三肽碸和四肽碸的製作方法

2023-04-23 18:46:51

專利名稱：三肽碸和四肽碸的製作方法
技術領域：
本發明涉及三肽碸(tripeptide sulfone)和四肽碸(tetrapeptidesulfone)、含有其的藥物組合物、其藥物應用以及其製備。
背景技術：
美國專利第5599903號；第5763570號；第5767086號；第5786336；和第5955432號；歐洲專利公開第0 645 397號；和PCT國際公開號WO 95/08563和WO 96/40205披露了是還原的穀胱甘肽(L-γ-穀氨醯基-L-半胱氨醯甘氨酸)的類似物的多種三肽和四肽化合物，包括下面化學式的化合物[WO 95/08563] 以及它們的C1-10烷基或者鏈烯基或者C7-12芳烷基酯、醯胺，以及混合的酯/醯胺，其中Z為S，O，或C；n為1至3；當Z為S或O且n為1時，X是可選包含1或2個不相鄰的O，S，或N雜原子，未取代或者用滷素，-NO、-NO2、-NR2、-OR、或-SR(其中R為H或C1-4烷基)單取代或者二取代的C1-20烴基；當Z為S且n為2時，一個X是按上述定義，而另一個X是C1-4烷基；以及當Z為C且n為3時，一個X是按上述定義，而另兩個X獨立地是H或者C1-4烷基；YCO是γ-glu、β-asp、glu、asp、γ-glu-gly、β-asp-gly、glu-gly、asp-gly；以及AAc是通過肽鍵連接至該化合物其餘部分的胺基酸。
這些化合物據稱具有多種用途，包括作為用於表徵穀胱甘肽S-轉移酶(GST)同功酶、確定細胞和組織的GST補體(complement)的試劑，作為色譜親合配體，粘合劑以及酶抑制劑；以及在治療學上，用於增強化療劑在腫瘤細胞中的細胞毒效果、選擇性地產生在腫瘤細胞中的細胞毒性、提高骨髓中粒細胞-巨噬細胞(GM)祖細胞的產生、刺激骨髓的分化、減輕化療劑的骨髓破壞效果、以及調節骨髓的造血作用。
TLK117，在那些專利和出版物中被確定為TER117，並不同地命名為γ-Glu-Cys(Bz)-苯基Gly、γE-C(Bz)-_G、γE-C(Bz)-PG、γE-C(苄基)-_G、和苄基PG，就是這些化合物中的一種。TLK117是具有以下化學式的化合物
並且可以命名為L-γ-穀氨醯基-S-(苯甲基)-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸。TLK117抑制GST P1-1的IC50大約為400nM。TLK199，在那些專利和出版物中被確定為TER199，是TLK117的二乙酯；而TLK261和TLK262則分別是二甲酯和二異丙酯。
美國公開申請號2003/0100511和PCT國際公開號WO00/44366披露了以下化學式化合物的二酯的脂質製劑，包括脂質體製劑 其中每個酯為1-25C；YCO為γ-glu或者β-asp；G*是苯基甘氨酸；Z是CH2、O、或S；以及X是6-8C的烷基、苄基或者萘基，或者其藥用鹽；或者以下化學式的化合物
其中R1和R2獨立地選自直鏈或支鏈的烷基基團(1-25C)、環烷基基團(6-25C)、取代的烷基基團(2-25C)、雜環基(6-20C)、醚或聚醚(3-25C)，或者其中R1-R2(2-20C)一起形成具有該化學式的大環；以及R3是6-8C的烷基、苄基、或萘基，或者其藥用鹽。
Townsend等人的Mol.Cancer Ther.，1(12)，1089-1095(2002)披露了以下化學式的化合物 「乙烯基碸」，是canfosfamide的GST-介導裂解的兩個產物之一，canfosfamide是以下化學式的GST-活化的抗癌劑， 其披露在美國專利第5556942號和PCT國際公開號WO 95/09866中，在那裡其被稱為TER 286。
許多疾病是以減少的骨髓為特徵，包括骨髓增生異常綜合症(MDS)，一種形式的白血病前期病，其中骨髓產生不足量的三種主要血液成分(白細胞、紅細胞和血小板)中的一種或多種。骨髓抑制-血細胞水平的降低以及骨髓中新血細胞產生的減少，也是很多常用化療藥的普遍的毒性作用。
TLK199已經顯示在體外誘導HL-60前髓細胞性白血病細胞的分化，增強體外和體內的細胞毒劑的活性，並刺激正常人外周血中造血祖細胞的所有三個譜系的集落的形成。在臨床前試驗中，TLK199已經顯示出增加正常動物中以及其白細胞因使用順鉑或者氟尿嘧啶的治療被消耗的動物中的白血細胞的產生。類似的效果可能提供一種治療MDS的新方法。TLK199目前正在被進行用於治療MDS的二期臨床試驗的評價。來自該試驗的中間結果(報告於2004和2005 American Society of Hematology會議)證實了TLK199被很好地耐受並且導致多譜系血液改善。這些結果還啟示出TLK199在治療化療引起的血細胞減少方面的潛在作用。
開發出用於人的GST P1-1的強效抑制劑，以增強化療劑在腫瘤細胞中的細胞毒素效果、選擇性地產生在腫瘤細胞中的細胞毒性、提高骨髓中GM祖細胞的產生、刺激骨髓的分化、減輕化療劑的骨髓抑制效果、以及調節骨髓的造血作用，是合乎需要的。

發明內容
在第一方面，本發明提供以下化學式的化合物
其中X為L-γ-穀氨醯基或者L-γ-穀氨醯基甘氨醯基；Y為H，可選取代的烷基、可選取代的雜烷基、可選取代的芳基、可選取代的芳烷基、可選取代的雜芳基、或者可選取代的雜芳烷基；以及Z為C5-9烷基、可選取代的芳基、可選取代的芳烷基、可選取代的雜芳基、或者可選取代的雜芳烷基；以及它們的C1-10烷基、苯基-C1-3烷基、或者(C5-6雜芳基)-C1-3烷基的單酯或者二酯；以及這些化合物的鹽及其單酯和二酯的鹽。
該化合物(尤其是以酸形式)在體外是GST P1-1的抑制劑，典型地是選擇性的抑制劑。在二酯形式中，它們也已經顯示出在來自體外HL-60細胞的GSTπ的免疫沉澱反應方面有效，並且對體外的HL-60細胞有細胞毒性。它們也在增強體外HL-60細胞的分化方面有活性，並且一種化合物已經顯示出增強從體外鼠骨髓細胞的粒細胞/單核細胞集落的形成。從這一點以及從與TLK117、TLK199和有關的化合物的結構相似性看，本發明的化合物因此有望在人的治療方面起作用以致增強化療劑在腫瘤細胞中的細胞毒性效果、選擇性地產生在腫瘤細胞中的細胞毒性、提高骨髓中GM祖細胞的產生、刺激骨髓細胞的分化、減輕化療劑的骨髓抑制效果、以及調節骨髓的造血作用。
在第二方面，本發明涉及包含本發明第一方面的化合物和可選的一種或多種賦形劑的藥物組合物。
在第三方面，本發明涉及通過給予本發明第一方面的化合物或者本發明第二方面的藥物組合物的治療方法，尤其是對人的治療方法，以用於下列中的一項或多項增強化療劑在腫瘤細胞中的細胞毒性效果、選擇性地產生在腫瘤細胞中的毒性、提高骨髓中GM祖細胞的產生、刺激骨髓細胞的分化、減輕化療劑的骨髓抑制效果、以及調節骨髓的造血作用，以及涉及本發明第一方面的化合物在製備用於下列中的一項或多項的藥物中的應用增強化療劑在腫瘤細胞中的細胞毒性效果、選擇性地產生在腫瘤細胞中的毒性、提高骨髓中GM祖細胞的產生、刺激骨髓細胞的分化、減輕化療劑的骨髓抑制效果、以及調節骨髓的造血作用。
在第四方面，本發明涉及製備本發明第一方面的化合物的方法。
在第五方面，本發明提供下面化學式的化合物 其中X是N-α-R1-L-γ-穀氨醯基或N-α-R1-L-γ-穀氨醯基甘氨醯基，其中R1為氨基保護基團；以及Y和Z按照對本發明第一方面的化合物所定義；
以及它們的C1-10烷基、苯基-C1-3烷基、或者(C5-6雜芳基)-C1-3烷基的單酯和二酯；以及這些化合物及其單酯和二酯的鹽。這些化合物可用作製備本發明第一方面化合物的中間體。
本發明的優選具體實施方式
由如提交的本申請的說明書和權利要求2-20的特徵加以特徵化，本發明的具體實施方式
的特徵還在於這些化合物的藥物組合物、方法和用途。
具體實施例方式
定義「烷基」是指通過從碳原子上去除一個氫原子而衍生自飽和或不飽和(但非芳香不飽和)的C1-C10、優選C1-C6碳氫化合物的單價基團，其可以是直鏈、支鏈、或環形，例如甲基、乙基、丙基、1-丙烯基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、環戊基、環戊烯-1-基、環丙基甲基、環己基、和環己基甲基。飽和烷基和C1-C6烷基是代表性的。注意，本申請中「烷基」的定義比傳統的定義更廣，並且包括更經常稱作「環烷基」、「環烷基烷基」、「鏈烯基」、和「炔基」的基團。
「取代的烷基」是被多達三個滷原子和/或選自-CN、-NO2、-OR、和-NR2(其中，每個R獨立地為氫、或C1-3烷基)的取代基所取代的烷基。因此，例如，取代的烷基基團包括如三氟甲基和3-氯丙基的基團。優選的取代的C5-6環烷基是環戊基和環己基，其被1或2個、特別是1個選自滷素、羥基、甲基、三氟甲基和甲氧基，尤其是氟、氯、或甲基的基團所取代。
「雜烷基」是指其中1或2個亞甲基基團被O、S、SO2、或NR(其中R為H或C1-3烷基)替代的「烷基」(如上文所定義的)，包括如3-氧戊基的直鏈基團；含有5或6個環原子的單環，如2-四氫呋喃基、2-吡咯烷基、3-哌啶基、2-哌嗪基、4-二氫吡喃基、和3-嗎啉基；以及諸如四氫呋喃-2-基甲基和哌啶-3-基乙基的基團。優選的C5-6環雜烷基基團是其中1個環亞甲基基團被O、S、SO2、NH、或N-甲基替代的環戊基或者環己基；並且包括2-和3-四氫呋喃基、3-和4-四氫吡喃基、4-四氫硫代吡喃基及其S，S-二氧化物，以及2-、3-、和4-哌啶基。「取代的雜烷基」是以相同於上述取代的烷基的方式取代的雜烷基。
「芳基」是指通過從碳原子上去除一個氫原子而衍生自含有6至14個環碳原子的芳香烴的單價基團，其可以為單環(例如，苯基)，稠多環(例如，萘基)，或者聯多環(例如聯苯基)。
「取代的芳基」是指用多達3個取代基取代的芳基，這些取代基選自滷原子、-CN、-NO2、-OH，可選滷-取代的C1-3烷基(例如，乙基、三氟甲基)、可選滷-取代的C1-3烷氧基、苯氧基、(C5-6雜芳基)氧基、甲醯基、羧基、C1-3烷氧羰基、以及-NR2(其中每個R獨立地為H或者C1-3烷基)。
「芳烷基」是指用芳基取代的烷基，如苄基和苯乙基。「取代的芳烷基」是指其中芳基和烷基中的一個或兩個被取代的芳烷基，其取代方式與上述對取代的芳基和取代的烷基所描述的相同。
「滷素」或「滷代」是指F、Cl、或者Br。
「雜芳基」是指通過從碳原子上去除一個氫原子而衍生自含有5-14個環碳原子的芳香烴、其中1至4個環碳原子被O、S、N或NR(其中R為H或C1-3烷基)替代的單價基團，並且可以是含有5或6個環原子的單環(如呋喃基、噻吩基、吡咯基、呃唑基、咪唑基、吡啶基、吡嗪基、噠嗪基、和嘧啶基)；稠二環(如苯並咪唑基、苯並三唑基、和喹啉基)；或者聯二環，尤其是(C5-6雜芳基)-苯基，如4-(2-吡啶基)苯基。優選的C5-6雜芳基基團是2-和3-呋喃基、2-和3-噻吩基，以及2-、3-和4-吡啶基。「取代的雜芳基」是指以對上述取代的芳基同樣的方式取代的雜芳基。
「雜芳烷基」是指用雜芳基取代的烷基，如2-吡咯基甲基。「取代的雜芳烷基」是指以與對上述取代的烷基同樣的方式取代的雜芳烷基。
「鹽」描述於題為「本發明的化合物」部分中。
「氨基保護基」是在合成本發明第一方面的化合物過程中能夠保護該化合物或其中間體中的穀氨醯基α-氨基基團，並隨後在不影響本發明第一方面化合物的其餘部分的情況下而可移除的基團。常用的這類基團包括叔丁氧羰基和苄氧羰基，通過酸解可以方便地去除；對於苄氧羰基還可以用催化加氫方便地去除。氨基保護基團在有機合成領域並且特別是肽合成領域是熟知的。適宜的這類基團以及其去除條件描述一些書籍中，例如Synthesis of Peptides andPeptidomimetics，Workbench edition，M.Goodman，ed.，Georg ThiemeVerlag，Stuttgart，Germany，2004，和Protective groups in organicsynthesis，3 ed.，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，eds.，John Wiley Sons，Inc.，New York，New York，U.S.A.，1999，並且對於本領域普通技術人員來說是眾所周知的。
「有效治療量」是指，當通過一種治療方法向哺乳動物、尤其是人給藥，以便進行治療時，足以對該疾病(其以治療為目的)的治療起作用的量。對哺乳動物疾病的「處理」或「治療」包括下列中的一個或多個(1)抑制疾病的發展，例如，阻止其發展，(2)消除疾病，例如，使疾病消退或者治癒疾病，
(3)防止疾病復發，以及(4)減輕疾病症狀。
本發明的化合物及其製備本發明第一方面的化合物是以下化學式的化合物 其中X為L-γ-穀氨醯基或者L-γ-穀氨醯基甘氨醯基；並且Y為H，可選取代的烷基、可選取代的雜烷基、可選取代的芳基、可選取代的芳烷基、可選取代的雜芳基、或者可選取代的雜芳烷基；Z為可選取代的C5-9烷基、可選取代的C5-9雜烷基、可選取代的芳基、可選取代的芳烷基、可選取代的雜芳基、或者可選取代的雜芳烷基；以及它們的C1-10烷基、苯基-C1-3烷基、或者(C5-6雜芳基)-C1-3烷基的單酯或者二酯；以及這些化合物及其單酯和二酯的鹽。
本發明第一方面的優選化合物包括那些具有下列一個或多個特徵的化合物
1.X為L-γ-穀氨醯基；2.Y為可選取代的C5-6環烷基、可選取代的C5-6的環雜烷基、可選取代的苯基、或者可選取代C5-6雜芳基；尤其Y是環戊基、環己基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、或者可選取代的苯基；更尤其是環己基或者更尤其是苯基，可選地用1或2個氟、氯、甲基、羥基、甲氧基、或三氟甲基基團取代；例如其中苯基為未取代、或者被取代並且其中一個取代基在4-位，尤其是其中只有一個取代基的那些基團；3.Z是C5-9烷基，或者是苯基，1-或2-萘基，2-、3-或4-聯苯基，或者2-、3-或4-(C5-6雜芳基)苯基，每一個可選地用1至3個滷素、氰基、羥基、羧基、三氟甲基、或者-R、-OR、-COOR或-NR2基團(其中R為C1-3烷基)取代；尤其是苯基或2-、3-或4-聯苯基，或者2-、3-或4-(C5-6雜芳基)苯基，每一個可選地用氟、氯、氰基、羥基、甲氧基、甲基、或三氟甲基取代；4A.該化合物為二酸；或者4B.該化合物為二酯、尤其是C1-6烷基二酯，更尤其是C1-3烷基二酯。
通常，具有更多數目這些特徵的化合物要比具有更少數目這些特徵的化合物優選；尤其是，在具有少於全部特徵的化合物上增加其中一個特徵通常將得到一個比沒有該特徵的化合物優選的化合物。
本發明化合物的適宜的鹽(參見Berge et al.，J.Pharm.Sci.，661(1971)，非窮舉)是當無機鹼(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀和氫氧化鈣)或者有機鹼(例如，乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、緩血酸胺、N-甲基葡糖胺)與羧基基團反應時所形成的化合物，以及當無機酸(例如，氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸和氯磺酸)或者有機酸(例如，乙酸、丙酸、草酸、蘋果酸、馬來酸、丙二酸、富馬酸、或者酒石酸，以及烷基磺酸或者芳烴磺酸如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸，取代的苯磺酸如氯苯磺酸和甲苯磺酸、萘磺酸和取代的萘磺酸、萘二磺酸和取代的萘二磺酸，以及樟腦磺酸)反應形成該化合物的氨基基團的酸加成鹽時生成的化合物。這些鹽優選用藥用酸和鹼形成。用於該化合物的適宜的鹽是酸加成鹽，尤其是用無機酸形成，如氫氯酸鹽。
通過本發明的方法製備本發明第一方面的化合物包括(a)氧化以下化學式的化合物(「硫化物」) 其中X為L-γ-穀氨醯基或者L-γ-穀氨醯基甘氨醯基，或者為N-α-R1-L-γ-穀氨醯基或者N-α-R1-L-γ-穀氨醯基甘氨醯基，其中R1為氨基保護基團，並且Y和Z按照對本發明第一方面的化合物所定義；或者其C1-10烷基、苯基-C1-3烷基、或者(C5-6雜芳基)-C1-3烷基的單酯或者二酯；以得到本發明第一或第五方面的化合物；(b)如果Y為N-α-R1-L-γ-穀氨醯基或者N-α-R1-L-γ-穀氨醯基甘氨醯基，對得到的作為本發明第五方面化合物的碸進行去保護則得到本發明第一方面的化合物；以及可選地
(c)如果在步驟(a)或者步驟(b)中製得的本發明第一方面的化合物是二酸，則形成該化合物的單酯或者二酯；或者(d)如果在步驟(a)或者步驟(b)中製得的化合物是單酯或者二酯，去酯化該化合物，以製備該化合物的二酸；以及(e)形成步驟(a)至步驟(d)任一步中製得的化合物的鹽。
在步驟(a)中，氧化硫原子以製備本發明第一方面的化合物(如果穀氨醯基氨基基團未被保護)或者本發明第五方面的化合物(如果穀氨醯基氨基基團被R1-保護)。
典型地，將該硫化物溶解在適宜的溶劑中，加入氧化劑，將反應混合物在足夠的溫度下保持足夠的時間以完成該氧化。適宜的溶劑/氧化劑組合包括C2-3鏈烷酸/過氧化氫/過氧鏈烷酸組合如乙酸/過氧乙酸和乙酸/過氧化氫/過氧乙酸，以及使用C2-3過氧鏈烷酸或者過氧三氟乙酸兼作為溶劑和氧化劑。在用例如二甲硫的試劑消耗掉過量的氧化劑後(如果需要)，只需通過濃縮分離出本發明第一(或第五)方面的化合物。特別適宜的溶劑/氧化劑組合包括其中該氧化發生在雙相體系中的混合體系，其中將該硫化物溶解在非極性疏質子溶劑例如一種酯(例如，乙酸異丙酯)中並且氧化是在水性溶液中進行。用於這些雙相氧化的適宜的氧化劑包括硼酸鹽和過氧化物如過硼酸鹽和過硫酸鹽，例如過硫酸銨、過硫酸鈉或過硫酸鉀，並且特別適宜的氧化劑是單過硫酸鉀，例如OXONETM(2KHSO5·KHSO4·K2SO4)。在分離水相和非水相後，並且在可選的洗滌該非水相以確保完全除去任何氧化劑之後，通過濃縮將本發明第一(或第五)方面的化合物從非水相中分離出來。
在可選的步驟(b)中，本發明第五方面的化合物的R1-保護的氨基基團被去保護以製備本發明第一方面的化合物。
本發明第五方面的化合物可以通過任何適宜的用於除去氨基保護基團而又不影響分子其餘部分的方法進行去保護。當該氨基保護基團是酸解可去除的基團時，其可以通過強酸如三氟乙酸並可選地在二氯甲烷存在下方便地去保護。當該氨基保護基團是催化可去除的氨基保護基團時，其可以通過催化還原或者異構化而方便地去保護，即使例如苄氧羰基的基團一般被認為是催化可去除的，其也可以用酸解除去。
對於催化還原，通常將化合物溶解在適宜的溶劑中，如C1-4烷醇、或者極性質子溶劑、或者在非極性疏質子溶劑中，尤其是在水存在下，例如有水存在的乙酸異丙酯中，並且在還原催化劑(通常為鈀催化劑，例如鈀黑、硫酸鋇載鈀、以及碳載鈀)存在下與氫或者氫供體例如環己烯或者1，4-環己二烯接觸。對於催化異構化，使用零價的鈀絡合物，例如四(三苯基膦)鈀(0)，通常在親核的烯丙基基團清除劑如仲胺的存在下進行。在除去該催化劑後，方便地用酸加成鹽(在可選的步驟(e)中)分離出本發明第一方面的化合物，在可選的步驟(c)和步驟(d)中，本發明第一方面的化合物被酯化(如果是二酸以及希望得到一種酯)，或者被去酯化(如果是酯以及希望得到二酸)。這些酯化或去酯化反應是常規方法，並且可以通過本領域普通技術人員已知的任何方法實現；具體而說，常規的酯化方法包括本發明第一方面的二酸化合物與產生該希望的酯的醇反應，使用該醇作溶劑，在滷代矽烷如氯代三乙基矽烷存在下，在室溫和該醇的沸騰溫度之間的溫度下進行。
在可選的步驟(e)中，形成本發明第一方面的化合物的鹽。其通常是酸加成鹽(參見前面對「鹽」的定義)。方便地，這是在形成本發明第一方面的化合物之後立即進行；其可以通過加入一種將成為該鹽的反溶劑的溶劑，諸如非質子溶劑，例如，烴或者如二氯甲烷的滷代烴，然後加入所選的酸以形成該鹽，尤其是以單獨無水酸的形式或者在非質子溶劑中，例如氯化氫氣體實現。如果必要或者希望，可以加入其他的對於該鹽的反溶劑，例如，醚如乙醚、甲基叔丁基醚、以及四氫呋喃，尤其是甲基叔丁基醚。
用於該方法的起始原料(「硫化物」)是三肽和四肽，可選地被單酯化或者二酯化，可選地在穀氨醯基氨基處被保護，並且帶有用Z-CH2-基團烷基化的半胱氨酸硫。
這些S-烷基化的穀胱甘肽類似物是通過本領域普通技術人員熟知的肽合成的傳統方法方便製得的。
當適宜的S-烷基化的半胱氨酸對於肽合成不是方便易得時，可以使用許多常規的S-保護基團如三苯甲基中的一種進行肽合成，然後將得到的S-保護肽例如通過酸解進行去保護。典型地，可選地在清除劑的存在下，將該S-保護的肽溶解在一種足夠強以除去該酸解可去除的S-保護基團但不至於強到除去任何氨基保護基團的酸中。合適的這樣的酸包括三氟乙酸和其他的強酸，例如三氟甲磺酸，可選地在例如二氯甲烷的共溶劑的存在下；適宜的清除劑包括芳香醚和硫化物，如茴香醚和硫代茴香醚，苯酚如甲(苯)酚，以及，最有效地，矽烷，包括三烷基矽烷例如三乙基矽烷和三異丙基矽烷和矽烷聚合物如聚甲基氫矽氧烷；並且特別適合的去保護劑是在聚甲基氫矽氧烷存在下的三氟乙酸。該S-去保護的肽可以通過加入反溶劑例如諸如烴或者醚的非質子非極性溶劑而從反應混合物中分離出來。
然後，用其中L為如滷素(氯或溴)的離去基團，化學式為Z-CH2-L的化合物或可選取代的烷基磺酸鹽或芳烴磺酸鹽對該S-去保護肽的硫醇鹽(硫羥酸鹽)陰離子進行烷基化，以製備合適的S-烷基化肽。這在穀氨醯基胺被保護以便最小化副反應時能方便地做到，而且甚至在該胺未被保護時也可以做到。
典型地，將S-去保護肽溶解於在一種適宜溶劑(例如，C1-6烷醇、二醇如1，2-乙二醇或1，3-丙二醇、醚如2-甲氧基乙醇，1，2-二甲氧基乙烷，或四氫呋喃等)中的強鹼(例如，鹼金屬或鹼土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽或醇鹽，或氫氧化銨；或有機胺鹼如四甲基胍、DBU(1，8-二氮雜二環[5.4.0]十一-7-烯)，等)溶液中，以形成硫醇鹽陰離子，加入化學式為Z-CH2-L的化合物(通常過量)，反應混合物在適宜的溫度下保持適宜的時間，直到反應完全。便利的反應條件是使用20％的四氫呋喃水溶液和大約10倍過量的碳酸氫鈉。
該硫化物也可以按下述製備用一個適宜的Z-CH2-基團烷基化一個(可選保護的)半胱氨酸，然後通過常規的肽合成方法形成三肽或四肽，其中，首先與化學式 的胺基酸偶聯，然後與一個(可選保護的)L-γ-穀氨醯胺或者L-γ-穀氨醯基甘氨酸偶聯；或者首先與一個(可選保護的)L-γ-穀氨醯胺或者L-γ-穀氨醯基甘氨酸偶聯，然後與化學式 的胺基酸偶聯。
化學式為 的許多胺基酸如D-苯基甘氨酸、D-(4-氯苯基)甘氨酸、D-(4-羥苯基)甘氨酸、D-(3-噻吩基)甘氨酸、和D-環己基甘氨酸，可以以溶解的形式商業獲得，並且在某些情況下以酯的形式獲得。其它的可以以外消旋形式獲得，但通過任何熟知的溶解胺基酸的方法可以溶解。還有一些可以通過胺基酸合成的已知方法製備。
該硫化物可以被製成二酸(但是這可能涉及穀氨醯基α-羧基以及氨基的中間保護)或者被製成單酯或二酯，這取決於起始胺基酸的情況。如果該硫化物被製成二酸，在該硫化物氧化成碸之前其可以被單酯化或二酯化(通常在氨基保護過程中)，並且酯化條件通常將與酯化本發明第一方面的化合物所用的條件類似。
本領域普通技術人員在利用自身知識和本披露內容(包括實施例)的情況下，將不難製備本發明第一和第五方面的化合物。
化合物的用途和製備方法本發明第一方面的化合物(尤其是以酸形式)是GST P1-1的抑制劑，典型地是選擇性的抑制劑。它們也在增強體外HL-60細胞的分化方面有活性，並且一種化合物已經顯示出增強從體外鼠骨髓細胞的粒細胞/單核細胞集落的形成。因此這些化合物有望在人的治療方面起作用用於增強化療劑在腫瘤細胞中的細胞毒性效果(因為GST、尤其是GST P1-1，其在很多腫瘤組織中有所提高，與腫瘤細胞對化療劑的抗性有關；因此一種GST抑制劑將降低腫瘤細胞清除化療劑的能力)、選擇性地產生在腫瘤細胞中的細胞毒性(還是因為GST的同功酶抑制)、提高骨髓中GM祖細胞的產生、刺激骨髓的分化、減輕化療劑的骨髓抑制效果、以及調節骨髓的造血作用。
本發明第五方面的化合物和本發明第四方面的方法可用於製備本發明第一方面的化合物。
本發明第二方面是包含本發明第一方面化合物、可選也包括賦形劑如藥用賦形劑的藥物組合物，治療方法，包括通常以治療有效量給予這些化合物或者含有這些化合物的藥物組合物，以及這些化合物在癌症治療和生產用於癌症治療的藥物中的應用。
這些化合物可以採用任何適合於所治療的受治療者和受治療者的症狀的狀態的途徑進行給藥。給藥的途徑包括但不限於，通過注射給藥，包括靜脈注射、腹膜內注射、肌內注射和皮下注射，通過經黏膜或經皮遞送，通過局部施藥，鼻內噴霧，栓劑給藥等，或可以口服給藥。含有這些化合物的藥物組合物可選地是脂質體製劑、乳劑、設計成穿過黏膜給藥的製劑或經表皮給藥的製劑。對於每一種給藥方法合適的製劑可以在，例如，RemingtonThe Scienceand Practice of Pharmacy，20 ed.，A.Gennaro，ed.，Lippincott Williams Wilkins，Philadelphia，Pennsylvania，U.S.A.，2003中找到。典型的組合物可以是口服的，或者是靜脈注射的溶液，和含有所述化合物，並一般也含有一種或多種藥物學上可接受的賦形劑。典型的劑型是片劑、靜脈注射的溶液和用於重配成靜脈注射溶液的凍乾粉、以及也用於靜脈注射的脂質體製劑和凍幹脂質體製劑。
本發明第一方面的化合物的治療有效劑量為約10～2000mg/m2體表面積，特別是50～1000mg/m2。給藥可以以1～35天的間隔進行；例如，約250～1000mg/m2以1～5周的間隔，特別是以1、2、3或4周的間隔，或者以更高的頻率進行，包括在幾天內(例如，5或7天)以1次/天的頻率進行給藥，而每2、3或4周重複這種給藥，或者在6～72h時間段內持續輸液，也以每2、3或4周重複這種給藥。一種典型的策略可以是每三周用五天的時間每天給藥一次。
製備和實施例下面的實施例給出了有用中間體的製備和通過本發明方法的本發明化合物的合成，以及本發明第一方面的化合物作為治療劑的應用。
製備例1和2描述了用於半胱氨酸或者三肽和四肽半胱氨酸(「硫化物」)的S-烷基化的試劑的製備。為了方便起見，該試劑被稱為苄基溴(α-溴甲苯)的衍生物。
製備例14-(2-吡啶基)苄基溴的製備將2mL 4-(2-吡啶基)甲苯(1.98g，11.7mmol)、2.5g N-溴代琥珀醯亞胺(NBS)(14.0mmol)、和23mg α，α′-偶氮二異丁腈(AIBN)(0.14mmol)懸浮在35mL四氯甲烷中，然後回流24小時。過濾產物，並通過旋轉蒸發從濾液中除去溶劑。加入等摩爾量的氯仿和水並萃取產物。分離氯仿層並乾燥，然後除去溶劑。得到2g粘稠狀黃色固體4-(2-吡啶基)苄基溴。
製備例24-(2-甲氧基苯基)苄基溴的製備將171mg 4-溴甲苯(1mmol)、152mg 2-甲氧苯基硼酸(1mmol)、1mg二乙酸鈀(4μmol)、322mg N-丁基溴化胺(1mmol)、和2MNa2CO3水溶液1.9mL(3.8mmol)置於可微波處理的壓力小瓶中並加熱到150℃保持5min。在冷卻至室溫後，將產物倒入分液漏鬥中，並各加入30ml水和30ml乙醚。萃取後，分出各層，並且水層另用30ml乙醚洗滌。合併醚萃取液，用MgSO4乾燥，在真空下通過旋轉蒸發除去溶劑。得到固體產品2-甲氧基-4′-甲基聯苯，160mg(81％產率)，NMR檢測純度為95％。
將160mg 2-甲氧基-4′-甲基聯苯(0.81mmol)、158mg NBS(0.91mmol)、和1mg AIBN(0.006mmol)懸浮在7mL四氯甲烷中，然後回流24小時。過濾產物，並通過旋轉蒸發從濾液中除去溶劑。加入等摩爾量的乙醚和水並萃取產物。分離醚層並用MgSO4乾燥，過濾，並除去溶劑，獲得油狀的4-(2-甲氧基苯基)苄基溴128mg。
4′-(2-氰基苯基)苄基溴可以用該方法由2-氰基苯基硼酸製備。
其它的用可選取代的苯基或者可選取代的C5-6雜芳基取代的苄基溴化物可以用這些製備的方法很容易地製備。
製備例3描述了S-烷基化的半胱氨酸的製備。
製備例3N-α-(叔丁氧羰基)-S-(4-聯苯基甲基)-L-半胱氨酸的製備將1.0g N-α-(叔丁氧羰基)-L-半胱氨酸(4.52mmol)溶解在9mL四氫呋喃和9mL 1M的NaOH水溶液的混合物中，NaOH水溶液已通過往其中鼓入氬氣而脫氣。加入1.12g 4-(溴甲基)聯苯(4.53mmol)在5ml四氫呋喃(THF)中的溶液，並且在鼓入氬氣和室溫的條件下攪拌該溶液8小時。真空下通過旋轉蒸發除去THF，殘留物用水稀釋並用乙醚洗滌。用6M的HCl水溶液酸化水相至pH為3，並用乙酸乙酯萃取三次。合併的有機萃取物用水、飽和NaHCO3水溶液、水和鹽水洗滌，然後乾燥並濃縮，以得到1.44g N-α-(叔丁氧羰基)-S-(4-聯苯基甲基)-L-半胱氨酸白色固體(82％產率)。
其它(可選取代的)S-烷基化的半胱氨酸可以通過該製備的方法容易地製備。
製備例4至製備例6描述了一些「硫化物」的製備。
製備例4L-γ-穀氨醯基-S-[(4-聯苯基)甲基]-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸的製備鹽酸鹽形式的L-γ-穀氨醯基-S-[(4-聯苯基)甲基]-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸是從330mg N-α-(苄氧羰基)-L-γ-穀氨醯基-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸通過將該氨基保護的肽溶解在乙腈/水中，加入大約10倍過量的碳酸氫鈉，並加入微過量的4-(溴甲基)聯苯、然後在氮氣下保持該反應直至完成而製得。用水稀釋反應混合物，用乙醚洗滌，分離水相併用鹽酸酸化至pH2-3，然後用乙酸乙酯萃取。有機相用無水MgSO4乾燥、過濾，並減少體積以得到N-α-(苄氧羰基)-L-γ-穀氨醯基-S-[(4-聯苯基)甲基)-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸。將約300mg該氨基保護的硫化物溶解在2mL 95∶5的三氟乙酸(TFA)∶二氯甲烷(帶1滴水)中，並在45℃下攪拌過夜，用製備的HPLC純化，以得到L-γ-穀氨醯基-S-[(4-聯苯基)甲基)-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸。分離該鹽酸鹽形式的L-γ-穀氨醯基-S-[(4-聯苯基)甲基)-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸。如果希望的話，該氨基保護的硫化物可以被已經直接引入氧化步驟(a)中，以製備本發明第五方面的化合物。
通過類似方法製備例如L-γ-穀氨醯基-S-{[4-(2-吡啶基)苯基]甲基}-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸的化合物，及其氨基保護的類似物。
其它硫化物，包括是單酯和二酯的硫化物可以通過類似的方法容易製得。
製備例5L-γ-穀氨醯基-S-[(4-聯苯基)甲基]-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸二乙酯的製備鹽酸鹽形式的L-γ-穀氨醯基-S-[(4-聯苯基)甲基]-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸二乙酯是從30mg L-γ-穀氨醯基-S-[(4-聯苯基)甲基]-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸，通過用乙醇和氯化三甲基矽烷進行酯化作用而製得，得到L-γ-穀氨醯基-S-[(4-聯苯基)甲基]-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸二乙酯。分離出該鹽酸鹽形式的L-γ-穀氨醯基-S-[(4-聯苯基)甲基]-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸二乙酯。
通過類似方法製備諸如L-γ-穀氨醯基-S-{[4-(2-吡啶基)苯基]甲基}-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸二乙酯的化合物。通過類似方法可以方便地製得該硫化物的其它酯，尤其是二酯。
製備例6L-γ-穀氨醯基-S-[(4-聯苯基)甲基]-L-半胱氨醯-D-環己基甘氨酸的製備D-環己基甘氨酸乙酯是從500mg D-環己基甘氨酸(3.1mmol)、通過將該酸懸浮在15mL乙醇中，加入2.02mL氯化三甲基矽烷(5當量)，並將該混合物在50℃加熱18小時而製得。在真空下除去揮發性成分，並將殘留物溶解在乙酸乙酯中，用NaHCO3水溶液洗滌，然後用鹽水洗滌兩次，用MgSO4乾燥，過濾，並蒸發以得到401mg D-環己基甘氨酸乙酯油狀固體。
將588mg(1.9mmol)的N-α-(叔丁氧羰基)-S-(4-聯苯基甲基)-L-半胱氨酸溶解在5mL二甲基甲醯胺(DMF)中，加入860mg(1.2當量)的O-苯並三唑-N，N，N′，N′-四甲基六氟磷酸脲(HBTU)，和990μL(3當量)的二異丙基乙胺。3min後，加入溶解在4mL DMF中的D-環己基甘氨酸乙酯360mg(1當量)，在室溫下攪拌該混合物2小時，然後分離粗產物N-α-(叔丁氧羰基)-S-(4-聯苯基甲基)-L-半胱氨醯-D-環己基甘氨酸乙酯。將二肽溶解在10mL 20％的TFA/二氯甲烷中，並在室溫下攪拌2小時，然後通過在真空下去除揮發物而分離粗產物。該粗產物S-(4-聯苯基甲基)-L-半胱氨醯-D-環己基甘氨酸三氟乙酸酯可以直接用於下一步，或者可以被進一步處理。
將N-α-(叔丁氧羰基)-O-α-叔丁基-L-γ-穀氨醯胺溶解在2mLDMF中，加入174mg(1.2當量)的HBTU和330μL(5當量)的二異丙基乙胺。5min後，加入溶解於2mL DMF中的200mg(0.38mmol)的粗S-(4-聯苯基甲基)-L-半胱氨醯-D-環己基甘氨酸三氟乙酸酯，在室溫下攪拌該混合物2小時。將混合物倒入0.1N的檸檬酸水溶液中，並用乙酸乙酯萃取。有機層用鹽水洗滌四次，用MgSO4乾燥，並且蒸發掉揮發物，以得到棕色油狀的N-α-(叔丁氧羰基)-O-α-叔丁基-L-γ-穀氨醯基-S-(4-聯苯基甲基)-L-半胱氨醯-D-環己基甘氨酸。將其溶解在10mL 20％的TFA/二氯甲烷中並在室溫下攪拌24小時。在真空下除去揮發物並用反相HPLC純化產物，然後分離47mg鹽酸鹽形式的L-γ-穀氨醯基-S-(4-聯苯基甲基)-L-半胱氨醯-D-環己基甘氨酸。如果希望的話，該保護的硫化物也可以被已經直接引入到氧化步驟(a)中。
以類似方法製備鹽酸鹽形式的L-γ-穀氨醯基-S-(4-聯苯基甲基)-L-半胱氨醯-D-(4-氯苯基)甘氨酸。
合成實施例1L-γ-穀氨醯基-3-[(苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，1A的合成向溶解於乙酸中的100mg(0.2mmol)的L-γ-穀氨醯基-S-(苯基甲基)-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸鹽酸鹽(TLK117鹽酸鹽)加入200μL、過乙酸在乙酸中的32％溶液(0.95mmol)。反應混合物保持在室溫，用LCMS跟蹤反應。反應完成後，在真空下濃縮反應混合物至固態，然後將該固體放在50％乙腈/水中，過濾，並且殘留物用更多的乙腈/水洗滌。凍幹濾液，然後該殘留物和濾液用製備的HPLC純化，再凍幹含產物的餾分。在溶解於乙腈/水中並凍幹之後，用甲醇/醚研碎並在真空下乾燥，得到固體產物L-γ-穀氨醯基-3-[(苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，，1A，通過LC(ELSD檢測)純度為96％。質子NMR譜(DMSO-d6)與設計的結構一致。類似地以更大的規模(分別為0.4mmol和11mmol)再製備兩份該物質，使用2.3-2.5倍過量的過乙酸，並稍微改變溶劑比率和數量。每種情況均得到同樣的產品。
合成實施例2L-γ-穀氨醯基-3-[(苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸二乙酯，1B的合成向溶解於3ml乙酸中的123mg(0.22mmol)L-γ-穀氨醯基-S-(苯基甲基)-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸二乙酯鹽酸鹽中加入225μL、32％的過乙酸在乙酸中的溶液(1.06mmol)。反應混合物保持在室溫，用LCMS跟蹤反應。反應完成後，在真空下濃縮反應混合物至固態，然後將該固體放在甲醇/二甲亞碸/水中，用製備的HPLC純化，並且再次凍幹含產物的餾分。得到固體產物L-γ-穀氨醯基-3-[(苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸二乙酯，1B。質子NMR譜(DMSO-d6)與設計的結構一致。
合成實施例3 L-γ-穀氨醯基-3-[(苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸二異丙酯，1D的合成向懸浮於6ml異丙醇中的309mg(0.61mmol)L-γ-穀氨醯基-S-(苯基甲基)-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸鹽酸鹽中加入767μL的氯化三甲基矽烷(6.05mmol)。在室溫和氮氣下攪拌該反應混合物，這時候逐漸形成白色沉澱。將混合物加熱至50℃，另加入300μL氯化三甲基矽烷，並將反應混合物保持在升高的溫度。在數小時後，發現反應完成了85％(其餘部分為單酯)；過濾已經形成的沉澱，用異丙醇洗滌，乾燥(得到240mg)，溶解在甲醇中，用製備的HPLC並用95∶5水/乙腈(帶0.01％鹽酸)作為溶劑進行純化。將87mg(0.16mmol)的二異丙酯溶解在2mL乙酸中，用82μL過乙酸溶液(2.5當量)進行氧化。反應完成後，加入2ml甲醇，用製備的HPLC並用95∶5水/乙腈(帶0.01％三氟乙酸)作為溶劑進行純化，並凍幹含產物的餾分。得到固體產物L-γ-穀氨醯基-3-[(苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸二異丙酯鹽酸鹽，HPLC檢測純度為98％。質子NMR譜(DMSO-d6)與設計的結構一致。
合成實施例4L-γ-穀氨醯基-3-[(苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸二甲酯，1C的合成鹽酸鹽形式的L-γ-穀氨醯基-3-[(苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸二甲酯，1C是從500mg(0.98mmol)的L-γ-穀氨醯基-S-(苯基甲基)-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸鹽酸鹽，用合成實施例3的方法，在酯化中用甲醇代替異丙醇，用氧化該二異丙酯相同的方式氧化該二甲酯，使用三次溶解/凍幹循環操作進行純化而製得。HPLC檢測純度為98％。
合成實施例5L-γ-穀氨醯基-3-[(4-聯苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，11A的合成鹽酸鹽形式的L-γ-穀氨醯基-3-[(4-聯苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，11A是以三個步驟從330mg N-α-(苄氧羰基)-L-γ-穀氨醯基-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸製得，通過將氨基保護的肽溶解於乙腈/水中，加入約10倍過量的碳酸氫鈉，並加入稍微過量的4-(溴甲基)聯苯，然後將反應保持在氮氣下直到完成。用水稀釋該反應混合物，用乙醚洗滌，分離水相，並用鹽酸將其酸化至pH2-3，然後用乙酸乙酯萃取。用無水硫酸鎂乾燥有機相，過濾，並降低體積，以得到N-α-(苄氧羰基)-L-γ-穀氨醯基-3-[(4-聯苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸。該氨基保護的硫化物約300mg被溶解於2mL 95∶5的三氟乙酸∶二氯甲烷(帶1滴水)中，並在45℃下攪拌過夜，用製備的HPLC純化，以得到L-γ-穀氨醯基-3-[(4-聯苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸。用與前面實施例中相同的方式氧化該去保護的硫化物，以得到鹽酸鹽形式的L-γ-穀氨醯基-3-[(4-聯苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸酯，11A，，HPLC檢測純度為92％。
合成實施例6L-γ-穀氨醯基-3-[(2-聯苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，4A的合成鹽酸鹽形式的L-γ-穀氨醯基-3-[(2-聯苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，4A是用合成實施例5的方法以三步從500mgN-α-(苄氧羰基)-L-γ-穀氨醯基-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸製得，用2-(溴甲基)-聯苯作為該保護的肽的烷化劑。HPLC檢測純度為99％。
合成實施例7L-γ-穀氨醯基-3-[(2-聯苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸二乙酯，4B的合成鹽酸鹽形式的L-γ-穀氨醯基-3-[(2-聯苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸二甲酯，4B是從143mg L-γ-穀氨醯基-S-(2-聯苯基甲基)-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸鹽酸鹽(實施例6中的中間體)，通過用乙醇和氯化三甲基矽烷酯化，然後氧化該二乙酯(如合成實施例3)得到。HPLC檢測純度為94％。
合成實施例8L-γ-穀氨醯基-3-[(2-萘基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，3A的合成鹽酸鹽形式的L-γ-穀氨醯基-3-[(2-萘基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，3A是以三步從N-α-(苄氧羰基)-L-γ-穀氨醯基-L-半胱氨醯-D-苯基甘氨酸，使用合成實施例5的方法製得，用2-(溴甲基)萘作為該保護肽的烷化劑。HPLC檢測純度為92％。
以類似方法製備鹽酸鹽形式的L-γ-穀氨醯基-3-[(5-硝基呋喃-2-基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，14A。HPLC檢測純度為99％。
本發明第一方面的代表性化合物在下面的表1中給出表1本發明第一方面的二酸化合物
#表示A連接至化合物的磺醯基硫原子的連接點用以上討論的一種方法製備化合物1A至12A的二乙酯1B至12B；用質譜分析，每個化合物得到對應於其質量的質量峰(M/z)，通常有正離子峰M+H，或者負離子峰M-H。也製備了二酸1A的二甲酯和二異丙酯1C和1D，並通過質譜分析，每個化合物得到正離子質量峰M+H。
本發明的其它化合物可以類似地製備，使用本領域普通技術人員根據自身經驗並參考了本說明後所熟知的方法進行。
體外分析實施例這些實施例舉例說明了在預言性的體外試驗中本發明化合物(以及比較化合物TLK117和TLK199中的一個或者另一個，以及「乙烯基碸」及其二乙酯)的效果。
重組的人GST P1-1，A1-1和M1-1同功酶，和兔的多克隆抗人GSTπ抗體獲自美國加利福尼亞州聖地牙哥的EMD Bioscences公司。小鼠的單克隆抗人GSTπ抗體獲自美國加利福尼亞州Carpinteria市的Dakoctyomation公司。IRDye800聯結的親合純化山羊抗兔IgG抗體獲自美國賓夕法尼亞州Gilbertsville市的Rockland Immunochemicals公司。人癌細胞系HL-60(前髓細胞性白血病)獲自美國馬裡蘭州貝塞斯達的國家癌症研究所。RPMI 1640培養基和Iscove’s改進的杜爾貝科培養基(IMDM)獲自美國加利福尼亞卡爾斯巴德市的Invitrogen公司。CellTiter-GloTM分析試劑盒獲自美國威斯康星州麥迪遜市的Promega公司，並按照製造商的指示說明使用。藻紅蛋白聯結的抗-CD11b抗體和藻紅蛋白聯結的同型對照抗體獲自美國加利福尼亞州聖何塞市的BD Biosciences公司。MethoCultTMM3234甲基纖維素培養基(2.5％甲基纖維素在IMDM中，補加了胎牛血清、牛血清蛋白、人重組胰島素、h轉鐵蛋白、2-巰基乙醇，和L-穀氨醯胺)獲自加拿大範庫弗峰州的StemCell Technologies公司，並按照製造商的指示說明進行稀釋(至1％甲基纖維素的濃度)。
體外實施例1穀胱甘肽S-轉移酶同功酶的抑制。本實施例說明了這些化合物作為穀胱甘肽S-轉移酶同功酶GST P1-1，A1-1，和M1-1的抑制劑的體外效果。GST P1-1的抑制被認為預示著在本發明第三方面的治療方法中的有效性，因為TLK199(在這些試驗中測試的是TLK117的二乙酯)已經顯示了在人中的骨髓刺激活性以及在動物模型中的化學增強活性。
重組的人GST P1-1，A1-1和M1-1同功酶分別以0.02、0.011、和0.0083單位/ml的最終濃度使用(1單位是在20℃和pH6.5時每min結合1μmol的1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)成為還原的穀胱甘肽(GSH)的酶的量)，在試驗緩衝劑(100mM的KH2PO4/K2HPO4，0.1mM EDTA，pH6.5的水中)中。GSH被製備成在水中的100mM的儲液，CDNB製成在乙醇中的100mM的儲液，二者皆用試驗緩衝劑稀釋至適宜的濃度(以獲得用於評價該同功酶的2×Km的最終濃度)。這些測試的化合物(二酸、1A至12A的化合物以及TLK117)被溶解在二甲亞碸(DMSO)中，並用DMSO稀釋至用於試驗的合適的濃度(8個濃度，該變化範圍的中點接近預期的IC50-導致50％抑制的酶活性的濃度)。對於每一次試驗，測試的化合物和GSH被加到該同功酶中。在將CDNB溶液加到該同功酶/化合物/GSH溶液中之後，立即在一個SpectraMax盤式讀數器(plate reader)(美國加利福尼亞州桑尼維爾市的Molecular Devices公司)上連續記錄下在340nm處的吸收達5min。在測試化合物的不同濃度下從吸收/時間曲線的斜率計算出每一化合物的GST抑制活性。所有試驗在兩個相同的孔中進行，用二甲亞碸(DMSO)對照，最終的DMSO濃度保持在2％。這些試驗的結果在下面的表2中給出。
體外實施例2在HL-60細胞中的細胞毒性。本實施例說明了本發明的化合物對HL-60人白血病細胞系的體外細胞毒性。
在96-孔的板中接種Log-階段細胞，每孔在150μL RPMI 1640培養基中接種1500細胞，培養基補以10％胎牛血清(FBS)和1％L-穀氨醯胺，並在37℃的空氣/5％ CO2下培育4-5小時。將測試化合物(二乙酯、化合物1B至12B和TLK199)溶解並順序稀釋在DMSO中(8個濃度，該變化範圍的中點接近預期的CC50)。在再一次以1∶50稀釋在補充的RPMI 1640培養基中後，加入50μL稀釋的化合物以達到0.5％的最終DMSO濃度。然後培育細胞72小時(大約三個重複時間)。然後通過離心(在20℃下，1200rpm，5min)收穫該細胞，移出100μL的培養液上清液並用同樣體積的CellTiter-Glo試劑取代。在室溫下連續攪拌培育10min之後，用發光計(光度計)對板讀數，活細胞的數目與觀察到的發光成正比。
全部試驗在三個相同的孔中進行，用DMSO溶劑對照。從發光/濃度曲線計算CC50(導致50％生長抑制的濃度)。這些試驗的結果在下面的表2中給出。
體外實施例3GSTπ免疫沉澱反應試驗。本試驗說明了本發明化合物在導致GSTπ免疫沉澱反應上的有益效果。這些結果被認為預示著在本發明第三方面的治療方法中的有效性，因為TLK199(在這些試驗中測試的是TLK117的二乙酯)已經顯示了在人中的骨髓刺激活性以及在動物模型中的化學增強活性。
HL-60細包以6×105細包/mL被接種，在20mL RPMI-1640培養基中補充以10％胎牛血清，1mM穀氨醯胺和20μM在T75細頸瓶中的慶大黴素，在37℃和5％ CO2的空氣中培養過夜。用0.1％ DMSO或20μM在含有0.1％ DMSO的培養基中的測試化合物(二乙酯，化合物1B到12B和TLK199)處理這些細胞達2小時。然後處理，通過離心分離收集這些細胞，並用磷酸鹽緩衝鹽水洗滌兩次。將細胞小球重懸浮在1mL溶解緩衝液(lysis buffer)中(50mM Tris，pH8.0，120mM NaCl，0.5％ NP-40表面活性劑，100mM NaF；在使用前已往其中加入蛋白酶和磷酸(酯)酶抑制劑(Roche Diagnostics，Indianapolis，Indiana，U.S.A.))，並在4℃溫和攪動培育30min。通過10min、13,000rpm的離心除盡該細胞溶解物(cell lysate)以除去細胞碎片。為了免疫沉澱反應，將2.1μg的小鼠單克隆抗人GSTπ抗體加入到1mg/mL全蛋白的500μL細胞溶解物中。在4℃下培養過夜後，向該混合物中加入30μL的蛋白A/G瓊脂糖珠(Pierce，Rockford，IL)，並在4℃下培育1小時。然後通過離心收集該珠，在溶解緩衝液中洗滌三次，重懸浮在10μL非還原性十二烷基硫酸鋰樣品緩衝液(Invitrogen，Carlsbad，California，U.S.A.)中。該懸浮的樣品在95℃下加熱5min，經過在4-12％凝膠上的SDS-PAGE處理，隨後使用兔多克隆抗人GSTπ抗體，IRDye800結合的、親合純化的山羊抗兔IgG抗體進行蛋白質印跡分析。GSTπ蛋白譜帶被可視化並且在Odyssey紅外掃描儀(Li-Cor，Lincoln，Nebraska，U.S.A.)上定量譜帶強度。將由化合物處理的譜帶強度與其相應的DMSO對照品進行比較並表示成抑制百分數。這些結果示於下面的表2中列。
表2 本發明二酸化合物的GST同功酶抑制及本發明二乙酯化合物的HL-60細胞毒性和GSTπ免疫沉澱反應

NM-未測值；*-二乙酯未制出本發明的二酸化合物是GST P1-1的強有力的抑制劑，並且對於GST P1-1通常還有相對於兩種其它的人GST同功酶GST A1-1和GST M1-1的選擇性。二乙酯全部顯示出良好的在HL-60細胞中的細胞毒性，並且很多(化合物)在免疫沉澱反應分析中被測出具有相當的GSTπ抑制。
其中一些本發明的二乙酯化合物還被測試出具有增強HL-60細胞的分化的能力。這證實了本發明化合物在體外刺激HL-60人白血病細胞系的有益效果。這些結果被認為預示著在人的骨髓刺激方面的效能，因為在此分析中增強分化的TLK199已經顯示出對人的骨髓刺激活性。在37℃和空氣/5％ CO2下將Log-階段細胞(1×105細胞/mL)在2mL體外實施例2中使用的補充的(supplemented)RPMI 1640培養基中培育24小時，並將試驗化合物溶解在DMSO中，DMSO的最終濃度為0.1％。通過離心(1250rpm，5min，20℃)收穫細胞並用2mL含有2％ FBS的冰冷磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌，然後用10μL藻紅蛋白-結合的抗-CD11b抗體或者10μL藻紅蛋白-結合的同型對照抗體染色。在冰上靜置30min後，將細胞重懸浮在2mL含2％FBS的冰冷PBS中。通過離心(1250rpm，5min，20℃)收穫細胞並將其重懸浮在0.4mL含2％ FBS的PBS中。CD11b的特定細胞表面表達，一種用於粒細胞和單核細胞的標記物是通過流式細胞測量術，使用FACSCalibur分析儀(BDBiosciences)檢測的。所有的分析均進行三份，用DMSO對照。分化的程度被表達為來自DMSO對照品的信號的倍數。多種試驗化合物增強了HL-60細胞的分化。
從這些結果和這些化合物與TLK199的結構相似性，這些化合物，尤其是二酯可望在治療上用於增強化療劑在腫瘤細胞中的細胞毒性效果、選擇性地產生在腫瘤細胞中的毒性、提高骨髓細胞中GM祖細胞的產生、刺激骨髓的分化、減輕化療劑的骨髓抑制效果、以及調節骨髓的造血作用。
製劑實施例本實施例例舉了本發明化合物尤其是二酯的適宜的製劑。
用於口服給藥的固體製劑通過組合以下物質而製得化合物25.0％w/w硬脂酸鎂 0.5％w/w澱粉 2.0％w/w羥丙基甲基纖維素 1.0％w/w微晶纖維素71.5％w/w並且將該混合物進行壓縮以形成片劑或者填充到含有例如250mg的該化合物的硬明膠膠囊中。如果有必要，可以通過施加成膜劑(例如，羥丙基甲基纖維素)、顏料(例如，二氧化鈦)和增塑劑(例如，鄰苯二甲酸二乙酯)的懸浮液對片劑進行塗敷，然後通過蒸發溶劑來乾燥該膜。
用於IV給藥的製劑是通過在磷酸鹽緩衝鹽水中溶解該化合物(例如以藥用鹽的形式)至1％w/v的濃度；並將該溶液消毒滅菌(例如通過滅菌過濾)，然後封裝在容納例如250mg的本發明化合物的無菌容器中而製得的。
可替換地，凍幹製劑通過將該化合物(又例如以藥用鹽形式)溶解在合適的緩衝液(例如上述磷酸鹽緩衝鹽水的磷酸鹽緩衝液)中，對該溶液進行滅菌，然後將其分裝進合適的無菌小瓶中，凍幹該溶液以除去水，然後密封小瓶而製得。可通過加入消毒水而重配該凍幹製劑，並且該重配的溶液可以進一步用例如0.9％氯化鈉靜脈輸注液或者5％葡萄糖靜脈輸注液加以稀釋以用於給藥。
可替換地，按照美國公開申請號2003/0100511(例如，實施例4和5)的方法，用本發明化合物代替此公開的化合物9，可以製得脂質體製劑，並且可以按該公開所述進行凍幹。
治療實施例本實施例例舉了用於本發明化合物的適宜的治療方法。
將上述製劑實施例中描述的以靜脈給藥製劑形式的本發明化合物在30min內以50mg/m2的初始劑量靜脈給予患有骨髓增生異常綜合症的病人，並將該劑量增大至100mg/m2、200mg/m2、400mg/m2、和600mg/m2。每三周給藥5天，每天給予該化合物一次。
雖然已經結合具體實施方式
和實施例描述了本發明作，但對參考了該技能和本披露內容的本領域普通技術人員來說顯而易見的是具體披露的物質和方法的等同替換也可以用於本發明，並且這些等同替換包括在所附權利要求書的範圍內。
權利要求
1.一種以下化學式的化合物 其中X為L-γ-穀氨醯基或者L-γ-穀氨醯基甘氨醯基；Y為H，可選取代的烷基、可選取代的雜烷基、可選取代的芳基、可選取代的芳烷基、可選取代的雜芳基、或可選取代的雜芳烷基；以及Z為C5-9烷基、可選取代的芳基、可選取代的芳烷基、可選取代的雜芳基、或者可選取代的雜芳烷基；或者其C1-10烷基、苯基-C1-3烷基、或者(C5-6雜芳基)-C1-3烷基的單酯或者二酯；或者所述化合物或其單酯或二酯的鹽。
2.根據權利要求1所述的化合物，其中，X為L-γ-穀氨醯基。
3.根據權利要求1或2所述的化合物，其中，Y為可選取代的C5-6環烷基、可選取代的C5-6環雜烷基、可選取代的苯基、或者可選取代C5-6雜芳基。
4.根據權利要求3所述的化合物，其中，Y是環戊基、環己基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、或者可選取代的苯基。
5.根據權利要求4所述的化合物，其中，Y是環己基。
6.根據權利要求4所述的化合物，其中，Y是苯基，可選地用1或2個氟、氯、甲基、羥基、甲氧基、或三氟甲基基團取代。
7.根據權利要求6所述的化合物，其中，所述苯基未被取代。
8.根據權利要求6所述的化合物，其中，所述苯基被取代，並且所述取代基之一在4-位。
9.根據權利要求8所述的化合物，其中，只有一個取代基。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的化合物，其中，Z是C5-9烷基，或者是苯基，1-或2-萘基，2-、3-或4-聯苯基，或者2-、3-或4-(C5-6雜芳基)苯基，每一個可選地用1至3個滷素、氰基、羥基、羧基、三氟甲基、或者-R、-OR、-COOR或-NR2基團(其中R為C1-3烷基)取代。
11.根據權利要求10所述的化合物，其中，Z是苯基，可選地用氟、氯、氰基、羥基、甲氧基、甲基、或三氟甲基取代。
12.根據權利要求11所述的化合物，其中，Z是苯基。
13.根據權利要求10所述的化合物，其中，Z是2-、3-或4-聯苯基，或2-、3-或4-(C5-6雜芳基)苯基，每一個可選地用氟、氯、氰基、羥基、甲氧基、甲基、或三氟甲基取代。
14.根據權利要求13所述的化合物，其中，Z是2-、3-或4-聯苯基，或者2-、3-或4-(C5-6雜芳基)苯基。
15.根據權利要求1至14中任一項所述的化合物，其為二酸。
16.根據權利要求1至14中任一項所述的化合物，其為二酯。
17.根據權利要求16所述的化合物，其為C1-6烷基二酯。
18.根據權利要求17所述的化合物，其為C1-3烷基二酯。
19.根據權利要求18所述的化合物，其為二乙酯。
20.根據權利要求1所述的化合物，其選自L-γ-穀氨醯基-3-[(苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，L-γ-穀氨醯基-3-{[(4-氯苯基)甲基]磺醯基}-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，L-γ-穀氨醯基-3-[(2-萘甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，L-γ-穀氨醯基-3-[(2-聯苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，L-γ-穀氨醯基-3-{[(2』-氰基-4-聯苯基)甲基]磺醯基}-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，L-γ-穀氨醯基-3-{[(8-喹啉基)甲基]磺醯基}-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，L-γ-穀氨醯基-3-{[4-(2-吡啶基)苯基甲基]磺醯基}-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，L-γ-穀氨醯基-3-{[(1-異喹啉基)甲基]磺醯基}-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，L-γ-穀氨醯基-3-{[(1-甲基苯並三唑-5-基)甲基]磺醯基}-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，L-γ-穀氨醯基-3-{[2-(1-萘基)乙基]磺醯基}-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，L-γ-穀氨醯基-3-[(4-聯苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-苯基甘氨酸，L-γ-穀氨醯基-3-[(4-聯苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-環己基甘氨酸，以及L-γ-穀氨醯基-3-[(4-聯苯基甲基)磺醯基]-L-丙氨醯-D-(4-氯苯基)甘氨酸，以及它們的二乙酯，以及這些所述化合物及其二乙酯的鹽。
21.一種含有權利要求1至20中任一項的化合物的藥物組合物。
22.根據權利要求21所述的藥物組合物，進一步包括賦形劑。
23.權利要求1至20中任一項所述的化合物在用於製備下列一項或多項的藥物中的應用增強化療劑在腫瘤細胞中的細胞毒性效果、選擇性地產生在腫瘤細胞中的毒性、提高骨髓中GM祖細胞的產生、刺激骨髓細胞的分化、減輕化療劑的骨髓抑制效果、以及調節骨髓的造血作用。
24.下列一項或多項的治療方法增強化療劑在腫瘤細胞中的細胞毒性效果、選擇性地產生在腫瘤細胞中的毒性、提高骨髓中GM祖細胞的產生、刺激骨髓細胞的分化、減輕化療劑的骨髓抑制效果、以及調節骨髓的造血作用，包括給予權利要求1至20中任一項所述的化合物或者權利要求21至22中任一項所述的組合物。
25.一種以下化學式的化合物 其中X是N-α-R1-L-γ-穀氨醯基或N-α-R1-L-γ-穀氨醯基甘氨醯基，其中R1為氨基保護基團；以及Y和Z如在權利要求1中所限定；或其C1-10烷基、苯基-C1-3烷基、或者(C5-6雜芳基)-C1-3烷基的單酯或者二酯；或者所述化合物或其單酯或二酯的鹽。
26.一種製備權利要求1的化合物的方法，包括(a)氧化一種以下化學式的化合物 其中X為L-γ-穀氨醯基或者L-γ-穀氨醯基甘氨醯基；或者為N-α-R1-L-γ-穀氨醯基或者N-α-R1-L-γ-穀氨醯基甘氨醯基，其中R1為氨基保護基團，以及Y和Z如權利要求1所限定；或其C1-10烷基、苯基-C1-3烷基、或者(C5-6雜芳基)-C1-3烷基的單酯或者二酯；(b)如果Y為N-α-R1-L-γ-穀氨醯基或者N-α-R1-L-γ-穀氨醯基甘氨醯基，則對所得的碸進行去保護以得到權利要求1的化合物；以及可選地(c)如果在步驟(a)或者步驟(b)中製備的權利要求1所述的化合物是二酸，則形成所述化合物的單酯或者二酯；或者(d)如果在步驟(a)或者步驟(b)中製備的化合物是單酯或者二酯，則去酯化所述化合物，以製備所述化合物的所述二酸；以及(e)形成在步驟(a)至(d)中任一步所製備的所述化合物的鹽。
27.根據權利要求26所述的方法，其中，R1是催化可去除的氨基保護基團。
全文摘要
本發明涉及三肽碸和四肽碸、含有其的藥物組合物、其藥物用途以及其製備。該化合物可用於增強化療劑在腫瘤細胞中的細胞毒性效果、選擇性地產生在腫瘤細胞中的毒性、提高骨髓細胞中GM祖細胞的產生、刺激骨髓的分化、減輕化療劑的骨髓抑制效果、以及調節骨髓的造血作用。
文檔編號A61K38/06GK101080418SQ200680001366
公開日2007年11月28日 申請日期2006年1月5日 優先權日2005年1月6日
發明者史蒂文·R·修, 納塔利婭·奧雷科埃切亞 申請人:泰立克公司