氨酸酯MTX＝甲氨蝶呤-＝沒有治療+＝提供治療c數值是兩次實驗的平均值核糖核苷酸還原酶由被兩種不同的基因R1和R2編碼的兩種相異蛋白質組分組成。因此，上述結果提示，R1信息也可以是設計具有有力抗腫瘤活性的短反義分子的適當目標。為了驗證這種可能性，構建了一種反義取向的20-mer的脫氧核糖核苷酸硫代磷酸酯序列，稱為AS-I-1395-20，並檢驗了其抗腫瘤能力。反義構造物AS-I-1395-20的序列為5』-ACAGGAATCTTTGTAGAGCA-3』(SEQIDNo103)，它定向核苷酸1395-1414上的R1信息。表12用R1反義構造物處理後，集落形成率降低細胞系HeLaS3AS-I-1395-20濃度抑制百分比0-0.2μM75％(實施例1)0.2μM77％(實施例2)細胞系HeLa1mMAS-I-1395-20濃度抑制百分比0-0.01μM00.05μM30％0.10μM60％細胞系小鼠SC2AS-I-1395-20濃度抑制百分比0-0.2μM76％如表12所示，用HelaS3細胞和HelalmM耐藥性細胞證明它是一種有效的腫瘤細胞增殖抑制劑。這些結果證明了設計定向R1信息的反義序列的有效性，還提示了其他潛在的位點也可能是有效的。因此，分析了R1mRNA，以尋找表現適合特徵的反義低聚脫氧核糖核苷酸序列(如上R2mRNA所述進行)。表2列出了其他具有與抗腫瘤劑一致的特徵的反義序列。實施例4R2反義對轉化的抑制作用採用實施例1-3所述方法，通過用R2編碼區[Fan等，1996b]的R2反義序列處理，抑制哺乳動物細胞的轉化。用反義取向的R2編碼序列或正確取向的R2編碼序列轉染含有H-ras致癌基因的NIH-3T3小鼠細胞。圖9所示結果證明，在R2反義構造物的存在下(圖9，b列)，與對照細胞相比(圖9，a列)，轉化灶減少，軟瓊脂生長降低。如上實施例1所示，R2編碼區能夠與H-ras起協同作用，增強惡性腫瘤，如表現為轉化灶數量增加(圖9，c列)。此外如本文所述，在軟瓊脂中進行的集落形成率測定證明了相似的結果。可以看到，含有H-ras致癌基因的NIH-3T3小鼠細胞、含有H-ras致癌基因和R2反義序列的NIH-3T3小鼠細胞和含有H-ras致癌基因和R2編碼區序列的NIH-3T3小鼠細胞，集落形成率分別為15.6±6.73、4.4±2.62和51±12.29。實施例5L60小鼠腫瘤細胞中用AS-II-626-20抑制核糖核苷酸還原酶R2蛋白水平的蛋白質印跡分析將細胞用補充有lipofectin但是沒有反義低聚核苷酸的生長培養液(圖l0A，a列)或含有0.2μMAS-II-626-20的lipofectin培養液(b列)處理4小時。作為附加的對照物，腫瘤細胞還用補充有lipofectin和0.2μM低聚核苷酸混雜對照物，其含有AS-II-626-20中發現的比例相同但是順序不同的核苷酸(ACGCACTCAGCTAGTGACAC，SEQ.ID.NO.164)(c列)，或0.2μM錯配低聚核苷酸GGCTAAACTGCTCCACCAAG(SEQIDNO163)，其與AS-II-626-20相比含有四個核苷酸錯配突變(TCGC變為CTGC)(d列)的生長培養液處理4小時。可注意到，與對照物(a、c和d列)相比，用AS-II-626-20處理(b列)的腫瘤細胞的R2蛋白顯著減少。小鼠L60腫瘤細胞用各種R2反義低聚核苷酸處理後。蛋白質印跡分析測定的R2蛋白水平降低將細胞用在lipofectin存在下的0.2μM低聚核苷酸(圖10B，b至f列)，或作為對照的沒有低聚核苷酸的lipofectin(a列)處理4小時。(b列)用AS-II-667-20處理的細胞；(c列)用AS-II-816-20處理的細胞；(d列)用AS-II-1288-20處理的細胞；(e列)用AS-II-1335-20處理的細胞；和(f列)用AS-II-1338-20處理的細胞。可注意到，用定向R2mRNA的反義低聚核苷酸處理的細胞中R2蛋白水平降低，這與它們抑制人腫瘤細胞增殖的能力是一致的(表13)。表13用0.2μM的各種定向R2信息的反義低聚脫氧核糖核苷酸硫代磷酸酯處理後，人腫瘤細胞的相對集落形成率降低，以抑制百分比表示對表13的說明-如表1所述，除非用(*)標註，所述反義低聚核苷酸被完全硫代酸化。-相對集落形成率值是2-8次測定所得到的平均值。-ND＝未檢測到。-各種細胞系是從美國典型培養物保藏中心，RockvilleMaryland獲得的。關於這些人癌細胞的信息T24＝膀胱細胞癌HCT116＝結腸細胞癌A549＝肺細胞癌MDA-MB-231＝乳房細胞腺癌MIAPaCa-2＝胰腺細胞癌PC-3＝前列腺細胞腺癌HepG2＝肝細胞癌HeLaS3＝從宮頸癌分離的細胞T-47D＝乳房導管癌H596＝肺腺鱗狀癌細胞Colo320＝結腸細胞腺癌實施例6腫瘤細胞用反義低聚核苷酸處理後的轉移特徵將105個小鼠10T1/2r-3細胞系的細胞用沒有添加低聚核苷酸(無)的lipofectin或含有0.2μMAS-II-626-20的lipofectin處理4小時，靜脈內(尾靜脈)注射到C3H/HeN同基因的小鼠中，並如前人所述方法(Damen等，1991)分析肺腫瘤。r-3細胞系是非常惡性的，以前已有描述(Taylor等，1992)。所觀察到的用AS-II-626-20處理和不用AS-II-626-20處理的組之間差異，是統計學上顯著的(p值＝0.027)。顯然，AS-II-626-20處理過的腫瘤細胞表現出明顯降低的轉移可能性。參見表14。表14用反義低聚核苷酸AS-II-626-20處理後同基因小鼠中的r-3小鼠10T1/2腫瘤細胞的轉移特徵實施例7對集落形成能力的抑制作用如前人所述方法(Choy等，1988)，評估用28種不同的反義低聚核苷酸處理的MDA-MB-231人乳癌細胞的集落形成能力。將細胞懸浮液的等分試樣接種在60mm陪替氏平皿中，並在37℃下、在補充有10％牛胎血清的α-MEM培養液中培養過夜。將細胞在5mlpH7.2的磷酸鹽緩衝鹽水中洗滌，然後用0.2μM反義/1ipofectin處理4小時。除去含有反義低聚核苷酸的培養液，將細胞洗滌一次，並在生長培養液中培養7至10天。集落用亞甲基藍染色，如文獻所述方法評估(Choy等，1988；Huang和Wright1994)。通過與在沒有反義低聚核苷酸存在下生長的培養物中的集落數比較，計算抑制百分比。所有實驗重複四次。圖11是各種反義低聚核苷酸處理對集落形成的抑制百分比的圖形。該圖顯示，對抗人核糖核苷酸還原酶R1的反義低聚核苷酸能夠抑制人乳癌細胞的集落形成。通過測定相對集落形成率，評估各種人腫瘤細胞系的集落形成能力(Choy等，1988)。將來自各種細胞系的細胞在5mlpH7.2的磷酸鹽緩衝鹽水中洗滌。將所述細胞用0.2μMAS-I-618-20反義低聚核苷酸/lipofectin處理4小時。然後除去含有反義低聚核苷酸的培養液，並將細胞用5ml生長培養液小心地洗滌。將細胞在含有109牛胎血清的生長培養液中培養七至十天。通過亞甲基藍染色用肉眼觀察存活的細胞，並評估集落(Choy等，1988；Huang和Wright1994)。圖12顯示帶有標準誤差的結果。評價了下列人腫瘤細胞系HepG2(肝)，SK-OV-3(卵巢)，U87(腦)，A2058(黑素瘤)，H460(肺)，MDA-MB-231(乳房)和AsPC-1(胰腺)。實施例8依劑量的抑制作用的蛋白質印跡分析將MDA-MB-231人乳癌細胞用不同的反義低聚核苷酸處理，通過蛋白質印跡分析R1蛋白水平的變化。將細胞用濃度為0.2μM的低聚核苷酸處理，培養24小時後製備全細胞蛋白提取物，如前人所述方法通過蛋白質印跡測定R1蛋白水平(Choy等，1988；Hurta和Wright1995B；Fan等，1996A)。使用從未處理細胞製備的蛋白質提取物作為對照。圖13是蛋白質印跡照片，顯示用各種反義低聚核苷酸處理後的R1蛋白表達水平。將MDA-MB-231人乳癌細胞用遞增濃度(0.025-0.2μM)的AS-I-618-20處理，未處理作為對照物(對照)，並用0.2μM的AS-I-618-20的混雜對照類似物(混雜)5』-ACTGCAGCCTATATGCAGCT-3』[SEQIDNO214]和含有四個鹼基變化的AS-I-618-20+的錯配對照類似物(錯配)5』-CTCTAGCGTCATATAGCCGA-3』[SEQIDNO215]處理。培養24小時後製備全細胞蛋白提取物，如前人所述方法進行蛋白質印跡分析(Choy等，1988；Hurta和Wright1994；Fan等，1996A)。圖14A是蛋白質印跡照片。圖14B是利用ImageQuant程序(MolecularDynamics)量化的蛋白質印跡中R1蛋白水平的圖形，以任意單位表示(相對強度)。實施例9免疫沉澱分析法證明，AS-I-618-20抑制目標R1有兩種獲得細胞內蛋白水平信息的通用方法。蛋白質印跡分析提供關於特定蛋白質穩態水平的信息(如實施例8所示)，免疫沉澱分析法提供關於細胞內蛋白質合成的信息。使用飽和量的AD-203抗-RI單克隆抗體，按照微小改動的Choy等，的方法進行免疫沉澱。對全細胞提取物和福馬林固定的金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcusaureus)細胞進行免疫沉澱。所得沉澱產物在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上進行分析。在含有甘氨酸的緩衝液中平衡後，將凝膠乾燥，暴露在膜下。掃描自體放射造影照片，並量化峰面積。圖15中，SCR為用混雜型的AS-I-618-20(相同比例的GTAC但完全不同的序列)處理的細胞，MIS為具有4個鹼基錯配的突變型的AS-I-618-20。利用AsPC-1腫瘤細胞(從人胰腺腫瘤細胞衍生)所得免疫沉澱結果證明，AS-I-618-20特異性地抑制腫瘤細胞內R1蛋白的合成。實施例10RNA印跡分析使RNA電泳通過1％甲醛瓊脂糖凝膠，然後轉移到尼龍膜上。按照前人所述方法(McClarty等，1990；Hurta和Wright1994)，進行印跡預雜交和雜交。在R1片段的存在下發生雜交(McClarty等，1987)。探針用α-32P標記並洗滌，如前人所述方法進行放射自顯影(McClarty等，1988；Hurta和Wright，1994)。如文獻所述，用含有甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶序列的質粒估計負荷(Choy等，1989；Edwards1985)。圖16是未用AS-I-618-20處理或者用AS-I-618-20處理的各種細胞mRNA的RNA印跡的自體放射造影照片。與沒有暴露在反義化合物之下的對照細胞相比，預先用AS-I-618-20處理的細胞中R1mRNA水平明顯減少。HT-29是人結腸腺癌細胞系，MDA-MB-231是人乳腺癌細胞系。實施例11致瘤性測定按照前人所述方法(例如Egan等，1987A；Egan等，1987B；Damen等，1989；Fan等，1996A)，測定腫瘤生長速率和腫瘤重量。簡言之，從培養皿中取出人肺癌(H460)細胞，洗滌，並將0.1ml等分試樣(106至107個細胞)皮下注射到得自CharlesRiver，Montreal的雌性CD-1裸鼠右側脅腹內。在可觸摸到腫瘤塊後，每隔一天通過尾靜脈注射，將在生理鹽水中的反義低聚核苷酸給藥。處理後大約14天，從小鼠中摘除腫瘤，並測量腫瘤的重量。圖17是顯示用反義低聚核苷酸處理的小鼠中腫瘤重量減少的圖形。下面，試驗AS-I-618-20對各種人腫瘤細胞系的抗腫瘤效果。簡言之，從培養皿中取出細胞，洗滌，並將0.1ml每種細胞系的等分試樣(106至107個細胞)皮下注射到得自CharlesRiver，Montreal的雌性裸鼠CD-1或BALB/cnu/nu右側脅腹內。在可觸摸到腫瘤塊後，每隔一天通過尾靜脈注射，將在生理鹽水中的反義低聚核苷酸AS-I-618-20(10mg/kg)給藥。有些動物僅接受鹽水，沒有低聚核苷酸。圖18是顯示處理後的腫瘤重量的圖形。淺色條是未處理的對照物所得結果，深色條是用AS-I-618-20處理動物所得結果。另外，在用反義AS-I-618-20處理後，測量人肺癌腫瘤在CD-1裸鼠中的生長。圖19顯示處理或沒有處理的腫瘤生長速率。實施例12AS-I-618-20對HT-29腫瘤中R1mRNA水平的作用將HT-29人結腸癌細胞皮下注射到CD-1裸鼠中。腫瘤出現後，每隔一天將AS-I-618-20的鹽水溶液通過尾靜脈注射給藥，濃度為10mg/kg。與此同時，對照動物僅接受鹽水。注射8次後處死小鼠，使用TRIzol試劑(Gibco-BRL，GaithersburgMD)從切除的腫瘤中提取總RNA。按照前人所述方法(Hurta和Wright1994)，進行R1mRNA水平的RNA印跡分析。探測控制RNA負荷的甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶(GADPH)mRNA的水平。顯示了兩套獨立的實驗。圖20是RNA印跡的自體放射造影照片。在AS-I-618-20靜脈內給藥後觀察到腫瘤組織中的R1mRNA被顯著抑制了，這為AS-I-618-20在體內到達腫瘤部位並通過反義機理髮揮作用提供了證據。實施例13各種反義序列的抗腫瘤效果比較從培養皿中取出人結腸癌(HT-29)細胞、人黑素瘤(A2058)細胞或人肺癌(H460)細胞，洗滌，並將0.1ml的等分試樣(106至107個細胞)皮下注射到得自CharlesRiver，Montreal的雌性CD-1裸鼠右側脅腹中。反義序列製成完全硫代磷酸化化合物，包括下列序列c-raf5』-TCCCGCCTGTGACATGCATT-3』[SEQIDNO216]PKC-α5』-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3』[SEQIDNO218]Bc1-25』-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3』[SEQIDNO219]c-myc5』-AACGTTGAGGGGCAT-3』[SEQIDNO220]c-myb5』-TATGCTGTGCCGGGGTCTTCGGGC-3』[SEQIDNO221]在檢測到可觸摸的腫瘤塊後，每隔一天通過尾靜脈注射，將在生理鹽水中的反義低聚核苷酸(10mg/kg)給藥2周。處理後大約14天，從小鼠中摘除腫瘤，測量腫瘤的重量(例如Egan等，1987A；Egan等，1987B；Damen等，1989；Fan等，1996A)。比較用每種低聚核苷酸處理後的腫瘤重量與對照鹽水組的腫瘤重量，測定顯著性。圖21是圖形，顯示用反義低聚核苷酸AS-II-626-20、AS-I-618-20、C-RAF、PKC-α和Bc12處理的CD-1裸鼠中，人結腸癌(HT-29)細胞引起的腫瘤的重量。每個結果是5至15隻小鼠結果的平均值，鹽水對照物是32隻小鼠的平均值。圖22是圖形，顯示用相同反義低聚核苷酸處理的CD-1裸鼠中，人黑素瘤(A2058)細胞引起的腫瘤的重量。每個結果是5至10隻小鼠的平均值。圖23是圖形，顯示用反義低聚核苷酸AS-II-626-20、AS-I-618-20、C-RAF、PKC-α、Bc12、c-myc和c-myb處理後CD-1裸鼠中，人肺癌H460細胞引起的腫瘤的重量。每個結果是10至20隻小鼠的平均值。權利要求1.小於約50個核苷酸的反義低聚核苷酸，它包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]。2.權利要求1的序列，進一步包含減少了的二聚物形成和減少了的自互補相互作用。3.用於抑制哺乳動物腫瘤細胞生長的藥物組合物，包含有效量的如權利要求1所述小於約50個核苷酸的反義低聚核苷酸和藥學上可接受的載體或稀釋劑。4.抑制哺乳動物贅生性細胞致瘤性的方法，該方法包括使贅生性細胞與有效量的包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]的反義低聚核苷酸接觸。5.抑制哺乳動物耐受化療藥物的贅生性細胞致瘤性的方法，該方法包括確定患有耐受化療藥物的腫瘤的患者；使腫瘤與該腫瘤所耐受的化療藥物和包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]的反義低聚核苷酸接觸，其中化療藥物和反義低聚核苷酸的量足以抑制腫瘤細胞的生長。6.權利要求5的方法，其中在沒有化療藥物的存在下，反義低聚核苷酸的量不足以抑制腫瘤細胞生長。7.增加哺乳動物贅生性細胞對化療藥物的敏感性的方法，是通過使腫瘤與包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]的反義低聚核苷酸接觸。8.如權利要求7所述的方法，其中在沒有化療藥物的存在下，反義組合物的量不足以抑制腫瘤細胞生長。9.如權利要求7所述的方法，其中在沒有化療藥物的存在下，反義組合物的量足以抑制腫瘤細胞生長。10.抑制哺乳動物腫瘤細胞轉移的方法，該方法包括將足以抑制腫瘤細胞生長的量的、包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]的反義低聚核苷酸對所述哺乳動物給藥。11.分離的DNA，它具有包含轉錄引發區的序列和編碼小於約50個核苷酸的反義低聚核苷酸的序列，該低聚核苷酸包含AS-I-618-20序列[SEQIDNO176]。全文摘要公開了用於調節細胞增殖、優選抑制腫瘤細胞增殖的方法和化合物。可以用於調節細胞增殖的化合物包括與哺乳動物核糖核苷酸還原酶基因區域互補的反義低聚核苷酸。文檔編號A61P35/00GK1345373SQ00805667公開日2002年4月17日申請日期2000年2月9日優先權日1999年2月11日發明者J·A·威裡特,A·H·楊申請人:吉倪塞思技術公司