含有修飾IgG2結構域的引起激動或拮抗特性的修飾抗體及其用途的製作方法
2023-04-30 14:55:12
優先權
本申請要求2014年3月24日提交的英國申請號1405264.1和2014年3月25日提交的英國申請號1405275.7的優先權，所述申請的內容以引用的方式整體併入本文。
領域
本申請大體上涉及以下發現，人igg2(h2)向抗-cd40抗體和其他免疫刺激受體抗體遞送獨特的fcγr-獨立性激動活性，所述其他免疫刺激受體包括4-1bb和cd28；以及可能地其他b7/cd28和tnf/tnfr家族成員，以及另外的發現，即h2的獨特激動或相反地拮抗活性依賴於鉸鏈和ch1二硫鍵的精確排列。基於此發現，本發明提供了新穎激動和拮抗抗體以及其在治療中的用途，其中igg2的鉸鏈區被誘變為將所述抗體『鎖定』成更柔性『h2a』或更緊密『h2b』構象，以便分別賦予抗體拮抗和激動特性。
背景
單克隆抗體(mab)為革命性的癌症治療，它重新燃起免疫系統可用於根除腫瘤的信念(sliwkowski等，(2013)；hodifs等，(2010)；wolchokjd等，(2013)。使用抗-ctla-4和抗-pd-1mab的結果已證實以下觀點，t-細胞免疫可提供針對攻擊性和難以治療的癌症的持久防護，所述癌症諸如轉移性黑色素瘤和非小細胞肺癌。(hodifs等，(2010)；wolchokjd等，(2013)；topaliansl等，(2012)。不同mab藥劑以不同方式介導其作用並且改進治療功效需要精確理解其作用機制。此外，mab同種型的選擇主要由於指導抗原接合下遊事件的fcγ受體(fcγr)相互作用中的差異而為關鍵的(nimmerjahnf&ravetchjv(2012)；whiteal等，(2013)。
藥劑通過消耗其細胞靶標起作用，諸如用抗-cd20消耗惡性b細胞(uchidaj等，(2004))或用抗-ctla4和抗-gitr消耗鼠t調節細胞(simpsontr等，(2013)bulliardy等，(2013)。對於這種類型的藥劑，小鼠igg2a(m2a)和人igg1(h1)為有效的，因為它們具有高激動性/抑制性(a/i)fcγr結合比率(hamaguchiy等，thejournalofexperimentalmedicine203(3):743-753；nimmerjahnf&ravetchjv(2005))。相比之下，其作用依賴於激動受體接合的mab諸如免疫刺激性抗-cd40(brahmer等，(2012)；bruhns等，blood113,3716-3725或細胞凋亡促進抗死亡受體(dr)4、dr5和fas(lif&ravetchjv(2012)；wilsonns等，(2011).xuy等，(2003)似乎主要依賴於與抑制性fcγriib交聯來遞送其活性(whiteal等，(2011)；lif&ravetchjv(2013),white等，(2013))。對於這種類型的藥劑，小鼠igg1(m1)在臨床前模型中為最佳的，因為它具有低a/i比率並且以足夠親和力接合fcγriib，以介導交聯(white等，(2011)；lif&ravetchjv(2011))。在臨床試驗中的激動性抗-cd40mabcp870,893(vonderheiderh等，(2007))為一種人igg2(h2)，它基於其同種型而未被預測接合fc？r)(bruhnsp等，(2009)。另外兩種激動性較小的cd40抗體chilob7.4和sgn40二者均為h1(advanir等，(2009)；johnson等，(2010))。另外，最新研究表明h2恆定區賦予特異性抗人cd28mab(tgn1412)增加的刺激活性(ballc等，(2012))。
儘管這樣，但是在本發明之前還不清楚待用於人治療中的應在激動性mab或融合蛋白中使用的最佳同種型。具體地說，關於抗體同種型如何可以實現治療性抗體的治療特性即其激動性或拮抗特性的理解較少。本發明解決了此需要，提供了改進的激動性(以及拮抗性)抗體，並且還提供了用於合成所述抗體的方式。在一個示例性實施方案中，這些抗體和融合蛋白例如靶向tnfr超家族成員的那些抗體和融合蛋白適用於治療適應症，其中無論是激動性還是拮抗性抗體或融合蛋白均是治療上需要的。
概述
本發明提供一種關於用於產生具有激動或拮抗特性的抗體的最佳抗體同種型的理解。更確切地說，本發明提供保護具有特異性突變的人igg2恆定區的抗體，其中根據這些特異性突變，這些抗體具有激動或拮抗特性。
本發明特別利用針對多種人共刺激受體(cd40、4-1bb和cd28)的mab確定人igg同種型的免疫調節活性並因此顯示人igg2(h2)比h1或人h4賦予這些藥劑更大的免疫刺激活性，並且顯示此活性並不依賴於fcgr相互作用中的差異而是依賴於h2鉸鏈和ch1結構域中二硫鍵的構象，所述構象使用誘變可被操縱成將mab『鎖定』成具有相反水平的激動水平的不同構象，從而提供具有限定水平的活性的同源超激動治療性抗體，所述活性獨立於局部微環境中的fcgr表達水平。
本發明還涉及包含具有特異性突變的人igg2恆定區的此類抗體和融合蛋白在疾病治療或預防中作為受體激動劑或受體拮抗劑的用途，其中此類受體激動劑或受體拮抗劑具有治療性應用。在示例性實施方案中，所述抗體將特異性接合tnf超家族成員，諸如cd40、ltα、ltβ、faslcd30、cd27、ox40、trail/apo-2l、4-1bb、4-1bbl、tnf、tnf-r、trance、trance-r、gitr或「糖皮質激素誘導的tnf受體」、tweak、fn14等；或者接合b7/cd28家族成員，諸如b7.1(cd80)、b7.2(cd86)、b7-dc(pd-l2或cd273)、b7-h1、b7-h2、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、b7-h5(vista)、b7-h6(ncr3lg1)、b7-h7(hhla2)、pd-1(cd279)、pd-l3、cd28、ctla-4(cd152)、icos(cd278)、btla、ncr3、cd28h、以及nkp30。
發明目的
本發明的一個目的為提供新穎的免疫激動劑或拮抗劑，並且更具體地說涉及超激動劑。
本發明的一個更具體的目的為提供包含突變igg2恆定區的新穎免疫激動劑或拮抗劑，其中此類突變增強了此類激動劑或拮抗劑多肽例如激動性或拮抗性igg2抗體或igg2/igg2嵌合融合蛋白的激動或拮抗特性。
本發明的另一個具體目的為提供非人igg2同種型例如人igg1、igg3、igg4、iga、igd、ige或igm抗體的修飾激動或拮抗抗體，其中higg2的整個或基本上整個鉸鏈和ch1區和任選地higg2的輕鏈恆定區用於替換非人igg2抗體例如人igg1、igg3、igg4、iga、igd、ige或igm相應的輕鏈恆定區、鉸鏈和ch1結構域或區。
本發明的一個更具體的目的為提供特異性結合人免疫細胞上表達的受體或配體的激動抗體，其中所述抗體激動由所述受體或配體引起的一種或多種生物活性、或由所述配體和受體的相互作用引起的生物活性，並且另外其中所述激動抗體包含至少人igg2的ch1和鉸鏈區(「h2區」)，其中所述igg2區的一個或多個半胱氨酸殘基被去除或改變成不同的胺基酸殘基，從而使得所得激動抗體的激動特性相對於其中所述一個或多個半胱氨酸未改變的其他方面相同的抗體有所增加。
本發明的另一個具體目的為提供特異性結合人細胞表面上表達的受體或配體的修飾抗體，其中所述修飾抗體激動由所述受體或配體引起的一種或多種生物活性或者由所述配體及其相應受體的相互作用引起的生物活性，其中所述抗體不是人igg2抗體，並且另外其中不是人igg2的所述修飾抗體的整個或基本上整個鉸鏈和ch1結構域和任選地輕鏈恆定區被higg2抗體相應的整個或基本上整個鉸鏈和ch1結構域(「h2區」或「h2結構域」)和任選地輕鏈恆定區替換。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的選自higg1、higg3、higg4、iga、igd、ige或igm的修飾抗體，其中所述抗體的整個或基本上整個鉸鏈和ch1結構域已被higg2相應的整個或基本上整個鉸鏈和ch1結構域(「h2區」或「h2結構域」)替換。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中位置127處的重鏈半胱氨酸殘基和位置214處的輕鏈半胱氨酸殘基中的任一個或兩者(其中編號是根據kabat)是缺失的或者被改變成不同的胺基酸殘基，從而使得所得修飾抗體的激動特性相對於其中所述半胱氨酸殘基中的任一個或兩者未改變的其他方面相同抗體有所增加。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中在所述修飾抗體的h2區中突變或缺失的唯一半胱氨酸殘基為輕鏈的位置214處的半胱氨酸並且所述修飾抗體包含(i)其中在h2區中沒有半胱氨酸殘基缺失或修飾的重鏈或者(ii)在重鏈的位置127、232或233處的半胱氨酸殘基中的一個或多個是缺失或突變的，從而產生修飾抗體，其中所得修飾抗體的激動特性相對於缺乏所述缺失或修飾的其他方面相同的抗體有所增加。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其包含修飾higg1或higg3。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，所述修飾抗體特異性結合人免疫細胞。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，所述修飾抗體結合樹突狀細胞、肥大細胞、單核細胞、巨噬細胞、nk細胞、b淋巴細胞、t淋巴細胞或以上任何組合。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中不存在所述修飾時所述抗體缺乏激動活性。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中不存在所述修飾時所述抗體具有所述修飾抗體的不超過10％的激動活性，其中激動活性在用於量化激動性的可接受測定中檢測。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中不存在所述修飾時所述抗體具有所述修飾抗體的不超過20％的激動活性，其中激動活性在用於量化激動性的可接受測定中檢測。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中不存在所述修飾時所述抗體具有所述修飾抗體的不超過30％的激動活性，其中激動活性在用於量化激動性的可接受測定中檢測。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中不存在所述修飾時所述抗體具有所述修飾抗體的不超過40％的激動活性，其中激動活性在用於量化激動性的可接受測定中檢測。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中不存在所述修飾時所述抗體具有所述修飾抗體的不超過50％的激動活性，其中激動活性在用於量化激動性的可接受測定中檢測。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中不存在所述修飾時所述抗體具有所述修飾抗體的不超過50％-80％的激動活性，其中激動活性在用於量化激動性的可接受測定中檢測。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中所述抗體激動由人受體或配體引起的一種或多種生物活性或由所述配體及其相應受體的相互作用引起的生物活性，並且另外其中所述修飾抗體包含至少higg2的輕鏈恆定區和重鏈的ch1和鉸鏈區(「h2區」)，其中選自位置127處的重鏈半胱氨酸殘基和位置214處的輕鏈半胱氨酸殘基的半胱氨酸殘基中的任一個或兩者被去除或改變成不同的胺基酸殘基，從而使得所得激動抗體的激動特性相對於其中所述半胱氨酸殘基二者未改變的其他方面相同的抗體有所增加(其中胺基酸編號是根據kabat)。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中所述修飾抗體輕鏈在位置214處的半胱氨酸殘基為缺失或突變的並且所述修飾抗體包含(i)其中h2區內沒有半胱氨酸殘基缺失或突變的重鏈或者(ii)所述修飾抗體包含其中位置127、232或233處的半胱氨酸殘基中的至少一個缺失或突變的重鏈。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中重鏈的h2區內沒有半胱氨酸殘基缺失或突變。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中重鏈內的位置127、232或233處的半胱氨酸殘基中的至少一個缺失或突變。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中重鏈內的位置127、232或233處的半胱氨酸殘基中的一個或兩個殘基的任何組合缺失或突變。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中所述修飾抗體的h2區為處於h2b構象中。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中higg2重鏈h2區內被去除、修飾或被另一種胺基酸殘基取代的唯一半胱氨酸殘基包括位置127處的重鏈半胱氨酸殘基。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中輕鏈區內沒有半胱氨酸被去除、修飾或被另一種胺基酸殘基取代。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中hig2輕鏈恆定區內被去除、修飾或被另一種胺基酸殘基取代的唯一半胱氨酸殘基包括位置214處的輕鏈半胱氨酸殘基。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中higg2h2區內被去除、修飾或被另一種胺基酸殘基取代的唯一半胱氨酸殘基選自位置127處的重鏈半胱氨酸殘基和位置214處的輕鏈半胱氨酸殘基。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，所述修飾抗體包含取代在輕鏈的位置214處的半胱氨酸的絲氨酸和/或取代在重鏈的位置127處的半胱氨酸殘基的絲氨酸殘基。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的higg1或higg3或higg4同種型的修飾抗體，其中所述higg1、higg3或higg4的整個鉸鏈或ch1區被higg2相應的鉸鏈和ch1區替換。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，所述修飾抗體為higg1。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，所述修飾抗體包含輕鏈或重鏈h2區內的一個或多個半胱氨酸殘基。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，所述修飾抗體包含h2區之外的另外的修飾，所述修飾並不影響或可感知地影響(不超過10％變化)所述修飾抗體的激動特性。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，所述修飾抗體特異性結合在人細胞表面上表達的tnf或b7超家族成員，例如cd40、4-1bb或cd28。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，所述修飾抗體特異性結合在至少一種類型的人免疫細胞上表達的受體或配體。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，所述修飾抗體結合選自以下各項的免疫細胞：t淋巴細胞、b淋巴細胞、單核細胞、肥大細胞、巨噬細胞、nk細胞、以及樹突狀細胞或其組合。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，所述修飾抗體包含整個人igg2ch1和鉸鏈區。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，所述修飾抗體缺乏所述人igg2fc區。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中所述抗體或融合物的激動特性為fcγr獨立性的。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，其中所述抗體特異性結合選自cd40、ltα、ltβ、cd30、cd27、ox40、4-1bb、tnf-r、trance-r、gitr或「糖皮質激素誘導的tnf受體」、tweak、以及fn14的tnfr超家族成員或結合選自b7.1(cd80)、b7.2(cd86)、b7-h1、b7-h2、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、b7-h5(vista)、b7-h6(ncr3lg1)、b7-h7(hhla2)、pd-1(cd279)、cd28、ctla-4(cd152)、icos(cd278)、btla、ncr3、cd28h、以及nkp30的b7/cd28家族成員。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，所述修飾抗體結合選自4-1bb、cd40或cd27的tnfr成員或者b7/cd28家族成員為ctla-4或cd28。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體，所述修飾抗體包含lob7.4的可變區。
本發明的另一個具體目的為提供含有如上所述的修飾抗體的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥物有效量的此修飾抗體。
本發明的另一個具體目的為提供此類抗體或具有其他免疫激動劑的此類組合物的用途。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾抗體在治療方法中的用途，所述治療方法包括施用至少一種修飾抗體或含有所述修飾抗體的融合蛋白，所述方法包括施用有效量的至少一種修飾抗體或含有根據本發明的修飾抗體的融合蛋白或組合物。在優選的實施方案中，治療的病狀選自癌症、感染、過敏症、自身免疫、移植、gvhd或炎症。
本發明的另一個具體目的為提供特異性結合人細胞表面上表達的受體或配體的修飾抗體，其中所述修飾抗體拮抗由所述受體或配體引起的一種或多種生物活性或者由所述配體及其相應受體的相互作用引起的生物活性，其中所述抗體不是人igg2抗體，並且另外其中不是人igg2的所述修飾抗體的整個或基本上整個鉸鏈和ch1結構域和任選地輕鏈恆定區被higg2抗體相應的整個或基本上整個鉸鏈和ch1結構域和輕鏈恆定區(「h2區」或「h2結構域」)替換，其中h2區內一個或多個半胱氨酸殘基被任選地修飾，所述修飾引起所得修飾抗體的拮抗特性增加。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的選自higg1、higg3、higg4、iga、igd、ige或igm的修飾拮抗抗體，其中所述抗體的整個或基本上整個鉸鏈和ch1結構域以及任選地輕鏈恆定區已被higg2相應的整個或基本上整個鉸鏈和ch1結構域以及輕鏈恆定區(「h2區」或「h2結構域」)替換。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中所述igg2h2區的選自位置232、233、236和239處的半胱氨酸殘基中的至少一個半胱氨酸殘基被去除或改變成不同的胺基酸殘基，使得所得修飾抗體的拮抗特性相對於其中所述一個或多個半胱氨酸殘基未改變的其他方面相同的抗體有所增加。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中所述修飾抗體在輕鏈的殘基214處的半胱氨酸和在重鏈的殘基127處的半胱氨酸未缺失、修飾或被另一種胺基酸殘基取代。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中所述抗體的h2區內的半胱氨酸修飾選擇性促進或引起所述修飾抗體的重鏈和輕鏈經由輕鏈的位置214處的半胱氨酸和重鏈的位置127處的半胱氨酸來締合。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中所述修飾抗體的h2區呈h2a構象。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中在h2區內除c214和c127之外的至少一個半胱氨酸殘基被改變成絲氨酸殘基。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，所述修飾拮抗抗體包含取代重鏈的位置232處的半胱氨酸的絲氨酸。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，所述修飾拮抗抗體包含取代重鏈的位置233處的半胱氨酸的絲氨酸。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其包含修飾higg1或higg3。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，所述修飾抗體特異性結合人免疫細胞。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，所述修飾拮抗抗體結合免疫細胞，包括樹突狀細胞、肥大細胞、單核細胞、巨噬細胞、nk細胞、b淋巴細胞、t淋巴細胞或以上任何組合中的至少一種。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中不存在所述修飾時所述抗體缺乏拮抗活性。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中不存在所述修飾時所述抗體具有所述修飾抗體的不超過10％的拮抗活性，其中拮抗活性在用於量化拮抗性的可接受測定中檢測。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中不存在所述修飾時所述抗體具有所述修飾抗體的不超過20％的拮抗活性，其中拮抗活性在用於量化拮抗性的可接受測定中檢測。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中不存在所述修飾時所述抗體具有所述修飾抗體的不超過30％的拮抗活性，其中拮抗活性在用於量化拮抗性的可接受測定中檢測。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中不存在所述修飾時所述抗體具有所述修飾抗體的不超過40％的拮抗活性，其中拮抗活性在用於量化拮抗性的可接受測定中檢測。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中不存在所述修飾時所述抗體具有所述修飾抗體的不超過50％的拮抗活性，其中拮抗活性在用於量化拮抗性的可接受測定中檢測到。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，所述修飾拮抗抗體特異性結合在人細胞上表達的受體或配體，其中所述抗體拮抗由所述受體或配體引起的一種或多種生物活性、或由所述配體及其相應受體的相互作用引起的生物活性，並且另外其中所述拮抗抗體包含至少人igg2的ch1和鉸鏈和輕鏈恆定區(「h2區」)，其中所述igg2h2區的選自位置232、233、236和239處的半胱氨酸殘基中的至少一個半胱氨酸殘基被去除或改變成不同的胺基酸殘基，使得所得拮抗抗體的拮抗特性相對於其中所述一個或多個半胱氨酸殘基未改變的其他方面相同的抗體有所增加。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中在輕鏈的位置214和重鏈的位置127處的半胱氨酸殘基未缺失、修飾或被另一種胺基酸取代。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中在higg2h2區內的一個或多個半胱氨酸殘基或其他胺基酸殘基被去除、修飾或被另一種胺基酸殘基取代，使得h2區呈h2a構象。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中在higg2h2區內所述半胱氨酸殘基中的至少一個被改變成絲氨酸殘基。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，所述修飾拮抗抗體包含取代重鏈的位置232處的半胱氨酸的絲氨酸。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，所述修飾拮抗抗體包含取代重鏈的位置233處的半胱氨酸的絲氨酸。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，所述修飾拮抗抗體特異性結合在人細胞表面上表達的tnf或tnfr超家族成員或b7家族成員。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，所述修飾拮抗抗體特異性結合至少一種類型的人免疫細胞。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，所述修飾抗體特異性結合在t細胞、b細胞、肥大細胞、巨噬細胞、單核細胞、nk細胞或樹突狀細胞上表達的受體或配體。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，所述修飾拮抗抗體包含整個人igg2恆定重鏈和輕鏈恆定區。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，所述修飾拮抗抗體缺乏人igg2fc區。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中所述抗體的拮抗特性為fcγr獨立的。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中所述抗體特異性結合選自以下各項的tnf/r超家族成員：cd40、cd40l(cd154)、ltα、ltβ、fasl(cd178)、cd30、cd30l(cd153)、cd27、cd27l(cd70)、ox40、ox40l、trail/apo-2l、4-1bb、4-1bbl、tnf、tnf-r、trance、trance-r、gitr或「糖皮質激素誘導的tnf受體」、tweak、以及fn14。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體，其中tnf/r或b7家族成員為4-1bb、4-1bbl、cd40、cd40l、cd27、cd28、b7.1、b7.2或cd70。
本發明的另一個具體目的為提供含有如上所述的修飾拮抗抗體的藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的修飾抗體或含有根據本發明的修飾抗體的融合蛋白。
本發明的另一個具體目的為提供含有如上所述的修飾拮抗抗體的藥物組合物或其用途，所述藥物組合物可包含另一種免疫激動劑或其他活性劑。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體在治療方法中的用途，所述治療方法包括施用至少一種拮抗抗體或含有根據本發明的抗體的融合蛋白或組合物，其中此類病狀優選地包括癌症、過敏、感染性疾病、自身免疫、移植、gvhd或炎性病狀。
本發明的另一個具體目的為提供如上所述的修飾拮抗抗體或其用途，所述用途包括施用包含lob7.4的可變區的抗體或對cd40、4-1bb或cd28有特異的另一種抗體，所述抗體可用於治療諸如癌症、感染、過敏、自身免疫或炎症的病狀。
本發明的另一個具體目的為提供新穎igg2激動抗體或含有所述抗體的融合蛋白，它們包含整個人igg2恆定區，所述抗體在鉸鏈區內被修飾以改變二硫鍵改組。
本發明的另一個具體目的為新穎igg2激動抗體或含有所述抗體的融合蛋白，所述抗體不含人igg2fc或另一個fc區。
本發明的另一個具體目的為提供新穎拮抗或激動抗體，其中人igg2的整個或基本上整個鉸鏈和ch1區和任選地higg2的輕鏈恆定區用於替換人igg1、igg3、igg4、iga或igm的相同結構域或區，任選地其中所述引入的higg2鉸鏈和/或higg2ch1區和輕鏈恆定區可包含增強所得修飾抗體的激動或拮抗特性的一個或多個突變。
本發明的另一個具體目的為提供新穎激動或拮抗抗體，其中所述抗體或融合物的激動特性為fcγr獨立的。
本發明的另一個具體目的為提供新穎激動或拮抗抗體或其自人治療中的用途，其中所述抗體特異性結合選自以下各項的tnfr超家族成員：cd40、ltα、ltβ、cd30、cd27、ox40、4-1bb、tnf、tnf-r、trance-r、gitr或「糖皮質激素誘導的tnf受體」、tweak、以及fn14。
附圖簡述
圖1(a)-圖1(f)包含顯示人igg2賦予抗-hcd40mab,lob7.4fcγr獨立的激動活性的實驗結果。
圖2(a)-圖2(c)包含顯示人igg2賦予抗-tnfrsfmabfcγr獨立的活性的實驗結果。
圖3(a)-圖3(d)包含顯示h2ch1和鉸鏈區賦予lob7.4fcγr-獨立的激動活性的實驗結果。
圖4(a)-圖4(e)包含顯示lob7.4h2的激動活性依賴於其形成h2b構象的能力的實驗結果。
圖5(a)-圖5(e)包含顯示抗小鼠cd40mab,3/23的同種型依賴性的實驗。
圖6(a)-圖6(e)包含證實lob7.4人igg2對人細胞的活性比人igg1更大並獨立於fcγr相互作用的實驗結果。
圖7(a)-圖7(d)包含證實h2a和h2b的拮抗和激動特性的實驗結果。
圖8(a)–圖8(h)包含顯示不同人同種型對抗-cd40活性的作用的實驗。
圖9(a)-圖9(g)包含進一步驗證同種型對圖8中的實驗的抗-cd40活性的作用的對照實驗。
圖10(a)–圖10(e)包含顯示人igg2的fcγr獨立性活性的實驗數據。
圖11(a)–圖11(f)包含驗證chilob7/4h2激動活性為fcγr-獨立性的其他實驗數據。
圖12(a)–圖12(e)包含顯示人igg2針對多種受體靶標的拮抗作用的數據。
圖13(a)和圖13(b)包含顯示ch1和鉸鏈區賦予chilob7/4h2活性的實驗。
圖14包含驗證chilob7/4開關突變體類似地結合cd40的對照實驗。
圖15(a)–圖15(i)總結了顯示誘變生成一系列chilob7/4h2激動形式的誘變實驗結果。
圖16(a)-圖16(g)包含驗證chilob7/4h2a和h2b形式的不同活性的另外的實驗數據。
圖17包含不同二硫鍵連接的h2亞型的示例性代表方案(改編自(martinez2008)。左圖示出h2a的結構，其被認為是h2合成的形式，並且右圖h2b示出主要的交替排列形式。突出顯示參與改組的半胱氨酸殘基。二硫鍵由各鏈之間或各鏈內的黑線表示。所示的ce-sds曲線示出了h2a和h2b形式的解析(正如所述，參考)而h1解析為單峰。
圖18(a)包含不同二硫鍵連接的h2亞型的示例性代表方案(改編自(martinez2008)，圖18(b)示出指定chilob7/4mab的nrce-sds曲線。指示了h2a和h2b位置和10kda標準。
圖19、圖20和圖21示例性示出誘變可將抗體『鎖定』成h2a和h2b形式的方法。
圖22、圖23、圖24和圖25包含顯示h2的誘變產生不同激動劑和拮抗劑的方式的實驗數據。
圖26包含表明h2b對比h2a形式的激動或拮抗特性可參與抗原加蓋或nfkb活化的實驗數據(表明多聚化可克服對fcγrx-連接的需要)。
圖27包含顯示不同同種型形式的抗-cd40抗體的免疫刺激特性的實驗數據。
圖28包含顯示不同同種型形式的抗-cd40抗體對b細胞增殖的作用的b細胞測定結果。
詳述
定義
正如所述的，本發明在廣義上涉及新穎激動或拮抗抗體和融合蛋白、以及其製造和在治療中的用途，其中所述抗體或融合蛋白包含人igg2恆定結構域，其中所述抗體包含產生具有增強的激動劑或拮抗劑特性的抗體或融合蛋白的特異性突變。
應理解，本發明不限於特定方法、方案、細胞系、動物種類或屬、以及所述試劑，這些可發生改變。也應了解，本文使用的術語僅出於描述特定實施方案的目的，並且並不意圖限制本發明的範圍，本發明僅由所附權利要求書限定。除非上下文另外明確地指出，否則本文所用的單數形式「一個(種)(a/and)」和「所述(the)」包括複數指示物。因此，例如，提及「一個細胞」包括多個此類細胞並且提及「蛋白質」包括提及一種或多種蛋白質以及其本領域技術人員已知的等效物，等等。除非另外明確說明，否則本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本發明所屬領域一般技術人員通常理解的含義相同的含義。
「激動劑」是指與受體組合可產生細胞反應的化合物。激動劑可為直接結合受體的配體。或者，激動劑可通過例如以下方式與受體間接組合：(a)與直接結合受體的另一種分子形成複合物，或者(b)以其他方式引起另一種化合物修飾以使得所述另一種化合物直接結合受體。激動劑可稱為特定受體或受體家族的激動劑(例如，tnf或tnfr激動劑)。「超激動劑」為在鉸鏈和ch1區的半胱氨酸中具有突變從而提供最佳激動特性的激動劑。
「拮抗劑」是指當與感興趣的分子例如tnf或tnfr家族超家族成員或其他配體或受體接觸時引起所述分子的某一活性或功能的大小與在所述拮抗劑不存在時觀察到的活性或功能的大小相比有所減小的化合物。感興趣的特定拮抗劑包括對包含igg2恆定結構域的tnfr超家族成員有特異的抗體和融合蛋白。
「抗原」是指能夠作為免疫反應的靶標的任何物質。抗原可為例如細胞介導的免疫反應和/或由受試者生物體引起的體液免疫反應的靶標。或者，抗原可為與免疫細胞接觸時的細胞免疫反應(例如，免疫細胞成熟、細胞因子產生、抗體產生等)的靶標。
在本文中「tnf/r」大體上是指腫瘤壞死因子(tnf)超家族或腫瘤壞死因子受體(tnfr)超家族的任何成員。tnf和tnfr超家族包括例如cd40、cd40l(cd154)、ltα、ltβ、lt-βr、fasl(cd178)、cd30、cd30l(cd153)、cd27、cd27l(cd70)、ox40、ox40l、trail/apo-2l、4-1bb、4-1bbl、tnf、tnf-r、tnf-r2、trance、trance-r、gitr或「糖皮質激素誘導的tnf受體」、gitr配體、relt、tweak、fn14、tnfα、tnfβ、rank、rank配體、light、hvem、gitr、troy、以及relt。除非另外說明，否則提及tnf/r激動劑或拮抗劑化合物可包括任何藥物可接受形式的化合物。
「b7家族成員」或「b7-cd28家族成員」是指在涉及免疫信號傳導的免疫細胞上表達的受體和配體大家族的成員。對於b7多肽家族成員常見的典型結構元件包括細胞外結構域，包括v-樣和c-樣ig結構域。發現信號序列處於全長b7家族多肽的n-末端，並且接著是n-至-c順序的v-樣ig結構域、c-樣ig結構域、跨膜結構域、以及細胞內結構域。在b7多肽的細胞外結構域內存在某些關鍵性殘基，即涉及多肽的二硫鍵形成和三維構象的兩對保守性半胱氨酸殘基(每對處於每個ig結構域內)。b7多肽家族中度保守，其中人家族成員的ig結構域彼此非常類似，並且與來自其他物種的b7家族成員的ig結構域非常類似。所述家族包括子家族，包括b7-1(cd80)、b7-2(cd86)和b7-h1、以及嗜乳脂蛋白(btn)/mog(髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白樣)家族成員，其中免疫調節b7子家族缺乏b30.2結構域並且嗜乳脂蛋白/mog子家族具有b30.2結構域。b7/cd28超家族的成員作為實例包括b7.1(cd80)、b7.2(cd86)、b7-dc(pd-l2或cd273)、b7-h1、b7-h2、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、b7-h5(vista)、b7-h6(ncr3lg1)、b7-h7(hhla2)、pd-1(cd279)、pd-l3、cd28、ctla-4(cd152)、icos(cd278)、btla、ncr3、cd28h、以及nkp30。
例如tnf或tnfr超家族成員或其他免疫細胞受體的術語「與x有關的生物效應」和「x活性」可互換使用並且包括與和激動劑或拮抗劑特異性相互作用的部分例如tnf或tnf/r超家族成員有關的任何生物效應。
在本文中術語「宿主細胞」通常是指工程化為表達根據本發明的一種或多種抗體的任何細胞。此細胞作為實例包括細菌、真菌、酵母、哺乳動物、無脊椎動物諸如昆蟲、植物以及禽類細胞。
術語「表達載體」是指含有促進靶宿主細胞內的外源蛋白表達操縱的元件的dna載體。通常，序列的操縱和用於轉化的dna的產生首先在細菌宿主細胞例如大腸桿菌中進行，並且載體通常將包含促進此類操縱的序列，包括細菌複製起點和適當的細菌選擇性標記物。選擇性標記物編碼在選擇培養基中生長的轉化宿主細胞的存活或生長所需要的蛋白質。未用含有選擇基因的載體轉化的宿主細胞將不能在所述培養基中存活。典型選擇基因編碼以下蛋白質：(a)對原核宿主細胞賦予對抗生素或其他毒素的抗性；(b)補體營養缺陷不足；或(c)供應不可從複合培養基獲得的關鍵營養素。用於轉化酵母的示例性載體和方法描述於例如，在burke,d.、dawson,d.和stearns,t.(2000).methodsinyeastgenetics:acoldspringharborlaboratorycoursemanual.plainview,n.y.:coldspringharborlaboratorypress中。感興趣的多肽編碼序列可操作地連接至提供所述多肽在酵母細胞內的表達的轉錄和翻譯調節序列。這些載體組件可包括但不限於以下各項中的一種或多種：增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。還可包括用於分泌多肽的序列，例如信號序列等。酵母複製起點為任選的，因為表達載體通常整合到酵母基因組中。在本發明的一個實施方案中，感興趣的多肽可操作地連接至或融合至提供多肽從酵母二倍體細胞中最佳分泌的序列。
在本文中「抗體結構域」或「區」是指抗體分子的不同部分或亞基。在igg情況下，重鏈具有四個亞基「ch3」、「ch2」、「ch1」(恆定部分)和vh(可變部分)。輕鏈具有兩個亞基cl和vl。兩個ch3單元直接連接，而ch2單元被寡糖分開。ch1位於重鏈「鉸鏈」之後並且通過二硫鍵連接至cl單元。「ch2結構域」通常根據eu編號系統從igg的約殘基231延伸至約340。ch2結構域的獨特之處在於它並未與另一個結構域緊密配對。相反，兩個n-連接的分支碳水化合物鏈插入在完整天然igg分子的兩個ch2結構域之間。已推測，碳水化合物可提供用於結構域-結構域配對的取代基並幫助穩定ch2結構域。burton,molec.immunol.22:161-206(1985)。「ch3結構域」包含fc區內c-末端殘基至ch2結構域的片段(即根據eu編號系統從igg的約胺基酸殘基341至約胺基酸殘基447)。
術語「fc區」通常是指包含免疫球蛋白重鏈的c末端多肽序列的二聚體複合物，其中c-末端多肽序列為可通過用木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得的多肽序列。fc區可包含天然或變體fc序列。儘管免疫球蛋白重鏈的fc序列的邊界可發生改變，但是人igg重鏈fc序列通常被定義為從約位置cys226的胺基酸殘基或從約位置pro230到fc序列的羧基末端的片段。免疫球蛋白的fc序列通常包含兩個恆定結構域ch2結構域和ch3結構域，並且任選地保護c.sub.h4結構域。在本文中「fc多肽」意指構成fc區例如單體fc的一種多肽。fc多肽可從任何適合的免疫球蛋白獲得，所述免疫球蛋白諸如igg1、igg2、igg3、或igg4亞型、iga、ige、igd或igm。
在本文中術語「h2a」構象是指igg2或含有igg2的鉸鏈和ch2區的修飾抗體的特定亞型。人igg2在免疫球蛋白中的獨特之處在於其改組ch1和鉸鏈區((25-28))內的二硫鍵的能力。h2的兩種亞型佔主導地位。h2a具有柔性的經典igg構象，其中ch1中的重鏈(hc)c127連接至輕鏈(lc)中的c214並且在相反鉸鏈半胱氨酸232、233、236和239之間存在4個hc間二硫鍵。
在本文中術語「h2b」或「h2b」構象是指igg2或含有higg2的鉸鏈和ch2區的修飾抗體的第二種特定亞型。((25-28))。h2b比h2a更緊密並且hcc127和lcc214與hc鉸鏈半胱氨酸232和233形成二硫鍵橋。
「kabat」或「eu編號方案」也稱為「eu索引」，它是本領域公認的且廣泛接受的指定抗體和具體地人抗體、以及包含在整個抗體或抗體片段內的特定結構域的特定胺基酸殘基的系統。除非本文另外指示，否則胺基酸殘基的編號是根據eu編號系統，其也稱為eu索引，如kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1991中所述的。
術語「可操作地連接」是指與另一種核酸序列處於功能關係中的核酸。例如，如果信號序列的dna表達為參與多肽分泌的前蛋白，那麼其可操作地連接至多肽的dna；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，那麼其可操作地連接至編碼序列。通常，「可操作地連接」意指所連接的dna序列為連續的並且在分泌前導序列的情況下為連續的且處於閱讀框中。然而，增強子並不需要為連續的。連接通過在常規限制性位點處連接或者經由本領域技術人員所熟悉的pcr/重組方法(gatewayrtechnology；invitrogen,carlsbadcalifornia)來實現。如果此類位點並不存在，那麼根據常規實踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
術語「啟動子」是指位於結構基因起始密碼子上遊(5』)的控制它們可操作地連接的特定核酸序列的轉錄和翻譯的非翻譯序列(通常在約100至1000bp內)。此類啟動子屬於若干類別：誘導型啟動子、組成型啟動子和阻抑型啟動子(響應於阻遏子的不存在而增加轉錄水平)。誘導型啟動子可響應於培養條件的某一變化(例如存在或不存在某一營養素或溫度變化)來引發在它們控制下自dna的轉錄程度增加。
啟動子片段也可用作同源重組和表達載體到宿主基因組中的相同位點的整合的位點；或者可選擇性標記用作同源重組的位點。
在本文中術語「感興趣的多肽」是指激動性或拮抗性人igg2抗體或人igg2融合蛋白。
術語「所需抗體」通常是指對靶標例如tnf或tnf/r超家族成員有特異的親本抗體或片段。術語「抗體」旨在包括具有匹配並識別表位的特定形狀的任何含多肽鏈分子結構，其中一種或多種非共價結合相互作用使複合物在分子結構與表位之間穩定。原型抗體分子為免疫球蛋白，並且來自所有來源例如人、齧齒動物、兔、牛、羊、豬、狗、其他哺乳動物、雞、其他禽類等的所有類型的免疫球蛋白igg、igm、iga、ige、igd等均被視為「抗體」。
感興趣的抗體編碼序列包括由天然序列編碼的那些序列、以及憑藉遺傳密碼子的簡併性而使序列不同於公開核酸的核酸、以及其變體。變體多肽可包含胺基酸(aa)取代、添加或缺失。胺基酸取代可為保守性胺基酸取代或去除非必需胺基酸的取代，例如改變糖基化位點或通過取代或缺失非功能必需的一個或多個半胱氨酸殘基來最小化錯誤摺疊。變體可設計為保留或增強蛋白質特定區域(例如，功能結構域、催化性胺基酸殘基等)的生物活性。變體還包含本文所公開的多肽的片段，具體地是生物活性片段和/或與功能結構域相對應的片段。用於體外誘變克隆基因的技術為已知的。在本發明中還包括已利用普通分子生物技術修飾以提高它們對蛋白水解降解的抗性或優化溶解特性或使它們更適合用作治療劑的多肽。
嵌合抗體可通過重組方式通過將可變輕鏈區和重鏈區(vl和vh)組合來產生，所述抗體從一種物種中具有來自另一種物種的恆定輕鏈區和重鏈區的產生抗體細胞中獲得。通常嵌合抗體利用齧齒動物或兔的可變區和人恆定區來產生具有主要人結構域的抗體。此類嵌合抗體的產生為本領域已熟知的，並且可通過標準方式實現(例如如美國專利號5,624,659中所述的，所述專利以引用的方式整體併入本文。在本文中重組嵌合抗體將包含鉸鏈區內修飾的人igg2恆定區，以便產生作為受體或配體激動劑或拮抗劑起作用的抗體。
人源化抗體被工程化為含有甚至更多人樣免疫球蛋白結構域，並且僅結合動物來源抗體的互補決定區。這通過小心評估單克隆抗體可變區的高變環序列並使它們匹配人抗體鏈的結構來實現。儘管在表面上較複雜，但是所述方法直接用於實踐。參見例如美國專利號6,187,287，所述專利以引用的方式完全併入本文。
免疫球蛋白及其片段可進行翻譯後修飾，例如以添加效應部分，諸如化學接頭，可檢測部分諸如螢光染料、酶、毒素、底物、生物發光材料、放射性材料、化學發光部分等，或者特異性結合部分諸如鏈黴抗生物素蛋白、抗生物素蛋白或生物素等，它們可用於本發明的方法和組合物中。
現在已深入了解了在脊椎動物中的抗體的一般結構(edelman,g.m.,ann.n.y.acad.sci.,190:5(1971))。抗體由分子量約23,000道爾頓的兩條相同多肽輕鏈(「輕鏈」)和分子量53,000-70,000的兩條相同重鏈(「重鏈」)組成。在「y」構型四條鏈通過二硫鍵連接，其中輕鏈在「y」構型開口處開始將重鏈括在一起。「y」構型的「分支」部分標記為fab區；「y」構型的主幹部分標記為fc區。胺基酸序列取向從「y」構型頂部的n-末端延伸至每條鏈底部的c-末端。n-末端具有帶有對引起它的抗原的特異性的可變區，並且長約100個胺基酸，在輕鏈與重鏈之間和從抗體至抗體之間存在輕微變化。
在每條鏈中可變區連接至恆定區，所述恆定區延伸所述鏈的其餘長度並且在特定類別的抗體內並不隨著抗體特異性而改變(即，產生它的抗原)。存在五種已知的主要類別的恆定區，它們決定了免疫球蛋白分子的類別(與γ、μ、α、δ和ε(γ、μ、α、δ或ε)重鏈恆定區相對應的igg、igm、iga、igd和ige)。恆定區或類別決定了隨後的抗體效應功能，包括補體活化(kabat,e.a.,structuralconceptsinimmunologyandimmunochemistry，第2版，第413-436頁，holt,rinehart,winston(1976))，以及其他細胞反應(andrews,d.w.等，clinicalimmunobiology,pp1-18,w.b.sanders(1980)；kohl,s.等，immunology,48:187(1983))；而可變區決定了與它反應的抗原。輕鏈被分類為κ鏈(κ)或λ鏈(λ)。每個重鏈類別均可用κ或λ輕鏈製備。輕鏈和重鏈彼此共價結合，並且當通過雜交瘤或通過b細胞產生免疫球蛋白時兩條重鏈的「尾」部分通過共價二硫鍵彼此結合。
表述「可變區」或「vr」是指抗體的每對輕鏈和重鏈內直接涉及抗體與抗原的結合的結構域。每條重鏈在一個末端具有可變結構域(vh)，接著具有多個恆定結構域。每條輕鏈具有在一個末端的可變結構域(vl)和在另一個末端的恆定結構域；輕鏈的恆定結構域與重鏈的第一恆定結構域對齊，並且輕鏈可變結構域與重鏈的可變結構域對齊。
表述「互補決定去」、「高變區」或「cdr」是指抗體輕鏈或重鏈可變區內可見的一個或多個高變區或互補決定區(cdr)(參見kabat,e.a.等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,(1987))。這些表述包括如kabat等所定義的高變區(「sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,」kabate.等，usdept.ofhealthandhumanservices,1983)或抗體三維結構中的高變環(chothia和lesk,jmol.biol.196901-917(1987))。每條鏈中的cdr由框架區緊密固定在一起並且與來自另一條鏈的cdr一起幫助形成抗原結合位點。在所述cdr內存在已描述為選擇性決定區(sdr)的選擇胺基酸，所述選擇性決定區表示由cdr以抗體-抗原相互作用使用的關鍵性接觸殘基(kashmiri,s.,methods,36:25-34(2005))。
「表位」或「結合位點」為抗原接合肽(諸如抗體)特異性結合的抗原上的部分或區域。蛋白質表位可包含直接參與結合的胺基酸殘基(也稱為表位的免疫顯性組分)和未直接參與結合的其他胺基酸殘基，諸如被特異性抗原結合肽有效阻斷的胺基酸殘基(換言之，胺基酸殘基處於特異性結合肽的「足跡」內)。
短語第一抗體「基本上」或「至少部分」結合與第二抗體相同的表位意指所述第一抗體表位結合位點在抗原上包含的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或更多的胺基酸殘基構成第二抗體表位結合位點。而且，第一抗體基本上或部分結合與第二抗體相同或重疊的表位意指第一抗體和第二抗體競爭結合如上所述的抗原。因此，術語「結合與單克隆抗體基本上相同的表位或決定簇」意指一種抗體與所述抗體「競爭」。
短語「結合與感興趣的抗體相同或重疊的表位或決定簇」意指抗體所述感興趣的抗體「競爭」在所述感興趣的抗體特異性結合的抗原上的至少一個或所有的殘基。結合與本文所述的單克隆抗體基本上或大致上相同的表位的一種或多種抗體的鑑別可容易利用許多其中可評定抗體競爭的免疫篩選測定中的任一種測定來確定。許多此類測定按常規方式實施並為本領域中所熟知的(參見例如1997年8月26日提交的美國專利號5,660,827，所述專利以引用的方式特別併入本文中)。應理解實際上確定本文所述抗體所結合的表位並不需要以任何方式鑑別結合與本文所述單克隆抗體相同或基本上相同或重疊的表位的抗體。
術語「融合蛋白」是指包含經由其單獨肽主鏈由共價鍵連接的兩個或更多個蛋白質或其片段的分子，最優選地通過編碼那些蛋白質的多核苷酸分子的遺傳表達所生成。在本發明中，融合蛋白通常將包含igg2恆定結構域，通常其中鉸鏈區被突變來鎖定激動或拮抗構象的h2。
術語「免疫球蛋白融合蛋白」是指多肽的功能部分(通常包含細胞表面蛋白的細胞外結構域)與免疫球蛋白恆定區的一個或多個部分例如鉸鏈ch1、ch2或ch3結構域或其部分或組合的融合物。在一個實施方案中，細胞外結構域或片段所來源的多肽為tnf配體和受體超家族的成員。所述分子的ig部分將整體或部分來源於igg2免疫球蛋白並且可能將包括其他免疫球蛋白同種型的部分，包括例如igg1、igg3、igg4、igm、iga等。免疫球蛋白融合蛋白在本文中被稱為fc融合蛋白的ig，其中鉸鏈和/或ch1區內的半胱氨酸被修飾或缺失。
因此，本發明大體上涉及包含igg2恆定區、優選地在鉸鏈區內含有特定突變的igg2恆定區的結構域的激動或拮抗抗體和免疫球蛋白融合蛋白。本發明人在本文中利用體外和體內方法的組合證實人igg2(h2)向抗體、特別是抗-cd40抗體和其他tnf/tnfr受體(包括4-1bb和cd28)抗體遞送獨特的fcγr-獨立性激動活性。更具體地說，本發明人利用以下實施例中所公開的材料和方法證實以下各項：
人igg2比人igg1賦予抗-cd40更大激動活性
在本發明之前，用於激動性mab’s的最佳同種型為未知的，因為還未報導用於激動性mab’s的人同種型的正式研究。具體地說，如下文詳細公開的，抗人cd40mablob7.4的研究驚人地顯示h2的獨特活性依賴於鉸鏈和ch1二硫鍵的精確排列。將lob7.4『鎖定』成更柔性『h2a』或更緊密『h2b』構象的化學『改組』或誘變分別賦予了拮抗和激動特性。以這種方式對h2進行工程化允許開發具有免疫刺激或免疫抑制特徵的多肽，這直接提示了治療性mab和治療性融合蛋白的設計。
如下文中詳細公開的，本發明人比較了當表達為具有h1或h2恆定區時mab針對cd40以及共刺激t細胞受體cd28和4-1bb的免疫刺激特性。在所有情況下，本發明人發現h2的激動性比h1更大，這獨立於mabfc和fcγr二者的相互作用。抗人cd40mablob7.4的嵌合形式的分析顯示活性依賴於二硫鍵在h2鉸鏈中的排列。此外，特定半胱氨酸殘基的突變可將mab鎖定成激動或拮抗構象。基於這些觀察，人igg2因此提供了操縱mab功能從而允許選擇fcγr-獨立性激動劑以及阻斷不適當免疫活化的抑制劑的獨特機會。
先前利用抗小鼠cd40mab3/23的研究證實3/23m1具有高激動性而3/23m2a由於與fcγriib結合的差異而不具有激動性(whiteal等，(2013)；white等(2011))。為了分析人同種型對活性的作用；本發明人將3/23和抗人(h)cd40mablob7.4的可變區克隆到h1和h2恆定區上並且在許多體外和體內測定中比較了它們的活性與m1和m2a的活性。
對於兩種mab，h2證實了與m1類似的免疫刺激特徵，而h1和m2a為大部分無活性的(參見圖1、圖2和圖5)。在體內，3/23m1和h2有效刺激ab和cd8t細胞針對ova的反應、脾臟dc的活化，並且在疫苗環境(表達ova的實體eg7腫瘤)和治療環境中(bcl1淋巴瘤模型)提供針對腫瘤發展的保護，而3/23h1和m2a並不如此(圖5a-圖5e和(18))。類似地，在體外，lob7.4h2比lob7.4h1引起大得多的分離的人b細胞活化(如通過作為活化標記物的細胞團聚或細胞聚集所評定的)、活化標記物cd23的上調和3h-胸苷結合以及分離的主要人朗格漢斯細胞的活化(如通過cd70上調所評定的)(參見圖6a、圖6b)。
lob7.4m1和h2(而非m2a或h1)也允許hcd40tg小鼠b細胞在體外活化和增殖(參見圖1a)並刺激hcd40tg小鼠中ab和內源性cd8t細胞針對ova的反應大量且顯著的增加(圖1b、圖1c)。因此，在許多模型系統中，使用針對小鼠和人受體的mab，h2恆定區比h1賦予抗-cd40更大的激動活性。
人igg2的fc-和fcγr-獨立性活性
表面等離子體共振(spr)證實lob7.4h2具有對fcγr(包括fcγriib(圖6c)，其為小鼠b細胞上的唯一fcγr)的低親和力，這表明h2的激動活性為fcγr-獨立的。與此一致的是，去除lob7.4h2fc以產生fab』2並不會減小其促進人或hcd40tg小鼠b細胞活化和增殖的能力，而進一步裂解成fab』或使用h1或h1fab』2會減小活性(圖1d並且數據未示出)。另外，pan阻斷的抗-fcγriimab並不影響lob7.4h2活化人b細胞的能力，而它確實阻斷通過fcγrii過度表達的交聯細胞誘導的lob7.4h1的活性(圖6e)。此外，儘管lob7.4m1和h2二者均促進hcd40tgb細胞在體外活化和增殖，但是fcγriib的遺傳缺失消融了m1而非h2的活性(圖1e)。最後，當用ova免疫hcd40轉基因fcγriibwt或ko小鼠時，在ko動物中lob7.4m1增加cd8t細胞擴增的能力減小>80％，而fcγriib的損失並不會影響lob7.4h2的激動活性(圖1f)。
人igg2對其他共刺激受體具有激動性
h2恆定區還賦予其他免疫刺激mabfcγr-獨立的活性。最初來源於親本m1sc26(24)的另一種抗-hcd40mab特異性的嵌合h2(目前在臨床開發中為sgn40(seattlegenetics))活化分離的人b細胞，如通過團聚、cd23上調和增殖所評定的，而嵌合h1並不如此(圖2a)。此外，親本sc26m1和sgn40-sotonh2促進了hcd40tg小鼠b細胞的增殖(圖2b)，而當fcγriib在遺傳上缺失時，僅sgn40-sotonh2刺激增殖(圖2b)。
利用針對兩種人t細胞受體4-1bb(cd137；內部產生的mab)和cd28(基於tgn1412專利保護序列)的mab得到類似的觀察。對於兩種靶標，當促進體外人t細胞增殖時h2的激動性大於h1(圖2c)。抗-hcd28h2mab引起並不表達fcγr的純化t細胞團聚和增殖，再次支持fcγr-獨立性作用機制(圖2c)。
人igg2鉸鏈和ch1結構域為激動活性所必需的
由於h2fc並非活性所需要的，所以利用其中lob7.4h1和h2的ch1或ch1和鉸鏈結構域二者轉換的嵌合mab研究ch1和鉸鏈結構域的作用(圖3)。使用超過擴增mab濃度範圍(5,000ng/ml)的hcd40tgwt或fcγriibkob細胞的增殖測量活性。天然lob7.4h2引起兩種細胞類型的顯著活化和增殖，其中活性峰值為約200ng/ml，而在任何濃度下均觀察到很少的對h1的反應(圖3a)。lob7.4m1在fcγriibwt中而非ko細胞中刺激增殖並且在低濃度下功效顯著小於h2(圖3a，底部2個圖)。具有轉換的ch1結構域(ch11/2和ch12/1)或其中h1的ch1和鉸鏈轉移至h2(鉸鏈1/2)的mab在兩種細胞類型之一中具有很小的活性。相比之下，將h2ch1和鉸鏈區轉移至h1(鉸鏈2/1)產生與天然h2類似的活性(圖3b)。這些數據表明h2的ch1和鉸鏈結構域為激動活性所必需的。
與體外數據一致，lob7.4h1和鉸鏈1/2突變體在hcd40tg小鼠中引起cd8t細胞針對ova的反應的較少刺激，而lob7.4h2和鉸鏈2/1嵌合體引起抗-ova-特異性cd8t細胞擴增的大量和顯著增加(圖3c)。
二硫鍵改組指示huigg2激動活性
人igg2在免疫球蛋白中的獨特之處在於其改組ch1和鉸鏈區內的二硫鍵的能力(圖17；(wpych等，(2008)；martinez等，(2008)；zhang等，(2010))。h2的兩種亞型佔主導地位：具有柔性的經典igg構象的h2a，其中ch1中的重鏈(hc)c127連接至輕鏈(lc)中的c214並且在相對鉸鏈半胱氨酸232、233、236和239之間存在4個hc間二硫鍵(圖17)；以及更緊密的h2b，其中hcc127和lcc214與鉸鏈半胱氨酸232和233形成二硫鍵橋(圖17)。h2a和h2b形成可通過非還原性毛細管電泳(nrce-sds(26,29)，它揭示了h2的雙峰和h1的單峰(圖17))來以分析方式分離。
嵌合lob7.4mab的nrce-sds分析顯示僅鉸鏈2/1突變體保留改組二硫鍵並產生雙峰的能力(圖3d)。這與以下觀察一致，hc半胱氨酸127(在ch1中)、232或233(在鉸鏈中)中任一個的突變防止了二硫鍵重新排列(26,30)並且表明lob7.4h2的激動活性與其改組二硫鍵的能力相關。
為了確定h2a和h2b形式是否與不同水平的激動活性相關，在具有或不具有變性劑的氧化還原緩衝液中使lob7.4化學『傾向(skewed)』於其h2a或h2b形式，如(28)中所述的。在單獨的氧化還原緩衝液中孵育迫使大部分(～75％)成為h2b，如通過nrce-sds所評定，而加入鹽酸胍使得>70％傾向於h2a(圖4a，左圖)。傾向的mab與顯著不同的活性相關，如通過其引起人b細胞團聚和活化或hcd40tgb細胞增殖(圖4a並且數據未示出)的能力評定的，其中h2b的活性顯著大於h2a。當抗小鼠cd40mab3/23、h2傾向於其a和b形式時觀察到類似的活性差異(圖7a-圖7c)。
點突變可將h2鎖定成激動和拮抗構象
由ballard和其他人(26,30)進行的簡潔研究表明hcc232或c233突變成s可將h2鎖定成其h2a形式，而hcc127s產生與h2b類似的形式。將這些突變引入到lob7.4h2中並通過nrce-sds證實其朝向h2a或h2b偏移(圖4b)。hcc232s或c233s導致lob7.4h2激動活性完全喪失，如通過hcd40tgb細胞增殖所測量的(wt或fcγriibko；圖4c，藍色線)。相比之下，hcc127s在高濃度下相對於天然h2使活性增加至幾乎與傾向的h2b一樣高的水平(圖4c，底部圖，藍色線)。有趣的時，與hcc233sh2a共孵育減小了lob7.4h2b的活性，特別是在高濃度下，從而產生幾乎與天然h2相同的特徵性鐘形曲線(圖4d)。類似地，lob7.4hcc233s也在體外顯著減小sgn40h2在hcd40tgb細胞上的激動活性(圖7d)。
lcc214的誘變還產生顯著的活性變化。lcc214s防止了lc與hc之間的二硫鍵合，從而在nrce-sds上產生分離的lc和hc二聚體峰(圖4c)。重要的是注意到h:l二硫鍵的喪失並不影響抗體結合，因為在生理緩衝液中兩條鏈通過非共價鍵保持在一起。當與wtlc或lcc214s組合時，這通過cd40在hcc233s的spr上的相同親和力來證實(圖4e)。
當lcc214s與wthc、hcc232s或c233s組合時，hc二聚體在nrce-sds上作為單一物質運行，這表明在每種情況下的單一構象。在所有情況下，lcc214s增加了激動活性並提供了特徵性b細胞增殖曲線：與wthc組合時觀察到與c127s突變體類似的曲線；與hc232s組合時產生與天然h2類似的曲線；並且當與hcc233s組合時可見與傾向的h2b非常類似的最大活性(圖4c，紅色線)。這些曲線具有高再現性並使用hcd40tg或人b細胞時為類似的(數據未示出)。因此，一級序列中的小變化可對h2活性具有顯著作用，從而使得能夠工程化激動劑和拮抗劑的活性譜。
人igg同種型和抗-cd40活性
為了評估人恆定區對激動活性的作用，使用抗人cd40mabchilob7/4(chowdhury,2014)，通常用於癌症患者的第1期臨床試驗。最初通過當嵌合到不同人恆定區時chilob7/4引起人b細胞在體外活化和增殖的能力來評定激動活性。所有嵌合體均類似地結合cd40，如通過流式細胞術測定的(圖8d)。chilob7/4h1和h2的fab』片段也以類似的親和力結合固定的hcd40(分別為10.0和10.2x10-9m)，如通過spr所測量的(圖8e)。當加入到純化的人b細胞中時，與chilob7/4h1或h4相比，chilob7/4h2引起大得多的b細胞活化和增殖，如分別通過同型粘附(細胞團聚)和3h胸苷攝取所評定的(圖8a)。為了確定fab』臂交換並不引起h4活性缺乏，將穩定的s228p突變引入到h4中(angal等，1993)。此改變(在圖8a中的h4*)並不改變h4活性。
在臨床前模型中，抗-cd40mab的免疫刺激和治療作用可通過上調dc上的共刺激分子cd70來介導，從而使得cd8t細胞免疫性增強(french等，1999；french等，2007；sanchez等，2007)。為了比較chilob7/4h1和h2活化人dc的能力，評定其在體外上調原代人朗格漢斯細胞上的cd70表達的能力(圖8b)，以及其增強由ifnγ測量的ebv-特異性人cd8t細胞的朗格漢斯細胞誘導的引物的能力(圖8c)。與對b細胞的作用一致，chilob7/4h2增強了朗格漢斯細胞cd70表達和cd8t細胞致敏，而chilob7/4h1並不如此。
在hcd40tg小鼠中評估chilob7/4同種型的體內激動活性(ahonen等，2002)。初始體外研究證實小鼠細胞中的hcd40響應於與chilob7/4的連接，這與人細胞中類似，因為chilob7/4h2刺激比h1(圖8d)大得多的分離hcd40tg小鼠b細胞活化和增殖，所述活化和增殖依賴於hcd40的表達(圖9f)。為了測試體內激動活性，評估chilob7/4當與模型抗原ova共同施用時增強cd8t細胞和ab反應的能力。與體外數據一致，chilob7/4h2刺激比使用h1所觀察到的顯著更大的抗-ovacd8t-細胞擴增以及ab反應(圖8e)。因此使用一系列的體外和體內方法，chilob7/4證實了當與h2對比h1或h4恆定區一起表達時更大的免疫刺激活性。
當評估抗小鼠cd40mab3/23時也在體內觀察到h1與h2激動活性之間的類似差異，其中還是3/23h2而非h1刺激有效的抗-ovacd8t-細胞和ab反應(圖8f)並且上調脾臟dc上的cd70(圖9g)。重要的時，免疫刺激能力的此差異與治療活性的差異相關，其中3/23h2而非h1在疫苗環境和治療環境中提供針對腫瘤發展的保護，在所述疫苗環境中用ova-表達的eg7腫瘤攻擊以ova和抗-cd40免疫的小鼠(圖9g)並且在治療環境中用單一100μg劑量的mab治療具有建立的b細胞淋巴瘤的小鼠(bcl1淋巴瘤模型(white,2014)；圖8h)。
人igg2活性為fcγr-獨立的。
h2對fcγriib(bruhns等，2009)的低親和力、在b細胞上的主導fcγr表明與使用fcγriib作為交聯劑的激動性m1(white等，2011)，其活性可為fcγr獨立的。實際上，其中可溶性fcγr穿過固定的mab的表面等離子體共振(spr)顯示chilob7/4h2與任何人或小鼠fcγr的結合非常少(圖11a和圖11b)，而chilob7/4h1在相同條件下明顯結合hfcγri、iia和iiia以及mfcγri和iv(圖11a和圖11b)。許多方法證實h2的fcγr獨立性活性。首先，pan-阻斷的抗-fcγriimab(at10)未能阻止chilob7/4h2對人b細胞的活化，如通過同型粘附和cd23上調所評定的(圖10a)。相比之下，at10完全阻斷了在fcγii-表達的交聯細胞存在下誘導的chilob7/4h1進行的活化(圖10a)。
其次，通過胃蛋白酶裂解去除chilob7/4h2fc(產生f(ab』)2片段)並不阻止人b細胞的活化和增殖，而fab』的減小消除了活性(圖10c)。相比之下，在相同條件下chilob7/4h1當作為igg、f(ab』)2或fab』加入時不能活化細胞，儘管過量加入時每種形式均防止由chilob7/4h2進行的活化(圖10b；圖11f)。第三，來自小鼠b細胞的遺傳缺失的fcγriib為這些細胞表達的唯一fcγr，它並不阻止響應於廣泛濃度範圍的chilob7/4h2的增殖(圖10c)，而對活性依賴於fcγriib交聯的chilob7/4m1的反應(white等，2011)已喪失(圖10c)。注意，chilob7/4h2當用於以不同濃度刺激b細胞時產生特徵性『鍾』形反應曲線並且在非常低水平為有活性的，這與活性隨著濃度升高而增加的交聯依賴性chilob7/4m1相反(圖10d)。這些不同曲線據推測反映了同種型賦予激動活性的不同機制並且在下文中進一步討論。
還在體內證實了chilob7/4h2的fcγr-獨立性活性。遺傳缺失的fcγriib先前顯示導致mab針對cd40(li和ravetch,2011；white等，2011；white,2014)、fas、dr4和dr5(li和ravetch,2012；wilson等，2011；xu等，2003)的激動活性喪失，與野生型(wt)小鼠中觀察到的相比，它並不減少由chilob7/4h2誘導的ova-特異性cd8t細胞的擴增，而正如預期的，chilob7/4m1的活性在fcγriibko中喪失(圖10d)。在不具有激動性fcγr的γ鏈ko小鼠中兩種mab均保留活性(圖10d)。最後，當作為f(ab』)2片段施用時chilob7/4提供強烈的體內cd8t細胞反應刺激，而使用chilob7/4h1的f(ab』)2時未觀察到反應(圖10e)。
人igg2對多種靶標具有激動性。
然後在臨床試驗中評價h2恆定區對另一種hcd40mabsgn40(也稱為嵌合h1)的活性的影響(advani等，2009)。由親本序列合成sgn40的可變區並將其嵌合到h1和h2恆定區上，以產生sgn40-sotonh1和h2。與chilob7/4類似地，sgn40-sotonh2提供比sgn40-sotonh1更大的人b細胞活化和增殖(圖12a)並且hcd40tgb細胞響應於sgn40-sotonh2而非其親本m1sc26的增殖(hanks等，2005)獨立於fcγriib表達(圖12b)。另外，sgn40-sotonh2顯著且有效地增加了fcγriibko小鼠中的體內ova-特異性cd8t細胞反應，而sgn40-sotonh1並不如此(圖12c)。在臨床開發中使用針對另外兩種共刺激受體h4-1bb和hcd28的mab的進一步研究顯示了由人t細胞體外增殖評定的h1與h2激動功能的類似差異(圖12d-圖12e)。對於hcd28，使用純化的t細胞。t細胞通常缺乏fcγr但顯示出同型粘附和響應於抗-hcd28h2的增殖增加，再次支持了fcγr-獨立性作用模式(圖12e)。與chilob7/4(圖8a)類似的，在純化的t細胞培養物中h4恆定區並未賦予抗-hcd28活性(圖12e)。
h2活性取決於人igg2ch1和鉸鏈區。
由於h1和h2chilob7/4mab的可變區相同並且h2的活性獨立於其fc結構域，所以評價chilob7/4h2的ch1和鉸鏈結構域在激動活性中的作用。為此，產生其中chilob7/4h1和h2的單獨ch1結構域或ch1和鉸鏈結構域二者轉換的突變體(圖13a)。結構域交換並不幹擾抗原結合，如通過流式細胞術評定的(圖14)。不同mab的比較性激動活性通過其促進人b細胞活化和hcd40tgb細胞體外增殖的能力來評定(圖13a)。當h2的ch1結構域被h1的該結構域(ch11/2)替換或者h1的ch1被h2的該結構域(ch12/1)替換(圖13a，(i)和(ii))時，可見少量b細胞增殖並且未活化人b細胞，除非提供表達高水平fcγriib的細胞來交聯mab。因此單獨h2ch1結構域(在ch12/1中)或單獨h2鉸鏈區(在ch11/2中)並不賦予活性。類似地，當h2的ch1和鉸鏈被h1的ch1和鉸鏈替換(ch1hge1/2)時(圖13a(iii))未見活性。然而，當h1的ch1和鉸鏈被h2的ch1和鉸鏈替換(ch1hge2/1)(圖13a(iv))時觀察到fcγriibwt和kohcd40tgb細胞二者的劇烈人b-細胞活化和增殖，這與使用天然h2所觀察到的類似。類似地，在體內，chilob7/4ch1hge2/1產生ova-特異性cd8t-細胞擴增的顯著增加而ch1hge1/2為無活性的(圖13b)。這些數據顯示h2的不常見激動活性需要其ch1和鉸鏈結構域。
人igg2活性依賴於其二硫鍵構型。
igg2在人igg中的獨特之處在於其『改組』ch1和鉸鏈區內的二硫鍵(圖18)從而產生一系列亞型的能力(dillon等，2008；martinez等，2008；wypych等，2008；zhang等，2010)。據信所述分子以其「h2a」形式合成，其中ch1中的重鏈(hc)cys127連接至輕鏈(lc)中的cys214，然後在血液中通過一系列中間體(liu等，2008)逐漸轉化成其『h2b』形式，其中hccys127和lccys214與hc鉸鏈cys232和cys233形成二硫鍵(圖18a)。重要的時，生理化學特性(dillon等，2008)和電子顯微鏡檢查(ryazantsev等，2013)表明h2a具有經典的igg柔性『y』構象，而h2b採用更緊密的形狀，其中fab』臂與鉸鏈緊密保持在一起。h2a和h2b形式可通過非還原性毛細管電泳(nrce-sds；(martinez等，2008))區分，其中它們與h1的單峰相比被顯示為未分離h2中的雙峰(圖18b)。在以上分析的chilob7/4mab突變體中，僅ch1hge2/1在nrce-sds上保留雙峰(圖18b)，這支持以下假設，二硫鍵改組對於激動活性為重要的。
為了確定不同二硫鍵合形式的chilob7/4是否與不同激動活性相關，採用兩種方法。首先，在變性劑存在或不存在下在氧化還原緩衝液中chilob7/4的化學『傾向』分別用於富集h2a或h2b(dillon等，2008)(圖15a，頂部圖)。這產生顯著不同的活性，其中使用傾向的h2b產生比h2a大得多的hcd40tgb細胞活化(圖15a)。當將傾向形式加入到人b細胞中時對於以下各項觀察到類似的b細胞活化差異(圖16a)：傾向形式的chilob7/4ch1hge2/1突變體(圖16b)和抗小鼠cd40mab3/23，其中3/23h2b能夠以可溶形式活化小鼠b細胞，而h2a需要與表達fcγriib的交聯細胞共孵育(圖15b；這些細胞表達非生理高水平的能夠交聯h2的fcγriib(white等，2011))。h2b傾向形式的chilob7/4還能夠作為完整igg(圖15d(i))或作為f(ab』)2片段(圖16c)活化fcγriibkob細胞，這證實其活性保持為fcγr-獨立的。其次，使用誘變產生如先前所述的『鎖定』h2a-和h2b-樣形式(allen等，2009；martinez等，2008)。chilob7/4的hcc232s或c233s突變產生同源h2amab，如通過nrce-sds評定的(圖15c(hcc232s,hcc233s))，所述h2amab在所測試的廣泛範圍的任何濃度下並不刺激hcd40tg小鼠b-細胞增殖(圖15d(ii)和(iii))，而h2b-樣hcc127s突變體(圖15c(hcc127s))對於fcγriibwt和ko細胞顯示相對於高濃度天然h2增加的活性(圖15d(iv))。
這些合併的數據表明h2的fcγr獨立性激動活性取決於在其鉸鏈和ch1結構域中的精確二硫鍵構象，並且確切地說取決於其採用更緊密h2b形式的能力。通過cd40連接進行免疫活化似乎需要在細胞膜上的受體成簇，以允許traf募集和細胞內信號向下遊傳導。通過nfkb活化介導了許多作用(elgueta等，2009)。使用原代hcd40tgb細胞(圖15e)和轉化的人ramosb細胞(圖16d)的實驗顯示chilob7/4h2b與h2a相比大得多的活化nfkb的能力，如由細胞刺激之後大大增強的ikb磷酸化所反映的。這與更緊密h2b促進cd40在細胞膜上成簇從而導致nfkb信號傳導和細胞活化的能力一致。
誘變產生一定範圍的igg2激動活性。
進一步研究顯示chilob7/4h2可被操縱來實現一定範圍的激動活性。lccys214突變成ser阻止了lc-hc二硫鍵合，從而在nrce-sds上產生兩個峰(圖15c(lcc214s))。然而，在非變性條件下mab保持完整而與cd40的結合沒有減少，如通過spr(圖15f)或流式細胞術(圖16e)所測量的。lcc214s引起hcd40tgb-細胞增殖的增加，這與c127s突變體類似(圖15d(i))。然而，lcc214s與hc232s組合得到與天然h2類似的曲線，其中活性在高濃度下極大地減小(圖15d(ii))，而lcc214s與hcc233s組合提供了與傾向的h2b類似的最大活性(圖15d(iii)對比(i))。如本文所述，天然chilob7/4(各亞型混合物)當用於在體外刺激b細胞時產生特徵性『鍾』形濃度曲線，其中b細胞反應在搞濃度下較低(例如，圖10d、圖12b和圖15d(i))。此作用在使用純h2b的情況下極大地喪失，其中高濃度保留全部活性(圖15d)，但在使用h2a和h2b的1:1混合物的情況下再現該結果(圖15g)。如果完全缺乏對h2a形式的反應，那麼這表明h2a可阻斷h2b的活性，從而減小其高濃度下的功效並且表明h2a具有一定水平的拮抗活性。最後，概括chilob7/4h2a和h2b活性在體內的差異，其中在hcd40tgfcγriibko小鼠中h2b引起比h2a顯著更大的ova-特異性cd8t細胞(圖15h)和ova特異性igg(圖15i)的擴增。對於h2a和h2b傾向形式的ch1hge2/1突變體觀察到類似的體內活性差異(圖16f和圖16g)。總之，數據表明h2的二硫鍵結構的操縱使得能夠產生具有限定和不同的免疫刺激功能的治療劑，重要的是所述功能獨立於fcγr在靶組織中的存在。
在實施例中進一步描述所進行的實驗並且在下文中更詳細地描述了本文所用的材料和方法。
實施例
在實施例1-7中使用的材料和方法
小鼠
c57bi/6和rag-/-小鼠來自charlesriverlaboratories(kent,uk)。其他遺傳改變的品系(所有均在c57bl/6背景下)為c57bl/6fcγriib-/-、otitcr轉基因品系(來自dr.matthiasmerkenschlager,imperialcollege,london)和人cd40轉基因品系(hcd40tg)(來自randolphnoelle(kingscollege,london))。人cd40tg/fcγriib-/-小鼠通過與由流式細胞術證實的基因型雜交育種來獲得。繁殖動物並在當地動物工廠中養殖動物並且使用約8-12周大的動物。所有實驗均根據當地倫理學協會指南在ukhomeoffice許可證編號ppl30/2451和ppl30/2964下進行。
抗體和試劑
使用以下雜交瘤：抗人cd23(mhm6)來自jgordon(universityofbirmingham)。在室內使用常規雜交瘤技術產生結合fcγriia和iib(33)的抗人fcγrii(at10)、抗人cd40(lob7.4；(22))和抗人4-1bb。抗小鼠cd19-pe(克隆1d3)、抗人cd19-pe(克隆rfb9)來自abdserotec(oxford,uk)。抗小鼠cd23-pe來自bdbiosciences。對於oti細胞染色，使用apc-標記的抗-cd8α(克隆53-6.7；bdbiosciences)和先前所述的在室內產生的pe標記的siinfekl四聚體(12)。使用facscaliber(bdbiosciences)進行流式細胞術。雞卵清蛋白(ova)購自sigma-aldridge(poole,uk)。無內毒素ova來自ag(regensberg,germany)。
嵌合抗體
編碼不同抗體的重鏈和輕鏈可變區的dna構建體從雜交瘤中通過pcr反應擴增或者通過genewiz,inc合成。sgn40-soton和tgn1412-soton使用公布序列(美國專利號wo2007/075326和us7,585,960)產生。將可變區亞克隆到含有不同抗體同種型的恆定區的表達載體(重鏈的pee6.4載體和輕鏈的pee12.4載體，lonza)。將重鏈和輕鏈載體進一步亞克隆在一起，之後轉染到293f細胞以瞬時產生抗體或者轉染到cho-k1細胞中以穩定產生抗體。通過蛋白a-瓊脂糖(sigma-aldrich)色譜法純化分泌的抗體並且通過凝膠過濾經由sephadex200(sigma-aldrich)去除聚集物。所有製備物均含低內毒素(1.5cm)。如先前所述地進行b細胞淋巴瘤(bcl1)治療(18)。
細胞活化和增殖
樹突狀細胞：對於顯微鏡檢查，在用100μg抗-cd40mab靜脈內注射後2天從rag-/-小鼠收穫脾臟並且如先前所述地對cd70和midc8進行切片染色(12)。如先前所述地分離人原代朗格漢斯細胞(lc)(35)。簡言之，在根據helsinkiguidelines由南安普頓和南西漢普郡研究倫理委員會(southamptonandsouthwesthampshireresearchethicscommittee)批准並獲得正式書面同意之後從健康個體獲取皮膚樣本。在20h酶促消化(disopase,2iu,gibco,uk)分離出上皮層。在從上皮層遷移48h後收集lc並且通過optipreptm密度梯度(axisshield,norway)富集至>70％cd1a+hladr+細胞。將細胞以5x104個細胞/孔接種到96u-底板中補充有青黴素/鏈黴素(1％,sigma,uk)和fbs(10％,invitrogen,uk)的rpmi1640(gibco,uk)中並且lob7.4人igg1或人igg2抗體或同種型對照(0.001μg/ml-10μg/ml)刺激18h。通過流式細胞術評定活化標記物(cd40、cd86、cd70,bdbiosciences,uk)在cd1a+hladr+(bdbiosciences,uk)lc上的表達。
b細胞：使用磁性陰性選擇試劑盒(miltenyibiotechorstemcelltechnologies)從脾臟(小鼠)或周圍血液單核細胞(pbmc，人)中純化b細胞。從血液錐體細胞中分離人pbmc(淋巴細胞分離劑，axis-shield)，所述血液錐體細胞通過國家血液中心(southamptongeneralhospital)從不具名健康供體中獲得。將細胞以1x105個細胞/孔接種到具有不同濃度的mab的96-孔圓底盤中，如對於個別實驗所述的。對於人細胞，使用具有和不具有重組人il-4(20ng/ml)的培養。在一些情況下，還加入用人fcγr轉染的1x105個293細胞。如先前(white等(2011))所述地進行轉染。為了評定活化，在孵育過夜後對細胞進行拍照(具有cc12軟成像系統的olympusckx41顯微鏡)並且通過流式細胞術(facscalibur,bdbiosciences)分析活化標記物表達。在培養5天(小鼠)或8天(人)之後通過[甲基-3h]胸苷(perkinelmer,cambridge,uk)結合評定增殖，如(white等，(2011))所述的。
t細胞：用2mmcfse標記人pbmc並且接著在如(36)所述的24孔板磚以高密度預培養2天，其中每孔1.5ml細胞，1x107個/ml。洗滌預培養的細胞並且以1x106個/ml重新懸浮以用於測定。對於一些實驗，使用總t細胞分離試劑盒(miltenyibiotec)從預培養的pbmc中分離出t細胞。對於抗-h4-1bbmab，將96孔圓底板的孔用pbs中的0.02μg/mlokt3塗覆4h，接著洗滌兩次並將105pbmc/孔用5μg/mlmab(最終體積150μl)孵育5天。通過流式細胞術分析cfse稀釋液來評定cd4+細胞的增殖。對於抗-cd28mab，在未塗覆孔中用mab孵育105個分離的t細胞並且如上所述地評定增殖。結果表示為分裂細胞百分比。
表面等離子體共振
使用biacoret100評定可溶性fcγ受體與3/23和lob7.4mab同種型之間的相互作用。通過標準胺偶聯根據製造商說明書將抗體或作為對照的bsa以高密度(15,000ru)和低密度(1,000ru)固定至cm5傳感器晶片(biacore)的流動細胞中。將可溶性fc受體(fcγri、iia、iib、iiia和iiib，randdsystems,abingdon,uk)以200、100、50、25、12.5和6.25nm(在50nm點，重複兩次進行)注射通過hbs-ep運行緩衝液(biacore)中的流動細胞中，流速為30μl/min。將可溶性fc受體注射5min並且監控解離10min。自動減去對照流動細胞的背景反應。
統計學分析
使用graphpadtmprism軟體(graphpadtmsoftware,inc.,lajolla,california)進行學生t-檢驗(非成對)。對於ab反應的比較，對數據進行對數轉換，隨後進行分析。當分析前對數轉換的p<0.05時接受顯著性。當p<0.05時接受顯著性。
實施例1
實施例1涉及圖1(a)-圖1(f)中顯示人igg2賦予抗-hcd40mablob7.4fcγr獨立性激動活性的實驗。圖(a)顯示其中純化的hcd40tg小鼠脾臟b細胞用200ng/ml指定的同種型lob7.4mab孵育的實驗結果。通過在孵育過夜後的細胞團聚(頂部圖)和cd23上調(中部圖；填充灰色直方圖，未處理對照，黑線處理的細胞)以及作為增殖量度的3h胸苷摻入量(底部圖；三份樣品的平均值+/-se)評估b細胞活化。示出來自7個實驗中的1個的數據。圖(b和c)示出其中hcd40tg小鼠用0.5mgsigmaova+100μg指定的mab免疫的結果。分別在8天和14天後測定循環siinfekl-特異性內源性cd8+t細胞(b)和抗-ovaab(c)。示出來自2個實驗的組合數據(n＝7)。圖(d)示出其中hcd40tgb細胞與(a)中一樣用1μg/mllob7.4h1和h2完整igg、fab』2或fab』片段孵育16h後進行分析的實驗結果。(所示5個實驗中的1個)圖(e)示出其中作為fcγriib+/+(wt)或fcγriib-/-(ko)的hcd40tgb細胞用1μg.ml指定的lob7.4mab孵育並與(a)中一樣進行分析的實驗結果。示出來自5個實驗中的1個的結果。(f)作為fcγriib+/+(wt)或fcγriib-/-的hcd40tg小鼠用oti細胞過繼轉移，接著用100？gsigmaova+100μg指定的lob7.4mab免疫。在5天後列舉循環oti細胞。值為三次重複小鼠的平均值+/-sd。示出來自2個實驗中的1個的結果。
實施例2
此實施例涉及在圖2中示出人igg2賦予其他抗-tnfrsfmabfcγr-獨立性活性。圖(a)包含其中人b細胞用抗-hcd40mabsgn40-sotonh1或h2孵育的實驗結果和如圖1(a)中評定的活化和增殖。圖(b)包含其中響應於200ng/mlsgn40h1和h2或sc26m1(sgn40親本mab)而發生的hcd40tgb細胞增殖(wt或fcγriib-/-)與圖1(e)中一樣地評定的實驗結果。示出來自2個實驗中的1個的結果。圖(c)包含其中響應於嵌合h1和h2的人t細胞增殖為pbmc培養物中的抗h4-1bb或純化t細胞培養物中的抗-hcd28。示出用於比較的同種型處理的對照(c)。在下部圖中的照片為用抗-cd28h1和h2處理的純化t細胞。
實施例3
此實施例涉及在圖3(a)-圖3(d)示出h2ch1和鉸鏈區賦予lob7.4fcγr-獨立性激動活性的實驗。圖(a和b)包含天然(a)或其中ch1(ch11/2和ch12/1)或ch1和鉸鏈區(交聯1/2和交聯2/1)已交換(b)的lob7.4h1和h2mab的(頂部)示意圖。在這些圖的中部圖中，示出與未刺激細胞(灰色直方圖)相比，在用指定的mab孵育過夜後在人b細胞上的cd23表達(黑線)。在這些圖的底部圖中，通過3h胸苷摻入量來評定響應於各種濃度的嵌合mab的hcd40tgfcγriib+/+(wt)或fcγriib-/-(ko)b細胞增殖。在(a)中比較了響應於lob7.4h1、h2和m1的增殖。(c)hcd40tg小鼠用oti細胞過繼轉移，接著用0.5mgsigmaova加上100μg所指定的lob7.4h1或h2或者嵌合鉸鏈1/2或鉸鏈2/1免疫。示出反應峰值(第5天)的循環oti細胞(平均值+/-sd,n＝6，從2個實驗中組合)。*p<0.05**p5個類似實驗中的1個的數據。)圖(e)示出結合固定hcd40的指定lob7.4h2突變體的spr曲線。所用的mab濃度為：100、20、4、0.8和0.16nm，hcd40～8000ru。在1200ruhcd40下獲得類似結果。
實施例5
此實施例涉及在圖5(a)-圖5(e)中示出抗小鼠cd40mab3/23的同種型依賴性的實驗。圖(a和b)包含其中小鼠用oti細胞過繼轉移接著用不具有(對照)或具有100μg指定3/23mab的500μgsigmaova或100μgendoova免疫的實驗結果。在(a)和(b)中分別在5天和14天後測量循環oti細胞和抗-ovaab濃度。結果對於三次重複小鼠為平均值+/-sd並且表示5次(sigmaova)或3次(endoova)實驗中的1個。(*p<0.05**p10個單獨實驗中的1個的結果。圖(b)包含其中來源於朗格漢斯細胞的人皮膚用lob7.4h1或h2或同種型對照mab孵育18h並且通過流式細胞術分析cd70表達的實驗。(示出來自2個實驗中的1個的結果)。(*p<0.05**p<0.01)。圖(c)示出與人fcγr結合的lob7.4h1和h2的表面等離子體共振(spr)傳感圖。使用以1,000或15,000ru固定的mab獲得類似的結果。圖(d)示出其中cfse-標記的人b細胞用lob7.4h1或h2加上未轉染293細胞(對照)或表達高水平的指定人fcγr的細胞孵育的實驗。在8天後通過流式細胞術分析cfse稀釋液來評定b細胞增殖。灰色直方圖表示未刺激細胞。圖(e)示出其中分離的人b細胞在50倍過量at10fab』2和/或表達高水平指定hfcγriia的293細胞存在或不存在下用lob7.4h1或h2孵育16h的實驗。將cd23表達(黑線)與未刺激細胞(灰色直方圖)進行比較。
實施例7
此實施例涉及在圖7(a)-圖7(d)中證實h2a和h2b的拮抗和激動特性的實驗。圖(a)示出天然3/23h2或化學傾向於其h2a和h2b形式的h2的nrce-sds曲線。圖(b)示出在表達fcγriib的交聯細胞不存在或存在下用天然或傾向形式的3/23h2孵育的小鼠b細胞上的cd23表達上調。(示出3個實驗中的1個)。圖(c)示出小鼠b細胞響應於指定濃度的3/23h2a和h2b的增殖。圖(d)示出hcd40tgb細胞wt或fcγriibko響應於單獨的sgn40-sotonh2或與lob7.4hcc233s(h2a)的1:1混合物的增殖。(示出來自2個實驗中的1個的重複兩次樣品的平均值和範圍)。
以下方法和材料用於實施例8-16中所述的實驗中。
材料和方法
小鼠
c57bi/6和rag-/-小鼠來自charlesriverlaboratories(kent,uk)。其他遺傳改變的品系(所有均在c57bl/6背景下)為fcγriib-/-(boross等，2011)、otitcr轉基因品系(由dr.matthiasmerkenschlager,imperialcollege,london惠贈)和人cd40轉基因品系(hcd40tg)(由randolphnoelle(kingscollege,london)惠贈)(ahonen等，2002)。人cd40tg/fcγriib-/-和g鏈-/-小鼠通過與由流式細胞術證實的基因型雜交育種來產生。繁殖動物並在當地動物工廠中養殖動物並且使用約8-12周大的動物。所有實驗均根據當地倫理學協會指南在ukhomeoffice許可證編號ppl30/2451和ppl30/2964下進行。
抗體和試劑。
使用以下雜交瘤：抗人cd23(mhm6)來自jgordon(universityofbirmingham)。抗人fc？nti-人fc)3(mhm6)來自γriia和iib(greenman等，1991)，抗人fcγriib(kb61)、抗人cd40(chilob7/4；(chowdhury,2014))和抗人4-1bb使用常規雜交瘤技術在室內產生。抗小鼠cd23-pe來自bdbiosciences。對於oti細胞染色，使用apc-標記的抗-cd8α(克隆53-6.7；bdbiosciences)和先前所述(white等，2011)的在室內產生的pe標記的siinfekl四聚體。使用facscalibur(bdbiosciences)進行流式細胞術。雞卵清蛋白(ova)來自sigma-aldridge(poole,uk)。無內毒素ova來自ag(regensberg,germany)。
嵌合抗體。
編碼不同mab的重鏈和輕鏈(κ)可變區的dna構建體從雜交瘤中通過pcr反應擴增或者通過genewiz,inc合成。抗-cd40mabsgn40-soton和抗-cd28tgn-soton使用公布序列(分別為美國專利號wo2007/075326和us7,585,960)產生。在增補版試驗方法中可見mab純化和質量控制方法的詳情。
免疫和免疫反應的評定。
如對個別實驗詳述的，經由尾靜脈注射200μlpbs來免疫小鼠。通過elisa測定血清抗-ovaab水平(white等，2010)。在一些實驗中，在免疫前一天經由尾靜脈給予3x105脾臟ova-特異性cd8(oti)t細胞。
腫瘤治療。
對於針對表達ova的胸腺瘤的疫苗eg7，在第-6天時用5x104oti細胞過繼轉移小鼠，接著在第-5天時接受0.5mgsigmaova+100mg抗-cd40mab。在第0天時用5x105eg7腫瘤細胞皮下攻擊小鼠。監控腫瘤生長並且在達到人道終點(當獲得兩個最大垂直測量值時為15mm平均腫瘤直徑)時處死小鼠。如(white,2014)所述地進行b細胞淋巴瘤(bcl1)治療。簡言之，在第0天用1x104個bcl1細胞通過尾靜脈接種小鼠。在第14天(當腫瘤良好地形成並且代表5％-10％脾重量)用單次100μg劑量的抗-cd40處理小鼠。
細胞活化和增殖。
在下文中描述了評定樹突狀細胞、b細胞和t細胞的活化和/或增殖的分離和測定詳情。
表面等離子體共振。
將biacoret100(gehealthcare)用於評定可溶性fcγ受體和chilob7/4mab同種型之間的相互作用以及可溶性mab與固定cd40之間的相互作用，如下文所述的。
統計學分析。
使用graphpadtmprism軟體(graphpadtmsoftware,inc.,lajolla,california)進行學生t-檢驗(非配對，雙尾)和存活分析(log-rankmantel-cox檢驗)。對於ab反應的比較，對數據進行對數轉換，隨後進行分析。在一些情況下，將來自多個實驗的數據合併。然而，這未必總是可能的，因為儘管在實驗之間的相對差值保持相同，但是絕對測量值通常變化太大難以合併。當處於此情況下時，示出具有在圖例中說明地進行的許多實驗的一個單一代表性實驗。
嵌合抗體產生和質量控制
將可變區亞克隆到含有不同抗體同種型的恆定區的表達載體(重鏈的pee6.4載體和輕鏈的pee12.4載體，lonza)。將重鏈和輕鏈載體進一步亞克隆在一起，之後轉染到293f細胞以瞬時產生mab或者轉染到cho-k1細胞中以穩定產生mab。通過蛋白a-瓊脂糖(sigma-aldrich)色譜法純化分泌的mab並且通過凝膠過濾經由sephadex200(sigma-aldrich)去除聚集物(如sec-hplc所揭示的)。所有製備物均含低內毒素(10mg/ml的mab濃度(圖9a)；ii)人b細胞在體外並不響應於內毒素((bourke等，2003)和圖9b)，但確實顯示在使用chilob7/4的活化中的同種型依賴性差異；iii)提供足以在體內增加對此水平的免疫反應的內毒素將需要至少50mg劑量的mab(為所給予的500倍)(圖9c)。
將流式細胞術和/或spr用於評定ag結合的差異。通過化學還原產生所述fab』來進行mab製備物的非還原性變性毛細管電泳(nrce-sds)(glennie等，1987)。使用蛋白a色譜法去除任何殘留的fc。
細胞分離、活化和增殖
樹突狀細胞：如先前所述地分離人原代朗格漢斯細胞(polak等，2012)。簡言之，在根據helsinkiguidelines由南安普頓和南西漢普郡研究倫理委員會批准並獲得正式書面同意之後從健康個體獲取皮膚樣本。在20h酶促消化(disopase,2iu,gibco,uk)分離出上皮層。在從上皮層遷移48h後收集lc並且通過optipreptm密度梯度(axisshield,norway)富集至>70％cd1a+hladr+細胞。將細胞以5x104個細胞/孔接種到96u-底板中補充有青黴素/鏈黴素(1％,sigma,uk)和fbs(10％,invitrogen,uk)的rpmi1640(gibco,uk)中並且chilob7/4人igg1或人igg2mab或同種型對照刺激18h。通過流式細胞術評定活化標記物cd40、cd86、cd70在cd1a+hladr+(全部為bdbiosciences)lc上的表達。
b細胞：使用磁性陰性選擇試劑盒(miltenyibiotech或stemcelltechnologies)從脾臟(小鼠)或周圍血液單核細胞(pbmc，人)中純化b細胞。從血液錐體細胞中分離人pbmc(淋巴細胞分離劑，axis-shield)，所述血液錐體細胞通過國家血液中心(southamptongeneralhospital)從不具名健康供體中獲得。將細胞以1x105個細胞/孔接種到具有不同濃度的mab的96-孔圓底盤中，如對於個別實驗所述的。在一些情況下，根據製造商說明書用人fcγrbeckmanpa800加上分析儀轉染1x105個293f細胞。為了產生傾向形式的h2，在40℃下在含有6mm半胱氨酸加上具有(對於h2a)或不具有(對於h2b)2m鹽酸胍的1mm半胱氨酸的0.2mtrisph8.0中將mab透析4天，然後在pbs中透析，隨後使用。使用胃蛋白酶消化來製備(fab』)2片段，接種使其化學減小成所述的fab』(glennie等，1987)。使用蛋白a色譜法去除任何殘留的fc。
細胞分離、活化和增殖
樹突狀細胞：如先前所述地分離人原代朗格漢斯細胞(polak等，2012)。簡言之，在根據helsinkiguidelines由南安普頓和南西漢普郡研究倫理委員會批准並獲得正式書面同意之後從健康個體獲取皮膚樣本。在20h酶促消化(disopase,2iu,gibco,uk)分離出上皮層。在從上皮層遷移48h後收集lc並且通過optipreptm密度梯度(axisshield,norway)富集至>70％cd1a+hladr+細胞。將細胞以5x104個細胞/孔接種到96u-底板中補充有青黴素/鏈黴素(1％,sigma,uk)和fbs(10％,invitrogen,uk)的rpmi1640(gibco,uk)中並且chilob7/4人igg1或人igg2mab或同種型對照刺激18h。通過流式細胞術評定活化標記物cd40、cd86、cd70在cd1a+hladr+(全部為bdbiosciences)lc上的表達。
b細胞：使用磁性陰性選擇試劑盒(miltenyibiotech或stemcelltechnologies)從脾臟(小鼠)或周圍血液單核細胞(pbmc，人)中純化b細胞。從血液錐體細胞中分離人pbmc(淋巴細胞分離劑，axis-shield)，所述血液錐體細胞通過國家血液中心(southamptongeneralhospital)從不具名健康供體中獲得。將細胞以1x105個細胞/孔接種到具有不同濃度的mab的96-孔圓底盤中，如對於個別實驗所述的。在一些情況下，還加入用人fcγr轉染的1x105個293f細胞(white等，2011)。為了評定活化，在孵育過夜後對細胞進行拍照(具有cc12軟成像系統的olympusckx41顯微鏡)並且通過流式細胞術(facscalibur,bdbiosciences)分析活化標記物表達。在培養5天(小鼠)或8天(人)之後通過[甲基-3h]胸苷(perkinelmer,cambridge,uk)結合評定增殖，如(white等，2011)所述的。
t細胞：用2mmcfse標記人pbmc並且接著在如(romer等，2011)所述的24孔板磚以高密度預培養2天，其中每孔1.5ml細胞，個/ml。洗滌預培養的細胞並且以1x106個/ml重新懸浮以用於測定。對於一些實驗，使用總t細胞分離試劑盒(miltenyibiotec)從預培養的pbmc中分離出t細胞。對於抗-h4-1bbmab，將96孔圓底板的孔用pbs中的0.02mg/mlokt3塗覆4h，接著洗滌兩次並將105個pbmc/孔用5？pbmc/孔孵育5或4h。通過流式細胞術分析cfse稀釋液來評定cd4+細胞的增殖。對於抗-cd28mab，在未塗覆孔中用mab孵育105個分離的t細胞並且如上所述地評定增殖。結果表示為分裂細胞百分比。
對於ebv-肽特異性cd8+人t淋巴細胞的活化；從hla-a2個體中擴增對ebv(glctlvaml；cambridgepeptides,uk)的bmlf-1表型有特異的hla-a2限制性t細胞，如(polak等，2012)所述的。將人原代朗格漢斯細胞(lc)用含有bmlf-1(proglc：fnnftvsfwlrvpkvsashleglctlvaml，10μm)的延長肽孵育6h並且用100ng/ml的chilob7/4h1或h2mab或同種型對照刺激18h。按照製造商方案在elispot測定中將脈衝和洗滌的lc(1x104個細胞)與bmlf-1-特異性t細胞(5x104個細胞)共培養20小時，以產生ifn-γ(mabtech,sweden)。用elispot3.5讀取器列舉斑點形成單位(sfu)。
表面等離子體共振。
使用biacoret100(gehealthcare)比較可溶性fcγ受體與chilob7/4mab同種型之間相對的相互作用。通過標準胺偶聯根據製造商說明書將抗體或作為參考的bsa以15,000ru固定至cm5傳感器晶片(biacore)中。由於存在fc，所以排除使用同種型對照mab塗覆參考流動細胞。在25℃下將可溶性fcγr(r和d系統，abingdon,uk)以hbs-ep+運行緩衝液(biacore)中的100nm注射通過流動細胞中，流速為30μl/min。用ph210mm甘氨酸再生30秒。通過使用100nm的陽性(hcd40-fc)和陰性(hox40-fc)對照融合蛋白(r和d系統)檢查塗覆到流動細胞上的mab的完整性(圖11c)。自動減去參考流動細胞的背景反應；忽略所有fcγr與參考細胞的結合(圖11d並且數據未示出)。通過以下各項中的至少一種來驗證純化fcγr蛋白各自的完整性：igg同種型的預期結合曲線((white等，2011，white等，2011)和此研究)；使用已知增強fcγr相互作用的突變fc增加與mab的結合(未示出)；通過固定抗-fc？相互作用進行的結合(未示出)；分類fcγr(未示出以及圖11e)。用於比較不同抗-cd40mab與固定化hcd40之間的相互作用的條件如下：用於比較fab』結合的條件，hcd40-fc(r和d系統)在ph5在如1000ru下如上所述地固定並且fab』片段以640、128、25.6、5.12和1.024nm經過(圖11e)；用於比較igg結合的條件，hcd40-fc在8000ru下固定並且igg以100、20、4、0.8和0.16nm經過(圖11f)。用ph1.510mm甘氨酸再生30秒。使用擬合1:1結合模型的biacore評價軟體測定chilob7/4h1和h2fab』片段對cd40的親和力。
實施例8
此實施例涉及在圖8(a)-圖8(h)中的實驗。這些實驗顯示不同人同種型對抗-cd40活性的作用。(a)在16h後通過同型粘附(頂部)和3h胸苷摻入評定人b細胞響應於指定同種型的chilob7/4(1μg/ml)的活化。各點代表來自每種同種型的2-5個實驗的個別樣品。(b)人朗格漢斯細胞未處理(黑色線)或用chilob7/4h1、h2或同種型對照(c)孵育(灰線)18h並且通過流式細胞術分析cd70表達；示出2個實驗中的1個。(c)與(b)中一樣通過用chilob7/4活化的hla-匹配的人朗格漢斯細胞進行的bmlf-1-特異性cd8+t-細胞活化的ifn-γelispot測定。代表一式三份的2個實驗的數據歸一化成未脈衝細胞的活化。(d)與(a)中一樣分析chilob7/4h1和h2對hcd40tgb細胞的活化。各點為來自以一式三份進行的3個實驗的個別樣品。(e)用具有或不具有(對照)100μg指定的chilob7/4mab的100μgova免疫hcd40tg小鼠。在第8天列舉循環的內源性ova-特異性cd8+t細胞，在第14天測定反應(左圖)和抗-ovaab(右圖)的峰值。示出來自4個實驗中的2個的個別動物。(f)用不具有(對照)或具有100μg指定3/23mab的無內毒素ova免疫用oti細胞過繼轉移的小鼠(n＝3)。在反應峰值(第5天；左圖)和在第14天的抗-ovaab(右圖)處列舉循環oti細胞。合併來自>5個實驗中的2個的數據。(g)將c57bi/6小鼠(n＝5)用oti細胞過繼轉移，用ova加上100μg指定3/23同種型免疫並且在5天後用eg7腫瘤皮下攻擊。示出來自2個實驗中的1個的存活曲線。(h)將balb/c小鼠(n＝5)用bcl1腫瘤細胞靜脈內攻擊並且在14天後(當腫瘤代表5％-10％脾重量時(white,2014))靜脈內給予100μg指定的3/23h1、h2或pbs(對照)。示出來自2個實驗中的1個的存活曲線。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
實施例9
此實施例涉及在圖9(a)-圖9(g)中作為驗證在圖8的實驗中同種型對抗-cd40活性的作用的對照實驗的實驗。用於同種型對抗-cd40活性的作用的對照實驗。(a-c)內毒素汙染並不能解釋抗-cd40活性。(a)在400ng/ml3/23m2a存在或不存在下將fcγriib-/-小鼠b細胞用逐漸增加濃度的lps孵育。通過3h胸苷摻入(平均值+/-sem三次重複)評定增殖。(b)在指示的1mg/mlchilob7/4h1和/或fcγriib過度表達交聯細胞存在或不存在下用1mg/mllps孵育16h後通過cd23上調(與對照的灰色相比的黑線)評定的人b細胞活化。(c)將小鼠用100mg無內毒素ova加上指定劑量的lps免疫。在第14天測定循環抗-ovaab滴度。(d)人chilob7/4同種型類似地結合cd40。用與不同濃度的不同人同種型的競爭性未標記chilobmab預先混合的10mg/mlchilob7/4h1-fitc孵育純化的hcd40tg小鼠b細胞。使用流式細胞術測定chilob7/4-fitc結合水平並將其表示為mfi最大值％(無競爭性mab存在)。將非靶向人igg4同種型mab(灰色三角形)作為非競爭性對照包括在內。(e)chilob7/4h1和h2fab』片段對hcd40具有類似親和力。將hcd40以1000ru固定並且將chilob7/4h1(實線)或h2(虛線)fab』片段以640、128、25.6和1.024nm流過晶片。通過擬合1:1結合模型計算親和力並且所述親和力分別為10.0和10.2nmh1和h2。(f)人和小鼠cd40mab的同種型對照。將純化的wt(mcd40+/+)或hcd40tg/mcd40ko(mcd40-/-,hcd40+/-)小鼠b細胞用1mg/ml的指定mab孵育16h。通過同型粘附(頂部圖)和cd23上調(底部圖)評定b細胞活化：填充灰色直方圖，未處理細胞；黑線，用僅mab處理；藍線，用mab+fcγriib過度表達交聯細胞孵育。(g)cd70在小鼠脾dc上的同種型特異性上調。對施用100mg指定3/23同種型的小鼠的脾切片進行cd70(綠色，左圖)和dc標記物midc8(紅色，中間圖；在右圖中合併)染色。條＝100mm。示出來自2個實驗中的1個的結果。
實施例10
此實施例涉及在圖10(a)-圖10(e)中其結果顯示人igg2的fcγr-獨立性活性的實驗。(a)chilob7/4h1或h2+/-或50-倍過量阻斷性抗-fcγrii(at10)f(ab』)2和/或指定的hfcγriib過度表達293f細胞(+/-fcγrii)對人b細胞的活化。將cd23表達(黑線)與未刺激細胞(灰色直方圖)進行比較。(b)通過1mg/ml的chilob7/4h1和h2完整igg、f(ab』)2或fab』對人b細胞活化(同型粘附和cd23上調，頂部圖)和增殖(底部圖)16h。示出來自4個實驗中的1個的重複兩次樣品的平均值和範圍。(c)通過3h胸苷摻入法測定使用具有不同濃度的指定chilob7/4同種型的fcγriib對hcd40tgb細胞wt或ko的增殖(4個實驗中的1個的重複兩次的平均值和範圍)。(d)作為fcγrwt、fcγriibko或常見g鏈ko(未活化fcγr)接受oti細胞接著接受ova加上指定chilob7/4mab的hcd40tg小鼠(n＝3-5)。在第5天列舉循環oti細胞。合併來自2個實驗的結果。(e)hcd40tg/fcγriibko小鼠接受oti細胞，然後在d0時用單獨的ova(對照)或用200mgchilob7/4h1或h2fab』2靜脈內免疫，接著在第1天和第2天用100mgfab』2免疫。示出在d5時的循環oti細胞。當靜脈內給予小鼠單次100mg劑量的h2fab』2時獲得類似結果(未示出)。***p<0.001，*p<0.05。
實施例11
此實施例涉及在圖11(a)-圖11(f)中證實chilob7/4h2激動活性為fcγr獨立性的實驗。(a和b)示出100nm指定人(a)和小鼠(b)fcγr與以15,000ru固定的chilob7/4h1或h2的spr曲線。所有曲線均相同標度(y軸至2500ru)呈現以允許比較相對結合。fcγriia的插圖顯示用200ru的y軸標度繪圖以顯示低水平結合的相同數據。(c)為了驗證結合mab的完整性，測定100nmhcd40蛋白(實線)或hox40蛋白(虛線)與在a和b中使用的流動細胞上固定的h1和h2mab的結合。(d)hfcγri和iib與固定bsa的背景結合。對於所有fcγr獲得類似結果。此背景從a和b中的曲線中減去。(e)為了證實hfcγriib的完整性，固定抗-fcγriib特異性mab(kb61)並比較hfcγri和iib的結合。(f)將純化的hcd40tg小鼠b細胞用單獨的1mg/mlchilob7/4h2igg(左圖，黑條)或在50-倍過量的指定chilob7/4igg片段存在下孵育16小時。在20小時後通過流式細胞術分析cd23表達(頂部圖；灰色直方圖為未處理細胞，黑線為mab處理的細胞)並且在5天後通過3h胸苷摻入分析b細胞增殖(底部圖，重複兩次樣品的平均值和範圍)。示出來自2個實驗中的1個的結果。
實施例12
此實施例涉及在圖12(a)-圖12(e)中示出人igg2針對多種受體靶標的拮抗作用的實驗。(a)如圖8a中一樣評定使用sgn40-sotonh1或h2對人b細胞的活化，示出5個實驗中的1個(兩次重複樣品的平均值和範圍)。(b)響應於sgn40h1和h2或親本sc26m1hcd40的tgb-細胞增殖(wt或fcγriibko)(兩次重複的平均值和範圍，3個實驗中的1個)。(c)hcd40tg/fcγriibko小鼠(n＝5)接受oti細胞並且然後用單獨的ova(對照)或用100mgsgn40-sotonh1或h2免疫。在d5列舉循環oti細胞，***p<0.001，示出2個實驗中的1個。(d和e)在總pbmc(c)或純化的t細胞(d)培養物中人cd4t細胞響應於嵌合h1、h2或h4抗-h4-1bb或hcd28的活化和增殖。各點表示個別供體。
實施例13
此實施例涉及在圖13中示出ch1和鉸鏈區賦予chilob7/4h2活性的實驗。(a)chilob7/4h1和h2(左圖)和突變體(頂部圖)的示意圖，其中h1和h2的ch1((i)ch11/2和(ii)ch12/1)或ch1和鉸鏈區((iii)ch1hge1/2和(iv)ch1hge2/1)得以交換。中間圖：在表達fcγriib的交聯細胞不存在或存在下在人b細胞上的cd23表達，並且底部圖：響應於嵌合mab的hcd40tgfcγriibwt或kob-細胞增殖(兩次重複的平均值和範圍)。(b)如圖10e中測定的用指定mab處理的hcd40tg小鼠(n＝3)中的oti反應。合併來自2個實驗的數據，****p5個實驗中的1個的重複兩次的平均值和範圍。(h和i)在用ova加上100mgchilob7/4c233s(h2a)或傾向的h2b免疫的hcd40tgfcγriibko小鼠(n＝5)中的ova-特異性oticd8t-細胞反應(h)和第18天的血清ab反應(i)。示出來自2個實驗中的1個的結果。**p<0.01，***p<0.001。
實施例16
此實施例涉及在圖16(a)–圖16(g)中進一步驗證chilob7/4h2a和h2b形式的不同活性的實驗。(a)在用200ng/ml天然、『a』或『b』傾向形式的chilob7/4h2孵育16h之後通過同型粘附評定的純化的人b細胞的活化(頂部圖)和cd23上調(底部圖)。(b)用指定濃度的chilob7/4h2、ch1hge2/1突變體或傾向形式的突變體孵育純化的hcd40tgb細胞並且如圖15a中所示地測量增殖(重複兩次樣品的平均值和範圍)。(c)響應於逐漸增加濃度的h2b傾向的chilob7/4h2igg或fab』2h的cd40tg小鼠b細胞增殖，如b中所測量的。(d)來自用1mg/mlchilob7/4h2a和h2b處理指定時間並用對phosph-ikka/b、磷ikb-a或ikb-a有特異的ab探測的ramos細胞的裂解物的蛋白質印跡。使用抗微管蛋白作為負載對照。(e)用與不同濃度的指定未標記突變體預先混合的chilob7/4h1-fitc孵育純化的hcd40tg小鼠b細胞並如圖13d所示地進行分析。(f)和(g)用oti細胞過繼轉移的hcd40tgfcγriibko小鼠用100mgova加上100mg傾向的突變體免疫，如圖12中一樣。隨著時間列舉循環oti細胞(每組5隻動物的平均值+/-sd)(d)和在第18天測量的血清中的抗-ova抗體(e)。示出來2個類似實驗中的一個的結果。*p<0.05，***p<0.001。
結論
最新臨床結果表明免疫刺激性mab’s可適用作治療劑，例如用於治療癌症(hodi等，(2010)；wolchok等，(2013)；topalian等，(2012)；brahmer等，(2012))和感染性疾病。然而，可用於體內治療的mab和融合蛋白的鑑別需要清楚地理解精確的作用機制。現在，大量數據表明同種型選擇是決定性的，因為它指示在ag結合之後介導事件的不同fcγr相互作用(nimmerjahn等，(2012)；white等，(2013))。已提出將mabfc的操縱作為一種通過使fc與fcγriib交聯來增強選定的相互作用並增加治療功效的方式(white等，(2013)；li和ravetch)(2012)；li和ravetch)(2013))。在本文中的數據反而提出同種型依賴性但fcγr-獨立性機制也可為活性的重要決定因素。
已證實fcγr接合的作用用於許多抗癌mab中。在抗-cd40的情況下，通過對mab交聯的需要，我們和其他人均已證實與fcγriib的結合為臨床前模型中的活性所必需的(white等，(2011)；li和ravetch(2011))。當開發用於人使用的藥劑時這具有一個挑戰，因為沒有人igg同種型能以足夠高的親和力結合fcγriib以介導此功能。對於fcγriib接合的需要也可能是有限的，因為此受體可能並不總是與mab靶標抗原共定位。在h2同種型的mab具有fcγr-獨立性激動活性的此報導中的說明因此是重要的，因為它提供了開發無論靶細胞位置在何處均具有激動性的藥劑的機會。
h2mab的激動活性並不需要外源性交聯的觀察為獨特且意外的。人igg2同種型的異常之處在於其在合成之後能重新排列其鉸鏈和ch1結構域內的二硫鍵的能力，從而產生具有不同構象的亞型(martinez等，(2008)；dillon等，(2008)；allen等，(2009))。據信igg2被合成為具有經典的柔性igg結合(其『a』形式)，所述結構含有4個hc間鉸鏈二硫鍵。隨著時間這通過一系列中間體轉化成更剛性且緊密的『b』形式，其中lc和hcch1被二硫鍵合至hc鉸鏈半胱氨酸232和233(martinez等，(2008)；dillon等，(2008)；allen等，(2009))。使用一系列遺傳工程化的mab，證實lob7.4h2的激動活性依賴於其改組鉸鏈中的二硫鍵的能力。此外，特定半胱氨酸或半胱氨酸殘基的組合的突變可將它鎖定成拮抗和激動構象。
先前的研究員報導了二硫鍵改組對h2活性的有限影響，其中b亞型傾向於具有更低的親和力和減小的功效。然而，在這些情況下，測量在抗原結合或阻斷受體-配體相互作用的能力方面的活性，dillon等，(2008)。發現通過激動和拮抗形式的lob7.4h2進行的cd40結合沒有差異。據推測，更剛性且緊密形式h2(與h2b類似)可與膜中的cd40形成緻密的組織性複合物，從而允許traf募集和下遊細胞內信號傳導，而不是交聯。更柔性形式h2如h2a抑制功能的能力可影響破壞這些複合物的能力，並且可解釋當天然h2活性或h2a和h2b形式的混合物活性在廣泛濃度範圍測量時觀察到的特徵性鐘形曲線。潛在地不同形式的lob7.4h2將結晶化來測定器精確構象並闡明其作用機制。h2恆定區還賦予另一種抗-hcd40mabsgn40以及針對在t細胞上表達的共刺激分子的mab(4-1bb和cd28)fcγr-獨立性活性的觀察表明這可能是此同種型的一般特性。
我們和其他人均發現激動性抗-cd40至少在鼠類模型中需要與fcγriib結合(li和ravetch,2011；white等，2011)，當開發用於人使用的藥劑時具有一個挑戰，因為人igg以非常低的親和力結合fcγriib，特別是作為單體(bruhns等，2009)。儘管fc工程化可增強fcγriib相互作用並提高活性(li和ravetch,2012；li和ravetch,2013；white等，2013)，但是此方法受限於以下事實，fcγriib並不一直可用於腫瘤微環境內的交聯並且當fcγriib接合在內皮細胞上時還可導致不良事件(xu等，2003)。在h2同種型的mab具有fcγr-獨立性激動活性的此報導中的說明因此是重要的，因為它提供了開發無論靶細胞位置在何處均具有激動性的藥劑的機會。人igg2同種型的獨特之處在於其在合成之後能重新排列其鉸鏈和ch1結構域內的二硫鍵的能力，從而產生一系列具有不同構象的亞型(allen等，2009；dillon等，2008；martinez等，2008；wypych等，2008)。據信它被合成為具有經典的柔性igg結合(其『a』形式)，所述結構含有4個hc間鉸鏈二硫鍵。隨著時間這通過一系列中間體轉化成更緊密的『b』形式，其中lc和hcch1被二硫鍵合至hc鉸鏈半胱氨酸232和233(allen等，2009；dillon等，2008；liu等，2008；martinez等，2008；wypych等，2008)。使用化學傾向方法和一系列遺傳工程化mab，證實chilob7/4h2的激動活性依賴於其形成h2b形式的能力。此外，特定半胱氨酸或其組合的突變可將其鎖定成具有不同程度的激動活性的構象。
注意，所選定輕鏈似乎影響了h2形成不同構象的能力，其中κ輕鏈而非λ輕鏈允許二硫鍵改組(dillon等，2008)。與此一致的時，研究中所用的所有mab均包含κ輕鏈。另外感興趣的是，已描述了二硫鍵連接的h2二聚體在人血液中的存在(yoo等，2003)。然而，也如其他人使用重組mab所報導的(martinez等，2008)，發現二聚體不存在於任何mab製備物質，如通過nrce-sds所揭示的。
先前研究h2a和h2b亞型的功能影響的嘗試未揭示fcγr或c1q接合(lightle等，2010)中的差異或者ag結合或阻斷受體-配體相互作用的能力中的一致差異，其中如果存在的話則h2b的活性較小(dillon等，2008；guo等，2008；martinez等，2008)。類似地，當通過spr或通過流式細胞術測量時在chilob7/4h2a和h2b形式對cd40的親合力中未觀察到任何差異。與非常類似的chilob7/4h1和h2fab對cd40的親和力組合，似乎很不可能的時親和力的變化可解釋h2a和h2b非常不同的特性。令人感興趣的時，liu等(liu等，2008)也說明了在患者中在數天內從a形式天然轉化成b形式並不是由半衰期的變化所引起的。在本文中評定了接合免疫共受體的mab的激動活性，其中已知受體成簇為啟動下遊免疫活化的強制性需要(elgueta等，2009)。發現可實現此類交聯而無fcγr接合的抗體形式既未預期也未解釋，因為截至目前所述的幾乎所有激動性mab對於活性需要fcγr交聯(bartholomaeus等，2014)，所述激動性mab包括在2006年在健康志願者中引起嚴重毒性的抗-cd28超激動劑tgn1412(suntharalingam等，2006)。據推測h2b的激動特性有其不常見的緊密構象引起，其中fab』臂向下靠近抗體的fc區旋轉。這可允許關閉在膜平面上接合的相鄰受體的『包裝』。在h2b中缺乏柔性也可使受體處於更剛性晶格中，以促進有效的下遊信號傳導。此方面的延伸可為h2b不同於h2a，可在預先存在的簇內穩定受體(smulski等，2013)，而柔性h2a可引起這些簇解離。由於h2響應於細菌多糖產生的主要同種型(barrett和ayoub,1986)，所以形成h2b的能力可為由接合這些重複性緊密包裝的表位的需要驅動的進化反應。
當使用抗-cd40h2a和h2b的混合物刺激b細胞從而在較高濃度下可見活性減小時在此研究中觀察到的特徵性鐘形曲線(例如圖10d)可反映更柔性h2a形式戰勝結構受限更大的h2b形式而交聯的能力。這可能是因為柔性h2a更有效地結合靶分子，而所述分子在流體血漿膜中繼續移動。進一步研究可測定不同形式的h2的更精確構型，從而可更多地解釋其精確作用模式。h2恆定區還賦予另一種抗-hcd40mabsgn40以及針對其他受體(4-1bb和cd28)的mabfcγr-獨立性活性的觀察表明這可能是此受限構象的一般特性。
在hcd40tg小鼠中的體內實驗清楚地證明了chilob7/4當作為嵌合m1對比h2mab施用時的不同作用機制。在兩種情況下均觀察到免疫刺激，然而，m1的活性依賴於fcγriib表達，而h2的活性完全獨立於fcγr相互作用。這增加了通過工程化試劑以同時接合兩種機制路徑來進一步增強活性的可能性；例如，含有se/lf突變以增加fcγriib親和力的嵌合ch1hge2/1(chu等，2008)。這是正在進行的研究的主題。另外，儘管在研究中h2活性為fcγr-獨立性的，但是重要的是確定其活性是否在體內受到人fcγr的存在的影響，所述人fcγr可以足夠親和力結合細胞表面上固定的h2以允許交聯，特別是在表達fcγriia-131h或fcγriiia-158v的患者中(lux等，2013)。
重要的是，目前為止臨床試驗中激動性最大的抗-cd40mab為是h2的cp870,893，與二者均為h1的激動性較小的chilob7/4和sgn40不同。cp870,893的最大耐受劑量比chilob7/4或sgn40的最大耐受劑量低10倍(vonderheide和glennie2013)，並且在胰腺癌和轉移性黑色素瘤患者中使用此藥劑產生有希望的臨床數據(bajor等，2014；beatty等，2013)。如在目前的研究中，richman和vonderheide最近證實cp870,893的體外激動活性均為fc和fcγr獨立性的(richman和vonderheide,2014)。這是重要的，因為它表明fcγr-獨立性路徑可遞送臨床環境中的結果並且目前的發現結果可能在一定程度上解釋了cp870,893的不常見功效。
所提供的數據深入參與了基於激動性mab的治療劑的開發。基於這些觀點，使得操縱h2的二硫鍵構型以控制mab針對一系列免疫受體的活性和毒性從而允許微調生物功能並隨後開發獨立於fcγr相互作用的新穎治療劑成為可能。
刺激抗癌免疫性的單克隆抗體(mab)在一個亞類患有傳統末端惡性腫瘤的患者中提供了治癒性治療。然而，實現這些藥劑的全部潛能將需要由其作用機制的詳細理解所提供的精確工程化。在此證實人igg2(h2)恆定區提供了在臨床開發中靶向三種免疫刺激共受體cd40、4-1bb和cd28(其激動活性獨立於-1bb)以及cd28(其激動活性為受體成簇和下遊細胞內信號傳導所需要的)的mab。此異常活性由h2鉸鏈內的獨特二硫鍵構型所賦予並且為工程化無論局部微環境內的fcγr表達如何均具有限定活性的改進臨床藥劑鋪平道路。
總之，在本文中證實了免疫刺激性mab當表達為h2時具有fcγr-獨立性激動活性，所述激動活性依賴於h2改組其鉸鏈區內的二硫鍵的獨特能力。因此使用h2可允許開發其功能並不依賴於fcγr的、具有長血清半衰期的且其活性獨立於細胞類型或解剖學位置的固有活性治療劑。所述數據還說明通過本文所述的二硫鍵修飾操縱h2mab產生可分別用於刺激或抑制免疫反應的激動劑或拮抗劑，例如igg2抗體或igg2融合蛋白，例如由b7/cd28或tnf/tnfr家族成員引起的那些。這些激動劑和拮抗劑將應用於治療許多疾病，例如癌症、自身免疫、感染性疾病、過敏以及炎性病狀。
治療性應用
本發明的激動和拮抗抗體可用於治療任何病狀，其中激動或拮抗特異性受體或配體的作用將為臨床上相關的。例如，這些抗體和融合蛋白可適用於治療自身免疫性病症，諸如獲得性脾臟萎縮、急性前葡萄膜炎、急性播散性腦脊髓炎(adem)、急性痛風性關節炎、急性壞死性出血性白質腦炎、急性鼻竇炎、慢性鼻竇炎、急性化膿性腦膜炎、其他中樞神經系統炎性病症、急性重度炎症、阿狄森病、腎上腺炎、成人發作型糖尿病(ii型糖尿病)、成人發作型特發性甲狀旁腺功能減退(aoih)、丙種球蛋白缺乏症、粒細胞缺乏症、脈管炎(包括血管炎、大血管血管炎、風溼性多肌痛和巨細胞(takayasu氏)動脈炎)、過敏性病狀、過敏性接觸性皮炎、過敏性皮炎、過敏性肉芽腫性血管炎、過敏性超敏反應病症、過敏性神經炎、過敏性反應、斑禿、全禿、阿爾波特氏症候群、牙槽炎(過敏性牙槽炎、纖維性肺泡炎、阿爾茲海默病、澱粉樣變性、肌萎縮性脊髓側索硬化症(als；lougehrig氏病)、嗜酸性粒細胞相關性病症、嗜酸性粒細胞增多症、全身性過敏反應、強直性脊柱炎、血管擴張、抗體介導性腎炎、抗-gbm/抗-tbm腎炎、抗原-抗體複合物介導性疾病、抗腎小球基底膜病、抗磷脂抗體症候群、抗磷脂症候群(aps)、口瘡、口瘡性口炎、再生障礙性貧血、心律失常、動脈硬化、動脈硬化性病症、關節炎、類風溼性關節炎、任選地急性關節炎、慢性類風溼性關節炎、慢性進行性關節炎、變形性關節炎、蛔蟲病、麴黴腫、含嗜酸細胞性肉芽腫、麴黴病、aspermiogenese、哮喘、支氣管哮喘(asthmabronchiale)、支氣管性氣喘(bronchialasthma)和自身免疫哮喘、共濟失調毛細血管擴張、共濟失調性硬化、動脈粥樣硬化、孤獨症、自身免疫性血管性水腫、自身免疫性再生障礙性貧血、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性糖尿病、睪丸和卵巢的自身免疫性疾病(包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎)、與膠原病相關的自身免疫性病症、自身免疫性神經異常、自身免疫性耳病、自身免疫性內耳病(aged)、自身免疫性內分泌疾病(包括甲狀腺炎)、自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫性腸病症候群、自身免疫性性腺衰竭、自身免疫性聽力喪失、自身免疫性溶血、自身免疫性肝炎、自身免疫性造血系統疾病、自身免疫性高脂血、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性內耳疾病(aied)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性中性粒細胞減少、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多內分泌腺疾病、自身免疫性多腺症候群i型、自身免疫性視網膜病變、自身免疫性血小板減少性紫癜(atp)、自身免疫性甲狀腺疾病、自身免疫性蕁麻疹、自身免疫介導的胃腸道疾病、軸突和神經元神經病變、巴婁病、貝切特氏病、良性家族性和缺血再灌注損傷、良性淋巴性血管炎、貝格爾氏病、iga腎病、養鳥人肺、失明症、伯克氏病、閉塞性細支氣管炎、支氣管炎、支氣管肺炎麴黴病、布魯頓症候群、大皰性類天皰瘡、卡普蘭氏症候群、心肌症、心血管缺血、castleman氏症候群、脂瀉病、口炎性腹瀉(麩質性腸病)、小腦變性、腦缺血和伴隨血管形成的疾病、查加斯病、通道病、癲癇症、cns的通道病、脈絡膜視網膜炎、脈絡膜炎、自身免疫性造血系統疾病、慢性活動性肝炎、自身免疫性慢性活動性肝炎、慢性接觸性皮炎、慢性嗜酸粒細胞性肺炎、慢性疲勞症候群、慢性肝炎、慢性超敏性肺炎、慢性炎症性關節炎、慢性發炎去髓鞘多發性神經病變(cidp)、慢性頑固性炎症、慢性皮膚黏膜念珠菌病、慢性神經病、igm多發性神經病變、igm-介導性神經病、慢性阻塞性氣道疾病、慢性肺部炎症性疾病、慢性復發性多病灶性骨髓炎(crmo)、慢性甲狀腺炎(橋本氏甲狀腺炎)亞急性甲狀腺炎、churg-strauss症候群、瘢痕性類天皰瘡/良性黏膜類天皰瘡、cns炎性病症、cns血管炎、乳糜瀉、寇甘氏症候群、冷凝集素病、息肉狀結腸炎、結腸炎(任選地潰瘍性結腸炎、潰瘍性結腸炎、膠原性結腸炎)、涉及t細胞浸潤的病狀和慢性炎性反應、先天性心臟傳導阻滯、先天性風疹感染、coombs陽性貧血、冠狀動脈性心臟病、柯薩奇病毒性心肌炎、crest症候群(鈣質沉著，雷諾氏現象)、克羅恩氏病、冷球蛋白血症、柯興氏症候群、睫狀體炎、慢性睫狀體炎、異時性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎、fuch氏睫狀體炎、囊胞性纖維症、細胞因子誘導的毒性、耳聾、退化性關節炎、脫髓鞘病、自身免疫性脫髓鞘病、脫髓鞘性神經病、登革熱、皰疹樣皮炎和異位性皮炎、皮炎(包括接觸性皮炎)、皮肌炎、具有急性炎性組分的皮膚病、德維克氏病(視神經脊髓炎)、糖尿病大動脈疾病、糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變、戴-布二氏貧血、瀰漫性肺間質纖維化、擴張型心肌病、盤狀紅斑狼瘡、涉及白細胞滲出的疾病、德雷斯勒氏症候群、杜普伊特倫氏攣縮、埃可病毒感染、溼疹(包括過敏性溼疹、特應性溼疹)、腦炎、任選地拉斯穆森腦炎和邊緣性和/或腦幹性腦炎、腦脊髓炎、變態反應性腦脊髓炎、過敏性脊髓炎和實驗性過敏性腦脊髓(eae)、動脈內增生、心內膜炎、內分泌性眼病、子宮內膜異位、心內膜心肌纖維化、晶狀體蛋白過敏性內眼炎(endophthalmiaphacoanaphylactica)、內眼炎、過敏性腸炎、嗜酸性粒細胞增多-肌痛症候群、嗜酸性筋膜炎、流行性角膜結膜炎、後天性大皰性表皮鬆解症(eba)、鞏膜外層、鞏膜外層炎、埃-巴二氏病毒感染、持久隆起性紅斑(erythemaelevatumetdiutinum)、多形性紅斑、麻風結節性紅斑、結節性紅斑、胎兒成紅細胞增多病、食管運動功能障礙、原發性混合型冷球蛋白血症、篩骨、埃文斯症候群、實驗性變應性腦脊髓炎(eae)、因子viii缺乏症、農民肺、風溼性發熱、費爾提氏症候群、纖維肌痛、纖維性肺泡炎、絲蟲病、局灶性節段性腎小球硬化(fsgs)、食品中毒、額骨(frontal)、胃萎縮、巨細胞動脈炎(顳關節炎)、巨細胞肝炎、巨細胞多肌痛、腎小球性腎炎、伴隨或未伴隨腎病症候群的腎小球性腎炎(gn)、慢性腎小球腎炎、急性腎小球腎炎(任選地原發性gn)、古德帕斯徹氏症候群、痛風性關節炎、粒細胞輸血相關性症候群、肉芽腫病(包括淋巴瘤樣肉芽腫病、肉芽腫病伴隨多血管炎(gpa)、肉芽腫性葡萄膜炎)、格雷夫斯病(grave'sdisease)、格-巴二氏症候群(guillain-barresyndrome)、滴狀銀屑病、陣發性血紅蛋白尿、hamman-rich氏病、hashimoto氏病、hashimoto氏腦炎、橋本氏甲狀腺炎、血色沉著病、溶血性貧血、免疫性溶血性貧血(包括自身免疫性溶血性貧血(aiha)、溶血性貧血、甲型血友病、紫癜、妊娠皰疹、人免疫缺陷型病毒(hiv)感染、痛覺過敏、血丙種球蛋白過少、性腺機能減退、甲狀旁腺功能減退、特發性糖尿病性尿崩症、特發性面神經麻痺、特發性甲狀腺功能減退症、特發性iga腎病、特發性膜性gn、特發性膜性腎病、特發性腎病症候群、特發性肺纖維化、特發性脂肪瀉、特發性血小板減少性紫癜(itp)、iga腎病、ige-介導性疾病(任選地為全身性過敏反應和過敏性和特異性鼻炎)、igg4-相關性硬化病、地域性迴腸炎、免疫複合物性腎炎、與由細胞因子和t-淋巴細胞介導的急性和延遲性超敏反應相關的免疫反應、免疫介導的gn、免疫調節性脂蛋白(包括成人呼吸窘迫綜合症、急性呼吸道窘迫綜合症(ards)、包涵體肌炎)、感染性關節炎、由於抗精子抗體引起的不育、所有或部分眼葡萄膜的炎症、炎性腸病(ibd)、炎性增生性皮膚病、炎性肌病、胰島素依賴型糖尿病(1型)、胰島炎、間質性膀胱炎、間質性肺病、肺間質纖維化、虹膜炎、缺血性再灌注病症、關節炎症、幼年型關節炎、青少年型皮肌炎、青少年糖尿病、青少年發作型(i型)糖尿病(包括兒童胰島素依賴型糖尿病(iddm))、青少年發作型類風溼性關節炎、川崎症候群(kawasakisyndrome)、燥性角膜結膜炎、錐蟲病(kypanosomiasis)、朗-伊二氏症候群(lambert-eatonsyndrome)、利什曼病、麻風病、白細胞減少症、白細胞粘附缺陷、白細胞分裂性脈管炎、白血球減少、扁平苔蘚、萎縮性硬化性苔蘚、木樣結膜炎、線性iga皮膚病、線性iga病(lad)、呂弗勒氏症候群(loffler'ssyndrome)、狼瘡狀肝炎、狼瘡、腎炎、腦炎、兒童的非腎性腎外盤狀脫髮性狼瘡(sle)、播散性紅斑狼瘡、萊姆關節炎(lymearthritis)、拉姆病(lymedisease)、淋巴細胞性間質性肺炎、瘧疾、男性和女性自身免疫性不孕症、上頜骨(maxillary)、中型血管炎、川畸氏病(kawasaki'sdisease)、結節性多動脈炎、膜增生性gn(mpgn)(包括i型和ii型)、以及快速進行性gn、膜gn(膜性腎病)、梅尼爾氏病(meniere'sdisease)、腦膜炎、微小性結腸炎、顯微鏡型多血管炎、偏頭痛、微小病變性腎病、混合結締組織病(mctd)、傳染性單核細胞增多症、莫倫氏潰瘍、穆-哈二氏病(mucha-habermanndisease)、多灶性運動神經病、多發性內分泌衰竭、多器官損害症候群、敗血症繼發性疾病、創傷、出血、多器官損害症候群、多發性硬化症(ms)、脊髓光學ms、多發性硬化症、腮腺炎、肌肉疾病、重症肌無力、胸腺瘤相關性重症肌無力、重症肌無力、心肌炎、肌炎、猝睡症、壞死性小腸結腸炎、以及透壁性結腸炎和自身免疫性炎性腸病、壞死性皮膚性超敏性血管炎、新生兒狼瘡症候群(nle)、腎病、腎病綜合症、神經系統疾病、視神經脊髓炎(德維克氏(devic's))、視神經脊髓炎、神經性肌強直、嗜中性白血球減少症、非癌性淋巴球增多症、非肉芽腫型葡萄膜炎、非惡性胸腺瘤、眼睛和眼眶炎性病症、眼部疤痕性類天皰瘡、卵巢炎、淋巴性眼炎(ophthalmiasymphatica)、眼陣攣肌陣攣症候群(oms)、斜視眼陣攣、眼陣攣肌陣攣症候群(oms)、以及感覺神經病、視神經炎、肉芽腫性睪丸炎、骨關節炎、復發性風溼病、胰腺炎、全血細胞減少症、pandas(與鏈球菌有關的兒童自身免疫性神經精神異常)、副腫瘤性小腦變性、副腫瘤症候群、副腫瘤症候群(包括神經性伴腫瘤症候群(例如，lambert-eaton肌無力症候群、伊頓-蘭伯特症候群(eaton-lambertsyndrome)、寄生蟲病、利什曼原蟲病、陣發性睡眠性血紅蛋白尿(pnh)、帕-羅二氏症候群(parryrombergsyndrome)、睫狀體扁平部炎(周邊葡萄膜炎)、parsonnage-turner症候群、細小病毒感染、類天皰瘡、大皰性類天皰瘡和皮膚類天皰瘡、天皰瘡、尋常型天皰瘡、紅斑性天皰瘡、落葉型天皰瘡、天皰瘡型黏膜性類天皰瘡、天皰瘡、消化性潰瘍、周期性麻痺、周圍神經病、靜脈周腦脊髓炎、惡性貧血(perniciousanemia)(惡性貧血(anemiaperniciosa))、惡性貧血、晶狀體抗原性葡萄膜炎、肺硬變、poems症候群、結節性多動脈炎、i型、ii型和iii型原發性慢性多發性關節炎、多軟骨炎、頑固性復發性多軟骨炎、多內分泌自身免疫性疾病、多內分泌衰竭、多腺性症候群、自身免疫性多腺性症候群(或多腺性內分泌病變症候群)、風溼性多肌痛、多發性肌炎、多發性肌炎/皮膚肌炎、多發性神經病變、急性多神經根炎、心切開術後症候群、後葡萄膜炎、自身免疫性葡萄膜炎、心肌梗死後症候群、心包切開術後症候群、鏈球菌感染後性腎炎、疫苗接種後症候群、早老性痴呆、原發性膽汁性肝硬化、原發性甲狀腺功能減退、原發性特發性粘液性水腫、原發性淋巴球增多症(包括單克隆b淋巴細胞增多、良性單克隆丙球蛋白病和意義不明的單克隆丙種球蛋白病)、mgus、原發性粘液性水腫、原發性進行性ms(ppms)、以及復發性多發性ms(rrms)、原發性硬化性膽管炎、孕酮性皮炎、進行性全身性硬化、增生性關節炎、銀屑病、斑塊狀銀屑病、銀屑病、銀屑病關節炎、肺泡蛋白沉積症、肺嗜酸粒細胞浸潤症、真性紅細胞性貧血、發育不全症(prca)、真性紅細胞性貧血、化膿性鼻竇炎、非化膿性鼻竇炎、膿皰型銀屑病和指甲性銀屑病、腎盂炎、壞疽性膿皮病、奎爾萬氏甲狀腺炎(quervain'sthyroiditis)、雷諾氏現象、反應性關節炎、習慣性流產、血壓反應減小、反射性交感神經營養不良、頑固性口炎性腹瀉、萊特氏病或症候群、復發性多軟骨炎、心肌或其他組織的再灌注損傷、再灌注損傷、呼吸窘迫症候群、多動腿症候群、視網膜自身免疫病、腹膜後纖維變性、雷諾症候群、風溼性疾病、風溼熱、風溼病、類風溼性關節炎、類風溼性脊椎炎、風疹病毒感染、sampter氏症候群、肉樣瘤病、血吸蟲病、施密特症候群(schmidtsyndrome)、scid和埃-巴二氏病毒相關性疾病、鞏膜、鞏膜炎、指硬皮病(sclerodactyl)、硬皮病、全身性硬皮病、硬化性膽管炎、擴散性硬化、硬化症、全身性硬化症、感覺神經聽力喪失、血清反應陰性脊柱關節病、席漢氏症候群、輸血後紫癜症候群(shulman'ssyndrome)、矽肺、斯耶格倫氏症候群(syndrome)、精子和睪丸自身免疫病、蝶竇炎、斯-約二氏症候群(stevens-johnsonsyndrome)、全身肌強直(僵人)綜合症、亞急性細菌性心內膜炎(sbe)、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、突發性聽力喪失、susac氏症候群、西登哈姆氏舞蹈病(sydenham'schorea)、交感性眼炎、全身性紅斑性狼瘡(sle)、系統性紅斑狼瘡、皮膚sle、系統性壞死性血管炎、以及anca-相關性血管炎、丘-施二氏血管炎症候群(css)、脊髓癆、高安氏動脈炎、毛細管擴張、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、血栓閉塞性脈管炎、血小板減少症(包括血栓性血小板減少性紫癜(ttp)和自身免疫性或免疫介導性血小板減少症)、特發性血小板減少性紫癜(itp)(包括慢性或急性itp)、血小板減少性紫癜(ttp)、甲狀腺機能亢進、組織損傷、託-亨二氏症候群(tolosa-huntsyndrome)、毒性表皮壞死溶解症、中毒性休克綜合症、輸血反應、嬰兒臨時性低丙種球蛋白血症、橫貫性脊髓炎、橫貫性脊髓炎、熱帶肺嗜酸性粒細胞增多症、結核病、潰瘍性結腸炎、未分化結締組織病(uctd)、蕁麻疹、慢性過敏性草麻症和慢性特發性蕁麻疹(包括自身免疫性蕁麻疹)、葡萄膜炎、前葡萄膜炎、葡萄膜視網膜炎、心瓣炎、血管功能障礙、血管炎、椎骨關節炎、水皰性皮膚病、白癜風、韋格內氏肉芽腫症(肉芽腫病伴隨多血管炎(gpa))、維-奧二氏症候群、以及x-連鎖高igm症候群。
另外，這些抗體和融合多肽可適用於治療炎性病症，諸如風溼病、類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病關節炎脊椎關節病變、強直性脊椎炎、反應性關節炎、賴特爾綜合症、晶體狀關節病變、痛風、假性痛風、焦磷酸鈣沉積病、多發性硬化症、拉姆病、風溼性多肌痛；結締組織病、全身性紅斑狼瘡、全身性硬化症、多肌炎、皮肌炎、斯耶格倫氏症候群；脈管炎病、結節性多動脈炎、韋格內氏肉芽腫症、churg-strauss症候群；炎性病狀，包括創傷或缺血的後果、肉狀瘤病；血管疾病，包括動脈粥樣硬化血管疾病、動脈粥樣硬化和血管閉塞性疾病、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、心肌梗死、中風、周圍血管疾病、血管支架內再狹窄；眼部疾病，包括葡萄膜炎、角膜疾病、虹膜炎、虹膜睫體炎、白內障、胃酸逆流/燒心、痤瘡、尋常痤瘡、過敏和過敏反應、阿爾茲海默病、哮喘、動脈粥樣硬化、血管閉塞性疾病、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、心肌梗死、中風、周圍血管疾病、血管支架內再狹窄、自身免疫性疾病、支氣管炎、癌症、心臟炎、白內障、脂瀉病、慢性疼痛、慢性前列腺炎、肝硬化、結腸炎、結締組織疾病、全身性紅斑狼瘡、全身性硬化症、多肌炎、皮肌炎、斯耶格倫氏症候群、角膜病、克羅恩氏病、晶體狀關節病變、痛風、假性痛風、焦磷酸鈣沉積病、痴呆、皮炎、糖尿病、乾眼症、溼疹、水腫、肺氣腫、纖維肌痛、胃腸炎、牙齦炎、腎小球腎炎、心臟病、肝炎、高血壓、超敏反應、炎性腸病、炎性病狀、創傷或缺血的後果、胰島素耐受性、間質性膀胱炎、虹膜睫狀體炎、虹膜炎、關節痛/關節炎/類風溼性關節炎、拉姆病、代謝性症候群(症候群x)、多發性硬化症、肌炎、腎炎、肥胖症、眼部疾病、葡萄膜炎、骨質缺乏症、骨質疏鬆症、帕金森病、盆腔炎性疾病、牙周疾病、多動脈炎、多軟骨炎、風溼性多肌痛、銀屑病、再灌注損傷、類風溼性關節炎、風溼病、類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病性關節炎、類風溼性關節炎、肉狀瘤病、硬皮病、竇炎、斯耶格倫氏症候群、痙攣性結腸、脊椎關節病、強直性脊柱炎、反應性關節炎、賴特爾綜合症、全身性念珠菌病、肌腱炎、移植排斥、uti's、陰道炎、血管疾病、動脈粥樣硬化血管疾病、血管炎病、結節性多動脈炎、韋格內氏肉芽腫症、churg-strauss症候群、以及血管炎。
而且，本發明的激動劑和拮抗劑可用於治療過敏性疾病，諸如支氣管哮喘、過敏性鼻炎、特異性皮炎、以及花粉和昆蟲過敏、溼疹、過敏性鼻炎、枯草熱、蕁麻疹、蕁麻疹(假膜性喉頭炎)以及食物過敏、以及其他特應性疾病。
另外，本發明激動劑和拮抗劑可用於治療不同癌症，諸如惡性腫瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、以及白血病。此類癌症的更具體的實例包括鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、以及肺鱗狀癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃部癌症或胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾腺癌、腎臟癌症或腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和不同類型的頭頸癌、以及b-細胞性淋巴瘤(包括輕度/濾泡型非霍奇金淋巴瘤(nhl)；小淋巴細胞(sl)nhl；中度/卵泡nhl；中度瀰漫性nhl；重度免疫母細胞nhl；重度淋巴母細胞nhl；重度小型非裂細胞nhl；大體積病變nhl；套細胞淋巴瘤；aids相關性淋巴瘤；特發性巨球蛋白血症(macroglobulinemia))；慢性淋巴細胞性白血病(cll)；急性淋巴母細胞白血病(all)；毛細胞白血病；慢性成髓細胞性白血病；多發性骨髓瘤以及移植後淋巴組織增生性疾病(ptld)。
而且，能使用本發明的激動劑和拮抗劑治療的癌症包括但不限於，惡性腫瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、以及白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌症的更具體的實例包括膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤、鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、以及肺鱗狀癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃部癌症或胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾腺癌、腎臟癌症或腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和不同類型的頭頸癌、以及b-細胞性淋巴瘤(包括輕度/濾泡型非霍奇金淋巴瘤(nhl)；小淋巴細胞(sl)nhl；中度/卵泡nhl；中度瀰漫性nhl；重度免疫母細胞nhl；重度淋巴母細胞nhl；重度小型非裂細胞nhl；大體積病變nhl；套細胞淋巴瘤；aids相關性淋巴瘤；特發性巨球蛋白血症)；慢性淋巴細胞性白血病(cll)；急性淋巴母細胞白血病(all)；毛細胞白血病；慢性成髓細胞性白血病；以及移植後淋巴組織增生性疾病(ptld)，以及母斑病相關的異常血管增生、水腫(諸如與腦部腫瘤相關的水腫)和梅格斯症候群。優選地，所述癌症選自由以下組成的組：乳腺癌、結腸直腸癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、腎細胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、卡波濟氏肉瘤、類癌性癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤、以及多發性骨髓瘤。所述癌症可為早期晚期(包括轉移性)膀胱癌、卵巢癌或黑色素瘤。所述癌症可為結腸直腸癌。適合於本發明的治療的癌症病狀包括轉移癌，其中髓源性抑制細胞進行的vista表達抑制了抗腫瘤反應和抗侵襲性免疫反應。本發明的方法特別適用於治療血管化腫瘤。
另外，本發明激動劑和拮抗劑可用於治療感染性病狀，例如病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染性病狀。其實例包括例如B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、埃-巴二氏病毒、巨細胞病毒、免疫缺陷型病毒(hiv)感染、hiv-1、hiv-2、皰疹、乳頭瘤病毒感染以及相關疾病、結核病、瘧疾、血吸蟲病、埃可病毒感染、細小病毒感染、風疹病毒感染、免疫接種後症候群、先天性風疹感染、百日咳、流行性感冒、腮腺炎、以及埃-巴二氏病毒相關性疾病。
根據本發明的cd40或cd27激動或拮抗抗體可特別用於治療諸如癌症、炎症、感染性和自身免疫性疾病、移植、gvhd等病狀並且用於促進疫苗的功效。
本發明抗體可單獨使用或與其他治療劑結合使用，其中此類治療劑可包括其他生物劑或非生物劑諸如小分子、化學治療劑、抗感染劑、抗炎劑、抗過敏劑、放射性核素、其他受體激動劑或拮抗劑、激素調節劑、生長因子調節劑等。用於治療癌症、感染性疾病、炎性病狀的適合治療劑為本領域已知的。適當的其他治療劑的選擇將取決於所治療的特定病狀。
本發明的激動劑和拮抗劑當用於治療時將併入到適用於治療性施用的藥物組合物中。此類組合物通常將包含有效量的激動劑或拮抗劑抗體或融合蛋白和載體，例如藥學上可接受的載體。如本文所用的，語言「藥學上可接受的載體」旨在包括與藥物施用相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。用於藥理學活性物質的此類介質的用途為本領域中已知的。除非任何常規介質或試劑與所述活性化合物不相容，否則預期其在所述組合物中的用途。輔助性活性化合物也可併入到所述組合物中。
本發明的藥物組合物被配製為與其希望的施用路徑相容。施用路徑的實例包括胃腸外，例如靜脈內、真皮內、皮下、經口(例如，吸入)、經皮(局部)、經黏膜、以及直腸施用。用於胃腸外、真皮內或皮下應用的溶液或懸浮液可包含以下組分：無菌稀釋劑諸如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、肝炎、丙二醇或其他合成的溶劑；抗菌劑諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑諸如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用於調節張度的試劑諸如氯化鈉或右旋糖。ph可用酸或鹼調節，諸如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸外製劑可包含在由玻璃或塑料製成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
適用於可注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(其中為水溶性的)或分散液和用於臨時配製無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。對於靜脈內施用，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、cremophoreltm.(basf,parsippany,n.j.)或磷酸鹽緩衝鹽水(pbs)。在所有情況下，所述組合物必需為無菌的並且流動性達到易於注射的程度。它在製造和保存條件下必需穩定並且防止微生物諸如細菌和真菌的汙染作用。載體可為含有以下物質的溶劑或分散介質：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)以及其適合的混合物。可例如通過使用諸如卵磷脂的包衣、在分散液的情況下通過維持所要求的顆粒大小、以及通過使用表面活性劑來維持適當流動性。可通過各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如，對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等來防止微生物的作用。在許多情況下，優選地在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)、以及氯化鈉。可通過在組合物中包含延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現可注射組合物的吸收延長。
可通過以下各項來製備無菌可注射溶液：將激動劑或拮抗劑以所需的量，根據需要，與一種以上列舉的成分或這些成分的組合併入適當的溶劑中，然後進行過濾滅菌。總體上，通過將活性化合物併入無菌媒介物來製備分散液，所述無菌媒介物含有基礎分散介質以及來自以上列舉成分的所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優選的製備方法為真空乾燥和冷凍乾燥，這些方法產生活性成分加上來自其先前無菌過濾的溶液的任何另外需要的成分的粉末。
口服組合物大體上包含惰性稀釋劑或可食用載體。它們可包含在明膠膠囊內或者壓製成片劑。出於口服治療性施用的目的，活性化合物可與賦形劑結合併用於片劑、錠劑或膠囊形式中。口服組合物還使用流體載體作為漱口劑來製備，其中所述流體載體中的化合物口服應用，漱口後吐出或吞咽。藥學上相容的結合劑和/或佐劑材料可作為組合物的一部分包含在內。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有以下成分中的任一種或具有類似性質的化合物：粘合劑諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如海藻酸、羧甲基澱粉(primogel)或玉米澱粉；潤滑劑諸如硬脂酸鎂或sterotes；助流劑，諸如膠態二氧化矽；增甜劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如薄荷油、水楊酸甲酯或橙味調節劑。
對於通過吸入進行施用，化合物以來自加壓容器或分配器(含有可溶性推進劑例如氣體諸如二氧化碳)或噴霧器的氣溶膠噴霧形式遞送。全身性施用還可通過經黏膜或經皮方式進行。對於經黏膜或經皮施用，在製劑中使用適用於穿透屏障的滲透劑。此類滲透劑通常為本領域已知的，並且對於經黏膜施用包括例如洗滌劑、膽酸鹽和夫西地酸衍生物。經黏膜施用可通過使用鼻噴霧劑或栓劑來實現。對於經皮施用，將活性化合物配製成膏劑、油膏、凝膠或霜劑，如本領域通常已知的。
所述化合物還可製備為栓劑(例如，使用常規栓劑基質諸如可可粉和其他甘油)或滯留灌腸劑形式以用於直腸遞送。在一個實施方案中，活性化合物用保護所述化合物使其免於從身體內快速消除的載體製備，諸如控制釋放製劑，包括植入物和微囊化遞送系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、以及聚乳酸。用於製備此類製劑的方法對於本領域技術人員而言將是顯而易見的。所述材料也可從alzacorporation商購獲得並且novapharmaceuticals,incliposomal懸浮液(包括用病毒抗原的單克隆抗體靶向受感染細胞的脂質體)也可用作藥學上可接受的載體。這些可根據本領域技術人員已知的方法來製備，例如，如美國專利號4,522,811中所述的。
為方便施用和統一劑量，將口服或胃腸外組合物配製成單位劑型為特別有利的。如本文所述的單位劑型是指適用作用於待治療受試者的單位劑量的物理分散單位；每個單位含有計算產生所需治療效果的預定量的活性化合物以及所需的藥物載體。本發明的單位劑量的規格由活性化合物的獨特特徵和待實現的特定治療效果以及將此活性化合物混合以治療個體的領域內的固有限制性指示或者直接取決於所述特徵和治療效果以及所述固有限制性。
此類化合物的毒性和治療功效由細胞培養或實驗動物中的標準藥物程序所決定。從細胞培養測定和動物研究中獲得的數據可用於配製一定範圍的用於人的劑量。此類化合物的劑量優選地在包括ed50而幾乎不具有或不具有毒性的循環濃度範圍內。所述劑量在此範圍內根據所採用的劑型和所利用的施用路徑來變化。對於在本發明的方法中使用的任何化合物，治療有效劑量最初可由細胞培養測定評估。劑量可被配製為在動物模型中實現循環血漿濃度範圍，所述範圍包括如在細胞培養中測定的ic50(即測試化合物實現症狀的半最大抑制的濃度)。此信息可用於更準確地確定人中有用的劑量。例如可通過高效液相色譜法測量血漿中的水平。
如本文所限定的，蛋白質或多肽的治療有效量(即，有效劑量)的範圍為約0.001至30mg/kg體重，優選地約0.01至25mg/kg體重，更優選地約0.1至20mg/kg體重，以及甚至更優選地約1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg或者5至6mg/kg體重。技術人員將了解的是，某些因素可影響有效治療受試者所需要的劑量，所述因素包括但不限於疾病或病症的嚴重性、受試者的一般健康和/或年齡、以及存在的其他疾病。此外，用治療有效量的蛋白質、多肽或抗體治療受試者可包括單次治療，或者優選地可包括一系列治療。
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已描述本發明及其示例性實施方案，本發明由所附權利要求書進一步描述。