一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法
2023-04-30 00:35:21
一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法
【專利摘要】一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法，包括：設計特異性識別和切割魚類基因組指定位點序列的基因組編輯工具、以及與所述指定位點序列相對應、包含敲入外源基因片段的同源供體，使用共顯微注射的方法將所述基因組編輯工具、所述同源供體以及在原生殖細胞特異穩定表達螢光蛋白的mRNA導入到魚類動物胚胎，利用檢測所述螢光蛋白mRNA所表達的螢光蛋白進行胚胎挑選並獲得穩定的遺傳性狀。該方法可以在魚類基因組的指定位點敲入外源基因片段，獲得帶有敲入的外源基因片段的子一代魚類的效率顯著高於已有的方法。
【專利說明】一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，涉及一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法。
【背景技術】
[0002] 基因打靶是重要的遺傳學技術手段。魚類是脊椎動物的遺傳學模式動物。傳統的 基因打靶依賴於胚胎幹細胞培養和同源重組。多種模式動物和許多經濟動物中由於沒有 建立胚胎幹細胞系難以應用基於同源重組的基因打靶。以往，斑馬魚等魚類中的反向遺傳 學手段比較有限，需要人為抑制基因表達時，通常用嗎啉代寡核苷酸或siRNA進行基因敲 降。包括鋅指核酸內切酶（ZFN)技術、轉錄激活子樣效應因子核酸內切酶（TALEN)技術和 CRISPR/Cas9核酸內切酶技術等的人工內切酶使斑馬魚中任意位點的基因組編輯有可能實 現。人工引入的DNA雙鏈斷裂可以顯著提高斷裂位點附近的同源重組發生率。
[0003] 只有發生在生殖細胞中的遺傳學改造會傳遞到下一代。在秀麗隱杆線蟲的遺傳 學操作中，研究者常將鋅指核酸內切酶、轉錄激活子樣效應因子核酸內切酶或CRISPR/Cas9 核酸內切酶等工具分子注射到線蟲的性腺中，以利於這些分子進入生殖細胞，進行遺傳學 改造。對於個體較大、不透明的斑馬魚和其他多數魚類，難以直接將人工內切酶和其他分子 注射到性腺中而不會對動物產生顯著損傷。
[0004] 斑馬魚的生殖細胞是由早期的原生殖細胞（primordial germ cells, PGCs)發育 而來的。斑馬魚的原生殖細胞的命運是由一團特殊的稱作"生殖質（germ plasm)"的細胞 質決定的。nanos基因對於原始生殖細胞的決定及遷移起著關鍵作用。在線蟲、水蛭、家蠶、 爪蟾、斑馬魚、小鼠和人類等多個物種中都有果蠅nanos基因同源物存在。nanos mRNA在斑 馬魚的PGCs中表達，並通過3'非編碼區在PGCs中被穩定化，在體細胞中迅速降解，因此能 夠作為研究斑馬魚PGCs的一個標記基因。現在已有利用nanos基因的3'非編碼區和綠色 突光蛋白融合標記PGCs來研究PGCs的遷移過程的方法。並且，羅非魚nanos2和nanos3分 別表達在雄性和雌性的生殖細胞中。在其他多種物種中nanos3也表達在兩性生殖細胞中， 但斑馬魚的nanos3的表達未見這種性別差異。由於斑馬魚胚胎發育過程中，細胞質不均等 分配，胚胎發育至1K細胞時，生殖質只分布於4個細胞中。胚胎發育到4K細胞時，這些含 有生殖質的原生殖細胞開始分裂，此後逐步發育為生殖細胞。這一決定方式在除哺乳動物 和爬行動物有尾目之外的許多脊椎動物中存在。原生殖細胞在胚胎中的含量是稀少的，而 人工注入的分子如果不進入這少數的原生殖細胞，就難以實現傳代的基因組改造。
[0005] 在利用人工內切酶改造斑馬魚基因組的操作中，注射過的胚胎（G0代，首建者）在 生長至足夠的規格後，一些研究人員會剪取其鰭進行基因型鑑定，分析魚鰭中的細胞是否 發生預期的基因組改造。但是，魚鰭並不包含原生殖細胞或生殖細胞，魚鰭中的基因組改造 情況不代表其生殖細胞中的情況，鰭的細胞中有或者沒有發生基因組改造，並不能有效地 提示預期的改造是否能傳遞到該個體的下一代。G0代個體相互交配，或者與未改造的（野 生型）個體交配，產生的子代（F1代）在生長至足夠的規格後，需要鑑定基因型，以確定所 需的改造是否傳到F1代中。值得注意的是，如果注射後，人工內切酶等分子沒有進入G0個 體的生殖細胞，後期對該個體的子代進行的鑑定都會得到陰性的結果，而傳統的方法中，這 部分GO個體及其子代始終都在工作範圍中，需要為之投入時間和勞動。
[0006] 為了提高斑馬魚基因組改造的傳代效率，有以下兩種方法：1、將注入的分子高效 地引入斑馬魚生殖細胞；2、分選注射後的斑馬魚胚胎，選擇出在原生殖細胞中含有較高水 平的注入分子的胚胎。其中，後者相對易於實現。一般認為，一同注入斑馬魚胚胎的分子會 共定位，即分布於同樣的細胞中。但是，本領域的研究者們目前沒有認識到注入的核酸在胚 胎中的不均等分配情況，並對之採取相應的措施以提高基因組編輯的傳代效率。
[0007] 因此，亟需一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法。已有的研究發現，斑馬魚 nanos3(曾名為nosl等）基因的3'非翻譯區（3'UTR)可以調控所在的信使RNA(mRNA) 在原生殖細胞中穩定化，而在其他細胞中不穩定，向斑馬魚1細胞期胚胎中注射構建的 YFP-nanos3mRNA，可以將斑馬魚胚胎的原生殖細胞標記上YFP的黃色螢光。發明人使用共 顯微注射的方法將上述CRISPR/Cas9系統、上述同源供體與可保證在原生殖細胞特異穩定 表達螢光蛋白的mRNA (即連接有nanos3基因片段螢光蛋白的mRNA)導入到魚類動物胚胎， 利用檢測所述螢光蛋白mRNA所表達的螢光蛋白進行胚胎挑選並獲得穩定的遺傳性狀。
【發明內容】
[0008] 為了解決以上問題，本發明提供了一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法，包 括：設計特異性識別和切割魚類基因組指定位點序列的基因組編輯工具、以及與所述指定 位點序列相對應、包含敲入外源基因片段的同源供體，使用共顯微注射的方法將所述基因 組編輯工具、所述同源供體以及在原生殖細胞特異穩定表達螢光蛋白的mRNA導入到魚類 動物胚胎，利用檢測所述螢光蛋白mRNA所表達的螢光蛋白進行胚胎挑選並獲得穩定的遺 傳性狀。
[0009] 本發明提供了一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法，包括：設計特異性識別 和切割魚類基因組指定位點序列的基因組編輯工具，使用共顯微注射的方法將所述基因組 編輯工具與在原生殖細胞特異穩定表達螢光蛋白的mRNA導入到魚類動物胚胎，利用檢測 所述螢光蛋白mRNA所表達的螢光蛋白進行胚胎挑選並獲得穩定的遺傳性狀。
[0010] 在本發明的一個實施例中，提供了一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法，包 括：設計特異性識別和切割魚類基因組指定位點序列的CRISPR/Cas9系統、以及與所述 指定位點序列相對應、包含敲入外源基因片段的同源供體，使用共顯微注射的方法將所述 CRISPR/Cas9系統、所述同源供體與連接有保證在原生殖細胞特異穩定表達螢光蛋白的 mRNA導入到魚類動物胚胎，利用檢測所述螢光蛋白mRNA所表達的螢光蛋白進行胚胎挑選 並獲得穩定的遺傳性狀。
[0011] 在本發明的另一個實施例中，提供了一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法， 包括：設計特異性識別和切割魚類基因組指定位點序列的CRISPR/Cas9系統，使用共顯 微注射的方法將所述CRISPR/Cas9系統與可保證在原生殖細胞特異穩定表達螢光蛋白的 mRNA導入到魚類動物胚胎，利用檢測所述螢光蛋白mRNA所表達的螢光蛋白進行胚胎挑選 並獲得穩定的遺傳性狀。
[0012] 在本發明的又一個實施例中，提供了一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法， 包括：設計特異性識別和切割魚類基因組指定位點序列的鋅指核酸酶（ZFN)、以及與所述 指定位點序列相對應、包含敲入外源基因片段的同源供體，使用共顯微注射的方法將所述 鋅指核酸酶mRNA、所述同源供體、可保證在原生殖細胞特異穩定表達螢光蛋白的mRNA導入 到魚類動物胚胎，利用檢測所述螢光蛋白mRNA所表達的螢光蛋白進行挑選胚胎並獲得穩 定的遺傳性狀。
[0013] 在本發明的再一個實施例中，提供了一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法， 包括：設計特異性識別和切割魚類基因組指定位點序列的鋅指核酸酶，使用共顯微注射的 方法將鋅指核酸酶mRNA與可保證在原生殖細胞特異穩定表達螢光蛋白的mRNA共注射於魚 類動物胚胎，利用檢測所述螢光蛋白mRNA所表達的螢光蛋白進行挑選並獲得穩定的遺傳 性狀。
[0014] 在本發明的另一個實施例中，提供了一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法， 包括：設計特異性識別和切割魚類基因組指定位點序列的轉錄激活因子樣效應物核酸酶 (TALEN)、以及與所述指定位點序列相對應、包含敲入外源基因片段的同源供體，使用共顯 微注射的方法將所述轉錄激活因子樣效應物核酸酶mRNA、所述同源供體、可保證在原生殖 細胞特異穩定表達螢光蛋白的mRNA導入到魚類動物胚胎，利用檢測所述螢光蛋白mRNA所 表達的螢光蛋白進行挑選胚胎並獲得穩定的遺傳性狀。
[0015] 在本發明的此外一個實施例中，還提供了一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方 法，包括：設計特異性識別和切割魚類基因組指定位點序列的轉錄激活因子樣效應物核酸 酶，使用共顯微注射方法將轉錄激活因子樣效應物核酸酶mRNA與在原生殖細胞特異穩定 表達螢光蛋白的mRNA導入到魚類動物胚胎，利用檢測所述螢光蛋白mRNA所表達的螢光蛋 白進行胚胎挑選並獲得穩定的遺傳性狀。
[0016] 本發明所指的顯著提高魚類基因組編輯效率的方法也指高效人工編輯魚類基因 組的方法。
[0017] 本發明的在原生殖細胞特異穩定表達螢光蛋白的mRNA包括保證在原生殖細胞特 異穩定表達螢光蛋白的基因序列和螢光蛋白的基因序列。在本發明的一個實施例中，所述 保證原生殖細胞特異穩定表達螢光蛋白的基因序列為nanos3基因。在本發明的另一個實 施例中，所述保證在原生殖細胞特異穩定表達螢光蛋白的基因片段為vasa基因的3'非編 碼區的片段。但本發明的保證在原生殖細胞特異穩定表達的基因序列並不限於此，只要可 以限制基因的mRNA在原生殖細胞穩定即可。
[0018] 在本發明的一個實施例中，nanos3基因的3'非編碼區的片段如SEQ ID No :9所 示。在本發明的另一個實施例中，vasa基因的3'非編碼區的片段如SEQ ID No :25所示。
[0019] 在本發明的一個實施例中，螢光蛋白為黃色螢光蛋白（YFP)。在本發明的一個實施 例中，螢光蛋白為綠色螢光蛋白（GFP)。但是本發明中的螢光蛋白並不限於此，可以是紅色 螢光蛋白（RFP)、青色螢光蛋白（CFP)、紅色螢光蛋白（mCherry)等螢光蛋白，只要能用於在 螢光顯微鏡下將明顯螢光的胚胎挑選出來即可。
[0020] 在本發明的一個實施例中，所述魚類為斑馬魚。在本發明的另一個實施例中，所述 魚類為黃顙魚。但是本發明中的魚類並不限於此，可以是閃電斑馬魚、泥鰍、金魚、青鏘魚、 冰虎魚和青魚等任何魚類，只要能夠實施本發明即可。
[0021] 在本發明中，所述基因組編輯工具能夠識別並結合指定的基因序列位點，並高效 精確地切割，隨後細胞利用天然的DNA修復過程來實現DNA的插入、刪除和修改，從而實現 基因組編輯。在本發明的一個實施例中，所述基因組編輯工具是CRISPR/Cas9系統。在本 發明的另一個實施例中，所述基因組編輯工具是鋅指核酸酶mRNA。在本發明的又一個實施 例中，所述基因組編輯工具是激活因子樣效應物核酸酶mRNA。但是本發明的基因組編輯工 具並不限於此，只要能夠識別並結合指定的基因序列位點，並有效精確地切割即可。
[0022] 在本發明中，所述CRISPR/Cas9系統可以是I型、II型和III型的CRISPR/Cas9 系統。每種CRISPR/Cas9系統均包含具有核酸酶活性的CRISPR相關（Cas)基因。II型 CRISPR/Cas9系統在發揮功能時僅需要一種蛋白，即Cas9核酸酶參與；而I、III型CRISPR/ Cas9系統則需要多種蛋白形成複合物才能行使功能。因此，優選地，CRISPR/Cas9系統可以 是II型CRISPR/Cas9系統。其中，該II型CRISPR/Cas9系統可以由Cas9蛋白、crRNA和 tracrRNA組成，也可以由Cas9蛋白和sgRNA組成。但是本發明中的CRISPR/Cas9系統並不 限於此，只要能夠實現識別特定序列並在DNA上進行切割即可。
[0023] 在本發明的一個實施例中，所述CRISPR/Cas9系統包括Cas9mRNA和sgRNA。
[0024] 在本發明的一個實施例中，所述基因組指定位點為aldhla2基因的位點，所述敲 入外源基因片段為mloxP基因位點的片段。在本發明的另一個實施例中，所述基因組指定 位點為aldhla2基因的位點。在本發明的又一個實施例中，所述基因組指定位點為mstna 基因的位點。在本發明的再一個實施例中，所述基因組指定位點為mstnb基因的位點。但 是本發明的基因組指定位點並不限於此，可以是任何所需敲入或者敲除的基因。
[0025] 在本發明的一個實施例中，注射所述Cas9mRNA/所述gRNA/所述同源供體/所述 螢光蛋白mRNA注射的質量比例為5:1:1:10。在本發明的又一個實施例中，注射所述鋅指核 酸酶mRNA/所述螢光蛋白mRNA注射的質量比例為1:5。在本發明的再一個實施例中，注射 所述轉錄激活因子樣效應物核酸酶mRNA/所述螢光蛋白mRNA注射的質量比例為1:5。
[0026] 在本發明的實施例中，所述胚胎處於1細胞期。
[0027] 在本發明的實施例中，所述胚胎挑選時期為胚胎發育至受精後48小時後進行篩 選。
[0028] 本發明的有益效果：發明人將人工內切酶、同源供體和帶有nanos33' UTR的螢光 蛋白mRNA共同顯微注射到斑馬魚1細胞期胚胎中，胚胎原生殖細胞中的螢光即表示在該原 生殖細胞中含有較高水平人工內切酶和同源供體。可以預期，這部分細胞的人工內切酶靶 位點被切割的效率較高，因而與同源供體發生同源重組的效率也較高。
[0029] 類似地，發明人將諸如ZFN、TALEN等人工內切酶和帶有nanos33' UTR的螢光蛋白 mRNA共同注射到斑馬魚1細胞期胚胎中，胚胎原生殖細胞中的螢光即表示在該原生殖細胞 中含有較高水平人工內切酶。可以預期，這部分細胞的人工內切酶靶位點被切割的效率較 高，因而產生插入/缺失突變的效率也較高。
[0030] 在螢光顯微鏡下將原生殖細胞中有明顯螢光的胚胎挑選出來，使之生長至性成 熟，不需要鑑定鰭或其他組織中是否發生所需的基因組改造，使G0雌雄個體相互交配，產 生F1代，鑑定F1代中是否發生的所需的基因組改造。由於G0個體在1細胞期注射之後 已經經過了螢光顯微鏡下的觀察挑選，所有原生殖細胞中不含有注入的分子的胚胎都被棄 去，待鑑定的F1代個體中就不存在這些不可能發生傳代的基因組改造的G0個體的子代。與 傳統的方法相比較，不再需要鑑定原生殖細胞中不含有注入的分子的G0的子代，而代之以 螢光顯微鏡下挑選G0代胚胎，工作量大幅減少，子代中獲得的傳代的基因組改造效率顯著 提1?。
[0031] 此外，本發明的方法通過用YFP_nanos33' UTR指示含有注入的核酸的原生殖細 胞，能夠標記帶有這樣核酸的原生殖細胞的胚胎。並且，理論上，含有注入的核酸的非原生 殖細胞不會被螢光標記，而不含有注入的核酸的原生殖細胞也不會被標記。與傳統方法中 將所有胚胎（稱為代胚胎，其下一代將繁育出大量的不含有注入核酸的那部分個體和數 量極少的含有注入核酸的那部分個體）都用於繁育F1代比較，本發明通過對針對注入的核 酸進入原生殖細胞這一指標進行人工挑選，可以極大地減少基因未發生編輯的無效F1代 個體，相應地減少篩選F1代突變體所需的時間、人力和費用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032] 圖1A示出在原生殖細胞中沒有明顯黃色螢光蛋白信號的斑馬魚胚胎。
[0033] 圖1B示出在原生殖細胞中明顯黃色螢光蛋白信號的斑馬魚胚胎。
【具體實施方式】
[0034] 應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施 例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如《分子克隆實驗指南（第三版）》 (Sambrook等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年）中所述的條件，或按照製造廠商所建議 的條件。
[0035] 以下參照實施例1詳細說明本發明的實施方式：
[0036] 實施例1在斑馬魚aldhla2基因內含子中定向敲入mloxP
[0037] 1、構建靶向斑馬魚aldhla2基因第三內含子與第四內含子的CRISPR/Cas9系統
[0038] 表1.構建靶向aldhla2的sgRNA使用的引物和模板序列
[0039]
【權利要求】
1. 一種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法，包括：設計特異性識別和切割魚類基 因組指定位點序列的基因組編輯工具、以及與所述指定位點序列相對應、包含敲入外源基 因片段的同源供體，使用共顯微注射的方法將所述基因組編輯工具、所述同源供體以及在 原生殖細胞特異穩定表達螢光蛋白的mRNA導入到魚類動物胚胎，利用檢測所述螢光蛋白 mRNA所表達的螢光蛋白進行胚胎挑選並獲得穩定的遺傳性狀。
2. -種顯著提高魚類基因組編輯效率的方法，包括：設計特異性識別和切割魚類基因 組指定位點序列的基因組編輯工具，使用共顯微注射的方法將所述基因組編輯工具與在 原生殖細胞特異穩定表達螢光蛋白的mRNA導入到魚類動物胚胎，利用檢測所述螢光蛋白 mRNA所表達的螢光蛋白進行胚胎挑選並獲得穩定的遺傳性狀。
3. 如權利要求1-2所述的方法，其中，所述在原生殖細胞特異穩定表達螢光蛋白的 mRNA包括保證在原生殖細胞特異穩定表達突光蛋白的基因序列和突光蛋白的基因序列，所 述保證原生殖細胞特異穩定表達突光蛋白的基因序列為nanos3基因或者vasa基因的3' 非編碼區的片段序列。
4. 如權利要求3所述的方法，其中，所述nanos3基因的3'非編碼區的片段序列如SEQ ID No :9所示，所述vasa基因的3'非編碼區的片段序列如SEQ ID No :25所示。
5. 如權利要求1-2所述的方法，其中，所述魚類為斑馬魚、黃顙魚、閃電斑馬魚、泥鰍、 金魚、青鏘魚、冰虎魚和青魚。
6. 如權利要求1-2所述的方法，其中，所述基因組編輯工具是CRISPR/Cas9系統。
7. 如權利要求6所述的方法，其中，所述CRISPR/Cas9系統包括Cas9mRNA和sgRNA。
8. 如權利要求7所述的方法，其中，注射所述Cas9mRNA/所述sgRNA/所述螢光蛋白 mRNA注射的質量比例為5:1:10。
9. 如權利要求1-2所述的方法，其中，所述基因組編輯工具是鋅指核酸酶mRNA。
10. 如權利要求9所述的方法，其中，注射所述鋅指核酸酶mRNA與所述螢光蛋白mRNA 注射的質量比例為1:5。
11. 如權利要求1-2所述的方法，其中，所述基因組編輯工具是激活因子樣效應物核酸 酶mRNA。
12. 如權利要求11所述的方法，其中，注射所述轉錄激活因子樣效應物核酸酶mRNA與 所述螢光蛋白mRNA注射的質量比例為1:5。
13. 如權利要求1所述的方法，其中，所述基因組指定位點為aldhla2基因的位點，所述 敲入外源基因片段為mloxP基因位點的片段。
14. 如權利要求1-2所述的方法，其中，所述胚胎處於1細胞期。
15. 如權利要求1-2所述的方法，其中，所述胚胎挑選時期為胚胎發育至受精後48小時 後進行篩選。
【文檔編號】C12N15/89GK104195177SQ201410382563
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月5日 優先權日:2014年8月5日
【發明者】趙慶順, 董張及 申請人:南京大學