用血管內皮生長因子受體拮抗劑抑制腫瘤生長的聯合療法的製作方法

2023-04-24 00:42:51 1

專利名稱：用血管內皮生長因子受體拮抗劑抑制腫瘤生長的聯合療法的製作方法
技術領域：
本發明涉及利用血管內皮生長因子(VEGF)受體拮抗劑與化療劑，放療，和/或其 它生長因子受體拮抗劑聯合治療腫瘤的方法。
背景技術：
血管發生是指毛細血管從預先存在於胚胎和成體生物中的血管形成，已知血管發 生是腫瘤生長，存活和轉移的重要因素。生長因子及其受體，包括表皮生長因子(EGF)，轉 化生長因子-α (TGF-α)，轉化生長因子-β (TGF-β )，酸性和鹼性成纖維細胞生長因子 (aFGF和bFGF)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，和血管內皮生長因子(VEGF)在腫瘤的血管 發生中發揮作用。見 Klagsbrun&D，Amore ,Annual Rev. Physiol.，53 :217-239 (1991)。這 些生長因子與其細胞表面受體的結合可誘導受體活化，引發並修飾信號轉導途徑，導致細 胞增殖和分化。VEGF，一種內皮細胞-特異性促有絲分裂劑，則與這些因子不同，這是因為 它是通過特異性促進內皮細胞增殖而作為血管發生誘導劑起作用的。VEGF是一種由兩個23kD的亞單位組成的同種型二聚糖蛋白，而且它是一種較強 的血管滲透性誘導劑，內皮細胞遷移和增殖的刺激劑，對於新形成的血管而言是重要的存 活因素。VEGF有4種不同的單體同種型，它們是從mRNA的可變剪接產生的。它們包括兩種 膜結合形式(VEGF2tlf^PVEGF189)和兩種可溶形式(VEGF16JPVEGF121)t5在除胎盤外的所有人 類組織中，VEGF165同種型的含量最高。VEGF是血管發生的重要調節劑，血管發生是指新血管由於內皮前體的原位分 化(成血管細胞)而從頭髮育，VEGF在胚胎組織(Breier等，Development (Camb. ),114 521 (1992))，巨噬細胞，以及傷口癒合過程中的增殖表皮角質形成細胞(Brown等，J. Exp. Med. , 176 :1375(1992))中表達，而且涉及與炎症有關的組織水腫O^errara等，Endocr. Rev. , 13 :18 (1992))。原位雜交研究已經證實，VEGF在很多人腫瘤系中高水平表達，包括多 形性成膠質細胞瘤，成血管細胞瘤，中樞神經系統瘤和AIDS-相關性卡波濟氏肉瘤(Plate等，(1992)Nature 359 :845-848 ；Plate 等(1993)Cancer Res. 53 :5822-5827 ；Berkman 等 (1993) J. Clin. Invest. 91 :153-159 ；Nakamura ^ (1992)AIDS Weekly, 13(1)) 高水平的 VEGF也可在低氧誘導的血管發生中觀察到(Stiweiki等，(1992)Nature 359:843-845)。VEGF的生物反應是通過其高親和性受體介導的，它們在胚胎發生(Millauer， Cell, 72 :835-846(1993))和腫瘤形成過程中的內皮細胞上選擇性表達。VEGF受體 (VEGFRs)通常是III類受體型酪氨酸激酶，其特徵在於它們氨基末端的胞外受體配體 結合域中有若干，通常是5或7個免疫球蛋白樣的環(Kaipainen等，J. Exp. Med. , 178 2077-2088(1993))。另外兩個區包括一個跨膜區和一個羧基末端胞內催化域，其可被不 同長度的親水性內激酶(interkinase)序列的插入，也稱作激酶插入域斷開(Terman等， Oncogene，6 1677-1683 (1991))。VEGFRs 包括由 Shibuya 等，Oncogene, 5 :519-524(1990) 測序的fins樣酪氨酸激酶受體(flt-1)，或VEGFR-1，在1992年2月20日提交的 W092/14248，和 iTerman 等，Oncogene，6 :1677-1683(1991)中描述，並由 Matthews 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :9026-9030 (1991)測序的，含有激酶插入域的受體/胎兒肝激酶 (KDR/flk-Ι)，或VEGFR-2，當然其它受體，如neuropilin-1和-2也能結合VEGF。其它酪氨 酸激酶受體，VEGFR-3 (flt-4)，可結合VEGF的同源物VEGF-C和VEGF-D，而且在淋巴管的發 育中更為重要。高水平的Flk-I是由浸潤神經膠質瘤的內皮細胞表達的(Plate等，(1992) Nature 359:845-848)。Flk-I的水平可被人成膠質細胞瘤產生的VEGF特異性上調(Plate等， (1993)CancerRes. 53 :5822-5827)。Flk-I在與內皮細胞(GAEC)有關的成膠質細胞瘤中的 高水平表達表明，受體活性很可能是在腫瘤形成過程中被誘導的，這是因為在正常的腦內 皮細胞中幾乎檢測不到Flk-I轉錄物。這種上調被限定在與腫瘤很近的血管內皮細胞。用 中和抗-VEGF單克隆抗體(mAbs)阻斷VEGF活性可抑制人腫瘤的異種移植物在裸鼠中生長 (Kim等，(199;3)Nature 362 :841-844)，從而表明VEGF在與腫瘤有關的血管發生中的直接 作用。雖然VEGF配體在腫瘤細胞中是上調的，而且其受體在浸潤腫瘤的血管內皮細胞 中也是上調的，但VEGF配體及其受體在與血管發生無關的正常細胞中的表達水平較低。因 此，這種正常細胞不會由於阻斷VEGF及其受體間的相互作用而受到影響，從而抑制血管發 生及腫瘤生長。本發明的目的是提供VEGF受體的拮抗劑。本發明另一個目的是提供使用這種 VEGF受體拮抗劑，特別是使用這種VEGF受體拮抗劑與放療，化療或其它受體拮抗劑聯合抑 制血管發生，由此抑制或減輕哺乳動物腫瘤生長的方法。

發明內容
本發明提供通過給予治療有效量的VEGF受體拮抗劑和其它受體拮抗劑的聯合而 減輕或抑制哺乳動物腫瘤生長的方法。本發明還提供通過給予治療有效量的VEGF受體拮 抗劑和放療的聯合而減輕或抑制哺乳動物腫瘤生長的方法。此外，本發明提供通過給予治 療有效量的VEGF受體拮抗劑和化療劑的聯合而減輕或抑制哺乳動物腫瘤生長的方法。


圖1 用單克隆抗體DC-101使flk-1 (VEGFR-2)/SEAPS免疫沉澱的蛋白質印跡證 實DC-101可使鼠flk-1 =SEAPS免疫沉澱，但不能使單獨的SEAPS免疫沉澱。圖加和2b 圖2a 競爭性抑制測定法，表示抗_f lk_l (VEGFR-2)單克隆抗體 DC-101對VEGF165誘導的轉染3T3細胞中f lk_l (VEGFR-2) /fms受體磷酸化的作用。圖2b VEGF誘導的flk-1 (VEGFR-2)/fms受體磷酸化對單克隆抗體DC-101所致抑制的敏感性。 C441細胞是在最大刺激濃度的VEGF165GOng/ml)及不同水平抗體的條件下測定的。圖 3a 和 3b 圖 3a 在有 mAb DC-IOl 存在時，VEGF-誘導的 flk-1 (VEGFR-2) /fms 受體磷酸化的滴定。C441細胞是在有(1-4道)或沒有(5-8道)5 μ g/ml mAb DC-IOl存 在時，用指定濃度的VEGF刺激的。在有抗體(9道)存在時測定的未受刺激的細胞用作對 照。圖北是相對於各VEGF濃度繪製的，圖3a各道中磷酸化受體水平的光密度測定掃描 圖，該圖顯示過量配體濃度對mAb的抑制程度。用於檢測的細胞溶解產物是按照下面實施 例所述，通過抗-磷酸酪氨酸製備的。圖 4 通過預結合的 mAb DC-IOl 抑制 VEGF-flk-l (VEGFR-2) /fms 的活化。C441 細 胞是在沒有(3道和4道)和有(5道和6道)DC-IOl時，用指定濃度的VEGF刺激的。未受 刺激的細胞(1道和2道)用作對照。MAb是在兩組條件下測定的。對於P而言，細胞與mAb 預結合，接著室溫用VEGF刺激15分鐘。對於C而言，同時加入mAb和配體，並按照上面所 述進行測定。圖5 用不同濃度的單克隆抗體DC-IOl和成膠質細胞瘤細胞的條件培養基(GB CM)處理VEGF-誘導的flk-1 (VEGFR-2) /fms受體磷酸化。圖 6 對抗-flk-1 (VEGFR-2) mAb 與 flk_l (VEGFR-2)/fms 轉染的 3T3 細胞 (C441)的結合進行FACS分析。把轉染的flk-1 (VEGFRD/fms3T3細胞與10 μ g/ml的 抗-flk-1 (VEGFR-2)mAb DC-IOl或同種型匹配的無關抗-flk-lmAb 23H7—起放在冰上溫 育60分鐘。洗滌細胞，用5 μ g與FITC偶聯的山羊抗-小鼠IgG再溫育，洗滌，並通過流式 細胞術進行分析，確定抗體結合。數據表示與使用無關mAb 23H7檢測到的相比，DC-IOl對 C441細胞的螢光水平。圖7:mAb DC-101與f lk_l (VEGFR-2)/fms受體在轉染的3T3細胞系C441上的飽和 結合。4°C時，使匯合的C441細胞與濃度逐漸增加的mAb DC-101 (50ng/ml-2 μ g/ml)在M 孔平板中溫育2小時。洗滌細胞，用5yg抗-大鼠IgG-生物素偶聯物溫育。為了檢測結 合，洗滌細胞，用1 1000稀釋的鏈黴抗生物素-HRP溫育，洗滌，並在比色檢測系統(TMB) 中溫育。數據代表mAb DC-IOl的濃度逐漸增加時，540nm處的吸光度。除去每次測定中第 二抗體與單獨細胞的結合是為了對非-特異性結合進行調整。數據代表三次獨立實驗的平 均值。圖 8 磷酸化 flk-1 (VEGFR-2) /fms 從 VEGF 刺激的 flk_l (VEGFR-2) /fms 轉染的 3T3細胞中的免疫沉澱。細胞是按照實驗過程所述用VEGF刺激的，溶解產物是用下列無關 或相關抗體免疫沉澱的1.大鼠抗-FLK2 IgG2a(mAb 2A13) ；2.大鼠抗-flk_l (VEGFR-2) IgGl (mAb DC-101) ；3.大鼠抗-FLK2IgGl (mAb 23H7) ；4.兔抗-fms 多克隆抗體。免疫沉澱 蛋白經過SDS PAGE，接著經過蛋白質印跡分析。VEGF活化受體的免疫沉澱是通過用抗-磷 酸酪氨酸抗體探測印跡而檢測的。
圖9 =VEGF-誘導的flk_l (VEGFR-2) /fms受體磷酸化對mAb DC-101抑制的敏感 性。預結合及競爭性測定法是在指定抗體濃度下，用40ng/ml VEGF進行的。用於受體檢測 的細胞溶解產物是按照下面實施例所述用抗磷酸酪氨酸製備的。圖10 :mAb DC-101對CSF-1誘導的fms受體磷酸化的作用。在(B)中，fms/FLK_2 轉染的3T3細胞系，10A2,是在沒有(3道和4道)和有(5道和6道)5 μ g/ml的mAb DC-101 時，用最優刺激水平的CSF-I刺激的。在沒有(1道)或有位道)抗體時測定的未受刺激的 細胞用作對照。用於檢測的細胞溶解產物是按照下面實施例所述通過抗磷酸酪氨酸製備的。圖11 活化flk-1 (VEGFR-2) /fms受體的mAb DC-101中和的特異性。C441細胞是 在有DC-101 (IgGl)或無關抗-FLK-2大鼠單克隆抗體2A13(IgG2a)或23H7 (IgGl)存在時， 用20或40ng/ml VEGF刺激的。測定法是在競爭性道)或預結合(9_11道)條件下， 在沒有VEGF(l-3道)和有VEGF存在時，用各個抗體進行的。用於檢測的細胞溶解產物是 按照下面實施例所述，通過抗磷酸酪氨酸製備的。分離印跡，並使用fms受體C-末端區的 兔多克隆抗體對印跡進行再次探測，從而檢測flk-1 (VEGFR-2)/fms受體。圖12 磷酸化受體帶從VEGF刺激的HUVEC細胞中的免疫沉澱。HUVEC細胞在內皮 生長培養基(EGM)中生長3天，期間不更換培養基，直到細胞亞匯合。受體形式是利用mAb DC-101從未受刺激的細胞(1道)，VEGF刺激的細胞O道)，以及在有1 μ g/ml肝素(3道) 存在時，用VEGF刺激的細胞的溶解產物中免疫沉澱出來的。磷酸化受體形式的磷酸化測定 法，免疫沉澱法，和檢測是按照實驗過程所述進行的。圖13 :mAb DC-101對反應於VEGF的HUVEC細胞增殖的作用。細胞按照圖6的說 明生長48小時。然後細胞經過下列測定條件不向培養基中加入任何物質(未處理過的)； 更換新鮮的內皮生長培養基(完全培養基)；在沒有或有ι μ g/ml肝素存在時，加入IOng/ ml VEGF ；在有1 μ g/ml DC-101存在時測定VEGF和VEGF-肝素處理過的細胞。用於進行增 殖測定的細胞是使用細胞增殖測定試劑盒(Promega)，通過在550nm處進行比色檢測而測 定的。圖1 和14b:圖14a:用DC-101 (大鼠抗-flk-Ι單克隆抗體)減輕個體動物的腫 瘤生長。圖14b 用對照的2A13組(大鼠抗-flk-2單克隆抗體)減輕個體動物的腫瘤生長。圖15 用人成膠質細胞瘤的細胞系GBM-18給無胸腺裸鼠皮下注射，並把它們分成 三組PBS對照組，無關大鼠IgGl對照23H7組，和DC-101。治療是用腫瘤異種移植物皮下 給予的，並持續4周。圖 16 表示不同的 scFv抗體(plCll，plF12，p2A6和p2A7)與固定化KDR(VEGFR_2) 直接結合的曲線圖。圖 17 表示通過不同的 scFv抗體(plCll，plF12，p2A6和p2A7)抑制KDR(VEGFR-2) 與固定化VEGF165結合的曲線圖。圖18 表示通過scFv抗體(p2A6和plCll)抑制VEGF-誘導的HUVEC增殖的曲線 圖。圖19 =C-PlCll的Vh和八鏈的核苷酸及推斷的胺基酸序列。圖20 表示抗體(c-plCll，plCll，p2A6)與固定化KDR(VEGFR-2)直接結合的曲線 圖。
圖21 表示c-plCll與表達HUVEC的KDR-(VEGFR-2)結合的FACS分析曲線圖。圖 22 表示通過不同的 scFv 抗體(c-plCll，plCll，和 p2A6)抑制 KDR(VEGFR_2) 受體與固定化VEGF165結合的曲線圖。圖23 表示通過c-pICl 1和冷VEGF165抑制放射性標記的VEGF165與固定化 KDR(VEGFR-2)受體結合的曲線圖。圖對表示通過抗-KDR(VEGFR-2)抗體(c_plCll，plCll)抑制VEGF-誘導的HUVEC 增殖的曲線圖。
具體實施例方式本發明提供用放療，化療，和/或其它受體拮抗劑與VEGF受體拮抗劑聯合減輕或 抑制哺乳動物腫瘤生長的方法。在優選實施方案中，當用VEGF受體拮抗劑與化療劑，放療，或其它受體拮抗劑或 其組合聯合治療腫瘤，包括人的腫瘤時，可產生協同效果。換句話說，當VEGF受體拮抗劑與 化療劑，放療，或其它受體拮抗劑或其組合聯合抑制腫瘤生長時，可產生比所預期的還要好 的治療效果。當使用聯合療法抑制腫瘤生長所產生的效果比使用VEGF受體拮抗劑和化療 劑，放療，或其它受體拮抗劑所產生的效果之和還要大時，表現出協同效果。優選，協同效果 是通過癌症的緩解加以證實的，其中這種緩解是使用VEGF受體拮抗劑和化療劑，放療，或 其它受體拮抗劑進行聯合治療時所沒有預見到的。(見實施例VIII.)VEGF受體拮抗劑是在開始化療或放療之前，之中，或之後，及其任意組合，即，在開 始化療和/或放療之前和之中，之前和之後，之中和之後，或之前，之中，和之後給予的。例 如，當VEGF受體拮抗劑是抗體時，抗體通常在開始放療和/或化療之前的1-30天之間，優 選3-20天之間，更優選5-12天給藥。放療與VEGF受體拮抗劑聯合使用的放射源對於所治療的患者而言可以是外在的或內 在的。當放射源對患者是外在的時，該療法被稱為外在射線放療(EBRT)。當放射源對於患 者是內在的時，該療法被稱為近程放射治療(BT)。放療是按照熟知的標準技術，使用為此目的製造的標準設備，如AECL Theratron 和Varian Clinac給予的。放療的劑量取決於多種因素，這是本領域熟知的。這種因素包 括所要治療的器官，放療途徑中的健康器官，因為這些健康器官可能會無意中受到不良影 響，患者對放療的耐受性，和需要進行治療的機體面積。所述劑量通常為Ι-lOOGy，更優選 2-80Gy。已經報導過的某些劑量包括脊髓35Gy，腎15Gy，肝20Gy，前列腺65_80Gy。然而應 當強調的是，本發明不限制於任何特定的劑量。劑量可由主治醫生根據已知情況中的特定 因素，包括上述因素確定。外在放射源與進入患者內的點之間的距離可以是任意距離，它代表在殺死靶細 胞和使副作用達到最小之間的可接受的平衡。通常，外在放射源距離進入患者內的點 70-100cm。通常，近程放射治療是通過把放射源放在患者中進行的。通常，放射源被放置在距 離所要治療的組織大約0-3cm處。已知的技術包括間質，腔內，和表面近程放射治療。放射 源可永久或暫時植入。永久植入物中使用的某些典型的放射性原子包括碘-125和氡。臨
8時植入物中使用的某些典型的放射性原子包括鐳，銫-137，和銥-192。已經用於近程放射 治療的某些其它放射性原子包括鋂-241和金-198。近程放射治療的放療劑量可與上述外在射線放療相同。除了上面提到的，用於確 定外在射線放療劑量的因素之外，在確定近程放射治療的劑量時，還要考慮到所用放射性 原子的性質。化療化療劑包括可有效抑制腫瘤生長的所有化合物。化療劑的給藥可以各種方式進行，包括通過腸胃外和腸內途徑全身給藥。在其中 一個實施方案中，VEGF受體拮抗劑和化療劑可作為獨立的分子分開給藥。在另一實施方案 中，VEGF受體拮抗劑通過與化療劑偶聯而連接。化療劑的例子包括烷基化劑，例如，氮芥類，乙烯亞胺化合物和烷基磺酸鹽；抗代 謝物，例如，葉酸，嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂分裂抑制劑，如，長春鹼和鬼白毒素衍生物； 細胞毒性的抗生素；損害或幹擾DNA表達的化合物。此外，化療劑包括此處所述的抗體，生物分子和小分子。化療劑的具體例子包括順鉬，達卡巴嗪(DTIC)，更生黴素，雙氯乙基甲胺(氮芥)， 鏈脲黴素，環磷醯胺，卡莫司汀(BCNU)，羅氮芥(CCNU)，阿黴素(亞德裡亞黴素)，柔紅黴素， 丙卡巴胼，絲裂黴素，阿糖孢苷，依託泊苷，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，長春花鹼，長春新鹼，博 萊黴素，紫杉醇(紫杉酚)，多西他賽(脫乙醯基紫杉醇)，阿地流津，天門冬醯胺酶，白消 安，卡鉬，克拉屈濱，達卡巴嗪，氟尿苷，氟達拉濱，羥基脲，異環磷醯胺，幹擾素α，利普安， 甲地孕酮，美法倉，巰基嘌呤，普卡黴素，米託坦，培加帕酶，噴司他丁，哌泊溴烷，光輝黴素， 鏈脲黴素，他莫昔芬，替尼泊苷，睪內酯，硫鳥嘌呤，噻替派，尿嘧啶氮芥，維諾利賓，苯丁酸 氮芥，紫杉酚及其組合。生長因子受體拮抗劑本發明所用的生長因子受體拮抗劑(除了 VEGF受體拮抗劑)包括可抑制生長因 子受體的配體對生長因子受體刺激的所有物質。這種刺激的抑制可抑制表達生長因子受體 的細胞生長。涉及腫瘤發生的生長因子受體的某些例子是表皮生長因子(EGFR)，血小板衍生的 生長因子(PDGFR)，胰島素樣生長因子(IGFR)，神經生長因子(NGFR)，和成纖維細胞生長因 子(FGF)的受體。優選，本發明所用的生長因子受體拮抗劑是EGFR拮抗劑。本發明的EGFR拮抗劑 是生物分子，小分子，或任何其它物質，它們可抑制EGFR活化，由此抑制EGFR的酪氨酸激酶 活性，並防止受體自磷酸化，以及涉及各種EGFR信號途徑的其它蛋白磷酸化。EGFR活化的 抑制是指EGFR活化的任意降低，它無需完全阻止或終止EGFR的活化。此外，本發明定義的EGFR活化的抑制是指由於EGFR拮抗劑與受體相互作用產生 的EGFR抑制。相互作用是指EGFR拮抗劑與受體之間充分的物理或化學相互作用，如此才 能抑制酪氨酸激酶的活性。本領域的技術人員應當了解這種化學相互作用的例子，它包括 在EGFR拮抗劑和受體之間，本領域已知的締合或鍵合，還包括共價鍵合，離子鍵合，氫鍵鍵 合等。與EGF拮抗劑形成對比，它與配體相互作用，由此抑制活化。根據其它生長因子的具體情況，EGFR活化的增加可能是由於配體水平升高，EGFR基因擴增，受體轉錄增加或引起上調受體信號的突變增加而引起的。編碼EGFR基因的擴增 導致與EGFR結合的配體數增加，從而進一步刺激細胞增殖。EGFR還可在沒有基因擴增的 情況下過量表達，據推測是通過可增加EGFR轉錄，mRNA翻譯，或蛋白穩定性的突變完成的。 EGFR突變體已在神經膠質瘤，非小細胞肺癌，卵巢癌和前列腺癌中鑑定，它們具有組成型活 性的酪氨酸激酶，表明高水平EGFR活性的作用，而不是EGFR在這些癌中過量表達的作用。 見，例如，Pedersen 等，Ann. Oneol.，12 (6) :745-60 (2001)。(III 型 EGFR 突變-各式命名 的EGFRvIII，de2-7EGFR或AEGFR-缺少由外顯子2-7編碼的胞外配體結合域的一部分)； 見 Wikstrand 等，Cancer Res.，55 :3140-3148 (1995)。在本發明其中一個實施方案中，EGFR拮抗劑抑制EGFR與其配體結合。配體與EGFR 外部的胞外域的結合可刺激受體二聚化，EGFR自磷酸化，受體的內部胞質酪氨酸激酶結構 域的活化，和涉及DNA合成及細胞分裂調節的多個信號轉導途徑的引發。EGFR的配體包括， 例如，EGF，TGF-a，雙調蛋白，肝素-結合 EGF(HB-EGF)和 betarecullulin。EGF 和 TGF-α 是可導致EGFR-介導的刺激的主要內源性配體，儘管TGF- α在促進血管發生方面更有效。在本發明另一實施方案中，EGFR拮抗劑結合EGFR。應當了解EGFR拮抗劑可與EGFR 的胞外部分外部結合，抑制或不抑制配體的結合，或與酪氨酸激酶結構域內部結合。結合 EGFR的EGFR拮抗劑的例子包括，但不限制於，生物分子，如對EGFR特異的抗體(及其功能 等同物)，直接作用於EGFR胞質域的合成激酶抑制劑，如小分子。本發明的EGFR拮抗劑優選對EGFR特異的生物分子，更優選抗體，或其功能等同 物。對本發明所用抗體的描述可在名為「抗體」的部分找到。此外，在抗體結合之後，優選 使EGFR-抗體複合物內化並降解，防止受體被細胞再利用。 已知的生物分子EGFR拮抗劑是ERBITUX (IMC-C225)，它是對EGFR特異的嵌 合(人/小鼠)單克隆抗體。見，例如，美國專利號4，943，533 (Mendelsohn等)；美 國專利號 6, 217，866 (Schlessinger 等)；美國申請號 08/973，065 (Goldstein 等)和 09/635, 974 (Teufel) ；W099/60023 (Waksal 等)和 WO 00/69459 (Waksal)。單克隆抗體 ERBITUX 特異性結合EGFR，並阻斷配體，例如EGF的結合。這種阻斷可抑制腫瘤生長，包 括通過幹擾EGFR活化作用而抑制腫瘤侵入，轉移，細胞修復和血管發生。此外，或可選擇性 地，單克隆抗體ERBITUX 可促進受體-抗體複合物的內化，防止其配體或任何其它機理進 一步刺激受體。生物分子EGFR拮抗劑的其它例子是ABX-EGF，它是對EGFR特異的完全人IgG2單 克隆抗體。ABX-EGF以較高的特異性結合EGFR，阻斷EGFR與其兩個配體，EGF和TGF-α 的結合。見，例如，Figlin等，ASCO第37期年會的摘要1102，San Francisco, CA, 2001 年5月12-15日。先前被稱作克隆E7.6.3的ABX-EGF的序列和描述在美國專利號 6，235，883 (Abgenix, Inc.)第28欄第62行-第29欄第36行和圖29-34中公開。見Yang 等，Critical Rev. Oncol. /Hematol. , 38 (1) :17-23, 2001。在可選擇性，但也是優選的實施方案中，本發明的EGFR拮抗劑是小分子的酪氨酸 激酶抑制劑。小分子的描述可在名為「小分子」的部分找到。已經描述過使用很多小分子 抑制EGFR。例如，Spada等，美國專利5，656，655，公開了可抑制EGFR的苯乙烯基取代的雜芳 基化合物。所述雜芳基是具有一個或兩個雜原子的單環，或具有1-約4個雜原子的雙環，
10該化合物可被任選取代或多取代。美國專利5，656，655公開的化合物引入此處作為參考。Spada等，美國專利5，646，153公開了可抑制EGFR的雙單環和/或雙環的芳基雜 芳基，碳環，和雜碳環化合物。美國專利5，646，153公開的化合物引入此處作為參考。Bridges等，美國專利5，679，683公開了可抑制EGFR的三環嘧啶化合物。所述化 合物是稠合的雜環嘧啶衍生物，在第3欄第35行-第5欄第6行描述。第3欄第35行-第 5欄第6行描述的這些化合物引入此處作為參考。Barker，美國專利5，616，582公開了具有受體酪氨酸激酶抑制活性的喹唑啉衍生 物。美國專利5，616，582公開的化合物引入此處作為參考。Fry 等，Science, 265 :1093-1095(1994)公開了具有抑制 EGFR 的結構的化合物。 結構在圖1中給出。Fry等所著文章圖1中所示的化合物引入此處作為參考。Osherov 等，J. Biol. Chem.，268 (15) :11，134-42 (1993)公開了可抑制 EGFR/HER1 和HER2的酪氨酸磷酸化抑制劑。Osherov等所著文章中公開的化合物，特別是表I，II，III， 和IV中的那些引入此處作為參考。Levitzki等，美國專利5，196，446公開了可抑制EGFR的雜芳基乙烯二基或雜芳基 乙烯二基芳基化合物。美國專利5，196，446第2欄第42行-第3欄第40行公開的化合物 引入此處作為參考。Panek 等，J. Pharma. Exp. Thera. J83 :1433-1444(1997)公開了被鑑定為 PD166285的化合物，它可抑制受體的EGFR，PDGFR，和FGFR家族。PD166285被鑑定為6-(2， 6-二氯苯基)-244-(2-二乙氨基乙氧基)苯氨基)-8-甲基-8H-吡啶並(2，3_d)嘧 啶-7-酮，它具有第1436頁圖1所示的結構。在Panek等所著文章第1436頁圖1中描述 的化合物引入此處作為參考。小分子EGFR拮抗劑的其中一個例子是IRESSA (ZD1939)，它是quinozaline 衍生物，可作為ATP-模擬物抑制EGFR。見，美國專利號5，616，582(Zeneca Limited)； WO 96/33980 (Zeneca Limited)第 4 頁；見，Rowinsky 等，ASCO 第 37 期年會的摘要 5， San Francisco, CA, 2001 年 5 月 12-15 日；Anido 等，ASCO 第 37 期年會的摘要 1712，San Francisco, CA,2001 年 5 月 12-15 日。TARCEVA 是小分子EGFR拮抗劑的另一個例子。TARCEVA (0SI_774)是4-取代 的苯氨基quinozaline衍生物[6，7_雙甲氧基-乙氧基)_喹唑啉_4_基]-(3-乙炔 基-苯基)胺鹽酸鹽]EGFR抑制劑，它在WO 96/30347 (Pfizer he.)第2頁第12行-第
4頁第 34 行和第 19 頁第 14-17 行描述。也見 Moyer 等，Cancer Res.，57 :4838-48 (1997)； Pollack等，J. Pharmacol. ,291 :739-48(1999)。TARCEVA 通過抑制EGFR及其下遊PI3/Akt 磷酸化和導致P27-介導的細胞周期停滯的MAP (促有絲分裂劑活化蛋白)激酶信號轉導途 徑而發揮作用。見，Hidalgo等，ASCO第37期年會的摘要281，San Franscio, CA, 2001年
5月 12-15 日。還有很多其它小分子也可抑制EGFR。小分子EGFR拮抗劑的一些例子 ^t WO 91/116051, WO 96/30347, WO 96/33980, WO 97/27199(ZenecaLimited), WO 97/30034(Zeneca Limited),WO 97/42187(Zeneca Limited),WO 97/49688(Pfizer Inc.)， WO 98/33798(Warner LambertCompany), WO 00/18761(American Cyanamid Company), 和WO 00/31048 (Warner Lambert Company)描述。小分子EGFR拮抗劑的具體例子包括C1-1033，它是酪氨酸激酶，特別是EGFR的quinozaline (N<4-(3-氯_4_氟-苯 氨基)-7-(3-嗎啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉-6-基]-丙烯醯胺)抑制劑，在WO 00/31048 (Warner-Lambert Company)第 8 頁第 22-6 行描述；PKI166，它是 EGFR 的吡咯並 嘧啶抑制劑，在 W097/27199 (Novartis AG)第 10-12 頁描述；GW2016，它是 EGFR 和 HER2 的 抑制劑；和ΕκΒ569。其它EGFR拮抗劑可使用熟知的方法很容易地確定。本發明的EGFR拮抗劑可抑 制EGFR的酪氨酸激酶活性，其通常涉及磷酸化事件。因此，磷酸化測定法可用於確定本發 明所用的拮抗劑。酪氨酸激酶活性的某些測定法在Panek等，(1997)和Batley等，Life Sci. ,62:143-50(1998)中描述。此外，可使用特異性檢測EGFR表達的方法。這些包括檢 測蛋白表達的免疫組織化學(HIC)，檢測基因擴增的螢光原位雜交(FISH)，競爭性放射性 配體結合測定法，固體基質印跡技術，如RNA和DNA印跡，逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR) 和 ELISA。見，例如，Grandis 等，Cancer，78 :1284-1292(1996) ；Shimizu 等，JapanJ. Cancer Res. ,85 :567-571(1994) ；Sauter 等，Am. J. Path.，148 :1047-1053(1996) ；Collins, Glia, 15 :289-296(1995) ；Radinsky等，Clin. Cancer. Res.，1 :19-31(1995) ；Petrides等，Cancer Res. ,50 :3934-3939(1990) ；Hoffmann 等，Anticancer Res. , 17 :4419-4426(1997)； Wikstrand 等，Cancer Res.，55 :3140-3148 (1995)。VEGF受體拮抗劑在其中一個實施方案中，VEGF受體拮抗劑特異性結合VEGF受體胞外域上的抗原 決定部位。VEGF受體的胞外域是配體-結合域。配體-結合域可在受體任何一個末端找 到，但通常位於氨基末端。VEGF受體的一些例子包括蛋白酪氨酸激酶受體，如文獻中提到的 flt-1 (VEGFR-I)，KDR和flk_l (VEGFR-2)。除非另有說明或以其它方式清楚地說明，本說明 書將遵循VEGF受體的常規文獻命名法。KDR (VEGFR-2)被稱作具有MW 180kD的VEGF受體 的人類形式(Terman等，上述)。Flk-I (VEGFR-2)被稱作KDR的鼠同系物(Matthews等，上 述)。Flt-I (VEGFR-I)被稱作VEGF受體的不同形式，但與KDR/flk-1 (VEGFR-2)受體有關。 見Siibuya等，上述。其它VEGF受體包括用VEGF交聯標記的那些，或與KDR (VEGFR-2)共-免疫沉澱的 那些。這些VEGF受體某些已知形式的分子量大約為170KD，150KD，130-i;35KD，120-125KD 和 85KD。見，例如，Quinn 等，Proc. Nat，1 Acad. Sci USA，90 :7533-7537 (1993) ；Scher 等， J.Biol. Chem.，271 :5761-5767(1996)。VEGF受體通常與細胞，如內皮細胞結合。VEGF受體還可與非-內皮細胞，如腫瘤 細胞結合。可選擇性地，VEGF受體可游離於細胞，優選可溶性形式。 本發明的拮抗劑可中和VEGF受體。在本說明書中，中和受體是指使受體的內在激 酶活性滅活，從而轉導信號。VEGF受體中和的可靠測定法是抑制受體磷酸化。本發明不受VEGF受體中和的任何特殊機理的限制。在申請這種應用時，還不了解 通過抗體中和VEGF受體的機理，通過其中一種拮抗劑中和的機理無須與通過另一種拮抗 劑中和的機理相同。某些可能的機理包括阻礙VEGF配體與VEGF受體的胞外結合域結合， 並防止受體二聚或寡聚。然而，不能排除其它機理。本發明的VEGF受體(或VEGFR)拮抗劑是生物分子，小分子，或抑制受體VEGFR亞CN 102133403 A
說明書
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家族的任何其它物質。受體VEGFR亞家族活化的抑制是指VEGFR活化的任意降低。S卩，阻 礙活化時，無需完全終止VEGFR活化。此外，本發明所定義的VEGFR活化的抑制是指VEGFR 拮抗劑與VEGFR相互作用之後，VEGFR拮抗劑的抑制。締合是指VEGFR拮抗劑與VEGFR之 間充分的物理或化學相互作用，從而抑制受體的酪氨酸激酶活性。本領域技術人員應當了 解這種化學相互作用的例子，包括本領域已知的締合或鍵合，包括共價鍵合，離子鍵合，氫 鍵鍵合等。因此，本發明的VEGFR拮抗劑可抑制受體的酪氨酸激酶活性，阻礙受體自磷酸化 和涉及VEGFR信號途徑的各種其它蛋白磷酸化。這種涉及血管發生和血管形成的調節的 途徑包括下列任何一種磷脂酶C γ (PLCy)途徑或磷脂醯肌醇3』激酶(PI3-K)/Akt和促 有絲分裂劑激活的蛋白激酶(MAPK)途徑。見，例如，Larrivee等，Int' 1 J. Mol. Med.，5 447-56(2000)。受體VEGFR亞家族的特徵在於胞外域中7個免疫球蛋白樣環，單一跨膜區和胞內 區中斷裂酪氨酸激酶結構域的存在(III類受體酪氨酸激酶)。受體VEGFR亞家族還有很 多已知的成員，它的例子包括VEGFR-I，VEGFRUP VEGFR-3。據信KDR(VEGFR_2)是主要的 VEGF信號轉導物，它可導致內皮細胞的增殖，遷移，分化，管形成，血管滲透性的增加，和血 管完整性的維持。VEGFR-I具有較弱的激酶活性，而且當受到VEGF刺激時，不能產生促有絲 分裂反應，雖然它可以高於KDR(VEGFR-2)大約10倍的親和性與VEGF結合。VEGFR-I還涉 及VEGF和胎盤生長因子(PIGF)誘導的單核細胞和巨噬細胞遷移以及組織因子的產生。對於上述EGFR而言，VEGFR活化的增加可能是由高水平的配體，VEGFR基因的擴 增，受體轉錄的增加或引起上調受體信號的突變而引起的。在本發明其中一個實施方案中，VEGn 拮抗劑抑制VEGFR與其配體結合。配體與 VEGFR外部的胞外域結合可刺激受體二聚化，VEGFR自磷酸化，受體內部胞質酪氨酸激酶結 構域的活化，和涉及血管形成及血管發生的調節的多個信號轉導途徑的引發。VEGFR 的配體包括 VEGF 及其同源物 P1GF，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D,和 VEGF-E。例 如，P1GF，它是只結合VEGFR-I的二聚分泌型因子，它通過絨毛細胞滋養層，合胞滋養層和 絨毛外滋養層大量產生，其胺基酸序列與VEGF的同源性很高。人類有3種同種型，P1GF-1， P1GF-2，和P1GF-3。對缺乏PlGF小鼠的研究證實，這種生長因子本身與血管發生無關，但可 特異性調節病理過程中的血管發生及VEGF的滲透作用。且，VEGF-D與VEGF-C緊密相關，這 是因為在其它VEGF家族成員中是找不到N-和C-末端延伸的存在。在成人組織中，VEGF-D 的mRNA在心臟，肺，骨胳肌，結腸，和小腸中的含量最豐富。對VEGF-D受體特異性進行的分 析揭示，VEGF-D是VEGFR-2 (Flkl)和VEGFR-3 (Flt4)的配體，而且可激活這些受體；然而， VEGF-D不結合VEGFR-I。此外，VEGF-D是內皮細胞的促有絲分裂劑。在本發明另一實施方案中，VEGFR拮抗劑結合VEGFR。應當認識到，VEGFR拮抗劑 可與VEGFR的胞外部分外部結合，抑制或不抑制配體的結合，VEGFR拮抗劑還可與酪氨酸激 酶結構域內部結合。結合VEGFR的VEGFR拮抗劑的例子包括，但不限制於，生物分子，如受 體核酶及對VEGFR特異的抗體(或其功能等同物)，和直接作用於VEGFR胞質結構域的合成 激酶抑制劑，如小分子。優選本發明的VEGFR拮抗劑是對VEGFR特異的生物分子，更優選抗 體或其功能等同物，下面將對它們作更詳細的描述。可選擇性地，本發明的VEGFR拮抗劑是 小分子激酶抑制劑，下面將對其作詳細描述。在其中一個優選實施方案中，VEGFR受體拮抗劑特異性結合VEGFR-I。特別優選抗
13原結合蛋白，它可結合VEGFR-I的胞外結構域，並通過其一個或兩個配體，VEGF和PlGF阻 斷結合，和/或中和VEGF-誘導的或PlGF誘導的VEGFR-I活化。例如，mAb 6. 12是與可溶 性，細胞表面表達的VEGFR-I結合的scFv。ScFv 6. 12含有小鼠單克隆抗體mAb 6. 12的八 和Vh結構域。產生mAb 6. 12的雜交瘤細胞系已經保藏，ATCC號為PTA-3344。保藏是根據 布達佩斯條約的規定，在用於專利程序及其條例(布達佩斯條約)的微生物保藏機構進行 的。這樣做可確保活培養物自保藏之日起維持30年。根據布達佩斯條約，在申請人和ATCC 之間達成協議的情況下，可從ATCC獲得生物體，這樣可確保在相關美國專利公開之後，不 受限制地使用它。按照專利法的規定，在實行該發明時，無須在任何行政機構的授權下使用 保藏菌株。其它優選抗體在實施例，特別是實施例XII，XIII，和XIV，及SEQID NO 1-83中 描述。此外，這些優選VEGFR抗體拮抗劑的其中一部分在Lu等，ht，1 J. Cancer,97 393-399(2002)中描述。還存在各種產生VEGFR-2抗體的雜交瘤。例如，產生大鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆 抗體的雜交瘤細胞系(DClOl)的保藏號為ATCC HB11534 ；產生小鼠抗小鼠VEGFR-2單克 隆抗體mAb 25的雜交瘤細胞系(M25. 18A1)的保藏號為ATCC HB 12152 ；產生小鼠抗小鼠 VEGFR-2單克隆抗體mAb 73的雜交瘤細胞系(M73. 24)的保藏號為ATCC HB12153。此外，產生抗VEGFR-I抗體的各種雜交瘤包括，但不限制於，雜交瘤KM1730 (保藏 號 FERM BP-5697)，KM1731(保藏號 FERM BP-5718)，雜交瘤 KM1732 (保藏號 FERM BP-5698)， KMl748 (保藏號 FERM BP-5699)，雜交瘤 KMl750 (保藏號 FERM BP-5700)，它們在 WO 98/2^16，W099/59636，澳大利亞申請號AU 199850666B2，和加拿大申請號CA23^893中描 述。很多其它VEGFR拮抗劑也是本領域已知的。VEGFR拮抗劑的某些例子在美國 申請號 07/813，593 ；07/906，397 ；07/946，507 ；07/977，451 ；08/055，269 ；08/252, 517 ； 08/601, 891 ；09/021, 324 ；09/208, 786 ；和 09/919，408(所有均屬於 Lemischka 等)；美國專利號 5，840，301 (Rockwell 等)；美國申請號 08/706，804 ；08/866，969 ； 08/967，113 ；09/047, 807 ；09/401, 163 ；和 09/798, 689(所有均屬於 Rockwell 等)； 美國申請號09Λ40，770 (Witte等)；和PCT/US01/06966 (Liao等)中描述。美國專 利號 5，861，301 CTerman 等)，Terman 等，0ncogene6 1677-1683 (1991 年 9 月)，WO 94/10202 (Ferrara 等)，和 WO 95/21865 (Ludwig)公開了 VEGFR 拮抗劑，特別是抗 VEGFR-2 抗體。此外，PCT/US95/01678 (Kyowa Hakko)描述了抗VEGFR-2抗體。抗VEGFR抗體還在美國 申請號 09/976，787 (Zhu 等)中描述。美國專利號 6，177，401 (Ullrich 等)，5，712，395 (App 等)，和5，981，569 (App等)描述的VEGFR拮抗劑是有機分子。此外，雙特異性抗體(BsAbs) 是已知的，它是具有兩種不同的抗原-結合特異性或位點的抗體，針對KDR(VEGFR-2)和 VEGFR-I0 見，例如，美國申請號 09/865，198 (Zhu) ；60/301，299 (Zhu)。Hennequin 等，在 J. Med. Chem. 42，5369-5389 (1999)中公開了某些可用作 VEGF 受 體拮抗劑的喹唑啉，喹啉和噌啉。見Annie等，Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes and HumanRetrovirology 17， A41 (1998) 。 $ Hermequin的^1 中&Jf 的VEGF受體拮抗劑引入此處作為參考。此外，App等(USPN :5，849，742)公開了可作為酪氨酸激酶抑制劑起作用的喹唑啉，quinoxiline，取代苯胺，異噁唑，丙烯腈和苯基丙烯腈化合物。Hermequin等，Annie等 和App等描述的小分子也可作為本發明的VEGF受體拮抗劑。此外，確定VEGFR拮抗劑的測定法是本領域熟知的，因此，適用於本發明的侯選拮 抗劑可很容易地鑑定。本發明的VEGFR拮抗劑可抑制VEGFR的酪氨酸激酶活性，其通常涉及 磷酸化事件。因此，磷酸化測定法可用於確定本發明的VEGFR拮抗劑。酪氨酸激酶活性的 某些測定法在 Panek 等，J. Pharmacol. Exp. Thera. ,283 :1433-44(1997)和 Batley 等，Life Sci. ,62 =143-50(1998)中描述。此外，還可使用特異性檢測VEGFR表達的方法。抗體本發明的抗體可通過本領域已知的方法生產。這些方法包括免疫學方法，由 Kohler 和 Milstein, Nature, 256 :495-497(1975)和 Campbell，單克隆抗體技術，齧齒動 物和人類雜交瘤的生產和描述，Burdon等，Eds.，生物化學和分子生物學的實驗室技術，13 卷，ElsevierScience Publishers, Amsterdam(1985)描述；以及 Huse 等，Science, 246, 1275-1281(1989)描述的重組DNA方法。本發明的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體或任何其它適宜類型的抗體，如 抗體的片段或衍生物，單鏈抗體(scFv)或抗體的合成同系物，只要抗體具有與那些完整 抗體相同或相似的結合性。除非另有說明或可從上下文清楚地知道，此處所用的抗體的 結構域，區和片段與本領域熟知的標準定義一致。見，例如，Abbas等，細胞和分子免疫學， W. B. Saunders Company, Philadelphia, PA(1991)。優選本發明的抗體是單克隆抗體。抗體片段可通過裂解完整抗體，或通過表達編碼該片段的DNA產生。抗體片段 可通過 Lamoyi 等，J. Immunol. Methods, 56 :235-243(1983)禾口 Parham，J. Immunol. 131 2895-2902(1983)所述的方法製備。這種片段可含有一個或兩個Fab片段或F(ab，)2片段。 這種片段還可含有單鏈片段可變區抗體，即，scFv,雙抗體，或其它抗體片段。生產這種功能 等同物的方法在PCT申請冊93/21319，歐洲專利申請號239，400 ；PCT申請WO 89/09622 ；歐 洲專利申請338，745 ；和歐洲專利申請EP 332，424中公開。單鏈抗體(scFv)是由使用或不用互連接頭連接的抗體重鏈可變區和輕鏈可變區 組成的。因此，scFv含有完整的抗體結合位點。這些鏈可在細菌，或真核細胞中產生。單鏈 抗體的一個例子是picil。(見下面的實施例IX。)PlCll可阻斷VEGF-KDR(VEGF-VEGFR-2) 的相互作用，抑制VEGF-刺激的受體磷酸化和HUVEC有絲分裂。這種scFv既可結合HUVEC 上的可溶性KDR(VEGFR-2)，又可結合細胞表面表達的KDR(VEGFR_2)。ρICll的序列如SEQ ID Νο:21所示。通過本領域已知的方法可把上述單鏈抗體構成嵌合抗體或人源化抗體，例 如，見下面的實施例ΙΧ-3。嵌合scFv的其中一個例子是嵌合plCll，S卩，c-plCll。優選所述抗體片段含有完整抗體的全部6個互補決定區，儘管片段所含的這種區 較少，如含有3個，4個或5個CDRs，但它也可以是功能性的。如果抗體太短以致不是免疫 原性的，那麼它可與載體分子偶聯。一些適宜的載體分子包括匙孔血藍蛋白和牛血清白蛋 白。偶聯可通過本領域已知的方法進行。本發明的抗體還包括可通過直接突變，親和力成熟，噬菌體展示，或鏈混排方法提 高結合性的那些。通過使CDRs突變，並篩選具有所需特性的抗原結合位點，可修飾或改進 親和性和特異性(見，例如，Yang等，J. Mol. Bio. ,254:392-403(1995))。CDRs是以各種方 法突變的。其中一個方法是使單個殘基或殘基的組合隨機化，這樣在其它相同的抗原結合位點群中，就可在特定位置找到全部20種胺基酸。可選擇性地，突變可通過易錯PCR方法， 在多種CDR殘基上誘導(見，例如，Hawkins等，J. Mol. Bio.，226 :889-896 (1992))。含有重 鏈和輕鏈可變區基因的噬菌體展示載體在大腸桿菌的增變菌株中繁殖(見，例如，Low等， J. Mol. Bio.，250 :359-368(1996))。這些誘變的方法只是本領域技術人員已知的多種方法 的舉例說明。本發明的抗體還可以是具有一類物種，例如小鼠的抗體可變區，和不同物種，例如 人的抗體恆定區的嵌合抗體。可選擇性地，本發明的抗體可以是人源化抗體，它具有來源於 其中一類物種，例如小鼠的抗體的高變或互補決定區(CDRs)，和人類抗體的構架可變區及 恆定區。可選擇性地，本發明抗體可以是具有人類抗體恆定區和可變區的人類抗體。抗體，特別是單克隆抗體，可通過本領域已知的方法生產。生產抗體的實例 包括，但不限制於，在雜交瘤細胞中生產並用編碼受體拮抗劑的DNA轉化哺乳動物細 胞。這些方法在各種出版物中公開，包括免疫學方法，由Kohler和Milstein，Nature, 256 :495-497 (1975)和Campbell，「單克隆抗體技術，齧齒動物和人類雜交瘤的生產和 描述」，Burdon等，Eds.，生物化學和分子生物學的實驗室技術，13卷，Elsevier Science Publishers, Amsterdam(1985)；和 Huse 等在 kience，246 :1275-U81 (1989)中描述的重 組DNA方法。抗體等同物也可通過本領域已知的方法製備。例如，抗體片段可從完整抗體酶促 製備。優選，抗體等同物是從編碼這種等同物的DNA製備的。編碼抗體片段的DNA是通過 使除編碼全長抗體的DNA所需部分之外的部分缺失而製備的。編碼嵌合抗體的DNA可通過 使編碼人恆定區的DNA重組而製備，它們基本上或僅僅來源於相應的人抗體區，還可通過 使編碼可變區的DNA重組而製備，它們基本上或僅僅來源於除人之外的哺乳動物可變區序 列。編碼人源化抗體的DNA可通過使編碼除互補決定區(CDRs)之外的恆定區和可變區的 DNA重組而製備，它們基本上或僅僅來源於相應的人抗體區，還可通過使編碼⑶Rs的DNA重 組而製備，它們基本上或僅僅來源於除人之外的哺乳動物。編碼抗體片段的DNA分子的適宜來源包括細胞，如雜交瘤，它可表達全長抗體。該 片段自身可被用作抗體等同物，或按照上面所述被重組成等同物。這部分描述的DNA缺失 和重組可通過已知方法進行，如在名為「抗體的功能等同物」部分所列的專利申請中公開的 那些，和/或其它標準重組DNA技術，如下面描述的那些。用於進行載體轉化和本發明受體拮抗劑表達的優選宿主細胞是哺乳動物細胞，例 如，C0S-7細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，和淋巴來源的細胞系，如淋巴瘤，骨髓瘤，或雜交 瘤細胞。也可選擇性使用其它真核宿主，如酵母。例如，小鼠胎兒肝基質細胞系2018可結 合 AP 標記-flkl 和 Ap 標記-flk-2 融合蛋白，即，含有 VEGFR-2 和 flk-2 (ATCC,Manassas, VA, CRL 10907)的配體，人胎兒脾細胞系Fsp 6沘91含有f lk_2配體(ATCC CRL 10935), ^P 人基質胎兒胸腺細胞系，F. thy62891含有VEGFR-2配體(ATCC CRL 10936)。轉化的宿主細胞是利用本領域已知的方法在液體培養基中培養的，所述液體培養 基含有可同化的碳源(碳水化合物，如葡萄糖或乳糖)，氮源(胺基酸，肽，蛋白或它們的降 解產物，如腖，銨鹽等)，和無機鹽(鈉，鉀，鎂和鈣的硫酸鹽，磷酸鹽和/或碳酸鹽)。此外， 培養基還含有，例如，促進生長的物質，如微量元素，例如，鐵，鋅，錳等。當需要在酵母中表達基因構建體時，用於酵母中的適宜選擇基因是存在於酵母質粒 YRp7 中的 trpl 基因。Stinchcomb 等，Nature, 282 :39(1979) ；Kingsman 等，Gene, 7 141(1979)。trpl基因可為酵母突變株提供選擇標記，所述酵母缺乏在色氨酸中生長的能 力，例如，ATCC No. 44076 或 PEP4-1。Jones，Genetics，85 12 (1977)。酵母宿主細胞基因 組中trpl的損害可為通過在色氨酸缺乏情況下的生長而檢測轉化提供有效的環境。同樣， Leu2-缺陷酵母株(ATCC 20，622或38，626)是由含有Leu2基因的已知質粒補充的。可選擇性地，編碼受體拮抗劑的DNA可被克隆到來源於病毒，如腺病毒腺伴隨病 毒，皰疹病毒，逆轉錄病毒或慢病毒的載體中。基因表達可由誘導型或非誘導型調節序列控 制。簡單地說，選擇含有表達所需DNA，如抗體，抗體等同物或VEGF受體的核酸分子的 適宜細胞來源。總RNA是通過標準過程從適宜來源製備的。總RNA用於指導cDNA合成。分 離RNA及合成cDNA的標準方法在分子生物學的標準手冊中提供，例如，上述那些。cDNA可通過已知方法擴增。例如，cDNA可被用作通過聚合酶鏈反應(PCR)進行擴 增的模板；見 Saiki 等，Science, 239,487 (1988)或 Mullis 等，美國專利 4，683，195。進行 PCR擴增的寡核苷酸引物序列來源於被擴增的已知序列。寡核苷酸是通過本領域已知的方 法合成的。話宜的方法包括由Caruthers在Science230, 281-285 (1985)描述的那些。PCR擴增使用上遊和下遊寡核苷酸的混合物。按照標準過程，根據每個特定的引物 對優化條件。利用電泳分析PCR產物的cDNA，所述cDNA具有與引物間序列相對應的適宜大 小。可選擇性地，編碼區可在兩個或多個重疊片段中擴增。重疊片段被設計成包括一個限 制性位點，從而使片段的完整cDNA組裝。為了分離VEGF受體完整的蛋白編碼區，例如，上遊的PCR寡核苷酸引物與5』端的 序列互補，優選含有ATG起始密碼子和起始密碼子的至少5-10個上遊核苷酸。下遊的PCR 寡核苷酸引物與所需DNA序列的3』端序列互補。所需DNA序列優選編碼VEGF受體的整個 胞外部分，且任選編碼跨膜區的全部或一部分，和/或胞內區的全部或一部分，包括終止密 碼子。擴增的DNA，如編碼抗體，抗體等同物，或VEGF受體的DNA可在各種宿主細胞中的 各種克隆載體中複製。宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。其中剪接DNA的載體可含有染色體，非-染色體及合成DNA序列的片段。一些適 宜的原核克隆載體包括來源於大腸桿菌的質粒，如colEl，pCRl，pBR322, pMB9, pUC，pKSM， 和RP4。原核載體還包括噬菌體DNA的衍生物，如M13和其它絲狀單鏈DNA噬菌體。用於克 隆編碼VEGF受體的核酸的優選載體是杆狀病毒載體。把含有所要表達的DNA的載體轉染到適宜的宿主細胞中。宿主細胞在適宜的培養 基中維持，並在細胞和載體複製的條件下生長。載體可從細胞回收。所要表達的DNA可從 載體回收。所要表達的DNA，如編碼抗體，抗體等同物，或受體的DNA被插入到適宜的表達載 體中，並在適宜的原核或真核細胞中表達。例如，插入到宿主細胞中的DNA可編碼VEGF受體的整個胞外部分，或編碼VEGF受 體胞外部分的可溶性片段。DNA編碼的VEGF受體胞外部分任選在5』端或3』端或兩個末 端與附加胺基酸序列連接。附加胺基酸序列可與VEGF受體的胞外區連接，如VEGF受體的 前導序列，跨膜區和/或胞內區。附加胺基酸序列也可以是不與VEGF受體連接的序列。優選，這種附加胺基酸序列可發揮特殊的作用，如提高表達水平，分泌，溶解性，或免疫原性。用於在細菌，特別是大腸桿菌中表達蛋白的載體是已知的。這種載體包括由 Dieckmann 和 iTzagoloff 在 J. Biol. Chem. 260,1513-1520(1985)中描述的 PATH 載體。這些 載體含有編碼鄰氨基苯甲酸鹽合成酶(TrpE)的DNA序列，然後是羧基末端多接頭。其它表 達載體系統是以半乳糖苷酶(PEX) ；麥芽糖結合蛋白(pMAL)；和穀胱甘肽S-轉移 酶(pGST)為基礎的，見 Gene 67,31(1988) ^P PeptideResearch 3,167(1990) 在酵母中使用的載體也是可用的。適宜的例子是2μ質粒。用於在哺乳動物細胞中表達的適宜載體也是已知的。這種載體包括熟知的SV-40 衍生物，腺病毒，逆轉錄病毒衍生的DNA序列和來源於功能性哺乳動物載體組合的穿梭載 體，如上面描述的那些，和功能性質粒及噬菌體DNA。其它真核表達載體是本領域已知的(例如，P. J. Southern和P. Berg，J. Mo 1. App 1. Genet.，丄，327-341 (1982) ；Subramani 等，Mol. Cell. Biol.，1 :854-864(1981) ；Kaufmann 和Siarp，「用調節物二氫葉酸鹽還原酶互補DNA基因共轉染的序列的擴增和表達」，J. Mol. Biol.159,601-621 (1982) ；)Kaufmann 和 Sharp, Mol.Cell.Biol.159,601-664(1982)； Scahill等，「中國倉鼠卵巢細胞中人免疫幹擾素DNA基因產物的表達和描述」，Proc. Nat，IAcad. Sci. USA迎，4654-4659 (1983) ；UrIaub 和 Chasin，Proc. Nat，IAcad. Sci. USA77, 4216-4220， (1980)。本發明所用表達載體含有至少一個表達控制序列，它與所要表達的DNA序列或片 段可操作性連接。把控制序列插入到載體中，從而控制並調節克隆DNA序列的表達。有效 的表達控制序列的例子是Iac系統，trp系統，tac系統，trc系統，噬菌體λ的主要操縱子 和啟動子區，fd外被蛋白的控制區，酵母的糖酵解啟動子，例如，3-磷酸甘油酸激酶的啟動 子，酵母酸磷酸酶的啟動子，例如，Pho5，酵母α-交配因子的啟動子，和來源於多形瘤，腺 病毒，逆轉錄病毒，和猿猴病毒的啟動子，例如，早期和晚期啟動子或SV40，和其它序列，已 知它們可控制原核或真核細胞和它們的病毒或其組合的基因表達。把含有控制信號和所要表達的DNA，如編碼抗體，抗體等同物，或VEGF受體的DNA 的載體插入到宿主細胞中進行表達。一些有效的表達宿主細胞包括熟知的原核及真核細 胞。某些適宜的原核宿主包括，例如，大腸桿菌，如大腸桿菌SG-936，大腸桿菌ΗΒ101，大腸 桿菌W3110，大腸桿菌Χ1776，大腸桿菌，大腸桿菌DHI，和大腸桿菌MRCl，假單胞菌屬， 桿菌屬，如枯草桿菌，和鏈黴菌屬。適宜的真核細胞包括組織培養物中的酵母和其它真菌， 昆蟲，動物細胞，如COS細胞和CHO細胞，人類細胞和植物細胞。在維持於適宜培養基中的宿主細胞中表達之後，可從培養基中分離所要表達的多 肽或肽，如編碼抗體，抗體等同物，或VEGF受體的多肽或肽，並利用本領域已知的方法進行 純化。如果多肽或肽沒有分泌到培養基中，那麼在分離和純化之前，要先溶解宿主細胞。此外，本發明的抗體可通過使用可溶性受體給哺乳動物免疫接種而製備。所述可 溶性受體自身可被用作免疫原，或與載體蛋白或其它物體，如珠子，即，瓊脂糖珠連接。在 哺乳動物產生抗體之後，分離產生抗體的細胞混合物，如脾細胞。單克隆抗體可通過從混合 物中分離產生抗體的各個細胞，並通過把細胞與腫瘤細胞，如骨髓瘤細胞融合使它們無限 增殖而製備。所得雜交瘤保存在培養基中，並表達單克隆抗體，它們是從培養基中採集的。抗體還可從與細胞表面結合的受體製備，所述細胞可表達目標特異性受體。與受體結合的細胞可以是天然表達受體的細胞，如用於表達VEGFR的血管內皮細胞。可選擇性 地，與受體結合的細胞可以是其中已經轉染了編碼受體的DNA的細胞，如3T3細胞，它已經 用VEGFR轉染。受體可被用作免疫原，從而得到本發明的抗體。受體肽可從天然來源獲得，如從表 達受體的細胞獲得。例如，VEGF受體肽可從血管內皮細胞獲得。可選擇性地，合成的受體 肽可使用市售的機器製備。在這種實施方案中，fIt-I (VEGFR-I)的VEGF受體胺基酸序列 例如由 Shibuya 等在 Oncogene 5,519-524(1990)中提供；KDR(VEGFR_2)的 VEGF 受體氨基 酸序列由 PCT/US92/01300 和 iTerman 等，0ncogene6 :1677-1683(1991)提供；f Ik-I 的 VEGF 受體胺基酸序列由 Mattews 等，Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA,88 :9026-9030(1991)提供。作為又一個選擇，編碼受體的DNAJn cDNA或其片段可被克隆並表達，回收所得多 肽，將其用作免疫原，從而得到本發明的抗體。例如，為了製備針對抗體的VEGF受體，可使 用標準重組DNA技術，如下面描述的那些，把編碼本發明VEGF受體的核酸分子，或其一部 分，特別是其胞外部分插入到用於在宿主細胞中表達的已知受體中。這種核酸分子的適宜 來源包括表達VEGF受體的細胞，即，血管內皮細胞。抗體可在任何哺乳動物中製備；除人之外的適宜哺乳動物包括，例如，兔，大鼠，小 鼠，馬，山羊，或靈長類動物。優選小鼠。抗體可以是下列其中一類免疫球蛋白的成員IgG， IgM，IgA，IgE，及其亞類，優選IgGl抗體。本發明的抗體及其等同物可以是任何一類免疫球 蛋白的成員或其組合。非抗體VEGFR拮抗劑除了上面討論的抗體，或抗體的功能等同物之外，本發明所用受體拮抗劑還可以 是其它生物分子和小分子，特別是與上述療法聯合。生物分子包括所有脂類和單糖聚合物，胺基酸及分子量大於450的核苷酸。因此， 生物分子包括，例如，寡糖和多糖；寡肽，多肽，肽，和蛋白；及寡核苷酸和多核苷酸。寡核苷 酸和多核苷酸包括，例如，DNA和RNA。生物分子還包括上述任何一種分子的衍生物。例如，生物分子的衍生物包括脂類 和寡肽，多肽，肽及蛋白的糖基化衍生物。生物分子的衍生物還包括寡糖和多糖的脂類衍生 物，例如，脂多糖類。在本說明書中，不是生物分子的任何分子都被認為是小分子。本發明的小分子是 具有碳和氫原子，及雜原子的物質，其中雜原子包括，但不限制於，氮，硫，氧和磷。小分子中 的原子經由共價鍵和離子鍵連接；前者通常用於小的有機化合物，例如，小分子酪氨酸激酶 抑制劑，如Iressa 和Tarceva ，後者通常用於小的無機化合物。小的有機分子中的原子排 列可以是一個鏈，例如，碳-碳鏈或碳-雜原子鏈，或含有碳原子的環，例如，苯，或碳與雜原 子的組合，即，雜環，例如，嘧啶或喹唑啉。與環系統連接的小的有機分子中一個或多個鏈的 結合構成取代的環系統，兩個環的稠合構成稠合的多環系統，它們可被簡單稱作多環系統， 其中一個例子是Iressa 的母體構架。小分子包括天然存在的化合物，如激素，神經遞質， 核苷酸，胺基酸，糖，脂類，及其衍生物，和通過常規的有機合成，生物合成，或其組合合成的 那些化合物。見，例如，Ganesan，Drug Discov. Today, 7(1) :47-55 (2002 年 1 月)；Lou，Drug Discov.Today,6(24) :1288-1294(2001 年 12 月)。小分子的某些例子包括有機化合物，有機金屬化合物，有機化合物和有機金屬化合物的鹽，糖，胺基酸，核苷及核苷酸。應當強調的是，小分子可具有任何分子量。它們被稱 作小分子僅僅是因為它們的分子量通常小於450。小分子包括天然存在的化合物及合成的 化合物。小分子和生物藥對人類患者的給藥是通過本領域已知的方法進行的。對於小分子 而言，這種方法的例子在Spada，美國專利5，646，153第57欄第47行-第59欄第67行描 述。給予小分子的描述引入此處作為參考。中和VEGF受體的VEGF活化內皮或非內皮細胞，如腫瘤細胞樣品中VEGF受體活化的中和可在體外或體內進 行。中和VEGF-受體表達細胞樣品中VEGF受體的VEGF活化包括使細胞與本發明的拮抗劑， 例如抗體接觸。細胞是在把VEGF加入到細胞樣品中之前，同時，或之後，在體外與拮抗劑， 例如抗體接觸的。本發明的拮抗劑，例如抗體與VEGF受體的體內接觸是通過把它給予哺乳動物而 實現的。給予哺乳動物的方法包括，例如，口服，靜脈內，腹膜內，皮下，或肌內給藥。這種體內中和法可用於抑制哺乳動物血管發生。血管發生的抑制是一種有效的治 療方法，如用於預防或抑制與病理狀況，如腫瘤生長有關的血管發生。因此，本發明的拮抗 劑，例如抗體是抗-血管發生並抗腫瘤的免疫治療劑。術語哺乳動物是指任何哺乳動物。哺乳動物的一些例子包括寵物，如狗和貓；飼養 動物，如豬，牛，綿羊和山羊；實驗室動物，如小鼠和大鼠；靈長類動物，如猴，無尾猿，黑猩 猩 』及人類。VEGF受體可在某非-內皮細胞，如腫瘤細胞上找到，表明自分泌和/或旁分泌環在 這些細胞中的意外存在。本發明的拮抗劑，例如，抗體可中和這種細胞上VEGF受體的活性， 由此阻斷自分泌和/或旁分泌環，並抑制腫瘤生長。抑制哺乳動物血管發生及病理狀況，如腫瘤生長的方法包括全身給予哺乳動物， 或直接給予哺乳動物內的腫瘤有效量的本發明任何一種拮抗劑，例如抗體，包括其任何一 種功能等同物。哺乳動物優選人。該方法可有效治療患有實體瘤，優選血管瘤，和非實體瘤 的患者。腫瘤生長的抑制或減輕包括阻止或抑制腫瘤，如癌性腫瘤或非癌性腫瘤的進展。 腫瘤的進展包括侵入，轉移，復發和腫瘤大小的增力卩。腫瘤生長的抑制或減輕還包括破壞腫瘤。所有類型的腫瘤都可通過本發明的方法進行治療。腫瘤可以是實體瘤或非實體瘤。可用本發明拮抗劑治療的實體瘤的一些例子包括癌，肉瘤，胚細胞瘤或神經膠質 瘤。這種腫瘤的一些例子包括表皮樣腫瘤，鱗狀細胞腫瘤，如頭和頸部腫瘤，結腸直腸腫瘤， 前列腺腫瘤，乳腺腫瘤，肺腫瘤，包括小細胞和非-小細胞肺腫瘤，胰腺腫瘤，甲狀腺腫瘤， 卵巢腫瘤，和肝腫瘤。其它例子包括卡波濟氏肉瘤，CNS腫瘤，成神經細胞瘤，毛細血管成血 管細胞瘤，腦膜瘤和腦轉移瘤，黑素瘤，胃腸癌和腎癌，及肉瘤，橫紋肌肉瘤，成膠質細胞瘤， 優選多形性成膠質細胞瘤，和平滑肌肉瘤。可使用本發明拮抗劑有效治療的血管化皮膚癌 的例子包括鱗狀上皮細胞癌，基底細胞癌，和皮膚癌，它們通過抑制惡性角質形成細胞，如 人惡性角質形成細胞治療。
非實體瘤的一些例子包括白血病，多發性骨髓瘤和淋巴瘤。白血病的一些例子包 括急性髓細胞性白血病(AML)，慢性髓細胞性白血病(CML)，急性淋巴細胞性白血病(ALL)， 慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，紅細胞性白血病或單核細胞性白血病。淋巴瘤的一些例子包 括與何杰金氏病和非何杰金氏病有關的淋巴瘤。隨後描述的實驗結果證實，本發明的抗體可特異性阻斷VEGF誘導的，在轉染的 3T3細胞中表達的，小鼠胞外flk-1 (VEGFR-2) (VEGFR-幻/胞內fms嵌合受體的磷酸化。所 述抗體對CSF-I完全刺激的嵌合胞外fms/胞內FLK-2受體沒有作用。下面所述的體內研 究表明，所述抗體可顯著抑制裸鼠的腫瘤生長。VEGF受體拮抗劑，例如，單克隆抗體的混合物可為抑制腫瘤細胞生長提供一種特 別有效的方法。該混合物可含有少至2，3或4種抗體，多至6，8或10種抗體。預防或抑制血管發生還可用於治療特徵在於過量血管發生的非瘤性病理疾病，如 新血管性青光眼，增生性視網膜病，包括增生性糖尿病性視網膜病，關節炎，黃斑變性，血管 瘤，血管纖維瘤，和牛皮癬。使用本發明的拮抗劑分離並純化VEGF受體使用常規方法，如親和色譜法，本發明的拮抗劑可用於分離並純化VEGF受體 (Dean 等，Affinity Chromatography :A PracticalApproach, IRL Press， Arlington， VA(1985))0本領域熟知的其它方法包括使用抗體包被的磁珠的磁性分離技術，使用與固體 基質連接的抗體的「淘選」技術，和流式細胞術。VEGF受體的來源通常是血管細胞，特別是血管內皮細胞，它可表達VEGF受體。血 管內皮細胞的適宜來源是血管，如臍帶血細胞，特別是人臍帶血管內皮細胞(HUVEC)。VEGF受體可用作生產其它物質的起始材料，如用於製造其它單克隆和多克隆抗體 的抗原，所述抗體可識別並結合VEGF受體或表達VEGF的細胞表面上的其它抗原。使用本發明的拮抗劑分離並純化flk-1 (VEGFR-2)陽性腫瘤細胞使用常規方法，如親和色譜法，本發明的拮抗劑可用於分離並純化 flk-1 (VEGFR-2) (VEGFR-2)陽性腫瘤細胞，S卩，表達flk_l (VEGFR-2)受體的腫瘤細胞(Dean 等，Affinity Chromatography :APractical Approach,IRL Press,Arlington,VA(1985))。 本領域熟知的其它方法包括使用抗體包被的磁珠的磁性分離技術，細胞毒性劑，如與抗體 偶聯的補體，使用與固體基質連接的抗體的「淘選」技術，和流式細胞術。體外或體內監測VEGF和VEGF受體的水平使用標準測定法和本領域已知的方法，本發明的拮抗劑，例如抗體可用於在體外 或體內監測生物樣品中VEGF或VEGF受體的水平。生物樣品的一些例子包括體液，如血液。 標準測定法包括，例如，標記抗體並進行標準免疫測定法，如本領域熟知的放射性免疫測定法。用於進行本發明的標準重組DNA技術由Sambrook等，在「分子克隆」，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987)中和 Ausubel 等(Eds.)在「分子生物學的當前 方案」，Green Pub lishingAssociates/ffi ley-Inter science, New York (1990)中描述。給藥為進行治療，可把本發明的受體拮抗劑給予腫瘤患者，給藥量足以預防，抑制，或 減輕腫瘤的進展，例如，腫瘤的生長，侵入，轉移和/或復發。足以達到這一目的的量被定義 為治療有效量。用於這種用途的有效量取決於疾病的嚴重程度和患者自身免疫系統的一般狀況。給藥方案還可根據疾病狀況和患者的狀態而改變，通常每天給藥一次或連續輸注多 次給藥(例如，每隔4-6小時)，或由主治醫生根據患者的情況決定。然而，應當注意，本發 明不限於任何特定的劑量。本發明可用於治療任何適宜的腫瘤，包括，例如，乳腺，心臟，肺，小腸，結腸，脾， 腎，膀胱，頭和頸，卵巢，前列腺，腦，胰腺，皮膚，骨，骨髓，血液，胸腺，子宮，睪丸，子宮頸或 肝的腫瘤。優選，當腫瘤是結腸腫瘤或非小細胞肺癌(NSCLC)時，使用本發明的方法。此外，本發明的腫瘤優選過量表達EGFR。在很多人類腫瘤中，都能檢測到升高的 EGFR 表達；例如，頭和頸(80-100% )，結直腸(25-77% )，胰腺(30-50% ) J^ (40-80% ), 食管03-89%)，腎細胞(50-90 % )，前列腺(65%)，膀胱(31-48 ，子宮頸/子宮 (90% )，卵巢(35-70% )和乳腺(14-91% )。EGFR的表達已被證實是預後不良，存活率降 低，和某些腫瘤類型轉移增加的指標。此外，本發明的腫瘤優選具有VEGFR的異常表達或信號傳遞。VEGFR信號傳遞的 提高可在多種不同的人類癌症中觀察到。高水平VEGFR-2是由浸潤神經膠質瘤的內皮細胞 表達的(Plate等，(1992)Nature359 :845-848)。VEGFR-2的水平可由人成膠質細胞瘤產生 的 VEGF 特異性上調(Plate 等，(199 Cancer Res. 53 :5822-5827)。VEGFR-2 在成膠質細 胞瘤相關性內皮細胞(GAEC)中的高水平表達表明，受體活性很可能是在腫瘤形成過程中 被誘導的，這是因為在正常的腦內皮細胞中，幾乎檢測不到VEGFR-2的轉錄物。這種上調被 限定在與腫瘤鄰近的血管內皮細胞。本發明可用於抑制或減輕腫瘤生長。腫瘤生長的抑制或減輕是指預防，抑制，或減 輕腫瘤的發展，例如腫瘤的生長，侵入，轉移和/或復發。此外，本發明還可用於治療血管發 生狀況，如動脈粥樣硬化，關節炎，黃斑變性和牛皮癬。對於所患狀況可用本發明進行治療 的那些患者的鑑定是本領域技術人員能力和知識範圍之內的事情。在本發明中，任何適宜的方法或途徑都可用於給予EGFR拮抗劑和/或VEGFR拮抗 劑，例如，口服，靜脈內，腹膜內，皮下，或肌內給藥。拮抗劑的給藥劑量取決於多種因素，包 括，例如，拮抗劑的類型，所治療腫瘤的類型和嚴重程度，以及拮抗劑的給藥途徑。然而，應 當強調的是，本發明不限於任何一種特定的給藥方法或途徑。在其中一個選擇性實施方案中，EGFR拮抗劑和VEGFR拮抗劑可與一種或多種抗腫 瘤劑聯合給藥。見，例如，美國專利號6，217，866 (khlessinger等)(抗EGFR抗體與抗 腫瘤劑聯合給藥)；美國申請號09/312，286 (Waksal等)(抗EGFR抗體與放療聯合治療)。 任何適宜的抗腫瘤劑都可使用，如化療劑或放療。化療劑的例子包括，但不限制於，順鉬，阿 黴素，紫杉醇，伊立替康(CPT-Il)，拓撲替康或其組合。當抗腫瘤劑是指進行放療時，放射 源對於所治療的患者而言，可以是外在的(外在光束放療-EBRT)或內在的(近程放射治 療-BT)。抗腫瘤劑的給藥劑量取決於多種因素，包括，例如，藥劑的類型，所治療腫瘤的類型 和嚴重程度，及藥劑的給藥途徑。然而，應當強調的是，本發明不限制於任何特定的劑量。在其它選擇性實施方案中，EGFR拮抗劑和VEGFR拮抗劑可與一種或多種適宜的佐 劑，例如，細胞因子(例如，IL-10和IL-13)或其它免疫刺激劑聯合給藥。見，例如，LarriWe 等，supra.然而，應當理解，僅給予EGFR拮抗劑和VEGFR拮抗劑的治療有效方式就足以預 防，抑制，或減輕腫瘤的進展。此外，EGFR拮抗劑和/或VEGFR拮抗劑可作為配體偶聯物給藥，它特異性結合受體，並在配體-毒素內化後，傳遞中毒性致死負荷量。毒素和受體間的偶聯物是為了研究 對EGFR-或VEGFR-過量表達的腫瘤細胞特異的毒劑，同時使非特異性毒性達到最小而設計 的。例如，由EGF和假單胞菌內毒素(PE)組成的偶聯物在體外對表達EGFR的HeLa細胞是 毒性的。各種藥劑，包括硫利達嗪和腺病毒，都可提高細胞對偶聯物的攝取，並增加偶聯物 的細胞毒性。應當理解，為預防或治療目的而用於哺乳動物中的本發明的EGFR和/或VEGFR 拮抗劑可以組合物的形式給藥，所述組合物還含有藥學上可接受的載體。適宜的藥學上可 接受的載體包括，例如，水，生理鹽水，磷酸鹽緩衝的鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇等的一種或多 種，及其組合。藥學上可接受的載體還可包括微量的輔助物質，如溼潤劑或乳化劑，防腐劑 或緩衝劑，它們可提高結合蛋白的保存期或有效性。正如本領域熟知的，可把組合物配製成 注射液，從而在給予哺乳動物後，快速，持續或延遲釋放活性成分。本發明的EGFR拮抗劑和/或VEGFR拮抗劑可以是各種形式。這些形式包括，例如， 固體，半-固體和液體劑型，如片劑，丸劑，粉劑，液體溶液，分散液或混懸液，脂質體，栓劑， 可注射和可輸注的溶液。優選形式取決於目標給藥模式和治療應用。這種拮抗劑可按照製藥領域熟知的方法製備。在製造組合物時，活性成分通常與 載體混合，或用載體稀釋，和/或封在載體內，例如，封入膠囊，藥袋，紙或其它容器中。當載 體作為稀釋劑使用時，它可以是固體，半-固體，或液體材料，它還可作為活性成分的載體， 賦形劑或介質。因此，組合物可以是片劑，錠劑，藥袋，扁囊劑，酏劑，混懸液，氣溶膠(固體 或液體基質)，含有10重量％活性化合物的軟膏劑，軟明膠膠囊和硬明膠膠囊，栓劑，注射 液，懸浮液，無菌包裝的粉劑和局部用藥膏。抑制腫瘤生長的試劑盒本發明還包括抑制腫瘤生長的試劑盒，試劑盒中含有治療有效量的EGFR拮抗劑 和治療有效量的VEGFR拮抗劑。本發明試劑盒的EGFR或VEGFR拮抗劑可以是任何適宜的拮 抗劑，它們的例子已經在上面描述。優選，試劑盒的EGFR拮抗劑包含對EGFR特異的抗體，或 其功能等同物。可選擇性地，還優選試劑盒的EGFR拮抗劑包含對EGFR特異的小分子。試 劑盒的VEGFR拮抗劑優選包含對VEGFR特異的抗體，或其功能等同物。可選擇性地，試劑盒 的VEGFR拮抗劑優選包含對VEGFR特異的小分子。此外，本發明的試劑盒還可含有抗腫瘤 劑。本發明適宜的抗腫瘤劑的例子已經在這裡描述。本發明的試劑盒還可含有佐劑，它們 的例子也已經在上面描述。因此，本發明的受體拮抗劑可用於體內體外的研究，診斷，預防或治療方法，它們 是本領域熟知的。當然，應當了解並預期本領域的技術人員可根據這裡公開的本發明原理 進行改變，這種改變也落在本發明的範圍之內。這裡提到的所有參考文獻全部引入此處作為參考。實施例提出下列實施例的目的是為了幫助理解本發明，而不是，也不應被解釋為以任何 方式限制本發明的範圍。實施例中不包括常規方法的詳細描述，例如在構建載體和質粒， 把編碼多肽的基因插入到這種載體和質粒中，或把質粒引入到宿主細胞中時所用的那些方 法。這種方法是本領域那些普通技術人員熟知的，而且已經在很多公開出版物中描述，包 Sambrook, J.，Fritsch，E. F.和Maniatis，T. (1989)分子克隆實驗室指南，第二版，ColdSpring Harbor LaboratoryPress0實施例1.細胞系和培養基NIH 3T3細胞是從美國典型培養物保藏中心(Rockville MD)獲得的。C441細胞系 是用嵌合受體小鼠flk-1 (VEGFR-幻/人fms轉染3T3細胞構建的。10A2是含有嵌合受體人 fms/小鼠FLK-2的3T3轉染子，它的分離和特性已經描述過(Dosil等，Mol. Cell. Biol. 13 6572-6585(1993))。細胞通常維持在Dulbecco，s改良Eagle，s培養基(DME)中，其中補 充了 10%小牛血清(CS), ImM L-穀氨醯胺，抗生素，和 600 μ g/ml G418 (Geneticin ；Sigma, St Louis MO)。成膠質細胞瘤細胞系，GBM-18維持在補充了 5%小牛血清，ImM L-穀氨醯胺，和抗 生素的DME中。生產分泌可溶性嵌合蛋白，小鼠flk-1 (VEGFR-2) =SEAPs (分泌型鹼性磷酸酶)的 穩定3T3系，並把它維持在DMEM和10%小牛血清中。收集條件培養基。從條件培養基中分 離出可溶性 flk-1 (VEGFR-2) :SEAP。實施例II.單克隆抗體的分離實施例II-1.大鼠抗小鼠flk-1 (VEGFR-2)單克隆抗體DC-101 (IgGl)用免疫複合物使Lewis大鼠(Charles River Labs)超免疫，所述免疫複合物含有 小鼠flk-1 =SEAPs可溶性受體，兔抗-鹼性磷酸酶多克隆抗體和G蛋白瓊脂糖珠。動物在 3個月內，腹膜內注射7次這種複合物(第0，14，21，28，49，63，77天)。在不同的時間，從 動物尾靜脈採集血液，並通過ELISA篩選與mflk-1 (VEGFR-2) =SEAPs高滴定度結合的免疫 血清。最後一次注射5天後，殺死大鼠，無菌除去脾臟。洗滌脾細胞，計數，並與鼠骨髓瘤細 胞系NSl以2 1的比例融合。在HAT培養基中選擇雜交瘤，並通過ELISA篩選特異性結 合mflk-1 (VEGFR-2) SEAPs而不結合SEAPs蛋白的集落。許多陽性雜交瘤進一步擴增並 通過限制稀釋而被克隆三次。下面研究其中一個被稱為DC-IOl的亞克隆。實施例II-2小鼠抗小鼠flk-1 (VEGFR-2)單克隆抗體Mab25和Mab73鼠抗flk-1 (VEGFR-2)單克隆抗體(Mabs)是按照與DC-101所用類似的方法生產 的。簡單地說，使用結合抗SEAP-蛋白/A瓊脂糖複合物或來源於轉染NIH 3T3細胞條件 培養基的小麥胚凝集素瓊脂糖的flk-1 (VEGFR-2)/SEAP可溶性受體給小鼠注射。6個月 內，定期使小鼠超免疫。收集免疫脾細胞，與鼠骨髓瘤細胞系NSI融合。在HAT培養基中 選擇雜交瘤，溫育之後，篩選產生小鼠Mab的集落。與DC-IOl所用的方法不同，首先篩選 結合flk-1 (VEGFR-2)/fms受體的陽性上清液，所述受體捕獲自ELISA平板上的C441細 胞溶解產物，所述ELISA平板包被有針對fms C-末端區的肽產生的多克隆抗體。然後通 過ELISA測定與完整C441細胞，和純化f lk_l (VEGFR-2) /SEAP及單獨的SEAP結合的活性 Mabs。使結合C441，與flk_l (VEGFR-2) /SEAP反應，而不與SEAP反應的雜交瘤上清液擴增， 在腹水中生長，並純化(EZ-PREP，Pharmacia)。在C441細胞上對純化的Mabs進行測定， 通過FACS測定它們的細胞表面結合能力，並在磷酸化測定法中測定它們抑制VEGF誘導的 flk-1 (VEGFR-2)/fms活化的能力。這些研究的結果得到了 Mabs25和73的克隆(同種型 IgGl)，用於根據它們特異性結合flk-1 (VEGFR-2)，以及以與DC-IOl相似的水平阻斷受體 活化的能力而進一步進行表徵。實施例III測定法
實施例II1-1. ELISA 方法抗體是通過固態ELISA篩選的，其中比較了各種mAbs與flk-l(VEGFR_2) =SEAP 和SEAP蛋白的結合特徵。50-100ng/孔，用ρΗ9· 6碳酸鹽緩衝液中的flk-1 =SEAP或AP 包被微量滴定板，4°C過夜。37°C時，用補充有10%新生小牛血清(NBlO)的磷酸鹽緩衝鹽 水封閉平板1小時。37°C時，把雜交瘤上清液或純化抗體加入到平板中溫育2小時，然後 加入與辣根過氧化物酶(Tago)偶聯的山羊抗-大鼠IgG溫育1小時。充分洗滌後，加 入TMB (Kirkegaard和Perry，Gaithersburg MD)和過氧化氫作為色原，在ELISA閱讀器的 450nm處對平板讀數。實施例II1-2同種型分析各單克隆抗體的同種型分析是按照先前所述(SongsakphisarmR.和Goldstein， N. I.，Hybridoma 12 :343-348,1993)使用大鼠同種型特異性試劑(Zymed Labs, South San Francisco CA)進行的。實施例II1-3磷酸化，免疫沉澱和免疫印跡測定法對前述方法(Tessler等)進行改進後，使用C441和10A2細胞進行磷酸化測定和 蛋白質印跡分析。簡單地說，細胞在DME-10% CS中生長至90%匯合，然後在實驗前，使血 清在DME-0. 5% CS中飢餓M小時。HUVEC細胞在EGM基礎培養基中生長至亞匯合。對於 中和測定法而言，在有和沒有mAb DC-101存在時，在沒有血清的條件下(DME-0. 1 % BSA)， 用各種濃度的適宜配體室溫刺激細胞15分鐘。配體VEGF和CSF-I分別以10-80ng/ml和 20-40ng/ml的濃度進行測定。單克隆抗體以0. 5 μ g/ml-10 μ g/ml的濃度測定。為了評估 mAb DC-101對VEGF誘導的flk_l (VEGFR-2) -fms受體活化的作用，同時加入抗體(競爭性 抑制)或在加入配體之前，使抗體與細胞預結合15分鐘。沒有和有DC-101存在時，在沒有 血清的培養基中溫育的細胞分別用作沒有和有抗體存在時的受體自磷酸化的對照。使表達 fms/FLK-2嵌合受體(10A2)的對照細胞系飢餓，用20和40ng/ml CSF-I刺激，在有和沒有 5μ g/mlDC-101存在的情況下測定。刺激後，用含有ImM原釩酸鈉的冰冷PBS洗滌細胞單層。然後，把細胞溶解在 溶解緩衝液(20mM Tris-HCl, ρΗ7· 4，1 % Triton X-100，137mM NaCl，10 % 甘油，IOmM EDTA，2mM 原釩酸鈉，IOOmM NaF，IOOmM 焦磷酸鈉，5mM Pefabloc (Boehr inger Mannheim Biochemicals, Indianapolis I N))，100 μ g 抑肽酶和 100 μ g/ml 亮抑蛋白酶肽)中， 14000xg離心10分鐘。利用多克隆抗體，使蛋白從轉染細胞的澄清溶解產物中免疫沉澱 出來，其中所述多克隆抗體是由與人fms受體C-末端區(Tessler等，J. Biol. Chem. 269, 12456-12461,1994)或與A蛋白瓊脂糖珠偶聯的鼠FLK-2內激酶結構域(Small等，Proc. Nat，1 Acad. Sci. USA，91，459-463，1994)相對應的肽產生的。與 DC-101 或無關大鼠 IgG 的免疫沉澱是用10μ g與G蛋白珠偶聯的抗體進行的。然後用0. 2% Triton X-100, IOmM Tris-HCl ρΗ8. 0,150mM NaCl，2mMEDTA(緩衝液 Α)洗滌珠子一次，用含有 500mM NaCl 的緩 衝液A洗滌珠子兩次，用Tris-HCl，pH8. 0洗滌珠子兩次。把滴幹的珠子與30 μ 12xSDS加 樣緩衝液混合，並在4-12%梯度凝膠(Novex，San Diego CA)中經過SDS PAGE。進行電泳 後，把蛋白印在硝酸纖維素濾膜上進行分析。使濾膜在含有5%牛血清白蛋白和10%脫脂 奶粉(Bi or ad, CA)的封閉緩衝液(50mM Tris-HCl, pH7. 4,150mM NaCl (TBS))中封閉過夜。 為了檢測磷酸化受體，用封閉緩衝液中，針對磷酸酪氨酸的單克隆抗體(UBI，Lake Placid,NY)室溫探測印跡1小時。然後用含有0. 吐溫-20 (TBS-T)的0. 5x TBS洗滌印跡，並用 與辣根過氧化物酶(Amersham)偶聯的山羊抗-小鼠Ig溫育。用TBS洗滌印跡，並用化學 發光試劑(ECL，Amersham)溫育1分鐘。與磷酸化蛋白反應的抗磷酸酪氨酸是通過曝光高 效發光檢測膠片(Hyperfilm-ECL，Amersham)0. 5-10分鐘檢測的。為了檢測C441細胞中flk-1 (VEGFR-2) /fms的受體水平，按照製造商(Amersham) 提供的方法分離印跡，並用抗-fms兔多克隆抗體再次探測。實施例II1-4流式細胞計結合測定法C441細胞在IOcm平板中生長至近匯合。用非-酶促解離緩衝液(Sigma)把細胞移 出，在沒有血清的冷培養基中洗滌，並重懸浮在補充了 BSA(HBSS-BSA)的Hanks平衡鹽 溶液中，濃度為每隻試管1百萬個細胞。在每隻試管中加入10 μ g單克隆Ab DC-101或同種 型匹配的無關抗體抗FLK-223H7，在冰上再保持60分鐘。洗滌後，加入5 μ 1與FITC(TAGO) 偶聯的山羊抗-小鼠IgG，在冰上保持30分鐘。洗滌細胞3次，在Iml HBSS-BSA中重懸浮， 並在Coulter Epics Elite細胞計數器上進行分析。螢光第二抗體的非特異性結合是根據 缺少第一抗體的樣品測定的。實施例II1-5完整細胞的結合測定法使用在M孔培養皿中生長至匯合的細胞對C441細胞進行測定。HUVEC細胞在6 孔培養皿中生長至匯合。用結合緩衝液(DMEM，50mMHEPES pH7. 0，0. 5%牛血清白蛋白)中 不同量的mAb DC-1014°C溫育細胞單層2小時。然後用冷的磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)洗 滌細胞，用終濃度為2. 5 μ g/ml，與生物素偶聯的第二抗-大鼠IgG抗體溫育。4°C溫育1小 時後，洗滌細胞，並用鏈黴抗生物素-辣根過氧化物酶複合物4°C溫育30分鐘。洗滌後，通 過用比色檢測系統(TMB，Kirkeggard和Perry)測量MOnm處的吸光度而測定細胞結合抗 體。單獨的第二抗體的OD 540nm用作非特異性結合的對照。實施例II1-6細胞增殖測定法促有絲分裂測定法是用Cell Titer 96非放射性細胞增殖測定試劑盒(Promega Corp. ,Madison，WI)進行的。在該測定法中，根據活細胞把四唑鹽還原成甲脂產物所獲 得的值比色測量增殖。簡單地說，HUVEC細胞以1000個細胞/孔的密度，在EGM基礎培養 基中的M孔明膠包被的平板中生長。溫育48小時後，向孔中加入各種成分。在有和沒有 1 μ g/ml mAb DC-101存在時，向培養基中加入10ng/ml VEGF0加入肝素(Sigma)至最終濃 度為1 μ g/ml。然後再溫育該細胞3天。為測量細胞生長，向各孔中加入20 μ 1四唑染料的 等分試樣，37°C溫育該細胞3小時。溶解細胞，測量甲臘產物的吸光度(0D570)，從而量化 增殖。實施例IV.體外活性測定法實施例IV-1.鼠抗-flk-1 (VEGFR-2)Mabs 25 和 73 弓丨起 VEGF 誘導的 flk-1 (VEGFR-2)/fms受體活化的特異性中和測定法是用從等濃度flk-1 (VEGFR-2) /fms轉染的3T3細胞系C441中免疫沉澱出 來的FLK/fms和PDGF受體進行的，而人EGFR是從腫瘤細胞系KB中免疫沉澱出來的。細 胞在有和沒有10 μ g/ml鼠抗-fIk-IMabs 25和37存在時，用含有20ng/ml VEGF (flk-1/ fms), DMEM-10% 小牛血清(PDGFR)，或 10ng/ml EGF (EGFR)的 RPMI-0. 5% BSA 刺激。刺激 後，用PBS-ImM原釩酸鈉洗滌細胞並溶解。Flk-1/fms和PDGFR是從溶解產物中免疫沉澱的，所述溶解產物具有分別針對c-fms (IM133) C-末端區和PDGF (UBI)受體的肽產生的多克 隆抗體。EGFR用針對人受體N-末端區溫育的Mab ￠22 免疫沉澱。免疫沉澱的溶解產物 經過SDS聚丙稀醯胺電泳，接著進行蛋白質印跡分析。用抗-PTyr Mab(UBI)探測印跡，以 檢測受體活化。相對於無關Mab和未受刺激的對照組評估受刺激細胞的受體中和。實施例IV-2使用Mab25和Mab73作為探針，通過蛋白質印跡檢測 flk-1 (VEGFR-2) /fms 受體受體是用鼠抗-flk-1(VEGFR-2)Mabs 在 flk_l (VEGFR-2)/fms 受體的蛋白質印 跡上檢測的，所述flk-1 (VEGFR-2)/fms受體是由針對c-fms受體C-末端區的肽產生的 多克隆抗體免疫沉澱的，而c-fms受體則來源於等濃度轉染的3T3細胞系C441的溶解產 物。通過SDS凝膠電泳和蛋白質印跡分析後，把印跡分成四部分，每部分都用50yg/ml的 抗-flk-1 (VEGFR-2)Mabs 25和73探測。然後分離印跡，並用抗-fms多克隆抗體再次探測， 以證實由各Mab檢測的帶代表flk-1 (VEGFR-2) fms受體。實施例IV-3通過用抗-flk-1 (VEGFR-2) Mabs免疫沉澱而檢測來源於VEGF刺激的 HUVEC 和 0VCAR-3 細胞的活化 KDR(VEGFR-2)蛋白是用來源於新鮮分離的HUVEC溶解產物的不同抗體免疫沉澱的。在溶解前， 用RPMI-0. 5 % BSA中的20ng/ml VEGF室溫刺激細胞10分鐘，並用含ImM原釩酸鈉的PBS洗 滌。各次免疫沉澱是用等體積溶解產物進行的，然後經過SDS聚丙烯醯胺電泳，接著進行蛋 白質印跡。最初用抗-PTyr Mab (UBI)探測印跡，隨後分離，並用針對flk_l/KDR(VEGFR_l/ VEGFR-2, IM 142)內激酶的肽產生的多克隆抗體再次探測，接著用針對flk_l (VEGFR-2) C-末端區的多克隆抗體(Santa CruzBiotechnology, Inc.)探測。免疫沉澱是用無關大 鼠 Mab，23H7，無關小鼠 Mab，DAB8，和抗 flk-1 (VEGFR-2) Mabs, DC-101，73，25，和抗 flk-1/ KDR(VEGFR-l/VEGFR-2)多克隆抗體，IM142進行的。在某些情況下，分離印跡，並用抗 flk-lMabs 73和25再次探測，以檢測交叉反應帶。類似方法用於檢測卵巢癌細胞系0VCAR-3的KDR(VEGFR_2)受體形式。實施例V抗體的活性實施例V-IELISA和用DC-101免疫沉澱人們發現大鼠IgGl單克隆抗體DC-IOl對鼠酪氨酸激酶受體flk_l (VEGFR-2)特 異。ELISA數據表明，抗體與純化的flk-1 (VEGFR-2) :SEAP結合，但不與鹼性磷酸酶或其它 受體酪氨酸激酶如FLK-2結合。如圖1所示，DC-IOl可使鼠flk_l (VEGFR-2) SEAPS免疫 沉澱，而不能使單獨的SEAPS免疫沉澱。實施例V-2用DC-IOl抑制Flk_l (VEGFR-2)受體磷酸化進行實驗以便確定DC-IOl是否能通過其關聯配體VEGF165中和C441細胞中 flk-1 (VEGFR-2)的磷酸化。在這些研究中，單克隆抗體和VEGF在室溫同時加入到細胞單層 中15分鐘。這些條件被設計成測定抗體對受體/配體結合的競爭性作用(競爭性抑制)。 圖加所示的這些測定結果表明，當在有DC-IOl存在的情況下測定細胞時，VEGF165誘導的 flk-1 (VEGFR-2)/fms受體磷酸化顯著降低。此外，這些數據表明，Mab與VEGF165競爭阻止 配體導致的受體完全活化。為了測定VEGF-fIk-I (VEGFR-2)相互作用對DC-101所致抑制 的敏感性，C441細胞是以最大刺激濃度的VEGFlfj40ng/ml)結合各種水平的抗體測定的。 這些Mab滴定的結果在圖2b中給出。當DC-101的濃度大於0. 5 μ g/ml時，VEGF165所致的flk-1 (VEGFR-2)磷酸化顯著降低。這些數據表明，相對較低濃度的抗體(< 1 μ g/ml)足以 抑制配體所致的受體活化。在80ng/ml的配體過量存在時，5 μ g/ml抗體就能夠中和VEGF165 對flk-1 (VEGFR-2)的刺激。作為對照，使用CSF-I在完全刺激的fms/FLK-2受體(10A2細 胞系)上測試DC-101的作用。在這些條件下，DC-101對受體活化沒有影響。實施例V-3利用DC-101進行抑制研究通過研究進一步評估Mab抑制的程度和特異性，其中在加入配體之前，用細胞預 溫育DC-101，以便使抗體與受體充分作用。在這些實驗中，用5 μ g/ml DC-101，通過常規 方法(ImClone, NY)製備的大鼠抗_FLK_2Mab (2A13)，和對照組大鼠IgGl (Zymed Labs)室 溫溫育細胞單層15分鐘，然後加入40ng/ml VEGF165再溫育15分鐘。為了比較而進行 測定，其中同時加入DC-101和VEGF165(競爭性抑制)。這些研究的結果(圖4)表明，用 flk-1 (VEGFR-2)/fms轉染的細胞預溫育的抗-flk_l (VEGFR-2)單克隆抗體可完全消除 VEGF165所致的受體活化。類似結果是用VEGF121進行刺激觀察到的。當加入無關同種型匹 配的大鼠抗體不會影響VEGF所致的flk-1 (VEGFR-2)磷酸化時，用抗-fms多克隆抗體探測 的相同印跡的活性顯示，每道受體蛋白的水平相同。這些數據表明，使用DC-101觀察到的 磷酸化抑制是由於受體活化的阻斷，而不是試驗樣品中缺少受體蛋白。實施例V-4通過FACS分析DC-101與C441細胞的結合通過FACS分析測定mAb與flk-1 (VEGFR-2)/fms受體(C441細胞)轉染的3T3細胞 的結合。圖6所示結果證明，在C441細胞表面上表達的嵌合flk-1 (VEGFR-2)/fms可被mAb DC-101特異性識別，而不能被針對相關酪氨酸激酶受體，FLK-2溫育的同種型抗體識別。 HiAb-受體在細胞表面相互作用的效率是根據測定法確定的，其中在完整的C441細胞上測 量mAb結合的不同水平。圖7所示的這些結果表明，mAb以大約500ng/ml相對較顯著親和性 與flk-1 (VEGFR-2)/fms受體結合。這些結果表明，mAb對細胞表面表達的flk_l (VEGFR-2) 具有較強的親和性。實施例V-5通過免疫沉澱測定DC-101的反應性DC-101與flk-1 (VEGFR-2)/fms受體的反應程度是在被VEGF活化後，測定抗 體使受體免疫沉澱的能力而進一步評估的。圖8表示VEGF刺激的C441細胞磷酸化 flk-1 (VEGFR-2)/fms受體的mAb DC-101所致的免疫沉澱。結果表明DC-101單克隆抗 體和抗fms多克隆抗體具有相似的受體作用水平，而大鼠抗FLK-2抗體2H37 (IgGl)和 2A13(IgG2a)則沒有反應性。然後進行實驗，確定mAb DC-101是否能夠在配體的最大刺激 濃度(40ng/ml)中和VEGF誘導的flk_l (VEGFR-2)/fms磷酸化。在這些研究中，把單克隆 抗體與配體同時加入到細胞單層中，或在配體刺激之前加入，室溫測定15分鐘。對這些條 件進行研究，以確定抗體對受體/配體結合的競爭性作用(競爭性抑制)和預結合抗體阻 止受體活化效果。圖4所示的這些測定結果表明，flk-1 (VEGFR-2)/fms的磷酸化是通過 同時加入mAb和VEGF降低的，並可被與受體預結合的抗體明顯抑制。這些數據的光密度掃 描揭示，mAb DC-101與flk-1 (VEGFR-2)/fms相互作用，抑制磷酸化至完全刺激的受體對照 組G道)的6% (5道，P)和40% (6道，C)。根據這些數據我們可推斷mAb DC-101與配 體-受體相互作用激烈競爭，中和flk-Ι受體的活化。為了確定VEGF-flk-1 (VEGFR-2)相 互作用對mAb DC-101所致抑制的敏感性，在抗體濃度逐漸增加時，用最大的VEGF水平測定 C441細胞。測定是在競爭和預結合條件下，用mAb進行的。這些mAb滴定的結果在圖9中給出。當mAb DC-101與濃度大於0. 5 μ g/ml的VEGF抗體競爭時，可觀察到f lk_l (VEGFR-2) 磷酸化的顯著降低。這些數據還表明，相對較低濃度的預結合抗體(< 1 μ g/ml)足以完全 抑制配體所致的受體活化。實施例V-6通過磷酸化測定法測定DC-101的活性為進一步評估mAb DC-101對受體活化的拮抗作用，進行磷酸化測定，其中把固定 量的抗體(5 μ g/ml)加入到用量逐漸增加的配體所刺激的C441細胞中(圖3a)。通過光密 度測定法的讀數量化有和沒有mAb DC-101時各配體濃度誘導的磷酸化水平。圖北給出的 這些數據的圖表明，即使有過量VEGF存在，抗體也能部分中和受體磷酸化。為了評估mAb DC-101對受體活化的特異性，測試了抗體競爭性抑制3T3轉染細胞系10A2中，CSF-I誘導 的fms/FLK-2受體活化的能力。在這些實驗中，測試了 5 μ g/ml的mAb DC-101和已知導 致受體完全活化的CSF-I濃度O0-40ng/ml)。圖10所示的這些結果表明，mAb DC-101對 CSF-I介導的fms/FLK-2受體磷酸化沒有作用。實施例V-7通過預溫育研究DC-101的抑制作用通過研究進一步評估抗體抑制的程度和特異性，其中DC-101或無關抗體是在加 入配體前用細胞預溫育的，以確保抗體與受體充分作用。在這些實驗中，細胞單層是在加 Λ 40ng/ml VEGF 前，用 5 μ g/mlDC-101，大鼠抗 FLK_2mAb (2A13)或對照大鼠 IgGl (Zymed Labs)預溫育的。為了進行對比，還進行了競爭性測定，其中同時加入抗體和VEGF。這些研 究的結果表明，只有把抗flk-l(VEGFR-2)單克隆抗體與flk-l(VEGFR-2)/fms轉染的細胞 預溫育才能夠完全消除VEGF所致的受體活化，而加入無關同種型匹配的大鼠抗體則不能 影響VEGF所致的flk-1 (VEGFR-2)磷酸化。用抗-fms多克隆探測同一印跡的活性(圖11) 顯示，每道的受體蛋白水平相等。這些數據表明，用mAb DC-101處理過的細胞觀察到的磷 酸化不足是由於阻斷了 VEGF-誘導的等量表達受體的磷酸化。實施例V-8抗體與同源受體形式的相互作用然後進行實驗，確定抗flk-l(VEGFR_2)單克隆抗體是否與人內皮細胞上的同源 受體形式相互作用。在克隆的HUVEC細胞(ATCC)上，對濃度逐漸增加的DC-101進行的滴定 表明，抗體具有複雜的結合行為。數據表示不同抗體與存在於內皮細胞上的VEGF受體的相 互作用(Vaisman等，J. Biol. Chem. 265，19461-19466，1990)。然後在與圖8報導的那些相 似的條件下，利用磷酸化測定法描述DC-101與VEGF刺激的HUVEC細胞相互作用的特異性。 在這些研究中，當扣除配體成分時，DC-101可使HUVEC細胞的蛋白帶免疫沉澱，所述蛋白帶 分子量與交聯VEGF-受體帶的那些相似(圖12)。當VEGF刺激細胞時(比較圖12中的1道 和2道)，這些帶顯示磷酸化的增加。此外，VEGF誘導的受體帶磷酸化是通過在測定時加入 1 μ g/ml肝素而加強(圖12中的3道)。這些發現與先前報導過的，存在低濃度肝素時，VEGF 與內皮細胞結合的增加相一致(Gitay-Goren 等，J. Biol. Chem. 267,6093-6098. 1992)。很難確定免疫沉澱蛋白與DC-101相互作用可產生圖12觀察到的複雜的磷酸化 帶，圖12給出了各種受體形式與HUVEC上VEGF的結合，及刺激後它們締合的可能性。據報 道，分子量約為180 (KDR(VEGFR-2) ),155,130-135，120-125和85的細胞表面表達的受體形 式可結合HUVEC上的VEGF。這種發現強調了若干不同受體形式在配體刺激後異二聚的可能 性，其異二聚的方式與KDR-flk-l(VEGFR-2/VEGFR-l)相似。然而，除了 KDR(VEGFR_2)夕卜， 這些受體形式的準確特性和作用還不明確。所以，抗體反應性可能是因為與其中不依賴於KDR(VEGFR-2)的VEGF受體中之一相互作用而引起的。通過FACS分析可知，DC-101既不與ELISA形式的人KDR(VEGFR_2)反應，也不與 新鮮分離的HUVEC結合。這些結果表明，DC-101與人KDR(VEGFR-2)直接作用是不大可能 的。通過FACS分析可知，與DC-101不同，Mab 25和Mab 73都與ELISA形式的人 KDR(VEGFR-2)反應，並結合新鮮分離的HUVEC。實施例V-9HUVEC的促有絲分裂測定法有和沒有抗體存在時，在用VEGF刺激的HUVEC細胞(ATCC)的促有絲分裂測定法 中對抗體進行試驗，可觀察到DC-101對內皮細胞的抑制作用。這些結果表明，VEGF所致的 細胞增殖的顯著增加可被DC-101大約減少35%。在這些測定法使用的生長條件下，肝素對 細胞生長沒有不同的作用。因為DC-101可對VEGF誘導的增殖和HUVEC的受體磷酸化起作用，因此可以想得 到這些結果是由於Mab與不定受體形式相互作用，其中不定受體形式很難接近細胞表面， 但可對HUVEC生長發揮某些作用，儘管這種作用很小。且，DC-101可把分子量合適的磷酸 化帶從VEGF-刺激的HUVEC中免疫沉澱出來的事實表明，DC-101可與和活化受體有關的不 定fIk-I (VEGFR-2)樣蛋白相互作用。實施例V-IOMab 25和Mab 73與C441細胞和HUVEC的結合通過FACS分析可知，Mabs 25和73可結合C441和HUVEC，並可在兩個細胞系中內 化。蛋白質印跡的結果表明，兩種抗f Ik-IMabs都可檢測由抗fms多克隆抗體從C441細胞 中免疫沉澱出來的FLK/fms受體帶。(見上面實施例IV-2的方法)。這些抗體可引起VEGF 誘導的f Ik-I (VEGFR-2) /fms受體的特異性中和，而且對PDGF所致的小鼠PDGF受體磷酸化 或EGF所致的人EGF受體磷酸化沒有作用。(見上述實施例IV-I的方法)。由增殖測定法 可知，它們具有抑制VEGF刺激的HUVEC至50%的能力，而DC-101則影響生長至很小的程 度。實施例V-IIKDR (VEGFR-2)與 Mab25 和 Mab73 的免疫沉澱KDR (VEGFR-2)代表一類可利用Mab 25和Mab 73從活化HUVEC中免疫沉澱出 來的磷蛋白。KDR(VEGFR-2)是在蛋白質印跡中檢測的，並使用抗f lk_l/KDR(VEGFR_l/ VEGFR-幻多克隆抗體(IMl^)從VEGF-刺激的早期傳代HUVEC進行免疫沉澱分析。相 反，利用這些抗體從VEGF-刺激的HUVEC中免疫沉澱出來的帶與IM142交叉反應，而不與 抗-flt-Ι (抗-VEGFR-1)多克隆抗體交叉反應。以實驗證據為基礎，根據這些發現推斷出， Mabs可影響HUVEC中KDR(VEGFR_2)的活性，並且暗示作為VEGF受體的KDR(VEGFR_2)與活 化內皮細胞中的增殖反應有關。(見上面實施例IV-3的方法)實施例VI非內皮(腫瘤)細胞上VEGF受體形式的存在通過免疫沉澱對若干腫瘤系進行篩選，以確定它們與DC-101的蛋白反應性，並用 抗磷酸酪氨酸檢測。細胞系8161(黑素瘤)和A431(表皮樣癌)的免疫印跡可產生分子量 約為170和120kd的磷酸化帶。這些結果表明，人VEGF受體形式在非內皮細胞，如腫瘤細 胞中表達。類似的實驗顯示，KDR(VEGFR-2)樣受體在卵巢癌細胞系，0VCAR-3中表達。這 些細胞似乎也分泌VEGF。磷酸化帶是利用抗-KDR (VEGFR-2)多克隆抗體從VEGF-刺激的0VCAR-3細胞中免疫沉澱出來的，通過蛋白質印跡分析可知，它可與抗f Ik-I (VEGFR-2) Mabs反應。且，利用鼠Mabs從這些細胞中免疫沉澱出來的帶可與同一多克隆抗體交叉反 應。此外，由增殖測定法可知，某些鼠抗-flk-l(VEGFR-2)Mabs可引起對這些細胞的抑制 作用。這些結果證實了人VEGF受體形式的非內皮表達(即，在腫瘤細胞上表達)。磷酸化 和增殖測定的數據還表明，VEGF可調節腫瘤發生過程中，自分泌和旁分泌方式的受體活性。 (見上述實施例IV-3的方法)實施例VII使用DC-101進行體內研究實施例VII-I利用DC-101體內抑制血管發生設計進行體內研究是為了確定抗flk-1 (VEGFR-2)單克隆抗體能否阻斷表達VEGF 的腫瘤細胞生長。在這些實驗中，使用了人多形性成膠質細胞瘤細胞系，它具有高水平的 VEGF信息，而且可在沒有血清的培養基中處理M小時後，分泌大約5ng/ml的VEGF生長因 子(圖5)。第0天，給無胸腺裸鼠(nu/nu ；Charles River Labs)側腹注射1_2百萬個成膠質 細胞瘤細胞。在同一天開始，給動物腹膜內注射DC-101或對照抗體(100μ g/動物)。隨後， 在第 3,5,7,10,12, 14，17，19，和 21 天，小鼠接受抗體治療。在第 0，3，5，7，10，12，14，17， 19，和21天，給動物注射100 μ g DC-101或鼠FLK-2 (2A13)受體的對照大鼠抗體，每隻動物 共接種lmg。腫瘤在第5天開始出現，一直持續50天。每天用測徑規測量腫瘤大小，並利用 下列公式計算腫瘤體積p/6x較大直徑x(較小直徑)2(Baselga J. Nat'l Cancerlnst. 85 1327-1333)。每周至少測量3次，並按照上面所述計算腫瘤體積。DC-101組中，有一隻患有 腫瘤的動物在研究的早期死亡，不能用於測定兩組之間的統計學顯著差異。圖1 和14b表示38天後，DC-101和2A13對照組之間，各動物腫瘤生長減輕的 比較。雖然在研究過程中，所有動物腫瘤的大小和數量都發生了變化，但用DC-101治療過 的小鼠在腫瘤進展過程中表現出全面的延遲。DC-101組的其中一隻小鼠保持沒有腫瘤一直 到第49天才發現較小的生長。儘管那樣，腫瘤生長還是被顯著抑制。對數據進行統計學分 析，以便評估兩組之間腫瘤大小的差異。對數據進行協方差的標準分析，其中腫瘤大小隨治 療時間而減小。結果表明，在腫瘤大小隨時間而減小的方面，DC-101組與注射2A13的小鼠 明顯不同(P < 0. 0001)。圖15表示DC-101對無胸腺裸鼠的治療效果，所述無胸腺裸鼠中移植了分泌VEGF 的人成膠質細胞瘤細胞系GBM-18。給裸鼠皮下注射GBM-18細胞，並把它們分成3個治療 組PBS對照組，無關大鼠IgGl對照組，和DC-101。治療與腫瘤的異種移植同時進行，並持 續4周。結果表明，與對照組相比，用DC-101治療過的裸鼠中的GBM-18腫瘤生長顯著降低。 該實驗表明，DC-101通過阻斷腫瘤相關性血管內皮細胞上flk-1 (VEGFR-2)的VEGF活化而 抑制腫瘤生長，且DC-101作為針對分泌VEGF的血管化腫瘤的抗-血管發生劑具有治療價 值。flk-1 (VEGFR-2)受體酪氨酸激酶的單克隆抗體可通過消除血管發生而抑制腫瘤 侵入。侵入性生長和血管發生是惡性腫瘤的重要特徵。兩個現象都被證實適於在表面移植 測定法中區分良性和惡性的角質形成細胞。把與膠原凝膠結合的細胞單層移植到裸鼠背肌 上後，最初形成的所有腫瘤細胞構成鱗狀上皮，但只有惡性角質形成細胞在2-3周內侵入 性生長。良性及惡性細胞都可誘導血管發生。然而，惡性細胞的血管發生反應發生較早，更強，且毛細血管向著惡性上皮生長。此外，在良性腫瘤細胞的移植物中，毛細血管在2-3周 後消退，而惡性角質形成細胞則維持不間斷的血管發生水平。血管內皮生長因子(VEGF)及 其關聯配體在腫瘤血管發生中起著關鍵的作用。DC-101的給藥可破壞不間斷的血管發生， 從而抑制腫瘤侵入。抗體可阻止新形成的血管網的成熟及進一步擴展，但不能顯著幹擾最 初的血管發生誘導。這些結果證實腫瘤侵入需要在先的血管發生，VEGF受體在維持這種模 型系統的血管發生中至關重要。實施例VII-2不同濃度的DC-101對所確立的成膠質細胞瘤(gbm_18)的作用給無胸腺小鼠(nu/nu)皮下接種GBM_18(人多形性成膠質細胞瘤)。當腫瘤的 平均體積達到100-200mm3時，開始抗體治療。治療包括下列6次注射(每周2次，注射3 周)⑴每次注射200，400或800g的DC-101 ； (ii)無關同種型匹配的大鼠IgG(每次注射 400 μ g)；或(iii)PBS。用測徑規測量腫瘤體積。與PBS和無關單克隆抗體組相比，DC-101 組的腫瘤抑制比較顯著(*)。其它實驗可證實大鼠抗flk-1 (VEGFR-2)單克隆抗體DC-101對裸鼠GBM-18腫瘤 生長的作用。第0天，給動物(nu/nu ；Charles RiverLabs ；10隻動物/組)皮下注射GBM-18 細胞(人成膠質細胞瘤[100] ； 1百萬/只動物)。第7天開始用PBS或DC-101 (每次注射 200 μ g)治療，每周兩次，持續3周(6x)。曲線圖表示各組隨時間改變的平均腫瘤體積和 消退數據，圖中還給出了它們各自的腫瘤生長速度(斜率以λ表示；實線)和99%置信限 (虛線)。用DC-101處理過的動物的曲線斜率與PBS的明顯不同(ρ<0.01)。值得注意的 是，無關大鼠IgGl單克隆抗體(抗小鼠IgA ；Pharmigen)對GBM-18異種移植物的生長沒有 影響，其結果與使用PBS觀察到的相似(沒有給出數據)。實施例VIII抗flk-1 (VEGFR-2)抗體可選擇性增加放療誘導的裸鼠中人腫瘤異種 移植物的治癒率該實施例是為了評估可阻斷鼠腫瘤血管內皮細胞上的重要VEGF受體-2， flk-1 (VEGFR-2)的單克隆抗體DC-101能否增加分次放療(RT)導致的腫瘤異種移植物的治 愈可能性，以及該抗體能否同時調節正常組織(小鼠皮膚)的放療反應。材料&方法把人小細胞肺癌54A和多形性成膠質細胞瘤U87皮下植入到裸鼠的 後腿中。當腫瘤直徑達到8mm時(第0天)開始治療。每3天腹膜內注射20或40mg/kg 體重的DC-101，共注射6次。連續5天，每天給予相等的分次放療總劑量。第0天，小鼠第 一次注射抗體，或開始RT。對於聯合療法而言，DC-101給藥在第0天開始，RT在第1天開 始。治療後，每周測量腫瘤大小2-3次。在任一組中觀察到腫瘤復發後，跟蹤有局部對照腫 瘤的小鼠90天。在開始RT後的前30天內，使用記分量表評估腫瘤放療區域的急性皮膚反 應。結果單獨使用的抗體可以劑量依賴性的方式抑制兩種腫瘤的生長(但不會消 退)。這種作用在54A中比在U87異種移植物中更顯著。在任一模型中，與單獨進行RT相 比，把最低劑量(共25-30Gy)的放療與DC-101聯合可進一步延遲腫瘤的生長。抗體也是 以劑量依賴性的方式增加RT的治癒效果。例如，較高劑量的DC-101可使局部控制50%腫 瘤所需的放療劑量降低在54A異種移植物中為1. 7倍(從單獨進行RT時的67. 6Gy降至 聯合療法的39. IGy)；在U87中為1. 3倍(從97. 8-74. 8Gy)。還有一點特別重要，那就是 DC-101的這種作用對腫瘤是選擇性的。即，沒有檢測到抗體對皮膚放療反應的平行改變。正如在其它實驗中評估的，DC-101誘導的腫瘤放療反應的提高與它們的輻射敏化或氧化的 改變無關，而與抗體顯著降低腫瘤間質液壓有關。結論結果共同表明，針對這些生長因子分子主要受體的抗體對VEGF-信號傳遞 途徑的阻斷可選擇性加強分次RT的腫瘤治癒反應；並因此提供一種治療法。實施例IX.生產單鏈抗體實施例IX-I材料實施例IX-I (a)細胞系和蛋白 原代培養的HUVEC維持在37°C，5% CO2的EBM-2培養基中。使用2-5代的細胞進行 所有測定。VEGF165蛋白在杆狀病毒中表達並純化。通過RT-PCR從人類胎兒腎臟的mRNA中 分離編碼KDR(VEGFR-2)胞外域的互補DNA，並把它亞克隆到載體AP-Tag的BglII和BspEI 位點中。在該質粒中，KDR(VEGFR-2)胞外域的cDNA在讀框中與人胎盤AP的cDNA融合。 所述質粒與新黴素表達載體PSV-Neo —起被電穿孔到OTH 3T3細胞中，並用G418選擇穩定 的細胞克隆。使用AP的固定化單克隆抗體，通過親和色譜法從細胞培養物上清液中純化出 可溶性融合蛋白KDR-AP。實施例IX-I (b)小鼠免疫法和單鏈抗體噬菌體展示文庫的構建給雌性BALB/C小鼠腹膜內(i. p.)注射200 μ 1 RIBI佐劑系統中的10 μ g KDR-AP 兩次，接著在2個月內，在沒有RIBI佐劑系統的條件下，腹膜內注射1次。在第一次免疫接 種時，給小鼠皮下(s. c.)注射200 μ 1 RIBI中的10 μ g KDR-AP。實行安樂死前，給小鼠腹 膜內加強20 μ g KDR-AP三天。除去供體小鼠的脾臟，並分離細胞。提取RNA並從脾細胞的 總RNA中純化出mRNA。使用mRNA構建scFv噬菌體展示文庫，它是在絲狀噬菌體M13的表 面展示的。scFv在絲狀噬菌體表面展示時，抗體的Vh和\結構域是通過15個胺基酸長的接 頭(GGGGS)3連接在一起的，並與噬菌體蛋白III的N-末端融合。為了進行檢測和分析，把 15個胺基酸長的E標記(其後面是琥珀密碼子(TAG))插入到\的C-末端和蛋白III之 間。位於E標記和蛋白III間的琥珀密碼子可使該構建體在轉移到抑制宿主(如TGI細 胞)中時，構成表面-展示形式的scFv，並在轉移到非抑制宿主(如HB2151細胞)中時，構 成可溶性形式的scFv。把組裝的scFv DNA連接到pCANTAB 5E載體中。把轉化的TGl細胞鋪於2YTAG平 板上並進行溫育。把集落刮在IOml 2YT培養基中，與5ml 50%甘油混合，_70°C貯存，作為 文庫的原液。實施例IX-I (c)生物淘選文庫原液生長至對數期時，把它引入到Mi;3K07輔助噬菌體中，並於30°C時，在 2YTAK培養基QYT含有100 μ g/ml氨苄西林和50 μ g/ml卡那黴素)中過夜擴增。噬菌體 製品在4% PEG/0. 5M NaCl中沉澱，在3%脫脂奶/含500 μ g/ml AP蛋白的PBS中重懸浮， 37°C溫育1小時，以捕獲展示抗AP scFv的噬菌體並阻斷其它非特異性結合。首先於37°C 時用 3%奶/PBS 封閉包被有 KDR-AP (10 μ g/ml)的 Maxisorp Mar 試 管(Nunc,Denmark) 1小時，然後用噬菌體製品室溫溫育1小時。用PBST洗滌試管10次，然 後用PBS (PBS含0. 1 %吐溫20)洗滌10次。用Iml新鮮製備的IOOmM三乙胺溶液室溫洗 脫結合噬菌體10分鐘。37°C用IOml對數中期的TGl細胞溫育洗脫的噬菌體30分鐘，靜置30分鐘，振搖。然後把感染的TGl細胞鋪於2YTAG平板上，30°C過夜溫育。在第三輪淘選後篩選出來的克隆有99% (185/186)是特異性的KDR(VEGFR_2)結 合劑。然而，在這些結合劑中，只有15(8% )個能阻斷KDR(VEGFR-2)與固定化VEGF的結 合。這15個克隆的DNA BstN I指紋表明存在2種不同的消化模式；而21個隨機抽取的 VEGF非阻斷劑產生了 4種不同的模式。第二輪淘選之後，可在已經鑑定的克隆中見到所有 的消化模式。各消化模式的代表克隆是從第二輪淘選後回收的克隆中挑選的，並進行DNA 測序。在15個測過序的克隆中，鑑定了 2個獨特的VEGF阻斷劑和3個非阻斷劑。其中一 個scFv，p2A7既不結合KDR(VEGFRj)，又不阻斷VEGF與KDR(VEGFRj)的結合，因此被選 作所有研究的陰性對照。實施例IX-I (d)噬菌體的ELISA各TGl克隆37°C時在96孔平板中生長，並按照上面所述把它引入到Μ1!3Κ07輔助 噬菌體中。用1/6體積的18%奶/PBS室溫阻斷擴增的噬菌體製品1小時，然後加入到包 被有KDR-AP或ΑΡ(1μ g/ml χ 100 μ 1)的Maxi-sorp 96孔微量滴定板(Nunc)中。室溫溫 育1小時後，用PBST洗滌該平板3次，並用兔抗M13噬菌體Ab-HRP偶聯物溫育。洗滌平板 5次，加入TMB過氧化物酶底物，使用微量平板讀數器讀出450nm處的0D，鑑定並對scFv抗 體測序。實施例IX-I (e)可溶性scFv的製備各個克隆的噬菌體用於感染非抑制大腸桿菌宿主HB2151和在2YTAG-N平板上 選擇的感染物。scFv在HB2151細胞中的表達是通過30°C時，在含有ImM異丙基-1-硫 代-B-D-吡喃半乳糖苷的2YTA培養基中培養細胞誘導的。細胞的胞質提取物是通過把細 胞沉澱重懸浮在25mMTris(pH 7. 5)中，並於4°C時，輕輕振搖溫育1小時製備的，其中25mM Tris (pH 7.5)含有 20% (w/v)蔗糖，200mM NaCl, ImM EDTA 禾Π 0. ImMPMSF。15，OOOrpm 離 心15分鐘後，使用RPAS PurificationModule (Pharmacia Biotech)通過親和色譜法從上 清液中純化出可溶性scFv。實施例IX-2測定法實施例IX-2(a)定量KDR (VEGFR-2)結合測定法使用兩種測定法定量檢測純化的可溶性scFv與KDR(VEGFRj)的結合。4個不同的克隆，包括兩個VEGF阻斷劑，PlCll和plF12，一個非阻斷劑，優勢克隆 P2A6和非結合劑p2A7是利用非抑制宿主大腸桿菌HB2151細胞在搖瓶中表達的。可溶性 scFv是通過抗-E標記親和色譜法從大腸桿菌的胞質提取物中純化出來的。這些克隆的純 化scFv的產率為100-400 μ g/1培養物。在直接結合測定法中，把不同量的可溶性scFv加入到KDR(VEGFRj)包被的96孔 Maxi-sorp微量滴定平板中，室溫溫育1小時，用PBST洗滌平板3次。然後用100 μ 1小鼠 抗E標記抗體室溫溫育該平板1小時，接著用IOOpl兔抗-小鼠抗體-HRP偶聯物培養。在 進行上述噬菌體ELISA過程後，洗滌平板並顯影。在另一測定法，即競爭性VEGF阻斷測定法中，把不同量的可溶性scFv與固定量的 KDR-AP(50ng)混合，室溫溫育1小時。然後把混合物轉移到包被有VEGF165QOOng/孔)的 96孔微量滴定平板中，室溫溫育2小時，之後洗滌平板5次，加入AP的底物，從而量化結合 的KDR-AP分子。然後計算IC5tl，即，抑制KDR(VEGFR-2)與VEGF結合的50%所需的scFv濃
圖16表示通過直接結合ELISA測定的，scFv與固定化KDR(VEGFR_2)的劑量依賴 性結合。如圖17所示，克隆PlCll和plF12也可阻斷KDR(VEGFR-2)與固定化VEGF的結合， 但P2A6不能。圖17所示的數據是三次測量的平均值士SD。陰性對照克隆p2A7，既不結合 KDR(VEGFR-2)，也不阻斷KDR(VEGFR_2)與VEGF的結合(圖16禾口 17)。克隆plCll,即每輪 淘選後的優勢克隆，顯示出最高的KDR(VEGFR-2)結合能力和阻斷VEGF與KDR(VEGFR_2)結 合的最高效力(表1)。使克隆PlCll與KDR(VEGFR-2)結合最大的50%所需的抗體濃度 和抑制KDR(VEGFR-2)與VEGF結合的50%所需的濃度分別為0. 3nM和3nM(圖17)。FACS 分析證實，plCll，plF12和p2A6也能結合在HUVEC細胞表面表達的受體。實施例IX-2 (b)可溶性scFv的BIAcore分析可溶性scFv與KDR(VEGFR_2)的結合動力學是用BIAcore生物傳感器(Pharmacia Biosensor)測量的。把KDR-AP融合蛋白固定在傳感器晶片上，注射62. 5nM-1000nM濃度的 可溶性scFv。獲得各濃度的傳感圖，並使用BIA Evaluation 2. O程序評估，以測定速率常 數kon和koff。Kd是根據速率常數koff/kon的比值計算的。表1表示BIAcore儀器上表面等離子共振的結果。阻斷VEGF的scFv，plCll和 P1F12分別以2. 1和5. 9nM的Kd與固定化的KDR(VEGFR_2)結合。非阻斷性scFv，p2A6與 KDR(VEGFR-2)結合時，其親和性比最好的結合劑plCll弱6倍，這主要是由於其更快的解離 速率。正如所預期的，p2A7不與BIAcore上的固定化KDR(VEGFR_2)結合。實施例IX_2(c)磷酸化測定法磷酸化測定法是按照前述方法，用早期傳代HUVEC進行的。簡單地說，在有或沒有 5 μ g/ml scFv抗體存在時，在補充了 0. 5 %牛血清白蛋白，沒有血清的EBM-2基礎培養基中 室溫溫育HUVEC 10分鐘，接著用20ng/ml VEGF165室溫刺激15分鐘。溶解細胞，使用與兔 抗-KDR(抗VEGFR-2)多克隆抗體(ImClone Systems Incorporated)偶聯的蛋白A瓊脂糖 珠把KDR(VEGFRj)受體從細胞溶解產物中免疫沉澱出來。洗滌珠子，與SDS加樣緩衝液混 合，對上清液進行蛋白質印跡分析。為了檢測KDR(VEGFRj)的磷酸化，用抗-磷酸酪氨酸 Mab,4G10探測印跡。對於MAP激酶活性測定法而言，用SDS-PAGE分辨細胞溶解產物，接著 使用磷酸-特異性MAP激酶抗體進行蛋白質印跡分析。所有信號都是用ECL檢測的。結果表明，阻斷VEGF的scFv plCll能夠抑制VEGF刺激的KDR(VEGFR_2)受體磷 酸化，而非阻斷性scFv p2A6則不能。此外，plCll還可有效抑制VEGF-刺激的MAP激酶 p44/p42活化。相反，plCll和p2A6都不能抑制FGF-刺激的MAP激酶p44/p42活化。實施例IX-2 (d)抗有絲分裂測定法把HUVEC(hl03個細胞/孔)鋪於96孔組織培養平板上的200 μ 1沒有VEGF， bFGF或EGF的EBM-2培養基中，37 °C溫育72小時。把不同量的抗體一式兩份加到孔中， 37°C預溫育1小時，之後加入VEGF165至16ng/ml的終濃度。溫育18小時後，向各孔中加入 0. 25 μ Ci的[3H=-TdR(Amersham)，再溫育4小時。把細胞放在冰上，用含血清的培養基洗 滌兩次，然後用10% TCA在4°C時溫育10分鐘。然後用水洗滌細胞1次，並在25 μ 1的2% SDS中溶解。加入閃爍液(150 μ 1/孔)，在閃爍計數器(ffallach, Model 1450 Microbeta ScintillationCounter)上測定已摻入DNA的放射性。scFv抗體阻斷HUVEC上VEGF-刺激的促有絲分裂活性的能力在圖18中表示。阻斷VEGF的scFv plCll可有力抑制HUVEC上VEGF誘導的DNA合成，其EC5tl，即抑制50% VEGF-刺激的HUVEC促有絲分裂的抗體濃度約為5nM。非阻斷性scFv p2A6對VEGF所致的 促有絲分裂活性沒有抑制作用。plCll和p2A6都不能抑制HUVEC中bFGF誘導的DNA合成 (沒有標出)。圖18所示數據表示至少3次獨立的實驗。(！)僅有VEGF ； (A)沒有VEGF。實施例IX-3從plCll生產嵌合抗體實施例IX_3(a)細胞系和蛋白原代培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)在37°C，5%C02mEBM-2培養基中維持。用 2-5代的細胞進行全部測定。VEGF165和KDR(VEGFR-2)鹼性磷酸酶融合蛋白(KDR-AP)分別 在杆狀病毒和NIH 3T3細胞中表達，並按上述過程純化。抗-KDR(抗-VEGFR^scFv plCll 和scFv p2A6，一種結合KDR (VEGFR-2)，但不阻斷KDR (VEGFR-2) -VEGF相互作用的抗體，是 從噬菌體展示文庫中分離出來的，噬菌體展示文庫是按上面所述，從使用KDR(VEGFR-2)免 疫的小鼠構建的。C225是一種針對表皮生長因子(EGF)受體的嵌合IgGl抗體。見上文。實施例IX-3 (b) scFv plCll可變結構域的克隆ρICll 的輕鏈(Vl) (SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO 16)和重鏈(Vh) (SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 15)的可變結構域是分別使用引物1和2，引物3和4，通過PCR從scFv表達載 體克隆的。然後分別使用引物5和2，引物5和4，通過PCR把哺乳動物細胞分泌的蛋白前 導肽序列加到八和5』端。引物 1 :5，CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA GAC ATC GAGCTC 3，[SEQ ID No 37]引物 2 :5，TCG ATC TAG AAG GAT CCA CTC ACG TTT TAT TTC CAG 3，BamHI [SEQ ID No 38]引物3 :5，CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAG GTC AAGCTG 3，[SEQ ID No 39]引物 4 5' TCG AAG GAT CCA CTC ACC TGA GGA GAC GGT 3，BamHI [SEQID No :40]引物 5 :5，GGT CAA AAG CTT ATG GGA TGG TCA TGT ATC ATC CTT TTTHind III CTA GTA GCA ACT 3，[SEQ ID No :41]實施例IX-3 (c)嵌合plCllIgG表達載體的構建構建用於表達嵌合IgG輕鏈和重鏈的獨立載體。克隆八基因是用Hind III和 BamH I消化的，並連接到含人κ輕鏈恆定區(Q)的載體ρΚΝΙΟΟ中，從而製造嵌合plCll 輕鏈，c-plCll-L的表達載體。克隆乂11基因是用Hind III和BamH I消化的，並連接到含人 IgGl(y)重鏈恆定區(Ch)的載體PGID105中，從而製造嵌合plCll重鏈，c-plCll-H的表 達載體。兩個構建都是通過限制酶消化檢驗的，並通過雙脫氧核苷酸測序加以證實。如圖19所示，Vh和\結構域在它們的5』端與編碼所標前導肽序列(SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24)的基因片段準確融合。V1^P \結構域分別經由Hind III/BamH I位 點連接到表達載體PG1D105中，含有人γ 1恆定區基因的cDNA形式，和表達ρΚΝΙΟΟ中，含有 人κ鏈恆定區基因的cDNA形式。在兩種情況下，表達都是在HCMVi啟動子的控制下進行 的，並由人工終止序列終止。根據Kabat等在高變序列定義中的規定，輕鏈和重鏈互補決定 區(OTR)殘基是下面劃線的部分，並分別標出了⑶R-Hl至H3，⑶R-Ll至L3。⑶R-Hl (SEQ ID NO 1 和 SEQ IDNO 9) ；CDR_H2(SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 10) ；CDR_H3(SEQ ID NO 3和 SEQ ID NO 11) ；CDR-Ll (SEQ ID NO :4禾口 SEQ ID NO 12) ；CDR-L2 (SEQID NO :5禾口 SEQ ID NO 13) ；CDR-L3(SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO 14)。實施例IX-3 (d) IgG的表達和純化COS細胞與等量c-plCll-L和c-plCll-H質粒共轉染，進行瞬時IgG表達。把在 150mm培養皿的DMEM/10% FCS中生長的亞匯合COS細胞用20ml含40mM Tris (pH 7. 4)的 DMEM 衝洗一次，然後用 4mlDMEM/DEAE-葡聚糖 /DNA 混合物(DMEM 含有 40mM Tris, 0. 4mg/ ml DEAE-葡聚糖(Sigma)，和 20 μ g c-plCll-L 和 c-plCll-H 質粒)37°C溫育 4. 5 小時。把 細胞用鈿1 DMEM/含IOOnM氯喹(Sigma)的2% FCS在37°C時培養1小時，接著用1. 5ml 20%甘油/PBS室溫溫育1分鐘。用DMEM/5% FCS洗滌細胞兩次，在20ml相同的培養基中 37°C過夜溫育。然後用純DMEM洗滌細胞兩次後，把細胞培養基更換成沒有血清的DMEM/ HEPES0在轉染後的第48和120小時，收集細胞培養物的上清液。按照製造商(Pharmacia Biotech)描述的方法，使用G蛋白柱通過親和色譜法從合併的上清液純化嵌合IgG。收集 含IgG的部分，把緩衝液更換成PBS，並用Centricon 10濃縮器(Amicon Corp.，Beverly, ΜΑ)濃縮。IgG純度是通過SDS-PAGE分析的。純化抗體的濃度是使用山羊抗-人y鏈特異 性抗體作為捕獲劑，使用HRP-偶聯的山羊抗-人k鏈抗體作為檢測劑，利用ELISA測定的。 使用臨床級抗體校準標準曲線。用G蛋白進行親和純化後，在SDS-PAGE中見到一個約150kD的單一蛋白帶。使用 HRP-偶聯的抗人IgGlFc特異性抗體進行的蛋白質印跡分析證實，純化蛋白中存在人IgG的 Fc部分(沒有標出)。ELISA的結果表明，與親代scFv相比，c-plCll可更有效地結合固定化的 KDR(VEGFR-2)(圖 20)。實施例IX-4測定和分析實施例IX-4 (a) FACS 分析早期世代的HUVEC細胞在缺失生長因子的EBM-2培養基中生長過夜，從而誘導 KDR(VEGFR-2)的表達。採集細胞，並用PBS洗滌3次，用c-plCll IgG(5 μ g/ml) 4°C溫育1 小時，接著用 FITC標記的兔抗人Fc 抗體(Capper，Organon Teknika Corp. ,West Chester, PA)再溫育60分鐘。洗滌細胞，利用流式細胞計(Model EPICS , CoulterCorp. ,Edison, NJ)進行分析。圖21是表示c-plCll與表達KDR(VEGFR_2)的HUVEC結合的FACS分析曲線圖。 正如先前使用親代scFv plCll所見，c-plCll特異性結合在早期世代的HUVEC上表達的 KDR(VEGFR-2)。 實施例IX-4 (b)定量的KDR (VEGFR-2)結合測定法把不同量抗體加入到包被有KDR (VEGFR-2)的96孔Maxi_sorp微量滴定平板 (Nunc. Danmark)中，室溫溫育1小時，然後用含0. 1 %吐溫20的PBS洗滌平板3次。室溫 使該平板用100 μ 1 scFv的小鼠抗E標記抗體-HRP偶聯物(Wiannacia Biotech)，或嵌合 IgG的兔抗人IgGFc特異性抗體-HRP偶聯物(Cappel，Organon Teknika Corp.)溫育1小 時。洗滌平板5次，加入TMB過氧化物酶底物(KPL，fetitherSburg，MD)，利用微量平板讀數 器(Molecular Device, Sunnyvale, CA)讀出 450nm 處的 0D。圖20是表示抗體與固定化KDR(VEGFR-2)直接結合的曲線圖。與親代scFv相比，c-plCll可更有效地結合固定化的KDR(VEGFRj)受體。實施例IX-4 (c) BIAcore 分析抗體與KDR (VEGFR-2)的結合動力學是用BIAcore生物傳感器(Pharmacia Biosensor)測量的。把KDR(VEGFR-2)-AP融合蛋白固定在傳感器晶片上，注射25nM_200nM 濃度的抗體或VEGF。獲得各濃度的傳感圖，並用BIA Evaluation 2. O程序評估，從而測定 速率常數kon和koff。Kd是用速率常數koff/kon的比值計算的。BIAcore分析揭示，與親代scFv相比，c-plCll與KDR(VEGFR_2)的結合親和性更 高(表2)。c-pICll的Kd為0. 82nM，而scFv的Kd為2. InM0 c-plCll親和性的增加主要 是由於二價嵌合IgG的解離速率(koff)較低。值得注意的是，c-plCll與KDR(VEGFR-2)的 結合親和性與天然配體VEGF與KDR(VEGFRj)的結合親和性類似，在BIAcore分析中測定 為 0. 93nM (表 2)。實施例IX-4 (d)競爭性VEGF結合測定法在第一個測定法中，把不同量抗體與固定量的KDR(VEGFRD-AP(50ng)混合，室 溫溫育1小時。然後把混合物轉移到包被有VEGF165 QOOng/孔)的96-孔微量滴定板中，室 溫溫育2小時，然後洗滌平板5次，加入AP的底物(對-硝基苯基磷酸，Sigma)，從而量化 結合的KDR(VEGFR-2)-AP分子。然後計算EC5tl，即，抑制KDR(VEGFR_2)與VEGF結合的50% 所需的抗體濃度。圖22表示c-plCll可阻斷KDR(VEGFR_2)受體與固定化VEGF的劑量依賴性結合。 與scFv 2. OnM的IC5tl值相比，嵌合抗體可更有效地阻斷VEGF-KDR (VEGFR-2)的相互作用， 其IC5tl值(即，抑制KDR(VEGFR-2)與VEGF結合的50%所需的抗體濃度)為0. 8nM。對照 scFv p2A6也可結合KDR (VEGFR-2)(圖20)，但不阻斷VEGF-KDR (VEGFR-2)的相互作用(圖 22)。在第二個測定法中，把不同量的c-plCll抗體或冷的VEGF165蛋白與固定量125I標 記的VEGF165混合，加入到包被有KDR(VEGFRj)受體的96孔微量滴定板中。室溫溫育該平 板2小時，洗滌5次，計算結合固定化KDR(VEGFR-2)受體的放射性標記的VEGF165量。測 定阻斷放射性標記的VEGF與固定化KDR(VEGFR-2)受體結合的50%所需的c-plCll和冷 VEGF165的濃度。放射性標記的VEGF165的結合抑制結果在圖23中表示。所示數據為三次測 量的平均值。c-plCll可以劑量依賴性方式與125I標記的VEGF有效地競爭結合固定 化KDR(VEGFR-2)受體。正如所預期的，C225，一種針對EGF受體的嵌合抗體既不結合 KDR(VEGFR-2)受體，也不阻斷VEGF-KDR (VEGFR-2)的相互作用(沒有表示)。實施例IX_4(e)磷酸化測定法在進行實驗前，使亞匯合的HUVEC細胞在缺失生長因子的EBM-2培養基中生長 M-48小時。用50nM原釩酸鈉預處理30分鐘後，在有或沒有抗體存在時，溫育該細胞15分 鍾，接著用20ng/ml的VEGF165或lOng/ml的FGF室溫刺激15分鐘。然後在溶解緩衝液(50nM Tris, 150mM NaCl, 1% NP-40,2mM EDTA，0. 25%脫氧膽酸鈉，ImM PMSF，1 μ g/ml 亮抑蛋白 酶肽，1 μ g/ml胃蛋白酶抑制劑，10 μ g/ml抑肽酶，pH7. 5)中溶解該細胞，細胞溶解產物用 於KDR(VEGFRj)和MAP激酶磷酸化測定。KDR(VEGFRj)受體是用與抗KDR(VEGFRj)抗體， Mab4. 13(ImClone Systems)偶聯的 A 蛋白瓊脂糖珠(Santa CruzBiotechnology，Inc.，CA)從細胞溶解產物中免疫沉澱出來的。蛋白用SDS-PAGE分辨，並經過蛋白質印跡分析。為了 檢測 KDR(VEGFR-2)磷酸化，用抗磷酸酪氨酸 Mab，PY20 (ICN Biomedicals, Inc. Aurora, OH) 探測印跡。對於MAP激酶活性測定而言，細胞溶解產物是用SDS-PAGE分辨的，接著使用磷 酸特異性MAP激酶抗體(New EnglandBioLabs, Beverly, ΜΑ)進行蛋白質印跡分析。所有 信號都是用ECL(AmershanuArlington Heights, IL.)檢測的。在兩個測定法中，用多克隆 抗KDR(VEGFR-2)抗體(ImClone Systems)再次探測該印跡，從而確保在SDS-PAGE凝膠各 道中加樣等量的蛋白。c-plCl 1可有效抑制VEGF-刺激的KDR(VEGFR-2)受體磷酸化和p44/p42MAP激酶 的活化。相反，C225則對VEGF-刺激的KDR(VEGFR-2)受體活化和MAP激酶沒有任何抑制作 用。單獨的c-plCll和C225對KDR(VEGFR-2)受體和p44/p42MAP激酶的活性沒有任何作 用。正如前面使用scFv plCll所見到的，c-plCll不能抑制FGF-刺激的p44/p42MAP激酶活 化(沒有表示)。此外，scFv p2A6和p2A6的嵌合IgG形式(c-p2A6)都不能抑制VEGF-刺 激的KDR(VEGFR-2)受體和MAP激酶的活化(沒有表示)。實施例IX-4 (f)抗有絲分裂測定抗KDR(VEGFR_2)抗體對VEGF-刺激的人內皮細胞有絲分裂的作用是用HUVEC，通 過[3H]-TdR DNA摻入測定法測定的。把HUVECGxlO3個細胞/孔)鋪板於96-孔組織培養 平板上200 μ 1沒有VEGF，bFGF或EGF的EBM-2培養基中，37°C溫育72小時。把不同量抗 體一式兩份加入到孔中，37°C預溫育1小時，然後加入VEGF165至16ng/ml的終濃度。溫育 18小時後，向各孔中加入0.25 μ Ci的[3H]-TdR，再溫育4小時。用閃爍計數器測定已摻入 DNA的放射性。圖M所示數據表示至少3次的獨立實驗。c-plCl 1和scFv plCll可有效抑制VEGF刺激的HUVEC有絲分裂(圖。與親 代scFv相比，c-plCll對VEGF-誘導的HUVEC有絲分裂而言，是一種更強的抑制劑。抑制 VEGF-誘導的HUVEC有絲分裂的50%所需的抗體濃度分別是c_plCll為0. 8nM，scFv為 6nM。正如所預期的，scFv p2A6對VEGF-刺激的內皮細胞增殖沒有任何抑制作用。根據上述說明以及很容易獲得的參考文獻和起始材料，本發明是可行的。然 而，申請人已經在美國典型培養物保藏中心，12301ParklawnDrive，Rockville，Md.， 20852USA(ATCC)中，保藏了下列產生單克隆抗體的雜交瘤細胞系1994年1月沈日保藏的，產生大鼠抗小鼠flk_l (VEGFR-2)單克隆抗體的雜交瘤 細胞系 DC-IOl (ATCC 保藏號 HBl 1534)。1996年7月19日保藏的，產生小鼠抗小鼠flk_l (VEGFR-2)單克隆抗體Mab 25的 雜交瘤細胞系M25. 18A1 (ATCC登記號HB12152)。1996年7月19日保藏的，產生小鼠抗小鼠flk_l (VEGFR-2)單克隆抗體Mab 73的 雜交瘤細胞系M73. 24 (ATCC保藏號HB12153)。保藏是根據布達佩斯條約的規定，在用於專利程序及其條例(布達佩斯條約)的 國際微生物保藏機構進行的。這樣做可確保活培養物自保藏之日起維持30年。根據布達 佩斯條約，在申請人和ATCC之間達成協議的情況下，可從ATCC獲得生物體，這樣可確保在 相關美國專利公開之後，不受限制地使用它。按照專利法的規定，在實行該發明時，無須在 任何行政機構的授權下使用保藏菌株。表1 抗-KDR (VEGFR-2) scFv 抗體的 KDR (VEGFR-2)結合分析
權利要求
1.治療有效量的血管內皮VEGFR拮抗劑在製備用於與化療劑聯合抑制人腫瘤生長的 藥物中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其中所述腫瘤過量表達VEGFR。
3.根據權利要求1或2所述的用途，其中所述腫瘤是乳腺，心臟，肺，小腸，結腸，脾，腎， 膀胱，頭和頸，卵巢，前列腺，腦，胰腺，皮膚，骨，骨髓，血液，胸腺，子宮，睪丸，子宮頸或肝的 腫瘤。
4.根據權利要求1-3任何一項所述的用途，其中所述腫瘤是結腸腫瘤。
5.根據權利要求1-3任何一項所述的用途，其中所述腫瘤是非小細胞肺癌(NSCLC)。
6.根據權利要求1-5任何一項所述的用途，其中所述VEGFR拮抗劑是用於靜脈內給藥。
7.根據權利要求1-5任何一項所述的用途，其中所述VEGFR拮抗劑是用於口服給藥。
8.根據權利要求1-7任何一項所述的用途，其中所述VEGFR拮抗劑抑制VEGFR與其配 體結合。
9.根據權利要求1-8任何一項所述的用途，其中所述VEGFR拮抗劑結合VEGFR。
10.根據權利要求1-9任何一項所述的用途，其中所述VEGFR拮抗劑包含對VEGFR特異 的抗體，或其功能等同物。
11.根據權利要求1-10任何一項所述的用途，其中所述VEGFR拮抗劑是DClOl。
12.根據權利要求2-11任何一項所述的用途，其中所述EGn 拮抗劑是C225。
13.根據權利要求2-10任何一項所述的用途，其中所述VEGFR拮抗劑是DClOl，並且所 述EGFR拮抗劑是C225。
14.根據權利要求1-10任何一項所述的用途，其中所述VEGFR拮抗劑包含對VEGFR特 異的小分子。
15.根據權利要求1-10任何一項所述的用途，其中所述VEGFR拮抗劑是fms樣酪氨酸 激酶受體(flt-1) VEGFR-I的拮抗劑。
16.根據權利要求1-15任何一項所述的用途，其中該藥物進一步包含一種佐劑。
17.根據權利要求1-16任何一項所述的用途，其中所述腫瘤過量表達EGFR。
18.根據權利要求2-17任何一項所述的用途，其中所述EGFR拮抗劑用於靜脈內給藥。
19.根據權利要求2-17任何一項所述的用途，其中所述EGFR拮抗劑用於口服給藥。
20.根據權利要求2-19任何一項所述的用途，其中所述EGFR拮抗劑抑制EGFR與其配 體結合。
21.根據權利要求2-20任何一項所述的用途，其中所述EGFR拮抗劑結合EGFR。
22.根據權利要求2-21任何一項所述的用途，其中所述EGFR拮抗劑抑制EGFR與ATP糹口口。
23.根據權利要求2-22任何一項所述的用途，其中所述EGFR拮抗劑包含對EGFR特異 的抗體，或其功能等同物。
24.根據權利要求2-22任何一項所述的用途，其中所述EGFR拮抗劑包含對EGFR特異 的小分子。
25.根據權利要求23所述的用途，其中所述抗體含有人類抗體的恆定區。
26.根據權利要求23所述的用途，其中所述抗體是含有小鼠抗體可變區的嵌合抗體。
27.根據權利要求23所述的用途，其中所述抗體是含有可變區的人源化抗體，而可變區則含有小鼠抗體的互補決定區(CDRs)和人類抗體的構架區。
28.根據權利要求23所述的用途，其中所述抗體是含有人類抗體可變區的人類抗體。
29.根據權利要求1-11和14-17任何一項所述的用途，其中所述化療劑選自順鉬，阿黴 素，紫杉酚及其組合。
30.根據權利要求1-11、14-17和四任何一項所述的用途，其中所述化療劑不與VEGF 受體拮抗劑偶聯。
31.根據權利要求1-11、14-17和30任何一項所述的用途，其中所述化療劑選自順鉬， 達卡巴嗪，更生黴素，雙氯乙基甲胺，鏈脲黴素，環磷醯胺，卡莫司汀，羅氮芥，阿黴素，柔紅 黴素，丙卡巴胼，絲裂黴素，阿糖孢苷，依託泊苷，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，長春花鹼，長春新 鹼，博萊黴素，紫杉醇，多西他賽，阿地流津，天門冬醯胺酶，白消安，卡鉬，克拉屈濱，達卡巴 嗪，氟尿苷，氟達拉濱，羥基脲，異環磷醯胺，幹擾素α，利普安，甲地孕酮，美法侖，巰基嘌 呤，普卡黴素，米託坦，培加帕酶，噴司他丁，哌泊溴烷，光輝黴素，鏈脲黴素，他莫昔芬，替尼 泊苷，睪內酯，硫鳥嘌呤，噻替派，尿嘧啶氮芥，維諾利賓，苯丁酸氮芥，紫杉酚及其組合。
全文摘要
本發明涉及用血管內皮生長因子受體拮抗劑抑制腫瘤生長的聯合療法。具體地，本發明提供一種減輕或抑制哺乳動物中腫瘤生長的方法，包括用治療有效量的VEGF受體拮抗劑與放療，化療，和/或其它受體拮抗劑聯合治療哺乳動物。
文檔編號A61P35/00GK102133403SQ20101058401
公開日2011年7月27日 申請日期2002年3月4日 優先權日2002年3月4日
發明者I·戈爾茨坦 尼爾, 帕特裡夏·羅克韋爾 申請人:英克隆有限責任公司