將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體同一個整合位點的方法

2023-04-30 00:39:01

專利名稱：將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體同一個整合位點的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體是一種將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合 到枯草芽孢桿菌染色體同一個整合位點的方法。
背景技術：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是非致病的，不產毒素和致熱致敏蛋白質，是 一種食品安全的菌種，被歸為食品級微生物範疇。而且枯草芽孢桿菌作為表達系統，具有以 下優點1.具有很強的蛋白質分泌功能，不需要破碎細胞來提取蛋白質，只需要較簡單地 處理髮酵上清液即可得到較純的目標蛋白質，目前已有多種外源蛋白在枯草芽孢桿菌中實 現了分泌表達。2.沒有明顯的密碼子偏愛性，同時表達產物也不容易形成包函體。3.發酵 條件簡單。開發利用枯草芽孢桿菌作為表達系統具有深遠的意義。根據所採用載體的類型不同，枯草芽孢桿菌表達模式可分為染色體整合表達和可 複製質粒表達兩種。在染色體整合表達中外源基因在宿主中可保持較好的穩定性，而複製 質粒通常不穩定，需加抗生素來維持。但是抗生素在食品及其添加劑生產中是不能添加的。 因此，枯草芽孢桿菌染色體整合表達是食品、藥品生產未來發展的一個趨勢。整合表達的一 個不足在於需表達基因的拷貝數低，從而影響外源蛋白的表達量。增加拷貝數的一種方法 是將外源基因分別整合在不同的位點。這種方法需要將外源基因克隆到不同的整合載體 上，而且外源基因在染色體不同的整合位點表達水平也可能不一樣。另一種方法是通過不 斷提高抗生素的濃度，篩選出整合拷貝數增加的重組子。這種方法利用抗生素濃度增加的 數量性狀來篩選重組子，假陽性高，獲得的整合菌株中的多拷貝外源基因不穩定，外源蛋白 的表達效果也不理想，往往需要高濃度的抗生素來維持外源基因的拷貝數。

發明內容
本發明的目的是提供一種方法，將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草 芽孢桿菌染色體同一個整合位點。通過提高表達單元的拷貝數，以期獲得更高的外源基因 表達量。本發明是將整合質粒整合到枯草芽孢桿菌染色體基因組，利用整合質粒的抗性基 因篩選標記篩選出重組菌，再用替換抗性基因篩選標記的質粒替換抗性基因篩選標記，整 合質粒再轉化得到的重組菌，再通過整合質粒上的抗性基因篩選標記和替換抗性基因篩選 標記質粒的抗性基因篩選標記篩選獲得重組菌。經過若干輪整合-替換-再整合，可以獲 得兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體基因組的重組菌。本發明用到的整合質粒pDG364、pMLK83、pDG1661、pDG1662、pDG1663、pDG1664、 PDG1728、pDG11729、pDG1730、pDG1731、ρAXOU pAX-spac、pSG1154、pSG1192、pSG1193、 PSG1729、pSG1190、pSG1191、pDL、pDK，及替換抗性基因篩選標記質粒 pVK71、pVK73、 JM103(pCm: :Er)、JM103(pCm: :Nm)、JM103 (pCm: : Sp)、JM103(pCm: :Tc)、JM103(pEr: :Cm)、 JM103(pEr: :Nm)、JM103 (pEr: :Pm)、JM103 (pEr: : Sp)均購自美國俄亥俄州立大學 Bacillus遺傳保藏中心(the Bacillus Genetic Stock Center, BGSC, http://www. bgsc. org) 本發明通過以下步驟實現1)將外源基因表達單元分別單獨克隆到枯草芽孢桿菌整合質粒上，每一個重組 整合質粒攜帶一個外源基因表達單元；2)第一個外源基因表達單元的整合是利用整合質粒將外源基因表達單元整合到 枯草芽孢桿菌染色體中，通過整合質粒上攜帶的抗性基因篩選標記A挑選得到外源基因表 達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體中的重組枯草芽孢桿菌1 ；3)用替換抗性基因篩選標記的質粒將上述重組枯草芽孢桿菌1的抗性基因篩選 標記A替換為抗性基因篩選標記B，通過抗性基因篩選標記B將替換成功的重組菌挑選出 來，得到帶抗性基因篩選標記B的重組枯草芽孢桿菌2 ；4)第二個外源基因表達單元的整合是利用連接有第二個外源基因表達單元的整 合質粒以同源單交換形式將第二個外源基因表達單元整合到重組枯草芽孢桿菌2上，通過 抗性基因篩選標記A和抗性基因篩選標記B篩選得到含有兩個外源基因表達單元的重組枯 草芽孢桿菌；5)重複上述步驟幻和步驟4)，將抗性基因篩選標記A替換為其他抗性基因篩選 標記後，用連接有外源基因表達單元的整合質粒以同源單交換形式整合到重組菌中，可以 得到兩個以上表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體中的重組菌；所述的外源基因表達單元可以相同或不同如不同，得到不同外源基因表達單元 整合到枯草芽孢桿菌染色體基因組的重組菌；如相同，得到兩個或兩個以上拷貝的外源基 因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體基因組的重組菌；所述的外源基因表達單元可以是單順反子，也可以是多順反子；所述的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌168衍生菌株，例如1A751，WB600，或WB800。根據使用的整合載體不同，本發明的方法的具體步驟如下1.利用整合質粒pMLK83及其衍生質粒或pDK及其衍生質粒(為方便描述，兩種質 粒統稱為H。具體應用時，每次只用其中一個質粒。下同)進行整合。1)將兩個外源基因表達單元A和B分別克隆到枯草芽孢桿菌整合型質粒PMLK83 及其衍生質粒或PDK及其衍生質粒，構建重組質粒H-A和H-B。2)用重組質粒H-A轉化宿主枯草芽孢桿菌，通過新黴素抗性，挑選出外源基因同 源交換整合到枯草芽孢桿菌染色體中的菌株[A]Neo+。3)質粒pVK71作為替換抗性基因篩選標記質粒轉化枯草芽孢桿菌[A]Neo+，挑選 出狀觀黴素抗性，新黴素抗性失活的菌株[A]Ne0-Spe+。4)用重組質粒H-B轉化枯草芽孢桿菌[A]Ne0_Spe+，挑選出狀觀黴素抗性和新黴素 抗性的菌株[AB]Ne0+Spe+，從而將兩個外源基因A、B表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體 基因組中。2.利用整合質粒PDG364及其衍生質粒或pDL及其衍生質粒(統稱為K)進行整合。1)將外源基因表達單元A、B、C、D和E分別克隆到枯草芽孢桿菌整合型質粒 PDG364及其衍生質粒或pDL及其衍生質粒，構建重組質粒K_A、K_B、K_C、K-D和K-E。2)用重組質粒K-A轉化宿主枯草芽孢桿菌，通過氯黴素抗性，挑選出外源基因同源交換整合到枯草芽孢桿菌染色體中的菌株[A] Cat+。3)質粒JM103 (pCm: :Er)作為替換抗性基因篩選標記質粒轉化枯草芽孢桿菌[A] Cat+,挑選出紅黴素抗性，氯黴素抗性失活的菌株[A]Cat_Erm+。4)用重組質粒K-B轉化枯草芽孢桿菌[A]Cat_Erm+，挑選出氯黴素抗性和紅黴素抗 性的菌株[AB]Cat+Erm+，從而將兩個外源基因A、B表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體基 因組中。5)分別以重組質粒K-C、K-D和K-E作為整合質粒，質粒JM103 (pCm: Nm)、 JM103(pCm::Sp)、JM103(pCm: :Tc)作為替換抗性基因篩選標記質粒，重複步驟3和4，最後 得到含有五個拷貝外源基因的重組菌[ABCDE]Cat+Erm+Neo+Spe+Tec+。3.利用整合質粒PDG1661及其衍生質粒或pDG1662及其衍生質粒(統稱為M)進
行整合。1)將外源基因表達單元A、B、C和D分別克隆到枯草芽孢桿菌整合型質粒pDG1661 及其衍生質粒或PDG1662及其衍生質粒，構建重組質粒M-A、M_B、M-C和M-D。2)用重組質粒M-A轉化宿主枯草芽孢桿菌，通過氯黴素抗性，挑選出外源基因同 源交換整合到枯草芽孢桿菌染色體中的菌株[A] Cat+。3)質粒JM103(pEr: :Cm)作為替換抗性基因篩選標記質粒轉化枯草芽孢桿菌[A] Cat+,挑選出紅黴素抗性，氯黴素抗性失活的菌株[A]Cat_Erm+。4)用重組質粒M-B轉化枯草芽孢桿菌[A]Cat_Erm+，挑選出氯黴素抗性和紅黴素抗 性的菌株[AB]Erm+Cat+，從而將兩個外源基因A、B表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體基 因組中。5)分別以重組質粒M-C和M-D作為整合質粒，以質粒JM103 (pEr Nm)、 JM103(pEr: :Pm)作為替換抗性基因篩選標記質粒，重複步驟3和4，最後得到含有四個拷貝 外源基因的重組菌[ABCD] Cat+Erm+Neo+Phm+。4.利用整合質粒PDG1663及其衍生質粒或pDG1664及其衍生質粒(統稱為N)進
行整合。1)將外源基因表達單元A、B、C和D分別克隆到枯草芽孢桿菌整合型質粒 PDG1663及其衍生質粒或pDG1664及其衍生質粒，構建重組質粒N_A、N_B、N-C和N-D。2)用重組質粒N-A轉化宿主枯草芽孢桿菌，通過紅黴素抗性，挑選出外源基因同 源交換整合到枯草芽孢桿菌染色體中的菌株[A]Erm+。3)質粒JM103(pEr: :Cm)作為替換抗性基因篩選標記質粒轉化枯草芽孢桿菌[A] Erm+,挑選出氯黴素抗性，紅黴素抗性失活的菌株[A]Erm_Cat+。4)用重組質粒N-B轉化枯草芽孢桿菌[A]Erm_Cat+，挑選出紅黴素抗性和氯黴素抗 性的菌株[AB]Erm+Cat+，從而將兩個外源基因A、B表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體基 因組中。5)分別以重組質粒N-C和N-D作為整合質粒，以質粒JM103 (pEr Nm)、 JM103(pEr: :Pm)作為替換抗性基因篩選標記質粒，重複步驟3和4，最後得到含有四個拷貝 外源基因的重組菌[ABCD]Erm+Cat+Neo+Phm+。5.利用整合質粒pSGllM及其衍生質粒、PSG1190及其衍生質粒、pSG1191及其衍 生質粒、PSG1192及其衍生質粒、PSG1193及其衍生質粒或pSG17^及其衍生質粒(統稱為R)進行整合。1)將兩個外源基因表達單元A和B分別克隆到枯草芽孢桿菌整合型質粒pSGl 154 及其衍生質粒、PSG1192及其衍生質粒、PSG1193及其衍生質粒、pSG1729及其衍生質粒、 PSG1190及其衍生質粒或PSG191及其衍生質粒，構建重組質粒R-A和R-B。2)用重組質粒R-A轉化宿主枯草芽孢桿菌，通過狀觀黴素抗性，挑選出外源基因 同源交換整合到枯草芽孢桿菌染色體中的菌株[A]Spe+。3)質粒pVK73作為替換抗性基因篩選標記質粒轉化枯草芽孢桿菌[A] Spe+,挑選 出新黴素抗性，狀觀黴素抗性失活的菌株[A]Spe-Ne0+。4)用重組質粒R-B轉化枯草芽孢桿菌[A] Spe—Neo+，挑選出狀觀黴素抗性和新黴素 抗性的菌株[AB]Ne0+Spe+，從而將兩個外源基因A、B表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體 基因組中。6.利用整合質粒pDG17^及其衍生質粒、pDG17^及其衍生質粒、pDG1730及其衍 生質粒、或PDG1731及其衍生質粒(統稱為X)進行整合。1)將兩個外源基因表達單元A和B分別克隆到枯草芽孢桿菌整合型質粒PDG1728 及其衍生質粒、PDG1729及其衍生質粒、PDG1730及其衍生質粒、或pDG1731及其衍生質粒， 構建重組質粒X-A和X-B。2)用重組質粒X-A轉化宿主枯草芽孢桿菌，通過狀觀黴素抗性，挑選出外源基因 同源交換整合到枯草芽孢桿菌染色體中的菌株[A]Spe+。3)質粒pVK73作為替換抗性基因篩選標記質粒轉化枯草芽孢桿菌[A]Spe+，挑選 出新黴素抗性，狀觀黴素抗性失活的菌株[A]Neo+Spe-。4)用重組質粒X-B轉化枯草芽孢桿菌[A]Ne0+Spe_，挑選出新黴素抗性和狀觀黴素 抗性的菌株[AB]Ne0+Spe+，從而將兩個外源基因A、B表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體 基因組中。7.利用整合質粒pAXOl及其衍生質粒或pA-spac及其衍生質粒(統稱為V)進行整合。1)將外源基因表達單元A、B、C、D和E分別克隆到枯草芽孢桿菌整合型質粒pAXOl 及其衍生質粒或pAX-spac及其衍生質粒，構建重組質粒V-A、V-B, V-C, V-D和V-E。2)用重組質粒V-A轉化宿主枯草芽孢桿菌，通過紅黴素抗性，挑選出外源基因同 源交換整合到枯草芽孢桿菌染色體中的菌株[A]Erm+。3)質粒JM103(pEr: :Cm)作為替換抗性基因篩選標記質粒轉化枯草芽孢桿菌[A] Erm+,挑選出氯黴素抗性，紅黴素抗性失活的菌株[A]Erm_Cat+。4)用重組質粒V-B轉化枯草芽孢桿菌[A]Erm_Cat+，挑選出紅黴素抗性和氯黴素抗 性的菌株[AB]Erm+Cat+，從而將兩個外源基因A、B表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體基 因組中。5)分別以重組質粒V-C、V-D和V-E作為整合質粒，以質粒JM103 (pEr Nm)、 JM103(pEr: :Pm)、JM103 (pEr Sp)作為替換抗性基因篩選標記質粒，重複步驟3和4，最後 得到含有五個拷貝外源基因的重組菌[AB⑶E]Erm+Cat+Neo+Phm+Spe+。本發明的優點是利用抗生素抗性的有無這個質量性狀來挑選獲得一個基因多拷 貝的重組菌，或多個基因整合到同一整合位點的重組菌，方法簡單有效。
具體實施例方式下面結合具體的實施例，進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了 舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的範圍。實施例1 兩個拷貝β -澱粉酶表達單元整合到枯草芽孢桿菌1Α751。1.整合質粒的構建 pMLK83-P43-CTBA根據Genbank中注釋的啟動子Ρ43序列，設計上遊引物為 5『attgctggacgcttatggac 3，和下遊弓|物為 5，cgggatccattcctctcttacctataat 3，。PCR 反 應體系 IOOul :DNA模板(枯草芽孢桿菌 1A751 總 DNA) Iul (約 20ng)，5XPrimeSTAR Buffer 20ul, 10pmol/ul dNTP 2ul，lOpmol/ul 正反向引物各為 2ul，2. 5U/ul PrimeSTAR HS DNA聚 合酶 Iul，添加 ddH20 至 IOOul。PCR 反應程序-MV 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，30 個循環；72°C IOmin ;4°C保存。PCR片段和質粒pMLK83用限制性內切酶BamH I、Hind III 分別進行雙酶切後用T4連接酶進行連接，轉化到大腸桿菌DH5a中，經篩選鑑定獲得重組
質粒 pMLK83-P43。
以全基因合成的方式合成如下DNA片斷(β-澱粉酶基因，簡稱CTBA)
1GGATCCATGAΑΑΑΑΑΑΑΤΑΤCATCACTTCTATCACATCTCTGGCTCTGGT
51TGCCGGGCTGTCTTTGACTGCTTTTGCAGCTACAACGGCTAGCATAGCAC
101CAAATTTCAAAGTTTTTGTAATGGGTCCATTAGAAAAAGTCACAGATTTT
151AATGCATTCAAAGATCAATTGATAACTTTAAAGAATAATGGTGTTTATGG
201TATAACAACAGATATTTGGTGGGGCTATGTTGAAAATGCAGGTGAAAATC
251AATTTGACTGGAGTTATTATAAGACATATGCTGATACCGTACGCGCTGCG
301GGATTGAAGTGGGTTCCAATAATGTCAACGCATGCCTGTGGAGGTAATGT
351TGGTGATACAGTAAATATACCTATTCCGTCATGGGTATGGACAAAAGATA
401CCCAAGATAATATGCAGTATAAGGATGAAGCCGGAAATTGGGATAATGAA
451GCAGTAAGTCCATGGTATTCTGGCTTAACCCAACTCTATAATGAATTTTA
501TTCATCTTTTGCATCAAATTTTAGCAGCTATAAAGATATAATTACTAAAA
551TATATATATCTGGAGGCCCTTCTGGAGAATTAAGATATCCTTCATATAAT
601CCTTCGCATGGATGGACATATCCTGGACGTGGCTCGCTGCAGTGCTATAG
651TAAAGCGGCTATAACAAGTTTTCAAAATGCTATGAAGTCTAAATATGGAA
701CTATAGCAGCAGTTAATAGTGCATGGGGTACAAGCCTAACTGATTTTTCT
751CAAATTAGTCCACCTACAGATGGTGATAATTTCTTTACAAATGGTTATAA
801AACTACTTATGGTAATGACTTTTTGACATGGTATCAAAGTGTTTTGACTA
851ATGAGTTAGCCAATATTGCTTCTGTAGCTCATAGCTGCTTTGATCCAGTA
901TTTAATGTTCCAATAGGAGCAAAAATAGCTGGAGTGCATTGGCTATATAA
951TAGTCCGACAATGCCACATGCTGCAGAATATTGTGCCGGTΤΑΤΤΑΤΑΑΤΤ
1001ATAGCACGCTACTCGATCAATTTAAGGCATCTAATCTTGCTATGACATTT
1051ACATGTCTTGAAATGGATGATTCTAATGCATATGTAAGTCCATATTATTC
1101TGCACCTATGACGTTAGTCCATTATGTAGCTAATCTTGCTAATAATAAAG
1151GTATAGTCCACAATGGAGAAAATGCTTTGGCTATATCCAACAACAATCAA
1201 GCTTATGTGA ATTGTGCAAA TGAATTAACA GGATATAATT TTTCTGGATT1251 TACACTTTTA AGACTTTCGA ATATTGTAAA TAGTGATGGA TCTGTGACAT1301 CAGAGATGGC TCCTTTTGTA ATTAATATAG TTACACTAAC GCCTAACGGT1351 ACGATACCAG TTACATTTAC AATAAACAAT GCGACAACTT ATTATGGACA1401 AAATGTATAT ATTGTTGGTA GTACATCTGA TCTTGGAAAT TGGAATACAA1451 CCTATGCCCG TGGTCCTGCA TCATGCCCTA ATTATCCTAC TTGGACAATA1501 ACGCTTAATC TATTACCTGG TGAGCAGATA CAGTTTAAAG CTGTAAAAAT1551 TGATAGTTCA GGAAATGTAA CTTGGGAAGG TGGCTCGAAT CATACTTATA1601 CTGTGCCGAC ATCTGGGACT GGTAGTGTCA CCATTACATG GCAAAATTAA1651 TCAATAAAAT GTTACACATA GAACAAATTG TAAACACTGG AATATATTCC1701 GGTGTTTTTT TGTATATTAT GGGCGTTTAA TCCGCGG將合成的β -澱粉酶基因DNA片段和質粒PMLK83-P43用限制性內切酶BamH I和 Sac II進行雙酶切後用Τ4連接酶進行連接，轉化到大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，經篩選 鑑定獲得重組質粒PMLK83-P43-CTBA。2.質粒pMLK83-P43-CTBA同源雙交換整合到枯草芽孢桿菌1Α751染色體基因組取一滿環枯草芽孢桿菌1Α751甘油菌劃LB平板，37°C培養箱培養過夜。轉化前一 天晚間挑單菌落至3ml LB培養基中，37°C，250rpm培養過夜，第二天上午取160 μ 1培養液 轉接至8ml SPI培養基中(SPI培養基SP鹽加體積濃度為50% (W/V)葡萄糖溶液和 1% (V/V)體積 100 X CAYE 溶液；SP 鹽溶液含 1. 96g/L (NH2) 2S04，13. 72g/L K2HPO4, 5. 88g/ L KH2PO4,0. 196g/LMgS047H20(單獨滅菌)和 0. 98g/L 檸檬酸鈉；100 X CAYE 溶液含 20g/L 酪蛋白胺基酸和100g/L酵母抽提物。)，37°C，250rpm培養至對數生長末期(約4 5小 時)；取0. 2ml生長至對數末期的培養液至aiil SPII培養基中(SPII培養基SPI培養基 加入 1 % (V/V，下同)體積 50mmol/L CaCl2 溶液，1 %體積 250mmol/L MgCl2 溶液)，37°C， IOOrpm培養90分鐘；在上述SPII培養基的菌體中加入20ul 10mmol/L EGTA，再於37°C， IOOrpm培養10分鐘；上述處理後的菌液即為枯草芽孢桿菌1A751感受態細胞。將1A751感 受態細胞分裝成0. 5ml每管，加入5ul質粒pMLK83-P43-CTBA (50ng/ul)，再於37°C，250rpm 培養90分鐘，取菌液塗布新黴素(20ug/ml)LB平板。用PCR方法篩選α-澱粉酶基因被破 壞的轉化子即得到枯草芽孢桿菌基因工程菌株lA751[CTBA]Neo+。篩選α-澱粉酶基因被 破壞的轉化子的PCR方法如下合成如下弓I 物:aaml :5，ggtctgatcgatgggatgtc 3，；aam2 5『 tcatcatcgctcatccatgt3' ；w2p 5『 actgacgattaccttgcg 3『 ；baci-pl 5』 cttccaatcacccgctctt 3』 .將轉化子在LB培養基中過夜培養後，提取總DNA.然後分別 用引物對aaml/aam2和w2p/baci_pl進行PCR. PCR反應條件分別如下aaml/aam2 :PCR 反應體系 20ul :DNA 模板(轉化子總 DNA) Iul (約 20ng)，10 X Taq Buffer 2ul, 10pmol/ul dNTP 0. 4ul，10pmol/ul 正反向引物各為 0. 5ul，2. 5U/ul Taq DNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 20ul。PCR 反應程序94°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s，72°C 30s, 30 個循環；72°C IOmin ；4°C保存；w2p/baci-pl :PCR反應體系 20ul :DNA模板(轉化子總 DNA) lul (約 20ng)，IOXTaq Buffer 2ul, 10pmol/ul dNTP 0. 4ul，10pmol/ul 正反向引物各為 0. 5ul，2. 5U/ul Taq DNA聚合酶 lul，添加 ddH20 至 20ul。PCR 反應程序-MV 5min ；94°C 30s,60°C 30s，72°C 70s, 30 個循環；72°C IOmin ；4°C保存；如果某一轉化子用W2pAaCi-pl引物對做PCR得到大約1. Ikb的產物，而用aaml/ aam2引物對做PCR得不到大約450bp的產物，則這個轉化子是α -澱粉酶缺失的轉化子。3.新黴素抗性基因的替換質粒pVK71與製備好的枯草芽孢桿菌1Α751 [CTBAjNeo+感受態細胞混合，220rpm, 37°C搖床培養90min，塗布到含壯觀黴素60ug/ml的LB固體培養基中，長出的菌落再接種到 含新黴素20ug/ml的LB固體培養基驗證，篩選出帶狀觀黴素抗性而新黴素抗性失活的菌株 1A751 [CTBAJNeo-Spe+ο4.質粒pMLK83-P43-CTBA同源單交換整合到枯草芽孢桿菌1A751 [CTBA] Neo^Spe+ 染色體基因組。質粒pMLK83-P43-CTBA與製備好的枯草芽孢桿菌1A751 [CTBAjNeo^Spe+感受態細 胞混合，220rpm, 37°C搖床培養90min，塗布到含新黴素20ug/ml，壯觀黴素60ug/ml的LB固 體培養基過夜培養，可篩選得到兩個拷貝β -澱粉酶表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體 基因組的菌株 lA751[CTBA2]Neo+Spe+05.枯草芽孢桿菌β -澱粉酶的表達枯草芽孢桿菌1Α751 [CTBAJNeo+在含新黴素20ug/ml的LB平板上活化，枯草芽孢 桿菌1A751 [CTBA2]Neo+Spe+在含新黴素20ug/ml、狀觀黴素60ug/ml的LB平板活化，分別 接種到LB液體培養基培養過夜，離心，上清液即為β -澱粉酶粗酶液。6.枯草芽孢桿菌1Α751 [CTBA] Neo+和枯草芽孢桿菌1Α751 [CTBA2] Neo+Spe+酶活 的比較吸取9ml 澱粉溶液於70°C 士0. 5°C恆溫水浴預熱5min後，加入1. Oml β -澱 粉酶粗酶液混勻，置於70°C 士0. 5°C恆溫水浴準確反應30min，置於冰水浴^iin終止反應， 混勻，吸取1. Oml溶液至IOml具塞試管，加入1. Oml DNS試劑(甲液稱取6. 9g結晶酚溶 於15.2ml 10%的NaOH溶液，用蒸餾水稀釋至69ml，再加入6. 9g亞硫酸氫鈉。乙液稱取 255g酒石酸鉀鈉溶於300ml 10%的NaOH溶液，再加入880ml 1 %的3，5- 二硝基水楊酸溶 液。甲液和乙液混合得黃色試劑貯於棕色瓶內，室溫下避光放置7天後作標準曲線)，置沸 水浴中加熱5min，流動水冷卻至室溫，用蒸餾水稀釋至10ml，混勻，以空白對照調零，用分 光光度計在540nm波長下進行比色，記錄吸光度。空白對照由滅活後的樣品溶液代替樣品 溶液。酶活定義為1ml酶液在70°C、pH6.0條件下，1小時水解澱粉液生成Img麥芽糖， 即為1個酶活力單位，以U/ml表示。經測定，枯草芽孢桿菌1A751 [CTBAJNeo+的粗酶液酶活為400U/ml左右，枯草芽孢 桿菌1A751[CTBA2]Neo+Spe+的粗酶液酶活為700U/ml左右，雙拷貝表達單元整合菌株的 β -澱粉酶酶活是單拷貝的1. 5-2倍。實施例2 四個拷貝β -澱粉酶表達單元整合到枯草芽孢桿菌1Α751。1.整合質粒的構建 pDG364-P43-CTBA根據Genbank中注釋的啟動子Ρ43序列，設計上遊引物為 5，cgggatccagcttcgtgcatgcag 3，和下遊弓I物為 5，cccaagcttattcctctcttacctataat 3，。 PCR 反應體系 IOOul =DNA 模板(枯草芽孢桿菌 1A751 總 DNA) Iul (約 20ng)，5XPrimeSTARBuffer 20ul, 10pmol/ul dNTP 2ul，10pmol/ul 正反向引物各為 2ul，2. 5U/ul PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 Iul，添加 ddH20 至 IOOul。PCR 反應程序-MV 5min ；94°C 30s, 60 °C 30s, 72°C lmin，30個循環；72°C IOmin ；4°C保存。PCR片段和質粒pDG364用限制性內切酶BamH I、Hind III分別進行雙酶切後用T4連接酶進行連接，轉化到大腸桿菌Dffia中，經篩選鑑 定獲得重組質粒PDG364-P43。
0115]以全基因合成的方式合成如下DNA片斷(β_澱粉酶基因，簡稱CTBA)
0116]1 AAGCTTTAATGA AAAAAAATAT CATCACTTCT ATCACATCTC TGGCTCTGGT
0117]51TGCCGGGCTGTCTTTGACTGCTTTTGCAGCTACAACGGCTAGCATAGCAC0118]101CAAATTTCAAAGTTTTTGTAATGGGTCCATTAGAAAAAGTCACAGATTTT0119]151AATGCATTCAAAGATCAATTGATAACTTTAAAGAATAATGGTGTTTATGG0120]201TATAACAACAGATATTTGGTGGGGCTATGTTGAAAATGCAGGTGAAAATC0121]251AATTTGACTGGAGTTATTATAAGACATATGCTGATACCGTACGCGCTGCG0122]301GGATTGAAGTGGGTTCCAATAATGTCAACGCATGCCTGTGGAGGTAATGT0123]351TGGTGATACAGTAAATATACCTATTCCGTCATGGGTATGGACAAAAGATA0124]401CCCAAGATAATATGCAGTATAAGGATGAAGCCGGAAATTGGGATAATGAA0125]451GCAGTAAGTCCATGGTATTCTGGCTTAACCCAACTCTATAATGAATTTTA0126]501TTCATCTTTTGCATCAAATTTTAGCAGCTATAAAGATATAATTACTAAAA0127]551TATATATATCTGGAGGCCCTTCTGGAGAATTAAGATATCCTTCATATAAT0128]601CCTTCGCATGGATGGACATATCCTGGACGTGGCTCGCTGCAGTGCTATAG0129]651TAAAGCGGCTATAACAAGTTTTCAAAATGCTATGAAGTCTAAATATGGAA0130]701CTATAGCAGCAGTTAATAGTGCATGGGGTACAAGCCTAACTGATTTTTCT0131]751CAAATTAGTCCACCTACAGATGGTGATAATTTCTTTACAAATGGTTATAA0132]801AACTACTTATGGTAATGACTTTTTGACATGGTATCAAAGTGTTTTGACTA0133]851ATGAGTTAGCCAATATTGCTTCTGTAGCTCATAGCTGCTTTGATCCAGTA0134]901TTTAATGTTCCAATAGGAGCAAAAATAGCTGGAGTGCATTGGCTATATAA0135]951TAGTCCGACAATGCCACATGCTGCAGAATATTGTGCCGGTΤΑΤΤΑΤΑΑΤΤ0136]1001ATAGCACGCTACTCGATCAATTTAAGGCATCTAATCTTGCTATGACATTT0137]1051ACATGTCTTGAAATGGATGATTCTAATGCATATGTAAGTCCATATTATTC0138]1101TGCACCTATGACGTTAGTCCATTATGTAGCTAATCTTGCTAATAATAAAG0139]1151GTATAGTCCACAATGGAGAAAATGCTTTGGCTATATCCAACAACAATCAG0140]1201GCTTATGTGAATTGTGCAAATGAATTAACAGGATATAATTTTTCTGGATT0141]1251TACACTTTTAAGACTTTCGAATATTGTAAATAGTGATGGATCTGTGACAT
0142]1301 CAGAGATGGC TCCTTTTGTA ATTAATATAG TTACACTAAC GCCTAACGGT
0143]1351 ACGATACCAG TTACATTTAC AATAAACAAT GCGACAACTT ATTATGGACA
0144]1401 AAATGTATAT ATTGTTGGTA GTACATCTGA TCTTGGAAAT TGGAATACAA
0145]1451 CCTATGCCCG TGGTCCTGCA TCATGCCCTA ATTATCCTAC TTGGACAATA
0146]1501 ACGCTTAATC TATTACCTGG TGAGCAGATA CAGTTTAAAG CTGTAAAAAT
0147]1551 TGATAGTTCA GGAAATGTAA CTTGGGAAGG TGGCTCGAAT CATACTTATA
0148]1601 CTGTGCCGAC ATCTGGGACT GGTAGTGTCA CCATTACATG GCAAAATTAA
1651 TCAATAAAAT GTTACACATA GAACAAATTG TAAACACTGG AATATATTCC1701 GGTGTTTTTT TGTATATTAT GGGCGTTTAA TGAATTC將合成的β -澱粉酶基因DNA片段和質粒PDG364-P43用限制性內切酶HindIII 和EcoR I進行雙酶切後用Τ4連接酶進行連接，轉化到大腸桿菌DH5 α感受態細胞中，經篩 選鑑定獲得重組質粒PDG364-P43-CTBA。2.質粒pDG364-P43-CTBA同源雙交換整合到枯草芽孢桿菌1Α751染色體基因組如實施例1的方法製備枯草芽孢桿菌1Α751感受態細胞。將1Α751感受態細胞分 裝成 0. 5ml 每管，加入 5ul 質粒？06364- 43-0^々(501^/111)，再於 37°C，250rpm 培養 90 分 鍾，取菌液塗布氯黴素(5ug/ml)LB平板。用PCR方法篩選α -澱粉酶基因被破壞的轉化子 即得到枯草芽孢桿菌基因工程菌株lA751[CTBA]Cat+。篩選α -澱粉酶基因被破壞的轉化 子的PCR方法如下合成如下弓I 物:aaml :5，ggtctgatcgatgggatgtc 3，；aam2 5『 tcatcatcgctcatccatgt3' ；w2p 5『 actgacgattaccttgcg 3『 ；baci-pl 5』 cttccaatcacccgctctt 3』 .將轉化子在LB培養基中過夜培養後，提取總DNA.然後分別 用引物對aaml/aam2和w2p/baci_pl進行PCR. PCR反應條件分別如下aaml/aam2 :PCR 反應體系 20ul :DNA 模板(轉化子總 DNA) Iul (約 20ng)，10 X Taq Buffer 2ul, 10pmol/ul dNTP 0. 4ul, lOpmol/ul 正反向引物各為 0. 5ul，2. 5U/ul Taq DNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 20ul。PCR 反應程序-M°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s，72°C 30s, 30 個循環；72°C IOmin ；4°C保存；w2p/baci-pl :PCR反應體系 20ul :DNA模板(轉化子總 DNA) Iul (約 20ng)，IOXTaq Buffer 2ul, 10pmol/ul dNTP 0. 4ul，10pmol/ul 正反向引物各為 0. 5ul，2. 5U/ul Taq DNA 聚合酶 lul，添加 ddH20 至 20ul。PCR 反應程序-M°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s，72°C 70s, 30 個循環；72°C IOmin ；4°C保存；如果某一轉化子用W2pAaCi-pl引物對做PCR得到大約1. Ikb的產物，而用aaml/ aam2引物對做PCR得不到大約450bp的產物，則這個轉化子是α -澱粉酶缺失的轉化子 1A751[CTBA]Cat+。3.用質粒JM103(pCm::Er)替換氯黴素抗性基因質粒JM103(pCm: :Er)與製備好的枯草芽孢桿菌1A751 [CTBA]Cat+感受態細胞混 合，220rpm，37°C搖床培養90min，塗布到含紅黴素lug/ml的LB固體培養基中，長出的菌落 再接種到含氯黴素5ug/ml的LB固體培養基驗證，篩選出紅黴素抗性而氯黴素抗性失活的 菌株 1A751[CTBA] Cat-Erm+。4.質粒pDG364-P43-CTBA同源單交換整合到枯草芽孢桿菌1A751 [CTBA] CatTrm+ 染色體基因組質粒pDG364-P43-CTBA轉化製備好的枯草芽孢桿菌1A751 [CTBAjCatTrm+感受態 細胞，在含氯黴素5ug/ml，紅黴素lug/ml的LB固體培養基挑選重組菌，可篩選得到兩個拷 貝β -澱粉酶表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體基因組的菌株1Α751 [CTBA2]Cat+Erm+。5.用質粒JM103(pCm::Nm)替換氯黴素抗性基因質粒JM103 (pCm: :Nm)轉化製備好的枯草芽孢桿菌1A751 [CTBA2] Cat+Erm+感受態 細胞，在含新黴素20ug/ml，紅黴素lug/ml的LB固體培養基中挑選重組菌，長出的菌落再接種到含氯黴素5ug/ml的LB固體培養基驗證，篩選出新黴素抗性而氯黴素抗性失活的菌株 1A751 [CTBA2] Cat-Neo+Erm+。6.質粒pDG364-P43-CTBA同源單交換整合到枯草芽孢桿菌1A751 [CTBA2] CatTrm+Neo+染色體基因組質粒pDG364-P43-CTBA轉化製備好的枯草芽孢桿菌1A751 [CTBA2] Cat^Neo+Erm+感 受態細胞，在含氯黴素5ug/ml、紅黴素lug/ml和新黴素20ug/ml的LB固體培養基中挑選重 組菌，可篩選得到三個拷貝β-澱粉酶表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體基因組的菌株 1Α751 [CTBA3] Cat+Neo+Erm+。7.用質粒JM103(pCm::Sp)替換氯黴素抗性基因質粒JM103(pCm: :Sp)轉化枯草芽孢桿菌1A751 [CTBA3] Cat+Neo+Erm+，在含狀觀黴 素60ug/ml，紅黴素lug/ml和新黴素20ug/ml的LB固體培養基中挑選重組菌，長出的菌落 再接種到含氯黴素5ug/ml的LB固體培養基驗證，篩選出狀觀黴素抗性而氯黴素抗性失活 的菌株 1A751 [CTBA3] Cat-Spe^teo+Erm+。8.質粒pDG364-P43-CTBA同源單交換整合到枯草芽孢桿菌1A751 [CTBA3] Cat^Spe+Neo+Erm+染色體基因組質粒pDG364-P43-CTBA 轉化枯草芽孢桿菌 1A751 [CTBA3] Cat-Spe+Neo+Erm+,在含氯 黴素5ug/ml、紅黴素lug/ml、新黴素20ug/ml和狀觀黴素60ug/ml的LB固體培養基中挑選 重組菌，可篩選得到四個拷貝β-澱粉酶表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體基因組的菌 株 1Α751 [CTBA4] Cat+Spe+Neo+Erm+。9.枯草芽孢桿菌β -澱粉酶的表達枯草芽孢桿菌1Α751 [CTBA4]Cat+Spe+Neo+Erm+在含氯黴素5ug/ml、紅黴素 lug/ml、 新黴素20ug/ml、狀觀黴素60ug/ml的LB平板上活化，接種到LB液體培養基培養過夜，離 心，上清液即為β-澱粉酶粗酶液。10.重組枯草芽孢桿菌表達的澱粉酶的酶活測定如實施例1的方法測定重組枯草芽孢桿菌表達的β -澱粉酶的酶活。經測定，單 拷貝表達單元整合菌株lA751[CTBA]Cat+的粗酶液酶活為400U/ml左右，雙拷貝表達單元 整合菌株1A751[CTBA2]Cat+Erm+的粗酶液酶活為700U/ml左右，三拷貝表達單元整合菌 株1A751[CTBA3]Cat+Neo+Erm+的粗酶液酶活為1000U/ml左右，四拷貝表達單元整合菌株 1A751 [CTBA4]Cat+Spe+Neo+Erm+的β -澱粉酶酶活為1200U/ml左右，四拷貝表達單元整合 菌株是單拷貝的3倍左右。
權利要求
1.將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體同一個整合位點 的方法，其特徵在於，是一種利用多種抗性基因篩選重組菌，將兩個或兩個以上外源基因表 達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體同一整合位點的方法，具體步驟是1)將外源基因表達單元分別單獨克隆到枯草芽孢桿菌整合質粒上，每一個重組整合質 粒攜帶一個外源基因表達單元；2)第一個外源基因表達單元的整合是利用整合質粒將外源基因表達單元整合到枯草 芽孢桿菌染色體中，通過整合質粒上攜帶的抗性基因篩選標記A挑選得到外源基因表達單 元整合到枯草芽孢桿菌染色體中的重組枯草芽孢桿菌1 ；3)用替換抗性基因篩選標記的質粒將上述重組枯草芽孢桿菌1的抗性基因篩選標記A 替換為抗性基因篩選標記B，通過抗性基因篩選標記B將替換成功的重組菌挑選出來，得到 帶抗性基因篩選標記B的重組枯草芽孢桿菌2 ；4)第二個外源基因表達單元的整合是利用連接有第二個外源基因表達單元的整合質 粒以同源單交換形式將第二個外源基因表達單元整合到重組枯草芽孢桿菌2上，通過抗性 基因篩選標記A和抗性基因篩選標記B篩選得到含有兩個外源基因表達單元的重組枯草芽 孢桿菌；5)重複上述步驟幻和步驟4)，將抗性基因篩選標記A替換為其他抗性基因篩選標記 後，用連接有外源基因表達單元的整合質粒以同源單交換形式整合到重組菌中，可以得到 兩個以上表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體中的重組菌；所述的外源基因表達單元可以相同或不同如不同，得到不同外源基因表達單元整合 到枯草芽孢桿菌染色體基因組的重組菌；如相同，得到兩個或兩個以上拷貝的外源基因表 達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體基因組的重組菌；所述的外源基因表達單元可以是單順反子，也可以是多順反子；所述的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌168衍生菌株。
2.根據權利要求1所述將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染 色體同一個整合位點的方法，其特徵在於，所述的枯草芽孢桿菌整合質粒為能與枯草芽孢 桿菌染色體基因組發生同源交換的質粒PMLK83及其衍生質粒或pDK及其衍生質粒；所述的 抗性基因篩選標記A為新黴素；所述的替換抗性基因篩選標記的質粒為PVK71 ；所述的抗性 基因篩選標記B為狀觀黴素。
3.根據權利要求1所述將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染 色體同一個整合位點的方法，其特徵在於，所述的枯草芽孢桿菌整合質粒為能與枯草芽孢 桿菌染色體基因組發生同源交換的質粒PDG364及其衍生質粒或pDL及其衍生質粒；所述的 抗性基因篩選標記A為氯黴素；所述的替換抗性基因篩選標記的質粒為JM103 (pCm: :Er)、 JM103(pCm: :Nm)、JM103 (pCm: Sp)、JM103(pCm: :Tc)；所述的抗性基因篩選標記 B 為紅黴 素、新黴素、狀觀黴素或四環素。
4.根據權利要求1所述將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌 染色體同一個整合位點的方法，其特徵在於，所述的枯草芽孢桿菌整合質粒為能與枯草 芽孢桿菌染色體基因組發生同源交換的質粒PDG1661及其衍生質粒或pDG1662及其衍 生質粒；所述的抗性基因篩選標記A為氯黴素；所述的替換抗性基因篩選標記的質粒為 JM103(pCm: :Er)、JM103(pCm: :Nm)、JM103(pCm: :Tc)；所述的抗性基因篩選標記 B 為紅黴素、新黴素或四環素。
5.根據權利要求1所述將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌 染色體同一個整合位點的方法，其特徵在於，所述的枯草芽孢桿菌整合質粒為能與枯草 芽孢桿菌染色體基因組發生同源交換的質粒PDG1663及其衍生質粒或pDG1664及其衍 生質粒；所述的抗性基因篩選標記A為紅黴素；所述的替換抗性基因篩選標記的質粒為 JM103(pEr: :Cm)、JM103(pEr: :Nm)、JM103(pEr: :Pm)；所述的抗性基因篩選標記 B 為氯黴 素、新黴素或腐草黴素。
6.根據權利要求1所述將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染 色體同一個整合位點的方法，其特徵在於，所述的枯草芽孢桿菌整合質粒為能與枯草芽孢 桿菌染色體基因組發生同源交換的質粒PSG1154、pSG1190、pSG1191、pSG1192、pSG1193或 pSG17^及它們相對應的衍生質粒；所述的抗性基因篩選標記A為狀觀黴素；所述的替換抗 性基因篩選標記的質粒為PVK73 ；所述的抗性基因篩選標記B為新黴素。
7.根據權利要求1所述將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染 色體同一個整合位點的方法，其特徵在於，所述的枯草芽孢桿菌整合質粒為能與枯草芽孢 桿菌染色體基因組發生同源交換的質粒pDG1728、pDG1729、pDG1730或pDG1731及它們相對 應的衍生質粒；所述的抗性基因篩選標記A為狀觀黴素；所述的替換抗性基因篩選標記的 質粒為pVK73 ；所述的抗性基因篩選標記B為新黴素。
8.根據權利要求1所述將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染 色體同一個整合位點的方法，其特徵在於，所述的枯草芽孢桿菌整合質粒為能與枯草芽孢 桿菌染色體發生同源交換的質粒PAXOl及其衍生質粒或pAX-spac及其衍生質粒；所述的 抗性基因篩選標記A為紅黴素；所述的替換抗性基因篩選標記的質粒為JM103(pEr: :Cm)、 JM103(pEr: :Nm)、JM103 (pEr :Pm)或JM103 (pEr: : Sp)；所述的抗性基因篩選標記B為氯黴 素、新黴素、腐草黴素或狀觀黴素。
全文摘要
本發明公開了將兩個或兩個以上外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體同一整合位點的方法。首先將外源基因表達單元克隆到含抗性基因篩選標記A的整合質粒，利用整合質粒將外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體獲得重組菌1，然後利用替換抗性基因篩選標記的質粒將重組菌1中的抗性基因篩選標記A替換為另一抗性基因篩選標記B，得到重組菌2。整合質粒再轉化重組菌2，通過抗性基因篩選標記A和B進行篩選得到包含兩個外源基因表達單元的重組菌。重複替換抗性基因和整合，可以獲得兩個以上相同或不同的外源基因表達單元整合到枯草芽孢桿菌染色體的重組菌。這種方法對構建整合型枯草芽孢桿菌表達菌株具有重要的應用前景。
文檔編號C12R1/125GK102127530SQ20101056364
公開日2011年7月20日 申請日期2010年11月29日 優先權日2010年11月29日
發明者廖東慶, 張雲光, 李叢, 李曉明, 梁蓮華, 韋玉琴, 黃日波 申請人:南寧邦爾克生物技術有限責任公司