微囊化材料及其製備方法

2023-04-30 09:27:01

專利名稱：微囊化材料及其製備方法
技術領域：
本發明涉及藥物投遞系統領域。特別是，本發明涉及用無抗原性生物可降解材料製備微囊藥物的方法，還涉及微囊化組合物，其靶向消化生物可降解包衣，並在細胞內或積累部位釋放完整藥物或活性成分的吞噬細胞，如巨噬細胞、內皮細胞、肝巨噬細胞、樹突細胞等，或患病器官(如肝、腎、肺、心臟、脾)，或患病位點(如腫瘤、關節)。該組合物可用於治療和預防疾病。
背景技術：
我們實驗室(和在先前同時待審申請)已證實，包含於清蛋白微球體(MS)中的水溶性化合物的微囊化靶向產生大多數前炎性細胞因子的吞噬細胞，如巨噬細胞/單核細胞。該技術已證實提高細胞因子抑制化合物的功效，如中和抗體。我們已進一步評估了製備含其他種類的藥物，如CNI-1493(一種抑制p38 MAP激酶的脒基腙化合物)、氯膦酸鹽(clodronate)(一種二膦酸鹽)、抗氧化劑如吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate)、及NF-kB的反義寡聚物的清蛋白微球體的方法。這些化合物的微囊化在體內全血模型、內毒素休克模型及細菌敗血性休克模型中提高細胞因子如TNF和IL1-β的抑制作用。我們也評估了製劑，並完成了黑素瘤疫苗製劑的效率檢測試驗，它在小鼠中很好地抑制腫瘤。
發明概述在本發明的第一個實施方案中，對以前開發的乳化方法學中的各種過程參數、材料和反應條件進行了擴展(也在上述引用的待同時待審申請中進行描述)。
針對特定患病位點的藥物遞送有助於降低對患者的副作用，從而預防毒性。通過使用微囊形式的藥物，可預防藥物暴露在非患病器官和組織中。
先前在同時待審申請中已公開了一種通過乳化方法，以橄欖油為乳化介質製備微囊化單克隆抗體的方法。此處我們公開了以幾種不同的油為乳化介質，並在不同的溫度下評估生物活性蛋白藥物，即NF-kB的反義寡核苷酸後的另外的數據，而且也對用不同的水溶性溶劑溶解藥物的過程進行了評估。
在本發明的第二個實施方案中，通過一種新型的噴霧方法，以不同的藥物、不同的溶劑、不同的溫度和方法學變量為例製備微球體。
用本乳化方法評估的其他種類的藥物如下a)生物活性蛋白藥物(如NF-kB的反義寡核苷酸)；b)疫苗製劑抗腫瘤(黑素瘤)疫苗製劑；c)化學藥物如CNI-1493(一種脒基腙化合物)及氯膦酸鹽(一種二膦酸鹽)。
在該實施方案中，我們評價了不同溶劑、不同溫度和方法學變量。用該噴霧方法評估的藥物是NF-kB的反義寡核苷酸。
在具體的實施方案中，本發明提供了一種通過噴霧包囊生物活性物質的方法，包括a.在水中溶解清蛋白；b.在磷酸鹽緩衝液(PBS)中溶解NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)；c.將溶解的清蛋白和溶解的NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)混合在一起；d.將步驟c形成的混合物冷卻；e.提供溶劑；f.冷卻步驟e的溶劑；g.將步驟f的溶劑維持在低溫下，以形成溶劑系統；h.攪拌步驟g的溶劑，將溶解的清蛋白和溶解的NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)噴霧溶解到溶劑中；i.評估含微囊化清蛋白藥物微球體的溶劑系統尺寸以獲得微球體；j.在攪拌溶劑系統並維持在低溫下時用戊二醛交聯微球體；k.用溶劑洗滌步驟j的微球體；l.測定步驟k中的微球體大小；及m.將步驟l的微球體冷凍乾燥。
上述遞送系統表明NF-kB的反義寡核苷酸可非常有效地抑制吞噬細胞如巨噬細胞、白細胞、樹突細胞和內皮細胞參與的細胞因子介導的過程。從這些研究中，其他幾個申請如下相關A)細胞因子相關疾病a)纖維化症候群TGF-β的反義化合物可用於抑制纖維化症候群中TGF-β的參與。
b)類風溼性關節炎TNF-α和IL-1-β的反義化合物可用於類風溼性關節炎。
c)移植排斥TNF-α和IL-1-β的反義化合物可用於抑制細胞因子(如TNF-α和IL-1-β)在器官移植時的釋放。
d)再灌注損傷TNF-α和IL-1-β的反義化合物可用於抑制細胞因子在再灌注損傷時的釋放。
e)敗血性休克吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(一種抗氧化劑)可用於抑制細胞因子(例如TNF-α和IL-1-β)的釋放。該藥物抑制NF-kB的激活作用。NF-kB是一種負責激活前炎性細胞因子的核轉錄因子。
B)疫苗遞送系統a)抗腫瘤疫苗微球體可用作與本申請證實的黑素瘤疫苗製劑類似的幾種類型疫苗製劑的有效疫苗遞送系統。
b)抗AIDS疫苗微球體可能用作抗AIDS病毒的有效疫苗遞送系統。AIDS病毒實際上在巨噬細胞中感染並擴增，由於微球體可被巨噬細胞有效攝入，因此將抗AIDS疫苗製劑加到微球體中可將其直接靶向巨噬細胞。而且這些微球體可包含抗AIDS藥物，如AZT，從而可直接在已知AIDS病毒擴增的位點，即巨噬細胞中釋放藥物。
C)抗腫瘤持續性藥物遞送系統a)治療癌症的白介素-12持續性釋放微球體考慮到癌症治療通常是長期的，對於治療癌症治療性藥物的持續性釋放是一個令人關注的問題。這樣可能使用更低的劑量而達到與常規的非持續性劑量形式相同的治療效果。隨著生物技術的出現和分子生物學技術的發展，我們的抗腫瘤庫已很快擴展到包括蛋白藥物、肽類和細胞因子類。這些新型的武器，儘管有效，但仍需要適當的遞送系統。由於這些藥物本質上是蛋白質，因此它們可能是血液中酶的靶標。因此注射這些藥物時需要很高的劑量，這不僅花費昂貴，而且是潛在危險的。白介素-12是最近發現的異二聚體細胞因子。在多種癌症的動物模型中已表明，白介素-12具有巨大的抗腫瘤潛力。利用遺傳工程學構建的成纖維細胞，已證實較低濃度的白介素-12的持續存在產生與更大濃度但不持續存在的白介素-12相同的抗腫瘤效果。但是，產生遺傳工程細胞不太容易，而且由於考慮到所涉及的花費和勞動力，將其用於大規模治療甚至更加困難。更好的選擇是形成顆粒藥物遞送系統，例如微球體，這樣不僅可保護這些蛋白藥物免受血液中酶的作用，而且可維持藥物的釋放。微球體除了具有可用大量生物可降解多聚體進行製備的優點外，還具有可大規模生產的另外的優點。
我們已評估了生物可降解清蛋白微球體在維持白介素-12釋放方面的作用。當對具有皮下黑素瘤的C57BL/6小鼠進行腹膜內給藥時，如果以周劑量的一半的溶液製劑進行給藥微球體，則可顯著延長存活時間。微球體劑型通常也產生更低水平的肝腎功能酶，這表明具有更低的毒性作用。
D)轉染系統微球體可用作將遺傳物質轉染到細胞中的有效工具。目前的一些細胞轉染方法可在轉染過程，例如顯微操作中導致大量細胞死亡。由於我們研究所用的微球體大小小於1微米，因此它們很容易被細胞攝入，從而將微球體中的藥物/物質直接轉移到細胞中。
本發明的其他特徵和優點可通過以下本發明實施方案的詳細描述及參考後附的權利要求而更加明顯。
附圖簡述在附圖中舉例說明本發明，其中相同的參考字符或參考表示整個圖片中相同或相似部分或參數(除非特別註明)

圖1所示的是利用以水為溶解藥物的水相在5攝氏度製備的不同的油，通過乳化方法和噴霧方法，NF-kB反義(AS)寡聚物的百分比藥物含量分析。
圖2所示的是利用作為溶解藥物水相的水和橄欖油在不同溫度設置下製備的批次，通過乳化方法和噴霧方法，NF-kB反義(AS)寡聚物的百分比藥物含量分析。
圖3所示的是通過乳化方法和噴霧方法，用橄欖油在10攝氏度製備的不同水相，NF-kB反義(AS)寡聚物的百分比藥物含量分析。
圖4所示的是通過乳化方法和噴霧方法，用不同的油製備NF-kB反義(AS)寡聚物的微球體的TNF-α水平。
圖5所示的是通過乳化方法和噴霧方法，在製備NF-kB反義(AS)寡聚物的過程中使用不同溫度時的TNF-α水平。
圖6所示的是通過乳化方法和噴霧方法，在製備NF-kB反義(AS)寡聚物的過程中測試的使用不同水相的TNF-α水平。
圖7所示的是在80微克MECA研究中所含的20微克ECA的腫瘤發病率。
圖8所示的是CNI-1493對內毒素誘導的TNF-α釋放的影響。
圖9所示的是CNI-1493對內毒素誘導的IL-1-β釋放的影響。
圖10所示的是不同劑量的可溶性(SOL)和微囊化(MC)CNI-1493對內毒素血症誘導的TNF-α水平的影響。
圖11所示的是不同劑量的可溶性(SOL)和微囊化(MC)CNI-1493對內毒素血症誘導的IL-1-β水平的影響。
圖12故意省略。
圖13所示的是氯膦酸鹽對內毒素誘導的TNF-α釋放的影響。
圖14所示的是氯膦酸鹽對內毒素誘導的IL-1-β釋放的影響。
圖15所示的是NF-kB反義(AS)寡聚物對在微球體(MS)和溶液(Soln)製劑中TNF-α抑制的影響。
圖16所示的是NF-kB反義(AS)寡聚物對微球體(MS)和溶液(Soln)製劑中IL-1-β水平的影響。
圖17所示的是在內毒素休克大鼠模型中，反義NF-kB微球體的劑量應答研究的影響。
圖18所示的是在內毒素休克大鼠模型中，用NF-kB(微球體和溶液)治療對TNF-α水平的影響。
圖19所示的是在內毒素休克大鼠模型中，用反義NF-kB微球體進行同時治療的劑量應答研究對存活率的影響。
圖20所示的是在內毒素休克大鼠模型中，用NF-kB反義寡聚物的微球體和溶液形式同時(S)處理對存活率的影響。
圖21所示的是用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進行同時(S)處理對TNF-α水平的影響。
圖22所示的是用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進行同時(S)處理對存活率的影響。
圖23所示的是用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進行延遲(D)處理對TNF-α水平的影響。
圖24所示的是用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進行延遲(D)處理對IL-1-β水平的影響。
圖25所示的是用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進行延遲(D)處理對存活率的影響。
圖26所示的是在全血模型中，通過用不同溶解系統製備的NF-kB反義(AS)寡聚物微球體，製備條件對抑制TNF-α的影響。
圖27所示的是體外PDTC對細胞因子水平的影響。
實施方案的詳細描述我們首先對原來在同時待審申請中公開的乳化方法的擴展進行描述。
我們進一步擴展了對用不同藥物、不同的油在不同過程溫度及用於溶解藥物的不同水性溶劑製備的微球體的檢測，還基於最初的專利申請，其中以清蛋白為多聚體基質、橄欖油為乳化介質，用針對細胞因子拮抗劑的單克隆抗體通過乳化方法製備微球體，評估了製備方法中的變量。
實施例1描述了通過乳化典型的生物活性蛋白，即核轉錄因子NF-kB的反義寡核苷酸進行包被。過程參數擴展包括對低芥酸菜子油(canolaoil)、棉子油(cottonseed oil)和礦物油的檢測。結果表明所檢測的油均能夠很好地工作。其他的生物惰性植物油或其他油，根據特定的生物惰性，包括但不限於，例如，葵花油、紅花油、豆油、棕櫚油、棕櫚仁油、椰子油、蓖麻油(caster)、花生油、gingley油、魚油、芝麻油、米糠油等，其所含的亞成分包括但不限於，例如，單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUEA)和必需脂肪酸(EFA)及上述混合物。其他礦物油包括但不限於重、輕及各種亞級分及其組合，包括在本發明範圍內。
對冷卻溶劑的溫度範圍進行檢測和擴展。檢測了5-40攝氏度的溫度範圍，並得到可以接受的結果。當溫度低於約5攝氏度時可能導致至少水溶性組分部分凍結，因此是不可取的。
進一步，水相的選擇目前擴展到包括但不限於，水、磷酸鹽緩衝液、水加吐溫80及鹽水。
實施例2描述了典型腫瘤疫苗藥物，即細胞外抗原的微球體形成及獲得的生物活性。
實施例3描述了水溶性藥物，即CNI-1493，一種脒基腙的微球體形成及獲得的生物活性。檢測結果表明利用本發明方法微囊化的CNI-1493在減緩內毒素或細胞因子釋放方面比相應劑量的可溶性非微囊形式更有效。
實施例4描述了典型化學藥物，即氯膦酸鹽，一種二膦酸鹽的微球體形成及獲得的生物活性。
實施例5描述了典型生物活性蛋白藥物，即NF-kB的反義寡核苷酸的微球體形成及獲得的生物活性。
實施例6描述了通過本發明的新型噴霧方法形成NF-kB的反義寡核苷酸的微球體製劑及獲得的生物活性。
本發明將結合以下僅用於舉例說明的實施例進行進一步描述。除非特別規定，這些實施例中出現的部分和百分比均以重量計算。而且應注意，除非特別聲明，形成微球體的方法中使用的是橄欖油。
實施例；第一部分實施例1生物活性蛋白藥物NF-kB-在敗血性休克中的臨床應用-NF-KB反義寡聚物的配製和檢測A)簡介NF-kB是一類核轉錄因子，以與IkB結合的非活性形式存在於細胞質中。內毒素刺激胞內介質，導致IkB磷酸化，將NF-kB轉位到核中，隨後激活DNA。從而很快產生合成多個前炎性介導物，包括TNF、IL1和IL6的mRNA。我們已發現針對NF-kB的p65亞單位的微囊化反義寡聚物(MSASO)在體外抑制TNF、IL1和IL6。反義化合物由於其可抑制特異蛋白合成的能力而有潛力作為非常有效的治療藥物。但反義治療的一個限制因素是這些大化合物很難獲得足夠的細胞內滲透。我們以前的工作已表明使用NF-kB反義物通過微囊化的細胞內遞送提高在細胞因子抑制的效率。微囊化改善了反義化合物的遞送，因為細胞內的寡核苷酸很快被轉運到核內。我們以前的研究已通過在內毒素休克及膿毒症大鼠模型中證實了針對NF-kB p65部分的微囊化反義物的效率大大提高證實了該假設。
B)通過清蛋白製備NF-kB的反義寡核苷酸。
1)將50mg人清蛋白溶於2cc無熱源的水中。
2)將NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)以25mg/cc的濃度單獨溶解在磷酸鹽緩衝液(PBS)中。
3)將上述兩種溶液在一起混合約30分鐘。
4)將得到的混合物冷卻到5攝氏度。
5)將20cc橄欖油倒入50cc燒杯中，冷卻到5攝氏度，並在冰浴中維持該溫度。
6)將清蛋白及寡核苷酸混合物加到油中，並用Branson超聲波儀以適中設置乳化20分鐘。
7)用雷射顆粒篩選器估計含有微囊化清蛋白-藥物微球體的乳劑大小，直到微球體直徑約1微米。
8)將微球體與0.5cc 25％w/v戊二醛溶液交聯1小時，並用組織勻漿器以高設置進行恆定攪拌，同時用冰浴維持在約5攝氏度的溫度。
9)微球體用20cc甲醇洗滌3次，最後用連續HPLC過濾器(50、20、10、5和1微米大小)篩分並懸浮在最終的甲醇洗滌物中。
10)將微球體冷凍乾燥並儲存在冰箱中直至使用。
在所有情況下，微球體在使用前均懸浮在無熱源的水或鹽水中。
重複上述程序，以評估使用不同類型的油為乳化介質，除了上述的5攝氏度外，對不同溫度在製備中的影響也進行了評估。最後，除水外，也評估了不同溶劑作為介質溶解藥物的能力。被評估的每個參數的詳細說明如下a)不同油的影響在研究中對不同的油，例如低芥酸菜子油、棉子油和礦物油進行了評估，並與以前製備微球體所用的橄欖油進行比較。應理解可以使用任何生物惰性的植物油或礦物油。
b)不同溫度的影響在較寬的溫度變化，如5、10、30和40攝氏度下製備微球體。因此本發明的方法可在約5-40攝氏度的溫度範圍內進行。
c)溶解藥物的不同水相的影響除水和磷酸鹽緩衝液(PBS)之外，使用含吐溫TM-80(聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯，購自ICI Americas，Inc.)的水和鹽水檢驗是否存在顯著差異。
用體外全血模型進行評估TNFα抑制作用的藥物含量分析和效率。對以下製備程序中的變量進行評估。
C)實驗方法a)藥物含量分析通過我們實驗室發展的HPLC進行藥物含量分析。
b)用體外全血模型評估TNFα抑制作用的效率研究。
用全血模型評估製劑的藥物效率，簡述如下將血液倒入含EDTA的lavender top管中。將血液分成3個5ml的等份樣品，並用以下批次的微球體的一種預處理1小時並用內毒素(100mcg/m1)刺激。在內毒素刺激0和4小時之後取樣並測定TNF-α水平。由於加入微囊化NF-kB寡聚物而產生的細胞因子抑制效率與同時待審專利申請中所述用橄欖油製備的微球體進行比較。
D)結果不同油對藥物含量分析的影響圖1所示的是通過乳化方法和噴霧方法用不同的油，以水為水相溶解藥物，在5攝氏度製備的NF-kB反義(AS)寡聚物的百分比藥物含量分析。各批次之間在p＜0.05無顯著性差異。雖然預計可使用輕礦物油和其他植物性油，但也使用了重礦物油(因為該術語是本領域熟練人員所熟知的)。溫度變化對藥物含量分析的影響圖2所示的是通過乳化方法和噴霧方法，用作為溶解藥物的水相的水和橄欖油，在不同溫度設置下製備的批次的NF-kB反義(AS)寡聚物的百分比藥物含量分析。各批次之間在p＜0.05無顯著性差異。在約5攝氏度以下，水相開始凝結，從而降低產量和活性。
使用的不同水相對藥物含量分析的影響圖3所示的是通過乳化方法和噴霧方法(如下述實施例6的詳細描述)用橄欖油在10攝氏度製備的不同的水相的NF-kB反義(AS)寡聚物的百分比藥物含量分析。各批次之間在p＜0.05無顯著性差異。不同的油對TNFα抑制的影響圖4所示的是通過乳化方法和噴霧方法用不同的油製備的NF-kB反義(AS)寡聚物微球體的TNFα水平。用水溶解藥物，溫度維持在5攝氏度。用橄欖油和其他油製備的各種批次之間在p＜0.05無顯著性差異。溫度變量對TNFα抑制的影響圖5所示的是通過乳化方法和噴霧方法在NF-kB反義(AS)寡聚物的製備過程中使用不同溫度的TNFα水平。在該過程中使用的是橄欖油。在不同的溫度設置下，各批次之間在p＜0.05無顯著性差異。使用的不同水相對TNFα抑制的影響圖6所示的是通過乳化方法和噴霧方法在NF-kB反義(AS)寡聚物的製備過程中檢測的用不同水相的TNFα水平。用橄欖油在10攝氏度製備微球體。使用不同的水相製備的各批次之間在p＜0.05無顯著性差異。
實施例2-腫瘤疫苗藥物-在腫瘤疫苗中以微球體為佐劑或聯合佐劑的腫瘤保護研究A)簡介免疫應答的誘導是一個需要用完整的免疫系統進行評估的綜合和複雜的過程。因此用小鼠的腫瘤模型來評估微囊化細胞外抗原(MECA)疫苗製劑。疫苗中所用的抗原來源於在培養中生長的B16鼠黑素瘤細胞。並使用與B16鼠黑素瘤細胞同源的C57BL/6小鼠。該疫苗是一種預防性腫瘤疫苗，首先對小鼠進行接種，以誘導抗腫瘤應答。然後刺激小鼠，從而測定抗腫瘤應答是否被誘導有能力以抑制鼠黑素瘤的建立。
B)製備黑素瘤疫苗製劑。
根據實施例1描述的方法製備微囊化疫苗製劑。
C)實驗方法。
免疫和腫瘤保護研究以戊二醛為交聯劑，通過油包水的乳化交聯技術製備MECA(總量80μg MECA中含20μgECA)和空白MP(微粒)。為了評估在第一次研究(共80μg MECA)中使用的等量的微粒中20μg胞外抗原的抗腫瘤作用，對3組8-12周齡的C57BL/6雌性小鼠(n＝5)進行皮下接種。這3組分別用20μg包含於總量為80μg微囊化胞外抗原MECA，並用PBS重懸到總體積為100μl中的胞外抗原(ECA)、溶解在PBS中的胞外抗原溶液(ECA solu)及溶解在PBS中的空白微粒(空白MP)進行接種。對小鼠每周接種一次，接種3周，共注射4次。最後一次接種7天後，用7×105成活的B16黑素瘤細胞對小鼠在對側位置進行皮下刺激，如上所述。然後對小鼠的腫瘤發展觀察60天，並記錄腫瘤的大小和腫瘤的發病率。
D)結果和討論C57BL/6雌性小鼠用MECA(20μgECA包含於總量為80μg的MECA中)，空白MP或ECA溶液進行皮下接種。第一次免疫接種後，小鼠每周接種一次，共進行3周。最後一次接種7天後，以7×105成活的同源B16黑素瘤細胞在遠離的位點接種C57BL/6小鼠。然後監測小鼠的腫瘤發展，並報告腫瘤的發病率(圖7)。本研究中MECA組在第60天仍有80％無腫瘤。相反在空白微粒組中有40％無腫瘤，ECA溶液組中有0％的小鼠無腫瘤。
本研究表明微囊化腫瘤抗原具有佐劑作用，可通過靶向專職抗原呈遞細胞而誘導腫瘤免疫。另外，在第60天空白微粒組有40％的小鼠無腫瘤的結果表明，由於BSA和B700腫瘤抗原之間具有同源性，因此BSA微粒可能是B16黑素瘤很好的佐劑。
圖7所示的是包含於80微克MECA研究中的20微克ECA的發病率。用總體積100微升PBS對小鼠進行皮下接種，共注射4次。每周進行1次接種。最後一次接種7天後，用7×105成活的腫瘤細胞(B16)進行刺激，並監測MECA組和對照組ECA溶液(ECA SOLN)和空白微粒(空白MP)組的發病率。
E)結論。
體內劑量應答研究表明，在本研究中20μg包含於80μg MECA中的ECA的接種劑量可很好的進行工作。該MECA疫苗的接種劑量可在直到60天的研究期內仍有80％的C57BL/6小鼠保持無腫瘤。本研究表明微囊化腫瘤抗原通過靶向專職抗原呈遞細胞在誘導腫瘤免疫中具有佐劑作用。另外，在第60天空白微粒組有40％的小鼠無腫瘤的結果表明，由於BSA和B700腫瘤抗原之間具有同源性，因此BSA微粒可能是B16黑素瘤極好的佐劑。
B16鼠源黑素瘤是一種非常嚴格的腫瘤模型。因此更可能代表人的癌症情況。這些結果表明微粒誘導產生更強的抗腫瘤作用。
實施例3-化學藥物，CNI-1493一種脒基腙化合物-在敗血性休克中的應用-微囊化CNI-1493的配製和檢測-通過微囊化CNI-1493在實驗性敗血性休克中預防致死率和抑制前炎性細胞因子A)簡介動物的內毒素血症與由激活的巨噬細胞和多形核細胞釋放的多效性細胞因子，例如TNFα和IL-1-β有關。抑制這些細胞因子作用的實驗性藥物，例如單克隆中和抗體(TNFα單克隆抗體)、受體拮抗劑(IL-1受體拮抗劑)和受體融合蛋白已在動物和臨床實驗中對其在敗血性休克中的效率進行了評價。最近，新開發的水溶性四價脒基腙化合物，命名為「CNI-1493」(N，N』-雙[3，5-二乙醯苯基]癸二醯胺脒腙四氯化氫)顯示在降低動物中脂多糖(LPS)誘導的TNFα、IL-1-β和IL-6的釋放中是有效的。
我們先前已報導，在各種體外和體內疾病模型中，微囊化細胞因子中和抗體與可溶形式相比增加它們的作用效果。同樣，由於微囊化藥物被巨噬細胞靶向吸收，其他細胞因子拮抗劑的微球體形式也比相應的可溶形式更有效。在本實施例中，我們通過結合的細胞因子網絡對微球體形式的新開發的化合物CNI-1493的功效進行評價。使用體外內毒素誘導的細胞因子釋放全血模型和內毒素血症和大腸桿菌誘導的腹膜炎的體內模型對可溶形式和微囊形式的CNI-1493的功效進行比較評估。
B)CNI-1493微球體的製備。
根據實施例1製備微囊化CNI-1493製劑。
C)實驗方法a)全血模型中體外內毒素誘導的細胞因子釋放在EDTA中收集5隻大鼠中每個樣品(n)的血液(每ml血含1.5mg EDTA)，並匯集在一起。在基線血漿樣品之後將血液等分為5組。每組有6個重複。每組進行以下一種處理0.25、0.5或1.0微克/毫升鹽水或可溶形式的CNI-1493或空白微球體(MC)，或0.25、0.5或1.0微克/毫升MC形式的CNI-1493。所有組在含5％CO2的氣氛中，37℃下溫育。溫育2小時後，向所有組中加入獲自大腸桿菌的內毒素0113(100ng/ml)(Associates of Cape Cod，Wood Hole，Massachusetts)，另外溫育24小時。在加入內毒素2、4、6和24小時後定時收集血漿樣品，並通過改進的鹼性磷酸酶ELISA技術測定TNFα和IL-1-β。
b)內毒素血症體內模型每組共有4隻大鼠。每組大鼠進行以下一種靜脈注射處理1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg或10mg/kg鹽水或可溶形式的CNI-1493或空白MC，或1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg或10mg/kg MC形式的CNI-1493。所有的大鼠也用15mg/kg從大腸桿菌獲得的內毒素0113(Associates of Cape Cod，Wood Hole，Massachusetts)進行靜脈注射，並監測7天的存活率。在加入內毒素0、2、4、8、24和48小時後，從大鼠的尾靜脈處收集血液，並用ELISA技術測定TNFα和IL-1-β。
c)大腸桿菌誘導的腹膜炎的體內模型每組共6隻大鼠。每組大鼠進行以下一種處理靜脈注射鹽水，或靜脈注射空白MC，或靜脈注射2mg/kg或5mg/kg可溶形式的CNI-1493，或靜脈注射2mg/kg或5mg/kg MC形式的CNI-1493，或靜脈注射2mg/kg或5mg/kg可溶形式的CNI-1493及腹膜注射15mg/kg慶大黴素，或靜脈注射2mg/kg或5mg/kg MC形式的CNI-1493及腹膜注射15mg/kg慶大黴素。所有的大鼠均腹膜注射1×1010CFU大腸桿菌活菌，並監測5天的存活率。在注射大腸桿菌0、2、4、8、24和48小時後，從大鼠的尾靜脈處收集血液，並用ELISA技術測定TNFα和IL-1-β。
D)結果和討論全血模型中內毒素誘導的細胞因子釋放CNI-1493對內毒素誘導的TNFα和IL-1-β釋放的影響分別如圖8和9所示。空白MC的存在並不顯著影響內毒素誘導的TNFα和IL-1-β的釋放。劑量為0.25微克/毫升可溶形式的CNI-1493不改變內毒素誘導的TNFα和IL-1-β的釋放，但0.5和1.0微克/毫升CNI-1493可顯著降低內毒素誘導的TNFα和IL-1-β的釋放。另外，含0.25、0.5和1.0微克/毫升CNI-1493的所有劑量的MC形式的CNI-1493顯著(p＜0.05)降低內毒素誘導的TNFα和IL-1-β的釋放。另外，所有劑量的MC形式的CNI-1493對內毒素誘導的細胞因子釋放的降低程度明顯大於相應的可溶形式的CNI-1493。
內毒素血症體內模型存活率數據如表1所示。
表1致死性內毒素血症中使用可溶形式(Sol.)和微囊化(MC)CNI-1493的存活率的比較。
*-使用Mann-Whitney檢測，當與相等劑量的Sol.CNI-1493或單獨內毒素進行比較時，在p＜0.05的顯著性。
所有用1、2、5mg/kg可溶形式的CNI-1493處理的動物在注射內毒素24小時之內均全部死亡，而50％用10mg/kg可溶形式的CNI-1493處理的動物和25％用1mg/kg劑量的MC形式的CNI-1493處理的動物在注射內毒素後仍然存活7天。另外，所有(100％)經過2、5和10mg/kgMC形式的CNI-1493處理的動物在注射內毒素後都存活7天。本研究的細胞因子水平如圖10和11所示(圖12特意省略)。可溶形式和MC形式的CNI-1493對TNFα水平的降低程度較大，而對IL-1-β水平的降低程度較小。但MC形式的CNI-1493在降低TNFα和IL-1-β二者的水平上顯著好於可溶形式的CNI-1493。
敗血性休克的大腸桿菌誘導的腹膜炎模型存活數據如表2所示。
表2大腸桿菌誘導的腹膜炎中使用可溶形式(Sol.)和微囊化(MC)CNI-1493的存活率的比較。
*-使用Mann-Whitney檢測，當與大腸桿菌+鹽水組或大腸桿菌+空白微球體組進行比較時，在p＜0.05的顯著性。
在注射大腸桿菌4到8小時內，所有用鹽水或空白MC或2mg/kg可溶形式的CNI-1493或5mg/kg可溶形式的CNI-1493或2mg/kg MC形式的CNI-1493預處理的動物均全部死亡。用5mg/kg MC形式的CNI-1493或2mg/kg可溶形式的CNI-1493及慶大黴素處理後，存在存活率為17％的針對致死率的最小保護。在經過5mg/kg可溶形式的CNI-1493預處理的組中，給藥慶大黴素可使存活率增加到50％，在經過2mg/kg MC形式的CNI-1493預處理的組中可達到67％，在經過5mg/kg MC形式的CNI-1493預處理的組中可達到83％。可溶形式和MC形式的CNI-1493均降低大腸桿菌誘導的TNFα和IL-1-β水平，但MC形式的CNI-1493在降低大腸桿菌誘導的TNFα和IL-1-β的水平上顯著優於可溶形式的CNI-1493。
微囊化CNI-1493在體外和體內模型中顯著提高效率。結果表明MC形式的CNI-1493在降低內毒素或大腸桿菌誘導的細胞因子釋放和致死率上比相應劑量的可溶形式的CNI-1493更有效。在以前用微囊化細胞因子中和抗體的研究中，我們發現與相應的可溶形式的中和抗體相比較，在抑制內毒素誘導的細胞因子釋放和預防由於內毒素或大腸桿菌誘導的腹膜炎的致死率方面功效的改善。微囊化合物的效率(持續釋放方式除外)通過吞噬細胞的胞內釋放而進行放大。在吞噬細胞吞噬後從微球體中釋放的CNI-1493提供更高的胞內濃度，從而通過胞內作用機制有效抑制前炎性細胞因子。以前的研究已表明可溶性CNI-1493可抑制來自外周血單核細胞的LPS誘導的細胞因子，如TNFα、IL-1-β和IL-6，如本研究所見。推測CNI-1493抑制TNFα合成的機制在翻譯或翻譯後水平。在本研究中，MC形式的CNI-1493在體外和體內模型中可強烈抑制內毒素誘導的TNFα和IL-1-β水平，而可溶形式的CNI-1493抑制內毒素誘導的TNFα和IL-1-β水平的程度較小。在體外全血模型中，被最低劑量的MC形式的CNI-1493(0.25microM)抑制的內毒素誘導的TNFα水平的程度與最高劑量(1.0mM)的可溶形式的CNI-1493相似。這表明理論上MC形式的CNI-1493在抑制內毒素誘導的TNFα合成方面與至少4倍可溶形式的CNI-1493的效力相同。
MC形式的CNI-1493(2mg/kg)可對致死性內毒素血症提供完全的保護作用，而相同劑量的可溶形式的CNI-1493(2mg/kg)處理，沒有存活，而用5倍劑量可溶形式的CNI-1493(10mg/kg)處理，僅有50％的存活率。MC形式的CNI-1493對內毒素血症致死率的完全保護作用表明，微囊化遞送系統具有更高的效率。與慶大黴素與可溶形式的CNI-1493聯合使用(50％)相比較，在劑量為5mg/kg CNI-1493時，慶大黴素和MC形式的CNI-1493聯合使用的大腸桿菌誘導的腹膜炎模型中的存活率更高(83％)。在本致死性感染模型中，可溶形式和MC形式均不能抑制致死率，除非慶大黴素與CNI-1493聯合使用。這表明在幾種嚴重的感染情況下，抗生素的治療是非常必要的。腹膜炎實驗模型已表明，對單獨用抗生素或單獨可溶形式的TNFα中和抗體進行治療的抗性。實際上，以前沒有研究報導除了聯合使用抗生素和微囊化細胞因子拮抗劑治療外，在該模型中用可溶形式的細胞因子拮抗劑處理的改善存活率。
總之，我們在體外全血模型中已證明微囊化CNI-1493高效抑制內毒素誘導的TNFα和IL-1-β的釋放。改善的功效已在敗血性休克的內毒素血症和大腸桿菌腹膜炎模型中產生顯著更佳的存活率。
實施例4
-化學藥物-氯膦酸鹽-應用-腎小球性腎炎-清蛋白微囊化的氯膦酸鹽引起的巨噬細胞耗損巨噬細胞依賴的腎小球性腎炎中細胞因子釋放的衰減A)簡介巨噬細胞通過釋放細胞因子、化學因子和其他物質而在炎症過程中具有重要作用。可通過一種水溶性化合物——氯膦酸鹽引起的巨噬細胞耗損來評估巨噬細胞在各種炎症介導的疾病中的作用。氯膦酸鹽是一種二膦酸鹽，是破骨細胞介導的骨質再吸收過程的有效抑制劑，在臨床上用作治療代謝性骨病。游離(溶液)形式的氯膦酸鹽在全身給藥時對巨噬細胞功能的作用很小。但含有氯膦酸鹽的脂質體很容易被巨噬細胞吞噬，從而造成肝、脾、淋巴結和腹膜腔的巨噬細胞及全身循環的單核細胞的耗損。我們已開發一種用清蛋白微囊化氯膦酸鹽的方法，該法比使用脂質體具有幾種優勢。清蛋白可作為生物可兼容的多聚體基質，從而形成各種大小的微球體(MS)，該微球體比脂質體穩定性更大，更容易進行製備。清蛋白是一種生物可降解的無毒物質，具有高效的微囊化效率。本研究的目的是測定含氯膦酸鹽的清蛋白MS是否1)將產生全身性巨噬細胞耗損，2)在體外對內毒素誘導的TNFα和IL-1-β釋放有作用，及3)在大鼠的實驗性腎小球性腎炎(GN)中對巨噬細胞滲透有作用。結果表明，氯膦酸鹽MS有效耗損巨噬細胞，降低內毒素誘導的TNFα和IL-1-β的釋放，抑制實驗性GN誘導的巨噬細胞滲透到腎小球中。
B)微球體的製備。
微囊化氯膦酸鹽根據實施例1進行製備。
C)實驗方法a)在大鼠全血模型中比較游離形式和微球體形式的氯膦酸鹽的體外效率將6到7隻重200-500克Fisher大鼠(F-344)(從Harlan Sprague-Dawley獲得)經心臟穿刺採血，並對每個「n」合併。向每毫升血中加入10微升15％EDTA溶液，抑制血液凝聚。將血液等分，對每毫升血液分別加入25、50和100μg溶解在鹽水中的游離氯膦酸鹽或50、100和200μg氯膦酸鹽MS(由於微囊化氯膦酸鹽製劑中清蛋白∶氯膦酸鹽的比率為1∶1，因此分別相當於25、50和100μg游離氯膦酸鹽)。來自每隻大鼠的一份血液也用50μl鹽水或400μg空白MS進行處理。2小時後加入100ng/ml內毒素，然後將血液樣品在5％CO2的氣氛中，37℃溫育24小時。1000xg離心10分鐘，收集基線、2、4、6和24小時的血漿樣品，並用我們實驗室發展的改進鹼性磷酸酶ELISA技術測定TNFα和IL-1-β。
b)健康大鼠和具有抗GBM GN的大鼠中氯膦酸鹽引起的巨噬細胞耗損通過用溶解在弗氏完全佐劑(FCA，Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri USA)中的大鼠腎的膜級分重複免疫綿羊而獲得抗GBM球蛋白。將綿羊血清針對大鼠紅細胞加熱去互補並吸收兩次(體積比為10％)。用終濃度50％的硫酸銨沉澱製備球蛋白級分並針對磷酸鹽緩衝液充分透析。通過向從動物服務中心(Monash University，Clayton，Victoria，Australia)獲得的重100-150克的Sprague-Dawley雄性大鼠靜脈注射劑量為100μg/gm體重的綿羊抗大鼠GBM球蛋白而引起GN。在引起抗GBM GN 48小時之前，對一組大鼠用5mg氯膦酸鹽MS(假設含有重量不超過50％的氯膦酸鹽)處理，而另一組不用氯膦酸鹽處理。以一組不進行任何抗GBM GN處理的健康正常大鼠作為對照。在注射抗GBM 72小時後，將所有的大鼠(包括健康對照大鼠)處死，從而獲得脾、肝和腎的組織樣品。然後將組織樣品在高碘酸鹽-賴氨酸-低聚甲醛中固定4小時，用7％蔗糖溶液洗滌，然後凍存在液氮冷凍的異戊烷中。
將凍存組織在低溫保持器中切成4mm的切片。用三層免疫過氧化物酶技術對組織切片進行染色。針對大鼠ED1的小鼠單克隆抗體，其是與細胞質抗原反應的pan-巨噬細胞標誌物，作為添加的一抗。然後以濃度為1∶100加入第二層兔抗鼠IgG球蛋白(Dako，Glostrup，Denmark)。然後以濃度1∶100加入過氧化物酶偶聯的鼠免疫球蛋白(Dako，Glostrup，Denmark)。然後將切片與二氨基聯苯胺(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri)溫育，並用蘇木素(Harris haemotoxylin)進行負染色。脾中巨噬細胞的數目通過計算10×1mm2紅髓區中ED1陽性細胞數並平均為細胞/mm2而獲得。肝中Kupffer細胞的數目通過計算10×1mm2肝索區中ED1陽性細胞數並平均為細胞/mm2而獲得。循環系統中的巨噬細胞以循環白細胞的比例進行計算。
D)結果和討論我們的研究結果表明包被在清蛋白中的小劑量氯膦酸鹽可有效耗損大鼠肝、脾、腎和外周血中ED1陽性巨噬細胞。氯膦酸鹽MS還迅速降低內毒素刺激的TNFα和IL-1-β釋放，比游離(溶液)形式的氯膦酸鹽更顯著，並抑制巨噬細胞向大鼠實驗性抗GBM GN過程中積累的腎小球中進行滲透。
已證明巨噬細胞耗損在評價巨噬細胞對病理狀態發展的作用上是一個非常有用的工具。
氯膦酸鹽是一種二膦酸鹽，在游離形式下對巨噬細胞的存活力有很小的作用，但包被在脂質體或MS(如本研究)中，則可在24-48小時內造成巨噬細胞群的暫時耗損。由氯膦酸鹽脂質體造成的巨噬細胞耗損是由於細胞凋亡誘導的細胞死亡而造成的。我們推測氯膦酸鹽MS具有相同的作用機制。
如本研究所見，用氯膦酸鹽MS預處理後對內毒素誘導的TNFα和IL-1-β釋放的降低已由別人通過氯膦酸鹽脂質體而發現。也已表明氯膦酸鹽脂質體可在鼠中降低細胞因子的基因表達。我們也發現，在全血模型中，與游離形式的氯膦酸鹽相比較，氯膦酸鹽MS更大程度降低內毒素誘導的細胞因子的釋放。含有不超過100μg游離氯膦酸鹽的最高劑量的氯膦酸鹽MS幾乎可完全抑制TNFα和IL-1-β釋放。氯膦酸鹽MS的作用機制可能是由於以與脂質體相似的方式對含氯膦酸鹽的清蛋白MS進行吞噬，然後在胞內釋放氯膦酸鹽，從而造成由於巨噬細胞的死亡導致的細胞因子釋放的抑制。氯膦酸鹽對細胞因子釋放的抑制對治療以前炎性細胞因子釋放為特徵的疾病可能是非常有利的。
以前的研究已表明，巨噬細胞在GN中腎損傷的誘導和發展中具有重要作用。GN的一個特點是蛋白尿和巨噬細胞滲透。我們的研究組以前已發現實驗性GN中氯膦酸鹽MS降低巨噬細胞滲透。我們已表明抗GBM誘導的GN造成巨噬細胞滲透(8.2個細胞/腎小球橫截面)，用氯膦酸鹽MS進行處理後抑制巨噬細胞滲透(2.2個細胞/腎小球橫截面)，類似本研究所見。另外，我們也已表明氯膦酸鹽MS(8.4mg/24小時)也可將抗GBMGN誘導的蛋白尿(43mg/24小時)顯著降低到正常健康大鼠中發明的相同的水平(5.3mg/24小時)。氯膦酸鹽MS可耗損GN中的巨噬細胞，因此在治療上是有用的。
氯膦酸鹽對內毒素誘導的TNFα和IL-1-β釋放的作用分別如圖13和14所示。空白MS的存在並不顯著影響內毒素誘導的TNFα和IL-1-β的釋放。低(25μg/ml)和中(50μg/ml)劑量的游離氯膦酸鹽並不改變內毒素誘導的TNFα和IL-1-β的釋放，但更高劑量(100μg/ml)游離氯膦酸鹽顯示降低內毒素誘導的TNFα和IL-1-β的釋放的趨勢。另外，含25、50和100μg/ml相當的游離氯膦酸鹽的所有劑量的氯膦酸鹽MS顯著降低內毒素誘導的TNFα和IL-1-β的釋放(p＜0.05)。
對ED1陽性巨噬細胞染色的組織切片表明，與健康對照大鼠相比較，接受氯膦酸鹽處理的大鼠的肝和腎中的ED1陽性的巨噬細胞顯著降低(p＜0.001)(參見表3)。
表3抗GBM GN的大鼠中氯膦酸鹽MS對巨噬細胞耗損的影響
a白細胞總數的百分比；*-在p＜0.001統計學顯著性。
外周血中的循環單核細胞也顯著降低(表3，p＜0.001)。同樣，ED1陽性巨噬細胞染色的腎切片表明，沒有巨噬細胞滲透到正常健康腎的腎小球中，也沒有誘導由ED1陽性巨噬細胞滲透造成的抗GBM GN。用氯膦酸鹽MS預處理在抗GBM GN中顯著降低巨噬細胞的滲透。
總之，這些研究表明含有氯膦酸鹽的清蛋白MS在大鼠中是一個全身性巨噬細胞耗損的有效工具。氯膦酸鹽MS引起的巨噬細胞耗損降低前炎性細胞因子，並改善已證實是巨噬細胞依賴的實驗性抗腎小球基膜GN。巨噬細胞的暫時性耗損可作為巨噬細胞依賴的疾病治療的一個特徵。
圖13所示的是在大鼠全血模型中游離形式的氯膦酸鹽(CLON)和微球體(MS)形式的CLON對內毒素誘導的TNF-α水平的影響。
向每毫升血中加入25、50和100μg溶解在鹽水中的游離氯膦酸鹽，或50、100和200μg溶解在鹽水中的氯膦酸鹽MS(分別相當於25、50和100μg游離氯膦酸鹽)。在所有組中，鹽水組每毫升血加入50μl鹽水，而空白MS組每毫升血加入400μg空白MS。2小時後加入100ng/ml內毒素，然後將血液在5％CO2的氣氛中，37℃溫育24小時。內毒素刺激後的血漿水平如本圖所示。在p＜0.05的水平上，MS形式的CLON降低內毒素誘導的TNFα的水平顯著好於游離形式的CLON。
圖14所示的是在大鼠全血模型中游離形式的氯膦酸鹽(CLON)和微球體(MS)形式的CLON對內毒素誘導的IL-1-β水平的影響。每毫升血加入25、50和100μg溶解在鹽水中的游離氯膦酸鹽，或50、100和200μg溶解在鹽水中的氯膦酸鹽MS(分別相當於25、50和100μg游離氯膦酸鹽)。在所有組中，鹽水組每毫升血加入50μl鹽水，而空白MS組每毫升血加入400μg空白MS。2小時後加入100ng/ml內毒素，然後將血液在5％CO2氣氛中，37℃溫育24小時。內毒素刺激後的血漿水平如本圖所示。在p＜0.05的水平上，MS形式的CLON降低內毒素誘導的IL-1-β的水平顯著好於游離形式的CLON。
實施例5-生物活性蛋白藥物-NF-KB-應用-敗血性休克-製備方法-乳化方法-含細胞因子拮抗劑，即NF-KB反義寡聚物(生物活性蛋白藥物)微球體的製備-在全血模型、內毒素休克模型和腹膜炎模型中的評估-微囊化的NF-KB反義寡聚物一種抑制前炎性細胞因子的新方式
A)簡介反義寡核苷酸與其特異的mRNA結合後可能產生單個蛋白合成的抑制作用。但反義化合物不足量的細胞內滲透限制了其作用效果。包含在微囊化清蛋白中的反義化合物則有利於巨噬細胞的正常吞噬作用，以將反義寡核苷酸遞送到胞內，從而提高寡聚物對核和胞質mRNA的暴露水平。將螢光標記的寡核苷酸顯微注射到巨噬細胞中，在幾分鐘內即出現在核內，從而立即與合成的mRNA相互作用。
我們實驗室的研究已表明清蛋白微囊1)在體外和體內可很快的被巨噬細胞吞噬，2)在肝、脾、腎和血液中分布在大於90％的單核細胞/巨噬細胞中，和3)遷移到感染區。以前的研究我們已表明，使用體內致死性內毒素休克模型和感染性腹膜炎模型中，微囊化TNF和IL1中和抗體在體外細胞因子抑制和動物存活率方面均有所提高。因此，微囊化藥物遞送直接靶向分泌大部分前炎性細胞因子的巨噬細胞中，可提高這些化合物的療效。
最近已對NF-kB進行研究，認為它是一種負責前炎性細胞因子，如TNF和IL1合成的核轉錄因子。其他參與前炎性過程的物質也由NF-kB調控。在膿血症和其他前炎性疾病，例如腎小球性腎炎、急性呼吸道衰竭症候群和腸炎中，NF-kB的活性增加。因此，NF-kB的反義寡核苷酸可能通過抑制前炎性細胞因子的合成而改變炎症症狀。這些化合物的微囊化可通過直接靶向巨噬細胞而進一步提高其效率。
本研究的目標如下a)測定NF-KB反義寡聚物的清蛋白微囊體是否可在體外全血模型中提高對內毒素刺激的TNF、IL1、IL6和IL8的抑制作用，和b)測定微囊化NF-KB的寡聚物是否可在體內內毒素休克和腹膜炎模型中抑制前炎性細胞因子和改善存活率。
B)微球體的製備。
根據實施例1製備微囊化NF-kB反義寡核苷酸。
C)實驗方法
a)體外全血模型從正常人志願者中採集血樣品，並分成多個1ml的等份樣品。向每個樣品中加入100μg大腸桿菌內毒素。
在以下溫育時間TNF---4小時，IL1---24小時之後，對每組通過ELISA測定細胞因子的水平，重複測定兩次。
對以下組進行研究1.對照內毒素+鹽水2.溶解在溶液中的NF-kB反義物，在加入內毒素前1小時給藥200和300μg/ml3.NF-kB無義(混雜的(scrambled))200和300μg/ml4.微囊化NF-KB反義寡聚物200和300μg/ml5.微囊化無義(混雜的)寡聚物200和300μg/mlb)體內內毒素休克模型通過靜脈注射15mg/kg大腸桿菌內毒素而在重約150克的Fischer大鼠中產生內毒素休克。通過ELISA在0、4、8、24和48小時測定TNF。並觀察5天內的存活率(120小時)。
在一個劑量應答研究完成後，對10隻大鼠注射300μg微囊化NF-KB反義寡聚物，對10隻大鼠靜脈注射300μg寡聚物溶液。
c)體內腹膜炎模型通過腹膜內注射1010大腸桿菌生物體而在大鼠中誘導產生腹膜炎。連續3天腹膜內注射15mg/kg慶大黴素。在0、4、8、24和48小時測定TNF。5天(120小時)內觀察存活率。
1.同時處理大腸桿菌腹膜內注射，以下處理同時進行，然後每日進行，持續2天。
a.對照b.微囊化NF-kB I.V.400μg/大鼠n＝10c.微囊化NF-kB I.V.200μg/大鼠n＝10d.NF-kB溶液I.V.400μg/大鼠n＝10
e.NF-kB溶液I.V.200μg/大鼠n＝102.延遲處理在最初腹膜內注射大腸桿菌(在TNF峰值水平)4小時後用上述劑量的寡聚物進行處理，然後再連續處理2天。
D)結果和討論NF-kB反義寡聚物微囊通過增加對巨噬細胞的胞內滲透而提高對前炎性細胞因子的抑制作用。使用體外全血模型，微囊化NF-kB反義寡聚物抑制為TNF＞IL1＞1L6＞IL8，均比相應量的寡聚物溶液的抑制作用大(p＜0.05)。在大鼠的內毒素休克模型中，微囊化NF-kB寡聚物在TNF抑制方面產生劑量依賴型的提高。在內毒素休克模型中，300μg/大鼠劑量的存活率為80％，而相應劑量的溶液的存活率為20％(p＜0.05)。在腹膜炎模型中微囊化寡聚物的存活率為80％，在延遲處理的組中存活率為70％，而在溶液組中分別為30％和20％。在微囊組中TNF和IL1的抑制程度更大。甚至在TNF峰值發生後給藥微囊化寡聚物的延遲處理組也有存活率。
總之，在另外的內毒素休克和腹膜炎的致死性模型中，微囊化NF-kB寡聚物在體外和體外提高對前炎性細胞因子的抑制作用，改善死亡率。微囊化NF-kB寡聚物可用於治療以前炎性細胞因子活性為特徵的病理疾病。
E)結果圖15所示的是NF-kB反義(AS)寡聚物微球體(MS)和溶液(Soln)製劑對TNF-α抑制的影響。
圖16所示的是在人全血研究中，NF-kB反義(AS)寡聚物微球體(MS)和溶液(Soln)製劑對IL-1-β水平的影響。
圖17所示的是反義NF-kB微球體在內毒素休克大鼠模型中的劑量反應研究。
圖18所示的是在內毒素休克大鼠模型中，NF-kB(微球體和溶液)處理對TNF-α水平的影響。
圖19所示的是在內毒素休克大鼠模型中用反義NF-kB微球體進行同時處理的劑量應答研究對存活率的影響。
圖20所示的是在內毒素休克大鼠模型中用NF-kB反義寡聚物以微球體和溶液形式進行同時(S)處理對存活率的影響。
圖21所示的是在大鼠腹膜炎模型中，用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進行同時(S)處理對TNF-α水平的影響。
圖22所示的是在大鼠腹膜炎模型中，用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進行同時(S)處理對存活率的影響。
圖23所示的是在大鼠腹膜炎模型中，用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進行延遲(D)處理對TNF-α水平的影響。
圖24所示的是在大鼠腹膜炎模型中，用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進行延遲(D)處理對IL-1-β水平的影響。
圖25所示的是在大鼠腹膜炎模型中，用NF-kB反義寡聚物(微球體和溶液形式)進行延遲(D)處理對存活率的影響。
實施例第二部分用不同的實例的藥物、不同的溶劑、不同的溫度和方法學變量通過噴霧方法製備微球體的評價A)簡介我們的目的在於評價通過噴霧方法製備的不同類型藥物(生物活性蛋白，寡核苷酸，化學品，疫苗)微球體，並研究油、溫度和方法的改變對製備微球體的影響。我們用生物可降解的無抗原性的清蛋白基質包裹細胞因子拮抗劑[例如NF-kB反義寡聚物]。
B)實驗方法學微球體製劑噴霧方法一般方法學本發明的一般基礎包括以下步驟與包囊多聚體(例如，但不限定於，清蛋白、脫乙醯殼多糖、球蛋白或一些其他可生物降解的天然或合成多聚體)一起製備被包囊的藥物(可以是生物活性蛋白，藥物或合成藥物)的水溶液。然後將多聚體-藥物溶液煙霧化(可使用一些形成噴霧的裝置，例如，但不限定於，超聲噴霧器)，從而形成細小的霧狀噴霧。然後將這種含多聚體-藥物(或其他物質)溶液的薄霧或噴霧加入溶劑系統中，例如丁醇或其他低級烷醇，例如，但不限定於，甲醇、乙醇、丙醇等(參見圖26)或一些惰性油(例如，但不限定於，橄欖油、低芥酸菜子油、棉子油、重或輕礦物油、前述物質的混合物或前述物質的亞組分，或類似物質)。溶劑系統保持在攪拌狀態下。細小的多聚體-藥物微球體混合到溶劑中，由於水溶性液滴不與溶劑系統混合，因此它們仍然保持各自分離。根據霧化的多聚體-藥物溶液的濃度，噴頭的構型，和/或可能其他參數(例如施加到溶液的壓力、通過溶液的空氣或氣體的速度或其他類似參數)，微球體的直徑範圍在約0.05-50微米之間，更優選地，直徑在約0.5-5微米。在溶劑系統中可含有或不含有乳化劑，例如Span 85。根據被包被藥物的性質，溶劑系統的溫度可在5-60攝氏度的範圍內變動。在所有溶液霧化完畢後，仍持續攪拌1/2-2小時。通過a)在於燥器中使用戊二醛蒸汽或b)將乾燥的微球體浸在溶劑系統中，所述溶劑系統含有0.5-20％w/v戊二醛的丁醇溶液的改變性質的戊二醛，或浸在類似的溶劑系統中，通過表面交聯硬化微球體。然後根據被包囊藥物的性質，用溶劑，例如，但不限定於乙醇、甲醇或丁醇或正己烷將微球體洗滌幾次。將水從微球體上除去，並通過a)冷凍乾燥微球體或b)通過在乾燥器中用脫水劑，例如碳酸鈣除去水，或通過c)根據藥物的性質，在真空爐中在溫度約25-100攝氏度下進行乾燥，從而使微球體形成一個堅硬的表面。所用的噴霧器(煙霧器)是超聲類型的(Omron MicroAir，NE-U03V)或任何可產生細小煙霧狀噴霧的裝置，例如a)甚至簡單的裝置，例如可以使用香水噴霧器，或可以使用氣壓式噴嘴類型的裝置。其他噴霧產生裝置和機械是本領域普通技術人員所知的，在此處不進行詳細討論。
本方法的優點如下a)產生的顆粒大小約0.05-50微米。
b)每批的顆粒大小分布在很窄的範圍。
c)本方法重複性好d)可在較短時間內產生大批量尺寸，使得該程序利於大批量生產。過程更類似於一個連續的流程。
實施例6-生物活性蛋白藥物NF-kB-應用-敗血性休克-製備方法-噴霧-通過噴霧方法製備含有細胞因子拮抗劑，即NF-kB反義寡聚物(生物活性蛋白藥物)微球體A)簡介在本研究中對含有細胞因子拮抗劑(NF-kB反義寡聚物(生物活性蛋白藥物))的微球體進行評價。
B)通過噴霧方法用清蛋白製備NF-kB反義寡核苷酸。
含有細胞因子拮抗劑[(NF-kB反義寡聚物(生物活性蛋白藥物)]的微球體與清蛋白微球體基質的交聯。
1)將50mg人清蛋白溶解在2cc無熱源的水中。
2)將NF-kB反義寡核苷酸(寡聚物)以25mg/cc的濃度單獨溶解在磷酸鹽緩衝液(PBS)中。
3)將上述兩種溶液在一起混合約30分鐘。
4)將得到的混合物冷卻到5攝氏度。
5)將以下概括為「不同油和溶劑的影響」中的20cc溶劑放在50cc燒杯中，冷卻到5攝氏度，並在冰浴中維持該溫度。
6)將清蛋白和寡核苷酸混合物噴霧到溶劑中，對溶劑系統持續攪拌30分鐘。
7)用雷射顆粒篩選器對含有微囊化清蛋白-藥物微球體的溶劑系統進行評估尺寸，直到微球體直徑約1微米。
8)將微球體與0.5cc 25％w/v戊二醛溶液交聯1小時，並用組織勻漿機以高速進行持續攪拌，同時在冰浴中維持溫度在約5攝氏度。
9)將微球體用20cc丁醇或乙醇或甲醇或正己烷洗滌3次，並用連續HPLC過濾器(50、20、10、5和1微米尺寸)最好篩選尺寸，同時懸浮在最後的溶劑中。
10)將微球體冷凍乾燥，貯存在冰箱中備用。
在所有情況下，使用前均將微球體懸浮在無熱源的水或鹽水中。在噴霧步驟中，在噴頭得到的顆粒通過管導入到含上述步驟5)溶劑的容器中，管尖維持在溶劑表面以下，從而使噴霧的顆粒在低於空氣界面的表面導入到溶劑溶液中，從而最小化在空氣中的損失。
為了對不同類型的油和溶劑系統作為乳化介質進行評價，重複上述步驟，除了上述5攝氏度以外，對製備中不同的溫度也進行了評價。最後，除水外，對不同溶劑作為溶解藥物的介質也進行了評價。對以下變量進行評價a)不同油和溶劑的影響在研究中使用了不同的油/溶劑，例如橄欖油、棉子油、低芥酸菜子油、礦物油和丁醇。
b)不同溫度的影響在寬變量的溫度條件下製備微球體。
c)溶解藥物的不同水相的影響除了PBS外，使用鹽水、蒸餾/去離子水和含吐溫-80的水溶解清蛋白和藥物。
d)不同交聯變量的影響當所有微球體噴霧到溶劑中後添加交聯劑，評估交聯的影響。
C)實驗方法a)藥物含量分析通過我們實驗室發展的HPLC方法確定藥物含量分析。
b)效率研究-體外全血模型研究在全血模型中對製劑的藥效進行評價，如下概述將血液合併到含EDTA的lavender top管中。將血液分成3個5ml的等份，用以下批次的微球體的一種預處理1小時，並用內毒素(100mcg/ml)進行刺激。在內毒素刺激0和4小時後取樣測定TNF-α水平。
D)結果圖1-6表示由噴霧方法和乳化方法製備的微球體的藥物含量和TNF-α抑制效率的數據比較。
實施例7-化學藥物吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽-應用-敗血性休克-製備方法乳化-微囊化吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽的製備和評價A)簡介吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PTDC)是一種水溶性低分子量抗氧化劑物質，抑制NF-kB活化。NF-kB是一種核轉錄因子，負責激活前炎性細胞因子。幾項研究已證實PTDC在大鼠內毒素休克模型中體外抑制細胞因子，並改善死亡率的功效。我們已證實在體外和體內，化合物，例如中和抗體和NF-kB反義寡聚物在細胞因子抑制方面的效率改善。化合物的微囊化靶向巨噬細胞，從而提高細胞因子抑制的效率。
B)實驗方法用全血模型評價微囊化PDTC的效率。對3個劑量[15微摩爾(μM)、30μM和60μM]進行研究。以包囊化形式和溶液形式將這些劑量加到1ml等份樣品中。通過標準ELISA方法測定TNF-α水平。
PDTC.
C)結果圖27所示的是PDTC在體外對細胞因子水平的影響。在所評價的3個劑量上，PDTC微球體與相應溶液劑量顯著不同。
雖然在以上僅對本發明的一些示例性實施方案進行詳細描述，但本領域中熟練人員容易理解，示例性實施方案的許多修改是可能的，只要沒有本質上脫離本發明的新的教導和優點。因此，所有這些修改均包括在以下權利要求所限定的本發明的範圍中。進一步應注意到任何此處提及的專利、申請和出版物全文結合於此作為參考。
權利要求
1.一種將生物活性物質包囊的方法，包括a.在水中溶解清蛋白；b.在磷酸鹽緩衝液(PBS)中溶解NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)；c.將所述溶解的清蛋白和所述溶解的NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)混合在一起；d.將步驟c中形成的混合物冷卻；e.提供溶劑；f.冷卻步驟e的所述溶劑；g.在冷卻的溫度下維持步驟f的所述溶劑，以形成溶劑系統；h.將所述溶解的清蛋白和所述溶解的NF-kB的反義寡核苷酸(寡聚物)噴霧到所述溶劑中，同時攪拌步驟g的所述溶劑；i.評估步驟h的含有微囊化清蛋白-藥物微球體的溶劑系統的尺寸以獲得微球體；j.攪拌並在冷卻的溫度下維持所述溶劑系統，用戊二醛交聯所述微球體；k.用溶劑洗滌步驟j的微球體；l.測定步驟k中的微球體尺寸；及m.將步驟1的微球體冷凍乾燥。
全文摘要
一種形成生物活性物質，例如蛋白聚合物或藥物微球體的方法，其通過在攪拌的冷的溶劑系統霧化溶解形式的待包囊物質，和包囊物質，例如清蛋白，使得形成的微球體證實當被巨噬細胞攝入時胞內生物活性，所述溶劑系統含有植物油、礦物油和/或低級醇。
文檔編號A61K48/00GK1756535SQ03824752
公開日2006年4月5日 申請日期2003年8月27日 優先權日2002年8月29日
發明者馬丁·J·德蘇扎 申請人:默瑟大學公司