重組極端耐熱α-澱粉酶的復性與純化方法
2023-05-20 11:09:51
專利名稱：：重組極端耐熱α-澱粉酶的復性與純化方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
，更具體地，本發明涉及一種嗜熱a-澱粉酶的重組表達與製備方法。
背景技術：
：a-澱粉酶是工業上最常用的酶製劑之一，廣泛應用於食品、紡織、化工工業以及發酵工業中的澱粉加工。尋求與開發耐受高熱的澱粉酶長期以來始終是工業酶研究領域的重點與熱點課題。對於澱粉酶耐熱性，生產產率以及酶活性的任何提高均具有十分重要的理論意義與直接商業價值。目前已經發現了多種嗜熱a澱粉酶。例如，獲自嗜熱古菌(Pj;rococc^/wn'ow力的a-澱粉酶PFA;獲自火球菌屬的嗜熱a-澱粉酶、獲自沃氏火球菌(Pyrococcuswoesd)的嗜熱a-澱粉酶等等。屍/wn'osi^是從海底火山溫泉中分離得到的絕對厭氧菌，最適生長溫度IO(TC，培養相對較為複雜，難以實現大規模工業培養，PFA的較大量製備只能通過外源重組表達方能夠實現。至今尚未有適宜於該酶的較大規模的製備方法的公開報導。目前多家實驗室在大腸桿菌及酵母中進行了a-澱粉酶的重組表達研究，但表達量均較低。以往的研究思路主要偏重於提高其可溶性的表達，包括採用低溫誘導，以提高重組蛋白質可溶性表達的策略，從菌體破碎上清中純化得到該重組蛋白；以及採用與Intein融合表達的方式，提高了蛋白可溶性表達量等方法，但總的表達量仍不高。本發明人在以往的工作中也致力於重組PFA的重組表達研究，嘗試採用了與現有技術思路不同的研究策略，即首先實現重組PFA蛋白質分子的大量與高效表達，即使是以不溶性的包涵體形式，之後再研究採用合適的純化復性方法以獲得較高活性的重組酶。以往的研究中，本發明人已經建立鹼變性-加熱-稀釋復性的純化方法，較高效率地純化獲得了具有較高生物活性重組PFA。然而，鹼變性-加熱-稀釋復性方法存在的問題是對操作條件要求高，對溫度和PH具有嚴格的要求。綜上，本領域還需要進一步研究改進嗜熱a-澱粉酶表達的策略，提供簡便、高效、低成本、易於放大的方法。
發明內容本發明的目的在於提供一種嗜熱a-澱粉酶的製備方法。在本發明的第一方面，提供一種嗜熱a-澱粉酶的製備方法，它包括步驟(1)用去垢劑溶液溶解嗜熱a-澱粉酶的包涵體，從而獲得含嗜熱a-澱粉酶的溶液；和(2)從(l)獲得的溶液中分離出所述的嗜熱a-澱粉酶。在另一優選例中，所述的嗜熱a-澱粉酶選自火球菌屬OPj^^occ""的嗜熱a-澱粉酶、嗜熱古菌CFyococc^/wn'o^^)的嗜熱a-澱粉酶(PFA)、沃氏火球菌(P;;rococc^vvo^e/)的嗜熱a-澱粉酶或來源於其他嗜熱微生物的嗜熱a-澱粉酶。在另一優選例中，所述的去垢劑是離子型去垢劑。在另一優選例中，在步驟(l)之前，還包括利用原核表達系統表達嗜熱a-澱粉酶，從而獲得嗜熱a-澱粉酶的包涵體。在另一優選例中，原核表達系統是大腸桿菌。在另一優選例中，用於表達嗜熱a-澱粉酶的表達載體為pT7473或pET21a。在另一優選例中，在步驟(l)中，所述的去垢劑選自十二烷基磺酸鈉(SDS)或十二烷基肌氨酸鈉(SLS)。在另一優選例中，所述的去垢劑溶液中去垢劑的濃度按照重量體積比(w/v)是0.01-10%;較佳的是0.02-5%;更佳的是0.1-3%;進一步更佳的是0.1-1%;如0.15%，0.2%，0.3%，0.5%，0.8%。在另一優選例中，所述的去垢劑溶液含有按照重量體積比0.01-10%的去垢劑和緩衝溶液。在另一優選例中，所述的緩衝液是醋酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液或磷酸鹽緩衝液。在另一優選例中，在步驟(l)中，去垢劑溶液溶解嗜熱a-澱粉酶的包涵體的時間是1-200分鐘；較佳的是10-100分鐘；如40分鐘、60分鐘、80分鐘。在另一優選例中，所述的去垢劑溶液的PH值是2.5-10.0;較佳的PH值是4.0-7.0。在另一優選例中，在步驟(2)中，採用疏水層析法從含嗜熱a-澱粉酶的溶液中分離嗜熱a-澱粉酶。在另一優選例中，採用PhenylSepharose6FastFlow疏水層析柱進行疏水層析；用乙二醇(優選包含在醋酸鈉緩衝液中)梯度洗脫。在另一優選例中，還包括收集用含10-80%(較佳的是30-70%)乙二醇洗脫的樣品。在本發明的第二方面，提供一種去垢劑的用途，用於溶解嗜熱a-澱粉酶的包涵體，獲得酶活力不變或增強的嗜熱a-澱粉酶。在另一優選例中，所述的去垢劑選自十二垸基磺酸鈉(SDS)、十二垸基肌氨酸鈉(SLS)。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1變性劑及有機溶劑對PFA澱粉酶活力的影響。圖2不同起始濃度的包涵體在各種濃度SDS中的溶解情況。包涵體蛋白質濃度A，6mg/ml;B，15mg/ml;C，26mg/ml;D，52mg/ml。蛋白質濃度，△酶活。圖3SDS法PFA疏水柱純化圖譜及SDS-PAGE分析圖。A:疏水層析圖譜，其中，峰l，流過樣品；峰2，乙二醇洗脫峰I;峰3,乙二醇洗脫峰II。B:SDS-PAGE電泳結果。其中，M，分子量標準；1，PFA重組菌；2，PFA包涵體；3，去垢劑溶解後樣品；4，疏水柱上樣樣品；5，6，乙二醇洗脫樣品。圖4十二垸基肌氨酸鈉法PFA疏水柱純化圖譜及SDS-PAGE分析圖。A:疏水層析圖譜，其中，峰l，流過樣品；峰2，乙二醇洗脫峰I;峰3，乙二醇洗脫峰II。B:SDS-PAGE電泳結果。其中，M，分子量標準；1，PFA重組菌；2,PFA包涵體；3,去坭劑溶解後樣品；4，疏水柱上樣樣品；5，6，乙二醇洗脫樣品。圖5去街劑方法純化的PFA耐熱性鑑定。A:去垢劑法純化的PFA與鹼-加熱法純化得到的PFA耐熱性比較，其中，■，去垢劑法10(TC;，鹼法10(TC;X，去垢劑法12(TC;▲，鹼法12(TC。B:去垢劑法純化得到的PFA在不同溫度下的耐熱性比較，其中，，卯。C;▲，IOO'C;X，ll(TC;+，120°C。圖6鹼-加熱方法與SDS方法純化獲得的PFA酶水解產物HPLC分析圖譜，其中，A:鹼加熱方法；B:SDS方法。具體實施例方式本發明人經過深入的研究，出乎意料地發現採用一定濃度的去垢劑來處理嗜熱a-澱粉酶包涵體，不僅可良好地溶解嗜熱a-澱粉酶包涵體，而且不會對嗜熱a-澱粉酶的酶活性產生影響，甚至還可一定程度地提高嗜熱a-澱粉酶的酶活性；也即嗜熱a-澱粉酶對於去垢劑及一些有機溶劑具有較強的抵禦作用。並且，經去垢劑溶解的嗜熱a-澱粉酶可直接通過疏水層析的方法進行純化。本發明的方法具有簡便、高效、成本低廉、收率高且易於放大的特點，克服了現有技術中嗜熱a-澱粉酶重組表達量低下或表達條件煩瑣等技術缺陷。原核表達系統(如大腸桿菌)以其易於操作、遺傳背景清楚、發酵成本低和蛋白表達水平高等優點，依然是生產重組蛋白的首選表達系統。但是原核表達的蛋白常常以包涵體的形式沉積於細胞內，表現為無活性的不溶性聚集物，如何高效地復性蛋白是基因工程蛋白生產過程中最關鍵和最困難的一步。包涵體溶解變性與復性是蛋白純化過程中的最為關鍵的因素。在大腸桿菌中表達的外源重組蛋白質包涵體，其蛋白質分子間主要通過非共價作用相互結合在一起，這些非共價作用包括疏水作用、範德華力、氫鍵以及離子鍵作用，唯一的共價作用是蛋白質分子中半胱氨酸殘基間的-s-s-鍵。目前常用的包涵體溶解方法是高濃度的尿素與鹽酸胍等變性劑。然而，蛋白包涵體的溶解受到多種因素的限制，不適合的溶解方法極易於影響蛋白的活性，如去垢劑類蛋白變性劑的採用極易於影響蛋白活性，被本領域人員列為慎用的對象。而嗜熱a-澱粉酶屬於水解酶類的蛋白，更需要慎重地選擇變復性方法和試劑以良好地保留其酶活性。本發明人試驗了多種對於包涵體溶解可能有用的試劑，最終意外地發現SDS等去垢劑對於嗜熱ci-澱粉酶的活性沒有任何影響，甚至還可能提高嗜熱a-澱粉酶的活性，其耐熱性與天然蛋白一致，其水解產物也與已報導的一致。並且，採用變性劑進行嗜熱a-澱粉酶包涵體的溶解操作條件簡單，成本低廉。因此，本發明提供一種嗜熱a-澱粉酶的製備方法，它包括步驟(1)用去垢劑溶液溶解嗜熱a-澱粉酶的包涵體，從而獲得含嗜熱a-澱粉酶的溶液；和(2)從(l)獲得的溶液中分離出所述的嗜熱a-澱粉酶。可用於本發明的嗜熱a-澱粉酶可以是來自嗜熱古菌(也譯為激烈火球菌)的嗜熱a-澱粉酶、火球菌屬的嗜熱a-澱粉酶、沃氏火球菌(Pyrococcuswoesei)的嗜熱a-澱粉酶以及來源於其他嗜熱微生物的嗜熱a-澱粉酶。在本發明中，所述的嗜熱a-澱粉酶也可以是嗜熱a-澱粉酶的變異體。代表性的嗜熱oi-澱粉酶包括(但並不限於)由以下基因編碼的嗜熱a-澱粉酶GenBank登錄號U96622、AF001268、AF177906.1、AE010170.1、AF240464.1、DQ192528.1等。較佳的是來自嗜熱古菌的嗜熱cx-澱粉酶。可用於本發明的包涵體沒有特別限制，只要該包涵體含有重組表達的嗜熱ot-澱粉酶。本發明所用的包涵體可由本領域常規的重組方法獲得，其中可以選用本領域常規的各種宿主細胞(一般是原核表達系統，如大腸桿菌)、質粒、啟動子等材料構建重組表達宿主細胞，並且在常規條件下發酵，從而獲得包涵體。一種獲得所述包涵體的方法是用編碼嗜熱a-澱粉酶的多核苷酸，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；培養該宿主細胞，使其大量表達嗜熱a-澱粉酶，形成包涵體。優選的，所述的宿主細胞是大腸桿菌；所述的用於表達嗜熱a-澱粉酶的表達載體為pT7473或pET21a。作為本發明的優選方式，所述的去垢劑是離子型去垢劑。任何具有上述特點的去垢劑在本發明中均是可用的。更佳的，所述的去垢劑選自十二烷基磺酸鈉(SDS)、十二烷基肌氨酸鈉等。進一步更佳的，所述的去垢劑是SDS。由於去垢劑對於嗜熱a-澱粉酶的酶活性沒有負面影響，因此當用於溶解嗜熱a-澱粉酶時，可採用的去垢劑的濃度範圍是較寬的。合適的去垢劑的濃度可根據包涵體蛋白的濃度來確定。作為本發明的優選方式，所述的去垢劑溶液中去垢劑的濃度按照重量體積比(w/v)是0.01-10%;較佳的是0.02-5%;更佳的是0.1-3%;進一步更佳的是0.1-1%;如0.15%，0.2%，0.3%,0.5%,0.8%。當用於溶解包涵體時，所述的去垢劑可以存在於任何合適的溶劑或緩衝液中，只需將該溶劑或緩衝液的pH調節到特定的數值。合適的緩衝液可以包括(但並不限於)以下種類磷酸鹽、硼酸鹽、醋酸鹽、Tris-HCl、碳酸鹽、甘氨酸-NaOH或它們的組合。合適的緩衝液的選擇是本領域人員熟知的。作為本發明的一種方式，所述的去垢劑溶液含有0.01-10%的去垢劑和10-500mmol/L(較佳的是20-300mmol/L;更佳的是40-200mmol/L)醋酸鹽溶液。去垢劑溶液溶解嗜熱a-澱粉酶的包涵體的時間沒有特別的限制，一般根據包涵體蛋白的濃度以及去垢劑的濃度的不同而不同，通常是1-200分鐘；較佳的是10-100分鐘；如40分鐘、60分鐘、80分鐘。在充分溶解後，多種蛋白純化方法均可用於從含嗜熱a-澱粉酶的溶液中分離出a-澱粉酶，包括但不限於分子篩法、離子交換層析、疏水層析等；或者也可採用一種以上的蛋白純化方法，主要視所需的蛋白純度而定。本發明人意外地發現，經去垢劑溶解的嗜熱a-澱粉酶蛋白仍可以吸附於疏水層析介質上，並可通過適當的洗脫液洗脫下來得以純化。與採用分子篩法相比，採用疏水層析法不僅可極好地從含嗜熱a-澱粉酶的溶液中分離嗜熱a-澱粉酶，而且上柱量大，成本低廉，適合較大規模的蛋白純化。作為本發明的優選方式，採用PhenylSepharose6FastFlow疏水層析柱進行疏水層析；用乙二醇(優選包含在醋酸鈉緩衝液中)梯度洗脫。進一步的實驗結果證實，採用本發明的方法溶解和純化獲得的嗜熱a-澱粉酶在酶的比活性、耐熱性以及酶水解產物等方面均具有與天然嗜熱a-澱粉一致的性質。本發明的主要優點在於(1)首次發現採用一定濃度的去垢劑來處理嗜熱a-澱粉酶包涵體，不僅可良好地溶解嗜熱a-澱粉酶包涵體，而且不會對嗜熱a-澱粉酶的酶活性產生影響。(2)建立了一種新的適合於復性和純化包涵體形式表達的重組嗜熱a-澱粉酶的方法，該方法具有簡便、高效、低成本、易於放大的特點，可以方便地應用於重組嗜熱a-澱粉酶的較大規模製備。同時該方法亦適用於其它以不溶性包涵體形式表達的嗜熱蛋白質的復性純化。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。I.材料與方法1.菌株及載體攜帶pET21a-PFA表達載體的Eco//BL21-CodonPlus(DE3)-RIL表達菌株的構建方法如下以Py腦occusfuriosusDSM3638(參見CN200610025974.0)基因組DNA為模板進行PCR擴增，上遊引物為5ATGAAATACTTGGAGCTTGAAGAG3;下遊引物為5AAGAAGCTTATCACCCAACACCACAATAACTC3;擴增程序為94。C變性3min，94°C1min，55°C1min，72°C2min，35個循環，72°C延伸10min。PCR擴增產物HindIII酶切，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒回收，pET21a(Novagen)以NdeI酶切，以T4DNA聚合酶補平，再以HindIII酶切，膠回收試劑盒回收，以T4DNA連接酶連接回收PCR片段和載體，轉化E.coliDH5a感受態，菌落PCR方法鑑定轉化子，DNA序列測定與GenBank收錄的PFA蛋白序列對比完全相同。將測序正確的重組質粒pET21a-PFA轉化至U￡co"BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(參見CN200610025974.0)中，獲得重組PFA表達菌株。2.主要試劑和溶液超聲破碎緩衝液Tris.HCl(pH8.0)50mM，EDTA10mM，NaCl100mM。120mmol/LBritton-Robinson緩衝液:醋酸、磷酸、硼酸各40mmol/L，用NaOH調至所需pH值。DNS試劑lg3，5-二硝基水楊酸溶解於20ml2mol/LNaOH中，加入30g酒石酸鈉鉀，稀釋至100ml。3.變性劑和有機溶劑對PFA澱粉酶活性的影響取適量的酶液，分別加入含8M尿素、6M鹽酸胍、1%去垢劑(如SDS)的120mmol/LBritton-Robinson緩衝液(pH8.5)，使終濃度分別為6M尿素、4M鹽酸胍、0.2%(w/v)SDS。取適量的酶液，按酶液:有機溶劑體積比為7:1的比例分別加入甲醇、乙醇、丙酮三種有機溶劑。室溫放置1小時，用含相應變性劑或有機溶劑的緩衝液稀釋後測定酶活。4.重組菌的發酵在15L發酵罐中進行PFA重組菌的高密度發酵，採用分批補料培養模式，最終每立升發酵培養液中可獲得約60g溼菌體。重組PFA蛋白質表達量佔菌體總蛋白含量約20%。5.包涵體在不同濃度去垢劑中的溶解性取發酵所得菌體，懸浮於超聲破碎緩衝液中超聲破碎，離心後棄去上清，反覆三次，獲得包涵體。水懸浮包涵體，調整蛋白濃度為58mg/ml，按100^1、200W、400pl、800^1/管分裝入Eppendorf管中，各分裝5管，14000卬m離心40分鐘，棄去上清。每管加入100^1120mmol/LBritton-Robinson緩衝液(pH8.5)，超聲使蛋白懸浮均勻。加入1/10懸浮液體積的不同濃度的去垢劑溶液，使得去垢劑終濃度分別為0.052%。振蕩均勻後室溫放置1小時使充分溶解。14000rpm離心40分鐘，測定上清的蛋白量和酶活力。6.去垢劑方法溶解、純化包涵體每克包涵體溼重懸浮於50ml含0.2%去垢劑的50mmol/L，pH5.0醋酸鈉溶液中。室溫攪拌1小時使充分溶解。離心，取上清上柱。用50mmol/L，pH5.0醋酸鈉溶液平衡PhenylSepharose6FastFlow疏水層析柱，上樣後用10倍柱體積50mmol/L，pH5.0醋酸鈉溶液洗柱。依次用含30%、50%、65%乙二醇的50mmol/L，pH6.0醋酸鈉緩衝液梯度洗脫。收集洗脫液，同時A280檢測；SDS-PAGE電泳分析蛋白的分布和純度。以Bradford法對純化後的目的蛋白進行濃度測定；DNS法進行酶活力的測定。7.澱粉酶活力測定方法(DNS法)將稀釋的酶液加入到0.5ml含1%澱粉的50mmol/L，pH5.0醋酸鈉溶液中，IO(TC反應15min，迅速放入冰水浴中終止反應。加入0.5mlDNS試劑，沸水煮5分鐘，冰水冷卻，加入5ml水，用分光光度計檢測在波長546nm的吸光度，以葡萄糖與DNS試劑反應作標準曲線。以1分鐘降解澱粉產生lpmol葡萄糖的酶量定義為1個酶活力單位(U)。8.PFA澱粉酶的熱穩定性為檢驗去垢劑方法對PFA澱粉酶熱穩定性的影響，分別對鹼-加熱法(參見CN200610025974.0)和去垢劑法獲得的純化蛋白進行耐熱性的測定。將兩種方法獲得的純化蛋白透析後調整到適當濃度，在0.6mlPCR管中加入20pl蛋白，加20jLtl礦物油以防止加熱過程中揮發。分別於9(TC、IO(TC、ll(TC、120。C放置0.5h、lh、1.5h、2h、4h。100°C以內在PCR儀中進行，100。C在沸水浴中進行，100。C以上在高壓滅菌鍋中進行，並忽略升降溫時間。取出後立即置於冰水中冷卻。對照置於室溫。用50mmol/L醋酸鈉(pH6.0)20倍稀釋熱處理後的酶液，取20pl用DNS法測殘餘酶活。將室溫放置的酶活力定為100%，其他與之比較得出相對酶活。9.重組PFA酶水解產物分析將純化的重組PFA(2.5U/ml)加入到1%可溶性澱粉溶液中95'C保溫4小時以上，冷卻後取上清進行HPLC檢測分析(Aglient1100高效液相色譜)。色譜條件如下色譜柱DIKMAInertsilNH2，5u，4.6*250mm。流動相70%乙腈/水，流速1.0ml/min，柱溫25C，檢測器SEDEX75ELSD蒸發光檢測器。以葡萄糖及相應麥芽寡糖作為標準品。II.實施例實施例1變性劑和有機溶劑對PFA澱粉酶活性的影響由於以往報導PFA具有較強的抗逆性。本發明人研究了幾種變性劑與有機溶劑對PFA酶活力的影響。將PFA澱粉酶分別置於6M尿素、4M鹽酸胍、0.2%SDS以及1/8(V/V)甲醇、丙酮、乙醇中測定其酶活力，發現4M鹽酸胍會降低酶活力，三種有機溶劑對PFA的酶活力影響不大。而SDS對PFA的酶活力不僅沒有影響，且有一定程度的增強作用，結果見圖l。實施例2包涵體在不同濃度去垢劑中的溶解性SDS曾被用於難溶蛋白質的溶解。經前述驗證，去垢劑不會抑制PFA的澱粉酶活力，因此本發明人嘗試採用去垢劑溶解PFA包涵體，以期獲得更簡便、高效的純化方法。通過測定幾種濃度的包涵體在不同濃度去垢劑的溶解性，發現隨包涵體蛋白濃度升高，充分溶解包涵體所需的去垢劑濃度隨之升高，見圖2。實施例3PFA的純化1取發酵所得菌體，懸浮於超聲破碎緩衝液中超聲破碎，離心後棄去上清，將沉澱懸浮，繼續超聲破碎，反覆三次，獲得包涵體。用水懸浮。從100g溼菌體中可以獲得15-20g溼的PFA包涵體。取純化好的溼重為2.0g的包涵體，懸浮於80ml含0.2%SDS去垢劑的50mmol/L，pH5.0的醋酸鈉溶液中。室溫攪拌1小時使其充分溶解。離心，取上清上PhenylSepharose6FastFlow疏水層析柱進行分離純化。實驗結果發現，加入去垢劑溶解後的PFA蛋白質仍能夠結合到PhenylSepharoseFF凝膠分離介質上，並可用一定濃度的乙二醇進行洗脫。層析圖譜及SDS-PAGE電泳分析結果如圖3，純化過程中各步驟的酶活性收率如表1。12表1SDS法蛋白純化表tableseeoriginaldocumentpage13實施例4PFA的純化2取純化好的溼重為1.0g的包涵體，懸浮於28ml含有一定濃度十二垸基肌氨酸鈉的50mmol/L，pH5.0的醋酸鈉溶液中。室溫攪拌l小時使其充分溶解。離心，取上清上PhenylSepharose6FastFlow疏水層析柱。樣品上柱完畢後用2-5倍柱體積德相應緩衝液洗柱，用含有一定濃度乙二醇的緩衝液進行洗脫。層析圖譜及SDS-PAGE電泳分析結果如圖4，純化過程中各步驟的酶活性收率如表2。表2十二烷基肌氨酸鈉法PFA蛋白純化表tableseeoriginaldocumentpage13實施例5耐熱性的測定對去塘劑溶解法純化出的蛋白進行耐熱性的鑑定，以鹼-加熱溶解法獲得的純化蛋白作為對照。以往的實驗數據表明鹼法所獲蛋白和天然的PFA蛋白的性質一致(LisaWang等，Efficientsolubilization,purificationofrecombinantextracellulara-amylasefrompyrococcusfuriosusexpressedasinclusionbodiesinEscherichiacoli，JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology,(2007)，vol34，NO.3,187-192.)。實驗結果如圖5所示，顯示在IO(TC和12(TC時，去垢劑溶解法獲得的重組PFA具有和對照相同的耐熱性。在已報導的相關研究(GrzybowskaB等，Cloningofthethermostablea-amylasegenefromPyrococcuswoeseiinEscherichiacoli.(2004)MolBiotechnol26:101109)中，Grzybowska等測定了PFA的耐熱性，發現該酶在ll(TC的半衰期為3.5小時，120。C加熱2小時仍有24。/。的酶活力。與上述已報導的研究相比，本發明人測定了本發明的SDS法純化的PFA在不同溫度下的耐熱性，發現其在ll(TC加熱4小時仍能維持50%以上的酶活力。120'C加熱2小時仍有34%的酶活力，表明採用去垢劑方法所獲得的蛋白具有與天然蛋白一致的耐熱性。實施例6PFA酶水解產物分析對用鹼-加熱變性方法及去垢劑溶解方法分離純化得到的PFA酶水解產物進行分析。結果如圖6。HPLC分析結果顯示，兩種方法純化獲得的PFA其水解澱粉後的產物組分及其百分含量均無區別。PFA的主要水解產物為G2至G7的寡糖(麥芽2糖至麥芽7糖)，其中葡萄糖的產生量很少。表2中列出了根據HPLC結果得到的兩種方法純化獲得的PFA水解澱粉後各種寡糖的百分含量，以及文獻報導(DongG等，ApplEnvironMicrobiol.63:35773584，1997)所對應得結果，表明此兩種方法純化的PFA其水解產物組分等與文獻報導結果一致。表3不同方法純化獲得的PFA水解澱粉後產生的寡糖產物分析tableseeoriginaldocumentpage15在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。權利要求1.一種嗜熱α-澱粉酶的製備方法，其特徵在於，它包括步驟(1)用去垢劑溶液溶解嗜熱α-澱粉酶的包涵體，從而獲得含嗜熱α-澱粉酶的溶液；和(2)從(1)獲得的溶液中分離出所述的嗜熱α-澱粉酶。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的嗜熱a-澱粉酶選自火球菌屬的嗜熱a-澱粉酶、嗜熱古菌的嗜熱a-澱粉酶、沃氏火球菌的嗜熱a-澱粉酶或來源於其他嗜熱微生物的嗜熱a-澱粉酶。3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的去垢劑是離子型去垢劑。4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，在步驟(l)中，所述的去坭劑選自十二烷基磺酸鈉或十二烷基肌氨酸鈉。5.如權利要求l-4任一所述的方法，其特徵在於，所述的去垢劑溶液中去垢劑的濃度按照重量體積比是0.01-10%。6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述的去垢劑溶液含有按照重量體積比0.01-10%的去垢劑，和緩衝溶液。7.如權利要求1-4任一所述的方法，其特徵在於，所述的去垢劑溶液的PH值是2.5-10.0。8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在步驟(2)中，採用疏水層析法從含嗜熱a-澱粉酶的溶液中分離嗜熱a-澱粉酶。9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，採用PhenylSepharose6FastFlow疏水層析柱進行疏水層析；用乙二醇梯度洗脫。10.—種去垢劑的用途，其特徵在於，用於溶解嗜熱a-澱粉酶的包涵體，獲得酶活力不變或增強的嗜熱a-澱粉酶。全文摘要本發明公開了一種嗜熱α-澱粉酶的製備方法，包括用去垢劑溶液溶解嗜熱α-澱粉酶的包涵體，從而獲得含嗜熱α-澱粉酶的溶液；和從所獲得的溶液中分離出所述的嗜熱α-澱粉酶。本發明的方法獲得的嗜熱α-澱粉酶具有天然蛋白一致的酶活性及耐熱性。本發明的方法具有簡便、高效、低成本及易於放大的特點，特別適用於重組嗜熱α-澱粉酶的較大規模製備。同時該方法亦適用於其它以不溶性包涵體形式表達的嗜熱蛋白質的復性純化。文檔編號C12N9/26GK101613681SQ200810039429公開日2009年12月30日申請日期2008年6月24日優先權日2008年6月24日發明者毅張,楊勝利,王麗薩,陸堅峰申請人:中國科學院上海生命科學研究院