膠體金層析法抗Sp100抗體檢測試紙的製作方法

2023-04-30 06:11:01 1

專利名稱：膠體金層析法抗Sp100抗體檢測試紙的製作方法
技術領域：
本實用新型屬於醫學免疫應用領域，具體涉及到利用膠體金免疫層析技術檢測抗 SplOO抗體的試紙。
背景技術：
在PBC患者體內可檢出多種自身抗體，如抗核抗體(ANA)、抗線粒體抗體(AMA)、抗平滑肌抗體(SMA)、抗肝腎微粒體抗體(LKM-I)抗可溶性酸性核蛋白(SplOO)抗體、抗核膜糖蛋白(Gp210)抗體、抗早幼粒細胞白血病蛋白(PML)、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/ LP)抗體等，其中最主要的抗體是AMA，PBC常伴有高滴度的AMA，病程早期就出現AMA是本病的特點。AMA於1965年由WalRer等在PBC患者血清中用間接免疫螢光法首次發現，其後的研究顯示，PBC患者的AMA陽性率可高達90%，此項檢測已成為PBC診斷的主要檢查項目。 (Neuberger J,Thomson R. PBC and AMA -what is the connection[J]. Hepatology,1999, 29(1)265 271)其AMA-M2在PBC中敏感性可達90%以上，仍有10% AMA-M2陰性的PBC患者需其他的免疫學指標來對這部分患者進行檢出([1]高榮凱.原發性膽汁肝硬化臨床分析.[J].中國實用醫藥.2009,4(1) :116-117.)。除AMA外，一部分患者血清中也存在ANA，血清抗核抗體(ANA)陽性的PBC患者大約佔50%左右。PBC患者常見的ANA免疫螢光有細胞核斑型、多核點型、核膜型、著絲點型、核仁型。多核點型和核膜型ANA對PBC患者有較高的特異性，可作為AMA陰性患者診斷 PBC 血清學指標。(Luettig B, Boeker K H, Schoessler W, et al. The antinucIear autoantibodies SplOOand gp210persist after orthotopic liver transplantation in patients with primary biliary cirrhosis [J]. J Hepatol, 1998,28(5) :824-828),其中多核點型的免疫螢光模式，是在除核仁以外的整個細胞核中出現3 20個不同大小的點 (大小 13 IlOym)。SplOO和早幼粒細胞白血病蛋白(PML)均產生多核點型免疫螢光模式，它們定位於核體結構中，為PBC特異性自身抗體的靶抗原。抗SplOO抗體的檢出可避免對AMA陰性 PBC患者診斷的遺漏和延誤。(邵傑，魏來，王豪，等.原發性膽汁性肝硬化患者中多核點型抗核抗體的檢測.[J].世界華人消化雜誌，2005，13 (12) :1478-1481.)抗SplOO抗體是PBC 特異性自身抗體，其特異性幾乎為100%。(劉妍，閆惠平，檀玉芬等.原發性膽汁性肝硬化患者抗SplOO抗體與核點型抗核抗體的檢測· [J]·臨床檢驗雜誌2009，27 (4) :256-258.)SplOO蛋白和PML蛋白共同定位於核點(也稱核體)，被稱為核點蛋白，二者與PBC 患者血清反應呈現相似的螢光表現一核點型，但二者是完全不同的抗原分子。它們的功能尚不清楚，但其結構包括一個鋅指結構和可能具有調節活性的DNA結合域，SplOO還有類似於MHC-I抗原結合部位保守區域的序列。核點蛋白在核上的表達受病毒感染、幹擾素等因素的影響。最初的免疫印跡方法表明SplOO抗原是分子量100KD左右的分子，但通過克隆表達得到的是一個編碼480個胺基酸組成，分子量為53KD的分子，因其在凝膠電泳時表現為100KD的反常的遷移率，故命名為SplOO。通過基因片段噬菌體展示肽庫技術分析SplOO的主要線性表位是四6-311及 332-351兩個區域，反應核心分別是SNSKVE/EPLEVFISA。抗SplOO抗體在免疫螢光方法中常表現為多核點型(multiple nuclear dots, MND)，即間期細胞可見3 20多個點狀顆粒，大小不同且分布在整個細胞核，胞漿無螢光， 易誤為抗著絲點抗體(ACA)，但ACA可使分裂期細胞染色體著色呈現典型表現，其顆粒數目較恆定，且大小均勻。目前以重組SplOO為抗原，用ELISA法檢測該抗體，敏感性及特異性都較IIF法提高。Szostechi等檢測PBC患者抗SplOO抗體陽性率為31%，而在其他自身免疫病(如 SLE、PSS、MCTD、PM/DM等0中其陽性率 ^ ^ (immunoblotting test, IBT) > ^^^^^ff fi (Line immuno assay, LIA)等。間接免疫螢光，觀察結果需要專業人員操作特殊的儀器設備，間接免疫螢光法存在檢測時間長但須有螢光顯微鏡觀察結果，技術程序比較複雜，並有一定的主觀人為判斷誤差，另外易受其他幹擾產生假陽性，標準化困難，也不適合高通量標本的檢測。酶聯免疫吸附法，需多次加樣和洗滌步驟，完成整個實驗過程需三小時左右。ELISA法檢測可用於高通量標本測定，靈敏度也較高，目前被廣泛認可，但操作比較繁瑣，需多次加樣和洗滌，需酶標儀，亦需要專業免疫學技術人員在實驗室中進行實驗操作，易受人員和場地的限制，同時易受各種溫度和孵育時間等環境條件因素的影響，對試驗帶來諸多不便。[0017]線性免疫分析法主要用於疾病大類的篩查，針對性相對較差，同時也不適合高通量樣本的檢測。目前市場上商品化抗SplOO抗體檢測試劑盒主要為免疫印跡法，雖綜合了 SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，但操作相對複雜，完成整個實驗過程需三小時左右，亦需要專業免疫學技術人員在實驗室中進行實驗操作，同時易受各種溫度和孵育時間等環境條件因素的影響，對試驗帶來諸多不便。膠體金層析法應用到抗SplOO抗體的檢測中。膠體金免疫層析法 (gold-immunochromatography assay, GICA)是應用膠體金標記技術，以膠體金作為示蹤物，以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細效應使樣品溶液在層析條上泳動，使樣品中的待測物與結合墊上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發生免疫反應，並與條狀纖維層析材料上的抗原(或抗體)發生免疫反應而被截留，進而形成肉眼可見的紫紅色條帶，得到直觀的實驗結果，達到快速檢測的目的(Sikowicz G et al. One-step chromatographic immunoassay for qualitative determination of choricogonadotropin in urine. Clin Chem. 1990(36) 1579-1586.)。使用時只將樣品加樣到樣品墊上，數分鐘就根據檢測線上紫紅色條帶出現情況來判斷陰陽性結果。與其他檢測方法相比，檢測時間短，只需要5 10 分鐘，操作人員無需培訓，操作簡便、快速，無需低溫保存，儲運方便等優勢。在自身免疫性疾病方面，目前國外市場上出現了一些檢測自身免疫疾病的試紙條產品，但抗SplOO抗體的膠體金免疫試紙在國內外市場上仍沒有問世。

實用新型內容本實用新型所要解決的技術問題是為了克服以上方法學的不足，將膠體金層析法應用到抗SplOO抗體的檢測中，同時首次將SplOO抗原蛋白應用到膠體金層析法中，採用間接法來實現血液中的抗SPlOO抗體檢測，實現高特異、高靈敏度、高準確性的檢測性能，快速篩選出抗SPlOO抗體的陽性樣本，能快速、便捷地輔助診斷原發性膽汁肝硬化。本實用新型所要解決的技術問題在於提供一種膠體金層析法抗SplOO抗體檢測試紙。本實用新型所要解決的技術問題可以通過以下技術方案來實現一種膠體金層析法抗SplOO抗體檢測試紙，包括有樣品墊、結合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊，所述樣品墊、結合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊由底板的一側依次向所述底板的另一側相互搭接粘貼在所述底板上，其特症在於所述的結合墊包被有金標抗體a層和金標抗體b層；所述的硝酸纖維素包被膜上設置有檢測線和質控線，所述的檢測線包被有SplOO 抗原蛋白層，所述的質控線包被有金標抗體c層。進一步，所述的金標抗體a層中的抗體A為抗人IgG單克隆抗體、抗人IgG多克隆抗體、葡萄球菌A蛋白(SPA)、鏈球菌G蛋白(Protein G)中的一種或多種。所述的抗人IgG多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種。所述的抗人IgG單克隆抗體為羊源或兔源中的一種。所述金標抗體a中的抗體A優選為葡萄球菌A蛋白。所述的金標抗體b層中的抗體B和金標抗體c層中的抗體C同時或不同時為單克隆抗體或多克隆抗體中的一種，其中金標抗體b層中的抗體B和金標抗體c層中的抗體C 可發生特異性結合形成免疫複合物。所述的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種，單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。所述的金標抗體b中的抗體B優選為兔IgG，相應地金標抗體c中的抗體C優選為羊抗兔IgG0所述的檢測線上包被的SplOO抗原蛋白層為通過原核表達克隆化基因獲得的 SplOO抗原蛋白層。所述SplOO抗原蛋白是通過大腸桿菌原核表達的克隆化基因所獲得的重組蛋白。所述樣品墊的樣本來自人血清、血漿、全血樣本。根據本實用新型應用的單克隆抗體可通過由Kohler等(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J]. Nature,1975(256) 495-497)首先描述的雜交瘤法進行製備，或者可通過重組DNA法進行製備(見美國專禾Ij 4816567)。"單克隆抗體，，由 Clackson 等(Making antibody fragments using phage display libraries[J]. Nature, 1991 :624-628)禾口 Marks 等(By-passing immunization Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage[J]. Journal of Molecular Biology, 1991 :581-597)所述技術從噬菌體抗體文庫中分離。根據本實用新型應用的多克隆抗體可通過陳學清等(免疫學常用實驗方法.[M]， 2000 :15-26)通過免疫動物來製備。本實用新型的SPAlrotein G通過原核表達克隆化重組基因，由J.薩姆布魯克等 (分子克隆實驗指南.[M]，2002:12^-1232)描述的大腸桿菌原核表達克隆化基因。本實用新型的膠體金層析法抗SplOO抗體檢測試紙的應用，其是定性檢測人血清中抗SplOO抗體，輔助診斷早期原發性膽汁肝硬化。本實用新型的檢測原理具體為選用親和層析純化的重組表達的SP100抗原蛋白， 金標抗體a和金標兔IgG作為膠體金標記複合物，噴塗於結合墊，利用間接法來檢測血清樣品中是否含有抗SP100抗體。檢測時，樣本隨著層析泳動到結合墊並浸潤膠體金標記複合物，其中的人IgG和金標抗體a結合形成人IgG-金標抗體a複合物，由於毛細效應，此人 IgG-金標抗體a複合物沿包被膜泳動向前，若血清樣品中有抗SP100抗體，此人IgG-金標抗體a複合物與包被於硝酸纖維素膜上的抗原蛋白發生特異性免疫結合反應，形成金標抗體a-人IgG-SplOO抗原蛋白三聯體複合物而被截留在檢測線上，逐漸富集形成較深的紫紅色條帶；由於毛細效應繼續泳動向前，金標兔IgG與包被在質控線上的羊抗兔IgG發生特異的免疫反應被截留，逐漸富集在質控線上形成較深的紫紅色條帶，多餘的未結合的物質繼續層析到吸水墊上，因此在檢測線和質控線都出現條帶的判為陽性結果；若血清樣品中不含有抗SP100抗體，金標抗體a到達檢測線時，不與包被在檢測線上的抗原蛋白發生免疫反應，因此在檢測線處沒有出現紫紅色條帶，金標抗體a繼續泳動向前到達吸水墊，而金標兔IgG繼續泳動向前與包被於質控線處羊抗兔IgG發生特異的免疫反應而被截留，逐漸富集在質控線上形成紫紅色條帶，因此僅在質控上出現條帶判為陰性結果。本實用新型將基因工程菌表達的抗原蛋白首次引入到試紙條中，實現了高特異性、高靈敏度、高準確度的檢測性能。目前市面上也出現了商品化ELISA試劑盒，但金標層析試紙與之相比，仍有諸多不同之處，不受場地人員之限，檢測時間短即5-10分鐘，判讀結果簡便。此外該試紙具有高特異性、高靈敏度、高準確度，能滿足市場的快速篩選PBC，為病人及早診斷治療提供條件，同時，也能滿足基層實驗室、即時檢測、床邊檢測的需求。與現有的檢測方法相比，本實用新型優點1.本實用新型的獨特性在於基因重組表達的SplOO抗原蛋白首次應用於膠體金層析試紙，大大提高了其檢測靈敏度，通過膠體金試紙可快速篩選出抗SPlOO抗體所有陽性樣本(能檢出大於25RU/ml的樣本)。2.本實用新型的優點是生產成本低。本實用新型所提供的抗SP100抗體的檢測試紙所需的核心試劑是抗體A即抗人IgG或SPA或PROTEIN G、抗體C、抗體B、抗原蛋白，其單條試紙所用試劑量少，且可通過購買商品化試劑或自製，抗原蛋白來源於自製的純化基因工程抗原蛋白。3.與已公開的用於抗SP100抗體檢測的其他方法相比，本實用新型的試紙具有許多其他方法所不能比擬的優點，如檢測時間短(5 IOmin)；不需要任何特殊儀器，可實現床邊檢測和門診即時檢測；操作簡便，只需一步反應，操作人員無需培訓，檢測成本低；對溫度無特殊要求，無需冷凍，儲存運輸方便，室溫可保存M個月。

圖1為本實用新型的側面結構示意圖。圖2為本實用新型的檢測結果示意圖。其中圖加所示為加樣後，反應3 5min即可看到檢測區D和控制區E相應位置上出現紫紅色條帶；圖2b所示為當控制區E和檢測區D均出現紫紅色條帶，結果為陽性，說明血清中含有抗SplOO抗體；圖2c所示為如只在控制區E出現一條紫紅色條帶，檢測區D不出現紫紅色條帶， 結果為陰性，說明血清中不含抗SplOO抗體；圖2dJe所示為如控制區E不出現紫紅色條帶，無論檢測區D是否有條帶出現， 都說明試紙失效。
具體實施方式
本實用新型所述的膠體金免疫層析法抗SplOO抗體檢測試紙，如圖1所示，該試紙是在底板7上由一側向另一側順次相互搭接地粘貼硝酸纖維素包被膜3、結合墊2、樣品墊 1、吸水墊6。結合墊2上包被有金標抗體a層和金標抗體b層，金標抗體a層的抗體A為羊抗兔IgG金標抗體或鼠抗人IgG金標抗體或葡萄球菌A蛋白(SPA)金標抗體或鏈球菌G蛋白金標抗體；金標抗體b層中的抗體B為兔IgG。硝酸纖維素包被膜3上設置有檢測線4和質控線5，檢測線4包被有Cenp-B抗原蛋白層，質控線5包被有金標抗體c層，金標抗體c層中的抗體為羊抗兔IgG。下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本實用新型。[0058]實施例ISplOO抗原蛋白製備應用於本試紙的SplOO抗原蛋白是通過基因克隆技術構建重組基因，然後採用原核表達技術成功表達出全部為人源的SplOO抗原蛋白。其中，SplOO抗原蛋白來源於純化基因工程抗原蛋白。實施例2抗體製備抗體A及抗體C、抗體B用下述方法來製備。其中抗體A中的抗人IgG、抗體C及抗體B—般可通過在動物上經多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射純化的免疫原和佐劑而產生。通過將0. 05mg Img免疫製劑(分別針對山羊或小鼠)與3倍體積的Freund』 s完全佐劑混合得到注射溶液，將該注射溶液在動物皮內多部位注射，一個月後將動物用1/5 至1/10原初量的人IgG的Freund』 s完全佐劑混合液經多部位動物皮下注射而加強免疫。 7 14天後將動物放血，測定血清抗人IgG滴度。對動物加強免疫直至滴度達到平臺期。 在許多免疫學教科書中描述了生產多克隆抗體的方法，例如，陳學清等《免疫學常用實驗方法》。通過從被免疫的動物回收脾細胞並使細胞永生化，例如通過與骨髓瘤細胞融合或通過Epstein-Barr病毒轉化，並且篩選能表達目的抗體的單克隆抗體(Kohl er, Milstein. Derivat ion of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion [J]. European Journal of Immunology，1976 :501_511)。可通過大腸桿菌原核表達克隆化基因來製備抗體A中的重組葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白，具體操作方法參見J.薩姆布魯克等(分子克隆實驗指南.[M]，2002: 1228-1232)，或購買商品化的重組葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白。實施例3膠體金溶液製備將0. 01 %的HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入每IOOmL HAuCl4溶液加入適量的還原劑溶液，顏色從藍色，然後淺藍、藍色，再加熱出現紅色，煮沸7 IOmin出現透明的橙紅色。再用超濾或微孔濾膜(0. 45 μ m)過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的雜質。 製備好的膠體金外觀應純淨、透亮、無沉澱和漂浮物，液面出現油狀物和大量黑色顆粒狀沉澱物時棄用。其中所使用的還原劑可以為檸檬酸三鈉(Frens 1973)、鞣酸-檸檬酸三鈉(Slot 與Gueeze 1985年)、白磷，優選使用檸檬酸三鈉，更優選地使用檸檬酸三鈉。其中所用玻璃容器應絕對清潔，用前需經酸洗、矽化。其水應為去離子超純水，電阻率達18. 2ΜΩ。膠體金溶液製備過程中，各溶液的配製方法如下LHAuCl4的配製用超純水溶解氯金酸，配成溶液，置4°C備用，有效期四個月。IOOOmL HAuCl4溶液配方IOg HAuCl4、超純水定容至1000mL。2. 檸檬酸三鈉的配製檸檬酸三鈉(Sodium Citrate)的配製用超純水溶解Sodium Citrate,配成1 %溶液，0. 22 μ m膜濾過，現配現用。實施例4本實用新型的膠體金免疫層析法抗SplOO抗體檢測試紙的製備方法，具體包括如下步驟[0074]步驟1，硝酸纖維素包被膜的製備(1)採用實施例1的方法製備SplOO抗原蛋白；(2)羊抗兔IgG金標抗體的製備用0. IM碳酸鉀調節實施例3製備的膠體金pH 7. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入4 25 μ g羊抗兔IgG，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌 10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用；(3)硝酸纖維素包被膜3的製備，用包被膜緩衝液稀釋SplOO抗原蛋白至濃度為 1. 0 1. 5mg/mL,調整ΒΙΟ-Dot儀器，噴塗於硝酸纖維素膜(NC)上檢測線4處，靠近結合墊 2端，距結合墊2約9. 5mm，使Cenp-B抗原蛋白包被於硝酸纖維素包被膜的檢測線4上；用包被緩衝液將羊抗兔IgG稀釋到0. 8 1. 5mg/mL,以1 10 μ 1/cm用BIO-Dot 儀器噴塗於硝酸纖維素膜(NC)上靠近吸水墊6的質控線5處，距吸水墊6約9mm。檢測線 4與質控線5兩線距離約5 8mm，噴線應粗細均勻。37°C烘乾，封裝備用。其使用的包被緩衝液可以是硼酸鹽，碳酸鹽，磷酸鹽，Tris-HCl或Tris-磷酸鹽， 醋酸鹽，巴比妥，等等，其緩衝液的目的為提供一定PH和離子強度使蛋白包被並牢固包被於NC膜，其緩衝液pH值一般約為6 9. 5範圍內，優選為6. 5 7. 5的中性緩衝範圍內， 且最優選緩衝液的PH值為7. 0 7. 4範圍內。緩衝液優選為磷酸鹽。其中的硝酸纖維素膜(NC)可以為任何商品化硝酸纖維素膜，S&SAE99, whatman 8ym、millipore M135、sartorius CN140等。使用的具體的NC膜不是本實用新型的關鍵， 但是在每次測定中，上述幾種NC膜可以作為優選。不同廠家使用的含不同表面活性劑的不同緩衝液處理的膜，與所用檢測線抗體溶液親和力有不同程度的差距，也會很大程度造成線條不均勻，拖帶或是彌散的現象，因此運用組裝試紙來選擇優選的NC膜。步驟2，結合墊的製備(1)羊抗人IgG金標抗體的製備用0. IM碳酸鉀調節實施例3製備的膠體金pH 8. 0 9. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g羊抗人IgG，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次， 末次用十分之一初始體積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用；(2)兔IgG金標抗體的製備用0. IM碳酸鉀調節實施例3製備的膠體金pH值至 7. 0 8. 0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g兔IgG，攪拌10 30min，然後加入 BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用。(3)結合墊的製備經緩衝液將聚脂膜浸泡30分鐘，37°C烘乾，將羊抗人IgG金標抗體和兔IgG金標抗體按一定的比例混合後，用ΒΙΟ-Dot儀器，以0. 5 4 μ 1/cm的用量噴塗在預處理的聚脂膜上，25°C 37°C乾燥，待乾燥完畢之後得結合墊2，結合墊2真空包裝， 置2°C 8°C備用。置於2°C 8°C的環境下備用；結合墊的製備過程中，可以使用的緩衝液包括以下幾種(a)含有 1% PVA,0. 71% Na3PO4U% BSA,0. 05% NaN3>0. 1% TritonX-IOO ；(b) 1% PVAU% BSA,0. 05% PR0CLIN 300、0. 1% TritonX-100, ρΗ7· OPBS ；(c) 1% PVAU% BSA、0. 05% PR0CLIN 300, ρΗ7· OPBS ；[0090](d)含有 1% PVA,0. 71% Na3PO4U% BSA,0. 05% NaN3>0. 1% Tween-20 ；(e)含有 1%PVA、0. 71 % Na3PO4U % BSA,0. 05% NaN3>0. 1 % Tween-20, pH7. OPBS ；其優選的緩衝液是緩衝液(d)，因為它具有區別陰陽性樣品的最大解析度。 PR0CLIN 300和NaN3起防腐作用，而Tween-20具有去汙和親水作用。羊抗人IgG金標抗體和兔IgG金標抗體之間的混合比例可以依照下述方法進行通過預實驗基本確定兔IgG金標抗體的0D20，用ΒΙΟ-Dot噴量1 μ 1/cm噴於預處理的聚脂膜上，用0. OlMPBS為上樣緩衝液，即能得到預期的顏色強度的條帶，確定兔IgG金標抗體的應用OD噴量為Ιμ 。隨後將羊抗人IgG金標抗體進行梯度稀釋到終濃度OD 100、80、60、40、20，然後將兔IgG金標抗體稀釋到終濃度OD 20，用ΒΙΟ-Dot將以上羊抗人IgG金標抗體和兔IgG金標抗體混合物噴量為3 μ 1/cm噴於處理好的聚酯膜，將製備的硝酸纖維素包被膜3、結合墊 2、樣本墊1、吸水墊6依次粘貼於底板7上，用陽性血清、臨界參考值血清、陰性血清為調試對象。判定依據陽性血清的檢測線4和質控線5兩者的條帶顏色強度一致為依據，臨界參考值血清能出現，陰性血清無條帶出現的那個OD值，即為這批的應用量。通過本試驗得出 0D20 40較為符合要求。步驟3，樣品墊的製備將玻璃纖維膜按45mL/片，用緩衝液均勻灑塗於玻璃纖維膜上，於37°C烘乾後得樣品墊，樣品墊用鋁箔袋封裝，備用；該步驟可以用的緩衝液包括以下幾種(a)0. 05M Borax,0. OlMPBS (pH 7. 0)、0· 1 % Sodium CaseinU % PEG20000、2 % BSA、0. 05% NaN3 ；(b)0. 05M Borax,0. OlMPBS (pH 7. 0)、0. 1 % Sodium CaseinU % PEG20000、2 % Casein,0. 05% NaN3 ；(c)0. 05M Tris-cl(pH 7. 0) ,0. 01MPBS.0. 1% Sodium CaseinU% PEG20000,2% Casein、。· 05% ·3。優選的緩衝液是緩衝液(a)，因為它具有區別陰陽性樣品的最大解析度，NaN3起防腐作用。步驟4首先進行原材料預裁剪樣品墊的裁切用裁切機將樣品墊切成與PVC製成的底板等長度即長^cm,寬 2. km，置乾燥房間備用。吸水墊的裁切用裁紙機將吸水紙切成與PVC製成的底板等長度即長28cm，寬 3cm製成吸水墊，置乾燥房間備用。結合墊的裁切用裁切機將結合墊切成與PVC製成的底板等長度即長^cm,寬 2. ^m，置乾燥房間備用。硝酸纖維素包被膜的裁切用裁紙機將硝酸纖維素包被膜切成與PVC製成的底板等長度即長^cm,寬1cm，置乾燥房備用。將硝酸纖維素包被膜3、結合墊2、樣本墊1、吸水墊6按圖1所示依次層疊在PVC 塑料製成的底板7上，組成大板。組裝車間溫度應控制在25°C 37°C，溼度20% 30%。[0110]步驟5切條用切條機將大板切成單人份，每人份寬度按照一定要求切成2. 5mm 4mm的寬度，隨機抽檢，靈敏度能檢出室內質控樣品(即弱陽性樣本)，條帶顯色程度達到如圖2d， 且無非特異性條帶，則產品通過質控規定成為合格產品。組裝、包裝將1人份已切好的試紙組裝在備好的試紙卡裡，使加樣窗對應試紙的樣品墊，結果顯示窗對應檢測區和控制區，組裝車間溫度應控制在25°C 37°C，溼度 20% 30%。再與乾燥劑、說明書、樣品加樣器封裝在外包袋裡，於4 25°C避光保存。在上述膠體金層析法抗Cenp-B抗體檢測試紙的製備過程中，各溶液的配置方法如下1.0. IM碳酸鉀的配製用超純水配製，0.22 μ m膜濾過，置4°C備用，有效期一個月。IOOOmL 0. IM K2CO3 溶液配方13. 8g K2CO3 ；超純水定容至 IOOOmL02. 10% BSA的配製用超純水配製，0. 05%疊氮鈉(NaN3)，0. 22 μ m膜濾過，置4°C 備用，有效期兩周。IOOOmL 10% BSA溶液配方IOOg BSA, 0. 5g NaN3 ；超純水定容至1000mL。3、包被緩衝液的配製9gNacl、l. 15gNa2HP04,0. 23g NaH2P04、IOgSucrose、 0. 5gEDTA溶於IL超純水中，過濾置於4°C備用。4.洗滌液也即保存液的配製2% BSA,0. 05% (NaN3) >0. OlM pH 7. 2PBS，0. 22 μ m 膜濾過，置 4°C備用，有效期兩周。IOOOmL 標記洗滌保存液配方:20g BSA,0. 5g NaN3、0. OlM pH 7. 2PBS 定容至 IOOOmL05.金標稀釋液的配製IOOOmL 稀釋液的配製2. 423g tris，lOgBSA，0. 2gNaN3 溶於超純水中，調 pH 8.0， 定容到1000mL。用稀釋液將金標稀釋到工作濃度後，加入20% Sucrose和5%的海藻糖。實施例5該實施例的膠體金免疫層析法抗Sp 100抗體檢測試紙的製備方法，其步驟基本與實施例4相同，只是將該實施例的步驟2中(1)的羊抗人IgG金標抗體的製備步驟替換為葡萄球菌A蛋白(SPA)金標抗體的製備，具體如下用pH 9. 00. 2M硼酸緩衝液調節膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 μ gSPA蛋白，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌 10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存
液將沉澱重懸，置4°C備用。該實施例步驟2中的葡萄球菌A蛋白(SPA)金標抗體和兔IgG金標抗體之間的混合比例可以依照實施例4的方法進行。實施例6該實施例的膠體金免疫層析法抗Sp 100抗體檢測試紙的製備方法，其步驟基本與實施例4相同，只是將該實施例的步驟2中(1)的羊抗人IgG金標抗體的製備步驟替換為鼠抗人IgG金標抗體的製備，具體如下用0. IM碳酸鉀調節膠體金pH值至7.0 8.0，按每毫升膠體金溶液緩慢加入8 12 μ g鼠抗人IgG，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min， 離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保存液將沉澱重懸，置4°C備用。該實施例步驟2中的鼠抗人IgG金標抗體和兔IgG金標抗體之間的混合比例可以依照實施例4的方法進行。實施例7該實施例的膠體金免疫層析法抗SplOO抗體檢測試紙的製備方法，其步驟基本與實施例4相同，只是將該實施例的步驟2中(1)的羊抗人IgG金標抗體的製備步驟替換為鏈球菌G蛋白金標抗體的製備，具體如下用pH 9. 00. 2M硼酸緩衝液調節膠體金pH值至5. 0 6. 5，按每毫升膠體金溶液緩慢加入10 15 μ g鏈球菌G蛋白，攪拌10 30min，然後加入BSA至終濃度0. 5 1 %，攪拌10 30min，離心，棄上清，將沉澱用洗滌液洗滌2 3次，末次用十分之一初始體積的保
存液將沉澱重懸，置4°C備用。該實施例步驟2中的鏈球菌G蛋白金標抗體和兔IgG金標抗體之間的混合比例可以依照實施例4的方法進行。本實用新型將重組表達的SplOO抗原蛋白引入到膠體金層析法抗SplOO抗體檢測試紙，能實現血液樣本中的抗SplOO抗體的檢測，能快速、便捷地輔助診斷原發性膽汁肝硬化實施例8樣本處理取全血1 5ml，自然凝集5分鐘後，3000 5000g/5min lOmin，取上清即得到待測樣品溶液，至少有100 μ 1以上待測樣品溶液。用微量加樣器吸取以上血清50 70 μ 1樣本於樣品墊，緩慢加樣。或者用吸管將血清樣本緩慢滴加3 5滴於樣品墊上，5 IOmin觀察結果，根據條帶出現情況來判讀陰陽性結果。實施例9試劑盒的檢測和臨床性能評估本實用新型的膠體金抗SplOO抗體檢測試紙的金標抗體a的抗體A優選為SPA，抗體b的抗體B為兔IgG，抗體c的抗體為羊抗兔IgG，對其試紙進行的臨床性能進行以下評估。1.穩定性試驗1. 137°C加速穩定性將試紙置於37°C進行加速實驗，每天取出用室內質控品進行測試，通過陰陽性參考品(各10份)的陰陽性符合率的批內精密度來判斷試紙的穩定性。4個月後結果顯示， 質控品的檢測結果符合預期，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率為100%。陰陽性參考品為 10份抗SPlOO抗體陽性血清和10份抗SPlOO抗體陰性血清。穩定性實驗將試紙置於4°C進行常規穩定性實驗，每月取出用室內質控品測試，同樣通過陰陽性參考品(各10份)的陰陽性符合率的批內精密度來判斷試紙的穩定性。12個月後結果顯示，質控品檢測結果符合預期，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率為100%。18個月後結果顯示，各個陰陽性參考品的陰陽性符合率仍為100%。M個月後檢測結果顯示，出現一例假陰性。綜合以上結果說明試紙在2 8°C貯存，2年內是穩定的。2.診斷靈敏度從臨床中收集到100份確診為原發性膽汁肝炎(PBC)病人的血清，用自製的膠體金試紙按照說明書上的操作步驟對上面收集到的PBC病人血清進行檢測。5min後統計結果
如下
臨床確診PBC病人樣本數陰性陽性1007822 根據上面統計的結果，根據對100份確認的PBC病人血清的檢測，可以發現有抗 SP100抗體陽性的樣本數量為22例，陰性樣本數量為78例。因此通過計算得出診斷靈敏性(% ) = 22/(22+78) X 100%= 22%3.診斷特異性從臨床中收集到健康獻血者血清和非PBC病人(包括其他自身免疫性疾病如類風溼關節炎和自免抗SplOO抗體人)血清各300份，用自製的膠體金試紙按照說明書上的操作步驟對上面收集到的健康獻血者和非PBC病人的血清進行檢測。5min後統計結果如下
權利要求1.膠體金層析法抗SplOO抗體檢測試紙，包括有樣品墊(1)、結合墊O)、硝酸纖維素包被膜(3)、吸水墊(6)，所述樣品墊(1)、結合墊(2)、硝酸纖維素包被膜(3)、吸水墊(6)由底板(7)的一側依次向所述底板(7)的另一側相互搭接粘貼在所述底板(7)上，其特徵在於所述的結合墊( 包被有金標抗體a層和金標抗體b層；所述的硝酸纖維素包被膜(3)上設置有檢測線(4)和質控線(5)，所述的檢測線(4)包被有SplOO抗原蛋白層，所述的質控線( 包被有金標抗體c層。
2.根據權利要求1所述的膠體金層析法抗SplOO抗體檢測試紙，其特徵在於所述的抗人IgG多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種；所述的抗人IgG單克隆抗體為羊源或兔源中的一種。
3.根據權利要求1所述的膠體金層析法抗SplOO抗體檢測試紙，其特徵在於所述金標抗體a層中的抗體A為葡萄球菌A蛋白。
4.根據權利要求1所述的膠體金層析法抗SplOO抗體檢測試紙，其特徵在於所述的金標抗體b層中的抗體B和金標抗體c層中的抗體C同時或不同時為單克隆抗體或多克隆抗體中的一種。
5.根據權利要求4所述的膠體金層析法抗SplOO抗體檢測試紙，其特徵在於所述的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源中的一種，所述的單克隆抗體為鼠源或兔源中的一種。
6.根據權利要求1所述的膠體金層析法抗SplOO抗體檢測試紙，其特徵在於所述的檢測線上包被的SplOO抗原蛋白層為通過原核表達克隆化基因獲得的SplOO抗原蛋白層。
專利摘要本實用新型公開了一種膠體金層析法抗Sp100抗體檢測試紙，其包括有樣品墊、結合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊，所述樣品墊、結合墊、硝酸纖維素包被膜、吸水墊由底板的一側依次向所述底板的另一側粘貼在所述底板上，其結合墊包被有金標抗體a層和金標抗體b層；硝酸纖維素包被膜上設置有檢測線和質控線，檢測線包被有Sp100抗原蛋白層，質控線包被有金標抗體c層。本實用新型採用間接免疫測定法，引入Sp100抗原蛋白，對結合墊和樣品墊進行了工藝優化，來實現抗Sp100抗體的高靈敏度、高特異、高準確性的檢測性能，為輔助診斷原發性膽汁肝硬化提供參考依據。
文檔編號G01N33/558GK202041533SQ20112003281
公開日2011年11月16日 申請日期2011年1月30日 優先權日2011年1月30日
發明者孫宏彬, 張玥, 葛文斌, 錢傑, 韓永俊, 高成秀 申請人:上海科新生物技術股份有限公司