與南瓜葉黃素含量主效QTL緊密連鎖的SNP分子標記及其應用的製作方法
2023-05-20 12:41:31 1
本發明屬於分子檢測技術及育種領域，特別涉及一種與南瓜葉黃素含量主效qtl緊密連鎖的snp分子標記及其應用。
背景技術：
葉黃素是一種廣泛存在於蔬菜、花卉、水果等植物中的天然物質，天然的葉黃素是一種優良的抗氧化劑，能抵禦游離基在人體內造成的細胞與器官損傷，從而達到預防機體衰老引發的心血管硬化、冠心病等，同時還可預防老年性眼球視網膜黃斑退化引起的勢力下降和失明。
南瓜中含有豐富的類胡蘿蔔素，其中葉黃素的含量尤為豐富，每100g鮮品中含葉黃素0-17mg。隨著科學研究的深入，社會的需求，人們越來越重視食品的營養保健作用，因此，選育高葉黃素南瓜是未來南瓜品質育種的重要目標之一。傳統育種方式選育高葉黃素品種雖然可行，但耗時耗力，不利於我國的南瓜育種事業。隨著高通量測序技術的成熟，特別是大量的snp(單鹼基擴增多態性)標記的開發，應用高密度遺傳圖譜的方法開展植物性狀基因定位成為挖掘植物基因的熱點之一。特別是南瓜的全基因組測序尚未完成，利用高通量測序技術開發大量的snp標記，開發性狀連鎖的分子標記進行品種的初期篩選，達到分子輔助育種的目的，可大大縮短育種的周期提高育種效率。因此，進行南瓜葉黃素含量的基因定位，篩選緊密連鎖的分子標記，建立早期輔助選擇技術體系，對葉黃素含量的遺傳改良具有重要意義。
技術實現要素：
本發明的目的在於與南瓜葉黃素含量主效qtl緊密連鎖的snp分子標記及其在育種方面的應用。
本發明所採取的技術方案是：
與南瓜葉黃素含量主效qtl位點緊密連鎖的snp分子標記，為分子標記6564或分子標記24019，其特徵在於，所述分子標記定位於中國南瓜11號連鎖群上，分別位於葉黃素基因兩側；其中，分子標記6564包含seqidno.1所示的核苷酸序列或其同源snp序列；分子標記24019包含seqidno.2所示的核苷酸序列或其同源snp序列。
進一步的，seqidno.1所示序列自5』端起第114位鹼基是snp位點，其鹼基為t或c。
進一步的，seqidno.2所示序列自5』端起第24位鹼基是snp位點，其鹼基為t或a。
可識別或擴增權利要求上述snp分子標記的分子探針或引物對。
進一步的，引物對為dcaps引物對。
進一步的，用於檢測分子標記6564的dcaps引物對的核苷酸序列如下所示：
f1：5』-tcattttgagcaccctggaa-3』(seqidno.3)，
r1：5』-ggtttagatggtccagatatccg-3』(seqidno.4)，
其對應的限制性核酸內切酶為hpy188i。
進一步的，用於檢測分子標記24019的dcaps引物對的核苷酸序列如下所示：
f1：5』-tcattctgctttagctttggata-3』(seqidno.5)，
r1：5』-gtcattgaatgcattggtaggag-3』(seqidno.6)，
其對應的限制性核酸內切酶為ecorv。
識別或檢測上述snp分子標記的分子探針或引物對在選育高葉黃素含量輔助育種中的應用。
一種用於南瓜葉黃素含量輔助育種的試劑盒，其包括識別或擴增上述snp分子標記的分子探針或引物對。
一種南瓜輔助育種的方法，包括提取南瓜基因組dna，檢測上述snp分子標記的類型，根據snp類型確定南瓜品種葉黃素含量高低。
本發明的有益效果是：
本發明對南瓜葉黃素含量的數量性狀位點進行了qtl定位，並篩選得到了與南瓜葉黃素含量qtl緊密連鎖的分子標記6564和分子標記24019，兩標記間的遺傳距離為0.553cm，定位的qtl位點對該數量性狀存在顯著關聯關係(p<0.05)，且貢獻率較高，分子標記6564的解釋概率為15.2％，分子標記24019的解釋概率為15.6％。通過這兩個分子標記可以預測南瓜葉黃素含量的高低，為實現南瓜葉黃素含量性狀的早期鑑定和篩選提供分子輔助選擇技術支持，同時大大縮短了傳統基因定位的時間。
附圖說明
圖1為高葉黃素含量的母本(p1)，果肉顏色為黃色，和低葉黃素含量的父本(p2)，果肉顏色為橙色；
圖2為南瓜葉黃素基因在高密度遺傳連鎖圖譜的初步定位結果圖：橫坐標表示連鎖群的位置，縱坐標表示lod值；紅線表示所有的lod值擬合後的結果；虛線標記的閾值是代表p<0.05的關聯閾值，表示關聯性顯著；
圖3為南瓜葉黃素基因所在的11號連鎖群的緊密連鎖區間，左邊為連鎖群的遺傳距離(cm),右邊為標記的編號，lutein為葉黃素基因所在位點；
圖4為分子標記6564的pcr擴增後酶切結果：p1、p2分別為高葉黃素含量母本和低葉黃素含量父本的酶切帶型，其中p1酶切完全，僅有一條114bp片段，p2不能被酶切，片段長度為137bp；f1部分酶切，存在114bp和137bp的片段，f2群體的隨機單株中存在p1，p2和f1的三種類型；
圖5為分子標記24019的pcr擴增後酶切結果：p1、p2分別為高葉黃素含量母本和低葉黃素含量父本的酶切帶型，其中p1酶切完全，僅有一條183bp片段，p2不能被酶切，片段長度為206bp；f1部分酶切，存在183bp和206bp的片段，f2群體的隨機單株中存在p1，p2和f1的三種類型。
具體實施方式
與南瓜葉黃素含量主效qtl位點緊密連鎖的snp分子標記，為分子標記6564或分子標記24019，其特徵在於，所述分子標記定位於中國南瓜11號連鎖群上，分別位於葉黃素基因兩側；其中，分子標記6564包含seqidno.1所示的核苷酸序列或其同源snp序列；分子標記24019包含seqidno.2所示的核苷酸序列或其同源snp序列。
進一步的，seqidno.1所示序列自5』端起第114位鹼基是snp位點，其鹼基為t或c。當該snp位點在兩個等位基因中只要有一個鹼基為t時，與分子標記6564緊密連鎖的南瓜葉黃素基因在果實中鑑定為高葉黃素含量，當該snp位點在兩個等位基因中的鹼基均為c時，則果實為低葉黃素含量南瓜。
進一步的，seqidno.2所示序列自5』端起第24位鹼基是snp位點，其鹼基為t或a。當該snp位點在兩個等位基因中只要有一個鹼基為t時，與分子標記24019緊密連鎖的南瓜葉黃素基因在果實中鑑定為高葉黃素，當該snp位點在兩個等位基因中的鹼基均為a時，則果實為低葉黃素南瓜。
可識別或擴增權利要求上述snp分子標記的分子探針或引物對。
進一步的，引物對為dcaps引物對。
進一步的，用於檢測分子標記6564的dcaps引物對的核苷酸序列如下所示：
f1：5』-tcattttgagcaccctggaa-3』(seqidno.3)，
r1：5』-ggtttagatggtccagatatccg-3』(seqidno.4)，
其對應的限制性核酸內切酶為hpy188i。
進一步的，用於檢測分子標記24019的dcaps引物對的核苷酸序列如下所示：
f1：5』-tcattctgctttagctttggata-3』(seqidno.5)，
r1：5』-gtcattgaatgcattggtaggag-3』(seqidno.6)，
其對應的限制性核酸內切酶為ecorv。
識別或檢測上述snp分子標記的分子探針或引物對在選育高葉黃素含量輔助育種中的應用。
一種用於南瓜葉黃素含量輔助育種的試劑盒，其包括識別或擴增上述snp分子標記的分子探針或引物對。
一種南瓜輔助育種的方法，包括提取南瓜基因組dna，檢測上述snp分子標記的類型，根據snp類型確定南瓜品種葉黃素含量高低。
下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。
以下實施例中所採用的分子生物學實驗技術包括dna提取、pcr擴增、page凝膠電泳、酶切、轉化等實驗，如無特殊說明，通常按照常規方法操作，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(sambrookj,russelldw，janssenk,argentinej.黃培堂等譯，2002，北京：科學出版社)，或按照製造廠商所建議的條件。
一、遺傳群體的構建及遺傳分析
1、供試材料植物材料：高葉黃素含量材料是從泰國引進分離獲得的高代自交系，命名為cmo-e(p1)，而低葉黃素含量材料是廣東本地獲得的高代自交系，命名為cmo-x(p2)。圖1為p1和p2的果肉照片，高葉黃素含量的母本(p1)，果肉顏色為黃色；而低葉黃素含量的父本(p2)，果肉顏色為橙色。cmo-e和cmo-x雜交獲得f1，f1自交得f2，用作遺傳分析和定位群體。
2、供試材料果實葉黃素含量的確定和遺傳規律分析
將200株f2群體單株果實以及父母本粉粹，冷凍乾燥後研磨，稱取各樣品粉末20mg，以丙酮(hplc級，bcr)作為提取液，用冷凍離心機(5417r，eppendorf)在12000r·min-1、4℃下離心15min，獲得類胡蘿蔔素提取液，採用高效液相色譜(hplc)測定果實葉黃素含量，結果如表1所示。
表1p1、p2、f1及30個f2群體單株果實的葉黃素含量
用excel2016處理數據，檢測是否服從正態分布。
二、南瓜遺傳圖譜構建和葉黃素含量高低的初步定位
1、南瓜基因組dna的提取
使用ctab法提取南瓜親本及200株f2群體基因組dna，提取的單株dna用於文庫構建；
2、遺傳圖譜構建
本研究前期委託深圳恆創生物科技有限公司利用ddrad技術進行高通量測序，一共202個樣本，採用ecroi和alnⅲ進行酶切，末端修復、添加測序接頭、pcr擴增等步驟完成整個文庫製備。文庫構建完成後，先使用qubit2.0進行初步定量，稀釋文庫至1ng/μl，隨後使用agilent2100對文庫的insertsize進行檢測，以保證文庫質量。將合格的文庫，根據數據量預算，進行illuminahiseq測序。插入片段長度為500bp；測序類型為pe150；去掉用於區分樣品的標籤序列(4～8bp)，實際read長度為142～146bp。通過聚類比較檢測出rad-tags上的snps集。
對初始snp集進行過濾，可得到較為可靠的基因型數據。共開發18314個snp標記，缺失率小於20％，選取3470個高質量snp，利用joinmap軟體將lod值設為6.0構建高密度分子標記遺傳圖譜，圖譜共分為20個連鎖群，總圖距3087.03cm，平均標記間圖距0.89cm，最短連鎖群87.30cm，最長274.47cm。
3、葉黃素基因lutein的精細定位
利用mapqtl5軟體採用複合區間作圖法(mqm)對群體的表型數據和遺傳圖譜信息進行分析計算以獲得性狀相關的qtl，置換檢驗次數設為1000，qtl判斷標準為：p值小於0.05時對應的lod值作為篩選的閾值，圖中以虛線表示。超過閾值表示為一個基因的連鎖定位區間，虛線的lod值為6.3，一個group代表一個連鎖群，將葉黃素基因lutein精細定位在11號連鎖群(圖2)，定位在兩個snp標記6564和24019之間，區間從86.709cm到87.262cm(圖3)，其中snp標記6564包括序列：
tcattttgagcaccctggaacaagagagaaaataaggccataaaaaacaaagtttaagttggggtgctcaagcaagaaaatataaaatgcaaatatctattactcactgcgtattggatatctggaccatctaaacc(seqidno:1)，其中下劃線標記的t具有t→c的變化(即自5』端起第114位鹼基是snp位點，其鹼基為t或c)。
snp標記24019包括序列：
tcattctgctttagctttggacgtcctggtggtcttctagtaggtggaggggttactgtgactagtgccgtagtcgattcatccaggattagtctgtccacatttgggacaggatggattgattccgcgtatgttaggcggtaactctcgactgtgaaatatctggggcaataatcatatgggctcctaccaatgcattcaatgac(seqidno:2)，其中下劃線標記的t具有t→a的變化(即自5』端起第24位鹼基是snp位點，其鹼基為t或a)。
三、dcaps分子標記開發、擴增、酶切驗證
根據分子標記6564和分子標記24019的snps標記信息，使用dcapsfinder2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.htm)和genetool分別設計衍生的酶切多態性擴增序列(dcaps)引物的錯配引物和另一側的引物，完成從snps向dcaps標記的轉化。6564的錯配鹼基數為1個，24019的錯配鹼基數為2個。
用於擴增分子標記6564的引物序列如下所示：
f1：5』-tcattttgagcaccctggaa-3』(seqidno.3)；
r1：5』-ggtttagatggtccagatatccg-3』(seqidno.4)；
當該snp位點在兩個等位基因中的鹼基均為t時，pcr產物可被限制性核酸內切酶hpy188i識別並切割，產生114bp的片段，可以判斷與分子標記6564緊密連鎖的南瓜葉黃素在果實中為高含量葉黃素；當該snp位點在兩個等位基因中的鹼基均為c時，pcr產物不能被限制性核酸內切酶hpy188i識別並切割，只有137bp的片段，可以判斷南瓜果實為低葉黃素南瓜；當該snp位點在兩個等位基因中的鹼基一個為t一個為c時，則存在114bp和137bp的片段，南瓜果實含有高葉黃素。
用於擴增分子標記24019的引物序列如下所示：
f1：5』-tcattctgctttagctttggata-3』(seqidno.5)，
r1：5』-gtcattgaatgcattggtaggag-3』(seqidno.6)，
當該snp位點在兩個等位基因中的鹼基均為t時，pcr產物可被限制性核酸內切酶ecorv識別並切割，產生183bp的片段，可以判斷與分子標記24019緊密連鎖的南瓜葉黃素在果實中為高含量葉黃素；當該snp位點在兩個等位基因中的鹼基均為a時，pcr產物不能被限制性核酸內切酶ecorv識別並切割，只有206bp的片段，可以判斷南瓜果實為低葉黃素南瓜；當該snp位點在兩個等位基因中的鹼基一個為t一個為a時，則存在183bp和206bp的片段，南瓜果實含有高葉黃素。
pcr擴增體系使用20μl的擴增體系，包含1utaq酶，1μl模板dna，1μl的dntp，1.5μl引物，2μl的10×pcrbuffer，加ddh2o至20μl。pcr擴增程序為：94℃3min，循環過程為94℃30s、退火30s、72℃1min、30個循環，最後72℃延伸10min。6564引物的退火溫度為55℃，24019的退火溫度為53℃。
在兩親本間進行pcr擴增，分別經過限制性內切酶hpy188i和ecorv進行酶切後使用聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測(圖4和圖5)。
實驗數據表明親本間表現特異，母本與父本的葉黃素含量比值為3，鑑定f2群體單株30個，兩個標記的結果一致，且果實葉黃素含量與雙酶切結果一致，上述兩個snp標記可以將高含量葉黃素和低含量葉黃素區分開。
使用其他公知的方法對分子標記6564和分子標記24019進行檢測，確定其snp情況，也可以達到相同的目的。
以上實施例僅為介紹本發明的優選案例，對於本領域技術人員來說，在不背離本發明精神的範圍內所進行的任何顯而易見的變化和改進，都應被視為本發明的一部分。
sequencelisting
廣東省農業科學院蔬菜研究所
與南瓜葉黃素含量主效qtl緊密連鎖的snp分子標記及其應用
qtl
6
patentinversion3.5
1
137
dna
南瓜
allele
(114)..(114)
snp位點，突變鹼基為c
1
tcattttgagcaccctggaacaagagagaaaataaggccataaaaaacaaagtttaagtt60
ggggtgctcaagcaagaaaatataaaatgcaaatatctattactcactgcgtattggata120
tctggaccatctaaacc137
2
206
dna
南瓜
allele
(114)..(114)
snp位點，突變鹼基為c
2
tcattctgctttagctttggacgtcctggtggtcttctagtaggtggaggggttactgtg60
actagtgccgtagtcgattcatccaggattagtctgtccacatttgggacaggatggatt120
gattccgcgtatgttaggcggtaactctcgactgtgaaatatctggggcaataatcatat180
gggctcctaccaatgcattcaatgac206
3
20
dna
人工引物
3
tcattttgagcaccctggaa20
4
23
dna
人工引物
4
ggtttagatggtccagatatccg23
5
23
dna
人工引物
5
tcattctgctttagctttggata23
6
23
dna
人工引物
6
gtcattgaatgcattggtaggag23