基因大片段、單拷貝缺失檢測晶片及其應用的製作方法
2023-05-20 02:44:46 1
專利名稱：基因大片段、單拷貝缺失檢測晶片及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測晶片及其應用，更具體地說涉及一種基因大片段、單拷貝缺失檢測晶片及其應用。
背景技術：
遺傳學、分子生物學理論和技術的發展給醫學帶來的直接成果之一是疾病的基因診斷、特別是遺傳性疾病的基因診斷成為可能。
90年代之前，由於受到分析技術和分析目標的限制，大多數實驗室在開展醫學遺傳學分析時主要圍繞細胞遺傳學和分子細胞遺傳學技術，觀察染色體異常與疾病發生的關係。光鏡下可見的染色體改變可能是Mb大小、涉及一個或多個基因的DNA片段。而對於單基因遺傳病，DNA的微小改變即可能導致基因功能的喪失，從而引起疾病的發生，因此染色體水平的遺傳學分析極大地限制了遺傳性疾病的基因診斷。進入90年代，隨著人類基因組計劃的開展和不斷取得進展，愈來愈多的疾病相關基因得到分離；與此同時多種敏感性較高的基因突變分析技術的出現和完善，使遺傳性疾病發病相關基因的突變分析和基因診斷逐步得到推廣。人類絕大多數遺傳性疾病發病相關基因一般沒有突變熱點，即病理性突變可以出現在基因的各個位點；發病相關基因的全基因篩查是準確作出基因診斷的基礎。目前實驗室常用的突變基因分析技術包括分子雜交技術、變性梯度凝膠電泳技術(DGGE)、單鏈構象多態性技術(SSCP)、變性高效液相色譜技術(DHPLC)、實時定量PCR技術、DNA序列分析技術等。這些技術具有足夠的敏感性，可以檢出絕大多數單個鹼基的改變。然而這些技術單次實驗可分析的DNA片段較短，在檢測未知突變時，須對某一病例的一個或多個疾病相關基因的每個外顯子進行突變篩查，分片段完成整個基因的分析。這樣需要的時間較長，工作量很大。臨床常規開展基因診斷，迫切需要分析效率較高、樣本通量較大、敏感性較強的突變基因分析技術。
近年興起的建立在分子雜交原理上的基因晶片技術是自90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一，是融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉的新技術，具有重大的基礎研究價值。同時，這項技術可開發多種商業化的晶片應用於基礎研究和臨床診斷，具有明顯的產業化前景。基因晶片技術作為一種高度平行、大規模、快速的生物信息檢測方案，將大量的探針通過點樣或原位合成固定到基底材料上，通過分子標記和分子雜交實現高通量的樣本檢測。根據點於晶片上的核酸序列來源，基因晶片有寡核苷酸晶片、cDNA晶片和Genomic晶片之分，包括二種模式一是將靶DNA固定於支持物上，適合於大量不同靶DNA的分析；二是將大量探針分子固定於支持物上，適合於對同一靶DNA進行不同探針序列的分析。目前已開發的基因晶片產品可實現基因表達分析、基因微小突變分析、SNP(單核苷酸多態性)位點分析、基因某些特定變異(如甲基化)的分析，這些晶片的開發和推廣已在生物醫學研究和應用中發揮重要作用。
然而基因突變的複雜性給基因診斷技術提出了新的要求。最新研究表明，介於遺傳性染色體異常和基因微小突變之間還普遍存在另一類的基因結構異常，即DNA的大片段缺失(Deletion)和複製(Duplication)。這類DNA大片段結構變異(突變)約佔基因突變的1/3，且在細胞內多表現為單拷貝的異常(顯性遺傳病的患病個體；隱性遺傳病的突變基因攜帶者)。完整的突變基因分析系統應包含可有效檢出各類突變的分析技術，但目前實驗室常用的基因診斷技術難以檢出這類突變。目前困擾基因診斷工作的問題之一是某些遺傳性疾病發病相關基因突變的檢出率不高，其原因可能主要有兩個方面①完成診斷需要做到的全基因篩查與現有分析技術的樣本通量之間的矛盾；②採用的分析技術是否可以涵蓋對各種類型的基因突變分析。為此我們已發展了定量多重PCR技術，這一技術可以有效檢出基因組DNA大片段結構變異，但限於它的樣本通量，大樣本的分析難以在短期內完成。根據我們在發展和完善定量多重PCR技術中得到的啟發，結合晶片技術，在設計和檢測中引入統計量的概念，研製基因組DNA大片段結構變異檢測晶片，用於篩查疾病相關基因的大片段變異(缺失或複製)。
新的基因突變檢測類晶片產品的開發和使用將填補目前基因晶片研究中的一個空白，可在遺傳性疾病的基因診斷(包括產前診斷)，遺傳相關性疾病的防治，腫瘤早期診斷，突變基因攜帶者和高危發病個體篩查等工作中發揮重要作用，產生良好的社會和經濟效益。
發明內容
本發明解決現有技術中受技術方法或樣本通量限制而難以臨床常規開展遺傳性疾病的基因大片段缺失檢測的不足和相關基因檢出率不高的缺點，提供一種樣本能量高、基因檢出率高的基因大片段、單拷貝缺失檢測晶片及其檢測方法。
本發明的技術方案是一種基因大片段、單拷貝缺失檢測晶片，其特徵在於
1)對於僅有單個候選基因的遺傳性疾病，選取不少於3個的檢測基因，其中一個為致病基因，其餘為參照基因，以基因外顯子為單位，根據基因的基因組DNA結構，選擇外顯子中具有相近Tm值長度為30～50個鹼基的序列併合成探針；2)對於具有多個候選基因遺傳性疾病，選取不少於3個的疾病相關基因作為檢測基因，以基因外顯子為單位，互為參照，根據基因的基因組DNA結構，選擇外顯子中具有相近Tm值長度為30～50個鹼基的序列併合成探針。所述的參照基因為基因組內結構序列保守的基因，所述的探針其分布是在玻片上以外顯子順序依次分布，並且各探針重複不少於5次。
一種利用上述檢測晶片用於基因遺傳性大片段缺失的檢測方法，其特徵在於步驟如下1)核酸樣品的製備提取可疑患者外周靜脈血DNA，酸化處理，裂解DNA分子至500-1000鹼基，稀釋至100ng/ul(待檢樣本)，隨機引物法低度循環擴增待檢樣本，在擴增過程中加入螢光物質，完成樣本DNA的標記；2)雜交螢光標記的樣本DNA 95℃變性處理，特定溫度下，4×SSC+1％BSA預雜交，雜交，室溫下，2×SSC+0.1％SDS、0.1×SSC+0.1％SDS避光漂洗，雙蒸水洗淨吹乾；3)雜交信號檢測螢光掃描儀掃描檢測；4)雜交信號的分析及結果判定首先以已知具有基因DNA大片段結構變異的不同陽性樣本為先例，以穩定檢出單拷貝變異作為標準，編寫軟體，建立探針點樣及晶片雜交後各點信號之間參數的計算模式，以此計算模式進行未知樣品分析。
所述的低度擴增為低度8～10個循環擴增。
上述晶片的製備方法，包括如下步驟1)載玻片的修飾；2)針設計、合成及修飾；3)探針的固定。
影響製備獲得的DNA大片段缺失檢測晶片性能的主要因素1)晶片載體—玻片的處理玻片表面化學修飾狀況直接關係到點布的探針能否通過分子手臂有效的結合於玻片表面，使各點的探針結合量穩定。
2)探針設計根據檢測目的基因各外顯子序列，通過選擇探針中(A+T)/(G+C)值，調整探針長度，使各探針雜交條件相近，以保證後續晶片雜交信號的穩定。
3)晶片上參照基因探針選擇基因選擇單拷貝的保守基因；探針序列設計使其雜交條件與檢測目的基因探針相近。
4)晶片上各探針的分布和重複次數根據各探針的雜交穩定性確定各探針的重複次數，使該探針點的雜交信號強度綜合處理後樣本拷貝數成正相關。
利用DNA大片段缺失檢測晶片對待檢樣品進行分析的條件可在以下方面進行優化1)裂解待檢DNA樣本PH值(4.0-4.5)及其處理時間的調整，保證裂解後的DNA片段大小在500-1000鹼基。
2)DNA樣本的低度擴增，通過調整DNA濃度、寡核苷酸引物量及DNA合成的循環次數，在保證DNA樣本中各基因片段拷貝數原有比值不變的前提下，各基因片段拷貝數的增加可以使晶片的雜交獲得明確的信號。
3)晶片雜交溫度，雜交後漂洗緩衝液的離子強度及漂洗時間，儘可能的去除雜交背景信號，保證雜交信號的清晰，使各探針雜交信號綜合處理後，其強度與以形成雜交的探針數成正相關。
本發明的有益效果是現有的基因晶片產品多應用於基因點突變，SNP(單核苷酸多態性)位點分析，若干鹼基缺失和基因的表達分析等。我們結合醫學遺傳學、腫瘤發病相關基因突變研究的最新進展，研製了一種普遍存在的基因突變(DNA大片段結構異常)類型的檢測晶片，填補目前基因晶片研究中的一個空白，可在遺傳性疾病的基因診斷(包括產前診斷)，遺傳相關性疾病的防治，腫瘤早期診斷，突變基因攜帶者和高危發病個體篩查等工作中發揮重要作用，產生良好的社會和經濟效益。
1)基因分析中檢測序列的「有」和「無」一般容易鑑別，難以鑑別的是DNA大片段結構異常時等位基因拷貝數的變化，特別是等位基因的單個拷貝缺失或單個拷貝複製。為解決這一問題，我們採用①以外顯子為單位設計探針，同時以外顯子為單位分析基因結構變異；②以不少於3個基因的所有外顯子同時分析，並設立參照，完成基因或其部分結構拷貝數的定量分析；③晶片檢測中引入統計量的概念，以穩定基因或基因片段拷貝數的定量分析。
2)檢出發病相關基因的遺傳性突變是基因診斷和遺傳諮詢的關鍵，而DNA大片段結構變異約佔基因突變的1/3。隨著功能基因組研究的深入，愈來愈多的疾病相關基因將得到分離，分子醫學和基因診斷在臨床上的作用也愈見重要，因此DNA大片段結構變異檢測晶片極具臨床應用前景。已經知道，除男性性染色體上的基因外，人類體細胞中的基因都呈雙拷貝。對於顯性遺傳性疾病(包括遺傳性腫瘤)，遺傳獲得的發病相關基因的異常為單拷貝的基因突變；而對於常染色體隱性遺傳性疾病，除概率較小的純合型發病個體外，人群中更多的是單拷貝的突變基因隱性攜帶者。DNA大片段結構變異時基因單拷貝異常的分析，可檢出突變基因攜帶者、高危發病個體、明確診斷患病個體。
3)這種新的基因突變檢測類晶片產品的開發和使用將在遺傳性疾病的產前、病前診斷，遺傳相關性疾病的防治，腫瘤早期診斷，突變基因攜帶者和高危發病個體篩查等工作中發揮重要作用。
具體實施例方式
實施例1遺傳性非息肉性大腸癌(HNPCC)發病相關基因大片段缺失檢測晶片的製備1)玻片的清洗及表面化學修飾選擇合適尺寸的玻片，1∶1的甲醇鹽酸溶液清洗，蒸餾水洗淨，濃硫酸浸泡，95％的乙醇充分衝洗，空氣乾燥。95％的乙醇和矽烷按49∶1的比例配置成矽烷化試劑，玻片置於其中浸泡，雙蒸水洗淨，立置玻片，自上向下吹乾，110℃烘烤。95％的乙醇或異丙醇浸泡，雙蒸水洗淨吹乾，Ph7.0、0.01M的PBS溶液配置5％的戊二醛溶液，玻片置於其中浸泡，0.01M的PBS溶液清洗，蒸餾水洗淨，吹乾。掃描儀掃描，選擇螢光背景較弱的玻片用於下一步實驗。
2)探針的合成序列選自MLH1、MSH2、MSH6基因的45個外顯子，探針長度30-50個鹼基，具有相近的Tm植，氨基化修飾3』末端。
3)探針的固定和分布碳酸鹽緩衝液稀釋探針，霧化條件下，點於預處理的玻片上。玻片置於封閉環境中，室溫放置一小時後轉至潮溼小室中37℃水浴兩小時。0.1％SDS水溶液浸洗，雙蒸水洗淨吹乾。玻片置於硼氫化鈉還原液中浸泡，將表面的醛基還原為羥基。每張晶片上各探針的點樣量不少於5，重複次數以滿足統計量的要求為準。
實施例2遺傳性非息肉性大腸癌(HNPCC)發病相關基因遺傳性大片段缺失分析與檢測1)核酸樣品的製備提取可疑患者外周靜脈血DNA，酸化處理，裂解DNA分子至500-1000鹼基，稀釋至100ng/ul(待檢樣本)。隨機引物法低度8個循環擴增待檢樣本，在擴增過程中參入螢光物質，完成樣本DNA的標記。
2)雜交螢光標記的樣本DNA 95℃變性處理，特定溫度下，4×SSC+1％BSA預雜交，雜交。室溫下，2×SSC+0.1％SDS、0.1×SSC+0.1％SDS避光漂洗，雙蒸水洗淨吹乾。
3)雜交信號檢測螢光掃描儀掃描檢測。
4)雜交信號的分析及結果判定首先以已知具有基因DNA大片段結構變異的不同陽性樣本為先例，以穩定檢出單拷貝變異作為標準，編寫軟體，建立探針點樣及晶片雜交後的計算模式，以此計算模式進行未知樣品分析。
實施例3假肥大型肌營養不良症發病相關基因大片段缺失檢測晶片的製備探針的合成序列選自DMD致病基因的79個外顯子、參照基因β-actin基因的3個外顯子及參照基因GAPDP基因的3個外顯子，探針長度30-50個鹼基，具有相近的Tm植，氨基化修飾3』末端。其餘方法步驟同實施例1。
實施例4假肥大型肌營養不良症發病相關基因大片段缺失分析與檢測1)核酸樣品的製備提取可疑患者外周靜脈血DNA，酸化處理，裂解DNA分子至500-1000鹼基，稀釋至100ng/ul(待檢樣本)。隨機引物法低度9個循環擴增待檢樣本，在擴增過程中參入螢光物質，完成樣本DNA的標記。
其餘方法步驟同實施例2。
實施例5苯丙酮尿症相關基因大片段缺失檢測晶片的製備探針的合成序列選自PAH基因的13個外顯子、參照基因β-actin基因的3個外顯子及參照基因GAPDP基因的3個外顯子，探針長度30-50個鹼基，具有相近的Tm植，氨基化修飾3』末端。
其餘方法步驟同實施例1。
實施例6苯丙酮尿症相關基因大片段缺失分析與檢測1)核酸樣品的製備提取可疑患者外周靜脈血DNA，酸化處理，裂解DNA分子至500-1000鹼基，稀釋至100ng/ul(待檢樣本)。隨機引物法低度10個循環擴增待檢樣本，在擴增過程中參入螢光物質，完成樣本DNA的標記。
其餘方法步驟同實施例2。
權利要求
1.一種基因大片段、單拷貝缺失檢測晶片，其特徵在於1)對於僅有單個候選基因的遺傳性疾病，選取不少於3個的檢測基因，其中一個為致病基因，其餘為參照基因，以基因外顯子為單位，根據基因的基因組DNA結構，選擇外顯子中具有相近Tm值長度為30～50個鹼基的序列併合成探針；2)對於具有多個候選基因遺傳性疾病，選取不少於3個的疾病相關基因作為檢測基因，以基因外顯子為單位，互為參照，根據基因的基因組DNA結構，選擇外顯子中具有相近Tm值長度為30～50個鹼基的序列併合成探針。
2.根據權利要求1所述的基因大片段、單拷貝缺失檢測晶片，其特徵在於所述的參照基因為基因組內結構序列保守基因。
3.根據權利要求1所述的基因大片段、單拷貝缺失檢測晶片，其特徵在於所述的探針其分布是在玻片上以外顯子順序依次分布，並且各探針重複不少於5次。
4.一種利用上述檢測晶片用於基因遺傳性大片段缺失的檢測方法，其特徵在於步驟如下1)核酸樣品的製備提取可疑患者外周靜脈血DNA，酸化處理，裂解DNA分子至500-1000鹼基，稀釋至100ng/ul(待檢樣本)，隨機引物法低度循環擴增待檢樣本，在擴增過程中加入螢光物質，完成樣本DNA的標記；2)雜交螢光標記的樣本DNA 95℃變性處理，特定溫度下，4×SSC+1％BSA預雜交，雜交，室溫下，2×SSC+0.1％SDS、0.1×SSC+0.1％SDS避光漂洗，雙蒸水洗淨吹乾；3)雜交信號檢測螢光掃描儀掃描檢測；4)雜交信號的分析及結果判定首先以已知具有基因DNA大片段結構變異的不同陽性樣本為先例，以穩定檢出單拷貝變異作為標準，編寫軟體，建立探針點樣及晶片雜交後各點信號之間參數的計算模式，以此計算模式進行未知樣品分析。
5.根據權利要求4所述的基因遺傳性大片段缺失的檢測方法，其特徵在於所述的低度擴增為低度8～10個循環擴增。
全文摘要
本發明公開了一種基因大片段、單拷貝缺失檢測晶片及其應用，解決了現有技術中受技術方法或樣本通量限制而難以臨床常規開展遺傳性疾病的基因大片段缺失檢測的不足和相關基因檢出率不高的缺點，提供一種樣本能量高、基因撿出率高的基因大片段、單拷貝缺失檢測晶片和檢測方法，其特徵在於選取檢測基因，以基因外顯子為單位，根據基因的基因組DNA結構，選擇外顯子中具有相近Tm值長度為30～50個鹼基的序列併合成探針；探針點樣固定於玻片，探針的分布符合統計量的要求；待檢DNA樣本酸化處理，製備成一定大小的DNA片段；待檢DNA樣本內加引物低度擴增，並標記螢光；待檢DNA樣本與晶片雜交，專用軟體分析各雜交探針點螢光信號，確定待檢DNA的目標基因是否存在大片段缺失。
文檔編號C12Q1/68GK1483837SQ0313174
公開日2004年3月24日 申請日期2003年7月25日 優先權日2003年7月25日
發明者王亞平, 張曉梅, 李金田, 吳曉柳, 朱明 , 張元穎 申請人:江蘇省腫瘤醫院