用於生產1,3-丁二醇的真核生物和方法

2023-05-03 21:02:51 2

用於生產1,3-丁二醇的真核生物和方法
【專利摘要】本文提供了非天然存在的真核生物，其可以經工程改造成生產細胞溶質乙醯輔酶A和增加細胞溶質乙醯輔酶A的可用性。本文還提供了非天然存在的具有1,3-丁二醇(1,3-BDO)途徑的真核生物和使用這樣的生物生產1,3-BDO的方法。
【專利說明】用於生產1, 3- 丁二醇的真核生物和方法
[0001]本申請要求2011年9月8日提交的美國系列號61/532，492、2011年9月30日提交的美國系列號61/541，951,2011年11月11日提交的美國系列號61/558，959,2012年5月18日提交的美國系列號61/649，039、和2012年6月4日提交的美國系列號61/655，355的權益，它們中的每一個特此通過引用整體併入。
1.【背景技術】
[0002]本文提供了通常與生物合成過程有關的方法和能夠生產有機化合物的真核生物。更具體地，在某些實施方案中，本文提供了非天然存在的真核生物，其可以經工程改造成生產細胞溶質乙醯輔酶A和增加細胞溶質乙醯輔酶A的可用性。在許多真核生物中，乙醯輔酶A主要由線粒體中的丙酮酸脫氫酶合成(圖1)。因而，存在開發這樣的真核生物的需要:其可以生產細胞溶質乙醯輔酶A和增加細胞溶質乙醯輔酶A的可用性。將乙醯輔酶A從線粒體輸出至細胞溶質的機制能夠實現起源於乙醯輔酶A的細胞溶質生產途徑的利用。這樣的細胞溶質生產途徑包括，例如，商品化學品諸如1，3_ 丁二醇(1，3-BD0)和/或其它目標化合物的生產。
[0003]本文還提供了可以經工程改造成生產1，3_BD0的非天然存在的真核生物。1，3-BD0生產對基於石油的原料的依賴，證明使用可再生原料生產1，3-BD0和丁二烯的替代途徑的開發是正當的。因而，存在開發真核生物和使用它們生產1，3-BD0的方法的需要。
[0004]本文中提供的生物和方法滿足了這些需要，並且還提供了有關的優點。
2.
【發明內容】

[0005]本文提供了非天然存在的真核生物，其可以經工程改造成生產細胞溶質乙醯輔酶A和增加細胞溶質乙醯輔酶A的可用性。這樣的生物有利地允許生產細胞溶質乙醯輔酶A，所述生物然後可以使用細胞溶質生產途徑用所述細胞溶質乙醯輔酶A來生產目標化合物，諸如1，3-BD0。本文還提供了具有1，3-BD0途徑的非天然存在的真核生物和使用這樣的生物生產1，3-BD0的方法。
[0006]在第一方面，本文提供了包含乙醯輔酶A途徑的非天然存在的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:(i)將乙醯輔酶A從所述生物的線粒體和/或過氧化物酶體運輸至所述生物的細胞溶質，(?)在所述生物的細胞質中生產乙醯輔酶A，和/或(iii)增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:檸檬酸合酶；檸檬酸轉運蛋白；檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；ATP檸檬酸裂合酶；檸檬酸裂合酶；乙醯輔酶合成酶；草醯乙酸轉運蛋白；細胞溶質蘋果酸脫氫酶；蘋果酸轉運蛋白；線粒體蘋果酸脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙醯輔酶連接酶或轉移酶；乙酸激酶；磷酸轉乙醯酶；丙酮酸脫羧酶；乙醛脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)；丙酮酸脫氫酶、丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脫氫酶(醯化)；蘇氨酸醛縮酶；線粒體乙醯肉鹼轉移酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶；細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；線粒體乙醯肉鹼移位酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶；磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化酶；PEP羧基激酶；草醯乙酸脫羧酶；丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)；乙醯輔酶羧化酶；丙二醯輔酶脫羧酶；草醯乙酸脫氫酶；草醯乙酸氧化還原酶；丙二醯輔酶還原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脫氫酶；丙二醯輔酶合成酶；丙二醯輔酶轉移酶；蘋果酸酶；蘋果酸脫氫酶；蘋果酸氧化還原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。
[0007]在另一個方面，本文提供了一種用於將乙醯輔酶A從線粒體和/或過氧化物酶體運輸至非天然存在的真核生物的細胞溶質的方法，所述方法包括:在一定條件下培養非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物足夠的時間段，以將乙醯輔酶A從線粒體和/或過氧化物酶體運輸至非天然存在的真核生物的細胞溶質。在某些實施方案中，本文提供了一種用於將乙醯輔酶A從線粒體運輸至所述非天然存在的真核生物的細胞溶質的方法。在其它實施方案中，本文提供了一種用於將乙醯輔酶A從過氧化物酶體運輸至所述非天然存在的真核生物的細胞溶質的方法。在某些培養非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物的實施方案中，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:將乙醯輔酶A從所述生物的線粒體和/或過氧化物酶體運輸至所述生物的細胞溶質。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:檸檬酸合酶；檸檬酸轉運蛋白；檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；ATP檸檬酸裂合酶；檸檬酸裂合酶；乙醯輔酶A合成酶；草醯乙酸轉運蛋白；細胞溶質蘋果酸脫氫酶；蘋果酸轉運蛋白；線粒體蘋果酸脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙醯輔酶A連接酶或轉移酶；乙酸激酶；磷酸轉乙醯酶；丙酮酸脫羧酶；乙醛脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)；丙酮酸脫氫酶，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶； 乙醛脫氫酶(醯化)；蘇氨酸醛縮酶；線粒體乙醯肉鹼轉移酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶；細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；線粒體乙醯肉鹼移位酶；和過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草醯乙酸脫羧酶；丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)；乙醯輔酶A羧化酶；丙二醯輔酶A脫羧酶；草醯乙酸脫氫酶；草醯乙酸氧化還原酶；丙二醯輔酶A還原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脫氫酶；丙二醯輔酶A合成酶；丙二醯輔酶A轉移酶；蘋果酸酶；蘋果酸脫氫酶；蘋果酸氧化還原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。
[0008]在另一個方面，本文提供了一種用於生產細胞溶質乙醯輔酶A的方法，所述方法包括:在一定條件下培養非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物足夠的時間段，以生產細胞溶質乙醯輔酶A。在一個實施方案中，本文提供了一種生產細胞溶質乙醯輔酶A的方法，所述方法包括:培養非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:在所述生物中產生細胞溶質乙醯輔酶A。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:檸檬酸合酶；檸檬酸轉運蛋白；檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；ATP檸檬酸裂合酶；檸檬酸裂合酶；乙醯輔酶A合成酶；草醯乙酸轉運蛋白；細胞溶質蘋果酸脫氫酶；蘋果酸轉運蛋白；線粒體蘋果酸脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙醯輔酶A連接酶或轉移酶；乙酸激酶；磷酸轉乙醯酶；丙酮酸脫羧酶；乙醛脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)；丙酮酸脫氫酶，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脫氫酶(醯化)；蘇氨酸醛縮酶；線粒體乙醯肉鹼轉移酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶；細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；線粒體乙醯肉鹼移位酶；和過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草醯乙酸脫羧酶；丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)；乙醯輔酶A羧化酶；丙二醯輔酶A脫羧酶；草醯乙酸脫氫酶；草醯乙酸氧化還原酶；丙二醯輔酶A還原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脫氫酶；丙二醯輔酶A合成酶；丙二醯輔酶A轉移酶；蘋果酸酶；蘋果酸脫氫酶；蘋果酸氧化還原酶；丙酮酸激酶jPPEP磷酸酶。
[0009]在另一個方面，本文提供了一種用於增加非天然存在的真核生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A的方法，所述方法包括:在一定條件下培養非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物足夠的時間段，以增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A。在某些實施方案中，本文提供了一種用於增加非天然存在的真核生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A的方法，所述方法包括:培養非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:增加所述非天然存在的真核生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:檸檬酸合酶；檸檬酸轉運蛋白；檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；ATP檸檬酸裂合酶；檸檬酸裂合酶；乙醯輔酶A合成酶；草醯乙酸轉運蛋白；細胞溶質蘋果酸脫氫酶；蘋果酸轉運蛋白；線粒體蘋果酸脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙醯輔酶A連接酶或轉移酶；乙酸激酶；磷酸轉乙醯酶；丙酮酸脫羧酶；乙醛脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)；丙酮酸脫氫酶，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脫氫酶(醯化)；蘇氨酸醛縮酶；線粒體乙醯肉鹼轉移酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶；細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；線粒體乙醯肉鹼移位酶；和過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草醯乙酸脫羧酶；丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)；乙醯輔酶A羧化酶；丙二醯輔酶A脫羧酶；草醯乙酸脫氫酶；草醯乙酸氧化還原酶；丙二醯輔酶A還原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脫氫酶；丙二醯輔酶A合成酶；丙二醯輔酶A轉移酶；蘋果酸酶；蘋果酸脫氫酶；蘋果酸氧化還原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。
[0010]本文提供了非天然存在的真核生物以及在所述真核生物中生產細胞溶質乙醯輔酶A和增加細胞溶質乙醯輔酶A的可用性的方法。本文還提供了非天然存在的真核生物及其生產某些商品化學品(諸如1，3_BD0)或其它目標化合物的最佳產率的方法。
[0011] 在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的真核生物，其包含:(I)乙醯輔酶A途徑，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:(i)將乙醯輔酶A從所述生物的線粒體和/或過氧化物酶體運輸至所述生物的細胞溶質，(?)在所述生物的細胞質中生產乙醯輔酶A，和/或(iii)增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A，和(2) I, 3-BD0途徑，其包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達。在某些實施方案中，(I)所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:檸檬酸合酶；檸檬酸轉運蛋白；檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；ATP檸檬酸裂合酶；檸檬酸裂合酶；乙醯輔酶A合成酶；草醯乙酸轉運蛋白；細胞溶質蘋果酸脫氫酶；蘋果酸轉運蛋白；線粒體蘋果酸脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙醯輔酶A連接酶或轉移酶；乙酸激酶；磷酸轉乙醯酶；丙酮酸脫羧酶；乙醛脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)；丙酮酸脫氫酶，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脫氫酶(醯化)；蘇氨酸醛縮酶；線粒體乙醯肉鹼轉移酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶；細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；線粒體乙醯肉鹼移位酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草醯乙酸脫羧酶；丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)；乙醯輔酶A羧化酶；丙二醯輔酶A脫羧酶；草醯乙酸脫氫酶；草醯乙酸氧化還原酶；丙二醯輔酶A還原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脫氫酶；丙二醯輔酶A合成酶；丙二醯輔酶A轉移酶；蘋果酸酶；蘋果酸脫氫酶；蘋果酸氧化還原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶；和/或(2)所述1，3-BD0途徑包括一種或多種選自以下的酶:乙醯乙醯輔酶A硫解酶；乙醯輔酶A羧化酶；乙醯乙醯輔酶A合酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醇形成)；3_氧代丁醛還原酶(醛還原)；4_羥基，2-丁酮還原酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醛形成)；3_氧代丁醛還原酶(酮還原)；3_羥基丁醛還原酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(酮還原)；3_羥基丁醯輔酶A還原酶(醛形成)；3-羥基丁醯輔酶A還原酶(醇形成)；乙醯乙醯輔酶A轉移酶、乙醯乙醯輔酶A水解酶、乙醯乙醯輔酶A合成酶或磷酸轉乙醯乙醯酶(phosphotransacetoacetylase)和乙醯乙酸激酶；乙醯乙酸還原酶；3_羥基丁醯輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶；3_羥基丁酸還原酶；和3-羥基丁酸脫氫酶。
[0012]在另一個方面，本文提供了一種用於生產1，3-BD0的方法，所述方法包括:在一定條件下培養非天然存在的真核生物足夠的時間段以生產1，3-BD0，其中所述非天然存在的真核生物包含:(I)乙醯輔酶A途徑，和(2)1，3-BD0途徑。在某些實施方案中，本文提供了一種生產1，3-BD0的方法，所述方法包括，培養非天然存在的真核生物，所述真核生物包含:乙醯輔酶A途徑，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:(i)將乙醯輔酶A從所述生物的線粒體和/或過氧化物酶體運輸至所述生物的細胞溶質，(ii)在所述生物的細胞質中生產乙醯輔酶A，和/或(iii)增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A ;和/或(2)1，3-BD0途徑，其包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:檸檬酸合酶；檸檬酸轉運蛋白；檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；ATP檸檬酸裂合酶；檸檬酸裂合酶；乙醯輔酶A合成酶；草醯乙酸轉運蛋白；細胞溶質蘋果酸脫氫酶；蘋果酸轉運蛋白；線粒體蘋果酸脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙醯輔酶A連接酶或轉移酶；乙酸激酶；磷酸轉乙醯酶；丙酮酸脫羧酶；乙醛脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)；丙酮酸脫氫酶，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脫氫酶(醯化)；蘇氨酸醛縮酶；線粒體乙醯肉鹼轉移酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶；細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；線粒體乙醯肉鹼移位酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草醯乙酸脫羧酶；丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)；乙醯輔酶A羧化酶；丙二醯輔酶A脫羧酶；草醯乙酸脫氫酶；草醯乙酸氧化還原酶；丙二醯輔酶A還原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脫氫酶；丙二醯輔酶A合成酶；丙二醯輔酶A轉移酶；蘋果酸酶；蘋果酸脫氫酶；蘋果酸氧化還原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶；和(2)所述1，3-BD0途徑包括一種或多種選自以下的酶:乙醯乙醯輔酶A硫解酶；乙醯輔酶A羧化酶；乙醯乙醯輔酶A合酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醇形成)；3_氧代丁醛還原酶(醛還原)；4-羥基、2-丁酮還原酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醛形成)；3_氧代丁醛還原酶(酮還原)；3_羥基丁醛還原酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(酮還原)；3_羥基丁醯輔酶A還原酶(醛形成)；3_羥基丁醯輔酶A還原酶(醇形成)；乙醯乙醯輔酶A轉移酶、乙醯乙醯輔酶A水解酶、乙醯乙醯輔酶A合成酶、或磷酸轉乙醯乙醯酶和乙醯乙酸激酶；乙醯乙酸還原酶；3_羥基丁醯輔酶A轉移酶、水解酶、或合成酶；3_羥基丁酸還原酶；和3-羥基丁酸脫氫酶。
[0013]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的真核生物，其包含:(1)1，3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，和(2)利用1，3-BD0途徑的一種或多種前體和/或中間體的一種或多種酶或途徑的缺失或減弱。在一個具體實施方案中，所述非天然存在的真核生物包含利用乙醯輔酶A的競爭途徑的缺失或減弱。在一個具體實施方案中，所述非天然存在的真核生物包含1，3-BD0中間體副產物途徑的缺失或減弱。
[0014]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的真核生物，其包含:(1)1，3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，和(2)利用1，3-BD0途徑的一種或多種輔因子的一種或多種酶或途徑的缺失或減弱。
[0015]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含一種或多種內源和/或外源核酸，所述核酸編減弱的選自以下的1，3-BD0途徑酶:乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醇形成)、3_氧代丁醛還原酶(醛還原)、4-羥基-2- 丁酮還原酶、乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醛形成)、3_氧代丁醛還原酶(酮還原)、3_羥基丁醛還原酶、乙醯乙醯輔酶A還原酶(酮還原)、3_羥基丁醯輔酶A還原酶(醛形成)、3_羥基丁醯輔酶A還原酶(醇形成)、乙醯乙酸還原酶、3-羥基丁酸還原酶、3-羥基丁酸脫氫酶和3-羥基丁醛還原酶；且其中所述減弱的1，3-BD0途徑酶是NAPDH依賴性的，且具有與由未改變的或野生型核酸編碼的1，3-BD0途徑酶相比降低的酶活性。
[0016]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含一種或多種內源和/或外源核酸，所述核酸編碼選自以下的1，3-BD0途徑酶:乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醇形成)、3_氧代丁醛還原酶(醛還原)、4-羥基-2- 丁酮還原酶、乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醛形成)、3_氧代丁醛還原酶(酮還原)、3_羥基丁醛還原酶、乙醯乙醯輔酶A還原酶(酮還原)、3_羥基丁醯輔酶A還原酶(醛形成)、3_羥基丁醯輔酶A還原酶(醇形成)、乙醯乙酸還原酶、3-羥基丁酸還原酶、3-羥基丁酸脫氫酶和3-羥基丁醛還原酶；其中至少一種核酸已經被改變，使得由所述核酸編碼的1，3-BD0途徑酶具有與由未改變的或野生型核酸編碼的1，3-BD0途徑酶相比更大的對NADH的親和力。
[0017] 在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含一種或多種內源和/或外源核酸，所述核酸編碼選自以下的1，3-BD0途徑酶:乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醇形成)、3_氧代丁醛還原酶(醛還原)、4-羥基-2- 丁酮還原酶、乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醛形成)、3_氧代丁醛還原酶(酮還原)、3_羥基丁醛還原酶、乙醯乙醯輔酶A還原酶(酮還原)、3_羥基丁醯輔酶A還原酶(醛形成)、3_羥基丁醯輔酶A還原酶(醇形成)、乙醯乙酸還原酶、3-羥基丁酸還原酶、3-羥基丁酸脫氫酶和3-羥基丁醛還原酶，其中至少一種核酸已經被改變，使得由所述核酸編碼的1，3-BD0途徑酶具有與由未改變的或野生型核酸編碼的1，3-BD0途徑酶相比更小的對NADPH的親和力。
[0018]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的真核生物，其包含:(I) I, 3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和(2)乙醯輔酶A途徑，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的內源和/或外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以增加所述生物中的NADH的量表達；其中所述乙醯輔酶A途徑包含:(1.) NAD依賴性的丙酮酸脫氫酶；(?.)丙酮酸甲酸裂合酶和NAD依賴性的甲酸脫氫酶；(ii1.)丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶和NADH:鐵氧還蛋白氧化還原酶；(iv.)丙酮酸脫羧酶和NAD依賴性的醯化乙醯基醛脫氫酶；(v.)丙酮酸脫羧酶、NAD依賴性的醯化乙醛脫氫酶、乙酸激酶和磷酸轉乙醯酶；或(v1.)丙酮酸脫羧酶、NAD依賴性的醯化乙醛脫氫酶和乙醯輔酶A合成酶。
[0019]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的真核生物，其包含:(1)1，3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和(2)戊糖磷酸途徑，其中所述生物包含至少一種編碼戊糖磷酸途徑酶的內源和/或外源核酸，所述戊糖磷酸途徑酶選自:6-磷酸葡萄糖脫氫酶、6-磷酸葡糖酸內酯酶和6-磷酸葡糖酸脫氫酶(脫羧)。
[0020]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的真核生物，其包含:(1)1，3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和(2)恩特納-杜德洛夫(EntnerDoudoroff)途徑，其中所述生物包含至少一種編碼恩特納-杜德洛夫途徑酶的內源和/或外源核酸，所述恩特納-杜德洛夫途徑酶選自:6_磷酸葡萄糖脫氫酶、6-磷酸葡糖酸內酯酶、磷酸葡糖酸脫水酶和2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶。
[0021]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的真核生物，其包含:(1)1，3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和(2)編碼可溶性的或膜結合的轉氫酶的內源和/或外源核酸，其中所述轉氫酶以足以將NADH轉化成NADPH的量表達。
[0022]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的真核生物，其包含:(1)1，3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和(2)內源和/或外源核酸，其編碼NADP依賴性的磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脫氫酶。
[0023]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的真核生物，其包含:(1)1，3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和(2)乙醯輔酶A途徑，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的內源和/或外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以增加所述生物中的NADPH的量表達；其中所述乙醯輔酶A途徑包含:(i) NADP依賴性的丙酮酸脫氫酶；(?)丙酮酸甲酸裂合酶和NADP依賴性的甲酸脫氫酶；(iii)丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶和NADPH:鐵氧還蛋白氧化還原酶；(iv)丙酮酸脫羧酶和NADP依賴性的醯化乙醯基醛脫氫酶；(V)丙酮酸脫羧酶、NADP依賴性的醯化乙醛脫氫酶、乙酸激酶和磷酸轉乙醯酶；或(vi)丙酮酸脫羧酶、NADP依賴性的醯化乙醛脫氫酶和乙醯輔酶A合成酶。[0024]在 另一個方面，本文提供了一種非天然存在的真核生物，其包含:(I) I, 3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和⑵一種或多種編碼NAD (P) H輔因子酶的內源和/或外源核酸，所述NAD(P)H輔因子酶選自磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、甲酸脫氫酶和醯化乙醯基醛脫氫酶；其中所述一種或多種編碼NAD (P)H輔因子酶的核酸已經被改變，使得由所述核酸編碼的NAD (P)H輔因子酶具有與由未改變的或野生型核酸編碼的NAD (P) H輔因子酶相比更大的對NADPH的親和力。
[0025]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的真核生物，其包含:(1)1，3-BD0途徑，其包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和(2) —種或多種編碼NAD (P) H輔因子酶的內源和/或外源核酸，所述NAD (P) H輔因子酶選自磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、甲酸脫氫酶和醯化乙醯基醛脫氫酶；其中所述一種或多種編碼NAD(P)H輔因子酶的核酸已經被改變，使得它編碼的NAD(P)H輔因子酶具有與由未改變的或野生型核酸編碼的NAD (P) H輔因子酶相比更小的對NADH的親和力。
[0026]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述生物:(i)包含在編碼NADH脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的NADH脫氫酶；和/或(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有NADH脫氫酶酶活性。
[0027]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述生物:(i)包含在編碼細胞色素氧化酶的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的細胞色素氧化酶；和/或(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有細胞色素氧化酶酶活性。
[0028]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述生物:(i)包含在編碼3-磷酸甘油(G3P)脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的G3P脫氫酶；(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P脫氫酶酶活性；和/或(iv)與所述真核生物的野生型形式相比，生產更低水平的甘油。
[0029]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述生物:(i)包含在編碼G3P磷酸酶的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的G3P磷酸酶；(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P磷酸酶酶活性；和/或(iv)與所述真核生物的野生型形式相比，生產更低水平的甘油。
[0030]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述生物:(i)包含在編碼丙酮酸脫羧酶的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的丙酮酸脫羧酶；(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有丙酮酸脫羧酶酶活性；和/或(iv)與所述真核生物的野生型形式相比，從丙酮酸生產更低水平的乙醇。
[0031]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述生物:(i)包含在編碼乙醇脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的乙醇脫氫酶；(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脫氫酶酶活性；和/或(iv)與所述真核生物的野生型形式相比，生產更低水平的乙醇。
[0032]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述生物:(i)包含在編碼蘋果酸脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的蘋果酸脫氫酶；(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有蘋果酸脫氫酶酶活性；和/或(iv)具有減弱的或阻斷的蘋果酸-天冬氨酸穿梭、蘋果酸-草醯乙酸穿梭和/或蘋果酸-丙酮酸穿梭。
[0033]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述生物:(i)包含在編碼乙醯乙醯輔酶A水解酶或轉移酶的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的乙醯乙醯輔酶A水解酶或轉移酶；和/或(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醯乙醯輔酶A水解酶或轉移酶酶活性。
[0034]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述生物:(i)包含在編碼3-羥基丁醯輔酶A水解酶或轉移酶的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的3-羥基丁醯輔酶A水解酶或轉移酶；和/或(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羥基丁醯輔酶A水解酶或轉移酶酶活性。
[0035]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；且其中所述生物:(i)包含在編碼乙醛脫氫酶(醯化)的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的乙醛脫氫酶(醯化)；和/或(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醛脫氫酶(醯化)酶活性。
[0036]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述生物:(i)包含在編碼3-羥基丁醛脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的3-羥基丁醛脫氫酶；和/或(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羥基丁醛脫氫酶酶活性。
[0037]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BDO的量表達，且其中所述生物:(i)包含在編碼3-氧代丁醛脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的3-氧代丁醛脫氫酶；和/或(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-氧代丁醛脫氫酶酶活性。
[0038]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述生物:(i)包含在編碼1，3- 丁二醇脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的1，3- 丁二醇脫氫酶；和/或(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有1，3- 丁二醇脫氫酶酶活性。
[0039]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述生物:(i)包含在編碼乙醯乙醯輔酶A硫解酶的內源和/或外源核酸中的破壞；(ii)表達減弱的乙醯乙醯輔酶A硫解酶；和/或(iii)與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醯乙醯輔酶A硫解酶酶活性。
[0040]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；且其中所述生物進一步包含編碼1，3-BD0轉運蛋白的內源和/或外源核酸，其中所述編碼1，3-BD0轉運蛋白的核酸以足以從所述真核生物輸出I, 3-BD0的量表達。
[0041]在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的真核生物，其包含組合的線粒體/細胞溶質1，3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼組合的線粒體/細胞溶質1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達。在某些實施方案中，所述組合的線粒體/細胞溶質1，3-BD0途徑包括一種或多種選自以下的酶:線粒體乙醯乙醯輔酶A硫解酶；乙醯輔酶A羧化酶；乙醯乙醯輔酶A合酶；線粒體乙醯乙醯輔酶A還原酶；線粒體乙醯乙醯輔酶A水解酶、轉移酶或合成酶；線粒體3-羥基丁醯輔酶A水解酶、轉移酶或合成酶；線粒體3-羥基丁酸脫氫酶；乙醯乙酸轉運蛋白；3_羥基丁酸轉運蛋白；3_羥基丁醯輔酶A轉移酶或合成酶、細胞溶質乙醯乙醯輔酶A轉移酶或合成酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醇形成)；3_氧代丁醛還原酶(醛還原)；4-羥基-2-丁酮還原酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醛形成)；3_氧代丁醛還原酶(酮還原)；3_羥基丁醛還原酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(酮還原)；3_羥基丁醯輔酶A還原酶(醛形成)；3_羥基丁醯輔酶A還原酶(醇形成)；乙醯乙酸還原酶；3-羥基丁醯輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶；3_羥基丁酸還原酶；和3-羥基丁酸脫氫酶。
[0042]在另一個方面，本文提供了一種生產1，3-BD0的方法，所述方法包括:在一定條件下培養本文提供的任一種非天然存在的包含1，3-BD0途徑的真核生物足夠的時間段以生產1，3-BD0。在某些實施方案中，在基本上厭氧的培養基中培養所述真核生物。在其它實施方案中，所述真核生物是Crabtree陽性的生物。
[0043] 在另一個方面，本文提供了一種用於選擇要引入非天然存在的真核生物中的外源性1，3-BD0途徑酶的方法，其中所述外源性1，3-BD0途徑酶在所述生物中以足以生產1，3-BD0的量表達，所述方法包括:(1.)測量至少一種1，3-BD0途徑酶的活性，所述1，3-BD0途徑酶使用NADH作為輔因子；(i1.)測量至少一種1，3-BD0途徑酶的活性，所述1，3-BDO途徑酶使用NADPH作為輔因子；和(ii1.)向所述生物中引入至少一種1，3-BD0途徑酶，所述1，3-BD0途徑酶對NADH作為輔因子的偏好大於NADPH，如在步驟I和2中確定的。
3.【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1顯示了在真核生物的細胞溶質中生產乙醯輔酶A的一種示例性途徑。
[0045]圖2顯示了使用檸檬酸和草醯乙酸轉運蛋白從線粒體乙醯輔酶A生產細胞溶質乙醯輔酶A的途徑。酶是:A)檸檬酸合酶；B)檸檬酸轉運蛋白；C)檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；D)ATP檸檬酸裂合酶；E)檸檬酸裂合酶；F)乙醯輔酶A合成酶或轉移酶、或乙酸激酶和磷酸轉乙醯酶；G)草醯乙酸轉運蛋白；K)乙酸激酶；和L)磷酸轉乙醯酶。
[0046]圖3顯示了使用檸檬酸和蘋果酸轉運蛋白從線粒體乙醯輔酶A生產細胞溶質乙醯輔酶A的途徑。酶是:Α)檸檬酸合酶；Β)檸檬酸轉運蛋白；C)檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；D)ATP檸檬酸裂合酶；E)檸檬酸裂合酶；F)乙醯輔酶A合成酶或轉移酶、或乙酸激酶和磷酸轉乙醯酶；H)細胞溶質蘋果酸脫氫酶；1)蘋果酸轉運蛋白J)線粒體蘋果酸脫氫酶；K)乙酸激酶；和L)磷酸轉乙醯酶。
[0047]圖4顯示了從乙醯輔酶A生物合成1，3-BD0的途徑。顯示的酶促轉化由下述酶進行:Α)乙醯乙醯輔酶A硫解酶，B)乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醇形成)，C)3-氧代丁醛還原酶(醛還原)，D)4-羥基-2-丁酮還原酶，Ε)乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醛形成)，F) 3-氧代丁醛還原酶(酮還原)，G) 3-羥基丁醛還原酶，H)乙醯乙醯輔酶A還原酶(酮還原)，I) 3-羥基丁醯輔酶A還原酶(醛形成)，J) 3-羥基丁醯輔酶A還原酶(醇形成)，K)乙醯乙醯輔酶A轉移酶、乙醯乙醯輔酶A水解酶、乙醯乙醯輔酶A合成酶、或磷酸轉乙醯乙醯酶和乙醯乙酸激酶，L)乙醯乙酸還原酶，M) 3-羥基丁醯輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶，N) 3-羥基丁酸還原酶，和O) 3-羥基丁酸脫氫酶。在圖4中描繪的在1，3-BD0途徑中由乙醯乙醯輔酶A硫解酶將乙醯輔酶A轉化成乙醯乙醯輔酶A(步驟A)的替代方案涉及:乙醯輔酶A羧化酶將乙醯輔酶A轉化成丙二醯輔酶A，和乙醯乙醯輔酶A合成酶將乙醯輔酶A和丙二醯輔酶A轉化成乙醯乙醯輔酶A (未顯示；參見圖7，步驟E和F，或圖9)。
[0048]圖5顯示了從細胞溶質丙酮酸生產細胞溶質乙醯輔酶A的途徑。酶是:A)丙酮酸氧化酶(乙酸形成)，B)乙醯輔酶A合成酶、連接酶或轉移酶，C)乙酸激酶，D)磷酸轉乙醯酶，E)丙酮酸脫羧酶，F)乙醛脫氫酶，G)丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)，H)丙酮酸脫氫酶，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶，I)乙醛脫氫酶(醯化)，和J)蘇氨酸醛縮酶。
[0049]圖6顯示了從線粒體或過氧化物酶體乙醯輔酶A生產細胞溶質乙醯輔酶A的途徑。酶是:A)線粒體乙醯肉鹼轉移酶，B)過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶，C)細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶，D)線粒體乙醯肉鹼移位酶，E)過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶。
[0050]圖7描繪了一個示例性的1，3-BD0途徑。A)乙醯乙醯輔酶A硫解酶，B)乙醯乙醯輔酶A還原酶，C)3-羥基丁醯輔酶A還原酶(醛形成)，D) 3-羥基丁醛還原酶，E)乙醯輔酶A羧化酶，F)乙醯乙醯輔酶A合酶。G3P是3-磷酸甘油。在該途徑中，乙醯乙醯輔酶A硫解酶將2當量的乙醯輔酶A轉化成乙醯乙醯輔酶A。可替換地，乙醯輔酶A羧化酶將乙醯輔酶A轉化成丙二醯輔酶A，並由乙醯乙醯輔酶A合成酶從乙醯輔酶A和丙二醯輔酶A合成乙醯乙醯輔酶A。3-羥基丁醯輔酶A還原酶然後將乙醯乙醯輔酶A還原為3-羥基丁醯輔酶A。3-羥基丁醯輔酶A還原酶將3-羥基丁醯輔酶A中間體進一步還原為3-羥基丁醛，後者被3-羥基丁醛還原酶進一步還原為1，3-BD0。可以任選地進一步工程改造所述生物，以缺失一個或多個示例性的副產物途徑(「X」)。
[0051]圖8描繪了示例性的組合的線粒體/細胞溶質1，3-BD0途徑。途徑酶包括:A)乙醯乙醯輔酶A硫解酶，B)乙醯乙醯輔酶A還原酶，C)乙醯乙醯輔酶A水解酶、轉移酶或合成酶，D) 3-羥基丁醯輔酶A水解酶、轉移酶或合成酶，E) 3-羥基丁酸脫氫酶，F)乙醯乙酸轉運蛋白，G) 3-羥基丁酸轉運蛋白，H) 3-羥基丁醯輔酶A轉移酶或合成酶，I)乙醯乙醯輔酶A轉移酶或合成酶，J)乙醯輔酶A羧化酶，和K)乙醯乙醯輔酶A合酶。
[0052]圖9描繪了乙醯乙醯輔酶A合酶將乙醯輔酶A和丙二醯輔酶A轉化成乙醯乙醯輔酶A的一種示例性途徑。
[0053]圖10描繪了從磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和丙酮酸至乙醯輔酶A和乙醯乙醯輔酶A的示例性途徑。A) PEP羧化酶或PEP羧基激酶，B)草醯乙酸脫羧酶，C)丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)，D)乙醯輔酶A羧化酶或丙二醯輔酶A脫羧酶，E)乙醯乙醯輔酶A合酶，F)草醯乙酸脫氫酶或草醯乙酸氧化還原酶，G)丙二醯輔酶A還原酶，H)丙酮酸羧化酶，I)乙醯乙醯輔酶A硫解酶，J)丙二酸半醛脫氫酶，K)丙二醯輔酶A合成酶或轉移酶，L)蘋果酸酶，M)蘋果酸脫氫酶或氧化還原酶，N)丙酮酸激酶或PEP磷酸酶。
4.【具體實施方式】
[0054]本文提供了非天然存在的真核生物以及在所述真核生物中生產細胞溶質乙醯輔酶A和增加細胞溶質乙醯輔酶A的可用性的方法。本文還提供了非天然存在的真核生物及其生產商品化學品(諸如1，3-BD0)和/或其它目標化合物的方法。
[0055]4.1 定義
[0056]本文使用的術語「非天然存在的」，當用於指本文提供的真核生物時，意圖表示，該真核生物具有至少一個在所述物種的天然存在的菌株(包括所述物種的野生型菌株)中通常未發現的遺傳改變。遺傳改變包括，例如，引入編碼代謝多肽的可表達核酸的修飾、其它核酸添加、核酸缺失和/或真核生物的遺傳物質的其它功能破壞。這些修飾包括，例如，所述物種的異源多肽、同源多肽或異源和同源多肽的編碼區和其功能片段。另外的修飾包括，例如，非編碼調節區，其中修飾會改變基因或操縱子的表達。示例性的代謝多肽包括:在乙醯輔酶A途徑中的酶或蛋白。
[0057]代謝修飾是指從其天然存在的狀態被改變的生物化學反應。因此，非天然存在的真核生物可以具有對編碼代謝多肽或其功能片段的核酸的遺傳修飾。本文公開了示例性的代謝修飾。
[0058]本文使用的術語「分離的」，當用於指真核生物時，意圖表示，基本上不含至少一種當所述真核生物在自然界中發現時的組分的生物。該術語包括從在其自然環境中被發現時的一些或全部組分中移出的真核生物。該術語還包括從真核生物在其非天然存在環境中被發現時的一些或全部組分中移出的真核生物。因此，分離的真核生物部分或完全與其在自然界中發現時或其在非天然存在的環境中生長、保藏、生存時的其它物質分離。分離的真核生物的具體實例包括部分純的微生物、基本上純的微生物和在非天然存在的培養基中培養的微生物。
[0059]本文中使用的術語「真核的」、「真核生物體」或「真核生物」意圖表示分類單位真核或真核域的任意單細胞或多細胞生物。具體地，該術語包括其細胞包含線粒體的那些生物。該術語也包括可以針對增加的細胞溶質乙醯輔酶A水平而進行培養的任意物種的細胞培養物。在本文提供的組合物和方法的某些實施方案中，所述真核生物是酵母。
[0060]本文中使用的術語「CoA」或「輔酶A」意圖指有機輔因子或輔基(酶的非蛋白質部分)，其存在是許多酶(脫輔酶)的活性所必需的，以形成活性酶系統。輔酶A在某些縮合酶中起作用，在乙醯基或其它醯基轉移中以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化中以及在其它乙醯化中產生起作用。
[0061]本文使用的術語「基本上厭氧的」，當用於指培養物或生長條件時，意圖表示，氧的量小於在液體培養基中的溶解氧飽和度的約10%。該術語還擬包括液體或固體培養基的密封室被保持在小於約I%氧的氣氛下。[0062]本文所使用的「外源的」意圖表示，相關分子或相關活性被引入宿主真核生物中。所述分子可以如下引入:例如,通過將編碼核酸引入宿主遺傳物質中，諸如通過整合進宿主染色體中，或作為非染色體遺傳物質諸如質粒。因此，當用於指編碼核酸的表達時，該術語指將編碼核酸以可表達的形式引入真核生物中。當用於指生物合成活性時，該術語指被引入至宿主相關生物中的活性。來源可以是例如同源的或異源的編碼核酸，其在引入至宿主真核生物中以後會表達相關的活性。因此，術語「內源的」指在宿主中存在的相關分子或活性。類似地，當用於指編碼核酸的表達時，該術語指在真核生物中含有的編碼核酸的表達。術語「異源的」指源自相關物種之外的來源的分子或活性，而「同源的」指源自宿主真核生物的分子或活性。因此，本文提供的編碼核酸的外源表達可以利用異源的或同源的編碼核酸中的任一種或兩者。
[0063]應當理解，當真核生物中包括超過一種外源核酸時，超過一種外源核酸表示如上討論的相關編碼核酸或生化活性。進一步理解，如本文所公開的，這樣的超過一種外源核酸可以在單獨的核酸分子上、在多順反子核酸分子上或以它們的組合引入宿主真核生物中，且仍然視作超過一種外源核酸。例如，如本文公開的，可以工程改造真核生物，以表達編碼所需途徑酶或蛋白的2種或更多種外源核酸。在將編碼所需活性的2種外源核酸引入宿主真核生物中的情況下，應當理解，所述2種外源核酸可以作為單個核酸(例如，在單個質粒上、在分開的質粒上)引入，可以在單個位點或多個位點處整合進宿主染色體中，且仍然視作2種外源核酸。類似地，應當理解，超過2種外源核酸可以以任意所需的組合(例如，在單個質粒上、在分開的質粒上)引入宿主生物中，可以在單個位點或多個位點處整合進宿主染色體中，且仍然視作2種或更多種外源核酸，例如3種外源核酸。因而，所述的外源核酸或生物合成活性的數目是指編碼核酸的數目或生化活性的數目，而不是指引入宿主生物中的單獨核酸的數目。
[0064]本文提供的非天然存在的真核生物可包含穩定的遺傳改變，其指可被培養五代以上而不失去所述改變的真核生物。一般而言，穩定的遺傳改變包括持續10代以上的修飾，特別穩定的修飾將持續約25代以上，以及更特別穩定的遺傳修飾將是50代以上，包括無限地。[0065]本領域的技術人員應當理解，參考合適的宿主生物和它們的相應代謝反應或所需代謝途徑的所需遺傳物質(諸如基因)的合適源生物，描述包括本文示例的代謝修飾在內的遺傳改變。然而，鑑於許多生物的完整基因組測序以及基因組學領域的高技能水平，本領域的技術人員可容易地將本文提供的教導和指導應用於基本上所有的其它生物。例如，通過摻入來自除所述物種之外的物種的相同或相似的編碼核酸，可將本文示例的代謝改變容易地應用於其它物種。這些遺傳改變一般而言包括例如物種同源物的遺傳改變，以及具體而言，直系同源物、旁系同源物或非直系同源基因置換。
[0066]直系同源物是通過垂直傳遞(vertical descent)相關並且在不同生物中負責基本上相同或同一功能的一個基因或多個基因。例如，小鼠環氧化物水解酶和人環氧化物水解酶對於環氧化物的水解生物學功能而言可被認為是直系同源物。例如，當基因共享數量足以表明它們是同源的序列相似性時，所述基因通過垂直傳遞相關，或基因通過從共同的祖先進化而相關。如果基因共享三維結構，但不一定共享足以表明它們從共同的祖先進化而來的量一其程度為一級序列相似性不可鑑定一的序列相似性，則所述基因也可以被認為直系同源物。為直向同源的基因可以編碼具有約25%序列相似性至100%胺基酸序列同源性的蛋白質。編碼共享小於25%的胺基酸相似性的蛋白質的基因，如果它們的三維結構也顯示相似性，也可以被認為通過垂直傳遞產生。酶的絲氨酸蛋白酶家族成員(包括組織纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶)被認為從共同的祖先通過垂直傳遞產生。
[0067]直系同源物包括基因或它們編碼的基因產物，其通過例如進化在結構或總體活性方面已經偏離。例如，在一種物種編碼顯示兩種功能的基因產物並且這些功能在第二種物種中已經被分成不同的基因的情況下，三個基因和它們的相應的產物被認為是直系同源物。就本文描述的代謝途徑而言，本領域的技術人員應當理解，攜帶要引入或破壞的代謝活性的直向同源基因要進行選擇用於構建非天然存在的真核生物。顯示可分離活性的直系同源物的例子是其中不同的活性已經在兩種或更多種物種之間或在單一物種內被分成不同的基因產物的情況。具體實例是將彈性蛋白酶蛋白酶解和纖維蛋白溶酶原蛋白酶解一兩種類型的絲氨酸蛋白酶活性一作為纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶分成不同的分子。第二個實例是支原體5』 -3』外切核酸酶和果蠅DNA聚合酶III活性的分離。來自第一物種的DNA聚合酶可以被認為是來自第二物種的外切核酸酶或聚合酶中任一種或兩者的直系同源物，反之亦然。
[0068]相比而言，旁系同源物是通過例如進化趨異所伴隨的複製相關的同源物，並且其具有類似或共同的但不是同樣的功能。旁系同源物可以起源或源自例如相同的物種或不同的物種。例如，微粒體環氧化物水解酶(環氧化物水解酶I)和可溶性環氧化物水解酶(環氧化物水解酶II)可以被認為是旁系同源物，這是因為它們代表從共同的祖先共同進化而來的兩種不同的酶，所述酶催化不同的反應並且在相同的物種中具有不同的功能。旁系同源物是來自相同物種的、彼此具有明顯的序列相似性的蛋白質，這表明它們是同源的或通過從共同的祖先共同進化而相關。旁系同源蛋白質家族群包括Hip A同源物、螢光素酶基因、肽酶以及其它。
[0069] 非直系同源基因置換是來自一種物種的非直系同源基因，其可以取代不同物種中的相關基因功能。取代包括，例如，與不同物種的相關功能相比，能夠在起源的物種中完成基本上相同或類似的功能。儘管一般而言，非直系同源基因置換可以鑑定為結構上與編碼相關功能的 已知基因有關，但是結構上較不相關但功能上類似的基因和它們相應的基因廣物，仍將落入本文所使用的術語的含義中。功能相似性要求，例如，與編碼要求取代的功能的基因相比，在非直系同源基因產物的活性位點或結合區域中至少有一些結構相似性。因此，非直系同源基因包括例如旁系同源基因或不相關的基因。
[0070]因此，在鑑定和構建本文提供的具有細胞溶質乙醯輔酶A生物合成能力的非天然存在的真核生物中，本領域技術人員應當理解，通過將本文提供的教導和指導應用到具體的物種，代謝修飾的鑑定可以包括直系同源物的鑑定以及引入或失活。就旁系同源物和/或非直系同源基因置換存在於編碼催化相似或基本上相似的代謝反應的酶的相關真核生物中而言，本領域的技術人員還可以利用這些進化相關的基因。
[0071]直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置換可以通過本領域的技術人員眾所周知的方法確定。例如，檢查兩種多肽的核酸或胺基酸序列將揭示在所比較的序列之間的序列同源性和相似性。基於這些相似性，本領域技術人員可以確定相似性是否足夠高，以表明蛋白質通過從共同的祖先進化而相關。本領域的技術人員眾所周知的算法，諸如Align、BLASTXlustal W以及其它算法，比較和測定未處理的序列相似性或同源性，並且還測定序列中空位(gap)的存在和顯著性，所述空位可以被標記重量或分數。這些算法在本領域也是已知的並且可類似地應用於確定核苷酸序列相似性或同源性。確定相關性的足夠相似性的參數基於眾所周知的方法計算，所述方法用於計算統計學的相似性或在隨機多肽中發現相似匹配的機會和所確定的匹配的顯著性。如果期望，兩個或更多個序列的計算機比較也可以由本領域技術人員進行視覺優化。相關的基因產物或蛋白質可以期望具有高度相似性,例如,25%至100%序列同源性。如果細察足夠大小的資料庫(約5% )，不相關的蛋自質可以具有一定同源性，所述同源性與期望偶然出現的基本相同。在5%和24%之間的序列可以或不可以代表足夠的同源性，以推斷所比較的序列是相關的。根據數據集的大小，可以實施確定這些匹配的顯著性的另外的統計學分析，以確定這些序列的相關性。
[0072]使用BLAST算法確定兩個或更多個序列的相關性的示例性參數例如可以是如下所示。簡而言之，胺基酸序列比對可以使用BLASTP2.0.8版(1999年I月5日)和如下參數完成:Matrix:0BL0SUM62 ；gap open:11 ；gap extension:1 ；x_dropoff:50 ；expect:10.0 ；wordsize:3 ；filter:on。核酸序列比對可以使用BLASTN2.0.6版(1998年9月16日)和如下參數完成:Match:1 ；mismatch:-2 ；gap open:5 ；gap extension:2 ；x_dropoff:50 ；expect:10.0 ；wordsize:11 ；filter:off。本領域的技術人員了解對上述參數可以進行何種修改以增加或減少例如比較的嚴格性和測定兩個或更多個序列的相關性。
[0073]4.2利用細胞溶質乙醯輔酶A的真核生物
[0074]在第一方面，本文提供了非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:(i)將乙醯輔酶A從所述生物的線粒體和/或過氧化物酶體運輸至所述生物的細胞溶質，(?)在所述生物的細胞質中生產乙醯輔酶A，和/或(iii)增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:檸檬酸合酶；檸檬酸轉運蛋白；檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；ATP檸檬酸裂合酶；檸檬酸裂合酶；乙醯輔酶A合成酶；草醯乙酸轉運蛋白；細胞溶質蘋果酸脫氫酶；蘋果酸轉運蛋白；線粒體蘋果酸脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙醯輔酶A連接酶或轉移酶；乙酸激酶；磷酸轉乙醯酶；丙酮酸脫羧酶；乙醛脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)；丙酮酸脫氫酶，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脫氫酶(醯化)；蘇氨酸醛縮酶；線粒體乙醯肉鹼轉移酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶；細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；線粒體乙醯肉鹼移位酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草醯乙酸脫羧酶；丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)；乙醯輔酶A羧化酶；丙二醯輔酶A脫羧酶；草醯乙酸脫氫酶；草醯乙酸氧化還原酶；丙二醯輔酶A還原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脫氫酶；丙二醯輔酶A合成酶；丙二醯輔酶A轉移酶；蘋果酸酶；蘋果酸脫氫酶；蘋果酸氧化還原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。這樣的生物會有利地實現細胞溶質乙醯輔酶A的生產，所述生物然後可以使用細胞溶質生產途徑利用所述細胞溶質乙醯輔酶A來生產目標化合物，例如，I, 3-BD0。
[0075]在一個實施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:將乙醯輔酶A從所述生物的線粒體運輸至所述生物的細胞溶質。在另一個實施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:將乙醯輔酶A從所述生物的過氧化物酶體運輸至所述生物的細胞溶質。在一個實施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:在所述生物的細胞質中生產乙醯輔酶A。在另一個實施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A。在其它實施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:將乙醯輔酶A從線粒體運輸至所述生物的細胞質並在所述生物的細胞質中生產乙醯輔酶A。在另一個實施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:將乙醯輔酶A從所述生物的過氧化物酶體運輸至所述生物的細胞溶質並在所述生物的細胞質中生產乙醯輔酶A。在其它實施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:將乙醯輔酶A從線粒體運輸至所述生物的細胞質並增加所述生物的細胞質中的乙醯輔酶A。在另一個實施方案中，本文提供了非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:增加來自過氧化物酶體的乙醯輔酶A並增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A。
[0076]在第二方面，本文提供了一種用於將乙醯輔酶A從線粒體和/或過氧化物酶體運輸至非天然存在的真核生物的細胞溶質的方法，所述方法包括:在一定條件下培養非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物足夠的時間段，以將乙醯輔酶A從線粒體和/或過氧化物酶體運輸至非天然存在的真核生物的細胞溶質。在一個實施方案中，本文提供了一種用於將乙醯輔酶A從線粒體運輸至非天然存在的真核生物的細胞溶質的方法，所述方法包括:在一定條件下培養非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物足夠的時間段，以將乙醯輔酶A從線粒體運輸至非天然存在的真核生物的細胞溶質。在另一個實施方案中，本文提供了一種用於將乙醯輔酶A從過氧化物酶體運輸至非天然存在的真核生物的細胞溶質的方法，所述方法包括:在一定條件下培養非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物足夠的時間段，以將乙醯輔酶A從過氧化物酶體運輸至非天然存在的真核生物的細胞溶質。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:檸檬酸合酶；檸檬酸轉運蛋白；檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；ATP檸檬酸裂合酶；檸檬酸裂合酶；乙醯輔酶A合成酶；草醯乙酸轉運蛋白；細胞溶質蘋果酸脫氫酶；蘋果酸轉運蛋白；線粒體蘋果酸脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙醯輔酶A連接酶或轉移酶；乙酸激酶；磷酸轉乙醯酶；丙酮酸脫羧酶；乙醛脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)；丙酮酸脫氫酶，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脫氫酶(醯化)；蘇氨酸醛縮酶；線粒體乙醯肉鹼轉移酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶；細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；線粒體乙醯肉鹼移位酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草醯乙酸脫羧酶；丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)；乙醯輔酶A羧化酶；丙二醯輔酶A脫羧酶；草醯乙酸脫氫酶；草醯乙酸氧化還原酶；丙二醯輔酶A還原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脫氫酶；丙二醯輔酶A合成酶；丙二醯輔酶A轉移酶；蘋果酸酶；蘋果酸脫氫酶；蘋果酸氧化還原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。
[0077]在另一個實施方案中，本文提供了一種用於將乙醯輔酶A從線粒體運輸至非天然存在的真核生物的細胞溶質的方法，所述方法包括:培養非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:將乙醯輔酶A從所述生物的線粒體運輸至所述生物的細胞溶質。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:檸檬酸合酶；檸檬酸轉運蛋白；檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；ATP檸檬酸裂合酶；檸檬酸裂合酶；乙醯輔酶A合成酶；草醯乙酸轉運蛋白；細胞溶質蘋果酸脫氫酶；蘋果酸轉運蛋白；線粒體蘋果酸脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙醯輔酶A連接酶或轉移酶；乙酸激酶；磷酸轉乙醯酶；丙酮酸脫羧酶；乙醛脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)；丙酮酸脫氫酶，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脫氫酶(醯化)；蘇氨酸醛縮酶；線粒體乙醯肉鹼轉移酶；細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；和線粒體乙醯肉鹼移位酶。
[0078]在某些實施方案中，本文提供了一種用於將乙醯輔酶A從過氧化物酶體運輸至非天然存在的真核生物的細胞溶質的方法，所述方法包括:培養所述非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:將乙醯輔酶A從所述生物的過氧化物酶體運輸至所述生物的細胞溶質。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶和過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶。
[0079] 在第三方面，本文提供了一種生產細胞溶質乙醯輔酶A的方法，所述方法包括:在一定條件下培養非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物足夠的時間段，以生產細胞溶質乙醯輔酶A。在一個實施方案中，所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:在所述生物中產生細胞溶質乙醯輔酶A。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:檸檬酸合酶；檸檬酸轉運蛋白；檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；ATP檸檬酸裂合酶；檸檬酸裂合酶；乙醯輔酶A合成酶；草醯乙酸轉運蛋白；細胞溶質蘋果酸脫氫酶；蘋果酸轉運蛋白；線粒體蘋果酸脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙醯輔酶A連接酶或轉移酶；乙酸激酶；磷酸轉乙醯酶；丙酮酸脫羧酶；乙醛脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)；丙酮酸脫氫酶，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脫氫酶(醯化)；蘇氨酸醛縮酶；線粒體乙醯肉鹼轉移酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶；細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；線粒體乙醯肉鹼移位酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草醯乙酸脫羧酶；丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)；乙醯輔酶A羧化酶；丙二醯輔酶A脫羧酶；草醯乙酸脫氫酶；草醯乙酸氧化還原酶；丙二醯輔酶A還原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脫氫酶；丙二醯輔酶A合成酶；丙二醯輔酶A轉移酶；蘋果酸酶；蘋果酸脫氫酶；蘋果酸氧化還原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。
[0080]在第四方面，本文提供了一種用於增加非天然存在的真核生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A的方法，所述方法包括:在一定條件下培養非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物足夠的時間段，以增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A。在某些實施方案中，所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:增加所述非天然存在的真核生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:檸檬酸合酶；檸檬酸轉運蛋白；檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；ATP檸檬酸裂合酶；檸檬酸裂合酶；乙醯輔酶A合成酶；草醯乙酸轉運蛋白；細胞溶質蘋果酸脫氫酶；蘋果酸轉運蛋白；線粒體蘋果酸脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙醯輔酶A連接酶或轉移酶；乙酸激酶；磷酸轉乙醯酶；丙酮酸脫羧酶；乙醛脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)；丙酮酸脫氫酶，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脫氫酶(醯化)；蘇氨酸醛縮酶；線粒體乙醯肉鹼轉移酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶；細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；線粒體乙醯肉鹼移位酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草醯乙酸脫羧酶；丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)；乙醯輔酶A羧化酶；丙二醯輔酶A脫羧酶；草醯乙酸脫氫酶；草醯乙酸氧化還原酶；丙二醯輔酶A還原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脫氫酶；丙二醯輔酶A合成酶；丙二醯輔酶A轉移酶；蘋果酸酶；蘋果酸脫氫酶；蘋果酸氧化還原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶。
[0081]在許多真核生物中，乙醯輔酶A主要由線粒體中的丙酮酸脫氫酶合成(圖1)。將乙醯輔酶A從線粒體輸出至細胞溶質的機制，能夠實現例如起源於乙醯輔酶A的細胞溶質1，3-BD0生產途徑的利用。用於輸出乙醯輔酶A的示例性機制包括在圖2、3和8中描繪的那些，其可以涉及在線粒體中從乙醯輔酶A和草醯乙酸形成檸檬酸，將檸檬酸從線粒體輸出至細胞溶質，和將檸檬酸轉化成草醯乙酸和乙酸或乙醯輔酶A。在某些實施方案中，本文提供了工程改造真核生物以增加它的細胞溶質乙醯輔酶A的可用性的方法，其中引入能夠實現圖2、3和8中的任一個中描繪的轉化的酶。本文中也公開了能夠實現所需轉化的示例性酶。
[0082]乙醯輔酶A集中在細胞的細胞器(諸如過氧化物酶體和線粒體)中，還可以藉助於載體蛋白(諸如肉鹼或其它乙醯基載體)而輸出到細胞溶質中。在本文提供的組合物和方法的某些實施方案中，乙醯基單元跨細胞器膜(諸如線粒體或過氧化物酶體膜)的易位利用載體分子或醯基輔酶A轉運蛋白。一種示例性的乙醯基載體分子是肉鹼。其它示例性的乙醯基載體分子或轉運蛋白包括穀氨酸、丙酮酸、咪唑和葡糖胺。
[0083]使用載體蛋白將集中在細胞的細胞器(諸如過氧化物酶體和線粒體)中的乙醯輔酶A輸出至細胞溶質的機制可以實現例如起源於乙醯輔酶A的細胞溶質1，3-BD0生產途徑的利用。在圖6中描繪了示例性的乙醯肉鹼易位途徑。在一個途徑中，線粒體乙醯輔酶A被線粒體乙醯肉鹼轉移酶轉化成乙醯肉鹼。線粒體乙醯肉鹼然後可以被線粒體乙醯肉鹼移位酶跨線粒體膜轉移進細胞溶質中，然後被細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶轉化成細胞溶質乙醯輔酶A。在另一個途徑中，過氧化物酶體乙醯輔酶A被過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶轉化成乙醯肉鹼。過氧化物酶體乙醯肉鹼然後可以被過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶跨過氧化物酶體膜轉移進細胞溶質中，然後被細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶轉化成細胞溶質乙醯輔酶A。[0084]將細胞溶質丙酮酸和蘇氨酸轉化成細胞溶質乙醯輔酶A的途徑，可以實現例如起源於乙醯輔酶A的細胞溶質1，3-BD0生產途徑的利用。除了幾種已知的途徑以外，圖5描繪了 4種新穎的將細胞溶質丙酮酸轉化成細胞溶質乙醯輔酶A的示例性途徑。在一個途徑中，丙酮酸被丙酮酸氧化酶轉化成乙酸(乙酸形成)。乙酸隨後被乙醯輔酶A合成酶、連接酶或轉移酶直接地轉化成乙醯輔酶A，或者經由乙醯磷酸中間體間接地轉化成乙醯輔酶A。在一個替代途徑中，丙酮酸被丙酮酸脫羧酶脫羧為乙醛。乙醛脫氫酶將乙醛氧化為乙酸。乙酸然後被乙酸激酶和磷酸轉乙醯酶轉化成乙醯輔酶A。在另一個途徑中，丙酮酸被丙酮酸氧化酶氧化為乙醯磷酸(乙醯磷酸形成)。磷酸轉乙醯酶然後將乙醯磷酸轉化成乙醯輔酶A。本文中也公開了能夠實現所需轉化的示例性酶。
[0085]用於將細胞溶質磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和丙酮酸轉化成細胞溶質乙醯輔酶A的途徑，也可以實現例如起源於乙醯輔酶A的細胞溶質1，3-BD0生產途徑的利用。圖10描繪了12種用於將細胞溶質PEP和丙酮酸轉化成細胞溶質乙醯輔酶A的示例性途徑。在一個途徑中，PEP羧化酶或PEP羧基激酶將PEP轉化成草醯乙酸(步驟A);草醯乙酸脫羧酶將草醯乙酸轉化成丙二酸(步驟B);丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)將丙二酸半醛轉化成乙醯輔酶A(步驟C)。在另一個途徑中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶將PEP轉化成丙酮酸(步驟N);丙酮酸羧化酶將丙酮酸轉化成草醯乙酸(步驟H);草醯乙酸脫羧酶將草醯乙酸轉化成丙二酸(步驟B);丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)將丙二酸半醛轉化成乙醯輔酶A(步驟C)。在另一個途徑中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶將PEP轉化成丙酮酸(步驟N);蘋果酸酶將丙酮酸轉化成蘋果酸(步驟L);蘋果酸脫氫酶或氧化還原酶將蘋果酸轉化成草醯乙酸(步驟M);草醯乙酸脫羧酶將草醯乙酸轉化成丙二酸(步驟B);丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)將丙二酸半醛轉化成乙醯輔酶A(步驟C)。在另一個途徑中，PEP羧化酶或PEP羧基激酶將PEP轉化成草醯乙酸(步驟A);草醯乙酸脫羧酶將草醯乙酸轉化成丙二酸半醛(步驟B);丙二醯輔酶A還原酶將丙二酸半醛轉化成丙二醯輔酶A (步驟G);丙二醯輔酶A脫羧酶將丙二醯輔酶A轉化成乙醯輔酶A (步驟(D)。在另一個途徑中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶將PEP轉化成丙酮酸(步驟N);丙酮酸羧化酶將丙酮酸轉化成草醯乙酸(步驟H);草醯乙酸脫羧酶將草醯乙酸轉化成丙二酸半醛(步驟B);丙二醯輔酶A還原酶將丙二酸半醛轉化成丙二醯輔酶A (步驟G);丙二醯輔酶A脫羧酶將丙二醯輔酶A轉化成乙醯輔酶A (步驟(D)。在另一個途徑中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶將PEP轉化成丙酮酸(步驟N);蘋果酸酶將丙酮酸轉化成蘋果酸(步驟L);蘋果酸脫氫酶或氧化還原酶將蘋果酸轉化成草醯乙酸(步驟M);草醯乙酸脫羧酶將草醯乙酸轉化成丙二酸半醛(步驟B);丙二醯輔酶A還原酶將丙二酸半醛轉化成丙二醯輔酶A (步驟G);丙二醯輔酶A脫羧酶將丙二醯輔酶A轉化成乙醯輔酶A (步驟(D)。在另一個途徑中，PEP羧化酶或PEP羧基激酶將PEP轉化成草醯乙酸(步驟A);草醯乙酸脫羧酶將草醯乙酸轉化成丙二酸半醛(步驟B);丙二酸半醛脫氫酶將丙二酸半醛轉化成丙二酸(步驟J);丙二醯輔酶A合成酶或轉移酶將丙二酸轉化成丙二醯輔酶A (步驟K);丙二醯輔酶A脫羧酶將丙二醯輔酶A轉化成乙醯輔酶A(步驟D)。在另一個途徑中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶將PEP轉化成丙酮酸(步驟N);丙酮酸羧化酶將丙酮酸轉化成草醯乙酸(步驟H);草醯乙酸脫羧酶將草醯乙酸轉化成丙二酸半醛(步驟B);丙二酸半醛脫氫酶將丙二酸半醛轉化成丙二酸(步驟J);丙二醯輔酶A合成酶或轉移酶將丙二酸轉化成丙二醯輔酶A (步驟K);丙二醯輔酶A脫羧酶將丙二醯輔酶A轉化成乙醯輔酶A (步驟D)。在另一個途徑中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶將PEP轉化成丙酮酸(步驟N);蘋果酸酶將丙酮酸轉化成蘋果酸(步驟L);蘋果酸脫氫酶或氧化還原酶將蘋果酸轉化成草醯乙酸(步驟M)；草醯乙酸脫羧酶將草醯乙酸轉化成丙二酸半醛(步驟B);丙二酸半醛脫氫酶將丙二酸半醛轉化成丙二酸(步驟J);丙二醯輔酶A合成酶或轉移酶將丙二酸轉化成丙二醯輔酶A (步驟K);丙二醯輔酶A脫羧酶將丙二醯輔酶A轉化成乙醯輔酶A(步驟D)。在另一個途徑中，PEP羧化酶或PEP羧基激酶將PEP轉化成草醯乙酸(步驟A);草醯乙酸脫氫酶或草醯乙酸氧化還原酶將草醯乙酸轉化成丙二醯輔酶A (步驟F);丙二醯輔酶A脫羧酶將丙二醯輔酶A轉化成乙醯輔酶A (步驟D)。在另一個途徑中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶將PEP轉化成丙酮酸(步驟N);丙酮酸羧化酶將丙酮酸轉化成草醯乙酸(步驟H);草醯乙酸脫氫酶或草醯乙酸氧化還原酶將草醯乙酸轉化成丙二醯輔酶A (步驟F);丙二醯輔酶A脫羧酶將丙二醯輔酶A轉化成乙醯輔酶A (步驟D)。在另一個途徑中，丙酮酸激酶或PEP磷酸酶將PEP轉化成丙酮酸(步驟N);蘋果酸酶將丙酮酸轉化成蘋果酸(步驟L);蘋果酸脫氫酶或氧化還原酶將蘋果酸轉化成草醯乙酸(步驟M);草醯乙酸脫氫酶或草醯乙酸氧化還原酶將草醯乙酸轉化成丙二醯輔酶A (步驟F);丙二醯輔酶A脫羧酶將丙二醯輔酶A轉化成乙醯輔酶A (步驟D)。
[0086]在某些實施方案中，本文提供的任意途徑(例如，乙醯輔酶A和/或1，3-BD0途徑)進一步包括將乙醯輔酶A轉化成乙醯乙醯輔酶A，例如，如在圖4、7或10中所示。在某些實施方案中，所述途徑包括乙醯乙醯輔酶A硫解酶，其將乙醯輔酶A轉化成乙醯乙醯輔酶A(圖4，步驟A ;圖7，步驟A ;圖10，步驟I)。在另一個實施方案中，所述途徑包括:乙醯輔酶A羧化酶，其將乙醯輔酶A轉化成丙二醯輔酶A(圖7，步驟E ;圖10，步驟D);乙醯乙醯輔酶A合酶，其將丙二醯輔酶A和乙醯輔酶A轉化成乙醯乙醯輔酶A (圖7，步驟F ;圖10，步驟E)。
[0087]在某些實施方案中，本文中提供的非天然存在的真核生物表達編碼乙醯輔酶A途徑的基因，所述乙醯輔酶A途徑用於生產細胞溶質乙醯輔酶A。在某些實施方案中，乙醯輔酶A途徑的成功工程改造需要:鑑別具有足夠活性和特異性的酶的適當集合，將它們的對應基因克隆進生產宿主中，優化用於將線粒體乙醯輔酶A轉化成細胞溶質乙醯輔酶A的培養條件，和測定輸出後細胞溶質乙醯輔酶A的產生或水平的增加。[0088]從線粒 體或過氧化物酶體乙醯輔酶A生產細胞溶質乙醯輔酶A可以通過許多途徑來完成，例如，在約2-5個酶促步驟中。在一個示例性的途徑中，檸檬酸合酶將線粒體乙醯輔酶A和草醯乙酸化合成檸檬酸，並由檸檬酸或檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白輸出線粒體(參見，例如，圖2)。細胞溶質中的檸檬酸的酶促轉化會產生細胞溶質乙醯輔酶A和草醯乙酸。細胞溶質草醯乙酸然後可以任選地被草醯乙酸轉運蛋白和/或檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白運回到線粒體中。在另一個示例性的途徑中，細胞溶質草醯乙酸首先在細胞溶質中被酶轉化成蘋果酸，然後任選地被蘋果酸轉運蛋白和/或蘋果酸/檸檬酸轉運蛋白轉移進線粒體中(參見，例如，圖3)。線粒體蘋果酸然後可以被線粒體蘋果酸脫氫酶轉化成草醯乙酸。在另一個示例性的途徑中，線粒體乙醯輔酶A被線粒體乙醯肉鹼轉移酶轉化成乙醯肉鹼。線粒體乙醯肉鹼然後可以被線粒體乙醯肉鹼移位酶跨線粒體膜轉移進細胞溶質中，然後被細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶轉化成細胞溶質乙醯輔酶A。在另一個示例性的途徑中，過氧化物酶體乙醯輔酶A被過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶轉化成乙醯肉鹼。過氧化物酶體乙醯肉鹼然後可以被過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶跨過氧化物酶體膜轉移進細胞溶質中，然後被細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶轉化成細胞溶質乙醯輔酶A。
[0089]從細胞溶質丙酮酸生產細胞溶質乙醯輔酶A可以通過許多途徑來完成，例如，在約2-4個酶促步驟中，並在圖5中描繪了示例性途徑。在一個途徑中，丙酮酸氧化酶將丙酮酸轉化成乙酸(乙酸形成)。乙酸隨後被乙醯輔酶A合成酶、連接酶或轉移酶直接地轉化成乙醯輔酶A，或者經由乙醯磷酸中間體間接地轉化成乙醯輔酶A。在一個替代途徑中，丙酮酸脫羧酶將丙酮酸脫羧成乙醛。乙醛脫氫酶將乙醛氧化成乙酸。乙酸然後被乙酸激酶和磷酸轉乙醯酶轉化成乙醯輔酶A。在另一個途徑中，丙酮酸氧化酶將丙酮酸氧化成乙醯磷酸(乙醯磷酸形成)。磷酸轉乙醯酶然後將乙醯磷酸轉化成乙醯輔酶A。在圖10中描繪了用於將細胞溶質丙酮酸轉化成乙醯輔酶A的其它示例性途徑。
[0090]如以上所討論的，用於將線粒體乙醯輔酶A轉化成細胞溶質乙醯輔酶A和增加真核生物內的細胞溶質乙醯輔酶A的水平的方法，可以實現經由細胞溶質生產途徑的幾種工業上重要的化合物(包括1，3-BD0)的細胞溶質生產，所述途徑利用細胞溶質乙醯輔酶A作為起始原料。在某些實施方案中，本文中提供的生物進一步包含使用細胞溶質乙醯輔酶A作為起始原料來生產化合物的生物合成途徑。在某些實施方案中，所述化合物是1，3-BD0。
[0091]可以將微生物工程改造成使用乙醯輔酶A生產幾種工業上重要的化合物，包括1，3-BD0。因而，本文提供了非天然存在的真核生物，其可以經工程改造成生產商品化學品，諸如1，3-丁二醇。1，3-BD0是一種4碳二醇，其在傳統上從乙炔經由它的水合而生產。得到的乙醛然後被轉化成3-羥基丁醛，後者隨後被還原以形成1，3-BD0。近年來，已經用更偏移的乙烯替代乙炔作為乙醛來源。1，3-BD0經常被用作食品矯味劑的有機溶劑。它也被用作聚氨酯和聚酯樹脂的共聚單體，並且被廣泛地用作降血糖劑。光學活性的1，3-BD0是一種用於合成生物活性化合物和液晶的有用起始原料。1，3-BD0的大量商業應用是隨後脫水以得到1，3- 丁二烯(Ichikawa等人，J.0f MolecularCatalysis A-Chemical, 256:106-112 (2006) ;Ichikawa 等人，J.0f Molecular CatalysisA-Chemical, 231:181-189 (2005))，所述I, 3- 丁二烯每年有250億磅用於生產合成橡膠(例如，輪胎)、膠乳和樹脂的石化產品。1，3-BD0生產對基於石油的原料的依賴，證明使用可再生原料生產1，3-BD0和丁二烯的替代途徑的開發是正當的。[0092]圖4描繪了使用乙醯輔酶A作為起始原料的多個示例性途徑，其可以用於從乙醯輔酶A生產1，3-BD0。在某些實施方案中，在圖4的1，3-BD0途徑中描繪的乙醯乙醯輔酶A由乙醯乙醯輔酶A合成酶從乙醯輔酶A和丙二醯輔酶A合成，例如，如在圖7 (步驟E和F)或圖9中所示，其中乙醯輔酶A羧化酶將乙醯輔酶A轉化成丙二醯輔酶A，乙醯乙醯輔酶A合成酶從乙醯輔酶A和丙二醯輔酶A合成乙醯乙醯輔酶A。
[0093]細胞溶質中的1，3-BD0生產依賴於天然細胞機制來提供必要的前體。如在圖4中所示，乙醯輔酶A可以提供用於生產1，3-BD0的碳前體。因而，能夠生產高濃度的細胞溶質乙醯輔酶A的乙醯輔酶A途徑是實現起源於乙醯輔酶A的細胞溶質1，3-BD0生產途徑的利用所需要的。
[0094]在本文提供的某些乙醯輔酶A途徑中，在細胞溶質中從丙酮酸或蘇氨酸前體合成乙醯輔酶A(圖5)。在本文提供的其它乙醯輔酶A途徑中，在細胞溶質中從磷酸烯醇丙酮酸(PEP)或丙酮酸合成乙醯輔酶A(圖10)。在本文提供的其它乙醯輔酶A途徑中，在細胞隔室中合成乙醯輔酶A，並將其直接地或間接地運輸至細胞溶質。將乙醯基單元從線粒體或過氧化物酶體運輸至細胞溶質的一種示例性機制是肉鹼穿梭(圖6)。另一種示例性機制包括:將線粒體乙醯輔酶A轉化成代謝中間體諸如檸檬酸或檸蘋酸，將該中間體運輸至細胞溶質，然後再生乙醯輔酶A(參見圖2、3和8)。在下面和在實施例1-1II中更詳細地描述了示例性的乙醯輔酶A途徑和對應的酶。
[0095]因而，在另一個方面，本文提供了一種非天然存在的真核生物，其包含:(1)乙醯輔酶A途徑，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:(i)將乙醯輔酶A從所述生物的線粒體和/或過氧化物酶體運輸至所述生物的細胞溶質，(?)在所述生物的細胞質中生產乙醯輔酶A，和/或(iii)增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A，和(2)1，3-BD0途徑，其包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達。在某些實施方案中，(I)所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:檸檬酸合酶；檸檬酸轉運蛋白；檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；ATP檸檬酸裂合酶；檸檬酸裂合酶；乙醯輔酶A合成酶；草醯乙酸轉運蛋白；細胞溶質蘋果酸脫氫酶；蘋果酸轉運蛋白；線粒體蘋果酸脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙醯輔酶A連接酶或轉移酶；乙酸激酶；磷酸轉乙醯酶；丙酮酸脫羧酶；乙醛脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)；丙酮酸脫氫酶，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脫氫酶(醯化)；蘇氨酸醛縮酶；線粒體乙醯肉鹼轉移酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶；細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；線粒體乙醯肉鹼移位酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草醯乙酸脫羧酶；丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)；乙醯輔酶A羧化酶；丙二醯輔酶A脫羧酶；草醯乙酸脫氫酶；草醯乙 酸氧化還原酶；丙二醯輔酶A還原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脫氫酶；丙二醯輔酶A合成酶；丙二醯輔酶A轉移酶；蘋果酸酶；蘋果酸脫氫酶；蘋果酸氧化還原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶；和/或(2)所述1，3-BD0途徑包括一種或多種選自以下的酶:乙醯乙醯輔酶A硫解酶；乙醯輔酶A羧化酶；乙醯乙醯輔酶A合酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醇形成)；3_氧代丁醛還原酶(醛還原)；4_羥基，2-丁酮還原酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醛形成)；3_氧代丁醛還原酶(酮還原)；3-羥基丁醛還原酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(酮還原)；3_羥基丁醯輔酶A還原酶(醛形成)；3-羥基丁醯輔酶A還原酶(醇形成)；乙醯乙醯輔酶A轉移酶、乙醯乙醯輔酶A水解酶、乙醯乙醯輔酶A合成酶、或磷酸轉乙醯乙醯酶和乙醯乙酸激酶；乙醯乙酸還原酶；3-羥基丁醯輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶；3_羥基丁酸還原酶；和3-羥基丁酸脫氫酶。
[0096]任何非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑且經工程改造成包含乙醯輔酶A途徑酶(諸如本文提供的那些)的真核生物，可以經工程改造成進一步包含一種或多種1，3-BD0途徑酶，諸如本文提供的那些。
[0097]本文還提供了一種用於生產1，3-BD0的方法，所述方法包括:在一定條件下培養本文提供的任一種包含1，3-BD0途徑的生物足夠的時間段以生產1，3-BD0。由本文描述的生物和方法生產的1，3-BD0的脫水會提供在小最終使用場所中生產可再生的丁二烯的機會，從而避免運輸該可燃性的且反應性的化學品的需要。
[0098]在第六方面，本文提供了一種生產1，3-BD0的方法，所述方法包括:在一定條件下培養非天然存在的真核生物足夠的時間段以生產1，3-BD0，其中所述非天然存在的真核生物包含:(1)乙醯輔酶A途徑；和(2)1，3-BD0途徑。在某些實施方案中，本文提供了一種生產1，3-BD0的方法，所述方法包括:培養非天然存在的真核生物，其包含:(I)乙醯輔酶A途徑，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:(i)將乙醯輔酶A從所述生物的線粒體和/或過氧化物酶體運輸至所述生物的細胞溶質，(?)在所述生物的細胞質中生產乙醯輔酶A，和/或(iii)增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A ;和(2) I, 3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達。在某些實施方案中，(I)所述乙醯輔酶A途徑包括一種或多種選自以下的酶:檸檬酸合酶；梓檬酸轉運蛋白；檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白；檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；ATP檸檬酸裂合酶；檸檬酸裂合酶；乙醯輔酶A合成酶；草醯乙酸轉運蛋白；細胞溶質蘋果酸脫氫酶；蘋果酸轉運蛋白；線粒體蘋果酸脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；乙醯輔酶A連接酶或轉移酶；乙酸激酶；磷酸轉乙醯酶；丙酮酸脫羧酶；乙醛脫氫酶；丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)；丙酮酸脫氫酶，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；乙醛脫氫酶(醯化)；蘇氨酸醛縮酶；線粒體乙醯肉鹼轉移酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶；細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；線粒體乙醯肉鹼移位酶；過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶；PEP羧化酶；PEP羧基激酶；草醯乙酸脫羧酶；丙二酸半醛脫氫酶(乙醯化)；乙醯輔酶A羧化酶；丙二醯輔酶A脫羧酶；草醯乙酸脫氫酶；草醯乙酸氧化還原酶；丙二醯輔酶A還原酶；丙酮酸羧化酶；丙二酸半醛脫氫酶；丙二醯輔酶A合成酶；丙二醯輔酶A轉移酶；蘋果酸酶；蘋果酸脫氫酶；蘋果酸氧化還原酶；丙酮酸激酶；和PEP磷酸酶；和(2)所述1，3-BD0途徑包括一種或多種選自以下的酶:乙醯乙醯輔酶A硫解酶；乙醯輔酶A羧化酶；乙醯乙醯輔酶A合酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醇形成)；3_氧代丁醛還原酶(醛還原)；4_羥基，2-丁酮還原酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醛形成)；3_氧代丁醛還原酶(酮還原)；3-羥基丁醛還原酶；乙醯乙醯輔酶A還原酶(酮還原)；3_羥基丁醯輔酶A還原酶(醛形成)；3-羥基丁醯輔酶A還原酶(醇形成)；乙醯乙醯輔酶A轉移酶、乙醯乙醯輔酶A水解酶、乙醯乙醯輔酶A合成酶、或磷酸轉乙醯乙醯酶和乙醯乙酸激酶；乙醯乙酸還原酶；3_羥基丁醯輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶；和3-羥基丁酸還原酶；和3-羥基丁酸脫氫酶。
[0099]任何非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑且經工程改造成包含乙醯輔酶A途徑酶(諸如本文提供的那些)的真核生物，可以經工程改造成進一步包含一種或多種1，3-BD0途徑酶。在某些實施方案中，與1，3-BD0途徑相組合的乙醯輔酶A途徑的成功工程改造需要:鑑別具有足夠活性和特異性的酶的適當集合，將它們的對應基因克隆進生產宿主中，優化用於生產細胞溶質乙醯輔酶A和生產1，3-BD0的培養條件，和測定1，3-BD0產物形成的產生或水平的增加。
[0100]例如，可以通過許多途徑在約3-6個酶促步驟(如在圖4中所示)中完成乙醯輔酶A至1，3-BD0的轉化。圖4描繪了從乙醯輔酶A生產1，3-BD0的多個途徑。從乙醯輔酶A至1，3-BD0的這些途徑中的每一個利用3個還原當量，並提供每消耗I摩爾葡萄糖得到I摩爾1，3-BD0的理論收率。其它碳底物(諸如合成氣)也可以用於生產乙醯乙醯輔酶A。假定從葡萄糖得到6摩爾CO和6摩爾H2，使葡萄糖氣化以形成合成氣，會產生每消耗I摩爾葡萄糖得到1.09摩爾1，3-BD0的最大理論收率，
[0101]6C0+6H2 — 1.091C4H10O2+1.636C02+0.545H2
[0102]本文提供的方法部分地涉及通過培養這些非天然存在的真核生物來生產1，3-BD0的方法。通過本文描述的生物和方法生產的1，3-BD0的脫水，會提供在小最終使用場所中生產可再生的丁二烯的機會，從而避免運輸該可燃性的且反應性的化學品的需要。
[0103]在某些實施方案中，所述非天然存在的真核生物包含乙醯輔酶A途徑，其中所述生物包含編碼至少一種乙醯輔酶A途徑酶的至少一種外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現以下目的的量表達:(i)將乙醯輔酶A從所述生物的線粒體和/或過氧化物酶體運輸至所述生物的細胞溶質，(?)在所述生物的細胞質中生產乙醯輔酶A，和/或(iii)增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A。在一個實施方案中，所述至少一種乙醯輔酶A途徑酶以足以將乙醯輔酶A從所述生物的線粒體和/或過氧化物酶體運輸至生物的細胞溶質的量表達。在一個實施方案中，所述至少一種乙醯輔酶A途徑酶以足以在所述生物中產生細胞溶質乙醯輔酶A的量表達。在另一個實施方案中，所述至少一種乙醯輔酶A途徑酶以足以增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A的量表達。
[0104]在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含:2A，2B，2C，2D，2E，2F，2G，2K，2L，3H，31 或 3J，或其中 2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2K、2L、3H、3I 和 3J 的任意組合；其中 2A 是檸
檬酸合酶；2B是檸檬酸轉運蛋白；2C是檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白或檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；2D是ATP檸檬酸裂合酶；2E是檸檬酸裂合酶；2F是乙醯輔酶A合成酶；2G是草醯乙酸轉運蛋白；2K是乙酸激酶；2L是磷酸轉乙醯酶；3H是細胞溶質蘋果酸脫氫酶；31是蘋果酸轉運蛋白JP3J是線粒體蘋果酸脫氫酶。在某些實施方案中，2C是檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白。在其它實施方案中，2C是檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白。
[0105] 在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑是在圖2中描繪的乙醯輔酶A途徑。在其它實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑是在圖3中描繪的乙醯輔酶A途徑。在一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2A、2B和2D。在另一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2A、2C和2D。在另一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2A、2B、2C和2D。在一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2A、2B、2E和2F。在另一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2A、2C、2E和2F。在其它實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2A、2B、2C、2E和2F。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2A、2B、2E、2K和2L。在另一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2A、2C、2E、2K和2L。在其它實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2A、2B、2C、2E、2K和2L。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含2G、3H、31、3J或它們的任意組合。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含2G。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含3H。在其它實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含31。在其它實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含3J。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含2G和3H。在一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含2G和31。在一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含2G和3J。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含3H和31。在其它實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含3H和3J。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含31和3J。在另一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含2G、3H和31。在另一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含2G、3H和3J。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含2G、3I和3J。在其它實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含3H、3I和3J。[0106]在一個實施方案中,所述乙醯輔酶A途徑包含2A。在另一個實施方案中,所述乙醯輔酶A途徑包含2B。在一個實施方案中,所述乙醯輔酶A途徑包含2C。在另一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2D。在一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2E。在另一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2F。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2G。在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2K。在另一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含2L。在其它實施方案中,所述乙醯輔酶A途徑包含3H。在另一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含31。在一個實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含3J。
[0107]在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含:2A和2B ;2A和2C ;2A和2D ;2A和2E ；2A 和 2F ；2A 和 2G ；2A 和 2K ；2A 和 2L ；2A 和 3H ；2A 和 31 ；2A 和 3 J ；2B 和 2C ；2B 和 2D ；2B 和 2E ；2B 和 2F ；2B 和 2G ；2B 和 2K ；2B 和 2L ；2B 和 3H ；2B 和 31 ；2B 和 3J ；2C 和 2D ；2C 和2E ；2C 和 2F ；2C 和 2G ；2C 和 2K ；2C 和 2L ；2C 和 3H ；2C 和 31 ；2C 和 3J ；2D 和 2E ；2D 和 2F ；2D 和 2G ；2D 和 2E ；2D 和 2F ；2D 和 2G ；2D 和 2K ；2D 和 2L ；2D 和 3H ；2D 和 31 ；2D 和 3J ；2E 和2F ；2E 和 2G ；2E 和 2K ；2E 和 2L ；2E 和 3H ；2E 和 31 ；2E 和 3 J ；2F 和 2G ；2F 和 2K ；2F 和 2L ；2F 和 3H ；2F 和 31 ；2F 和 3J ；2G 和 2K ；2G 和 2L ；2G 和 3H ；2G 和 31 ；2G 和 3J ；2K 和 2L ；2Κ和 3Η ；2Κ 和 31 ；2Κ 和 3J ；2L 和 3H ；2L 和 31 ；2L 和 3J ；3H 和 31 ；3H 和 3J ;或 31 和 3J。在某些實施方案中，所述非天然存在的真核生物包含2種或更多種外源核酸，其中所述2種或更多種外源核酸中的每一種編碼不同的乙醯輔酶A途徑酶。
[0108]在其它實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B和2C ;2A、2B和2D ;2A、2B和2E ;2A、2B 和 2F ;2A、2B 和 2G ;2A、2B 和 2K ;2A、2B 和 2L ;2A、2B 和 3H ;2A、2B 和 31 ;2A、2B 和3J ;2A、2C 和 2D ;2A、2C 和 2E ;2A、2C 和 2F ;2A、2C 和 2G ;2A、2C 和 2K ;2A、2C 和 2L ;2A、2C 和3H ;2A、2C 和 31 ;2A、2C 和 3J ;2A、2D 和 2E ;2A、2D 和 2F ;2A、2D 和 2G ;2A、2D 和 2K ;2A、2D 和2L ;2A、2D 和 3H ;2A、2D 和 31 ;2A、2D 和 3J ;2A、2E 和 2F ;2A、2E 和 2G ;2A、2E 和 2K ;2A、2E 和2L ;2A、2E 和 3H ;2A、2E 和 31 ;2A、2E 和 3J ;2A、2F 和 2G ;2A、2F 和 2K ;2A、2F 和 2L ;2A、2F 和3H ;2A、2F 和 31 ;2A、2F 和 3J ;2B、2C 和 2D ;2B、2C 和 2E ;2B、2C 和 2F ;2B、2C 和 2G ;2B、2C 和2K ;2B、2C 和 2L ;2B、2C 和 3H ;2B、2C 和 31 ;2B、2C 和 3J ;2B、2D 和 2E ;2B、2D 和 2F ;2B、2D 和2G ;2B、2D 和 2K ;2B、2D 和 2L ;2B、2D 和 3H ;2B、2D 和 31 ;2B、2D 和 3J ;2B、2E 和 2F ;2B、2E 和2G ;2B、2E 和 2K ;2B、2E 和 2L ;2B、2E 和 3H ;2B、2E 和 31 ;2B、2E 和 3J ;2B、2F 和 2G ;2B、2F 和2K ;2B、2F 和 2L ;2B、2F 和 3H ;2B、2F 和 31 ;2B、2F 和 3J ;2B、2G 和 2K ;2B、2G 和 2L ;2B、2G 和3H ;2B、2G 和 31 ;2B、2G 和 3J ;2B、2K 和 2L ;2B、2K 和 3H ;2B、2K 和 31 ;2B、2K 和 3J ;2B、2L 和3H ;2B、2L 和 31 ;2B、2L 和 3J ;2C、2D 和 2E ;2C、2D 和 2F ;2C、2D 和 2G ;2C、2D 和 2K ;2C、2D 和2L ;2C、2D 和 3H ;2C、2D 和 31 ;2C、2D 和 3J ;2C、2E 和 2F ;2C、2E 和 2G ;2C、2E 和 2K ;2C、2E 和2L ;2C、2E 和 3H ;2C、2E 和 31 ;2C、2E 和 3J ;2C、2F 和 2G ;2C、2F 和 2K ;2C、2F 和 2L ;2C、2F 和2G ;2C、2F 和 2K ;2C、2F 和 2L ;2C、2F 和 3H ;2C、2F 和 31 ;2C、2F 和 3J ;2D、2E 和 2F ;2D、2E 和2G ;2D、2E 和 2K ;2D、2E 和 2L ;2D、2E 和 3H ;2D、2E 和 31 ;2D、2E 和 3J ;2D、2F 和 2G ;2D、2F 和2K ;2D、2F 和 2L ;2D、2F 和 3H ;2D、2F 和 31 ;2D、2F 和 3J ;2D、2G 和 2K ;2D、2G 和 2L ;2D、2G 和3H ;2D、2G 和 31 ;2D、2G 和 3J ;2D、2K 和 2L ;2D、2K 和 3H ;2D、2K 和 31 ;2D、2K 和 3J ;2D、2L 和3H ;2D、2L 和 31 ;2D、2L 和 3J ;2D、3H 和 31 ;2D、3H 和 3J ;2D、3I 和 3J ;2E、2F 和 2G ;2E、2F 和2K ;2E、2F 和 2L ;2E、2F 和 3H ;2E、2F 和 31 ;2E、2F 和 3J ;2E、2G 和 2K ;2E、2G 和 2L ;2E、2G 和3H ;2E、2G 和 31 ;2E、2G 和 3J ;2K、2L 和 3H ;2K、2L 和 31 ;2K、2L 和 3J ;2K、3H 和 31 ;2K、3H 和3J ;2K、3I 和 3J ;2L、3H 和 31 ;2L、3H 和 3J ;2L、3I 和 3J ;或 3H、3I 和 3J。在某些實施方案中，所述非天然存在的真核生物包含3種或更多種外源核酸，其中所述3種或更多種外源核酸中的每一種編碼不同的乙醯輔酶A途徑酶。
[0109]在某些實施方案中，所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2C和2D ;2A、2B、2C和2E ；2A、2B、2C 和 2F ;2A、2B、2C 和 2G ;2A、2B、2C 和 2K ;2A、2B、2C 和 2L ;2A、2B、2C 和 3H ;2A、2B、2C 和 31 ;2A、2B、2C 和 3J ;2A、2B、2D 和 2E ;2A、2B、2D 和 2F ;2A、2B、2D 和 2G ;2A、2B、2D 和2K ;2A、2B、2D 和 2L ;2A、2B、2D 和 3H ;2A、2B、2D 和 31 ;2A、2B、2D 和 3J ;2A、2B、2E 和 2F ;2A、 2B、2E 和 2G ;2A、2B、2E 和 2K ;2A、2B、2E 和 2L ;2A、2B、2E 和 3H ;2A、2B、2E 和 31 ;2A、2B、2E 和3J ;2A、2B、2F 和 2G ;2A、2B、2F 和 2H ;2A、2B、2F 和 21 ;2A、2B、2F 和 3H ;2A、2B、2F 和 31 ;2A、2B、2F 和 3J ;2A、2B、2G 和 2K ;2A、2B、2G 和 2L ;2A、2B、2G 和 3H ;2A、2B、2G 和 31 ;2A、2B、2G 和3J ;2A、2B、2K 和 2L ;2A、2B、2K 和 3H ;2A、2B、2K 和 31 ;2A、2B、2K 和 3J ;2A、2B、2L 和 3H ;2A、2B、2L 和 31 ;2A、2B、2L 和 3J ;2A、2B、3H和 31 ;2A、2B、3H 和 3J ;2A、2B、3I 和 3J ;2A、2C、2D 和2E ;2A、2C、2D 和 2F ;2A、2C、2D 和 2G ;2A、2C、2D 和 2K ;2A、2C、2D 和 2L ;2A、2C、2D 和 3H ;2A、2C、2D 和 31 ;2A、2C、2D 和 3J ;2A、2C、2E 和 2F ;2A、2C、2E 和 2G ;2A、2C、2E 和 2K ;2A、2C、2E 和2L ;2A、2C、2E 和 3H ;2A、2C、2E 和 31 ;2A、2C、2E 和 3J ;2A、2C、2F 和 2G ;2A、2C、2F 和 2K ;2A、2C、2F 和 2L ;2A、2C、2F 和 3H ;2A、2C、2F 和 31 ;2A、2C、2F 和 3J ;2A、2C、2G 和 2K ;2A、2C、2G 和2L ;2A、2C、2G 和 3H ;2A、2C、2G 和 31 ;2A、2C、2G 和 3J ;2A、2C、2K 和 2L ;2A、2C、2K 和 3H ;2A、2C、2K 和 31 ;2A、2C、2K 和 3J ;2A、2C、2L 和 3H ;2A、2C、2L 和 31 ;2A、2C、2L 和 3J ;2A、2C、3H 和31 ;2A、2C、3H 和 3J ;2A、2C、3I 和 3J ;2A、2D、2E 和 2F ;2A、2D、2E 和 2G ;2A、2D、2E 和 2K ;2A、2D、2E 和 2L ;2A、2D、2E 和 3H ;2A、2D、2E 和 31 ;2A、2D、2E 和 3J ;2A、2D、2F 和 2G ;2A、2D、2F 和2K ;2A、2D、2F 和 2L ;2A、2D、2F 和 3H ;2A、2D、2F 和 31 ;2A、2D、2F 和 3J ;2A、2D、2G 和 2K ;2A、2D、2G 和 2L ;2A、2D、2G 和 3H ;2A、2D、2G 和 31 ;2A、2D、2G 和 3J ;2A、2D、2K 和 2L ;2A、2D、2K 和3H ;2A、2D、2K 和 31 ;2A、2D、2K 和 3J ;2A、2D、2L 和 3H ;2A、2D、2L 和 31 ;2A、2D、2L 和 3J ;2A、2D、3H和 31 ;2A、2D、3H 和 3J ;2A、2D、3I 和 3J ;2A、2E、2F 和 2G ;2A、2E、2F 和 2K ;2A、2E、2F 和2L ;2A、2E、2F 和 3H ;2A、2E、2F 和 31 ;2A、2E、2F 和 3J ;2A、2E、2G 和 2K ;2A、2E、2G 和 2L ;2A、2E、2G 和 3H ;2A、2E、2G 和 31 ;2A、2E、2G 和 3J ;2A、2E、2K 和 2L ;2A、2E、2K 和 3H ;2A、2E、2K 和31 ;2A、2E、2K 和 3J ;2A、2E、2L 和 3H ;2A、2E、2L 和 31 ;2A、2E、2L 和 3J ;2A、2E、3H 和 31 ;2A、
【權利要求】
1.一種非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:將乙醯輔酶A從所述生物的線粒體運輸至所述生物的細胞溶質和/或增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A，其中所述乙醯輔酶A途徑包含選自以下的途徑:
i.2A、2B 和 2D ；
i1.2A、2C 和 2D ；
ii1.2A、2B、2E和 2F ；
iv.2A、2C、2E和 2F ；
V.2A、2B、2E、2K 和 2L ;和
v1.2A、2C、2E、2K 和 2L ； 其中，2A是檸檬酸合酶；2B是檸檬酸轉運蛋白；2C是檸檬酸/草醯乙酸轉運蛋白或檸檬酸/蘋果酸轉運蛋白；2D是ATP檸檬酸裂合酶；2E是檸檬酸裂合酶；2F是乙醯輔酶A合成酶；2K是乙酸激酶；且2L是磷酸轉乙醯酶。
2.根據權利要求1所述的生物，其中，所述乙醯輔酶A途徑進一步包含2G、3I和/或3J，其中2G是草醯乙酸轉運蛋白，3H是細胞溶質蘋果酸脫氫酶，31是蘋果酸轉運蛋白，且3J是線粒體蘋果酸脫氫酶。
3.一種非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中，所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A，其中，所述乙醯輔酶A途徑包含選自以下的途徑:
i.5A 和 5B ；
i1.5A、5C 和 5D ；
ii1.5E、5F、5C 和 5D ;和
iv.5G 和 5D ； 其中，5A是丙酮酸氧化酶(乙酸形成)；5B是乙醯輔酶A合成酶、連接酶或轉移酶；5C是乙酸激酶是磷酸轉乙醯酶；5E是丙酮酸脫羧酶，5F是乙醛脫氫酶；且5G是丙酮酸氧化酶(乙醯磷酸形成)。
4.一種非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中，所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:將乙醯輔酶A從所述生物的線粒體和/或過氧化物酶體運輸至所述生物的細胞溶質和/或增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A，其中，所述乙醯輔酶A途徑包含選自以下的途徑:
i.6A、6D 和 6C ;和
i1.6B、6E 和 6C ； 其中，6A是線粒體乙醯肉鹼轉移酶；6B是過氧化物酶體乙醯肉鹼轉移酶；6C是細胞溶質乙醯肉鹼轉移酶；6D是線粒體乙醯肉鹼移位酶；且6E是過氧化物酶體乙醯肉鹼移位酶。
5.一種非天然存在的包含乙醯輔酶A途徑的真核生物，其中，所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A，其中，所述乙醯輔酶A途徑包含選自以下的途徑:
i.1OAUOB 和 IOC ；
i1.1ON、10H、10B 和 IOC ；
6.根據權利要求1-5中的任一項所述的生物，其中，所述真核生物包含2、3、4、5、6、7、.8、9或10種各自編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸。
7.根據權利要求1-6中的任一項所述的生物，所述生物進一步包含1，3_丁二醇(1, 3-BD0)途徑，其中，所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的外源核酸，所述.1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述1，3-BD0途徑包含選自以下的途徑:
8.根據權利要求7所述的生物，其中: i.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B和2D，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4E、.4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； ii.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B和2D，和(2)所述1，3-BD0途徑包含:(ii)4A、.4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； ii1.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B和2D，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4E、.4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； iv.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B和2D，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H和 4J ;*7E、7F、4H 和 4J ； V.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B和2D，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H、41 和 4G ;或 7E、.7F、4H、4I 和 4G ； v1.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B和2D，且(2)所述1, 3-BD0途徑包含:4A、4H、.4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； vi1.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B和2D，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、.40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； vii1.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B和2D，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、.4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； ix.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C和2D，且(2)所述1, 3-BD0途徑包含:4A、4E、.4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； X.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C和2D，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4B和.4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； x1.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C和2D，且(2)所述1, 3-BD0途徑包含:4A、4E、.4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； xi1.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C和2D，且(2)所述1, 3-BD0途徑包含:4A、4H和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； xii1.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C和2D，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、.4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； xiv.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C和2D，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H、.4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； xv.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C和2D，且(2)所述1, 3-BD0途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 .7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； xv1.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C和2D，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、.4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ；xvi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E和2F，且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:`4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； xvii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E和2F，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:`4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； xix.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E和2F，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、`4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； XX.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E和2F，且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、`4H 和 4J;*7E、7F、4H 和 4J ； xx1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E和2F，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、`4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； xxi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E和2F，且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:`4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； xxii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E和2F，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:`4A、4K、40、4N 或 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； xxiv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E和2F，且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:`4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； XXV.(I) 2A、2C、2E 和 2F,且(2)所述 I, 3-BD0 途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、`4E、`4F 和 4G ；xxv1.(I) 2A、2C、2E 和 2F,且(2)所述 I, 3-BD0 途徑包含:4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和`4D ； xxvi1.(I) 2A、2C、2E 和 2F,且(2)所述 I, 3-BD0 途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、`7F、`4E、4C 和 4D ； xxvii1.(I) 2A、2C、2E 和 2F,且(2)所述 I, 3-BD0 途徑包含:4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、`4H和4J ； xxix.(1)2A、2C、2E和2F，且(2)所述 1，3-BD0 途徑包含:4A、4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、`4H、`41 和 4G ； XXX.(1)2A、2C、2E和2F，且(2)所述 1，3-BD0 途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、`7F、`4H、4M、4N 和 4G ； xxx1.(1)2A、2C、2E和2F，且(2)所述 I, 3-BD0 途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;*7E、`7F、`4K、40、4N 和 4G ； xxxi1.(I) 2A、2C、2E 和 2F,且(2)所述 I, 3-BD0 途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 `7E、`7F、4K、4L、4F 和 4G ； xxxii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； xxxiv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:(ii)4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； XXXV.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ；xxxv1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； xxxvi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； xxxvii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； xxxix.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； xl.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2B、2E、2K和2L，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； xi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； xii1.(I)所述乙醯輔酶A途 徑包含:2A、2C、2E、2K和2L，和(2)所述1，3-BD0途徑包含:(ii)4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； xlii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； xliv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； xiv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； xlv1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； xlvi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； xlvii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:2A、2C、2E、2K和2L，且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； xlix.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5A和5B ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4E、.4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ；.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5A和5B ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4B和4D ；或 7E、7F、4B 和 4D ； I1.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5A和5B ;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4E、4C和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； Ii1.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5A和5B ;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H和.4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； Iii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5A和5B ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4H、.41 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； Iiv.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5A和5B;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H、.4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； Iv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5A和5B ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4K、40、.4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ；Iv1.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5A和5B ;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； Ivi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5A、5C和5D ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； Ivii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5A、5C和5D ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； Iix.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5A、5C和且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； Ix.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5A、5C和5D ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4H和 4J;*7E、7F、4H 和 4J ； Ix1.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5A、5C和;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； Ixi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5A、5C和5D ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； Ixii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5A、5C和5D ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ；
Ixiv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5A、5C和5D ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； Ixv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5E、5F、5C和5D ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； Ixv1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5E、5F、5C和5D ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； Ixvi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5E、5F、5C和5D ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； Ixvii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5E、5F、5C和5D ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； Ixix.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5E、5F、5C和5D ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； Ixx.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5E、5F、5C和;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； Ixx1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5E、5F、5C和5D ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； Ixxi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5E、5F、5C和5D ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； Ixxii1.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5G和;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； Ixxiv.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5G和;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4B和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； Ixxv.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5G和;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4E、.4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； lxxv1.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5G和;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H和 4J ;*7E、7F、4H 和 4J ； Ixxvi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5G和;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、.4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； Ixxvii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5G和;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、.4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； Ixxix.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5G和5D ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4K、.40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ;或者 Ixxx.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5G和;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、.4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； Ixxx1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6A、6D和6C ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、.4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； Ixxxi1.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:6A、6D和6C ;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:.4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ；
Ixxxii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6A、6D和6C ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:.4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； Ixxxiv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6A、6D和6C ;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:.4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； Ixxxv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6A、6D和6C ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、.4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； Ixxxv1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6A、6D和6C ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:.4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； Ixxxvi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6A、6D和6C ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:.4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； Ixxxvii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6A、6D和6C;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:.4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； Ixxxix.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:6B、6E和6C ;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:.4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； Xe.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6B、6E和6C ;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4B和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； xc1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6B、6E和6C ;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、.4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； xci1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6B、6E和6C ;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、.4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； xcii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6B、6E和6C;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、.4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； xciv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6B、6E和6C ;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、.4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ；xcv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6B、6E和6C ;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； xcv1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:6B、6E和6C ;且(2)所述I, 3-BD0途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； xcvi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:1OAUOB和IOC ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； xcvii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10B和IOC ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； xcix.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、IOB和IOC ;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； c.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10B和IOC ;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； c1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10AU0B和IOC ;且(2)所述I, 3-BDO途徑包含:4A、4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； ci1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10B和IOC ;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； cii1.(I)所述乙醯輔 酶A途徑包含:10A、IOB和IOC ;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； civ.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、IOB和IOC ;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； CV.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10HU0B和IOC ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； cv1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10HU0B和IOC ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； cvi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10HU0B和IOC ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； cvii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:ION、10H、IOB和IOC ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； cix.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10HU0B和IOC ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； ex.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10HU0B和IOC ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； cx1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10HU0B和IOC ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； cxi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10HU0B和IOC ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； cxii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10M、10B和IOC ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； cxiv.(I)所述乙醯輔酶六途徑包含:10隊101^、1(^1(?和IOC ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ；
cxv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10M、10B和IOC ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； cxv1.(I)所述乙醯輔酶六途徑包含:10隊101^、1(^1(?和IOC ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； cxvi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10M、10B和IOC ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:4A、4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； cxvii1.(I)所述乙醯輔酶六途徑包含:10隊101^、1(^1(?和IOC ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； cxix.(I)所述乙醯輔酶六途徑包含:10隊101^、1(^1(?和IOC ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； CXX.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10M、10B和IOC ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； cxx1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10B、10G和IOD ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； cxxi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10BU0G和IOD ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； cxxii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10B、10G和IOD ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； cxxiv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10BU0G和IOD ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； cxxv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10BU0G和IOD ;且(2)所述I, 3-BDO途徑包含:4A、4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； cxxv1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10BU0G和IOD ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； cxxvi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10B、10G和IOD ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； cxxvii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10BU0G和IOD ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； cxxix.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10H、10B、10G和IOD ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； cxxx.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10H、10B、10G和IOD ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； cxxx1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10H、10B、10G和IOD ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； cxxxi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10H、10BU0G和IOD ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:4A、4H和4J ;或7E、7F、4H和4J ； cxxxii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10H、10BU0G和IOD ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:4A、4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ；cxxxiv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:ION、10H、IOBUOG和IOD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； cxxxv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10H、10B、10G和IOD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； cxxxv1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10H、10BU0G和IOD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； cxxxvi1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10M、10B、10G和IOD ;且(2)所述I, 3-BD0 途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； cxxxvii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10M、10B、10G和IOD ;且(2)所述I, 3-BD0 途徑包含:4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； cxxxix.(I)所述乙醯輔酶六途徑包含:10隊101^、1(^1(?、106和IOD ;且(2)所述I, 3-BD0 途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； cxl.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10M、10BU0G和IOD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H和4J ;或7E、7F、4H和4J ； cxl1.(I)所述乙醯輔酶4途徑包含:10隊101^、1(^1(?、106和IOD ;且(2)所述I, 3-BD0 途徑包含:4A、4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； cxli1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10M、10B、10G和IOD ;且(2)所述I, 3-BD0 途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； cxl ii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10M、10BU0G和IOD ;且(2)所述I, 3-BD0 途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； cxl iv.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10M、10B、10G和IOD ；且(2)所述I, 3-BD0 途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； cxlv.(I)所述乙醯輔酶六途徑包含:1(^、1(?、1(^、101(和IOD ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； cxlv1.(I)所述乙醯輔酶六途徑包含:1(^、1(?、1(^、101(和IOD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4B和4D ;或7E、7F、4B和4D ； cxlvi1.(I)所述乙醯輔酶六途徑包含:1(^、1(?、1(^、101(和IOD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； cxlvii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10B、10J、10K和IOD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H和4J ;或7E、7F、4H和4J ； cxlix.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10B、10J、10K和IOD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； cl.(I)所述乙醯輔酶六途徑包含:1(^、1(?、1(^、101(和IOD ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； cl1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、10B、10J、10K和IOD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； cli1.(I)所述乙醯輔酶六途徑包含:1(^、1(?、1(^、101(和IOD ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； clii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10H、10B、10J、10K和IOD ;且(2)所述.1, 3-BDO 途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； cl.1v.(.1)所述乙醯輔酶六途徑包含:.10隊.10!.1、.1(?、.1(^、.10.1(和.1OD ;且(2)所述.1, 3-BDO 途徑包含:4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； c.1v.(.1)所述乙醯輔酶A途徑包含:.10N、.10H、.10B、.10JU0K和.1OD ;且(2)所述.1，3-BDO途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； clv.1.(.1)所述乙醯輔酶A途徑包含:.1ON、.10H、.10B、.10J、.1OK和.1OD ；且(2)所述.1, 3-BDO 途徑包含:4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； clv.1.1.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:.10N、.10H、.10B、.10JU0K和.1OD ;且(2)所述.1, 3-BD0 途徑包含:4A、4H、4.1 和 4G ;或 7E、7F、4H、4.1 和 4G ； clv.1.1.1.(.1)所述乙醯輔酶A途徑包含:.10N、.10H、.10B、.10JU0K和.1OD ;且(2)所述.1, 3-BD0 途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； cl.1x.(.1)所述乙醯輔酶八途徑包含:.10隊.10!.1、.1(?、.1(^、.10.1(和.1OD ;且(2)所述.1, 3-BD0 途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； clx.(.1)所述乙醯輔酶A途徑包含:.10N、.10H、.10B、.10JU0K和.1OD ;且(2)所述.1，3-BD0途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； clx.1.(.1)所述乙醯輔酶A途徑包含:.10N、.10L、.10M、.10B、.10J、.10K和.1OD ;且(2)所述.1, 3-BD0 途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； clx.1.1.(.1)所述乙醯輔酶A途徑包含:.10N、.10L、.10M、.10B、.10JU0K和.1OD ;且(2)所述.1, 3-BD0 途徑包含:4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； clx.1.1.1.(.1)所述乙醯輔酶A途徑包含:.10N、.10L、.10M、.10B、.10JU0K和.1OD ;且(2)所述.1, 3-BD0 途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； clx.1v.(.1)所述乙醯輔酶六途徑包含:.10隊.10.1^、.1(^.1(?、.1(^、.10.1(和.1OD ;且(2)所述.1, 3-BD0 途徑包含:4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； clxv.(.1)所述乙醯輔酶A途徑包含:.10N、.10L、.10M、.10B、.10JU0K和.1OD ;且(2)所述.1, 3-BD0 途徑包含:4A、4H、4.1 和 4G ;或 7E、7F、4H、4.1 和 4G ； clxv.1.(.1)所述乙醯輔酶六途徑包含:.10隊.10.1^、.1(^.1(?、.1(^、.10.1(和.1OD ;且(2)所述.1, 3-BD0 途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； clxv.1.1.(.1)所述乙醯輔酶A途徑包含:.10N、.10L、.10M、.10B、.10JU0K和.1OD ;且(2)所述.1, 3-BD0 途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； clxv.1.1.1.(.1)所述乙醯輔酶六途徑包含:.10隊.1(^、.1(^.1(?、.1(^、.10.1(和.100;且(2)所述 .1, 3-BD0 途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； clx.1x.(.1)所述乙醯輔酶A途徑包含:.10AU0F和.1OD ;且(2)所述.1, 3-BD0途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； clxx.(.1)所述乙醯輔酶A途徑包含:.10A、.10F和.1OD ;且⑵所述.1，3-BD0途徑包含:4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； clxx.1.(.1)所述乙醯輔酶A途徑包含:.10AU0F和.1OD ;且(2)所述.1, 3-BD0途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； clxx.1.1.(.1)所述乙醯輔酶A途徑包含=.1OAUOF.1P .1OD ;且(2)所述.1，3-BD0途徑包含:4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ；clxx1 11.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10A、1OF和1OD ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4H、41 和 4G ;或 7E、7F、4H、41 和 4G ； clxx1v.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10AU0F和1OD ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:.4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； clxxv.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10AU0F和1OD ;且(2)所述1, 3-BDO途徑包含:.4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； clxxv1.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10AU0F和1OD ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:.4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； clxxv11.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10HU0F和1OD ;且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； clxxv111.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:1ON、10H、1OF和1OD ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； clxx1x.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:1ON、10H、1OF和1OD ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； clxxx.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10HU0F和1OD ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； clxxx1.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:1ON、10H、1OF和1OD ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4H、41 和 4G ;或 7E、7F、4H、41 和 4G ； clxxx11.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10H、10F和1OD ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； clxxx111.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:1ON、10H、1OF和1OD ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； clxxx1v.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10HU0F和1OD ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； clxxxv.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10MU0F和1OD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； clxxxv1.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10MU0F和1OD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4B和4D ;或7E、7F、4B和4D ； clxxxv11.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10M、10F和1OD ;且(2)所述.1,3-BD0 途徑包含:4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； clxxxv1 11.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10MU0F和1OD ;且⑵所述.1,3-BD0 途徑包含:4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； clxxx1x.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10MU0F和1OD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H、41 和 4G ;或 7E、7F、4H、41 和 4G ； CXC.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10M、10F和1OD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； cxc1.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10MU0F和1OD ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ;或者 cxc11.(1)所述乙醯輔酶A途徑包含:10N、10L、10M、10F和1OD ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G。
9.一種非天然存在的真核生物，其包含: (1)乙醯輔酶A途徑，其中，所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以實現下述的量表達:增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A，其中所述乙醯輔酶A途徑包含選自以下的途徑:
i.5J 和 51 ；
i1.5J、5F 和 5B ;和
ii1.5H ； 其中，5B是乙醯輔酶A合成酶、連接酶或轉移酶；5F是乙醛脫氫酶；5H是丙酮酸脫氫酶、丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或丙酮酸甲酸裂合酶；51是乙醛脫氫酶(醯化)；且5了是蘇氨酸醛縮酶；和 (2)I, 3-BD0途徑，其中，所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的外源核酸，所述.1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達，且其中所述1，3-BD0途徑包含選自以下的途徑:
i.4A、4E、4F和 4G ；
i1.4A、4B 和 4D ；
ii1.4A、4E、4C和 4D ；
iv.4A、4H 和 4J ；
v.4A、4H、4I和 4G ；
v1.4A、4H、4M、4N和 4G ；
vi1.4A、4K、40、4N和 4G ；
vii1.4A、4K、4L、4F和 4G ；
ix.7E、7F、4E、4F 和 4G ；
x.7E、7F、4B和 4D ；
x1.7E、7F、4E、4C和 4D ；
xi1.7E、7F、4H和 4J ；
xii1.7E、7F、4H、4I和 4G ；
xiv.7E、7F、4H、4M、4N和 4G ；
xv.7E、7F、4K、40、4N 和 4G ;和
xv1.7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； 其中，4A是乙醯乙醯輔酶A硫解酶；4B是乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醇形成)；4C是3-氧代丁醛還原酶(醛還原)，其中，4D是4-羥基，2- 丁酮還原酶；4E是乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醛形成)；4F是3-氧代丁醛還原酶(酮還原)；4G是3-羥基丁醛還原酶或3-羥基丁醛還原酶；4H是乙醯乙醯輔酶A還原酶(酮還原)；41是.3-羥基丁醯輔酶A還原酶(醛形成)；4J是3-羥基丁醯輔酶A還原酶(醇形成)；4K是乙醯乙醯輔酶A轉移酶、乙醯乙醯輔酶A水解酶、乙醯乙醯輔酶A合成酶、或磷酸轉乙醯乙醯酶和乙醯乙酸激酶；4L是乙醯乙酸還原酶；4M是3-羥基丁醯輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶；4N是3-羥基丁酸還原酶；40是3-羥基丁酸脫氫酶；7E是乙醯輔酶A羧化酶；且7F是乙醯乙醯輔酶A合酶。
10.根據權利要求9所述的生物，其中 1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:(I) 5J和51 ;且(2)所述I, 3-BDO途徑包含:4A、4E、.4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ；. 11.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5J和51;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:4A、4B和.4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； ii1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5J和51 ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:4A、4E、4C和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； iv.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5J和51;且⑵所述l，3-BDO途徑包含:4A、4H和.4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； V.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5J和51 ;且(2)所述l，3-BDO途徑包含:4A、4H、4I和.4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； v1.(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5J和51 ;且(2)所述l，3-BDO途徑包含:4A、4H、4M、.4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； vi1.⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5J和51;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:4A、4K、.40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； vii1.其中所述乙醯輔酶A途徑包含:(1)5J和51 ;且(2)所述l，3-BDO途徑包含:4A、.4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； ix.其中所述乙醯輔酶A途徑包含:(1)5J、5F和5B ;且(2)所述1，3-BDO途徑包含:.4A、4E、4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； X.其中⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5J、5F和5B ;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:.4A、4B 和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； x1.其中⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5J、5F和5B;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:.4A、4E、4C 和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ； xi1.其中⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5J、5F和5B;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:.4A、4H 和 4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； xii1.其中⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5J、5F和5B;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:.4A、4H、4I 和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； xiv.其中⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5J、5F和5B;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:.4A、4H、4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； xv.其中⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5J、5F和5B;且⑵所述l，3-BDO途徑包含:.4A、4K、40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ； xv1.其中⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5J、5F和5B;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:.4A、4K、4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G ； xvi1.其中(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5H;且⑵所述l，3-BDO途徑包含:4A、4E、.4F 和 4G ;或 7E、7F、4E、4F 和 4G ； xvii1.其中(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5H;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:4A、4B和 4D ;或 7E、7F、4B 和 4D ； xix.其中(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5H;且⑵所述1，3-BDO途徑包含:4A、4E、4C和 4D ;或 7E、7F、4E、4C 和 4D ；XX.其中⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5H;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H和.4J ;或 7E、7F、4H 和 4J ； xx1.其中(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5H;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4A、4H、4I和 4G ;或 7E、7F、4H、4I 和 4G ； xxi1.其中(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5H;且⑵所述1，3_BD0途徑包含:4A、4H、.4M、4N 和 4G ;或 7E、7F、4H、4M、4N 和 4G ； xxii1.其中⑴所述乙醯輔酶A途徑包含:5H;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、.40、4N 和 4G ;或 7E、7F、4K、40、4N 和 4G ;或者 xxiv.其中(I)所述乙醯輔酶A途徑包含:5H;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4A、4K、.4L、4F 和 4G ;或 7E、7F、4K、4L、4F 和 4G。
11.一種非天然存在的真核生物，其包含: (1)乙醯乙醯輔酶A途徑，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯乙醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述乙醯乙醯輔酶A途徑酶以足以增加所述生物的細胞溶質中的乙醯乙醯輔酶A的量表達，其中所述乙醯乙醯輔酶A途徑包含: .1.8A、8C、8F和81，其中8A 是線粒體乙醯乙醯輔酶A硫解酶；8C是線粒體乙醯乙醯輔酶A水解酶、轉移酶或合成酶；8F是乙醯乙酸轉運蛋白；且81是細胞溶質乙醯乙醯輔酶A轉移酶或合成酶；或者 i1.8J、8K、8C、8F和81;其中8J是線粒體乙醯輔酶A羧化酶；8K是線粒體乙醯乙醯輔酶A合酶；8C是線粒體乙醯乙醯輔酶A水解酶、轉移酶或合成酶；8F是乙醯乙酸轉運蛋白；且81是細胞溶質乙醯乙醯輔酶A轉移酶或合成酶；和 (2)I, 3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以在所述生物的細胞溶質中生產1，3-BD0的量表達，且其中所述.1，3-BD0途徑包含選自以下的途徑:
.1.4E、4F 和 4G ；
i1.4B 和 4D ；
ii1.4E、4C和 4D ；
iv.4H 和 4J ；
V.4H、4I 和 4G ;和
v1.4H、4M、4N 和 4G ； 其中4B是乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醇形成)；4C是3-氧代丁醛還原酶(醛還原)；4D是4-羥基，2- 丁酮還原酶；4E是乙醯乙醯輔酶A還原酶(輔酶A依賴性的，醛形成)；4F是3-氧代丁醛還原酶(酮還原)；4G是3-羥基丁醛還原酶；4H是乙醯乙醯輔酶A還原酶(酮還原)；41是3-羥基丁醯輔酶A還原酶(醛形成)；4J是3-羥基丁醯輔酶A還原酶(醇形成)；4L是乙醯乙酸還原酶；4M是3-羥基丁醯輔酶A轉移酶、水解酶或合成酶；且4N是3-羥基丁酸還原酶。
12.根據權利要求11所述的生物，其中 .1.⑴所述乙醯乙醯輔酶A途徑包含:8A、8C、8F和81;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:.4E、4F 和 4G ； i1.⑴所述乙醯乙醯輔酶A途徑包含:8A、8C、8F和81;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4B 和 4D ； ii1.⑴所述乙醯乙醯輔酶A途徑包含:8A、8C、8F和81;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4E、4C 和 4D ； iv.⑴所述乙醯乙醯輔酶A途徑包含:8A、8C、8F和81;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4H 和 4J ； V.⑴所述乙醯乙醯輔酶A途徑包含:8A、8C、8F和81 ;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4H、4I 和 4G ； v1.(I)所述乙醯乙醯輔酶A途徑包含:8A、8C、8F和81 ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4H、4M、4N 和 4G ； vi1.(I)所述乙醯乙醯輔酶A途徑包含:8J、8K、8C、8F和81 ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4E、4F和4G ； vii1.(I)所述乙醯乙醯輔酶A途徑包含:8J、8K、8C、8F和81 ;且(2)所述1，3-BD0途徑包含:4B和4D ； ix.⑴所述乙醯乙醯輔酶A途徑包含:8J、8K、8C、8F和81;且⑵所述1，3-BD0途徑包含:4E、4C和4D ； X.(I)所述乙醯乙醯輔酶A途徑包含:8J、8K、8C、8F和81 ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4H和4J； x1.(I)所述乙醯乙醯輔酶A途徑包含:8J、8K、8C、8F和81 ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4H、4I和4G ;或者 xi1.(I)所述乙醯乙醯輔酶A途徑包含:8J、8K、8C、8F和81 ;且(2)所述1，3_BD0途徑包含:4H、4M、4N 和 4G。
13.根據權利要求1-12中的任一項所述的生物，其中，所述生物包含2、3、4、5、6、7、8、.9、10、11、12、13、14或15種各自編碼1，3-BDO途徑酶的外源核酸。
14.根據權利要求1-13中的任一項所述的生物，其中，所述至少一種外源核酸是異源核酸。
15.根據權利要求1-14中的任一項所述的生物，其中，所述生物是在基本上厭氧的培養基中。
16.根據權利要求1-15中的任一項所述的生物，所述生物進一步包含一個或多個副產物途徑的減弱或缺失。
17.根據權利要求16所述的生物，其中，所述一個或多個副產物途徑是在圖7中描繪的一個或多個副產物途徑，3-氧代丁醛脫氫酶或乙醯乙醯輔酶A硫解酶。
18.根據權利要求16或19所述的生物，其中所述副產物途徑包含: i.3-磷酸甘油(G3P)脫氫酶，其將二羥基丙酮轉化成G3P; i1.將G3P轉化成甘油的G3P磷酸酶； ii1.將丙酮酸轉化成乙醛的丙酮酸脫羧酶； iv.將乙醛轉化成乙醇的乙醇脫氫酶； v.乙醛脫氫酶(醯化)，其將乙醯輔酶A轉化成乙醛； v1.乙醯乙醯輔酶A水解酶或轉移酶，其將乙醯乙醯輔酶A轉化成乙醯乙酸；vi1.3-羥基丁醯輔酶A水解酶或轉移酶，其將3-羥基丁醯輔酶A(3-HB輔酶A)轉化成3-羥基丁酸； vii1.3-羥基丁醛脫氫酶，其將3-羥基丁醛轉化成3-羥基丁酸； ix.1，3- 丁二醇脫氫酶，其將1，3- 丁二醇轉化成3-氧代丁醇； X.線粒體丙酮酸脫氫酶，其將丙酮酸轉化成乙醯輔酶A ; x1.3-氧代丁醛脫氫酶，其將3-氧代丁醛轉化成乙醯乙酸；和/或 xi1.乙醯乙醯輔酶A硫解酶，其將乙醯乙醯輔酶A轉化成乙醯輔酶A。
19.一種用於將乙醯輔酶A從線粒體運輸至非天然存在的真核生物的細胞溶質的方法，所述方法包括:在一定條件下培養根據權利要求1-18中的任一項所述的生物足夠的時間段，以將乙醯輔酶A從所述非天然存在的真核生物的線粒體運輸至細胞溶質。
20.一種用於增加非天然存在的真核生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A的方法，所述方法包括:在一定條件下培養根據權利要求1-18中的任一項所述的生物足夠的時間段，以增加所述生物的細胞溶質中的乙醯輔酶A。
21.一種用於將乙醯輔酶A從過氧化物酶體運輸至非天然存在的真核生物的細胞溶質的方法，所述方法包括:在一定條件下培養根據權利要求4或6-19中的任一項所述的生物足夠的時間段，以將乙醯輔酶A從非天然存在的真核生物的過氧化物酶體運輸至細胞溶質。
22.—種非天然存在的包含1，3-BDO途徑的真核生物，其中所述生物進一步包含一種或多種內源和/或外源核酸，所述核酸編碼:
i.1, 3-BDO 途徑酶，所述 1, 3-BDO 途徑酶選自:4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、41、4J、4L、4N、40、7E和7F ;其中至少一種核酸已經被改變，使得由所述核酸編碼的1，3-BDO途徑酶具有與由未改變的或野生型核酸編碼的1，3-BDO途徑酶相比更大的對NADH的親和力； i1.減弱的1，3-BDO途徑酶，所述減弱的l，3-BDO途徑酶選自:4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、41、4J、4L、4N、40、7E和7F ;其中所述減弱的1，3-BDO途徑酶是NAPDH依賴性的，且具有與由未改變的或野生型核酸編碼的1，3-BDO途徑酶相比降低的酶活性； ii1.1, 3-BDO 途徑酶，所述 1, 3-BDO 途徑酶選自:4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、41、4J、4L、4N、40、7E和7F ;其中所述真核生物包含一種或多種基因破壞，所述一種或多種基因破壞會減弱內源性NADPH依賴性的1，3-BDO途徑酶的活性；或者
iv.1, 3-BDO 途徑酶，所述 1, 3-BDO 途徑酶選自:4A、4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、41、4J、4L、4N、40、7E和7F ;其中至少一種核酸已經被改變，使得由所述核酸編碼的1，3-BDO途徑酶具有與由未改變的或野生型核酸編碼的1，3-BDO途徑酶相比更小的對NADPH的親和力。
23.一種非天然存在的真核生物，其包含: (1)(a) 1, 3-BDO途徑，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BDO途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BDO途徑酶以足以生產1，3-BDO的量表達；和 (b)乙醯輔酶A途徑，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的內源和/或外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以增加所述生物中的NADH的量表達；其中所述乙醯輔酶A途徑包含: i.NAD依賴性的丙酮酸脫氫酶； i1.丙酮酸甲酸裂合酶和NAD依賴性的甲酸脫氫酶； ii1.丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶和NADH:鐵氧還蛋白氧化還原酶；iv.丙酮酸脫羧酶和NAD依賴性的醯化乙醯基醛脫氫酶； V.丙酮酸脫羧酶、NAD依賴性的醯化乙醛脫氫酶、乙酸激酶和磷酸轉乙醯酶；或 v1.丙酮酸脫羧酶、NAD依賴性的醯化乙醛脫氫酶和乙醯輔酶A合成酶； (2)(a) 1, 3-BDO途徑，其中所述生物包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和 (b)編碼可溶性的或膜結合的轉氫酶的內源和/或外源核酸，其中所述轉氫酶以足以將NADH轉化成NADPH的量表達； (3)(a)1, 3-BDO途徑，其中所述生物包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和 (b)內源和/或外源核酸，所述核酸編碼NADP依賴性的磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脫氫酶； （4） （a)1, 3-BDO途徑，其中所述生物包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和 (b) 一種或多種編碼NAD(P)H輔因子酶的內源和/或外源核酸，所述NAD(P)H輔因子酶選自磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、甲酸脫氫酶和醯化乙醯基醛脫氫酶；其中所述一種或多種編碼NAD(P)H輔因子酶的核酸已經被改變，使得由所述核酸編碼的NAD (P) H輔因子酶具有與由未改變的或野生型核酸編碼的NAD (P) H輔因子酶相比更大的對NADPH的親和力；或者 (5)(a) I, 3-BDO途徑，其中所述生物包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和 (b) 一種或多種編碼NAD(P)H輔因子酶的內源和/或外源核酸，所述NAD(P)H輔因子酶選自磷酸化或非磷酸化3-磷酸甘油醛脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、甲酸脫氫酶和醯化乙醯基醛脫氫酶；其中所述一種或多種編碼NAD(P)H輔因子酶的核酸已經被改變，使得它編碼的NAD(P)H輔因子酶具有與由未改變的或野生型核酸編碼的NAD(P)H輔因子酶相比更小的對NADH的親和力。
24.一種非天然存在的真核生物，其包含: (1)I, 3-BDO途徑，其中所述生物包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和 (2)戊糖磷酸途徑，其中所述生物包含至少一種編碼戊糖磷酸途徑酶的內源和/或外源核酸，所述戊糖磷酸途徑酶選自:6_磷酸葡萄糖脫氫酶、6-磷酸葡糖酸內酯酶和6-磷酸葡糖酸脫氫酶(脫羧)。
25.根據權利要求24所述的真核生物，所述真核生物進一步包含增加進入戊糖磷酸途徑的代謝通量的遺傳改變。
26.一種非天然存在的真核生物，其包含: (I)I, 3-BDO途徑，其中所述生物包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和 (2)恩特納-杜德洛夫途徑，其中所述生物包含至少一種編碼恩特納-杜德洛夫途徑酶的內源和/或外源核酸，所述恩特納-杜德洛夫途徑酶選自:6_磷酸葡萄糖脫氫酶、6-磷酸葡糖酸內酯酶、磷酸葡糖酸脫水酶和2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶。
27.根據權利要求26所述的真核生物，所述真核生物進一步包含增加進入恩特納-杜德洛夫途徑的代謝通量的遺傳改變。
28.一種非天然存在的真核生物，其包含: (1)1, 3-BDO途徑，其中所述生物包含至少一種編碼NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述NADPH依賴性的1，3-BD0途徑酶以足以生產1，3-BD0的量表達；和 (2)乙醯輔酶A途徑，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯輔酶A途徑酶的內源和/或外源核酸，所述乙醯輔酶A途徑酶以足以增加所述生物中的NADPH的量表達；其中所述乙醯輔酶A途徑包含: i.NADP依賴性的丙酮酸脫氫酶； ii.丙酮酸甲酸裂合酶和NADP依賴性的甲酸脫氫酶； iii.丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶和NADPH:鐵氧還蛋白氧化還原酶； iv.丙酮酸脫羧酶和NADP依賴性的醯化乙醯基醛脫氫酶； V.丙酮酸脫羧酶、NADP依賴性的醯化乙醛脫氫酶、乙酸激酶和磷酸轉乙醯酶；或者 v1.丙酮酸脫羧酶、NADP依賴性的醯化乙醛脫氫酶和乙醯輔酶A合成酶。
29.根據權利要求28所述的非天然存在的真核生物，所述真核生物進一步包含一種或多種基因破壞，所述一種或多種基因破壞會減弱內源性的NAD依賴性的丙酮酸脫氫酶、NAD依賴性的甲酸脫氫酶、NADH:鐵氧還蛋白氧化還原酶、NAD依賴性的醯化乙醯基醛脫氫酶或NAD依賴性的醯化乙醛脫氫酶的活性。
30.一種非天然存在的包含1，3-BDO途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BDO途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BDO途徑酶以足以生產1，3-BDO的量表達，且: (1)其中所述生物: i.包含在編碼NADH脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞； ii.表達減弱的NADH脫氫酶； iii.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有NADH脫氫酶酶活性； iv.(1.)和(i1.)； V.(1.)和(ii1.)； v1.(i1.)和(ii1.);或者 vi1.(1.)、(i1.)和(ii1.); (2)其中所述生物: i.包含在編碼細胞色素氧化酶的內源和/或外源核酸中的破壞； ii.表達減弱的細胞色素氧化酶； iii.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有細胞色素氧化酶酶活性； iv.(1.)和(i1.)； v.(1.)和(ii1.)； v1.(i1.)和(ii1.);或者
vi1.(1.)、(i1.)和(ii1.); (3)其中所述生物:i.包含在編碼丙酮酸脫羧酶的內源和/或外源核酸中的破壞； i1.表達減弱的丙酮酸脫羧酶； ii1.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有丙酮酸脫羧酶酶活性； iv.與所述真核生物的野生型形式相比，從丙酮酸生產更低水平的乙醇； V.(1.)和(i1.)； v1.(1.)和(ii1.); vi1.(1.)和(iv.)； vii1.(i1.)和(ii1.); ix.(i1.)和(iv.)； x.(ii1.)和(iv.)； x1.(1.)、(i1.)和(ii1.); xi1.(1.)、(ii1.)和(iv.)； xii1.(ii.)、(ii1.)和(iv.);或者 xiv.(1.)、(i1.)、(ii1.)和(iv.)； (4)其中所述生物: i.包含在編碼乙醇脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞； i1.表達減弱的乙醇脫氫酶； ii1.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醇脫氫酶酶活性； iv.與所述真核生物的野生型形式相比，生產更低水平的乙醇； V.(1.)和(i1.)； v1.(1.)和(ii1.); vi1.(1.)和(iv.)； vii1.(i1.)和(ii1.); ix.(i1.)和(iv.)； x.(ii1.)和(iv.)； x1.(1.)、(i1.)和(ii1.); xi1.(1.)、(ii1.)和(iv.)； xii1.(ii.)、(ii1.)和(iv.);或者 xiv.(1.)、(i1.)、(ii1.)和(iv.)； (5)其中所述生物: i.包含在編碼蘋果酸脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞； ii.表達減弱的蘋果酸脫氫酶； ii1.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有蘋果酸脫氫酶酶活性；iv.具有減弱的或阻斷的蘋果酸-天冬氨酸穿梭、蘋果酸-草醯乙酸穿梭和/或蘋果酸-丙酮酸穿梭； V.(1.)和(i1.)； v1.(1.)和(ii1.); vi1.(1.)和(iv.)； vii1.(i1.)和(ii1.); ix.(i1.)和(iv.)； x.(ii1.)和(iv.)； x1.(1.)、(i1.)和(ii1.); xi1.(1.)、(ii1.)和(iv.)； xii1.(ii.)、(ii1.)和(iv.);或者 xiv.(1.)、(i1.)、(ii1.)和(iv.)； (6)其中所述生物:i.包含在編碼乙醯乙醯輔酶A水解酶或轉移酶的內源和/或外源核酸中的破壞； ii.表達減弱的乙醯乙醯輔酶A水解酶或轉移酶； iii.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醯乙醯輔酶A水解酶或轉移酶酶活性； iv.(1.)和(i1.)； V.(1.)和(ii1.)； v1.(i1.)和(ii1.);或者 vi1.(1.)、(i1.)和(ii1.); (J)其中所述生物: i.包含在編碼3-羥基丁醯輔酶A水解酶或轉移酶的內源和/或外源核酸中的破壞； i1.表達減弱的3-羥基丁醯輔酶A水解酶或轉移酶； ii1.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羥基丁醯輔酶A水解酶或轉移酶酶活性。； iv.(1.)和(i1.)； V.(1.)和(ii1.)； v1.(i1.)和(ii1.);或者 vi1.(1.)、(i1.)和(ii1.); (8)其中所述生物: i.包含在編碼乙醛脫氫酶(醯化)的內源和/或外源核酸中的破壞； i1.表達減弱的乙醛脫氫酶(醯化)； ii1.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醛脫氫酶(醯化)酶活性； iv.(1.)和(i1.)； V.(1.)和(ii1.)； v1.(i1.)和(ii1.);或者 vi1.(1.)、(i1.)和(ii1.);(9)其中所述生物:i.包含在編碼3-羥基丁醛脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞； i1.表達減弱的3-羥基丁醛脫氫酶； ii1.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-羥基丁醛脫氫酶酶活性；
iv.(1.)和(i1.)；
V.(1.)和(ii1.)； v1.(i1.)和(ii1.);或者
vi1.(1.)、(i1.)和(ii1.); (10)其中所述生物: i.包含在編碼3-氧代丁醛脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞； i1.表達減弱的3-氧代丁醛脫氫酶； ii1.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有3-氧代丁醛脫氫酶酶活性；
iv.(1.)和(i1.)；
V.(1.)和(ii1.)； v1.(i1.)和(ii1.);或者
vi1.(1.)、(i1.)和(ii1.); (11)其中所述生物: i.包含在編碼1，3-丁二醇脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞； i1.表達減弱的1，3-丁二醇脫氫酶； ii1.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有1，3-丁二醇脫氫酶酶活性。；
iv.(1.)和(i1.)；
V.(1.)和(ii1.)； v1.(i1.)和(ii1.);或者 vi1.(i.)、(i1.)和(ii1.);或者 (12)其中所述生物: i.包含在編碼乙醯乙醯輔酶A硫解酶的內源和/或外源核酸中的破壞； i1.表達減弱的乙醯乙醯輔酶A硫解酶； ii1.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有乙醯乙醯輔酶A硫解酶酶活性；
iv.(1.)和(i1.)；
V.(1.)和(ii1.)； v1.(i1.)和(ii1.);或者
vi1.(1.)、(i1.)和(iii) ο
31.根據權利要求1-6中的任一項所述的生物，其中所述生物進一步包含1，3-BDO途徑，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BDO途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1，3-BDO途徑酶以足以生產1，3-BDO的量表達，和(1)其中所述生物: i.包含在編碼G3P脫氫酶的內源和/或外源核酸中的破壞； ii.表達減弱的G3P脫氫酶； iii.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P脫氫酶酶活性； iv.與所述真核生物的野生型形式相比，生產更低水平的甘油； V.(i.)和(ii.)； vi.(i.)和(iii.); vii.(i.)和(iv.)； viii.(ii.)和(iii.); ix.(ii.)和(iv.)； x.(iii.)和(iv.)； xi.(i.)、(ii.)和(iii.); xii.(i.)、(iii.)和(iv.)； xiii.(ii.)、(iii.)和(iv.);或者 xiv.(i.)、(ii.)、(iii.)和(iv.);或者 (2)其中所述生物: i.包含在編碼G3P磷酸酶的內源和/或外源核酸中的破壞； ii.表達減弱的G3P磷酸酶； iii.與所述真核生物的野生型形式相比，具有更低的或不具有G3P磷酸酶酶活性； iv.與所述真核生物的野生型形式相比，生產更低水平的甘油； V.(i.)和(ii.)； vi.(i.)和(iii.); vii.(i.)和(iv.)； viii.(ii.)和(iii.); ix.(ii.)和(iv.)； x.(iii.)和(iv.)； xi.(i.)、(ii.)和(iii.); xii.(i.)、(iii.)和(iv.)； xiii.(ii.)、(iii.)和(iv.);或者
xiv.(i.)、(ii.)、(iii.)和(iv.)。
32.—種非天然存在的包含1,3-BD0途徑的真核生物，其中所述生物包含至少一種編碼1,3-BD0途徑酶的內源和/或外源核酸，所述1,3-BD0途徑酶以足以生產1,3-BD0的量表達；且其中所述生物進一步包含編碼1,3-BD0轉運蛋白的內源和/或外源核酸，其中所述編碼1,3-BD0轉運蛋白的核酸以足以從所述真核生物輸出1,3-BD0的量表達。
33.根據權利要求24-32中的任一項所述的生物，其中所述1,3-BD0途徑酶選自:4B、4C、4D、4E、4F、4G、4H、4i、4J、4L、4N和 40。
34.根據權利要求23-33中的任一項所述的生物，其中所述1,3-BD0途徑包含選自以下的途徑:
i.4A、4E、4F 和 4G ；i1.4A、4B 和 4D ；ii1.4A、4E、4C和 4D ；iv.4A、4H 和 4J ；v.4A、4H、4I和 4G ；v1.4A、4H、4M、4N和 4G ；vi1.4A、4K、40、4N和 4G ；vii1.4A、4K、4L、4F和 4Gix.7E、7F、4E、4F 和 4G ；x.7E、7F、4B和 4D ；x1.7E、7F、4E、4C和 4D ；xi1.7E、7F、4H和 4J ；xii1.7E、7F、4H、4I和 4G ；xiv.7E、7F、4H、4M、4N和 4G ；xv.7E、7F、4K、40、4N 和 4G ;和xv1.7E、7F、4K、4L、4F和 4G。
35.根據權利要求34所述的生物，其中所述生物包含選自以下的乙醯輔酶A途徑:.1.2A、2B 和 2D ；i1.2A、2C 和 2D ；ii1.2A、2B、2E和 2F ；iv.2A、2C、2E和 2F ；V.2A、2B、2E、2K 和 2L ；v1.2A、2C、2E、2K和 2L ；vi1.5A 和 5B ；vii1.5A、5C 和 5D ；ix.5E、5F、5C 和 5D ；x.5G 和 5D ；x1.6A、6D 和 6C ；xi1.6B、6E和 6C ；xii1.1OAUOB 和 IOC ；xiv.1ON、10H、10B 和 IOC ；xv.1ON、10L、10M、10B 和 IOC ；xv1.10A、10B、10G和 IOD ；xvi1.1ON、10H、10B、10G 和 10D ；xvii1.10N、10L、10M、10B、10G 和 10D ；xix.10A、10B、10J、10K 和 10D ；xx.10N、10H、10B、10J、10K 和 10D ；xx1.10N、10L、10M、10B、10J、10K 和 10D ； xxi1.10AU0F 和 10D ； xxii1.10N、10H、10F 和 10D ;和xxiv.1ON、10L、10M、10F 和 10D。
36.根據權利要求22-35中的任一項所述的生物，其中所述內源和/或外源核酸是內源核酸。
37.根據權利要求22-35中的任一項所述的生物，其中所述內源和/或外源核酸是外源核酸。
38.一種非天然存在的真核生物，其包含: (1)乙醯乙酸途徑，其中所述生物包含至少一種編碼乙醯乙酸途徑酶的外源核酸，所述乙醯乙酸途徑酶以足以增加所述生物的細胞溶質中的乙醯乙酸的量表達，其中所述乙醯乙酸途徑包含:8A、8C和8F，其中8A是線粒體乙醯乙醯輔酶A硫解酶；8C是線粒體乙醯乙醯輔酶A水解酶、轉移酶或合成酶；且8F是乙醯乙酸轉運蛋白；和 (2)1, 3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以在所述生物的細胞溶質中生產1，3-BD0的量表達，且其中所述1，3-BD0途徑包含選自以下的途徑:
i.40、4N 和 4G ;和
i1.4L、4F 和 4G ； 其中4F是3-氧代丁醛還原酶(酮還原)；4G是3-羥基丁醛還原酶；4L是乙醯乙酸還原酶；4N是3-羥基丁酸還原酶；且40是3-羥基丁酸脫氫酶。
39.一種非天然存在的真核生物，其包含: (1)3-羥基丁酸途徑，其中所述生物包含至少一種編碼3-羥基丁酸途徑酶的外源核酸，所述3-羥基丁酸途徑酶以足以增加所述生物的細胞溶質中的3-羥基丁酸的量表達，其中所述3-羥基丁酸途徑包含選自以下的途徑:
i.8A、8B、8D和 8G ；
i1.8A、8C、8E和 8G ；
ii1.8J、8K、8D 和 8G ;和
iv.8J、8K、8E和 8G ； 其中8A是線粒體乙醯乙醯輔酶A硫解酶；8B是線粒體乙醯乙醯輔酶A還原酶；8C是線粒體乙醯乙醯輔酶A水解酶、轉移酶或合成酶；8D是線粒體3-羥基丁醯輔酶A水解酶、轉移酶或合成酶；8E是線粒體3-羥基丁酸脫氫酶；且SG是3-羥基丁酸轉運蛋白；8J是線粒體乙醯輔酶A羧化酶；8K是線粒體乙醯乙醯輔酶A合酶；和 (2)1, 3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以在所述生物的細胞溶質中生產1，3-BD0的量表達，且其中所述1,3-BD0途徑包含4N和4G，其中4G是3-羥基丁醛還原酶；且4N是3-羥基丁酸還原酶。
40.一種非天然存在的真核生物，其包含: (1) 3-羥基丁醯輔酶A途徑，其中所述生物包含至少一種編碼3-羥基丁醯輔酶A途徑酶的外源核酸，所述3-羥基丁醯輔酶A途徑酶以足以增加所述生物的細胞溶質中的3-羥基丁醯輔酶A的量表達，其中所述3-羥基丁醯輔酶A途徑包含選自以下的途徑: i.8A、8B、8D、8G和 8H ；
i1.8A、8C、8E、8G 和 8H ；
ii1.8J、8K、8B、8D、8G、8H;和iv.8J、8K、8C、8E、8G、8H ； 其中8A是線粒體乙醯乙醯輔酶A硫解酶；8B是線粒體乙醯乙醯輔酶A還原酶；8C是線粒體乙醯乙醯輔酶A水解酶、轉移酶或合成酶；8D是線粒體3-羥基丁醯輔酶A水解酶、轉移酶或合成酶；8E是線粒體3-羥基丁酸脫氫酶；8G是3-羥基丁酸轉運蛋白；且8H是3-羥基丁醯輔酶A轉移酶或合成酶；8J是線粒體乙醯輔酶A羧化酶；8K是線粒體乙醯乙醯輔酶A合酶；和 (2)1, 3-BD0途徑，其中所述生物包含至少一種編碼1，3-BD0途徑酶的外源核酸，所述1，3-BD0途徑酶以足以在所述生物的細胞溶質中生產1，3-BD0的量表達，且其中所述.1，3-BD0途徑包含選自以下的途徑: . 1.41 和 4G ;和
i1.4J； 其中41是3-羥基丁醯輔酶A還原酶(醛形成)；其中4G是3-羥基丁醛還原酶；且4J是3-羥基丁醯輔酶A還原酶(醇形成)。
41.根據權利要求40所述的生物，其中 .i.(I)所述3-羥基丁醯輔酶A途徑包含:8A、8B、8D、8G和8H，且(2)所述1，3-BDO途徑包含:41和4G ； ii.(I)所述3-羥基丁醯輔酶A途徑包含:8A、8C、8E、8G和8H，且(2)所述I, 3-BDO途徑包含:41和4G ； iii.(1)所述3-羥基丁醯輔酶A途徑包含:8J、8K、8B、8D、8G和8H，且(2)所述1，3-BDO途徑包含:41和4G ; iv.(1) 3-羥基丁醯輔酶A途徑包含:8J、8K、8C、8E、8G和8H，且(2)所述l，3_BDO途徑包含:41和4G ； V.(1)所述3-羥基丁醯輔酶A途徑包含:8A、8B、8D、8G和8H，且(2)所述1，3-BDO途徑包含:4J ； v1.(1)所述3-羥基丁醯輔酶A途徑包含:8A、8C、8E、8G和8H，且(2)所述I, 3-BDO途徑包含:4J ； vi1.(1)所述3-羥基丁醯輔酶A途徑包含:8J、8K、8B、8D、8G和8H，且(2)所述1，3-BDO途徑包含:4J ;或者 vii1.⑴3-羥基丁醯輔酶A途徑包含:8J、8K、8C、8E、8G和8H，且(2)所述l，3_BDO途徑包含:4J。
42.根據權利要求22-41中的任一項所述的生物；其中所述生物是在基本上厭氧的培養基中。
43.—種用於生產1，3-BDO的方法,所述方法包括:在一定條件下培養根據權利要求7-17或21-42中的任一項所述的生物足夠的時間段以生產1，3-BDO。
44.根據權利要求43所述的方法，其中所述生物是Crabtree陽性的生物，且其中真核生物是在包含過量的葡萄糖的培養基中。
45.一種用於選擇要引入非天然存在的真核生物中的外源性1，3-BDO途徑酶的方法，其中所述外源性1，3-BDO途徑酶在所述生物中以足以生產1，3-BDO的量表達，所述方法包括下述步驟:(i)測量至少一種1，3-BDO途徑酶的活性，所述至少一種1，3-BD0途徑酶使用NADH作為輔因子； (ii)測量至少一種1，3-BD0途徑酶的活性，所述至少一種1，3-BD0途徑酶使用NADPH作為輔因子；和 (iii)向所述生物中引入至少一種1，3-BD0途徑酶，所述至少一種1，3_BD0途徑酶對NADH作為輔因 子的偏好大於NADPH，如在步驟⑴和(ii)中所確定的。
【文檔編號】C12P1/00GK103917651SQ201280054855
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年9月7日 優先權日:2011年9月8日
【發明者】A·P·博加德, M·J·伯克, 羅賓·E·奧斯特豪特, 普裡蒂·法克雅, 李靜怡 申請人:基因組股份公司