包含突變spr基因以及野生型tsp基因的細菌宿主菌株的製作方法

2023-04-23 22:00:06

專利名稱：包含突變spr基因以及野生型tsp基因的細菌宿主菌株的製作方法
包含突變SPR基因以及野生型TSP基因的細菌宿主菌株本發明涉及重組細菌宿主菌株，特別是大腸桿菌(E.Coli)。本發明還涉及在此細胞中產生目的蛋白質的方法。
背景技術：
通常將細菌細胞，如大腸桿菌，用於生產重組蛋白質。使用細菌細胞如大腸桿菌生產重組蛋白質有很多優勢，具體而言是因為細菌細胞作為宿主細胞可以使得基因通過質粒插入而具有多祥的屬性。大腸桿菌已經用於很多重組蛋白質的生產，包括人胰島素。儘管使用細菌細胞產生重組蛋白質有很多優勢，但是仍然有顯著的局限性，包括細菌細胞易於在目的重組蛋白質的表達過程中裂解。這種裂解表型可見於野生型細菌細胞，也可見於遺傳工程改造的細胞，如細菌蛋白酶缺陷的細胞。蛋白酶在轉換大腸桿菌細胞周質和細胞質中老舊、損壞或摺疊錯誤的細胞上起到重要作用。細菌蛋白酶起降解目的重組蛋白質的作用，因此常常顯著降低活性蛋白質的產量。因此，需要降低蛋白酶活性以降低目的蛋白質的蛋白質水解。然而，缺乏蛋白酶如Tsp (也稱為Prc)的細菌菌株也表現有細胞裂解。Tsp (也稱為Prc)為一種60kDa的細胞周質蛋白酶。Tsp (prc)活性降低對降低目的蛋白質的蛋白質水解是可取的。然而，發現缺少蛋白酶Prc的細胞在低滲透壓下顯示出熱敏感生長概況。Hara等人分離了 Tsp缺陷菌株，其為耐熱性回復突變株，含有基因夕卜抑制子(spr)突變(Hara 等人，Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996) )。Spr 為18kDa的膜結合細胞周質蛋白酶，spr的底物為Tsp以及外膜中參與細胞分裂中細胞壁水解的肽聚糖。spr基因標記為UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4(SPR_EC0LI)。攜帶有突變spr基因的蛋白酶缺陷細菌菌株已在Chen等人(Chen C，Snedecor B, Nishihara JC, JolyJCj McFarlandNj Andersen DC,Batters by JE，Champion KM. Biotechnol Bioeng. 2004Mar5;85(5) :463-74)中有描述，其中描述了攜帶prc (Tsp)及另ー種蛋白酶DegP不同突變組合的大腸桿菌菌株的構建，是通過擴增基因上遊及下遊區域並將其一起連接於包含選擇性標記物及spr W174R突變體的載體上產生的。出乎意料地發現攜帶突變spr基因及野生型Tsp基因的革蘭氏陰性細菌細胞為具有降低的裂解水平的細胞。因此，本發明人提供了新菌株，其具有用於產生目的蛋白質的優勢特性。出乎意料地，根據本發明的細胞顯示出優勢的生長及蛋白質生產表型，因為已知 spr和Tsp為相互抑制子，因此，可以預測如果讓其中之一成為主導則細胞可以顯示出生長不良的表型，如變得滲漏或更傾向發生細胞裂解。然而，與野生型細胞相比以及包含敲除突變Tsp基因的細胞，本發明的細胞的細胞裂解表型有顯著的降低。發明概述本發明提供了重組的革蘭氏陰性細菌細胞，其包含編碼突變spr蛋白質的突變spr基因且其中細胞包含非重組野生型染色體Tsp基因。在一個實施方式中，除了突變spr基因外，根據本發明的細胞的基因組與野生型細菌細胞基因組是同基因的(isogenic)。
本發明提供的細胞顯示出優勢的生長以及蛋白質生產表型。本發明還提供了用於生產目的重組蛋白質的方法，包括在如上文限定的重組革蘭氏陰性細菌細胞中表達目的重組蛋白質。附圖簡述圖I顯示了相比於野生型W3110和MXE001，MXE012和MXE017的生長概況。圖2顯示了相比於野生型W3110和MXE001，在MXE012和MXE017中抗-TNFaFab』的表達情況。 圖3顯示了在抗-TNFa Fab』生產發酵期間，W3110和MXE012的生長概況。圖4顯示了在抗づ,0 &13』生產發酵中13110和]\^^012(131108ロ『H119A)的細胞周質抗-TNFa Fab的積累情況(實線及實心圖標)以及培養基Fab』的積累情況(虛線及空心圖標)。圖5顯示了表達抗-TNFa Fab』的菌株W3110和MXE012以及表達抗-TNF a Fab』及重組DsbC的菌株W3110和MXE012的生長概況。圖6顯示了表達抗-TNFa Fab』菌株W3110和MXE012以及表達抗-TNF a Fab』及重組DsbC的菌株W3110和MXE012的細胞周質(陰影圖標)以及上清(空心非陰影圖標)中的抗-TNFa Fab』產量。圖7 顯示了菌株13110、]\^^001、]\^^008 和 MXE012 的 dsDNA 測定的結果。圖8顯示了菌株W3110、MXE001、MXE008和MXE012的蛋白質測定的結果。圖9a顯示了野生型ptr (蛋白酶III)和敲除突變的ptr (蛋白酶III)的蛋白質及基因序列的5』末端。圖9b顯示了野生型Tsp和敲除突變的Tsp的蛋白質及基因序列的5』末端。圖9c顯示了野生型DegP及突變DegP蛋白質及基因序列的區域。

圖10顯示了用於產生根據本發明實施方式的細胞的載體的構建。圖11顯示了表達抗-TNFa Fab』及重組DsbC的菌株MXE012的200L發酵物的生長概況。圖12顯示了表達抗-TNFa Fab』及重組DsbC的菌株MXE012的200L發酵物的抗-TNFa Fab』 滴度。圖13顯示了表達抗-TNF a Fab』及重組DsbC的菌株MXE012的200L發酵物的活力。圖14顯示了表達抗-TNF a Fab』及重組DsbC的菌株MXE012的3000L發酵物的生長概況。圖15顯示了顯示了表達抗づ,0 &13』及重組0813(的菌株]\^^012的3000し發酵物的抗-TNFa Fab』滴度。序列簡述SEQ ID NO: I是野生型Tsp基因的DNA序列，包括起始密碼子上遊的6個核苷酸ATGAAC。SEQ ID N0:2是野生型Tsp蛋白質的胺基酸序列。SEQ ID NO: 3是突變的敲除Tsp基因的DNA序列，包括起始密碼子上遊的6個核苷酸 ATGAAT。
SEQID NO:4是野生型蛋白酶III基因的DNA序列。SEQID NO:5是野生型蛋白酶III蛋白質的胺基酸序列。SEQID NO:6是突變的 敲除蛋白酶III基因的DNA序列SEQID NO: 7是野生型DegP基因的DNA序列。SEQID N0:8是野生型DegP蛋白質的胺基酸序列。SEQID NO:9是突變DegP基因的DNA序列。SEQID NO: 10是突變DegP蛋白質的胺基酸序列。SEQID NO: 11是抗-TNF抗體輕鏈可變區的胺基酸序列。SEQID NO: 12是抗-TNF抗體重鏈可變區的胺基酸序列。SEQID NO: 13是抗-TNF抗體輕鏈的胺基酸序列。SEQID NO: 14是抗-TNF抗體重鏈的胺基酸序列。SEQID NO: 15是用於突變Tsp基因區域的3』寡核苷酸引物的序列，包含Ase I限制性位點。SEQID NO: 16是用於突變Tsp基因區域的5』寡核苷酸引物的序列，包含Ase I限制性位點。SEQID NO: 17是用於突變蛋白酶III基因區域的3』寡核苷酸引物的序列，包含Ase I限制性位點。SEQID NO: 18是用於突變蛋白酶III基因區域的5』寡核苷酸引物的序列，包含Ase I限制性位點。SEQID NO: 19是用於突變DegP基因區域的5』寡核苷酸引物的序列，包含Ase I限制性位點。SEQID N0:20是用於突變DegP基因區域的3』寡核苷酸引物的序列，包含Ase I限制性位點。SEQID NO:21是野生型spr基因的序列，包括信號序列，S卩，前26個胺基酸殘基。SEQID NO: 22是非突變spr基因序列，不包括信號序列。SEQID NO: 23是突變OmpT序列的核苷酸序列，包括D210A和H212A突變。SEQID NO: 24是突變OmpT序列的胺基酸序列，包括D210A和H212A突變。SEQID NO: 25是突變敲除OmpT序列的核苷酸序列。SEQID NO:26是帶his標籤的DsbC的核苷酸序列。SEQID NO:27是帶his標籤的DsbC的胺基酸序列。SEQID NO:28 顯示了 hTNF40 的 CDRHl 胺基酸序列。SEQID NO: 29顯示了 hTNF40的CDRH2的胺基酸序列，其為雜合CDR，其中C-端六個胺基酸來自人亞群3種系抗體(human subgroup3)的H2⑶R序列，且由此雜合產生的序列中胺基酸變化由下劃線標出，如下WINITIGEPI YADSXKG。SEQID NO:30 顯示了 hTNF40 的 CDRH3 胺基酸序列。SEQID NO:31 顯示了 hTNF40 的 CDRLl 胺基酸序列。SEQID NO:32 顯示了 hTNF40 的 CDRL2 胺基酸序列。SEQID NO:33 顯示了 hTNF40 的 CDRL3 胺基酸序列。SEQID NO:34 顯示了 hTNF40 的 CDRH2 胺基酸序列。
SEQ ID N0:35顯示了 OmpA寡核苷酸轉接子的序列。SEQ ID N0:36顯示了編碼用於大腸桿菌Fab表達的基因間序列I (IGSl)的寡核苷酸盒。SEQ ID NO: 37顯示了編碼用於大腸桿菌Fab表達的基因間序列2 (IGS2)的寡核苷
酸盒。 SEQ ID NO: 38顯示了編碼用於大腸桿菌Fab表達的基因間序列3 (IGS3)的寡核苷酸盒。SEQ ID NO: 39顯示了編碼用於大腸桿菌Fab表達的基因間序列4 (IGS4)的寡核苷酸盒。本發明優選實施方式詳述本發明提供了適合於表達目的蛋白質的重組的革蘭氏陰性細菌細胞，其包含突變spr基因及非重組野生型染色體Tsp基因。出乎意料地發現與野生型細胞相比或包含突變Tsp基因的細胞，攜帶突變spr及非重組野生型染色體Tsp的細胞顯示出細胞生長的改善，並顯示出降低的細胞裂解表型。進ー步地，在一個實施方式中，與野生型細胞相比或包含突變Tsp基因的細胞，攜帶突變spr及非重組野生型染色體Tsp的細胞顯示出目的重組蛋白質產量的提高。提高的蛋白質產量可以是細胞周質蛋白質產量及/或上清蛋白質產量。在一個實施方式中，由於細胞滲漏減少，本發明的細胞與野生型細胞相比顯示出提高的細胞周質蛋白質產量。由於細胞裂解減少，重組細菌細胞能夠延長地表達目的重組蛋白質。根據本發明的細胞優選地在細胞周質及/或培養基中表達的目的蛋白質的最大產量為大約 I. 0g/L、l. 5g/L、l. 8g/L、2. 0g/L、2. 4g/L、2. 5g/L、3. 0g/L、3. 5g/L 或 4. Og/L。與已知的遺傳工程改造菌株，如蛋白酶缺陷細菌菌株(先前產生此種菌株用以表達重組蛋白質)相關的缺點包括使用了參與細胞新陳代謝及DNA複製的基因突變，例如，大腸桿菌菌株中的phoA、fhuA、lac、rec、gal、ara、arg、thi和pro。這些突變可以對宿主細胞具有很多有害作用，包括對細胞生長、穩定性、重組蛋白質表達產量及毒性的作用。具有一種或多種這些基因組突變的菌株，特別是具有大量這些突變的菌株可以喪失健康，這使得細菌生長速率降低到不適合エ業化蛋白質生產的水平。進ー步地，任何以上基因組突變可以以不可預測的有害方式順式或反式影響其他基因並由此改變菌株表型、健康以及蛋白質概況。進一歩地，使用嚴重突變的細胞一般不適合於生產用於商業化的重組蛋白質，尤其是用於治療的蛋白質，因為這些菌株一般具有缺陷的代謝途徑，因此在基本或化學限定的培養基中生長不良或根本不生長。在本發明ー個優選的實施方式中，細胞只攜帯能夠引入spr突變體的基因組最小突變。在此實施方式中，細菌細胞的基因組與野生型細菌細胞基因組的差異只有對spr基因的一個或兩個突變，且不攜帯任何其他可以對細胞生長和/或表達目的蛋白質能力有不利作用的突變。因此，相比於包含對基因組序列有進ー步遺傳工程改造突變的細胞，根據本發明的一種或多種重組宿主細胞展示了改進的蛋白質表達和/或改進的生長特徵。相比於包含對細胞基因組的其他破壞的細胞，本發明提供的細胞還更適合於用於產生治療用蛋白質。本發明還提供了重組革蘭氏陰性細菌細胞，其含有編碼突變spr蛋白質的突變spr基因，其中除了突變spr基因外細胞的基因組與野生型細菌細胞基因組是同基因的。在本發明的這個方面，所述細胞攜帯野生型Tsp基因。野生型染色體Tsp基因優選地為非重組染色體Tsp基因。技術人員可容易地使用本領域熟知的方法，包括發酵方法、ELISA及蛋白質G hplc，測試候選的細胞克隆以確定其是否具有目的蛋白質的所需要產量。合適的發酵方法描述於 Humphreys D P 等人(1997)。Formation of dimeric Fabs inE. coli: effect of hinge size and isotype,presence of interchain disulphidebond，Fab』 expression levels,tail piece sequences and growth conditions.J. IMMUNOL. METH. 209:193-202;Backlund E. Reeks D. Markland K. Weir N.BoweringL.Larsson G. Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichiacoli,Journal Article. Research Support, Non-U. S. Govi t Journal of Biotechnology. I35 (4):358-65，2008 Jul 31;Champion KM. Nishihara JC. Joly JC. Arnott D. Similarityof the Escherichia coli proteome upon completion of different biopharmaceuticalfermentation processes. [Journal Article]Proteomics. I (9) : 1133-48, 2001Sep;以及Horn U. Strittmatter W. Krebber A. Knupfer U.Kujau M. Wenderoth R. Muller K. Matzku S.Pluckthun A.Riesenberg D. High volumetric yields of functional dimericminiantibodies in Eschericnia coli, using an optimized expression vector andhigh—cell—density fermentation under non—limited growth conditions, Journa丄Article. Research Support, Non-U. S. Govi t Applied Microbiology & Biotechnology.46(5-6) :524-32, 1996Dec。本領域技術人員還可容易地使用本領域熟知方法，如蛋白質GHPLC、圓二色譜、NMR，X-光晶體成像及表位親和カ測量方法，測試分泌蛋白質以確定蛋白質是否正確摺疊。在本發明ー個優選的實施方式中，細胞進ー步包含編碼DsbC的重組多核苷酸。
現在將以更詳細的方式描述本發明。除非上下文另有說明，術語「蛋白質」和「多肽」在本文交換使用。「肽」意欲指代10個或更少的胺基酸。除非上下文另有說明，術語「多核苷酸」包括基因、DNA、cDNA、RNA、mRNA等。如本文所使用的，術語「包含」在本說明書的上下文中應解釋為「包括」。在本發明的上下文中，非突變的細胞或對照細胞指的是與本發明重組革蘭氏陰性細胞相同類型的細胞，其中所述細胞未被修飾為攜帯突變spr基因。例如，非突變細胞可為野生型細胞，並可與本發明細胞在進行修飾引入任何所述突變之前衍生自相同的宿主細胞群體。詞句「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」及「菌株」可交換使用。詞句「包含突變Tsp基因的細胞的表型」在本發明上下文中指的是帶有突變Tsp基因的細胞所表現出的表型。一般地，包含突變Tsp基因的細胞會裂解，尤其是在高細胞密度下。這些細胞的裂解引起任何重組蛋白質滲漏入上清。攜帯突變Tsp基因的細胞還可以顯示出在低滲透壓下的熱敏型生長。例如，細胞顯示不出生長速率或生長速率降低，或在高溫(如40°C或更高)下，細胞在低滲培養基中死亡。術語「同基因的」在本發明的上下文中指的是與所述細胞來源的野生型細胞相比，本發明細胞的基因組除了突變SPR基因外具有幾乎相同或相同的基因組序列。在此實施方式中，根據本發明的細胞基因組不包含其他非天然發生的或遺傳工程改造的突變。在ー個實施方式中，考慮到任何可以發生的天然發生的突變，與野生型細胞相比，根據本發明的細胞除了突變spr基因外有幾乎相同的基因組序列。在一個實施方式中，與野生型細胞相比，根據本發明的細胞除了突變spr基因外可以具有完全相同的基因組序列。在其中細胞包含編碼DsbC的重組多核苷酸的本發明實施方式中，編碼DsbC的重組多核苷酸可存在於轉化入細胞及/或整合入宿主細胞基因組的合適的表達載體上。在其中編碼DsbC的重組多核苷酸插入宿主基因組的實施方式中，由於插入的編碼DsbC的重組多核苷酸，本發明的細胞也與野生型細胞不同。優選地，編碼DsbC的重組多核苷酸是在細胞內表達載體中，因此對宿主細胞基因組造成破壞最小。術語「野生型」在本發明的上下文中指的是可以在自然中發生或可分離自環境而不攜帶任何遺傳工程改造突變的革蘭氏陰性細胞菌株。大腸桿菌野生型菌株的ー個實例為W3110，如 W3110K-12 菌株。 任何合適的革蘭氏陰性細菌都可用作生產本發明重組細胞的親本細胞。合適的革蘭氏陰性細菌包括鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、突光假單胞菌(Pseudomonas f luorescens)、胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)、志賀桿菌(Shigella)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)及大腸桿菌。優選地,親本細胞為大腸桿菌。大腸桿菌的任何合適菌株可用於本發明，但優選地所使用的為野生型W3110菌株，如K-12W3110。在一個優選的實施方式中，除了突變SPR基因外細胞與野生型大腸桿菌細胞如W3110是同基因的。在一個實施方式中，本發明的細胞包含編碼目的蛋白質的多核苷酸。在此實施方式中，編碼目的蛋白質的多核苷酸可包含在轉化入細胞和/或整合入宿主細胞基因組的合適的表達載體內。在編碼目的蛋白質的多核苷酸插入宿主基因組的實施方式中，由於插入的編碼目的蛋白質的多核苷酸，本發明的細胞與野生型細胞也不同。優選地，多核苷酸是在細胞內表達載體中，因此對宿主細胞基因組造成破壞最小。根據本發明的細胞攜帯野生型Tsp基因。在本發明的ー個方面，細胞攜帯野生型非重組染色體Tsp基因。野生型非重組染色體Tsp基因指的是染色體Tsp基因，其不是使用重組DNA技術構建、產生或插入染色體的。如本文所使用的，「Tsp基因」指的是編碼蛋白酶Tsp (也稱為Prc)的基因，Tsp是一種能夠作用於青黴素結合蛋白質-3 (PBP3)及噬菌體尾巴蛋白質的細胞周質蛋白酶。野生型Tsp基因的序列顯示於SEQ ID NO: 1，野生型Tsp蛋白質序列顯示於SEQ ID N0:2。Spr蛋白質為18kDa的膜結合細胞周質蛋白酶，spr的底物為Tsp及外膜中參與細胞分裂期間細胞壁水解的肽聚糖。Spr蛋白質的野生型胺基酸序列顯示於SEQ ID NO:21 (包含在N-端的信號序列)及SEQ ID NO:22 (不含26個胺基酸的信號序列)(根據UniProt登記號P0AFV4)。本發明中Spr蛋白質的胺基酸編號包括信號序列。因此，spr蛋白質的I號胺基酸為顯示於SEQID N0:21中的第一個胺基酸(Met)。
突變spr基因優選地為細胞的染色體spr基因。突變spr基因編碼能夠抑制包含突變Tsp基因的細胞的表型的spr蛋白質。攜帯突變Tsp基因的細胞可具有良好的細胞生長速率，但是這些細胞的一個限制在於其易於裂解，尤其在高細胞密度下。因此，包含突變Tsp基因的細胞的表型為易於裂解，尤其在高的細胞密度下。攜帯突變Tsp基因的細胞還顯示了低滲透壓下的熱敏型生長方式。然而，本發明的細胞所攜帯的spr突變在引入攜帯突變Tsp基因的細胞中時抑制了突變Tsp表型，因此，(尤其在高細胞密度下)細胞顯示出裂解減少。本領域技術人員可容易地測量搖瓶或高細胞密度發酵技術中的細胞的生長表型。相比於攜帶Tsp突變 體及野生型spr的細胞，從提高的生長速率及/或重組蛋白質生產(尤其是細胞周質中)上可見攜帶spr突變體及Tsp突變體的細胞展示出對細胞裂解表型的抑制。可對spr基因進行任何合適的突變或多種突變產生能夠抑制包含突變Tsp基因的細胞的表型的spr蛋白質。該活性可由本領域技術人員通過產生攜帯突變spr基因及突變Tsp基因的細胞並將其表型與只攜帯突變Tsp基因的細胞相比較而進行測試。對Tsp基因進行的合適突變在下文有詳細描述。除非另有說明，提到突變Tsp基因或編碼Tsp的突變Tsp基因指的是編碼具有降低蛋白酶活性的Tsp蛋白質的突變Tsp基因或者敲除突變的Tsp基因。詞句「編碼具有降低蛋白酶活性的Tsp蛋白質的突變Tsp基因」指的是相比於野生型非突變Tsp基因，Tsp基因不具有完全的蛋白酶活性。突變Tsp基因編碼的Tsp蛋白質具有野生型非突變Tsp蛋白質的50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低、或者5%或更低的蛋白酶活性。突變的Tsp基因可以編碼不具有蛋白酶活性的Tsp蛋白質。細胞沒有染色體Tsp缺陷，S卩，Tsp基因序列未經刪除或突變以阻止任何形式的Tsp蛋白質表達。任何合適的突變可引入Tsp基因以產生具有降低的蛋白酶活性的蛋白質。自革蘭氏陰性細菌表達的Tsp蛋白質的蛋白酶活性可容易地由本領域技術人員通過任何本領域合適的方法進行測試，如描述於Keiler等人(Identification of Active Site Residuesof the Tsp Protease*THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 270, No. 48, Issue ofDecember I, pp. 28864 - 28868, 1995Kenneth C. Keiler和 Robert T. Sauer)的方法,其中測試了 Tsp的蛋白酶活性。Keiler等人(見上文)已經報導Tsp的活性位點包含殘基S430、D441和K455，且殘基G375、G376、E433和T452對Tsp的結構維持很重要。Keiler等人(見上文)報導其發現突變的 Tsp 基因 S430A、D441A、K455A、K455H、K455R、G375A、G376A、E433A 和 T452A 不可檢測到蛋白酶活性。進ー步報導突變的Tsp基因S430C顯示出野生型活性的大約5-10%。因此，產生具有降低的蛋白酶活性的蛋白質的Tsp突變可包含突變，如對殘基S430、D441、K455、G375、G376、E433和T452中的ー種或多種進行錯義突變。優選地，產生具有降低的蛋白酶活性的蛋白質的Tsp突變可包含突變，如對殘基S430，D441和K455中的ー種或多種進行錯義突變。因此，突變的Tsp基因可包含 對S430的突變；或 對D441的突變；或
對K455的突變；或·對S430和D441的突變；或·對S430和K455的突變；或·對D441和K455的突變;或 對S430、D441和K455的突變。S430、D441、K455、G375、G376、E433和T452中的一個或多個可突變為任何合適的胺基酸，產生蛋白質具有降低的蛋白酶活性。合適的突變的實例為S430A、S430C、D441A、K455A、K455H、K455R、G375A、G376A、E433A和T452A。突變Tsp基因可包含對活性位點殘基的ー個、兩個或三個突變，例如基因可包含
· S430A 或 S430C;和/或.D441A;和/或· K455A 或 K455H 或 K455R。優選地，Tsp基因包含點突變S430A或S430C。詞句「敲除突變Tsp基因」指的是所述基因包含ー個或多個突變由此導致此基因編碼的蛋白質不表達，造成細胞中由所述敲除突變基因編碼的蛋白質缺陷。敲除基因可部分或全部地轉錄，但不翻譯為編碼的蛋白質。敲除突變的Tsp基因可以任何合適的方式，例如通過刪除、插入、點突變、錯義、無義及移碼突變中ー種或多種方式進行突變，使得蛋白質不表達。例如，基因可通過將外源DNA序列如抗生素抗性標記物插入基因編碼序列而被敲除。突變的Tsp基因可包含基因起始密碼子和/或位於基因起始密碼子下遊、基因終止密碼子上遊的ー個或多個終止密碼子的突變，由此阻止Tsp蛋白質表達。對起始密碼子的突變可為起始密碼子核苷酸中ー個、兩個或所有三個核苷酸的錯義突變。備選地或另外地，起始密碼子可通過插入或刪除移碼突變進行突變。Tsp基因在編碼序列的5』末端包含兩個ATG密碼子，其中兩個ATG密碼子之一或全部可通過錯義突變而進行突變。Tsp基因可在第二個ATG密碼子(3號密碼子)處突變為TCG，如圖9b所示。Tsp基因可備選地或另外地包含位於基因起始密碼子下遊、基因終止密碼子上遊的ー個或多個終止密碼子。優選地，敲除突變Tsp基因包含起始密碼子的錯義突變以及ー個或多個插入的終止密碼子。Tsp基因可突變以刪除第五個密碼子中的「T」而形成移碼，在11和16號密碼子處產生終止密碼子，如圖9b所示。Tsp還可突變為插入AseI限制性位點而在21號密碼子處產生第三個框內終止密碼子，如圖9b所示。敲除突變的Tsp基因可具有SEQ ID NO: 3的DNA序列，其包括起始密碼子上遊的 6個核苷酸ATGAAT。SEQ ID NO: 3的敲除突變Tsp序列中所作出的突變顯示於圖％。在一個實施方式中，突變的Tsp基因具有SEQ ID NO: 3的7-2048號核苷酸的DNA序列。因此，一旦鑑定出攜帯有合適的突變Tsp基因的細胞，即可鑑定產生能夠抑制包含突變Tsp基因的細胞的表型的spr蛋白質的合適spr基因突變。根據本發明一個優選的實施方式的細胞包含編碼spr蛋白質的突變spr基因，其在選自 N31、R62、170、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、G147、H157和W174的ー個或多個胺基酸處具有突變，更優選地在選自C94、S95、 V98、Y115、D133、V135、H145、G147、H157和W174的ー個或多個胺基酸處具有突變。在此實施方式中，spr蛋白質優選地不具有任何其他突變。優選地，突變spr基因編碼的spr蛋白質在選自 N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、G147和H157的ー個或多個胺基酸處具有突變，更優選地，在選自C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147和H157的ー個或多個胺基酸處具有突變。在此實施方式中，spr蛋白質優選地不具有任何其他突變。優選地，突變SPR基因編碼的spr蛋白質在選自 N31、R62、170、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144 和G147的ー個或多個胺基酸處具有突變，更優選地，在選自S95、V98、Y115、D133、V135和G147的ー個或多個胺基酸處具有突變。在此實施方式中，spr蛋白質優選地不具有任何其他突變。在本發明的ー個方面，提供了革蘭氏陰性細菌細胞，其包含突變spr基因，編碼的spr 蛋白質在選自 C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147 和 H157 的一個或多個胺基酸處具有突變，優選地，在選自S95、V98、Y115、D133、V135和G147的ー個或多個胺基酸處具有突變，其中的細胞包含野生型Tsp基因。在此實施方式中，spr蛋白質優選地不具有任何其他突變。
野生型染色體Tsp基因優選地為非重組染色體基因。優選地，細胞還包含編碼DsbC的重組多核苷酸。對ー個或多個以上胺基酸的突變可以是對編碼所述胺基酸的ー個、兩個或三個核苷酸的任何合適的錯義突變。突變將胺基酸殘基變成任何合適的胺基酸，產生能夠抑制包含突變Tsp基因的細胞的表型的突變SPR蛋白質。錯義突變可將胺基酸變為相比於野生型胺基酸不同大小及/或具有不同化學特性的胺基酸。在一個實施方式中，突變是對C94、H145和H157構成的催化單分子中的ー個、兩個或三個胺基酸殘基進行的突變(Solution NMR Structure of the NlpC/P60Domain ofLipoprotein Spr from Escherichia coli Structural Evidence for a Novel CysteinePeptidase Catalytic Triad, Biochemistry, 2008，47，9715-9717)。因此，突變SPR基因可包含 對C94的突變；或 對H145的突變；或 對H157的突變；或·對C94和H145的突變;或 對C94和H157的突變；或·對H145和H157的突變;或 對 C94、H145 和 H157 的突變。在此實施方式中，spr蛋白質優選地不具有任何其他突變。C94、H145和H157中的ー個、兩個或三個可突變為任何合適的胺基酸，產生能夠抑制包含突變的Tsp基因的細胞的表型的spr蛋白質。例如，C94、H145和H157中的ー個、兩個或三個可突變為小胺基酸如Gly或Ala。因此，spr蛋白質可具有C94A、H145A和H157A突變中的ー個、兩個或三個。優選地，spr基因包含錯義突變H145A，已經發現其產生能夠抑制包含突變的Tsp基因的細胞的表型的spr蛋白質。對本文的置換突變體的標記由字母+數字+字母構成。第一個字母標記野生型蛋白質中的胺基酸。數字指的是進行胺基酸置換的位置，第二個字母標記用於置換野生型胺基酸的胺基酸。在一個優選的實施方式中，突變spr蛋白質包含在選自N31、R62、170、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144 和 G147 的ー個或多個胺基酸處的突變，優選地為選自S95、V98、Y115、D133、V135和G147的一個或多個胺基酸處的突變。在此實施方式中，spr蛋白質優選地不具有任何其他突變。因此，突變SPR基因可包含 對N31的突變；或 對R62的突變；或·對170的突變；或 對Q73的突變；或· 對S95的突變；或 對V98的突變；或 對Q99的突變；或 對RlOO的突變；或 對L108的突變；或 對Y115的突變；或 對D133的突變；或 對V135的突變；或 對L136的突變；或 對G140的突變；或 對R144的突變；或 對G147的突變。在一個實施方式中，突變SPR蛋白質包含多重胺基酸突變*595和丫115;或· N31、Q73、R100 和 G140 ;或· Q73、R100 和 G140 ;或.RlOO 和 G140;或.Q73 和 G140;或.Q73 和 R100;或· R62、Q99 和 R144 ;或.Q99 和 R144。胺基酸N31、R62、170、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144和G147中的一個或多個可突變為任何合適的胺基酸，產生能夠抑制包含突變的Tsp 基因的細胞的表型的 spr 蛋白質。例如，N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140和R144中的一個或多個可突變為小胺基酸如Gly或Ala。在一個優選的實施方式中，spr蛋白質包含以下突變中的ー個或多個N31Y、R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D 或 V135G、L136P、G140C、R144C和G147C。優選地，spr蛋白質包含以下突變中的ー個或多個S95F、V98E、Y115F、D133A、V13 或V135G和G147C。在此實施方式中，spr蛋白質優選地不含有任何其他突變。在一個實施方式中，spr蛋白質具有選自N31Y、R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D 或 V135G、L136P、G140C、R144C 和 G147C 的ー個突變。在此實施方式中，spr蛋白質優選地不具有任何其他突變。在一個進ー步的實施方式中，spr蛋白質具有多重突變,選自.S95F 和 Y115F;
· N31Y、Q73R、R100G 和 G140C;· Q73R、R100G 和 G140C;· R100G 和 G140C; .Q73R 和 G140C;.Q73R 和 R100G;· R62C、Q99P 和 R144C;或.Q99P 和 R144C。在一個實施方式中，spr蛋白質具有突變W174R。在一個備選的實施方式中，spr蛋白質不具有突變W174R。在一個優選的實施方式中，根據本發明的細胞包含突變SPR基因以及編碼DsbC的
重組多核苷酸。如本文所使用的，「重組多肽」指的是使用重組DNA技術構建或產生的蛋白質。編碼DsbC的多核苷酸序列可與細菌細胞中發現的編碼DsbC的內源序列同一。備選地，編碼DsbC的重組多核苷酸序列為野生型DsbC序列的突變形式，例如，其有移除的限制性位點，如EcoRI位點，及/或具有編碼his標籤的序列。用於本發明的經修飾DsbC核苷酸序列的實例顯示於SEQ ID NO: 26，其編碼帶his標籤的DsbC胺基酸序列，顯示於SEQ ID NO: 27。在本發明的ー個方面，提供了革蘭氏陰性細菌細胞，其包含編碼突變spr蛋白質的突變spr基因以及編碼DsbC的重組的多核苷酸，並且其中細胞包含野生型Tsp基因。野生型Tsp基因優選地為非重組染色體Tsp基因。DsbC是ー種發現於大腸桿菌細胞周質中的原核蛋白質,其催化大腸桿菌中二硫鍵的形成。DsbC的胺基酸序列長度為236 (包括信號肽)，分子量為25.6KDa (UniProtNo. POAEGeXDsbC於 1994年首次發現(Missiakas等人The Escherichia coli dsbC(xprA)gene encodes a periplasmic protein involved in aisulfiae bond formation, TheEMBO Journal vol 13, no 8，ρ2013_2020, 1994 以及 Shevchik 等人 Characterization ofDsdC, a periplasmic protein of Erwinia cnrysantnemi and Escnerichia coil withdisulfide isomerase activity, The EMBO Jounral vol 13,no 8，p2007_2012，1994)。已知其與催化ニ硫鍵形成的蛋白質共表達以改善宿主細胞中的蛋白質表達。W098/56930公開了用於在細菌細胞中生產異源的含ニ硫鍵的多肽的方法，其中原核的ニ硫鍵異構酶如DsbC或DsbG與真核多肽共表達。US6673569公開了ー種人工操縱子，其包含編碼DsbA、DsbB, DsbC和DsbD各個的多核苷酸，用於生產外源蛋白質。EP0786009公開了用於在細菌中生產異源多肽的過程，其中在誘導編碼異源多肽的核酸表達之前誘導編碼DsbA或DsbC的核酸表達。 我們已經發現在包含突變SPR基因及野生型Tsp基因的細菌細胞中表達編碼DsbC的重組多核苷酸這一特定組合提供了用於表達目的蛋白質的改良的宿主。出乎意料地發現與野生型細胞相比或包含突變Tsp基因的細胞，所述新菌株顯示出増加的細胞生長速率及増加的細胞存活時間。具體地，相比於攜帶突變Tsp基因的細胞，攜帯重組DsbC基因、spr突變及野生型Tsp的細胞顯示出細胞裂解減少的表型。在一個實施方式中 ，根據本發明的細胞還進ー步表達如下的ー種或多種蛋白質· 一種或多種能夠促進細胞摺疊的蛋白質，如FkpA、Skp、SurA, PPiA和PPiD ;和/或· ー種或多種能夠促進蛋白質分泌或易位的蛋白質,如SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY 和 Lep ;和 / 或· ー種或多種能夠促進ニ硫鍵形成的蛋白質,如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。可將ー種或多種以上蛋白質整合入細胞基因組且/或插入表達載體。在一個實施方式中，根據本發明的細胞不含有編碼以下一種或多種其他蛋白質的重組多核苷酸· 一種或多種能夠促進細胞摺疊的蛋白質，如FkpA、Skp、SurA, PPiA和PPiD ;和/或· ー種或多種能夠促進蛋白質分泌或易位的蛋白質,如SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY 和 Lep ;和 / 或· ー種或多種能夠促進ニ硫鍵形成的蛋白質,如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。在本發明ー個優選的實施方式中，重組革蘭氏陰性細菌細胞進ー步包含突變DegP基因和/或突變Ptr基因和/或包含突變OmpT基因，所述突變DegP基因編碼具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白質，其中突變ptr基因編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白質或為敲除突變Ptr基因，其中突變OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質或為敲除突變OmpT基因。在一個實施方式中，本發明提供重組的革蘭氏陰性細菌細胞，其包含a.突變spr基因；b.野生型非重組染色體Tsp基因；以及c.編碼具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白質的突變的DegP基因，和/或突變OmpT基因，其中突變OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質或為敲除突變OmpT基因。優選地，在此實施方式中，除了以上突變之外所述細胞與野生型細菌細胞是同基因的。在一個實施方式中，本發明提供了重組革蘭氏陰性細菌細胞，包含a.突變SPR基因；b.野生型非重組染色體Tsp基因；以及c.突變ptr基因和/或突變OmpT基因，其中突變ptr基因編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白質或為突變Ptr基因，其中突變OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質或為敲除突變OmpT基因。優選地，在此實施方式中，除了以上突變之外所述細胞與野生型細菌細胞是同基因的。
在一個實施方式中，本發明提供了細胞，包含a.突變SPR基因；b.野生型非重組染色體Tsp基因；c.編碼具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白質的突變DegP基因；d.突變ptr基因，其中突變ptr基因編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白質或為突變Ptr基因；以及e.任選地，突變OmpT基因，其中突變OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質或為敲除突變OmpT基因。 優選地，在此實施方式中，除了以上突變之外所述細胞與野生型細菌細胞是同基因的。在本發明ー個實施方式中，細胞攜帶突變DegP基因。如本文所使用的，「DegP」指的是編碼DegP蛋白質(也稱為HtrA)的基因，其具有作為分子伴侶和蛋白酶雙重功能(Families of serine peptidases ；Rawlings ND,Barrett AJ. MethodsEnzymol. 1994;244:19-61)。非突變DegP基因的序列顯示於SEQ ID NO: 7，非突變的DegP氣基酸序列顯不於SEQ ID N0:8。在低溫下，DegP起分子伴侶的作用，在高溫下，DegP偏向於起蛋白酶的作用(A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a WidelyConserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue 3, Pages 339 - 347.SpiessC,Beil A, Ehrmann M 以及 The proteolytic activity of the HtrA(DegP)proteinfrom Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J 等人 Microbiology2008，154，3649-3658)。 在這些細胞包含DegP突變的實施方式中，細胞中的DegP突變提供了突變DegP基因，其編碼具有分子伴侶活性但不具有完全蛋白酶活性的DegP蛋白質。詞句「具有分子伴侶活性」在本發明的上下文中指的是與野生型非突變DegP蛋白質相比，突變DegP蛋白質具有相同或幾乎相同的分子伴侶活性。優選地，突變DegP基因編碼的DegP蛋白質具有野生型非突變DegP蛋白質的50%或更高、60%或更高、70%或更高、80%或更高、90%或更高或者95%的分子伴侶活性。更優選地，與野生型DegP相比，突變DegP基因編碼的DegP蛋白質具有相同的分子伴侶活性。詞句「具有降低的蛋白酶活性」在本發明的上下文中指的是與野生型非突變DegP蛋白質相比，突變DegP蛋白質不具有完全的蛋白酶活性。優選地，突變DegP基因編碼的DegP蛋白質具有野生型非突變DegP蛋白質50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低或者5%或更低的蛋白酶活性。更優選地，突變DegP基因編碼的DegP蛋白質不具有蛋白酶活性。所述細胞不是染色體DegP缺陷的，即，DegP基因序列未經刪除或突變以阻止任何形式的DegP蛋白質的表達。任何合適的突變可引入DegP基因以產生具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的蛋白質。表達自革蘭氏陰性細菌的DegP蛋白質的蛋白酶和分子伴侶活性可由本領域技術人員通過任何合適的方法進行測試，如描述於Spiess等人的方法，其中對DegP的蛋白酶和分子伴侶活性的測試在DegP的天然底物MalS上進行(A Temperature-Dependentbwitch from しhaperone to Protease in a Widely しonserved Heat Shock Protein.Cell, Volume 97, Issue 3, Pages 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M);以及在 Theproteolytic activity of the HtrA (DegP)protein from Escherichia coli at lowtemperatures, Skorko-Glonek J 等人 Microbiology 2008, 154, 3649-3658 中描述的方法。DegP為絲氨酸蛋白酶，其活性中心由Hisl05、Aspl35和Ser210的胺基酸殘基組成的催化三分子構成(Families of serine peptidases, MethodsEnzymol. , 1994, 244:19-61Rawlings N and Barrett A)。產生具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP突變可包含的突變如對Hisl05、Aspl35和Ser210中ー個、兩個或三個的錯義突變。因此，突變DegP基因可包含 對Hisl05的突變；或 對Aspl35的突變；或·對Ser210的突變；或·對 Hisl05 和 Aspl35 的突變；或·對 His 105 和 Ser210 的突變；或·對 Aspl35 和 Ser210 的突變；或·對 Hisl05、Aspl35 和 Ser210 的突變。Hisl05，Aspl35和Ser210中的ー個、兩個或三個可突變為任何合適的胺基酸，產生具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的蛋白質。例如，Hisl05，Aspl35和Ser210中的ー個、兩個或三個可突變為小胺基酸如Gly或Ala。其他合適的突變是將Hisl05，Aspl35和Ser210中的ー個、兩個或三個變為具有相反特性的胺基酸，如Aspl35突變為Lys或Arg，極性的Hisl05突變為非極性胺基酸如Gly、Ala、Val或Leu，而小分子親水性Ser210突變為大分子或疏水性殘基如Val，Leu, Phe或Tyr。優選地，DegP基因包含點突變S210A，如圖9c中顯示，發現其產生了具有分子伴侶活性但不具有蛋白酶活性的蛋白質(Ai'emperature-Dependent bwitch from Chaperone to Protease in a Widely しonservedHeat Shock Protein.Cell, Volume 97,Issue 3,Pages 339 - 347. Spiess C,BeiIA, Ehrmann M)。DegP具有兩個PDZ結構域，PDZl (260-358號殘基)和TOZ2 (359-448號殘基)，其調節蛋白質-蛋白質相互作用(A Temperature-Dependent Switch from Chaperoneto Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Issue3, Pages 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M)。在本發明白勺一個實施方式中，將 DegP基因突變以刪除rozi結構域和/或Η)Ζ2結構域。rozi和roz2的刪除導致相比於野生型DegP蛋白質，DegP蛋白質的蛋白酶活性完全喪失，且分子伴侶活性降低，而刪除rozi或roZ2之ー導致相比於野生型DegP蛋白質，具有5%的蛋白酶活性和類似的分子伴侶活性(A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a WidelyConserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97,Issue 3, Pages 339 - 347.SpiessC, Beil A, Ehrmann M)。 突變DegP基因還可包含沉默的非天然發生的限制性位點，如Asel，以助於鑑定和篩選方法，例如，如圖9c所示。SEQ ID N0:9中提供了突變DegP基因的優選序列，其包含點突變S210A及Ase I限制性標記物位點，所編碼的蛋白質序列顯示於SEQ ID NO: 10。SEQ ID NO:9的突變DegP序列中所作出的突變顯示於圖9c。在本發明的實施方式中，其中細胞包含突變DegP基因，其編碼的DegP蛋白質具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性，相對於其中DegP基因突變為敲除DegP而阻止DegP表達(如染色體缺陷DegP)的突變細胞，本發明提供的ー種或多種細胞可以提供產自所述細胞正確摺疊蛋白質的提高的產量。在包含敲除突變DegP基因而阻止DegP表達的細胞中，DegP的分子伴侶活性完全喪失，而根據本發明的細胞中，DegP的分子伴侶活性得到保留，同時卻喪失了全部的蛋白酶活性。在這些實施方式中，根據本發明的一種或多種細胞具有降低的蛋白酶活性而阻止蛋白質的蛋白水解作用，同時卻保留了分子伴侶活性以使蛋白質在宿主細胞中得以正確的摺疊和運輸。本領域技術人員能夠使用本領域已知方法容易地測試分泌的蛋白質以確定蛋白質是否正確摺疊，所述方法如蛋白質G HPLC、圓二色譜、NMR、X-光晶體成像和表位親和測量方法。 在這些方法中，相比於攜帶突變敲除DegP基因而阻止DegP表達的細胞，根據本發明的一種或多種細胞具有改善的細胞生長。不意欲受到任何理論的約束，由於保持分子伴侶活性的DegP蛋白酶增加細胞處理所有需要分子伴侶活性的蛋白質的能力從而顯示出細胞生長改善。因此，相比於攜帶DegP敲除突變的細胞，在本發明的一種或多種細胞中，產生對細胞的生長和繁殖必需的正確摺疊蛋白質有所増加，由此改善調控生長的細胞途徑。進一歩地，已知的DegP蛋白酶缺陷菌株一般為溫度敏感型，一般在超過大約28°C的溫度下不生長。然而，根據本發明的細胞是非溫度敏感型，可在28°C或更高的溫度下生長，包括大約30°C -大約37°C的溫度，這些溫度一般用於細菌生產蛋白質的エ業規模生產。在本發明ー個實施方式中，細胞攜帶突變ptr基因。如本文所使用的，「ptr基因」指的是編碼蛋白酶III的基因，其為降解高分子量蛋白質的蛋白酶。非突變Ptr基因的序列顯示於SEQ ID N0:4，非突變蛋白酶III蛋白質的序列顯示於SEQ ID N0:5。除非另有說明。提到突變ptr基因或編碼蛋白酶III的突變ptr基因時，指的是編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III的突變Ptr基因或敲除突變Ptr基因。詞句「編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III的突變Ptr基因」在本發明的上下文中指的是相比於野生型非突變Ptr基因，突變ptr基因不具有完全的蛋白酶活性。優選地，突變ptr基因編碼的蛋白酶III具有野生型非突變蛋白酶III蛋白質的50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低或者5%或更低的蛋白酶活性。更優選地，突變Ptr基因編碼的蛋白酶III蛋白質不具有蛋白酶活性。在此實施方式中，細胞在染色體Ptr上沒有缺陷，即ptr基因序列未經刪除或突變而阻止任何形式蛋白酶III蛋白質的表達。任何合適的突變可引入ptr基因以產生具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III。表達自革蘭氏陰性細菌的蛋白酶III蛋白質的蛋白酶活性可容易地由本領域技術人員通過任何本領域合適的方法進行測試。詞句「敲除突變ptr基因」在本發明的上下文中指的是所述基因包含ー個或多個突變，由此導致此基因編碼的蛋白質不表達，造成細胞中由所述敲除突變基因編碼的蛋白質缺陷。敲除基因可部分或全部地轉錄，但不翻譯為編碼的蛋白質。敲除突變Ptr基因可以以任何合適的方式，例如通過刪除、插入、點突變、錯義、無義及移碼突變中ー種或多種方式進行突變，使得蛋白質不表達。例如，基因可通過將外源DNA序列如抗生素抗性標記物插入基因編碼序列而被敲除。在一個優選的實施方式中，基因不是通過將外源DNA序列如抗生素抗性標記物插入基因編碼序列而突變的。優選地，蛋白酶III基因包含對基因起始密碼子的突變和/或形成位於基因起始密碼子下遊、基因終止密碼子上遊的ー個或多個終止密碼子的突變，由此阻止蛋白酶III蛋白質的表達。對靶標敲除基因起始密碼子進行突變引起起始密 碼子功能的喪失，並由此確保靶標基因在編碼序列的起始不含有合適的起始密碼子。對起始密碼子的突變可為起始密碼子核苷酸中ー個、兩個或三個核苷酸的錯義突變。備選地或另外地，起始密碼子可通過插入或刪除移碼突變進行突變。在一個優選的實施方式中，ptr基因突變使得ATG起始密碼子變為ATT，如圖9a。敲除突變ptr基因可備選地或另外地包含位於基因起始密碼子下遊、基因終止密碼子上遊的ー個或多個終止密碼子。優選地，敲除突變ptr基因包含對起始密碼子的錯義突變以及一個或多個插入的終止密碼子。所述ー個或多個插入的終止密碼子優選地為框內終止密碼子。然而，所述ー個或多個插入的終止密碼子可備選地或另外地為框外密碼子。當框外起始密碼子通過插入或刪除移碼突變轉變為框內起始密碼子時，需要一個或多個框外終止密碼子以終止翻譯。可通過任何合適的突變引入所述ー個或多個終止密碼子，所述突變包括無義點突變和移碼突變。優選地，可通過移碼突變和/或插入突變引入所述ー個或多個終止密碼子，優選地通過以包含終止密碼子的序列置換基因序列的一段而實現。例如，可插入AseI限制性位點，其包含終止密碼子TAA。在一個優選的實施方式中，將ptr基因突變以通過插入Ase I限制性位點而插入框內終止密碼子，如圖9a所示。在一個優選的實施方式中，敲除突變ptr基因具有SEQ IDNO:6的DNA序列。在SEQ ID NO:6所示的敲除突變ptr基因序列中所作出的突變顯示於圖9a。上文描述的敲除突變具有優勢，因為其對靶標敲除基因位點上遊或下遊的染色體DNA造成最小的破壞或無破壞，且不需要插入和保留外源DNA，如抗生素抗性標記物，這些可以影響細胞用於表達目的蛋白質，尤其是治療性蛋白質的合適度。因此，相比於通過將外源DNA插入基因編碼序列而敲除蛋白酶基因的細胞，根據本發明的一種或多種細胞可以顯示出改善的生長特徵和/或蛋白質表達。在一個實施方式中，根據本發明的細胞攜帶突變OmpT基因。如本文所使用的，「OmpT基因」指的是編碼蛋白酶OmpT (外膜蛋白酶T)的基因，其為外膜蛋白酶。野生型非突變OmpT基因的序列為SWISS-PROT P09169。除非另有說明，提到突變OmpT基因或編碼OmpT的突變OmpT基因時，指的是編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質的突變OmpT基因或敲除突變OmpT基因，詞句「編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質的突變OmpT基因」在本發明的上下文中指的是相比於野生型非突變OmpT基因，突變OmpT基因不具有完全的蛋白酶活性。突變OmpT基因可以編碼的OmpT蛋白質具有野生型非突變OmpT蛋白質的50%或更低、40%或更低、30%或更低、20%或更低、10%或更低或者5%或更低的蛋白酶活性。突變OmpT基因可以編碼不具有蛋白酶活性的OmpT蛋白質。在此實施方式中，細胞在染色體OmpT上沒有缺陷，即OmpT基因序列未經刪除或突變而阻止任何形式的OmpT蛋白質的表達。任何合適的突變可引入OmpT基因以產生具有降低的蛋白酶活性的蛋白質。表達自革蘭氏陰性細菌的OmpT蛋白質的蛋白酶活性可容易地由本領域技術人員通過任何本領域合適的方法進行測試，如描述於Kramer等人(Identification of essentialaciaic residues οι outer membrane protease OmpT supports a novel activesite, FEBS Letters 505 (2001)426-430)和 Dekker 等人(Substrate Specitificity ofthe Integral Membrane Protease OmpT Determined by Spatially Addressed PeptideLibraries, Biochemistry 2001,40，1694-1701)的方法。Kramer等人(Identifixation of active site serine and histidine residuesin Escherichia coliouter membrane protease OmpT FEBS Letters 2000468,220-224)已經報導了 OmpT，公開了由丙氨酸置換絲氨酸、組氨酸和酸性殘基導致活性降低對於 Glu27、Asp97、Asp208或HislOl活性降低 10倍，對於Ser99活性降低 500倍，對於Asp83、Asp85、Asp210或His212活性降低 10000倍。Vandeputte-Rutten等人(Crystal Structureof the Outer Memorane Protease OmpT irom Escherichia coli suggests a novelcatalytic site, The EMBO Journal2001, Vol 20No 185033-5039)提出具有活性中心，包含 Asp83_Asp85 對以及 His212_Asp210 對。進一步地，Kramer 等人(Lipopolysaccharideregions involved in the activation of Escherichia coli outer memorane proteaseOmpT, Eur. J. Biochem. FEBS 2002,269，1746-1752)公開了 L4 環中的 D208A、D210A、H212A、H212N、H212Q、G216K/K217G、K217T和R218L突變，這些都導致酶活性部分或幾乎全部喪失。因此，產生具有降低的蛋白酶活性的OmpT突變可以包含的突變如對E27、D43、D83、D85、D97、S99、H101E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212G216、K217、R218 和 E250中ー個或多個殘基的錯義突變。E27、D43、D83、D85、D97、S99、H101E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212G216、K217、R218和E250中一個或多個可突變為任何合適的胺基酸以產生具有降低的蛋白酶活性的蛋白質。例如，E27、D43、D83、D85、D97、S99、H101E111、E136、E193、D206、D208、D210、H212G216、K217、R218和E250中的ー個或多個可突變為丙氨酸。合適的突變的實例為E27A、D43A、D83A、D85A、D97A、S99A、H101AE111A、E136A、E193A、D206A、D208A、D210A、H212A、H212N、H212Q、G216K、K217G、K217T、R218L 和 E250A.在一個實施方式中，突變 OmpT 基因包含D210A和H212A突變。包含D210A和H212A突變的合適的突變OmpT序列顯示於SEQ IDN0:23。詞句「敲除突變OmpT基因」在本發明的上下文中指的是所述基因包含ー個或多個突變由此導致此基因編碼的蛋白質不表達，造成細胞中由所述敲除突變基因編碼的蛋白質缺陷。敲除基因可部分或全部地轉錄，但不翻譯為編碼的蛋白質。敲除突變OmpT基因可以任何合適的方式，例如通過刪除、插入、點突變、錯義、無義及移碼突變中ー種或多種方式進行突變，使得蛋白質不表達。例如，基因可通過將外源DNA序列如抗生素抗性標記物插入基因編碼序列而被敲除。在一個實施方式中，OmpT基因包含對基因起始密碼子的突變和/或位於基因起始密碼子下遊、基因終止密碼子上遊的ー個或多個終止密碼子的突變，由此阻止OmpT蛋白質的表達。對起始密碼子的突變可為起始密碼子核苷酸中ー個、兩個或三個核苷酸的錯義突變。備選地或另外地，起始密碼子可通過插入或刪除移碼突變進行突變。合適的突變敲除OmpT序列顯示於SEQ ID N0:24。在一個實施方式中，根據本發明的革蘭氏陰性細菌細胞不攜帶有敲除突變OmpT基因，如染色體ompT缺陷。在一個實施方式中，根據本發明的革蘭氏陰性細菌細胞不攜帶有敲除突變DegP基因，如染色體degP缺陷。在一個實施方式中，根據本發明的革蘭氏陰性細菌細胞不攜帯突變DegP基因。在一個實施方式中，根據本發明的革蘭氏陰性細菌細胞不攜帶敲除突變ptr基因，如染色體Ptr缺陷。包括敲除突變在內的許多遺傳工程改造突變涉及使用抗生素抗性標記物，這樣能夠選擇和鑑定成功突變的細胞。然而，使用抗生素抗性標記物有大量的不利之處。在本發明的一個實施方式中，突變基因可包含一個或多個標記物位點。因此，spr基因及/或編碼具有分子伴侶活性而不具有蛋白酶活性的DegP蛋白質的突變DegP基因及/或突變Ptr基因及/或突變OmpT基因可突變為包含一個或多個限制性標記物位點。限制性位點通過遺傳工程改造而進入基因，其為非天然發生的。限制性標記物位點是有利的，因為其能夠使得對包含所需的染色體突變的正確修飾的細胞進行選擇和鑑定。經修飾攜帯ー個或多個所述突變基因的細胞可通過對來自細胞裂解物的基因組DNA進行PCR而進行分析，其中所用的寡核苷酸對設計為擴增包含非天然發生的限制性標記物位點的基因組DNA 區域。隨後將擴增的DNA與能夠在非天然發生限制性標記物位點消化DNA的合適的限制性酶孵育之前和之後通過瓊脂糖凝膠電泳進行。用限制性酶孵育後產生的DNA片段證實了細胞已經成功地修飾為攜帯所述ー個或多個突變的基因。在細胞包含具有SEQ ID NO:6的DNA序列的敲除突變ptr基因的實施方式中，SEQID N0:17和SEQ ID NO: 18中所示的寡核苷酸引物序列可用於擴增來自轉化細胞的基因組DNA中包含非天然發生的AseI限制性位點的DNA。擴增的基因組DNA然後可與Ase I限制性酶一同孵育並通過凝膠電泳進行分析以證實基因組DNA中有突變ptr基因存在。在細胞包含具有SEQ ID N0:9的DNA序列的敲除突變DegP基因的實施方式中，SEQID N0:19和SEQ ID NO: 20中所示的寡核苷酸引物序列可用於擴增來自轉化細胞的基因組DNA中包含非天然發生的Ase I限制性位點的DNA。擴增的基因組DNA然後可與Ase I限制性酶一同孵育並通過凝膠電泳進行分析以證實基因組DNA中有突變DegP基因存在。一個或多個限制性位點可通過任何合適的突變而引入，包括刪除、插入、點突變、錯義、無義和移碼突變中的ー種或多種。限制性位點可通過對起始密碼子的突變及/或引入一個或多個終止密碼子的突變而引入，如上文所描述的。此實施方式是有利的，因為限制性標記物位點是所弓I入的敲除突變的直接且唯一的標記物。可插入包含框內終止密碼子的限制性標記物位點，如Ase I限制性位點。這一點尤其有利，因為插入的限制性位點同時起到限制性標記物位點以及終止密碼子的作用，以阻止基因編碼序列的完全轉錄。例如，在通過引入Ase I位點向ptr基因引入終止密碼子的實施方式中，這還製造出限制性位點，如圖9a所示。
可通過突變起始密碼子和任選地ー個或多個其他點突變，將限制性標記物位點插入。在此實施方式中，限制性標記物位點優選地為EcoR I限制性位點。這一點有其有利，因為對起始密碼子的突變還製造出限制性標記物位點。例如，在一個實施方式中，Ptr基因的起始密碼子變為ATT,這製造出Eco R I標記物位點，如圖9a所示。在細胞攜帶突變OmpT基因的本發明的實施方式中，所述ー個或多個限制性位點可通過任何合適的突變引入，所述突變包括刪除、插入、點突變、錯義、無義和移碼突變中的ー種或多種。例如，在OmpT基因包含D210A和H212A突變的實施方式中，這些突變引入的沉默的HindIII限制性位點，其可用作選擇性標記物。在突變SPR基因和突變DegP基因中，標記物限制性位點可使用沉默密碼子改變而引入。例如，AseI位點可用作沉默限制性標記物位點，其中TAA終止密碼子在框外，如圖9c所示的DegP序列。在本發明的實施方式中，其中ptr基因突變為編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III，可使用沉默密碼子改變引入一個或多個標記物限制性位點。根據本發明的重組革蘭氏陰性細菌細胞可通過任何合適的方式產生。本領域技術人員了解可用於將染色體基因序列用突變的基因序列置換而引入spr突變體基因的合適的技木。可採用合適的載體，其能通過同源重組整合入宿主染色體。合適的基因置換的方法描述於，例如，Hamilton等人(New Method forvenerating Deletions and bene Replacements in Escherichia coli, Hamilton し· M.等人，Journal of Bacteriology Sept.1989,Vol. 171, No. 9p 4617-4622)、Skorupski 等入(Positive selection vectors for allelic exchange, bkorupski K 矛ロ TaylorR.K.，Gene, 1996，169，47-52)、Kiel 等人(A general method for the constructionof Escherichia coli mutants by homologous recombination and plasmidsegregation, Kiel J. A. K. ff.等人 Mol Gen Genet 1987，207:294-301 )、Blomfield 等人(Allelic exchange in Escherichia coil using the Bacillus subtilis sacB geneand a temperature sensitive pSClOl replicon, Blomfield I. C.等人,MolecularMicrobiology 1991，5 (6)，1447-1457)以及Ried等人(An nptl-sacB-sacR cartridge forconstructing directed, unmarked mutations in Gram-negative bacteria by markerexchange-eviction mutagenesis, Ried J. L. and Collmer A. , Gene 57(1987)239-246)。能使同源重組/置換發生的合適質粒為pK03質粒(Link等人，1997，Journal ofBacteriology, 179, 6228-6237)。在細胞包含編碼DsbC的重組多核苷酸的實施方式中，本領域技術人員了解可用於插入編碼DsbC的重組多核苷酸的合適技術。可使用合適的載體如pK03質粒，將編碼DsbC的重組多核苷酸整合入細胞基因組。在細胞包含編碼目的蛋白質的重組多核苷酸的實施方式中，本領域技術人員也了解可用於插入編碼目的蛋白質的重組多核苷酸的合適技木。可使用合適的載體如PK03質粒，將編碼目的蛋白質的重組多核苷酸整合入細胞基因組。備選地或另外地，編碼DsbC的重組多核苷酸和/或編碼目的蛋白質的重組多核苷酸可以不整合在重組表達盒中。在一個實施方式中，本發明採用了表達盒，以攜帶編碼DsbC和/或目的蛋白質的多核苷酸以及ー種或多種調控表達序列。所述ー種或多種調控表達序列可包含啟動子。所述ー種或多種調控表達序列還可包含3』不翻譯區如終止序列。合適的啟動子在下文詳細討論。在一個實施方式中，本發明採用表達盒以攜帯編碼目的蛋白質的多核苷酸和/或編碼DsbC的重組多核苷酸。表達盒一般包含ー種或多種調控表達序列、編碼ー種或多種目的蛋白質的ー種或多種編碼序列及/或編碼DsbC的編碼序列。所述ー種或多種調控表達序列可包括啟動子。所述ー種或多種調控表達序列還可包含3』不翻譯區如終止序列。合適的啟動子在下文詳細討論。在一個實施方式中，根據本發明的細胞包含ー種或多種載體，如質粒。載體優選地包含ー種或多種如上文限定的表達盒。在一個實施方式中，編碼目的蛋白質的多核苷酸序列和編碼DsbC的多核苷酸插入到ー個載體中。備選地，編碼目的蛋白質的多核苷酸序列和編碼DsbC的多核苷酸插入到分別的載體中。在目的蛋白質為包含重鏈和輕鏈的抗體的實施方式中，可以用兩種載體轉染細胞 系，第一種載體編碼了輕鏈多肽，第二種載體編碼重鏈多肽。備選地，可使用單ー載體，此載體包括編碼輕鏈和重鏈多肽的序列。備選地，編碼抗體的多核苷酸序列和編碼DsbC的多核苷酸插入到ー種載體。優選地，此載體包含編碼抗體的輕鏈和重鏈多肽的序列。在細胞還表達ー種或多種其他如下蛋白質的實施方式中， 一種或多種能夠促進細胞摺疊的蛋白質，如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD;和/或· ー種或多種能夠促進蛋白質分泌或易位的蛋白質,如SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY 和 Lep;和/或· ー種或多種能夠促進ニ硫鍵形成的蛋白質,如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。所述ー種或多種其他蛋白質可表達自ー種或多種與編碼DsbC的多核苷酸和/或編碼目的蛋白質的多核苷酸序列插入相同載體的多核苷酸。備選地，所述ー種或多種多核苷酸可插入分別的載體。用於本發明的載體可通過將如上文限定的一種或多種表達盒插入合適的載體而產生。備選地，用於指導多核苷酸序列表達的調控表達序列可包含於載體中，因此，要完整地構建載體只需要多核苷酸的編碼區域。合適地，編碼DsbC的多核苷酸和/或編碼目的蛋白質的多核苷酸插入可複製載體，一般為自主複製載體，以在細胞的合適的啟動子控制下在細胞內進行表達。本領域已知許多載體可用於此目的，選擇合適的載體取決於核酸大小以及特定的細胞類型。可用來將根據本發明的多核苷酸轉化入宿主細胞的載體的實例包括·質粒，如 pBR322 或 pACYC184 和/或·病毒載體如細菌噬菌體·轉座遺傳元件如轉座子這些載體通常包含DNA複製的質粒起點、抗生素選擇性標記物、啟動子以和及轉錄終止子，由多克隆位點分隔開(表達盒)以及編碼核糖體結合位點的DNA序列。本發明採用的啟動子可直接與相關的多核苷酸相連，或備選地可位於恰當的位置，例如位於載體中，使得當相關多核苷酸插入時，相關的啟動子可對其起作用。在ー個實施方式中，啟動子位於其作用的多核苷酸編碼部分之前，例如，相關的啟動子在多核苷酸各個編碼部分之前。如本文所使用的，「在……之前」意為啟動子位於相對編碼多核苷酸部分的5引物端。啟動子可以為宿主細胞內源或外源的。合適的啟動子包括Lac、tac、trp、PhoA、Ipp、Arab、Tet 和 T7。所使用的一種或多種啟動子可為可誘導啟動子。
在其中的編碼DsbC的多核苷酸及編碼目的蛋白質的多核苷酸插入ー個載體的實施方式中，編碼DsbC和目的蛋白質的核苷酸序列可處於單一的啟動子或分別的啟動子的控制之下。在其中編碼DsbC和目的蛋白質的核苷酸序列處於分別的啟動子控制下時，啟動子可為獨立的可誘導啟動子。用於細菌系統的表達單位通常還包含Shine-Dalgamo (S. D.)序列，其可操作地連接於編碼目的多肽的DNA。啟動子可通過限制性酶消化從細菌來源的DNA移除並插入包含所需的DNA的載體。在其中的多核苷酸序列包含用於兩種或更多目的蛋白質(例如抗體輕鏈和抗體重鏈)的兩種或更多編碼序列的本發明的實施方式中，多核苷酸序列可包含一個或多個內核糖體插入位點(IRES)序列，其使得能夠在mRNA的中間起始翻譯。IRES序列可位於編碼的多核苷酸序列之間，以增強mRNA分別翻譯而產生多種編碼的多肽序列。表達載體優選地還包含用於產生抗體或其抗原結合片段的雙順反子信息，如WO03/048208或W02007/039714 (其內容併入本文作為參考)中所描述。優選地，上遊的順反子包含編碼抗體輕鏈的DNA，下遊順反子包括編碼對應的重鏈的DNA，雙順反子基因間序列(IGS)優選地包含選自 IGSl (SEQ ID NO: 36)、IGS2 (SEQ ID NO: 37)、IGS3 (SEQ ID NO: 38)和 IGS4(SEQ ID NO:39)的序列。終止子可以是宿主細胞內源或外源的。合適的終止子為rrnB。進ー步的合適的轉錄調控子包括啟動子和終止子，蛋白質靶向方法可見於「strategies for Achieving High-Level Expression of benes in Escherichiacoli」 Savvas C. Makrides, Microbiological Reviews, Sept 1996,p 512-538。插入表達載體的DsbC多核苷酸優選地包含編碼DsbC信號序列的核酸以及DsbC編碼序列。所述載體優選地包含能夠使得載體在一種或多種所選的宿主細胞中複製的核酸序列，優選地，其能夠不依賴宿主染色體而複製。對於多種細菌這樣的序列已經熟知。在一個實施方式中，DsbC及/或目的蛋白質在N-端及/或C-端包含組氨酸標籤。抗體分子可分泌自細胞或通過合適的信號序列進入細胞周質。備選地，抗體分子可在細胞的細胞質內積累。優選地，抗體分子進入細胞周質。編碼目的蛋白質的多核苷酸可與另ー種多肽融合表達，另ー種多肽優選地為信號序列或其他在成熟多肽的N-端具有特異性剪切位點的多肽。所選擇的異源信號序列應當為可以被宿主細胞識別並加工的肽。對於不能識別並加工原生或真核多肽信號序列的原核宿主細胞，則用原核信號序列置換信號序列。合適的信號序列包括0mpA、PhOA、LamB、PelB、DsbA 和 DsbC。構建包含ー種或多種上文列出的組分的合適的載體採用了標準的連接技術。對分離的質粒或DNA片段進行剪切、加尾並連接為產生所需質粒要求的形式。在本發明ー個優選的實施方式中，本發明提供了多順反子載體，其包含編碼DsbC的多核苷酸序列以及編碼目的蛋白質的多核苷酸序列。多順反子載體可通過有利的克隆方法產生，其使多核苷酸序列以重複順序地克隆進入載體。所述方法利用了一對限制性位點的可兼容末端，如AseI和NdeI限制性位點的「AT」末端。包含編碼序列並具有可兼容粘性末端的多核苷酸如AseI-NdeI片段，可克隆入載體中的限制性位點，如Ndel。多核苷酸序列的插入破壞了 5』限制性位點但創造出一個新的3』限制性位點，如Ndel，然後可插入包含可兼容粘性末端的其他多核苷酸序列。此過程然後可進行重複以插入其他序列。插入載體的每段多核苷酸序列包含終止密碼子3』方向的非編碼序列，這段序列可包含Ssp I位點用以進行選擇、Shine-Dalgarno核糖體結合序列、富含A的間隔子和編碼起始密碼子的NdeI位點。構建包含編碼抗體輕鏈(LC)、抗體重鏈(HC)、DsbC多核苷酸序列以及進一步的多核苷酸序列的載體示意圖顯示於圖10。成功突變的菌株可使用本領域熟知的方法進行鑑定，包括菌落PCR DNA測序以及菌落PCR限制性酶切作圖。 在其中細胞包含兩種或更多種突變基因的實施方式中，突變的蛋白酶可在相同或不同載體上引入革蘭氏陰性細菌。在一個實施方式中，根據本發明的革蘭氏陰性細菌細胞不攜帶敲除突變OmpT基因，如染色體ompT缺陷。根據本發明的細胞可以進一歩包含編碼目的蛋白質的多核苷酸序列。編碼目的蛋白質的多核苷酸序列可以為外源或內源的。編碼目的蛋白質的多核苷酸序列可整合入宿主染色體或可非整合的存在於載體中，通常為質粒。在一個實施方式中，根據本發明的細胞表達目的蛋白質。「目的蛋白質」在本發明的上下文中意欲指代用於表達的多肽，通常為重組多肽。然而，目的蛋白質可以為表達自宿主細胞中內源基因的內源蛋白質。如本文所使用的，「重組多肽」指的是使用重組DNA技術構建或產生的蛋白質。目的蛋白質可以為表達自外源載體的與內源蛋白質同一的外源序列或其突變形式(例如，其具有減弱的生物活性)或其片段。備選地，目的蛋白質可為並非宿主細胞正常表達的異源蛋白質。目的蛋白質可以為任何合適的蛋白質，包括治療性、預防性或診斷性蛋白質。在一個實施方式中，目的蛋白質可用於治療包括炎性疾病及障礙、免疫疾病及障礙、纖維化障礙以及癌症在內的疾病或障礙。術語「炎性疾病」或「障礙」以及「免疫疾病或障礙」包括類風溼關節炎、牛皮癬關節炎、斯蒂爾病(still’s disease)、Muckle Wells病、牛皮癖、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、SLE(系統性紅斑狼瘡)、哮喘、過敏性關節炎、特應性皮炎、多發性硬化、脈管炎、I型糖尿病、器官移植以及移植物抗宿主病。術語「纖維化障礙」包括特發性肺纖維化(IPF)、系統性硬化(或硬皮病)、腎纖維化、糖尿病腎病、IgA腎病、高血壓、晩期腎病、腹膜纖維化(持續不臥床腹膜透析)、肝硬化、老年性黃斑退化症(ARMD)、視網膜病、心反應性纖維化、瘢痕、瘢痕瘤(keloid)、燒傷、皮膚潰瘍、血管成形術、冠狀動脈架搭橋術、關節成形術以及白內障手木。術語「癌，，包括產生自上皮的惡性新生生長，其見於皮膚，或更通常地見於身體器官內膜(lining)，例如乳腺、卵巣、前列腺、腎、胰腺、胃、膀胱或腸。癌傾向於浸潤進入臨近阻止病擴散(轉移)到遠處器官，例如至骨、肝臟、肺或腦。所述蛋白質可以為蛋白水解敏感型多肽，即，易於裂解、對裂解易感，或在原生狀態或在分泌過程中被一種或多種革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌、蛋白酶裂解。在一個實施方式中，目的蛋白質對選自DegP、蛋白酶III和Tsp的蛋白酶具有蛋白水解敏感性。在ー個實施方式中，目的蛋白質對蛋白酶Tsp具有蛋白水解敏感性。在一個實施方式中，目的蛋白質對蛋白酶DegP和蛋白酶III具有蛋白水解敏感性。在一個實施方式中，目的蛋白質對蛋白酶DegP和Tsp具有蛋白質水解敏感性。在一個實施方式中，目的蛋白質對蛋白酶Tsp和蛋白酶III具有蛋白質水解敏感性。在一個實施方式中，目的蛋白質對蛋白酶DegP、蛋白酶III和Tsp具有蛋白質水解敏感性。優選地，蛋白質為真核多肽。
由根據本發明的細胞表達的目的蛋白質可以是例如為免疫原，包含兩種異源蛋白質的融合蛋白質或抗體。作為目的蛋白質的抗體包括單克隆、多價、多特異性、人源化、全長人抗體或嵌合抗體。所述抗體可來自任何物種，但其優選地衍生自單克隆抗體、人抗體或人源化片段。抗體可衍生自免疫球蛋白分子的任何種型(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亞型，可獲自任何物種包括例如小鼠、大鼠、鯊魚、兔、豬、倉鼠、駱騎、美洲駝(Ilama)、山羊或人。抗體片段的各個部分可獲自超過ー種物種，例如，抗體片段可以是嵌合的。在ー個實施例中，恆定區來自一個物種而可變區來自另一物種。抗體可以為具有全長重鏈和輕鏈或其片段，例如VH、VL、VHH、Fab、修飾的Fab、Fab』、F(ab』)2、Fv、scFv片段、Fab-Fv的完整的抗體分子，或雙重特異性抗體如Fab_dAb，描述於 PCT/GB2008/003331。抗體可特異於任何靶標抗原。抗體可以為細胞相關的蛋白質，如細胞表面蛋白質，其存在於細胞上如細菌細胞、酵母細胞、T細胞、內皮細胞或腫瘤細胞；或其可為可溶性蛋白質。目的抗原也可為任何醫療相關蛋白質如在疾病或感染中上調的那些蛋白質，例如受體及/或其對應配體。細胞表面蛋白的具體實例包括粘附分子，例如整合素如β 整合素(如VLA-4)、E-選擇素、P-選擇素或L-選擇素、⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶7、⑶8、⑶I la、⑶I Ib、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、CD69、CD134 (0X40)、ICOS、BCMP7、CD137、CD27L、CDCPl、CSFl 或 CSFl-受體、DPCRl、DPCRl、dudulin2、FLJ20584、FLJ40787, HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、nectin-樣蛋白 2、NKCC1、PTK7、RAIGl、TCAMl、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、胚癌抗原(CEA)，人乳脂球蛋白(HMFG1和2)、1型MHC及II型MHC抗原、KDR和VEGF，恰當的時候還包括其受體。可溶性抗原包括白介素如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-14、IL-16或IL-17，如IL17A和/或IL17F，病毒抗原如呼吸道合胞體病毒或巨細胞病毒抗原，免疫球蛋白如IgE，幹擾素如α-幹擾素、幹擾素或Y-幹擾素，腫瘤壞死因子TNF(之前稱為腫瘤壞死因子-α )，腫瘤壞死因子-β，集落刺激因子如G-CSF或GM-CSF，以及血小板衍生生長因子如I3DGF-α和PDGF-β，恰當的時候還包括其受體。其他抗原包括細菌細胞表面抗原，細菌毒素，病毒如流感病毒、EBV、HepA、B和C，生化武器試劑，放射性核素和重金屬，以及蛇和蜘蛛毒液及毒素。
在一個實施方式中，抗體可用於功能性地改變目的抗原的活性。例如，抗體可直接或間接地中和、拮抗或抵消所述抗原的活性。在本發明的ー個方面，提供了重組的革蘭氏陰性細菌細胞，其包含編碼突變SPR蛋白質的突變SPR基因，野生型Tsp基因以及編碼特異於TNF的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸徐良。野生型染色體Tsp基因優選地為非重組染色體Tsp基因。優選地，細胞進ー步包含編碼DsbC的重組多核苷酸。在一個優選的實施方式中，由根據本發明的細胞表達的目的蛋白質為抗-TNF抗體，更優選地為抗-TNF Fab』，如W001/094585中所描述的(其內容併入本文作為參考)。在一個實施方式中，抗體具有針對人TNFa的特異性，其包含的重鏈中可變結構域包含的CDR具有SEQ ID NO: 28所示的CDRHl序列，SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 34所示的CDRH2序列或SEQ ID NO:30所示的CDRH3序列。在一個實施方式中，抗體包含的輕鏈中的可變結構域包含的⑶R具有SEQ ID NO: 31所示的CDRLl序列，SEQ ID NO: 32所示的CDRL2序列或SEQ ID NO: 33所示的CDRL3序列。上文提到的SEQ IDS N0S: 28及30-34給出的CDR衍生自小鼠單克隆抗體hTNF40。然而，SEQ ID N0:29由雜合⑶R構成。所述雜合⑶R包括來自小鼠單克隆抗體hTNF40的重鏈⑶R2的部分(SEQ ID NO:34)以及來自人3組種系區域V序列的重鏈⑶R2的部分。在一個實施方式中，抗體包含重鏈和輕鏈，其重鏈中可變結構域包含的⑶R具有SEQ ID NO: 28 所示的 CDRHl 序列，SEQ ID NO: 29 或 SEQ ID NO: 34 所示的 CDRH2 序列或 SEQID NO: 30所示的⑶RH3序列；其輕鏈中可變結構域包含的⑶R具有SEQ ID N0:31所示的CDRLl序列，SEQ ID NO:32所示的CDRL2序列或SEQ ID NO:33所示的CDRL3序列。在一個實施方式中，抗體包含SEQ ID NO:28所示的CDRHl，SEQ ID NO:29或SEQID N0:34所示的CDRH2，SEQ ID NO:30 所示的 CDRH3，SEQ ID NO:31 所示的 CDRLl，SEQ IDN0:32所示的CDRL2以及SEQ ID NO: 33所示的CDRL3。優選地，抗體包含SEQ ID NO: 29所示的CDRH2。抗-TNF抗體優選地為植入⑶R的抗體分子。在一個優選的實施方式中，可變結構域包含人受體框架區及非人供體⑶R。優選地，抗體分子具有針對人TNF(之前稱為TNF a )的特異性的抗體分子，其中輕鏈包含SEQ ID N0:11的輕鏈可變區，其中重鏈包含SEQ ID N0:12的重鏈可變區。 抗-TNF抗體優選地為Fab或Fab 』片段.優選地，具有針對人TNF的特異性的抗體分子是Fab』，並且具有的輕鏈序列包含或由SEQ ID NO: 13組成，重鏈序列包含或由SEQ ID N0:14組成。在表達後，抗體片段可進行進一歩加工，例如通過綴合至另外的實體，如效應子分子。例如，如本文所使用的術語效應子分子包括抗腫瘤試劑、藥物、毒素(如細菌或植物來源的酶活性毒素或其片段，例如蓖麻毒素及其片段)、生物學活性蛋白質例如酶、其他的抗體或抗體片段、合成或天然發生的多聚體、核酸及其片段(如DNA、RNA及其片段)、放射性核素(尤其是放射性碘素、放射性同位素)、螯合金屬、納米顆粒、及報告子基團如螢光化合物或可由NMR或ESR光譜檢測到的化合物。效應子分子可由任何合適的方法連接於抗體或其片段，例如抗體片段可經過修飾連接於至少一種效應子分子，如W005/003171或W005/003170(其內容併入本文作為參考)所描述的。W005/003171或W005/003170也描述
了合適的效應子分子。在一個實施方式中，如果有需要，抗體或其片段如Fab是PEG化的，以產生具有所需(例如與完全抗體類似)特性的產物。例如，抗體可以為PEG化的抗-TNF-a Fab』，如W001/094585中所描述的，優選地其在重鏈C末端的ー個半胱氨酸殘基上連接有賴氨醯-順丁烯ニ醯亞胺-衍生基團，其中賴氨酸殘基的兩個氨基基團中每個都與具有大約20，OOODa的分子量的甲氧基聚(こニ醇)殘基相連，這樣甲氧基聚(こニ醇)殘基的總平均分子量為大約40，OOODa,更優選地，所述賴氨醯-順丁烯ニ醯亞胺-衍生基團為[I-[ [ [2-[ [3- (2，5- ニ氧-I-批咯燒基)-1-氧丙基]氨基]こ基]氨基]-羧基]-1，5-戍燒ニ基]ニ·(亞胺擬基)。細胞還可包含編碼ー種或多種其他目的蛋白質的其他多核苷酸序列。在一個實施方式中，選擇ー種或多種在野生型時已知與目的重組蛋白質在純化中共純化的大腸桿菌宿主蛋白質進行遺傳修飾，如描述於Humphreys等人「Engineering of Escnerichia coli to improve the purification oi periplasmicFab』 fragments: changing the pi of the chromosomalIy encoded PhoS/PstSprotein」，Protein Expression and Purification 37 (2004) 109-118 和 W004/035792 (其內容併入本文作為參考)。使用這些修飾的宿主蛋白質改善了目的蛋白質(尤其是抗體)的純化過程，是通過改變所選的大腸桿菌蛋白質的物理特性使之不再與重組抗體共純化而在大腸桿菌中生產。優選地，受到改變的大腸桿菌蛋白質選自ー種或多種磷酸結合蛋白質(PhoS/PstS)、ニ肽結合蛋白質(DppA)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)和硫氧還蛋白質。在一個實施方式中，汙染性宿主蛋白質的物理特性通過向C端或N端添加胺基酸標籤得到改變。在一個優選的實施方式中，改變的物理屬性為等電點，胺基酸標籤為連接於C末端的多天冬氨酸標籤。在一個實施方式中，通過添加所示標籤得到改變的大腸桿菌蛋白質為ニ肽結合蛋白質(DppA)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、硫氧還蛋白和磷酸結合蛋白質(PhoS/PstS)。在一個特異性實施方式中，大腸桿菌磷酸結合蛋白質(PhoS/PstS)的pi通過添加多天冬氨酸標籤(PolyD)由7. 2減少至5. 1，其C端包含了 6個天冬氨酸的標籤。還優選地是對汙染性大腸桿菌蛋白質的特定殘基進行修飾以改變其物理特性，不管是單獨修飾還是與N或C末端添加標籤相結合。這些改變可包括插入或刪除以改變蛋白質大小，或胺基酸置換以改變PI或疏水性。在一個實施方式中，這些殘基位於蛋白質表面。在一個優選的實施方式中，改變了 PhoS蛋白質表面的殘基以降低蛋白質的pi。優選地，所提到的殘基對於磷酸結合(Bass，US5, 304，472)很重要，因此為了維持功能性PhoS蛋白質要儘量避開。優選地，靶向的是那些伸出蛋白質表面很遠或在鹼性殘基大基團之內或附近的賴氨酸殘基。在一個實施方式中，PhoS蛋白質具有連接於C末端的六聚多天冬氨酸標籤，而分子相反的末端上帝表面殘基用於置換。優選地，所選的賴氨酸殘基置換為穀氨酸或天冬氨酸以形成比將中性殘基變為酸性殘基更大的Pl電勢變化。本文對於置換突變體的標記由字母+數字+字母構成。第一個字母標記野生型蛋白質中的胺基酸。數字指的是做出胺基酸置換的胺基酸位置，第二個字母標記用於置換野生型胺基酸的胺基酸。在本發明優選的PhoS突變中，275、107、109、110、262、265、266、309、313號賴氨酸殘基(K)以單ー或組合突變的形式置換為穀氨酸(E)或穀氨醯胺(Q)，另外，318號賴氨酸(K)可以單ー或組合突變的形式置換為天冬氨酸(D)。優選地，單ー突變為K262E、K265E和K266E。優選地，組合突變為K265/266E和K110/265/266E。更優選地，所有突變都與連接於C端的多天冬氨酸(polyD)標籤相組合，優選地還與K318D置換相組合。在一個優選的實施方式中，這些突變導致Pl降低至少2個單位。優選地，本發明的突變將PhoS的pi從7. 2降低至大約4-大約5. 5。在本發明的一個實施方式中，使用突變polyD K318D、polyD K265/266E和polyDK110/265/266E分別將大腸桿菌PhoS蛋白質的pi從7. 2降低至大約4. 9、大約4. 8以及大約 4. 5。編碼 目的蛋白質的多核苷酸可以以與另ー種多肽融合的形式表達，另ー種多肽優選地為信號序列或其他在成熟多肽的N端有特異性剪切位點的多肽。所選的異源信號序列應當為可由宿主細胞識別並加工的序列。對於不能識別和加工原生或真核多肽信號序列的原核宿主細胞，信號序列由原核信號序列置換。合適的信號序列包括OmpA、PhoA、LamB,PelB、DsbA 和 DsbC。只要相關方面能適用於這些實施方式，則本文描述的本發明的實施方式關於所述多核苷酸方面對本發明備選實施方式同等適用，例如載體、表達盒及/或包含其中所採用的組分的宿主細胞。本發明還提供了用於生產目的重組蛋白質的方法，包括在有效表達目的重組蛋白質的條件下，於培養基中培養如上文所描述的革蘭氏陰性細菌細胞，以及從重組革蘭氏陰性細菌細胞的細胞周質和/或培養基中回收所述目的重組蛋白質。在一個實施方式中，其中細胞包含編碼DsbC的重組多核苷酸，細胞是在有效表達編碼DsbC的重組多核苷酸的條件下進行培養的。本發明的方法中優選採用的革蘭氏陰性細菌細胞及目的蛋白質已在上文詳細描述。當編碼目的蛋白質的多核苷酸是外源吋，多核苷酸可使用任何本領域已知的合適方式併入宿主細胞。編碼DsbC的多核苷酸序列也可使用任何本領域已知的合適的方式併入宿主細胞。一般地，多核苷酸作為轉化入細胞的表達載體的一部分而併入。因此，在一方面，根據本發明的細胞包含含有編碼目的蛋白質的多核苷酸的表達盒以及含有編碼DsbC的多核苷酸的表達盒。編碼目的蛋白質的多核苷酸序列以及編碼DsbC的多核苷酸序列可使用標準技術轉化入細胞，如使用氯化銣、PEG或電穿孔方法。根據本發明的方法還可採用選擇系統以促進對成功轉化有編碼目的蛋白質的多核苷酸的穩定細胞進行選擇。選擇系統一般採用編碼選擇性標記物的多核苷酸共轉化。在一個實施方式中，每種轉化入細胞的多核苷酸進一歩包含編碼ー種或多種選擇性標記物的多核苷酸序列。因此，轉化編碼目的蛋白質的多核苷酸和任選的編碼DsbC的多核苷酸以及編碼標記物的一種或多種多核苷酸可同時發生，然後採用選擇系統以選擇產生所需的蛋白質的細胞。能夠表達所述ー種或多種標記物的細胞能夠在特定人工設置的條件下存活/生長/擴增，例如在添加毒素或抗生素條件下，因為其中併入的多肽/基因或選擇系統的多肽組分提供了某些特性(例如，抗生素抗性)。不能表達所述一種或多種標記物的那些細胞則不能在這些人工設置的條件下存活/生長/擴增。可根據需要選擇更嚴格或不那麼嚴格的的人工設置條件。本發明可採用任何合適的選擇系統。一般地，選擇系統可基於包括在載體中的一種或多種提供對已知抗生素抗性的基因，例如四環素、氯黴素、卡那黴素或氨苄青黴素基因。選擇在相關抗生素存在下生長的細胞，因為其表達提供對抗生素抗性的基因以及所需要的蛋白質。在本發明中可使用可誘導表達系統或組成型啟動子以表達目的蛋白質及/或DsbC。在一個實施方式中，通過向培養基中添加誘導子，誘導編碼目的蛋白質的多核苷酸序列以及編碼DsbC的重組多核苷酸的表達。合適的可誘導表達系統以及組成型啟動子在本領域熟知。可使用任何適合的培養基培養轉化的細胞。可為具體的選擇系統採用恰當的培養基，例如培養基可以包含抗生素以使只有已經成功轉化的細胞能夠在培養基中生長。
根據需要，可對獲自培養基的細胞進行進ー步的選擇和/或純化。根據需要，此方法可進ー步包括一個或多個提取及純化目的蛋白質的步驟。可從菌株中回收多肽，包括從細胞質、細胞周質及/或上清中。用於純化蛋白質的具體方法取決於蛋白質類型。合適的方法包括在免疫親和或離子交換柱上的分級；こ醇沉澱；反相HPLC;疏水相互作用色譜；矽色譜；離子交換樹脂色譜如S-SEPHAR0SE和DEAE;層析聚焦；硫酸銨沉澱；以及凝膠過濾。在一個實施方式中，所述方法進ー步包括將目的重組蛋白質與DsbC分離。可通過常規抗體純化步驟，合適地將抗體與培養基和/或細胞質提取物和/或細胞周質提取物分離，例如，通過蛋白質A-瓊脂糖凝膠、蛋白質G色譜，蛋白質L色譜，嗜硫的、混合形式的樹脂，His-標籤，FLAG標籤，羥磷灰石色譜，凝膠電泳，透析，親和色譜，硫酸銨、こ醇或PEG分餾/沉澱，離子交換膜，擴張的床吸附色譜(EBA)或模擬移動床色譜。所述方法還可以包括進ー步的步驟，測量目的蛋白質表達量以及選擇具有高表達水平的目的蛋白質的細胞。此方法還可包括ー個或多個其他下遊加工步驟，如對目的蛋白質如抗體或抗體片段進行PEG化。本文所描述的ー個或多個方法步驟可在合適的容器如生物反應器中組合進行。實施例實施例I——產生細胞菌株MXE001 ( Δ Tsp)通過如下方法產生MXE001菌株將Tsp盒以Sal I、Not I限制性片段的形式移至進行了類似的限制性酶切的pK03質粒內。ρΚ03質粒使用pSClOl的溫度敏感型突變體的複製起點(RepA)以及氯黴素標記物以加強和選擇染色體整合事件。編碼果聚糖蔗糖酶的sacB基因對生長於蔗糖上的大腸桿菌是致死的，因此(與氯黴素標記物及PSClOl起點一同)用於加強並選擇去整合以及質粒消除。此方法理論在之前有所描述(Hamilton等人，1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622 以及 Blomfield 等人，1991，MolecularMicrobiology, 5，1447-1457)。除了插入的基因之外，pK03系統將所有選擇性標記物從宿主基因組移除。構建了以下質粒。PMXE191 :包含如SEQ ID NO: 3所示的敲除突變Tsp基因，其包含EcoRI和AseI限制性標記物。然後將質粒轉化入電感受態大腸桿菌W3110細胞,其使用Methods in MolecularBiology, vol. 47, Nickoloff, J. A. (ed. ), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)中Miller, E. M.和 Nickoloff, J. A.，「Escherichia coli electrotransformation，，的方法進行製備。第I天將40 μ I的大腸桿菌細胞與(IOpg) I μ I的pK03DNA混合於冰冷的BioRadO. 2cm電穿孔小杯，然後以2500V、25yF、200Q進行電穿孔。立即加入1000 μ I的2xPY，細胞在培養箱中30°C下、250rpm搖I小時進行復甦。將細胞進行1/10的系列稀釋在2xPY中，然後將100 μ I的等分試樣鋪於30°C和43°C下預熱的、含有20 μ g/ml氯黴素的2xPY瓊脂 平板。將平板在30°C和43°C下孵育過夜。第2天在30°C下生長的菌落數量給出電穿孔效率的估算值，而在43°C下存活生長的菌落代表潛在的整合事件。挑取43°C平板上的単一菌落並重懸於IOml的2xPY中。將100 μ I的懸液鋪於含有5%(w/v)蔗糖並預熱到30°C的2xPY瓊脂平板上以產生單菌落。將平板在30°C V孵育過夜。第3天此時的菌落代表了潛在的自發去整合及質粒消除的事件。如果去整合和消除事件在生長早期發生，則所述克隆實體的大部分是純系的(clonal)。挑取單ー菌落並將其複製物鋪於含有20 μ g/ml氯黴素或5%(w/v)蔗糖的2xPY瓊脂平板。將平板在30°C下孵育過夜。第4天在蔗糖上生長且在氯黴素中死亡的菌落代表了潛在的染色體置換質粒消除事件。挑取這些菌落並通過使用突變特異性寡核苷酸的PCR進行篩選。將產生具有正確大小陽性PCR條帶的菌落劃線至含有5%(w/v)蔗糖的2xPY瓊脂平板上並將平板在30°C孵育過夜產生單ー菌落。第5天使用PCR陽性、氯黴素敏感型以及蔗糖抵抗型大腸桿菌的單菌落製作甘油貯備株，製作化學感受態細胞並用作PCR模板用於使用5』和3』兩側的寡核苷酸的PCR反應，以產生PCR產物用於使用Taq聚合酶的直接的DNA測序。通過對包含非天然發生Ase I限制性位點的Tsp基因區域(如圖la、lb、lc所示)使用寡核苷酸引物進行PCR擴增，以測試細胞菌株MXE001以確認基因組DNA是否成功修飾為攜帶突變Tsp基因。隨後將擴增的DNA區域與限制性酶Ase I孵育，然後通過瓊脂糖凝膠電泳分析孵育之前和孵育之後DNA所擴增的區域以確認非天然發生的Ase I限制性位點是否存在於突變的基因中。此方法按如下步驟進行使用PCR及以下寡核苷酸對從MXE001和W3110的大腸桿菌細胞裂解物的製備的基因組DNA進行擴增6284Tsp3， 5， -GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC-3』 (SEQ ID NO:15)6283Tsp5， 5』 -GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3， (SEQ ID NO:16)通過將單克隆細胞在20ul Ix PCR緩衝液中於95°C下加熱10分鐘製備裂解物。使混合物冷卻至室溫，然後在13，200rpm下離心10分鐘。移除上清並貼上「細胞裂解物」的標籤。使用Tsp寡核苷酸對擴增各菌株。使用標準PCR步驟擴增DNA。
Snl緩衝液 xlO (Roche)
IuIdN I P 潘合_ ( Eoche，IOinM mix)
l.SuI5』寡核苷酸(Spmol)UuI3』寡核著酸(5p_U
2ul細胞裂解物
(KSiilTaq DNA 聚合酶(Roche 5U/ul)
38.Snl H 20PCR 循環。
94 V I分鐘94 V I分鐘)
55 V I分鐘)重複進行30個循環
72 V I分鐘)
72 V 10分鐘反應完成時，將25ul移至新離心管用Ase I進行消化。向25ul的PCR反應物中加入19ul的H20、5ul緩衝液3 (NEB)Uul的Ase I (NEB)，混合，在37°C下孵育2小時。向餘下的PCR反應物中加入5ul上樣緩衝液(x6)，取出20ul上樣於0. 8%TAE200ml瓊脂糖凝膠(Invitrogen)加溴化乙錠(5ul的10mg/ml儲備液),並於100伏電泳I小時。最後一個泳道上樣IOul的分子量標記物(Perfect DNA marker 0. l_12Kb, Novagen)。在Ase I消化完成時，加入IOul上樣緩衝液(x6)，取20ul上樣於0. 8%TAE瓊脂糖凝膠(Invitrogen)加溴化乙錠(5ul的10mg/ml儲備液)並於100伏下電泳I小時。最後一個泳道加入了 IOul的分子量標記物(Perfect DNA marker 0. l_12Kb, Novagen)。兩塊膠都使用UV透照儀進行觀察。擴增的基因組片段顯示Tsp的正確條帶大小，2. 8kb。以Ase I消化後確認了在Tsp缺陷菌株MXEOOl中存在有引入的Ase I限制性位點，而在W3110對照中沒有。MXEOOl:使用Tsp引物組擴增的基因組DNA，並將擴增所產生的DNA用Ase I消化，產生2. 2和0. 6Kb的條帶。W31IOPCR擴增的DNA無法由Ase I限制性酶進行消化。實施例2 -產牛SDr突奪體使用互補測定法產生並選擇spr突變。使用C:IO丨1 tee丨1i(隨機誘變多樣性PCR試劑盒將Spr基因突變，該試劑盒在每IOOObp引入1-2個突變。將突變SPR PCR DNA克隆入表達CDP870Fab』及spr突變體的可誘導表達載體[pTTO⑶P870]。然後將此連接產物電轉化至使用Miller，E.M.和Nickoloff,J. A.，「Escherichia coli electrotransformation，」在Methods in MolecularBiology, vol. 47, Nickoloff, J. A. (ed. ), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)中的方法製備的大腸桿菌菌株MXEOOl (ATsp)。使用以下的操作流程將40ul的電感受態MXE001、2. 5ul的連接產物(IOOpg的DNA)加入0. 2cm的電穿孔小杯,使用BioRad Genepulser Xcell在2500V、25iiF、200Q的條件下進行電轉化。電轉化後，加入Iml的S0C(Invitrogen)(預熱至37°C)並對細胞輕柔搖動，使之在37°C下復甦I小時。將細胞鋪於低滲瓊脂糖平板(5g/L酵母提取物、2. 5g/L蛋白腖、15g/L瓊脂(皆為Difco)並於40°C孵育。將形成菌落的細胞在43°C下重新鋪於HLB以確認MXEOOl菌株重新獲得了在高溫低滲條件下生長的能力。從所選的克隆製備質粒DNA並對其測序以鑑定spr
突變。
使用此方法分離出與ATsp表型互補的spr蛋白質的八個單一突變、一個雙突變以及兩個多重突變，如下I. V98E2. D133A3. V135D4. V135G5. G147C6.S95F 和 Y115F7. I70T8. N31T、Q73R、R100G、G140C9. R62C、Q99P、R144C10. L108S11. L136P
_2] 實施例3-產生攜帶spr突變的突變體大腸桿菌細胞菌株使用實施例2中鑑定的spr的1_5號個體突變以及三個催化三分子突變(C94A，H145A，H157A)和W174R產生新菌株，使用野生型W3110大腸桿菌菌株(基因型F-LAM-IN (rrnD-rrnE) lrphl (ATCC號27325))產生攜帶野生型非重組染色體Tsp基因的spr突變菌株或使用來自實施例I的MXEOOl ( A Tsp)菌株產生A Tsp/突變SPR組合突變菌株。以下突變體大腸桿菌細胞菌株是使用基因置換載體系統產生的，使用的是pK03同源重組 / 置換質粒(Link 等人，1997，Journal of Bacteriology, 179，6228-6237),如實施例I中用於產生MXEOOl的方法。表I.
權利要求
1.重組革蘭氏陰性細胞，其包含編碼突變spr蛋白質的突變spr基因，並且其中細胞包含非重組野生型染色體Tsp基因。
2.根據權利要求I的細胞，其中所述突變spr基因編碼的spr蛋白質在選自Hl45、N31、R62、170、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、G147、H157和W174的ー個或多個胺基酸處具有突變。
3.根據權利要求2的細胞，其中所述突變spr基因編碼的spr蛋白質具有選自H145A、N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、G147C、H157A 和 W174R 的ー個或多個突變。
4.根據權利要求3的細胞，其中所述spr蛋白質的ー個或多個突變選自S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D、V135G 和 G147C。
5.根據權利要求4的細胞，其中所述突變spr基因編碼的spr蛋白質具有突變S95F和Y115F。
6.根據權利要求3的細胞，其中所述spr蛋白質突變為H145A。
7.根據任何前述權利要求的細胞，其中除了突變spr基因外，所述細胞與野生型細菌細胞是同基因的。
8.根據任何前述權利要求的細胞，其中所述細胞進ー步包含編碼DsbC的重組多核苷酸。
9.根據權利要求1-8中任何ー項的細胞，其中所述細胞進ー步包含ー種或多種以下突變基因 a.編碼具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白質的突變DegP基因； b.突變Ptr基因，其中所述突變ptr基因編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白質或其為敲除突變Ptr基因；以及 c.突變OmpT基因，其中所述突變OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質或其為敲除突變OmpT基因。
10.根據任何前述權利要求的細胞，其中所述細胞為大腸桿菌。
11.根據任何前述權利要求的細胞，其中所述細胞包含編碼目的蛋白質的多核苷酸序列。
12.根據權利要求11的細胞，其中所述細胞包含的載體含有編碼DsbC的重組多核苷酸 以及編碼目的蛋白質的多核苷酸序列。
13.根據權利要求12的細胞，其中所述載體包含控制編碼DsbC的重組多核苷酸以及編碼目的蛋白質的多核苷酸序列的表達的啟動子。
14.根據權利要求11-13中任何ー項的細胞，其中所述目的蛋白質為抗體或其抗原結合片段。
15.根據權利要求14的細胞，其中所述抗體或其抗原結合片段對TNF具有特異性。
16.重組革蘭氏陰性細菌細胞，其包含編碼突變spr蛋白質的突變spr基因、野生型Tsp基因以及編碼對TNF具有特異性的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸序列。
17.根據權利要求16的細胞，其中所述細胞包含編碼DsbC的重組多核苷酸。
18.用於生產目的重組蛋白質的方法，包括於培養基中在能夠有效表達目的重組蛋白質的條件下，培養權利要求1-17中任何ー項限定的重組革蘭氏陰性細菌細胞，以及從所述重組革蘭氏陰性細菌細胞的細胞周質和/或培養基中回收目的重組蛋白質。
19.根據權利要求18的方法，其中所述目的重組蛋白質回收自細胞周質和/或上清。
20.根據權利要求18或19的方法，其中所述細胞包含編碼DsbC的重組多核苷酸，且細胞培養於能夠有效表達編碼DsbC的重組多核苷酸的條件下。
21.根據權利要求20的方法，其中編碼目的蛋白質的多核苷酸序列以及編碼DsbC的重組多核苷酸的表達是通過向培養基中添加誘導子而進行誘導的。
22.根據權利要求20或權利要求21的方法，其中所述方法進ー步包括將目的重組蛋白質與DsbC相分離。
全文摘要
本發明提供了重組革蘭氏陰性細菌細胞，其包含編碼突變SPR蛋白質的突變SPR基因，且其中的細胞包含非重組野生型染色體Tsp基因。
文檔編號C12N15/70GK102712694SQ201180005972
公開日2012年10月3日 申請日期2011年1月13日 優先權日2010年1月14日
發明者D·P·哈姆費雷斯, M·埃裡斯 申請人:Ucb醫藥有限公司