含有磷脂混合物並具有抗細胞程序死亡活性的組合物的製作方法

2023-05-19 21:42:46

專利名稱：含有磷脂混合物並具有抗細胞程序死亡活性的組合物的製作方法
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本發明涉及了對細胞程序死亡具有抑制作用的物質的組合物。更具體地說，本發明涉及了具有抗細胞程序死亡活性的磷脂(PA、PI、LPA、LPI和LPC)混合物的組合物。發明背景細胞程序死亡是一種導致個體細胞死亡的正常生理過程。這種細胞程序死亡的過程涉及到多種正常的或病原性的生物作用，並且該過程可以由許多不相關的刺激所引發。在衰老過程中也會出現細胞程序死亡的生物調節的變化，並且會引起許多與衰老有關的病症和疾病。
細胞程序死亡的最新研究揭示出，誘發細胞程序死亡的正常代謝途徑能夠被很多種信號啟動，這些信號包括激素，血清生長因子的缺失，化學治療劑，電離輻射，和因人體免疫缺損病毒(HIV)造成的感染。Wyllie(1980)Nature 284555-556；Kanter等人(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun 118392-399；Duke和Cohen(1986)Lymphokine Res.5289-299；Tomei等人(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.155324-331；Kruman等人(1991)J.Cell.Physiol.148267-173；Ameisen和Capron(1991)Immunol.Today12102-105；及Sheppard和Ascher(1992)J.AIDS 5143-147。那些影響細胞程序死亡的生物控制的試劑對大量臨床病症都具有治療功效。
編程性細胞死亡的特點表現為細胞收縮、染色質凝聚、細胞質水泡狀生長、膜通透性增大和核小體間DNA裂解。Gerschenson等人(1992)FASEB J. 62450-2455；及Cohen和Duke(1992)Ann.Rev.Immunol.10267-293。
含有部分的、經一定程度加工的植物提取物的多種食品補充劑已被用於改善化療、輻射和愛滋病(AIDS)中伴隨的腸胃紊亂。這些補充劑通常含有碳水化合物、脂肪和植物性蛋白水解物。例如，可以參見Tomei和Coe等人的in Apoptosis The Molecular Basis of Cell Death(1991)ColdSpring Harbor Laboratory Press。
一些由植物提取物中得到的一些蛋白酶抑制劑具有抗癌活性。Troll等人(1987)Adv.Canner Res.49265-283。Bowman-Birk抑制劑是這些抑制劑中最好的。Birk(1985)Int.J.Pep.pro.Res.25113-131。Bowman-Birk抑制劑被描述成一類能抑制細胞轉化且分子量約是8KD的二硫化物鍵合蛋白。Chou等人(1974)Proc.Natl.Acad.Sci.USA711748-1752；Yavelow等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA825395-5399；及Yavelow等人(1983)Cancer Res.(Suppl.)432454s-2459s。對含有Bowman-Birk抑制劑的大豆粗提物進行了具體的描述。Kennedy等人的美國專利4,793,3996；PCT公開號WO94/20121；和Kennedy，A.R.(1994)Canner Res.(Suppl)541999s-2005s。還有關於Bowman-Birk抑制劑免疫性的描述。WO90/03574；和美國專利4,959,310；和5,053,327。Bowman-Birk抑制劑還被發現有巨噬細胞脫粒的活性。日本特許公報63051335。
磷脂是一類親水親油性的含磷脂類，它們是生物膜的重要組成。不同的磷脂製品可以應用於烹飪、藥物轉運(脂質體)、緩釋傳遞體系、疏水性藥物的載體介質、基因轉移和基因替代治療、防曬劑、乳劑、消泡劑、缺損肺表面活性劑的替代、去汙劑和膜穩定劑。
在許多植物和動物產品中都發現含有磷脂酸(PA)、磷脂醯肌醇(PI)、溶血性磷脂酸(LPA)、溶血性磷脂醯肌醇(LPI)、和溶血性磷脂醯膽鹼(LPC)。很多植物和動物產品中含有LPA，據報導它具有許多包括致有絲分裂、生長因子作用在內的生理活性，並且可以作為一種抗皺劑。美國專利4,263,286；4,746,652；5,326,690；和5,340,568。下列文獻對LPA有詳細的評述，Moolenaar(1994)TICB4213-219；和Eichholtz等人(1990)Biochem.J.291677-680；和Moolenaar(1995)J.Biol.Chem.27012949-12952。
PCT專利公開號WO95/15173描述了植物來源的脫脂(delipidated)提取物可以產生抗細胞程序死亡的作用。現在認為，這些提取物中含有重量比是2∶1∶2∶20∶20的LPA、LPC、LPI、PA和PI，提取物還含有許多蛋白質和碳水化合物組分在內。
在本發明中引用的所有參考文獻都作為參考文獻以其全部內容併入本發明。發明概述本發明涉及抑制細胞程序死亡的組合物和製備這些組合物的方法。本發明還涉及這些組合物製備和應用的方法。
因此，本發明一方面涉及了含有磷脂的組合物，這些磷脂是磷脂酸(PA)、磷脂醯肌醇(PI)、溶血性磷脂酸(LPA)、溶血性磷脂醯肌醇(LPI)、和溶血性磷脂醯膽鹼(LPC)，它們之間的配比是能產生抗細胞程序死亡作用的比例。
另一方面，本發明提供了製備這些組合物的方法。這些方法包括將有效量的上述磷脂以它們各自相應的比例進行結合，並且將這些磷脂進行聲處理直至所得溶液具有光學透明度。
又一方面，本發明提供了這些組合物的應用方法。這些方法包括將這些組合物用於治療細胞程序死亡，治療是通過給予需要這類治療的患者以有效治療量的含有上述組合物的可藥用治療劑來實現的。該方法包括用組合物來治療與細胞程序死亡有關的病症。使用這些組合物的其他方法包括防止培養的細胞發生細胞程序死亡，改善連續性器官移植中的器官保藏和分流術中的器官原位保藏，例如，心臟、肝臟、肺、腦等，以及治療牽涉有細胞程序死亡的皮膚病病症的方法。對附圖的簡單描述附

圖1(A)和1(B)是ElirexTM(以前稱為「ROM」)在不同溫度條件下儲存一周後的穩定性棒圖。棒的陰影部分代表了活的粘附性細胞(ADH)。棒的空白部分代表了程序死亡的無血清的釋放性細胞(SDR)。穩定性是以細胞密度(附圖1(A))和百分率(附圖1(B))來表示的。在附圖1(A)中，空心環代表粘附性細胞的具有統計學意義的顯著性增加；實心環代表了程序死亡細胞的具有統計意義的顯著性減少。附圖1(B)，空心方塊代表了具有統計學意義的存活細胞的百分率；實心方塊代表了程序死亡細胞的具有統計學意義的百分率。
附圖2(A)和2(B)是NM和RNM在10T 1/2細胞中的抗細胞程序死亡活性的對比棒圖。棒的陰影部分代表了活細胞(ADH)。棒的空白部分代表了程序死亡的無血清釋放細胞。NM是一種具有抗細胞程序死亡活性的大豆來源的提取物。RNM是具有10∶10∶2∶2∶1(PA∶PI∶LPA∶LPI∶LPC)比例的重組脂混合物。加有牛血清白蛋白(BSA)並且最終濃度為0.01％的RNM被表示為RNM+。抗細胞程序死亡活性是以細胞密度(附圖2(A))和百分率(附圖2(B))來表示。附圖2(A)中，空心環代表了活細胞的具有統計意義的顯著性增加；實心環代表了程序死亡細胞的具有統計學意義的顯著性減少。附圖2(B)，空心方塊代表了存活細胞的統計學意義的百分率；實心方塊代表了程序死亡細胞的統計學意義的百分率。
附圖3(A)和3(B)是含有植物來源磷脂的RNM和含有動物來源磷脂的RNM分別所具有的抗細胞程序死亡活性的對比棒圖。劑量濃度是100μg/ml。溶液不論含有或不含BSA其最終濃度都是0.01％。棒圖的陰影部分表示細胞(ADH)。棒圖的空白部分代表程序死亡細胞(SDR)。抗細胞程序死亡活性是以細胞密度(附圖3(A))和百分率(附圖3(B))來表示。在各附圖中，第二和第三個棒代表大豆來源的磷脂；第四和第五棒代表了動物來源的磷脂。附圖3(A)中，空心環代表了活細胞(ADH)的具有統計意義的顯著性增加；實心環代表了程序死亡細胞(SDR)的具有統計學意義的顯著性減少。附圖3(B)，空心方塊代表了存活細胞的有統計學意義的百分率；實心方塊代表了程序死亡細胞的有統計學意義的百分率。
附圖4(A)是以PI為具體實例(採用Avanti Polar Lipids1994的目錄)，將含有大豆來源磷脂的脂肪酸[A]和含有牛肝臟來源磷脂的脂肪酸[B]進行比較。空白部分的棒表示飽和脂肪酸；陰影部分的棒表示不飽和脂肪酸。各脂肪酸的種類是以X∶Y來劃分，其中X代表了鏈的長度，Y代表了雙鍵的數目。「S/U」是指飽和脂肪酸相對於不飽和脂肪酸的比例。
附圖5(A)至(E)是一系列圖示，用來表示RNM中的PA(附圖5(A))、PI(附圖5(B))、LPA(附圖5(C))、LPI(附圖5(D))、和LPC(附圖5(E))在不同濃度下的抗細胞程序死亡活性。所含磷脂的比例分別保持在常數10∶10∶2∶2∶1(PA∶PI∶LPA∶LPI∶LPC)，但所研究磷脂的濃度(μg/ml)是不同的。箭頭代表磷脂在100μg/ml的劑量下當比例為10∶10∶2∶2∶1時的起始濃度。
附圖6是附圖5所述各磷脂在不同濃度下的抗細胞程序死亡活性試驗的總圖示。所含磷脂的比例保持在常數10∶10∶2∶2∶1(PA∶PI∶LPA∶LPI∶LPC)，但這些磷脂在100μg/ml當量劑量下的濃度(μg/ml)是不同的。附圖中的磷脂表示如下LPA(由實線連接的方塊)、LPI(由實線連接的環)、LPA(由實線連接的三角)、PA(由虛線連接的方塊)、PI(由虛線連接的環)。
附圖7是重組RNM和ElirexTM在不同劑量時的抗細胞程序死亡活性對比圖示。ElirexTM是由實線連接的空心方塊表示，並且ElirexTM的磷脂比例是由附圖5和6中優選出的。抗細胞程序死亡是以存活細胞的百分率表示。
附圖8表示在不同pH條件下用Eagel基礎培養基稀釋(BME)得到的ElirexTM的抗細胞程序死亡活性。由虛線連接的實心三角代表了BME中的ElirexTM在不同濃度(μg/ml)下的抗細胞程序死亡活性。實心方塊代表ElirexTM在pH為8(碳酸氫銨緩衝液)時的活性。實心三角代表ElirexTM在pH為5.0(醋酸鈉緩衝液)時的活性。實心環代表ElirexTM在pH為6.5(磷酸鈉緩衝液)時的活性。在用細胞培養介質稀釋前，都必須先在含有100-200mMNaCl的測試緩衝液中進行聲處理，使之重新混懸。本發明實施方法現已發現，含有特定比例五種磷脂的組合物比含天然比例的這些磷脂具有更高的抗細胞程序死亡活性，其中的五種磷脂可以來源於植物、動物或合成。這些組合物很容易從各種渠道得到，包括來源於植物和動物。組合物還可以採用脂合成領域的已知方法來合成。組合物將因為來源和植物生長條件的不同而使化學組成略有差異。組合物在此被稱為ElirexTM。
我們以前對植物來源的、可產生抗細胞程序死亡作用的提取物進行過描述，提取物活性測定採用體外細胞試驗來完成，該體外細胞試驗是能夠對細胞程序死亡信號產生應答的試驗。如PCT WO95/15173所述。現在，我們發現活性組分是磷脂磷脂酸(PA)、磷脂醯肌醇(PI)、溶血性磷脂酸(LPA)、溶血性磷脂醯肌醇(LPI)、和溶血性磷脂醯膽鹼(LPC)。天然提取物分別含有這些磷脂並且它們的比例是約20∶20∶2∶1∶2。在此它被稱為「天然混合物」(NM)。這些磷脂可以這種比例重新進行結合，以得到重組天然混合物(RNM)，該RNM中不含有天然混合物所含的雜質。RNM是ElirexTM的一個具體實例。雖然這個比例是最常見的標準含量比例，但是它可以因各種原因而在很小的範圍內變化，改變的原因包括季節、生長條件、生長區域、收穫條件、儲存、種子(育種)類型和種子的基因技術，但是不僅僅局限於此。本發明中，這些磷脂的比例不同於發現的天然來源比例，但卻更有效。
本發明所述組合物含有活性成分磷脂PA、PI、LPA、LPI、和LPC。所含各磷脂的比例範圍分別是0-20∶5-20∶2-16∶0-4∶0-8。優選各磷脂的比例範圍大約分別是2-15∶8-15∶6-10∶2-4∶2-8。更優選這些磷脂的比例分別是近10∶10∶8∶2∶4的比例。雖然這些磷脂的結構是確定的，但由於脂鏈長度和飽和程度的不同而使它們各不相同。通常，這些磷脂具有下列結構式，也包括本領域已知的其他結構的磷脂，但這些磷脂必須能夠在任一標準細胞程序死亡試驗中產生抗細胞程序死亡應答。
PA的結構式是
PI的結構式是
LPA結構式是
其中R是一個非取代或取代的、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的、含有11-23個碳原子的烷基。
並且，在此所採用的LPA含有多種不同的分子，包括結構式如下的2-脫氧-或2-脫氧-2-滷素-溶血性磷脂酸化合物，但是不僅僅局限於此
或LPA的可藥用鹽，其中R是一個非取代或取代的、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的、含有11-23個碳原子的烷基；X分別是O或S；Y是O或(CH)n，其中n＝0-2；並且Z是H、滷素、NH2、SH、OH、或OPO3H2。
還包括RC(O)O基，例如，它可以是月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基、棕櫚油醯基、油醯基、亞油醯基；優選油醯基、棕櫚油醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、或月桂醯基。最優選16碳鏈的棕櫚醯基和棕櫚油醯基，和18碳鏈的硬脂醯基、油醯基和亞油醯基，但是不排除其他碳鏈長度的脂肪酸，包括C12、C14、C20和C22，但不局限於此。適當磷脂的具體例子可以參見任何磷脂商品目錄，如(1994)Avanticatalog，具體是其中的第14和21頁。
其中R是非取代或取代的、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的、帶有大約11-23個碳原子的烷基。
LPC的結構式為
其中R是非取代或取代的、飽和或不飽和的、直鏈或支鏈的、帶有大約11-23個碳原子的烷基。
磷脂的可藥用鹽包括游離酸形式、鹼金屬鹽，例如鈉和鉀；鹼土金屬鹽，例如鈣和鎂；無毒重金屬鹽；銨鹽；三烷基銨鹽，如三甲基銨和三乙基銨；以及三烷氧基銨鹽，例如三乙醇銨、三(2-羥乙基)銨、和Tromethamine(三(羥甲基)氨基甲烷)，但是不僅限於此。尤其優選鈉鹽和銨鹽。
組合物中的磷脂可以由市場上買到，或從多種植物(包括植物的某些部分)和動物中分離到。優選的植物是豆類，但是磷脂也可以從其他植物中分離得到，其他植物可包括豆科植物(扁豆和豌豆等)，但不僅限於此。磷脂還可以由純化的植物提取物中分離出來，純植物提取物包括了大豆糖漿、卵磷脂、部分提純的蛋白濃縮物、部分提純的蛋白水解物、和其他可從中提取脂的大豆成分，但不僅局限於此。本領域所屬技術人員能夠按照在此描述的方法來判斷，是否可以從特定種類的植物、植物提取物和植物的某些部分中分離出本發明所述磷脂。美國專利3,365,440中描述了可從豆類中提取到磷脂。
任何可以產生組合物磷脂的植物提取物或其某些部分都適用於本發明。可以利用的植物器官包括了莖、葉、根、花、根狀莖、和尤其是植物的儲存器官，如種子、塊莖和球莖，但不僅限於此。所用植物組成部分優選的是儲存器官。最優選使用的是乾燥的大豆種子。雖然在此使用了術語「種子」和「種子類」，但應該理解成任何可以產生至少一種本發明所述磷脂的植物組成部分。
可以採用所屬技術領域中任何已知的方法從植物中獲得磷脂，只要這些方法能夠純化得到至少一種本發明所述磷脂。所屬技術領域中，有許多已知的方法是用於純化和分析植物來源磷脂的。例如，參見Bligh和Dyer(1959)Can.J.Biochem.Physiol.37911-917；Patton等人(1982)J.Lipid Res.23190-196；Jungalwala(1985)Recent Developments inTechniques for Phospholipid Analysis，in Phospholipids in Nervous Tissues(編輯Eichberg)Jphn Wiley和Sons，第1-44頁；Hamilton等人(1992)的系列文獻，A Practical Approach(Rickwood等人編輯)IRLPress at Oxford Unicersity Press；和Kates(1986)Techniques ofLipidologyIsolation，Analysis and Identification in LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology(Burdon等人編輯)Elsevier。
磷脂還可以來自於動物。優選的動物是哺乳動物，最優選的是來源於肝臟細胞的磷脂。這種磷脂可以從市場上買到或採用所屬領域的已知方法從動物組織中純化得到。例如從動物和蛋的卵磷脂，或從WO95/15173所述的組合物中得到。
本發明所述的磷脂還可以採用所屬技術領域的已知方法來合成。適宜的半合成磷脂及它們的合成在Kates的Techniques of Lipidology(1972)中進行了描述。
可以使用不同純度的磷脂。純度可以採用任何已知的技術方法來進行分析，例如二維的TLC和HPLC，同時也對全脂、磷脂或磷酸酯進行分析。Kates概括了許多適當的方法。尤其是，磷脂必須達到足夠的純度，當它們被混合且總濃度大約是10mg/ml時，混合物可以經下述方法的聲處理得到相對透明的溶液。理想的情況是，磷脂至少達到90％的純度，更優選至少達到95％純度，最優選至少達到99％純度。
在應用中，磷脂可以結合也可不結合蛋白質。在此，「結合蛋白」是指任何能夠保護LPA使之保持其活性的蛋白。結合蛋白的實例包括白蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)和豌豆白蛋白，但是不局限於此。
能夠影響ElirexTM組合物活性的其他因素是磷脂的鏈長、不飽和度、是否含有膽甾醇、是否存在微團、脂質體、洗滌劑和乳化劑、及LPA中鏈的位置，即鏈是位於甘油的第一還是第二個碳原子上。毋庸置疑，聲處理可以導致脂質體和/或微團或其他多層脂質體的形成，引起ElirexTM活性的提高。短鏈LPA不如C16和C18鏈的LPA更有效。
不容懷疑的是，PA、PI、LPI、和LPC的存在被推斷為能夠保護LPA，使其不發生降解，並且可以提高LPA的生理作用。
本發明進一步涉及了製備ElirexTM組合物的方法。各磷脂的比例範圍分別地是(PA∶PI∶LPA∶LPI∶LPC)0-20∶5-20∶2-16∶0-4∶0-8。優選各磷脂的比例分別地大約是2-15∶8-15∶6-10∶2-4∶2-8。優選的組合物是其所含磷脂以大約10∶10∶8∶2∶4的重量比例混合。比例值的「大約」是指磷脂比例可以在接近多至15％的範圍內變化，但優選其變化不超過5％的範圍，更優選比例在±0.5％之間變化。
磷脂可以在任何緩衝溶液中混懸，優選pH值為5-8的含游離二價陽離子的溶液。例如D-PBS(磷酸鹽緩衝鹽水，游離的鈣和鎂鹽，GibcoBRL)或濃度是50mM的含有等滲氯化鈉的碳酸氫銨溶液。在用於治療的組合物中，優選那些可生理用緩衝溶液。很寬範圍的pH值都是有效的。優選pH介於5.5-8，即使任何使ElirexTM活性減小的pH值也可以被採用。我們發現混合物在pH為8時具有最高活性。優選的是，磷脂在濃度為50mM且用0.154M氯化鈉溶液配製的碳酸氫銨溶液中混懸，溶液pH值為7.7-8.0。
特別是，為了獲得最大活性可以將磷脂混合物破裂。可以採用任何不引起變性或不產生磷脂化學修飾的破裂方法，其包括了微流化、擠壓、和聲處理，但不限於此。通常將混合物進行聲處理直至產生光學透明度，只要不使混合物過熱聲處理就可以持續進行。本文具體例舉了優選的聲處理參數。此處的「光學透明度」是指混合物由不透明變成透明。該變化可以很容易地通過肉眼觀察到，而不需要更多地測定。然而，「透明」可以規定為混合物在600O.D.(光密度)的條件下吸收度小於0.2AU。
混合物濃度可以製成近50mg/ml。優選採用的濃度是10mg/ml。通常，間隔5分鐘進行一次聲處理循環，即5分鐘的聲處理，隨後5分鐘平衡化作用。然而，該過程可以根據所處理混合物的體積和聲處理產生熱量的多少而改變。
需要進行聲處理的混合物的濃度和體積、以及聲處理器的輸出功率決定了聲處理所需的總時間。聲處理必須持續直至混合物變為透明。通常，混合物需要3-90分鐘長的聲處理。優選的是，聲處理分成數個持續5分鐘的階段，共進行6-12次這樣的階段，每個階段間間隔1-5分鐘，以使混合物達到平衡及散熱。水浴溫度不超過約60℃；然而，混合物能夠經高壓熱處理但不損失活性。優選水浴的溫度不超過37℃。還優選經聲處理過的混合物在使用前應該進行無菌過濾。
ElirexTM的活性可以通過已知的多種抗細胞程序死亡試驗來測定。這些方法包括除去血清的C3H/10T1/2細胞試驗，該試驗通常可參見PCT公開號WO94/25621中的詳細描述，此試驗是優選的試驗方法，優選方法還包括該參考專利文獻實施例3中所述方法，但不僅僅局限於此。另外，體內細胞程序死亡抑制作用可以通過任何已知的方法進行測定。
本發明還涉及了含有已基本純化ElirexTM的治療用組合物。組合物所需的純度可以通過實驗來測定，所屬技術領域的技術人員是已知的。組合物適用於如下所述的多種疾病，並且同時適於人用和獸用。
通常，ElirexTM組合物是可藥用的，這是因為它們在治療劑量範圍內具備了低毒性、穩定性、及能夠和很多種載體進行混合以滿足多種途徑給藥的性能。ElirexTM可以單獨或與其他有效藥用試劑結合使用，其中有效藥用劑包括抗生素、創傷癒合劑、抗氧化劑和其他治療劑，但不僅僅局限於此。適宜的抗生素包括，氨苄青黴素、四環素、氯黴素和青黴素，但不只是這些。適宜的創傷癒合劑包括轉移生長因子(TGF-βs)、表皮生長因子(EGFs)、成纖維細胞生長因子(FGFs)和血小板來源生長因子(PDGFs)，但不局限於此。適宜的抗氧化劑包括維生素C和E，但不局限於此。
組合物含有至少有效治療量的一種ElirexTM，並且可以含有至少一種生理用載體。所用的可生理用載體應該是使用後不會對身體產生副作用，而且能夠使ElirexTM充分溶解以運送有效治療量的化合物。ElirexTM的有效治療量要部分地根據進藥的方式、需治療的病症、和本領域普通技術人員所熟知的其他依據來判斷。通常，有效治療量是指足夠緩解所治療病症中的細胞程序死亡、以及顯示出症狀改善跡象的用量。儘管由於病症的不同導致有效量範圍較寬，並且該有效量可以根據實驗來測定，但治序有效量通常是不低於0.0001％重量或1μg/ml。特殊病症的給藥途徑將在下面進行討論，對於本領域技術人員而言是易於理解的。
給藥途徑包括局部、透皮、腸胃外、經腸胃的、經支氣管和經肺泡的。局部給藥是通過局部塗敷含有有效治療量ElirexTM的膏霜、凝膠、漂洗劑等來完成的。局部給藥是通過局部施用膏霜、凝膠、漂洗劑等含有效治療量的ElirexTM的物質完成的。透皮給藥是通過塗敷膏霜、漂洗劑、凝膠等物質，以使ElirexTM能夠透過皮膚進入血流。腸胃外途徑的給藥包括直接注射，如靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下注射，但不只局限於此。腸胃內途徑給藥包括食入和直腸給藥，但不局限於此。經支氣管和經肺泡途徑給藥包括經口腔或經鼻腔的吸入，及直接注射到氣道中，如通過氣管造口術，但是不局限於這些。
當ElirexTM單獨局部塗敷時，可以根據需要將它們與可局部藥用或化妝品用載體共同製成混合物來給藥。此處的「局部可藥用載體」是指任何基本無毒的、局部給藥的常規用載體，載體中的ElirexTM能夠在直接應用於皮膚或黏膜表面時保持其穩定性和生物作用。例如，ElirexTM可以以常規方式溶解在液體中，或在介質中分散或乳化以形成液體製劑，或與半固體(凝膠)或固體載體混合以形成糊劑、粉劑、軟膏劑、膏霜、洗劑等等，但不局限於此。
適宜的可局部藥用載體包括水、石油膏(凡士林)、礦脂、礦物油、植物油、動物油、有機和無機蠟，例如微晶、石蠟和地蠟，天然聚合物，例如黃原膠、明膠、纖維素、膠原蛋白、澱粉、或阿拉伯樹膠，合成聚合物，例如在下面將討論的物質、醇、多羥基化合物等等。載體可以是水溶性載體組合物，它基本溶於水。這些水溶性的、可局部藥用的載體組合物不僅可以包括一種或多種上述適當的組分，還可以包括持續或緩慢釋放用載體，載體包括含水性、水分散性或水溶性組合物，例如脂質體、微綿體、微球或微囊、含水基質軟膏、油包水或水包油乳化劑、凝膠或類似物。
本發明的一個具體方案中，可局部藥用載體包括了長釋或緩釋用載體。載體是任何能夠長釋或緩釋ElirexTM以達到更有效給藥效果的物質，應用它們可以達到減少一次或數次ElirexTM的給藥次數和/或減少ElirexTM給藥劑量、易於使用、及延長或延緩對皮膚病症作用的效果。載體在任何油性、脂肪、蠟、或潮溼環境條件中，都能夠通過擴散或釋放作用將ElirexTM釋放於需治療的患處，這就要根據載體對ElirexTM的負載水平來決定，以便達到ElirexTM被釋放的效果。這類載體的非局限實例包括天然或合成的脂質體、微綿體、微球、或微囊等等。適於在潮溼環境中持續或緩慢釋放的載體實例包括明膠、阿拉伯膠、黃原烷聚合物；有ElirexTM負載水平的物質有木質素聚合物及其類似物；油性、脂肪或蠟質環境包括了熱塑性樹脂或軟質熱固性樹脂或高彈體，其中的熱塑性樹脂，例如聚滷乙烯、聚乙烯酯、聚偏滷乙烯和滷代聚烯烴，高彈體例如是brasiliensis、聚二烯、和滷代天然或合成橡膠；及軟質熱固性樹脂，例如聚氨基甲酸乙酯、環氧樹脂及其類似物。長釋或緩釋載體優選脂質體、微綿體、微球或凝膠。
本發明的皮膚病病症治療方法中，將所用的組合物直接塗敷在需治療的患處。若無特殊需要，局部用組合物將在所需部位維持大約24-48小時以釋放ElirexTM。
如果需要，可以將一種或多種的、在局部藥用或化妝品組合物的常規用附加成分與載體結合，例如增溼劑、溼潤劑、矯味劑、緩衝劑、顏料、防腐劑、維生素如A、C和E、乳化劑、分散劑、浸潤劑、氣味調節劑、膠凝劑、穩定劑、推進劑、抗微生物劑、防曬劑、酶等等。局部藥物製劑領域的技術人員能很容易地選擇出適當的特定附加成分和它們的用量。適當的附加成分的非限定性實例包括超氧化歧化酶、十八烷醇、肉豆蔻酸異丙酯、山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、丙二醇、水、十二烷基硫酸鹼金屬或鹼土金屬鹽、羥苯甲酸甲酯、辛基二甲基-對-氨基苯甲酸(Padimate O)、尿酸、網硬蛋白、粘多糖、羥乙基澱粉(例如，DuPontPentafraction)、透明質酸、蘆薈、卵磷脂、聚氧乙烯山梨醇單油酸酯。聚乙二醇、維生素A或C、生育酚(維生素E)、α-羥基或α酮基的酸如丙酮酸、乳酸或乙醇酸，或任何在美國專利4,340,586，4,695,590，4,959,353，或5,130,298和5,140,043中公開的局部用成分。
由於需治療的皮膚病病症是肉眼可見的，局部用載體還可以是局部化妝品用載體。此處的「局部化妝品用載體」表示任何基本無毒的、局部用化妝品的常規用載體，這些載體中的ElirexTM在直接塗敷在皮膚表面時仍然保持其穩定性和生物有效性。適當的化妝用載體是所屬領域技術人員熟知的，可以包括化妝用的液體、膏霜、油、洗劑、軟膏劑、凝膠、或固體，例如化妝晚霜、粉底霜、曬黑洗劑、防曬劑、手部洗劑、化妝品和化妝品基質、面膜等等，但是不局限於此。因此，局部化妝品用載體基本與可藥用載體相似，但常不相同；事實上，對於可藥用載體的早期探討也適於化妝品用載體。組合物可以含有其他化妝品常規組分，包括香料、雌激素、維生素A、C或E、α-羥基或α-酮基酸，例如丙酮酸、乳酸或乙醇酸，羊毛脂、凡士林、蘆薈、羥苯甲酸甲酯或丙酯、顏料及其類似物。
組合物中，治療皮膚病病症或疾病所需的ElirexTM有效量可以根據下列因素而改變，即皮膚症狀、皮膚老化程度、磷脂的特定比例或所用磷脂的純度、製劑和所用載體的類型、給藥頻率、被治療個體的整體健康狀況，及類似因素。所屬領域技術人員可以根據這些因素和本文內容來決定任何特定患者所需的準確用量。優選組合物在1天內至少給藥兩次但不超過六次，或者，當使用長釋或緩釋劑型時減少給藥次數。
局部、口服和腸胃外給藥的組合物通常含有佔組合物總重量約0.001％-10％重量的ElirexTM，優選含有約佔組合物0.01％-2％重量的ElirexTM，特別優選ElirexTM約佔組合物總重量的0.1％-1.5％。
局部用組合物的給藥是將其在需治療皮膚或黏膜的患處塗敷成覆蓋層或膜層。為了簡便，只將塗敷用物質擦抹在患處。塗敷是不需要將藥抹入皮膚內，形成的膜層或覆蓋層可在皮膚上保持過夜。
本發明所述組合物適用於透皮給藥，包括但不限於可藥用洗劑、混懸劑、油、膏霜、軟膏劑、漂洗劑、凝膠、以及脂質體載體，該脂質體載體是混懸於適當賦形劑中的，其中含有有效治療量ElirexTM。這些組合物直接塗敷在皮膚上，或與保護性載體混合，例如透皮製劑(稱為「貼劑」)。適當的膏霜、軟膏劑等實例，例如可以在Physician’s Desk Refernce中查到。適合的透皮製劑有具體的描述，如美國專利4,818,540(Chien等人)。
本發明涉及了適於腸胃外給藥的ElirexTM組合物，不只包括可藥用的無菌等滲溶液。這些溶液包括ElirexTM在靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下注射時所需的生理鹽水和磷酸鹽緩衝鹽水。
本發明涉及了適於經胃腸給藥的ElirexTM組合物，包括可藥用的、口服給藥的粉劑、丸或液體，及直腸給藥的栓劑，但不局限於此。
本發明涉及了適於經支氣管和經肺泡給藥的ElirexTM組合物，包括各種可藥用的、吸入用的氣霧劑，但是不僅是這些。以氣霧劑劑型給藥的具體藥物是五脒，該藥物是通過吸入給予AIDS病患者以預防由卡氏肺囊蟲誘發的肺炎。
本發明進一步涉及了適於經支氣管和經肺泡給予ElirexTM的裝置。該裝置包括但不限於霧化器和汽化器。本發明還涉及了電子注射和直接注射的裝置。電子注射，或稱離子電滲療法，是一種採用很小的電流使帶電荷的元素、化合物和藥物透過皮膚以使治療藥物轉運到局部組織或全身的方法，該方法不對皮膚造成破壞。
本發明涉及了適於移植前器官儲存的溶液。Chien等人(1993)在「Hibernation Induction Trigger for Organ Preservation」in MedicalIntelligence Unit，R.g.Landes Co.Ausin，TX.對適用的溶液進行了描述。ElirexTM可以用來，例如，代替和改進通常使用的極其不純的大豆製品。
上述組合物是為了說明適於本發明ElirexTM給藥的組合物，但不局限於此。生產不同種類組合物的方法是所屬領域技術人員所能夠了解的，在此不詳細描述。
生產適當注射用、局部塗敷用裝置，如霧化器和汽化器，的方法也是所屬領域技術人員所能夠了解的，在此不詳細描述。
本發明還提供了與細胞程序死亡相關的病症的治療方法，該方法包括給予一定量ElirexTM以有效地抑制細胞程序死亡。在這些方法中需給予有效治療量的、包括上述組合物在內的可藥用組合物。「有效治療量」是指能夠達到有效作用或所需臨床效果的量。有效治療量可以一次或多次給予。許多與細胞程序死亡相關的但能夠治療的疾病包括皮膚老化作用、局部缺血後的再灌注作用、免疫抑制、胃腸紊亂症、心血管紊亂、組織移植排異、創傷癒合、和阿爾茨海默氏病症，但不局限於此。
與免疫抑制有關的病症是由於多種刺激引起的，這些刺激包括病毒，包括但不限於HIV病毒，化療劑、和輻射。這些刺激引發了許多病症中的細胞程序死亡，不僅僅包括消化道組織和相關胃腸性的紊亂。
胃腸紊亂包括但不限於腸內膜損傷、嚴重的慢性潰瘍、結腸炎、輻射誘發的損傷、化療引發性損傷、寄生蟲導致的胃腸道紊亂症、和由任何其他原因造成的腹瀉。許多病毒性和細菌性感染會導致胃腸紊亂；ElirexTM還適合治療這些感染伴隨的副作用。ElirexTM特別適於用來改善化療引發的胃腸紊亂症。現已知道，用氨甲蝶呤和磷脂處理的大鼠與空白對照動物相比，遭受較小的餵食困擾且沒有腹瀉。如下所示，優選的ElirexTM實施方案比天然來源的、不純的磷脂混合物，有超過200％的抗細胞程序死亡活性。因此，ElirexTM不僅適用於預防化療誘發的腹瀉還可以預防噁心。
ElirexTM尤其適於治療動物的各種胃腸疾病，特別是家畜。這些病症，尤其是腹瀉，造成許多幼仔損失。胃腸疾病的治療優選以胃腸方式給藥。對於家畜，有效量的ElirexTM通常是與飼料混合在一起。對於人，可以通過任何所屬領域所熟知的胃腸給藥方法來給予。優選口服。
另外，可以將ElirexTM給予免疫缺損患者，尤其是HIV-陽性患者，以達到預防或至少是緩解那些與疾病有關的T細胞的程序死亡，該細胞程序死亡會導致免疫缺損症惡化，正如所看到的那樣，病人體內會患上惡性膨脹的AIDS。優選通過腸胃外方式給予這類患者以ElirexTM，但也可以是透皮或經胃腸給藥。
ElirexTM還可以用來治療與再灌注損傷相關的細胞程序死亡，該再灌注損傷涉及多種疾病，包括但不限於冠狀動脈梗阻、大腦梗塞、脊柱/頭部創傷和伴隨性的嚴重麻痺、其他損害造成的再灌注損傷，例如凍傷，以及任何以往認為可以用超氧化物歧化酶(SOD)治療的病症。氧自由基在心臟疾病中的作用的綜述可以參見Singal(1988)「Oxygen Radicals in thePathophysiology of Heart Disease」Kluwer Academic Publishers，MA，USA.。
心肌梗塞和腦梗塞通常是由突發性動脈或靜脈血供應不足造成的，這種供血不足是由氣栓、血栓、或壓力引起並造成微小區域的壞死；心臟、腦、脾、腎、腸、肺和睪丸都容易受到影響。血液再灌注造成梗塞，而細胞程序死亡則出現在梗塞區域的周圍組織中；因此，須在剛形成梗塞在再灌注過程中或梗塞形成後很短時間內就給予ElirexTM，這樣才能達到治療效果。
因此，本發明涉及與再灌注相關的細胞程序死亡的治療方法，該方法包括給予需要這種治療的患者以有效治療量ElirexTM。
本發明進一步涉及減輕與心肌和大腦梗塞有關的細胞程序死亡和再灌注損傷的方法，患者在梗塞時會有心臟病發作和心臟搏動的危險，該方法是給予需要這種治療的患者以有效治療量的ElirexTM。
優選腸胃外給予本發明所述組合物來治療再灌注損傷。任何其他適合的方法也可使用，例如心肌梗塞時直心臟注射。這種注射的裝置是所屬領域技術人員熟知的，例如，Aboject心肌注射器。
本發明還涉及了在哺乳動物器官、組織、和細胞培養與保藏過程中抑制和預防細胞發生程序死亡的方法。該方法是將有效量的ElirexTM加入到任何種的介質或溶液中，該介質和溶液是所屬領域中常用於培養或保藏哺乳動物器官、組織、和細胞的。
本發明又涉及了技術人員所熟知的、用於培養和保藏哺乳動物器官、組織和細胞的介質和溶液，該介質和溶液中含有一定量的ElirexTM，以有效地抑制或預防培養細胞發生的程序死亡。
本發明上述方面涉及了哺乳動物細胞培養用介質，該介質包括至少一種有效量的ElirexTM，及應用該介質來抑制或預防哺乳動物細胞培養中的細胞程序死亡。有效量是指能夠降低細胞程序死亡速率的量。現在發現，ElirexTM能夠抑制或預防細胞在受到輕度損傷情況下發生的細胞程序死亡，這種損傷通常會誘發細胞程序死亡。這種損傷包括但不限於低度輻射、冷凍細胞貯存物的解凍、溫度、pH、滲透性、或培養介質離子濃度的快速改變、長期在不適溫度、pH、滲透性、或培養介質離子濃度下暴露、與細胞毒素接觸、原始細胞培養製備中細胞從完整組織解離下來、無血清生長(或無血清介質中的生長)。
本發明涉及了含有組織培養介質和有效量ElirexTM的組合物。將ElirexTM作為抗細胞程序死亡介質添加劑加入到無血清介質中，無血清介質包括但不限於AIM V介質、Neuman和Tytell’s無血清介質、Trowell’s T8介質、Waymouth’s MB752/1和705/1介質、和Williams』介質E。除了無血清介質以外，還有其他適當的哺乳動物細胞培養介質，該培養介質也能夠與作為抗細胞程序死亡介質添加劑的ElirexTM混合，包括Eagel基礎培養基、Fisher’s介質、McCoy’s介質、介質199、RPMI介質1630和1640、以F-10F-12營養混合物為基礎的介質、Leibovitz’sL-15介質、Glasgow極限必需介質、和Dulbecco改進的Eagle介質，但是不僅限於此。可含有ElirexTM的哺乳動物細胞培養介質還可以進一步是任何所屬領域技術人員已知的介質添加劑，包括蔗糖、維生素、激素、金屬蛋白質、抗生素、抗真菌素、生長因子、脂蛋白和血清，但不限於此。
本發明還涉及哺乳動物移植前用的器官保藏溶液，以及這種溶液應用於抑制或預防哺乳動物器官在移植前的手術摘除和外科處理中的細胞程序死亡，其中該溶液包括有效量的ElirexTM。就所有情況而言，抑制和預防細胞程序死亡所需的ElirexTM濃度可以通過所屬領域技術人員按照例如本發明下列實施例所描述的方法，以及本領域其他已知的方法進行實驗性測定。
ElirexTM被認為可以局部塗敷在皮膚上以治療多種皮膚病病症。這些病症包括但不限於衰老造成的皺縮或鬆弛和/或失去光澤或鱗皮病。從而本發明涉及了皮膚病治療方法。另外，禿髮是由毛囊細胞程序死亡造成的。因此，適合採用ElirexTM的皮膚局部治療方式來防止連續脫髮。Stenn等人(1994)J.Invest.Dermatol.103107-111。
如上所述，優選採用含有效量ElirexTM的組合物的局部塗敷方式來治療這些病症。有效量的ElirexTM是指可以改善或減輕皮膚病症狀的用量。尤其是，能夠達到消除皮膚病病症或恢復正常皮膚功能的治療效果；然而，本發明也包括所有對疾病症狀的改善或緩解。
下來的實施例是用來說明本發明，但不局限於此。實施例1最佳重組混合物的合成將從市場購買到的純化大豆磷脂PA、PI、LPA、LPI、LPC(例如，得自AvantiPolar Lipids，Inc.)懸浮在pH為8.0且含有154mM NaCl的50mM碳酸氫銨溶液中，或含有游離二價陽離子的pH在5-8範圍內的緩衝水溶液中。可以使用總濃度大於10mg/ml的磷脂溶液，但需經聲處理後達到透明。所用磷脂的最高總濃度大約是50mg/ml。
通常，磷脂混合物混懸在緩衝液中，混合物放置在一次性的硼矽酸鹽玻璃杯中，優選使用2-3ml的16×100mm的試管或1.2ml的13×100mm試管，或1ml的12×75mm試管。然後將混合的磷脂進行聲處理。優選採用小型浴式聲處理器，例如帶有大小為9×19cm橢圓型浴槽的Branson200型聲處理器，聲處理頻率是40kHz並且耗電率是24W。水浴溫度在21-40℃範圍內。優選在25-37℃之間。水位高度調至接近於試管內磷脂混合物的高度。另外，還可以採用探針式聲處理器(Fisher Scientific SonicDismenbrator model 550)進行處理，但是要防止混合物過熱。
混合物進行聲處理的時間是在3-90分鐘內，該聲處理過程中，先進行5分鐘聲處理，隨後放置5分鐘以使混合物達到平衡，將聲處理過程和平衡過程交替進行直至混合物變成透明溶液，並且該混合物能很容易地通過濾器而被吸入到孔徑是0.22μm的5ml注射器內。
ElirexTM在不同溫度下的穩定性如附圖1所示。ElirexTM是在4℃、室溫、和65℃下儲存一周。所得結果表明，ElirexTM在65℃條件下儲存會造成活性損失，但在4℃或室溫下沒有發生顯著的活性損失。
各磷脂組分的最佳比例可以通過將各純化磷脂以不同比例混合、並且每次改變一種磷脂組分的方法來測定。實施例2中對各種混合物抗細胞程序死亡活性進行了分析。當確定最佳相對配比後，可以通過改變最有效磷脂組分的比例來發現最佳絕對活性。下表表示最終測試的配比。
所得結果如附圖5-6所示。LPA的濃度隨鏈長度進行改變，以測定這些參數對活性的作用。ElirexTM在不向溫度下的穩定性如附圖1所示。實施例2採用C3H/10T1/2細胞進行的細胞程序死亡分析試驗為了測定ElirexTM的抗細胞程序死亡活性，採用下面所述試驗。PCT公開號WO94/25621和WO95/15173中描述了細胞分析試驗。簡單地說，將C3H/10T1/2克隆8細胞在50-58％融合的條件下和呈指數生長期下進行分析試驗，該細胞指數生長期是隨機分布的細胞周期位置，沒有處於G0期和靜止狀態的細胞。在試驗開始前，將2000個細胞/ml(5ml，在60mm培養平板中)育種5天，以使細胞呈指數生長狀態。當T＝0時，將作為細胞程序死亡刺激因素的培養物轉移到無血清介質中，將種子提取物加入其中。空白對照物含有10-7和5×10-1M的12-O-十四烷醯佛波醇-13-乙酸酯(TPA)，以保證細胞培養的反應性。將ElirexTM樣品加入無血清介質中，並且當加入到培養基之前將其無菌過濾。分析試驗以一式三份或四份的平行試驗進行。細胞應答試驗是在含有或不含有ElirexTM的無血清物中在18-28小時間進行。在各自含有不同細胞數量的細胞培養平板中進行兩種分析試驗。
1.將所有非粘附性或鬆散粘附細胞從培養皿中轉移出來並採用適當的技術來計數，通常是使用電子顆粒計數器。這些是程序死亡性細胞，即無血清釋放細胞(SDR)，是在無血清介質培養的作用中釋放出來的。通過紫外結構分析和DNA片段分析法看出，這些釋放細胞中的近95％是程序死亡細胞。
2.將保留的粘附性細胞與緩衝液接觸，常採用的緩衝液是平衡鹽溶液，例如pH為7.3、不含有鈣和鎂鹽的、含有0.05％胰蛋白酶和0.53mM乙二胺四乙酸(EDTA)的Hanks平衡鹽溶液。在室溫或37℃條件下將各培養物溫育，該溫育是在振搖平臺上進行，這樣可以保證胰蛋白酶試劑能均勻分布在培養物表面。當達到標準時間階段後，通常是10分鐘，將釋放細胞從各培養皿中轉移出來，並且按照上述的方法測定，通常採用電子顆粒計數法。該ADH細胞計數包括了胰蛋白酶耐受性細胞和胰蛋白酶敏感細胞，如PCT WO94/25621所述。
抗細胞程序死亡活性是以計算出來的材料濃度(μg/ml的介質)來表示，該濃度是指能夠使50％經無血清處理釋放的細胞存活的濃度。
由程序死亡細胞試驗中得到的結果如附圖7-8所示。在附圖中，發生程序死亡的細胞(SDR)和粘附性細胞(ADH)的百分率是分別表示的。附圖所示數據證明，ElirexTM組合物有效地減少了融合細胞的程序死亡，該結果是相比於Eagle基礎培養基(BME)的無血清空白對照而言的。實施例3pH和鹽濃度對ElirexTM的抗細胞程序死亡活性的影響在不同的pH和鹽濃度條件下測定ElirexTM組合物的抗細胞程序死亡活性。
ElirexTM活性測定是按照實施例1中所述，將磷脂重新混懸在pH為8.0的碳酸氫銨、或pH為6.5的磷酸鈉、或pH為6.5的HEPES、或pH為5.0的醋酸鈉溶液中，上述溶液的濃度都是50mM並且含有154mM(等滲)氯化鈉。附圖1表示所得的結果，其中pH為8時活性最高。
為了測定溶液所含鹽濃度對活性的影響，將pH.為8的溶液在氯化鈉濃度分別為0、100、500和1000mM的條件下進行測定。為了處理細胞，所有樣品都先製備成濃溶液，然後用BME稀釋。最佳鹽濃度是在100-200mM之間，但結果並沒用圖表示。
還做了不同溫度下的貯藏穩定性試驗。所有溶液在4、37和69℃下儲存一周然後測定它們的活性。所得結果在附圖1中表示。
最佳的溶液是含有105mM氯化鈉的50mM溶液碳酸氫氨溶液，該溶液pH值為8，並且儲存在4℃條件下。
雖然本發明通過一些具體的說明和實施例來使本發明發明目的易於理解，但很顯然地是，所屬領域的技術人員一定能夠在實際工作中作出進一步的改進和修飾。因此，本發明的說明和實施例不能作為本發明保護範圍的限定，本發明將在權利要求書中另有規定。
權利要求
1.一種具有抗細胞程序死亡活性的組合物，該組合物包括(a)磷脂酸(PA)；(b)磷脂醯肌醇(PI)；(c)溶血性磷脂酸(LPA)(d)溶血性磷脂醯肌醇(LPI)；和(e)溶血性磷脂醯膽鹼(LPC)；其中各磷脂基本上是純的磷脂。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中，各磷脂的含量比例是在約分別0∶5∶2∶0∶0-20∶20∶16∶4∶8的範圍內。
3.根據權利要求1所述的組合物，其中各磷脂的含量比例是在約2∶8∶6∶2∶2-15∶15∶10∶4∶8的範圍內。
4.根據權利要求1所述的組合物，其中各磷脂含量比例是在大約4∶16∶12∶4∶4-7.5∶7.5∶5∶2∶4的範圍內。
5.根據權利要求1所述的組合物，其中各磷脂含量比例約是分別10∶10∶8∶2∶4。
6.根據權利要求1所述的組合物，其中的磷脂是來源於植物、動物或經合成得到，但其中LPA是非動物性來源的。
7.根據權利要求6所述的組合物，其中，動物來源的磷脂是從肝臟中提取的。
8.根據權利要求1所述的組合物，其中組合物已經聲處理。
9.根據權利要求8所述的組合物，其中，進行的聲處理直至使組合物呈透明狀。
10.根據權利要求8所述的組合物，其中，聲處理所持續的時間大約是3-90分鐘。
11.根據權利要求8所述的組合物，其中聲處理過程是將聲處理過程和平衡過程交替進行，各過程分別持續5分鐘。
12.根據權利要求8所述的組合物，其中，聲處理時使組合物溫度不得高於60℃。
13.根據權利要求1所述的組合物，還包括可生理用緩衝液。
14.根據權利要求13所述的組合物，其中的緩衝液pH值約在5.5-8.0之間。
15.根據權利要求14所述的組合物，其中的緩衝液的pH值是約8.0。
16.根據權利要求1的組合物，其中所含磷脂的總濃度大約為10mg/ml。
17.一種製備具有抗細胞程序死亡活性組合物的方法，該方法包括的步驟是(a)將一定量的下列物質，以能夠產生抗細胞程序死亡活性的比例混合，並且溶於可生理用的緩衝液中，這些物質是(i)磷脂酸(PA)；(ii)磷脂醯肌醇(PI)；(iii)溶血性磷脂酸(LPA)(iv)溶血性磷脂醯肌醇(LPI)；和(v)溶血性磷脂醯膽鹼(LPC)。(b)將磷脂/緩衝液混合物進行聲處理。
18.根據權利要求17的方法，其中磷脂可以是來自植物、動物或合成來源的，但其中LPA是非動物來源的。
19.根據權利要求18所述的方法，其中動物來源的磷脂是從肝臟提取的。
20.根據權利要求18的方法，其中所含磷脂的總濃度大約為10mg/ml。
21.根據權利要求17所述的方法，其中，持續進行聲處理直至磷脂組合物呈透明狀。
22.根據權利要求17所述的方法，其中聲處理所持續的時間大約是3-90分鐘。
23.根據權利要求17所述的方法，其中的聲處理是將聲處理過程和平衡過程交替進行，各過程分別持續5分鐘。
24.根據權利要求17所述的方法，其中聲處理時組合物溫度不得高於60℃。
25.根據權利要求17所述的方法，其中緩衝液的pH值是約8.0。
26.根據權利要求25所述的方法，其中，緩衝液是選自含碳酸氫鹽的一系列溶液。
27.根據權利要求1、7、19或21所述方法製得的組合物。
28.一種細胞程序死亡的治療方法，包括給予需要這種治療的患者以有效治療量的可藥用組合物，該可藥用組合物含有權利要求27所述的組合物。
29.根據權利要求28所述的方法，其中患者患有胃腸性紊亂。
30.根據權利要求29的方法，其中，胃腸性紊亂是由刺激因素引起，這些刺激是選自人體免疫缺陷病毒、化療劑和輻射和那些有關的傳染性疾病。
31.根據權利要求29所述的方法，其中，胃腸性紊亂是由於炎性腸疾病。
32.根據權利要求30所述的方法，其中的傳染性疾病選自由致腹瀉性生物引發的一系列疾病。
33.根據權利要求31所述的方法，其中該治療能夠減輕與免疫抑制病毒、化療劑、或輻射和免疫抑制藥物有關的病症。
34.根據權利要求33所述的方法，其中的病毒是人體免疫缺陷病毒。
35.根據權利要求28所述的方法，其中患者患有與局部缺血和/或在局部缺血後再灌注有關的細胞程序死亡疾病。
36.根據權利要求35所述的方法，其中的再灌注與冠狀動脈梗阻；腦梗塞；脊柱/頭部創傷和嚴重的並發性麻痺和凍傷有關。
37.一種組合物，該組合物含有組織培養介質和有效量的、如權利要求27所述的組合物。
38.一種預防培養細胞中發生細胞程序死亡的方法，該方法包括用權利要求27所述的組合物處理細胞。
39.根據權利要求38所述的方法，其中的細胞是哺乳動物細胞。
40.根據權利要求39所述的方法，其中細胞是人體細胞。
41.根據權利要求38所述的方法，其中的細胞是昆蟲細胞。
42.根據權利要求39所述的方法，其中的細胞來源於組織或器官的某部分。
43.一種器官保藏的方法，該方法包括在儲存器官的溶液內加入有效量的、如權利要求27所述的組合物。
44.一種器官保藏的方法，該方法包括給予受體動物至少一個靜脈內型藥物團，該靜脈內藥物含有有效量的如權利要求27所述組合物。
45.一種治療皮膚病的方法，該皮膚病與細胞程序死亡有關，該治療方法包括採用局部給予方式，給予需要這種治療的患者以有效治療量的可藥用組合物，該組合物包括了權利要求27所述的組合物。
46.根據權利要求45所述的方法，其中的皮膚病是指皮膚的皺縮、鬆弛、鱗皮病、禿髮或脫髮。
47.根據權利要求46所述的方法，其中權利要求27所述組合物是膏霜劑或軟膏劑或凝膠劑。
48.一種治療創傷的方法，該方法包括給予有效量的含有權利要求27所述的組合物。
全文摘要
本發明涉及了一種具有抗細胞程序死亡活性的組合物,該組合物包括磷脂酸、磷脂醯肌醇、溶血性磷脂酸、溶血性磷脂醯肌醇和溶血性磷脂醯膽鹼。
文檔編號A61K41/00GK1200036SQ96197739
公開日1998年11月25日 申請日期1996年9月13日 優先權日1995年9月14日
發明者I·C·巴特斯特, M·W·弗爾, J·G·古達德, L·D·託美爾 申請人:Lxr生物技術有限公司