檢測高危型人乳頭瘤病毒的方法及試劑盒的製作方法

2023-05-04 05:08:51 1

專利名稱：：檢測高危型人乳頭瘤病毒的方法及試劑盒的製作方法檢測高危型人乳頭癍病毒的方法及試劑盒所屬領域本發明涉及檢測臨床樣品中人乳頭瘤病毒(HR-HPV)存在的方法及試劑盒，特別是涉及以實時定量螢光聚合酶鏈反應技術檢測臨床樣品中高危型人乳頭瘤病毒，以為診斷宮頸癌、尖銳溼疣提供實驗室依據的臨床檢測方法及完成該方法所使用的試劑盒。發明背景宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。近年，隨著生活方式的改變，宮頸癌患者的發病年齡更趨年輕化，並且病例數有不斷上升的趨勢。宮頸癌是目前唯一一種發病原因比較清楚的的腫瘤，主要病因是由高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的持續或反覆感染所致[Walb(還ers肌JacobsMV,ManosMM,eta丄H麗npapillomavirusisanecessarycauseofinvasivecervicalcancerworldwide.JPathol,1999:189(1):50-53]。目前確定的HPV型別約有80個，依其感染的上皮所在部位分為皮膚型HPV和生殖道上皮HPV，其中約35個型別涉及生殖道感染。依據不同型別HPV與宮頸癌發生危險性的高低，又分為低危險型HPV和高危型HPV，約20個型別與腫瘤相關。在世界範圍內，宮頸癌主要危害那些未進行高危型人乳頭瘤病毒篩查的婦女。研究表明，HPV16、18型與宮頸癌高度相關，31、33和35型中度相關。HPV型別分布有地域差別，在中國人群中，HPV16、52、58型相對多見。HPV的陰性預測價值達100%，即無HPV感染時可基本排除宮頸癌的發生。宮頸癌早期手術治療效果極佳，以預防為主的策略作為降低宮頸癌死亡率的主要途徑是簡單而有效的[NobbenhuisMAE，WalboomersJ固，HelmerhorstTJM，etal.Relationofhumanpapi1lomavirusstatus1.0cervicallesionsandconsequencesforcervical-cancerscreening:aprospectivestudy.Lancet，1999:354:20-25]。如果能早期檢查出並成功地治療(特別是癌前千預性治療)發生在宮頸組織的癌前病變(可以潛伏多年)，就可有效地阻斷癌前病變向宮頸癌的發展。人乳頭瘤病毒感染病例的診斷主要依靠實驗室檢查。實驗室檢查包括細胞形態學檢測和分子生物學檢測(測序、原位雜交、雜交捕獲、PCR等)。細胞形態學檢測方法靈敏度與特異性均較低，受操作者的主觀影響比較大；測序、原位雜交技術複雜，對操作者的要求較高，在臨床應用中受到限制；雜交捕獲方法已被美國FDA批准並已應用於臨床，但該方法成本高、操作複雜、存在假陽性，因此也限制了其在宮頸癌普查中的大規模應用；定性PCR方法雖然靈敏度高並能對病毒進行早期檢測，但是因其步驟繁瑣且容易造成汙染，從而也限制了它的臨床使用。實時螢光定量PCR技術是上世紀90年代中期基於傳統的PCR技術發展起來的。與傳統的(終點檢測)PCR技術相比，實時定量檢測方法不僅實現了低拷貝數靶多核苷酸的定量分析，而且還具有特異性和精確度更強、自動化程度更高以及汙染的可能性更小等優點。實時螢光PCR技術是在聚合酶鏈反應(PCR)體系中加入螢光標記探針，使用一種帶有電荷偶聯裝置(CCD)的PCR擴增儀，通過檢測螢光信號的動態變化實時反映PCR的每個循環的擴增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發出特定波長的激發光，收集檢測螢光信號，並通過軟體分析匯總到工作站得到擴增曲線。通過對擴增曲線以及循環閾值(Ct)的分析，能夠對被檢樣品進行定性和定量分析。TaqManPCR技術是實時螢光PCR的一種(MackayIMa/.Real-timePCRinvirology..NucleicAcidsRes.20025;30(6):1292-1305;Lie,Y.S.,Petropoulos,C丄，AdvancesinquantitativePCRtechnology:5'nucleaseassays.CurrentOpinioninBiotechnology1998.9,4348.)。與傳統的PCR相對比，其在反應體系中增加了一條兩端分別標記螢光報告基團和淬滅基團的探針。探針結構完整時，螢光報告基團發出螢光的能量轉移給淬滅基團，呈現淬滅效應。如果擴增過程中有耙序列的存在，擴增的過程中探針分子逐漸被水解切斷，螢光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間螢光共振能量轉移效應，螢光報告基團發出螢光信號。隨著擴增的進行，螢光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。在使用已知的實時螢光定量PCR技術檢測和定量分析臨床樣品中某特定耙核酸的實踐中，為了減少和避免檢測結果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準確性，一個關鍵性的基本技術環節是如何基於已知的靶多核苷酸序列設計並製備適當的引物和寡核苷酸探針。本發明人在以往多年從事PCR技術特別是實時螢光定量PCR技術研究的基礎上，將該技術應用於人乳頭瘤病毒的所有已知變異體之基因組多核苷酸的檢測和定量分析，成功地完成了本發明。
發明內容本發明的一個目的是提供一種使用實時螢光定量PCR技術定量檢測樣品中HR-HPV病毒的方法，該方法包括(1)提供包括樣品、核酸擴增體系和螢光監測體系在內的反應與檢測混合物，(2)通過擴增反應循環擴增所說的耙多聚核苷酸，(3)使所說的螢光發生基團與被擴增的靶多聚核苷酸間接結合，(4)確定螢光發生基團所產生的螢光量，並結合定量標準曲線確定靶多聚核苷酸的存在及其相對量(即靶核酸序列的拷貝數)；其中核酸擴增系統包括可與靶聚多核苷酸結合的寡核苷酸引物，並且螢光實時監測系統包括一個可與靶多聚核苷酸特異性結合的寡核苷酸探針；特徵在於所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是5'-ttgatgaaaatggcaatcc-3，(SEQIDNO:1)、5，-gacaaaaacggaaatccagt-3，(SEQIDN0:2)、5，-categgtgtctgcatcttc-3，(SEQIDN0:3)和5，-catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4),並且所使用的寡核苷酸探針是5，-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3,(SEQIDNO-5)禾口5，-accacgtecttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的樣品是可疑高危型HPV感染者的臨床樣品。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的高危型HPV選自中國人群中常見的、與宮頸癌發生發展有關係的各型HPV。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的高危型HPV選自HPV16、18、31、33、35、39、45、52、58、59、67型。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的靶多聚核苷酸來自高危型HPV。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的核酸擴增系統是聚合酶鏈反應，並且所說的擴增反應循環是大約重複40次的聚合酶鏈反應循環。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的核酸擴增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、(b)2'-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結合的正向引物，和(d)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結合的反向引物。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的螢光實時檢測體系包括能夠與耙多聚核苷酸結合併且兩末端分別結合的有螢光發生基團和螢光淬滅基團的寡核苷酸探針。根據本發明的一個優選實施方案，所說的方法進一步包括(1)確定樣品中的靶多聚核苷酸經擴增後所產生的螢光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環次數；(2)將己確定的樣品中靶多聚核苷酸的閾循環次數與標準溶液中已知量耙多聚核苷酸的閾循環次數相比較，以計算出樣品中耙多聚核苷酸的量。本發明的另一個目的是提供一種使用實時螢光定量PCR技術定量檢測臨床樣品中HPV的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有濃縮液、DNA提取液、純水、PCR擴增反應液、稀釋液、陰性對照樣品、強陽性標準品和加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔併集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其中濃縮液由PEG8000組成；DNA提取液由異硫氰酸胍、氫氧化鈉、SDS組成的溶液。PCR反應管內為PCR體系，由引物、探針、耐熱DNA聚合酶、dNTPs、H20和緩衝液組成；稀釋液為TE溶液。本發明的試劑盒中使用帶有目的基因片段的重組質粒作為強陽性標準品，其濃度為lXlS拷貝/ml，使用帶有目的基因片段的重組質粒作為臨界陽性標準品，其濃度為lXlS拷貝/ml，並使用生理鹽水作為陰性對照。根據本發明的再一個優選實施方案，其中用於耙多聚核苷酸擴增體系的正向和反向引物分別是5，一Ugatgaaaatggcaatcc一3'(SEQIDNO:1)、5'一gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDNO:2)、5，-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)和5，-catcgtUtccttgtcctc-3，(SEQIDNO:4)。根據本發明的再一個優選實施方案，其中用於靶多聚核苷酸擴增和監測體系的寡核苷酸探針是5'_accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3，(SEQIDNO:5)禾口5，-accacgtccttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。本發明涉及實時定量螢光PCR方法及試劑盒，特別是涉及實時定性定量螢光聚合酶鏈反應方法及其試劑盒在中國人群中常見的高危型HPV感染的實驗室診斷中的應用。本發明提供了一種使用實時螢光定量PCR技術定性定量檢測臨床樣品中高危型HPV存在的方法，該方法包括(1)提供包括HPV基因組核酸的樣品、核酸擴增體系，和螢光監測體系的反應與檢測混合物，(2)通過擴增反應循環擴增所說的靶多聚核苷酸，(3)使所說的螢光發生基團與被擴增的耙多聚核苷酸間接結合，(4)4)確定螢光發生基團所產生的螢光量，並結合定量標準曲線確定耙多聚核苷酸的存在及其相對量；其中核酸擴增體系包括可與靶多聚核苷酸結合的寡核苷酸引物，並且螢光檢測體系包括可與靶多聚核苷酸結合的寡核苷酸探針；特徵在於所說的擴增反應中所使用的正向和反問寡核苷酸引物分別是5'-ttgatgaaaatggcaatec-3'(SEQIDNO:1)、5'-gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDNO:2)、5'-categgtgtctgcatcl,tc-3'(SEQIDNO:3)禾口5'-catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4)，並且所使用的寡核苷酸探針是5'-accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3，(SEQIDNO:5)和5，-accacgtccttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。與基於擴增反應完成後進行單一終點檢測的傳統PCR方法不同，實時定量聚合酶鏈反應方法可以在擴增反應的進程中隨時監測擴增產物的產生，從而大大提高了定量檢測的準確性和精密度。眾所周知，實時螢光定量PCR是在PCR擴增中同時加入引物和5'、3'末端分別標記有螢光報告基團(例如6-FAMamidite羧基螢光素6)和螢光淬滅基團(例如6-羧基四甲基若丹明)的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒有與靶序列互補結合，其序列保持完整，報告基團發射的螢光信號將被淬滅基團吸收，所以沒有螢光信號產生；而當PCR擴增反應進行時，DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性將降解螢光探針，導致螢光報告基團與螢光淬滅基團分離，因而螢光監測系統可接收並記錄到螢光信號。每擴增一條DNA鏈即有一個螢光分子產生，從而實現螢光信號的累積與PCR產物形成完全同步，實時地監測整個PCR反應進程，並可藉助標準曲線對未知靶多聚核苷酸(模板)進行定量分析。與通常的實時定量螢光PCR技術相似，本發明的檢測樣品中HPV病毒基因組雙鏈靶多聚核苷酸存在的方法中同樣包括U)提供包括(a)待檢樣品，(b)耐熱DNA聚合酶和(c)2-脫氧核苷三磷酸(dNTP)的擴增反應體系，以及包括(a)能夠與待檢雙鏈靶多聚核苷酸的第一條互補鏈結合的正向引物，(b)能夠與待檢雙鏈靶多聚核苷酸的第二條互補鏈結合的反向引物，以及(c)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的任一條鏈結合併且兩末端分別標記有螢光發生基團和螢光淬滅基團的寡核苷酸探針的螢光檢測體系；(2)通過一次或多次聚合酶鏈反應擴增所說的靶多聚核苷酸；(3)退火後使所說的螢光發生基團通過探針與靶多聚核苷酸的結合併在Taq酶的外切活性作用下釋放螢光發生基團而產生螢光信號；(4)檢測並確定螢光發生基團所產生的螢光量；(5)分析一次或多次擴增循環所發出的螢光量，以檢測靶多聚聚核苷酸的存在；特徵在於其中所說的靶多聚核苷酸是HPV基因組多核苷酸，所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別5，-Ugatgaaaatggcaatec-3，(SEQIDNO:1)、5'-gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDNO:2)、5'-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)禾口5，-catcgttttccttgtcctc-3，(SEQIDNO:4)，並且所使用的寡核苷酸探針是5'-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3'(SEQIDNO:5)和5'-accacgtecttgagaaaaaggatt-3'(SEQIDNO:6)。如前所述，為了檢測出臨床樣品中可能存在的高危型HPV病毒，並能夠準確有效地將高危型HPV病毒感染與低危型HPV病毒、單純皰疹病毒2型、生殖支原體、巨細胞病毒、解脲脲原體、沙眼衣原體、淋病雙球菌及其他常見泌尿生殖道感染病原體鑑別開來，設計並製備實現這些目的的寡核苷酸引物和探針是一個非常重要的技術環節。為此，我們在使用適當的核酸分析軟體對已知HPV病毒型的基因組核苷酸序列進行同源性比較，並在找出同源區段的基礎上，進一步使用適當的引物設計軟體(例如PrimerPremier5.5)選擇並設計具有下示核苷酸序列的寡核苷酸引物1:5，-ttgatgaaaatggee.atec-3,(SEQIDNO:1)，引物2:5，-gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDN0:2)，弓l物3:5'-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)禾U弓I物4:5'-catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4);以及具有下示序列的寡核苷酸探針5'-accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3，(SEQIDNO:5)和5'-accacgtecUgagaaaaaggatt-3'(SEQIDNO:6)。引物所對應的擴增區段相當於HPV病毒E1基因編碼序列的保守區，長度為107bp-120bp。所設計的這些引物和探針均具有互補於高危型HPV病毒基因組保守區的序列，而且與其他泌尿生殖道感染相關病原體的核苷酸序列沒有同源性，也不包括任何常見的核酸內切酶，所以大大減少甚至避免了HPV病毒檢測的假陰性和假陽性，提高了檢測的可靠性和準確度。可使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速蛋白質液相層析法(FPLC)純化並進行氨解處理。同樣合成所需的檢測探針，氨解處理後分別在其5，端標記作為螢光發生基團(報導基團)的6-FAMamidite，並在其3'端標記帶有活性連接臂的、作為螢光淬滅或抑制基團的TAMRA。以FPLC層析法純化螢光標記的探針。然後，可使用變性條件下的聚丙烯醯胺凝膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑑定所合成的引物和探針。使用常規DNA提取方法或市售的DNA提取試劑盒，從得自受試者的宮頸脫落細胞樣品中提取DNA用於後繼的PCR擴增。在含有引物l、2、3和4(各10pmo1)、探針5和6(各3pmo1)、DNA模板(PCR擴增靶序列)、dNTPs(IOmM)、耐熱DNA聚合酶(PlantiniumDNA聚合酶)、PCR緩衝液和水的反應體系中，使用ABI7000型或其他結構類型的自動螢光檢測熱循環儀對如上得到的DNA序列進行PCR擴增。所使用的反應條件是93'C預變性3分鐘後，93°C30秒，55°C45秒，共進行40次循環。反應完成後，藉助裝置上配有的自動分析系統進行結果分析。在本研究中，如果循環閾(Ct)值等於或大於25,結果即為陰性；如果Ct值小於25，結果則為陽性。其中以反應的前10個循環所產生的螢光信號作為螢光本底信號，螢光域值的預設設置為卜10個循環的螢光信號標準偏差的10倍。一般說來，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數呈線性關係。起始拷貝數越多，Ct值越小。因為在擴增反應的Ct值之前的階段，擴增系統中的酶、引物、探針和dNTPs均大大過量，而且系統的pH值和離子濃度等也相對穩定，所以此時擴增反應的效率是一個與模板數無關的飽和定值。與Ct值相關的只有起始模板數(多聚核苷酸樣品的拷貝數)和與樣品無關的PCR系統效率。可利用已知起始拷貝數的標準品製作標準曲線，其中以耙多聚核苷酸起始拷貝數的對數為橫坐標，並以如上測得的Ct值為縱坐標。獲得未知量靶多聚核苷酸的Ct值後，即可從基於平行實驗得到的數據製作的標準曲線上得知其起始拷貝數的對數，然後計算出該靶多聚核苷酸的起始拷貝數(當擴增循環達到Ct值即初始進入指數擴增期時，Ct值的重現性極好，即同一靶多聚核苷酸在不同時間擴增或同一時間在不同管內擴增所得到的Ct值總是恆定的)。也就是說，為了基於上述的擴增反應結果推算出靶多聚核苷酸的量(起始拷貝數)，本發明的方法還應進一步包括(1)確定樣品中的靶多核苷酸經擴增後所產生的螢光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環次數；(2)將已確定的樣品中靶多聚核苷酸的閾循環次數與標準溶液中已知量靶多聚核苷酸的閾循環次數相比較，從而計算出樣品中靶多聚核苷酸的量。本發明的另一個目的是提供一種使用實時螢光定量PCR技術定量檢測臨床樣品中高危型HPV病毒的試劑盒，該試劑盒包括(l)分別裝有濃縮液、DNA提取液、純水、含有本領域已知的常規成分的PCR擴增反應液、稀釋液、陰性對照樣品、強陽性標準品和DNA陽性對照品並加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔併集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據本發明的一個優選實施方案，其中濃縮液用於濃縮液態待檢樣品。根據本發明的另一個優選實施方案，其中稀釋液用於稀釋陽性定量標準品。根據本發明的再一個優選實施方案，其中用於靶多核苷酸擴增體系的正向和逆向引物引物分別5'—Ugatgaaaatggcaatcc-3'(SEQIDNO:1)、5'—gficaaaaacggaaatccagt-3，(SEQIDNO:2)、5，-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)和5'—catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4)。根據本發明的再一個優選實施方案，其中用於靶多聚核苷酸擴增和監測體系的寡核苷酸是5，-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3'(SEQIDNO:5)禾口5，-accacgtecttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。可按照如上所述的步驟或試劑盒中所附使用說明書中指出的方法使用本發明的試劑盒。如前所述，為了檢測出臨床樣品中可能存在的高危型HPV病毒，並準確有效地將高危型HPV病毒感染與低危型HPV病毒、單純皰疹病毒2型、生殖支原體、巨細胞病毒、解脲脲原體、沙眼衣原體、淋病雙球菌及其他常見泌尿生殖道感染病原體鑑別開來，本發明基於對不同型別HPV和相關病毒基因組核苷酸序列的同源性比較，特別設計了適用本發明試劑盒的寡核苷酸引物和探針。使用這些引物和探針完成的實時定量檢測，大大減小了高危型HPV病毒多核苷酸檢測的假陽性和假陰性。我們的實驗證明，本發明檢測高危型HPV病毒基因組核苷酸的精確度幾乎為100c/。，靈敏度達到102個拷貝。值得特別說明的是，為了確保本發明的高危型HPV病毒檢測方法的準確性，我們還使用攜帶有HPV病毒核苷酸序列的重組質粒作為DNA定量檢測標準品。藉助這些標準品並使用本發明的試劑盒，在相同條件下進行平行檢測並製作所謂的外標定量標準曲線，以進一步驗證本發明試劑盒的檢測精確度和準確性，並作為生產本發明試劑盒的附加的質量控制標準。圖l顯示(Stdcurve)窗口下的標準曲線。針對模板數為102107拷貝的反應體系進行T叫ManPCR分析。當拷貝數為100時，被檢樣品的Ct值在25左右，即檢測下限靈敏度可到達100拷貝。圖2顯示強中弱三份陽性標本的檢測曲線。三份標本的Ct值分別是25.95、21.45和13.47;結合擴增曲線呈S形，即可判定三份樣品均為陽性。圖3顯示陰性標本的檢測曲線。三個標本的擴增曲線為較平直的折線，與螢光檢測閾值線沒有交點，或者顯示Ct值在2530之間的範圍內，並且擴增曲線不具有S形特徵。圖4顯示HPV16、18、31、33、52、58型等標本的檢測曲線，標本均經反向斑點雜交和測序確認為相應型別。擴增曲線呈S形，可判定被檢樣品均為陽性。圖5顯示陽性標本重複性實驗的檢測曲線，可看出不同的曲線均在同一CT值範圍內，此結果表明試劑盒具有良好的重複性。具體實施方式實施例l:高危型人乳頭瘤病毒檢測試劑盒及其使用(1)製備包括下列組成成分的試劑盒DNA提取液(500pl/管)l管、PCR反應管(未貼標籤管)IO管、H20(2000pl/管)l管、強陽性標準品(50pl/管)l管、臨界陽性標準品(50ulZ管)l管、陰性對照(50pl/管)l管。(2)標本採集、運送和保存以無菌棉拭子或宮頸刷取疑似人乳頭瘤病毒感染患者的宮頸脫落細胞，以及用於活檢的組織標本或疣組織，置於低溫冰箱(一70'C或一20°C)內冷凍保存。如集中檢驗，標本需在(TC以下環境中運送並於24小時內送達實驗室。(3)檢測步驟和結果分析-宮頸刷、宮頸拭子加入lml無菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，擠幹棉拭子。吸取全部液體轉至1.5ml離心管中，12，000離心5分鐘。去上清，沉澱直接加入50n1DNA提取液充分混勻(由於提取液內含有不溶於水的物質，故取樣時需先用加樣器充分混勻；如出現因吸頭嘴部太細不能吸取或取樣後堵塞吸頭的現象，可先用潔淨無汙染的剪刀將吸頭嘴部剪掉一截)。10(TC加熱處理10分鐘(誤差不超過1分鐘)後，12,000rpm離心5分鐘，取上清液2y1用於PCR反應。組織活檢、切片標本用適量滅菌生理鹽水洗去送檢組織沾帶的血液，取約50mg組織，加1ml滅菌生理鹽水用勻漿器研磨成組織勻漿並轉移至1.5ml離心管中.12，000rpm離心5分鐘後，去上清，向沉澱物中加入50ulDNA提取液充分混勻，IO(TC恆溫處理10分鐘(誤差不超過1分鐘)。12,OOOrpm離心5分鐘後，收集上清液2ii1用於PCR反應。將強陽性標準品6000rpm離心15秒，加入稀釋液450ul，充分混勻後標示為105。然後另取3支新的0.5ml離心管，對標準品依次進行10倍梯度稀釋(分別標示為104、103、]02)，-2(TC保存備用。然後分別取待檢樣品(每份2ul)、同體積的定量標準品和陰性對照品，加樣於PCR反應體系中進行PCR擴增。PCR循環條件是93。C預變性3分鐘，93°C45秒，55'C60秒，進行10次循環，此!O個循環內不檢測螢光信號；93°C30秒，55。C45秒，進行30次循環，在反應的延伸階段檢測螢光信號。反應結束後保存檢測數據文件。調節分析參數，使標準曲線(Stdcurve)窗口下的標準曲線圖達到最佳(即相關性數值<-0.95)(參見圖l)。由圖2和圖3可分別看出，陽性標本的螢光曲線與設定的閾值線有一交點，而陰性標本的螢光曲線則低於閾值。最後由儀器自動分析裝置計算出未知標本的測定數值(Qty)，即標本中HPV病毒的DNA含量(參見圖2和3)。實施例2:對確定HPV型別的標本進行檢測具體步驟同實施例l，不同的是所用標本均經反向斑點雜交和測序確認為HPV16、18、31、33、52、5趣，HPV16、18、31、33、52、58型是中國人群感染最多的型別。標本提取核酸後用本發明的試劑盒進行PCR擴增，在擴增的同時由儀器自動監測並收集螢光信號的變化。反應結束後分析，應用本發明的試劑盒均能檢測出已知型別的標本(參見圖4)。實施例3:臨床標本檢測的重複性測試具體步驟同實施例l，不同的是所用標本為確定陽性的標本。提取核酸後用本發明的試劑盒進行PCR擴增，每一份標本設置多個復管。在擴增的同時由儀器自動監測並收集螢光信號的變化。反應結束後分析，應用本發明的試劑盒檢測結果顯示同一標本不同的曲線均在同一CT值範圍內，此結果表明試劑盒具有良好的重複性。(參見圖5)。實施例4:20份臨床標本檢測並與其他藥盒的比較20例臨床標本取自廣東省人民醫院，具體步驟同實施例l，不同的是所用標本同時用西班牙BIOTOOLS國Labs,S.A.公司BIOPAPQTS試劑盒檢測，該試劑盒已經通過歐盟CE認證，能夠檢測常見的高危型人乳頭瘤病毒。BIOPAPQTS試劑盒使用螢光染料的方法對臨床標本進行實時定量檢測。通過比較本發明中所說的試劑盒與BIOPAPQTS試劑盒在臨床標本檢測所得的結果，來鑑定本發明所說試劑盒在臨床檢測中的有效性。表1:本發明中的試劑盒與BI0PAPQTS試劑盒檢測結果比較tableseeoriginaldocumentpage15上表中'一'表示試劑盒檢測均為陰性，CT值表示標本中的靶多核苷酸經擴增後所產生的螢光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環次數。如上表，兩種方法得到的結果進行對比，顯示了良好的一致性，說明了本發明試劑盒的高可信性。由於本發明使用螢光探針，較染料法有更高的特異性；本發明的試劑盒較目前市場上使用的美國Digene公司雜交捕獲(hybridcapureII，HCII)方法在對儀器和操作人員的要求方面更易應用，檢測的靈敏度也高於雜交捕獲方法。序列表中山大學安達基因股份有限公司檢測高危型乳頭瘤病毒的方法及試劑盒6119DNA人工序列根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。1ttgatgaaaatggcaatcc220DNA人工序列根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。2geicaaaaacggsaatccagt319DNA人工序列根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。3catcggtgtctgcatcttc419DNA人工序列根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。4catcgttttccttgtcctc526DNA人工序列根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增過程中檢測螢光信號增長的探針。5accatgtcctttcaaaaaaacatttc624DNA人工序列根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增過程中檢測螢光信號增長的探針。6accacgtccttgagaaaaaggatt權利要求1一種使用實時螢光定量聚合酶鏈反應技術定量檢測樣品中常見高危型HPV病毒存在的方法，該方法包括(1)提供包括HPV病毒基因組核酸的樣品、核酸擴增體系，和螢光監測體系的反應與檢測混合物，(2)通過擴增反應循環擴增所說的靶多聚核苷酸，(3)使所說的螢光發生基團與被擴增的靶多聚核苷酸間接結合，(4)確定螢光發生基團所產生的螢光量，並結合定量標準曲線確定靶多聚核苷酸的存在及其相對量；其中核酸擴增體系包括可與靶多聚核苷酸結合的寡核苷酸引物，並且螢光檢測體系包括可與靶多聚核苷酸結合的寡核苷酸探針；特徵在於所說的擴增反應中所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是5』-ttgatgaaaatggcaatcc-3』(SEQIDNO1)、5』-gacaaaaacggaaatccagt-3』(SEQIDNO2)、5』-catcggtgtctgcatcttc-3』(SEQIDNO3)和5』-catcgttttccttgtcctc-3』(SEQIDNO4)，並且所使用的寡核苷酸探針是5』-accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3』(SEQIDNO5)和5』-accacgtccttgagaaaaaggatt-3』(SEQIDNO6)。2、根據權利要求1的方法，其中所說的核酸擴增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、(b)2，-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結合的正向引物，和(d)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結合的反向引物。3、根據權利要求1的方法，其中所說的螢光檢測體系包括能夠與靶多聚核苷酸結合併且兩末端分別結合有螢光發生基團和螢光淬滅基團的寡核苷酸探針。4、根據權利要求1的方法，所說的方法進一步包括(1)確定樣品中的靶多聚核苷酸經擴增後所產生的螢光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環次數；(2)將已確定的樣品中靶多聚核苷酸的閾循環次數與標準溶液中已知量耙多聚核苷酸的閾循環次數相比較，以計算出樣品中靶多聚核苷酸的量。5、根據權利要求1的方法，其中所說的高危型HPV病毒是中國人群中常見的宮頸癌相關人乳頭瘤病毒。6、根據權利要求l的方法，其中所說的高危型人乳頭瘤病毒選自16、18、31、33、35、39、45、52、58、59和67型人乳頭瘤病毒。7、根據權利要求l的方法，其中所說的靶多聚核苷酸來自中國人群中常見的高危型人乳頭瘤病毒。8、使用實時螢光定量聚合酶鏈反應技術定量檢測臨床樣品中高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有濃縮液、DNA提取液、純水、擴增反應液、稀釋液、陰性對照樣品、強陽性標準品和加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔併集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，特徵在於其中用於靶多聚核苷酸擴增體系的正向和反向引物分別是5'-ttgatgaaaatggcaatcc-3，,5，_gacaaaaacggaaatccagt-3，，5'-catcggtgtctgcatcttc-3'，5'-catcgtUtccttgtcctc-3;其中用於耙多聚核苷酸擴增和監測體系的寡核苷酸是5'-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3'禾口5'-accacgtecttgagaaaaagga1t_3'。全文摘要本發明涉及檢測臨床樣品中宮頸癌、尖銳溼疣的病原體—高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)存在的方法及試劑盒，特別是涉及以實時定量螢光聚合酶鏈反應技術診斷HR-HPV感染的方法及所使用的試劑盒。文檔編號C12Q1/68GK101130824SQ200610037188公開日2008年2月27日申請日期2006年8月25日優先權日2006年8月25日發明者何蘊韶,王偉毅,王方金,鋼程申請人:中山大學達安基因股份有限公司