微生物木糖葡聚糖內切轉糖基酶(xet)的製作方法

2023-04-23 16:05:36 3

專利名稱：微生物木糖葡聚糖內切轉糖基酶(xet)的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物木糖葡聚糖內切轉糖基酶(xyloglucanendotransglycosylase，XET)，其生產方法和用途。
背景技術：
木糖葡聚糖內切轉糖基酶(XET)是一種已知來自於植物的酶。就我們所知，還沒有報導過來源於微生物的XET。
Stephen C.Fry等在生物化學雜誌(1992年，282，821-828頁)中暗示XET負責切割和再連接微絲間(intermicrofibrillar)木糖葡聚糖鏈，因此XET能導致植物細胞膨脹所需要的細胞壁鬆弛。
XET已被提議用於調控植物形態(參見EP562836中21、27-28頁)。
人們相信XET存在於所有植物，特別是所有的陸生植物中。已從雙子葉植物、單子葉植物，具體說是禾本科單子葉植物和百合科單子葉植物，以及苔類和蘚類植物中提取到了XET(文獻可參考生物化學雜誌(1992)282，823頁)。
在共同未決的專利申請PCT/DK96/00538(WO97/23683)中，我們已指出，用XET酶處理後，纖維素材料可以獲得改善的強度特性和/或提高的保形性能和/或更好的抗皺性能。
XET酶有一些很有趣的應用，因此本發明的一個目的是提供可用於諸如以上用途的微生物來源的木糖葡聚糖內切轉糖基酶。微生物來源的木糖葡聚糖內切轉糖基酶應該具有易於大量生產的優勢。
發明概述通過篩選分析發現了大批在系統發生上比較分散的微生物能產生XET活性。
因此，本發明涉及一種能夠由培養表達XET的微生物而得到的木糖葡聚糖內切轉糖基酶製劑；具體說本發明涉及一種木糖葡聚糖內切轉糖基酶的生產方法，它包括a)在適宜的營養培養基中，有利於XET酶產生的條件下，培養表達微生物XET的微生物，以及b)隨後從營養培養基中純化XET酶。
另外，本發明還涉及本發明的XET製劑用於處理纖維素材料的用途，同時涉及微生物XET製劑。
附圖簡述結合以下附圖進一步闡述本發明，其中

圖1顯示根據實施例5得到的Dichotomocladium hesseltinei，Tiarosporella phaseolina和淡黑假黑盤菌(Pseudoplectanianigrella)的XET活性的pH曲線(△Tiarosporella phaseolina；□淡黑假黑盤菌；◆Dichotomocladium hesseltinei)。
圖2顯示根據實施例5得到的木糖葡聚糖酶活性的pH曲線(△Tiarosporella phaseolina；□淡黑假黑盤菌；◆Dichotomocladium hesseltinei)。
發明詳述本發明涉及一種能夠由微生物培養而得到的木糖葡聚糖內切轉糖基酶製劑。
在本申請中表明XET可由真菌和細菌產生，預計酵母也能產生XET。
可用「XET試紙」鑑定產XET的微生物。這種「XET試紙」在共同未決的專利申請PCT/GB96/02351(WO97/11193)中有述；它是在標記了的寡糖中浸泡過的塗覆木糖葡聚糖的試紙。
通過以下方法製備標記的寡糖、浸透了木糖葡聚糖的試紙，並進行點印跡檢測XET活性。標記寡糖的製備將還原性寡糖4-O-[4-O-[4-O-[6-O-α-D-吡喃木糖-β-D-吡喃葡萄糖]-6-O-(2-O-β-D-吡喃半乳糖)-α-D-吡喃木糖-β-D-吡喃葡萄糖]-6-O-(2-O-β-D-吡喃半乳糖)-α-D-吡喃木糖-β-D-吡喃葡萄糖]-D-葡萄糖(『XLLG』)(1克)溶於25ml含1克氰氫硼化鈉(NaCNBH3)的碳酸氫銨飽和水溶液中，25℃置暗處，保持7天進行還原性胺化。乾燥除去碳酸氫銨，純化XLLG的(水合茚三酮反應性)胺化衍生物(例如通過凝膠過濾層析或陽離子交換層析)。產物應是寡糖基-1-氨基-1-脫氧多羥基醇(deoxyalditol)，即XLLG的還原性末端D-葡萄糖部分被1-氨基-1-脫氧-D-葡糖醇取代了的衍生物。
將寡糖基-1-氨基-1-脫氧多羥基醇(50mg)溶於3ml 3％硼砂(四硼酸二鈉；pH＝9.0-9.5)中，攪拌下逐漸加入0.75ml含有10mg麗絲胺若丹明磺醯氯(購自Molecular Probes Inc.，USA)的幹二甲基甲醯胺(DMF)新鮮配製的溶液，混合溶液置暗處過夜。再加入0.75ml含10mg麗絲胺若丹明磺醯氯的DMF，混合溶液再放置8小時。經凝膠過濾層析然後在C18-矽膠柱子上進行反相層析，純化鮮粉色的寡糖基-1-氨基-1-脫氧多羥基醇-麗絲胺若丹明偶聯物(XLLGol-SR)。用水清洗後一個柱子後，採用甲醇梯度，在大約50％甲醇中洗脫下XLLGol-SR。
製備浸透木糖葡聚糖的試紙用1％木糖葡聚糖水溶液溼潤Whatman 1號濾紙，將濾紙乾燥。將XLLGol-SR製劑稀釋在足量的75％丙酮水溶液中，使580nm處的光吸收值(A580)為0.2；然後將塗覆了木糖葡聚糖的Whatman 1號濾紙浸在該溶液中，並再次乾燥；產品稱為XET試紙。用非水性粘合劑將適當大小的XET試紙片(例如72×108mm)粘在非吸收性介質(如透明醋酸纖維素紙)上。XET活性的點印跡檢測
i)將待進行XET活性檢測的液滴用吸液管點在一張XET試紙的標記位置上。如果斑點是4μl，樣品之間的距離可以是9mm(圓心到圓心，即象在標準的96孔檢測盤中的式樣)。
ii)然後迅速(在斑點乾燥以前)將XET試紙夾在兩張塑料(例如象空中投影儀中所用的醋酸纖維素膠片)之間，進行保溫(例如20℃，1小時)。
iii)將保溫過的XET試紙及其塑料底襯放置(試紙側朝下)在含有150ml溶劑(例如現配的乙醇/蟻酸/水(體積比1∶1∶1))的盤子中，溶劑能將未反應的XLLGol-SR從試紙上除去，由於XET催化的轉糖基作用而結合至木糖葡聚糖的XLLGol-SR則不會被除去。這時可將試紙與塑料底襯分離。
iv)將試紙在流水中漂洗5分鐘，然後在大約100ml丙酮中洗5分鐘，再徹底乾燥。如果需要，可以在80℃烤箱中5分鐘，以加快乾燥處理。
v)然後在短波長紫外燈(例如，254nm發射光；佩帶適當的眼睛和皮膚保護裝置)下檢查試紙。粉色(橙色螢光)斑點指示有活性XET，可以用掃描螢光分光計進行定量測定。XET酶我們已經發現，具有XET活性的微生物酶可以是轉糖基酶(意味著它們缺少水解活性或只有很低的水解活性)，或者它們能同時催化木糖葡聚糖的轉糖基作用和水解。
從植物中得到的同時具有轉糖基活性和水解活性的XET酶也有描述(參見植物生理學植物分子生物學年度綜述，1995，46509頁)。系統分類本文所用的系統分類主要根據NIH資料庫(Entrez，versionspring 1996)中使用的系統(可從全球通網絡(http//www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin/ef/entrezTAX)得到)。
對於Entrez資料庫未收錄的微生物分類，使用了以下常用並在世界範圍內接受的參考書對子囊菌綱(Ascomycetes)，參考Eriksson，O.E.Hawksworth，D.L.Systema Ascomycetum，12卷(1993)。
對擔子菌綱(Basidiomycetes)，參考Julich，W.Higher Taxaof Basidiomycetes，Bibliotheca Mycologia，85，485頁(1981).
對接合菌綱(Zygomycetes)，參考O』Donnell，K.Zygomycetesin culture，University of Georgia，US，257頁(1979).
常用真菌參考書Hawksworth，D.L.，Kirk，P.M.Sutton，B.C.和Pegler，D.N.真菌詞典，國際真菌學會，616頁(1995)；Von Arx，J.A.培養中會形成孢子的各個真菌屬(The generaof fungi sporulating in culture)，424頁(1981).優選真菌本發明的一個優選實施方案中，XET製劑是通過培養真菌，具體說是擔子菌(Basidiomycota)，接合菌(Zygomycota)，子囊菌(Ascomycota)或有絲分裂孢子真菌(Mitosporic fugus)生產的。
優選的擔子菌菌株是屬於革蓋菌目(Coriolales)，裂褶菌目(Schizophyllales)，韌革菌目(Stereales)或Xenasmatales各目的層菌綱(Hymenomycetes)菌株；具體說是屬於革蓋菌科(Coriolaceae)，伏革菌科(Corticiaceae)，裂褶菌科(Schizophyllaceae)，韌革菌科(Stereaceae)或Tubulicrinaceae各科的菌株。優選以下各屬栓菌屬(Trametes)，伏革菌屬(Corticium)，裂褶菌屬(Schizophyllum)或Tubulicrinis。優選的種是毛栓菌(Trametes hirsuta)、玫瑰色伏革菌(Corticium roseum)、裂褶菌屬之種、毛韌革菌(Stereumhirsutum)或Tubulicrinis subulatus。
優選的子囊菌菌株是屬於腔菌綱(Loculoascomycetes)，盤菌綱(Discomycetes)，核菌綱(Pyrenomycetes)或不整囊菌綱(Plectmycetes)的菌株，優選屬於座囊菌目(Dothideales)，斑痣盤菌目(Rhytismatales)，盤菌目(Pezizales)，錘舌菌目(Leotiales)，炭角菌目(Xylariales)，肉座菌目(Hypocreales)，海殼目(Halosphaeriales)，黑痣菌目(Phyllachorales)，腐皮殼菌目(Diaporthales)和散囊菌目(Eurotiales)各目的菌株。
優選的菌株是屬於葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)，小穴殼菌科(Dothioraceae)，球腔菌科(Mycosphaerellaceae)，毛筒殼科(Tubeufiaceae)，格孢腔菌科(Pleosporeceae)，小球腔菌科(Leptosphaeriaceae)，斑痣盤菌科(Rhytismataceae)，肉盤菌科(Sarcosomataceae)，火絲菌科(Pyronemataceae)，糞盤菌科(Ascobolaceae)，核盤菌科(Sclerotiniaceae)，圓孔殼科(Amphisphaeriaceae)，炭角菌科(Xylariaceae)，肉座菌科(Hypocreaceae)，海殼科(Halosphaeriaceae)，黑痣菌科(Phyllachoraceae)，黑腐皮殼科(Valsaceae)，黑盤孢科(Melanconidaceae)，和發菌科(Trichocomataceae)各科的菌株；特別是屬於二孢屬(Diplodia)，Plowrightia，葉點黴屬(Phyllosticta)，殼針孢屬(Septoria)，毛筒殼屬(Tubeufia)，鏈格孢屬(Alternaria)，盾殼黴屬(Coniothyrium)，莖點黴屬(Phoma)，Embellisia，Tiarosporella，Galiella，假黑盤菌屬(Pseudoplectania)，火絲菌屬(Pyronema)，珠頭黴屬(Oedocephalum)，葡萄孢屬(Botrytis)，外殼孢屬(Aposphaeria)，盤多毛孢屬(Pestalotia)，多毛菌屬(Pestalotiopsis)，孔座殼屬(Poronia)，Nodulisporium，炭角菌屬(Xylaria)，鐮孢屬(Fusarium)，輪枝孢屬(Verticillium)，周刺座黴屬(Volutella)，Chaetapiospora，Lulwothia，刺盤孢屬(Colletotrichum)，殼囊孢屬(Cytospora)，座盤孢屬(Discula)，擬莖點黴屬(Phomopsis)，棒盤孢屬(Coryneum)，Seimatosporium，麴黴屬(Aspergillus)，散囊菌屬(Eurotium)，正青黴屬(Eupenicillium)，青黴屬(Penicillium)，Petromyces和踝節菌屬(Talaromyces)各屬的菌株。
優選的種是棉色二孢(Diplodia gossypina)；Plowrightiaribesia；葉點黴屬之種；殼針孢屬之種；Tubeufiaamazonensis.；鏈格孢屬之種； Embellisia hyacinthi；新莖點黴(Phoma neoloba)；熱帶莖點黴(Phoma tropica)；盾殼黴屬之種；橄欖色盾殼黴(Coniothyrium olivaceoum)；當克盾殼黴(Coniothyrium dunckii)；Tiarosporella sp.；Tiarosporellaphaseolina；Galiella celebica；淡黑假黑盤菌(Pseudoplectanianigrella)；磚火絲菌(Pyronema domesticum)；珠頭黴屬之種；灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)；外殼孢屬之種；盤多毛孢屬之種；多毛菌屬之種；點孔座殼(Poronia punctata)；炭角菌屬之種；Nodulisporium sp.；腐皮鐮孢(Fusarium solani)；輪枝孢屬之種；巴西周刺座黴(Volutella buxi)；Chaetapiosporarhododendri；Lulworthia uniseptata；棘孢刺盤孢(Colletotrichum aculatum)；Colletotrichum crassipes；殼囊孢屬之種；座盤孢屬之種(Discula sp.)；Phomopsis ilicis；Phomopsis cirsii；慄棒盤孢(Coryneum castaneicola)；Seimatosporium lichenicola；塔木裡氏麴黴(Aspergillustamarii)；Eurotium chevalieri；爪哇正青黴(Eupenicilliumjavanicum)；膠囊青黴(Penicillium capsulatum)；奧爾森氏青黴(Penicillium olsonii)；嗜松青黴(Penicillium pinophilum)；婁格法爾特氏青黴(Penicillium roqueforti)；義大利青黴(Penicillium italicum)；變灰青黴(Penicillium canescens)；疣孢青黴(Penicillium verruculosum)；Petromyces alliaceus和黃色踝節菌(Talaromyces flavus)各種的菌株。
有用的接合菌菌株是屬於毛黴目(Mucorales)的菌株，優選屬於絲枝黴科(Chaetocladiaceae)和毛黴科(Mucoraceae)的菌株。
優選的菌株屬於Dichotomocladium，放射毛黴屬(Actinomucor)，球託黴屬(Gongronella)，Sporodiniella和毛黴屬(Mucor)，具體是Dichotomocladium hesseltinei、雅致放射毛黴(Actinomucor elegans)、卵形孢球託黴(Gongronellabutleri)、Sporodiniella umbellata和米赫毛黴minor變種(Mucor miehei var minor)等種。
分類不確定的菌株的例子是Vialaea insculpta。
屬於有絲分裂孢子真菌菌株的例子是Acrodontiumcrateriforme、出芽短梗黴(Aureobasidium pullulans)、Circinotrichum sp.、Cryptocline sp.、Ellisiopsis sp.、黑色附球菌(Epicoccum nigrum)、粘帚黴屬之種(Gliocladium sp.)、Helicorhoidion irregulare.、殼蠕孢屬各種(Hendersoniaspp.)、Mariannaea sp.、Microsphaeropsis sp.、柱隔孢屬之種(Ramularia sp.)、Sarcopodium sp.、Spadicoides sto.、Speiropsis pedatospora.、Sporotrichum exile.、杆黴屬之種(Stilbella sp.)、單端孢屬之種(Trichothecium sp.)、Trimmatostroma abietes.、Tubakia dryina.、Wiesneriomyces sp.和美索尼氏接柄孢(Zygosporium masonii)。
優選的細菌本發明另一方面涉及一種可通過培養細菌產生的新型XET製劑。
優選的細菌是革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌。
產XET的革蘭氏陽性細菌的例子有屬於芽孢桿菌屬的菌株。
優選的菌株已發現以下菌株是XET陽性的1.Dichotomocladium hesseltinei.菌株保藏號CBS164.61；分類接合菌，毛黴目，絲枝黴科。
2.雅致放射毛黴。菌株保藏號CBS154.86；分類接合菌，毛黴目，絲枝黴科。
3.米赫毛黴minor變種。菌株保藏號ATCC36018；分類接合菌，毛黴目，毛黴科。
4.卵形孢球託黴。根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，於1997年1月28日將一株卵形孢球託黴保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號CBS448.97；分類接合菌，毛黴目，絲枝黴科。
5.Sporodiniella umbellata.菌株保藏號CBS195.77分類；接合菌，毛黴目，毛黴科6.葉點黴屬之種。分離自中國的一株Pithecolobium sp.，分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目(Dothidiales)，球腔菌科(Mycosphaellaceae)。
7.殼針孢屬之種。根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，於1996年1月2日將一株殼針孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)。保藏號CBS831.95；分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，球腔菌科。
8.棉色二孢。根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，於1996年3月12日將一株棉色二孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)。保藏號CBS274.96；分類子囊菌，腔菌綱(Loculoascomycetes)，座囊菌目，葡萄座腔菌科(Botrysphaeriaceae)。
9.Plowrightia ribesia.分離自丹麥Ribes sp.，分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，小穴殼菌科(Dothioraceae)。
10.Tubeufia amazonensis。菌種保藏號ACTT42524；分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，毛筒殼科。
11.鏈格孢屬之種。分類子囊菌，腔菌綱(Loculoascomycetes)，座囊菌目，格孢腔菌科。
12.Embellisia hyacinthi.菌種保藏號IMI211561；分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，格孢腔菌科。
13.新莖點黴。分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，格孢腔菌科。
14.熱帶莖點黴。菌種保藏號CBS537.66；分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，格孢腔菌科。
15.盾殼黴屬之種。分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，小球腔菌科。
16.橄欖色盾殼黴。菌種保藏號CBS304.68。分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，小球腔菌科。
17. 克盾殼黴。分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，小球腔菌科。
18.Tiarosporella phaseolina.根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，於1997年1月28日將一株Tiarosporella phaseolina保藏在 Centraalvureau voorSchimmelcultures(CBS)，保藏號CBS446.97；分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，斑痣盤菌目，斑痣盤菌科。
19.Tiarosporella sp.。分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，斑痣盤菌目，斑痣盤菌科。
20.Galiella celebica.分離自在日本採集的樣品，分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，盤菌目(Pezizales)，肉盤菌科。
21.淡黑假黑盤菌。根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，於1997年1月28日將一株淡黑假黑盤菌保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號CBS444.97；分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，盤菌目(Pezizales)，肉盤菌科。
22.磚火絲菌。分離自挪威的樣品。分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，盤菌目(Pezizales)，火絲菌科。
23.珠頭黴屬之種。分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，盤菌目(Pezizales)，糞盤菌科。
24.灰色葡萄孢。根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，於1997年1月28日將一株灰色葡萄孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號CBS447.97，分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，錘舌菌目(Leotiales)，核盤菌科。
25.外殼孢屬之種。分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，錘舌菌目，核盤菌科。
26.盤多毛孢屬之種。根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，於1997年1月28日將一株盤多毛孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號CBS445.97。分類子囊菌，核菌綱，炭角菌目，圓孔殼科。
27.多毛菌屬之種。分類子囊菌，核菌綱，炭角菌目，圓孔殼科。
28.點孔座殼。分離自瑞典的樣品，分類子囊菌，核菌綱，炭角菌目，炭角菌科。
29.炭角菌屬之種。分離自生長在Mona，Jamaica的棕櫚Sabaljamaicensis葉子。分類子囊菌，核菌綱，炭角菌目，炭角菌科。
30.Nodulisporium sp.分類子囊菌，核菌綱，炭角菌目，炭角菌科。
31.腐皮鐮孢。分離自印度玉米粒樣品，分類子囊菌，核菌綱，肉座菌目，肉座菌科。
32.輪枝孢屬之種。根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，於1996年1月2日將一株輪枝孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號CBS830.95；分類子囊菌，核菌綱，肉座菌目，肉座菌科。
33.巴西周刺座黴。菌株保藏號IMI049467，分類子囊菌，核菌綱，肉座菌目，肉座菌科。
34.Chaetapiospora rhododendri.分類子囊菌，核菌綱，炭角菌目，炭角菌科，亞赤殼科(Hyponectriaceae)35.Lulworthia uniseptata.根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，於1997年1月28日將一株殼囊孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號CBS442.97，分類子囊菌，核菌綱，海殼目，海殼科。
36.棘孢刺盤孢。分類子囊菌，核菌綱，黑痣菌目，黑痣菌科。
37.Colletotrichum crassipes.分類子囊菌，核菌綱，黑痣菌目，黑痣菌科。
38.殼囊孢屬各種。根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，於1997年1月23日將一株殼囊孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號CBS424.97，分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑腐皮殼科。
39.殼囊孢屬之種。根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，於1997年1月23日將一株殼囊孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號CBS425.97，分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑腐皮殼科。
40.座盤孢屬之種。分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑腐皮殼科。
41.Pbomopsis ilicis.分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑腐皮殼科。
42.Phomopsis cirsii.分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑腐皮殼科。
43.慄棒盤孢。分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑盤孢科。
44.Seimatosporium lichenicola。分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑盤孢科。
45.塔木裡氏麴黴。菌株保藏號CBS821.72，分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發菌科。
46.Eurotium chevalieri.菌株保藏號CBS472.91，分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發菌科。
47.膠囊青黴。菌株保藏號CBS273.86，分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發菌科。
48.奧爾森氏青黴。菌株保藏號CBS523.89。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發菌科。
49.嗜松青黴。菌株保藏號CBS440.89。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發菌科。
50.婁格法爾特氏青黴。菌株保藏號CBS167.91。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發菌科。
51.義大利青黴。菌株保藏號IMI078681。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發菌科。
52.變灰青黴。菌株保藏號CBS579.70，分離自埃及的一個鹽礦。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發菌科。
53.爪哇正青黴。菌株保藏號CBS448.74。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發菌科。
54.疣孢青黴。菌株保藏號CBS563.92。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發菌科。
55.黃色踝節菌。菌株保藏號ATCC52201。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發菌科。
56.Petromyces alliaceus.菌株保藏號CBS511.69。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發菌科。
57.毛栓菌(Trametes hirsuta).分離自在丹麥採集的樣品，分類擔子菌，層菌綱，革蓋菌目，革蓋菌科。
58.裂褶菌屬之種。根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，於1997年1月28日將一株裂褶菌保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號CBS443.97.分類擔子菌，層菌綱，裂褶菌目，裂褶菌科。
59.玫瑰色伏革菌。分離自在丹麥採集的樣品，分類擔子菌，層菌綱，盤革菌目(Aleurodiscales)，伏革菌科(Cortiaceae).
60.Tubulicrinis subulatus分離自在丹麥採集的樣品，分類擔子菌，層菌綱，Xenasmatales，Tubulicrinaceae。
61.毛韌革菌。分離自在丹麥採集的樣品，分類擔子菌，層菌綱，韌革菌目，韌革菌科。
62.Acrodontium crateriforme.分類有絲分裂孢子真菌。
63.出芽短梗黴。分類有絲分裂孢子真菌。
64.Circinotrichum sp.分類有絲分裂孢子真菌。
65.Cryptocline sp.分類有絲分裂孢子真菌。
66.Ellisiopsis sp.分類有絲分裂孢子真菌。
67.黑色附球菌。分類有絲分裂孢子真菌。
68.粘帚黴屬之種。分類有絲分裂孢子真菌。
69.Helicorhoidion irregulare.分類有絲分裂孢子真菌。
70.殼蠕孢屬之種。分類有絲分裂孢子真菌。
71.Mariannaea sp.。分類有絲分裂孢子真菌。
72.Microsphaeropsis sp.。分類有絲分裂孢子真菌。
73.柱隔孢屬之種。分類分類有絲分裂孢子真菌。
74.Sarcopodium sp.。分類有絲分裂孢子真菌。
75.Spadicoides sto.保藏號IMI203428，分類有絲分裂孢子真菌。
76.Speiropsis pedatospora.分類有絲分裂孢子真菌。
77.Sporotrichum exile.保藏號CBS350.47，分類有絲分裂孢子真菌。
78.杆黴屬之種。分類有絲分裂孢子真菌。
79.單端孢屬之種。分類有絲分裂孢子真菌。
80.Trimmatostroma abietes.分類有絲分裂孢子真菌。
81.Tubakia dryina.分類有絲分裂孢子真菌。
82.Wiesneriomyces sp.。分類有絲分裂孢子真菌。
83.美索尼氏接柄孢分類有絲分裂孢子真菌。
84.Vialaea insculpta.分類未定。
85.嗜鹼芽孢桿菌。根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，於1997年2月12日將一株嗜鹼芽孢桿菌保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，保藏號DSM11104。生產XET可以通過在含有合適碳氮源的營養培養基(這種培養基是本領域已知的)上有氧培養上述微生物菌株生產本發明的XET酶。
或者，可以通過對含有來自上述菌株之一的適當遺傳信息的轉化宿主微生物進行有氧培養來生產本發明的XET酶。因此，本發明還涉及木糖葡聚糖內切轉糖基酶(XET)的生產方法，該方法包括a)在適宜的營養培養基中，有利於XET酶產生的條件下，培養表達微生物XET的轉化宿主微生物，以及b)隨後從營養培養基中純化XET酶。
可以用本領域已知方法製備和培養這種轉化子。克隆編碼XET的DNA序列可以用本領域的各種公知方法，從任何能產生所述XET的微生物中分離編碼本發明XET酶的DNA序列。
首先，用能產生待研究的XET的生物體之染色體DNA或信使RNA構建基因組DNA和/或cDNA文庫。然後，如果該XET的胺基酸序列是已知的，則可以合成出同源的標記寡核苷酸探針，用它從製備自所述微生物的基因組文庫或cDNA文庫中鑑定出XET編碼克隆。或者，可以用含有已知XET基因的同源序列的標記寡核苷酸探針作為探針，使用低嚴謹度的雜交和清洗條件，鑑定XET編碼克隆。
還有另一種XET編碼克隆的鑑定方法，包括將基因組DNA或cDNA片段插入表達載體(例如質粒)中，用得到的DNA文庫轉化XET陰性宿主生物體，然後將轉化細胞鋪到瓊脂平板上，利用上面描述的方法鑑定出表達XET的克隆。
或者，可以用已確立的標準方法合成製備編碼該酶的DNA序列，例如，S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(四面體通訊22，1981，1859-1869頁)描述的磷酸胺(phosphoamidite)法，或Matthes等(EMBO雜誌3，1984，801-805頁)描述的方法。在磷酸胺法中，寡核苷酸被合成(例如用自動DNA儀)、純化、退火、連接並克隆到合適的載體中。
最後，DNA序列可以是按照標準技術，通過將合成的、基因組或cDNA來源的片段(確切地說，諸片段對應於整個DNA序列的不同部分)連接起來而製備的基因組和合成混合來源的、合成和cDNA混合來源的、或者基因組和cDNA混合來源的。正如US4683202或R.K.Saiki等(科學239，1988，487-491頁)描述的，還可以用特異引物通過聚合酶鏈式反應(PCR)製備DNA序列。
表達XET根據本發明，可以用通常包括調控序列(編碼啟動子、操縱子、核糖體結合位點、翻譯起始信號和任選的抑制基因或者各種激活子基因)的表達載體，將通過上述方法或本領域已知的任何可替代方法產生的XET編碼DNA序列表達為酶的形式。
攜帶編碼本發明XET酶的DNA序列的重組表達載體可以是任何能夠方便地進行重組DNA操作的載體，載體的選擇經常取決於它將要導入的宿主細胞。因此，載體可以是自主複製的載體(即以染色體外實體存在的載體，其複製獨立於染色體複製的載體)，例如質粒，噬菌體或染色體外成分，微小染色體或者人工染色體。或者，載體可以是這樣一種類型，當它被導入宿主細胞時，載體會整合到宿主細胞基因組，並與它所整合的染色體一起複製。
在載體中，DNA序列應與合適的啟動子序列可操縱地連接。啟動子可以是在所選宿主細胞中表現出轉錄活性的任何DNA序列，並可以來源於編碼宿主細胞同源或異源蛋白質的基因。適用於指導本發明XET編碼DNA序列轉錄的啟動子(特別是在細菌宿主中)的實例有大腸桿菌lac操縱子的啟動子，天藍色鏈黴菌瓊脂糖酶基因dagA啟動子，地衣芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyL)的啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖原澱粉酶基因(amyM)的啟動子，解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyQ)的啟動子，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子。為了在真菌宿主中轉錄，適用啟動子的例子有來源於編碼米麴黴TATA澱粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑色麴黴中性α-澱粉酶，黑色麴黴酸穩定的α-澱粉酶，黑色麴黴葡糖澱粉酶，Rhizomucor miehei脂酶，米麴黴鹼性蛋白酶，米麴黴丙糖磷酸異構酶或者構巢麴黴乙醯胺酶等的基因的啟動子。
本發明的表達載體還可以包含合適的轉錄終止子，在真核細胞中，還可以包含與編碼本發明XET酶的DNA序列可操縱連接的多聚腺苷酸化序列。終止序列和多聚腺苷酸化序列可以適當地從啟動子相同來源得到。
載體另外可以包含能使載體在所述宿主細胞中複製的DNA序列。這種序列的例子是質粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1以及pIJ702的複製起點。
載體還可以包含選擇標記，例如其產物能補償宿主細胞缺陷的基因(如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因)，或者賦予抗生素抗性(如氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素抗性)的基因。另外，載體可以包含麴黴選擇標記(如amdS，argB，niaD和產生潮黴素抗性的標記sc)，或者通過共轉化來實現選擇(例如，WO91/17243所描述的)。
儘管胞內表達在一些方面具有優勢(例如，當用某些細菌作宿主細胞時)，但通常優選胞外表達。
構建編碼XET酶並含有啟動子、終止子和其它元件的本發明載體的適用步驟對本領域技術人員是眾所周知的(參考，例如Sambrook等，分子克隆實驗指南，第二版，Cold Spring Harbor，1989)。
包含以上定義的本發明DNA構建體或表達載體的本發明細胞是重組生產本發明XET的優選宿主細胞。可以通過將DNA構建體(以單拷貝或多拷貝)整合到宿主染色體內，用本發明編碼XET的DNA構建體方便地轉化細胞。通常認為發生這種整合比較有利，因為這樣DNA序列便更可能穩定地保留在細胞內。可以按照常規方法(例如同源或異源重組)將DNA構建體整合到宿主染色體內。或者，可以用以上描述的與不同類型宿主細胞相聯繫的表達載體轉化細胞。
本發明的細胞可以是高等生物體細胞，例如哺乳動物或昆蟲細胞，但優選微生物細胞，例如細菌或真菌(包括酵母)細胞。
合適的細菌的例子是革蘭氏陽性細菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜鹼芽孢桿菌、解澱粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或蘇雲金芽孢桿菌；或淺青紫鏈黴菌，或鼠灰鏈黴菌；或革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌。細菌的轉化可以通過原生質體轉化或依照已知方式用感受態細胞進行。
酵母細胞可以從酵母屬或裂殖酵母屬(例如釀酒酵母)中選擇。絲狀真菌以屬於麴黴屬之種為好(例如米麴黴或黑麴黴)。轉化真菌細胞可以通過已知方式(包括原生質體形成和原生質體轉化及隨後細胞壁再生的過程)進行。適用於麴黴屬宿主細胞轉化的步驟在EP238023中有描述。
本發明還有一個方面涉及本發明XET酶的生產方法，該方法包括在利於產生XET的條件下培養上述宿主細胞，並從細胞中和/或培養基中回收XET。
用於培養細胞的培養基可以是任何適於所用宿主細胞生長並表達本發明XET的常規培養基。合適的培養基可以購買到或者可以根據公開配方(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄描述的)製備。
可以通過眾所周知的操作從培養基中方便地純化宿主細胞分泌出來的XET，包括通過離心或過濾分離培養基中的細胞，鹽析沉澱培養基中的蛋白質成分(例如用硫酸銨)，隨後利用層析操作(如離子交換層析、親和層析等)。
工業應用根據本發明，用XET酶處理後，纖維素材料可以獲得改善的強度特性和/或提高的保形性能和/或更好的抗皺性能。XET酶能將以氫鍵結合到纖維素纖維上的木糖葡聚糖分子重排並連接，從而獲得上述性能。
為了增強XET酶的效能，在某些情況下，將木糖葡聚糖加入纖維素材料中的做法是有益的，這樣酶可以將更多纖維素材料連接在一起。
可以在水中用XET酶處理纖維素材料，或者在有某些成分(如緩衝液和/或潤溼劑和/或穩定劑和/或聚合物和/或降低水活度的有機成分(如DMSO))的水中進行。
合適的緩衝液可以是磷酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽、己二酸鹽，三乙醇胺，單乙醇胺，二乙醇胺，碳酸鹽(特別是鹼金屬或鹼土金屬碳酸鹽，具體說是碳酸鈉或碳酸鉀，或銨和HCl鹽)，二胺，特別是二氨基乙烷，咪唑，Tris或胺基酸緩衝液。
潤溼劑用於提高纖維素材料的溫度。潤溼劑優選非離子表面活性劑類型。
穩定劑可以是能穩定XET酶的一種試劑。
根據本發明，XET在水性介質中的濃度可以在0.01-1000μg酶蛋白/g纖維素材料，優選0.05-100μg酶蛋白/g纖維素材料。
通常要將反應介質(含有纖維素材料和XET酶)保溫至少幾分鐘。從1分鐘到20小時的保溫時間通常都是合適的，具體地說，常常優選保溫時間為30分鐘到10小時。
本發明方法中的反應介質溫度在10-90℃的範圍內比較合適，具體說對所述XET酶以15-70℃為宜。
通過以下非限定性6實施例進一步闡述本發明。
實施例1篩選XET陽性菌株培養基PD瓊脂39g馬鈴薯葡萄糖瓊脂，DIFCO 0013；加入去離子水至1000ml，121℃高壓蒸氣滅菌15-20分鐘。
YPG瓊脂4g酵母提取物(DIFCO 0127)，1g KH2PO4(Merck4873)，0.5g MgSO4·7H2O(Merck5886)，15g葡萄糖(Roquette 101-0441)，20g瓊脂(Merck1614)，去離子水補至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌15-20分鐘。
MEA20g麥芽浸膏粉(DIFC00186)，1g蛋白腖(DIFC00118)，20g葡萄糖(Roquette France 1010441)，20g瓊脂(Merck1614)，去離子水補至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘。
培養基A(每瓶)30g麥麩，45ml下述溶液10g rofec(Roquette101-0441)，10g NH4NO3(Merck1187)，10g KH2PO4(Merck 4873)，40gSolcafloc(Dicacel，購自Dicalite-Europe-Nord，9000Gent，Belgium)，0.75g MgSO4.7H2O(Merck 5886)，15g CaCO3，自來水補至1000ml，pH調至6.5。121℃高壓蒸汽滅菌40分鐘。
培養基B20g大豆餅，5g maltodex01(Roquette101-7845)，15g麥麩，3g蛋白腖(DIFC00118)，10g微晶纖維素(Merck2331)，0.2mlpluronic(PE-6100，101-3068)，1g橄欖油，去離子水補至1000ml。
取100ml裝入帶有兩個擋板的500ml Erlenmeyer瓶中。121℃高壓蒸汽滅菌40分鐘。
培養基C100g蔗糖，40g大豆餅，10gNa2HPO4.12H2O(Merck6579)，0.1ml pluronic(PE-6100，101-3068)，自來水補至1000ml。裝有100ml培養基的帶兩個擋板的Erlenmeyer瓶中加入0.5g CaCO3。121℃高壓蒸汽滅菌40分鐘。臨用前，每100ml培養基加10ml 1M NaHCO3(pH9)。
發酵步驟將真菌菌株保存在瓊脂培養皿(9cm)中，或者PDA、YPG、MEA斜面(參見培養基列表)上。每個瓊脂斜面用10ml無菌蒸餾水洗，每個搖瓶接種3ml。
真菌菌株在搖瓶中於如下生長條件下培養培養基A和B(參見培養基列表)。
溫度26℃RPMA靜止B125-200培養時間A6到30天
B2-21大細菌分離物保存在TY瓊脂(pH9)斜面上，TY瓊脂包含20g胰蛋白腖，5g酵母提取物，0.7ml 1％FeCl2.4H2O溶液，0.1ml1％MnCl2.4H2O溶液，1.5ml 1％MgSO4.7H2O溶液，20g瓊脂，去離子水補至1000ml。121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。傾注平板前，向100ml瓊脂中加入10ml無菌1M NaHCO3(pH9)。
斜面於30℃保溫4天，每個瓊脂斜面用10ml無菌水洗下，每個搖瓶接種3ml。
細菌在含有培養基C的搖瓶中，於30℃、300rpm培養4天。
活性檢測將B和C中獲得的培養液於10000rpm離心10分鐘。檢測上清的XET活性。
向每個含有麥麩及已充分生長的培養物的搖瓶中加入200ml自來水，於200rpm振蕩2小時。然後離心培養液，上清用於檢測XET活性。
XET分析用前面描述的點印跡方法分析樣品。
結果用前面描述的方法，發現1種芽孢桿菌和幾種屬於不同分類群的真菌是陽性的。結果示於下表。
嗜鹼芽孢桿菌在培養基C(pH9)(見培養基列表)中於30℃、300rpm生長4天後呈陽性。真菌分離物培養基A培養基B雅致放射毛黴 + -Dichotomocladium hesseltinei + +卵形孢球託黴 未作 +米赫毛黴minor變種+ +Sporodiniella umbellata - +鏈格孢屬之種 + -外殼孢屬之種 未作 +塔木裡氏麴黴 + +灰色葡萄孢 + +Chaetapiospora rhododendri - +棘孢刺盤孢 + -Colletotrichum crassipes + -當克盾殼黴 + +橄欖色盾殼黴 + -盾殼黴屬各種 - +慄棒盤孢 - +殼囊孢屬之種 + +棉色二孢 + +座盤孢屬之種 + +Embellisia hyacinthi + -爪哇正青黴 + -Eurotium chevalieri - +腐皮鐮孢 + -Galiella celebica+ +Lulworthia uniseptata+ +Nodulisporium sp.+ -珠頭黴屬之種 - +變灰青黴 + -膠囊青黴 + -義大利青黴 未作 +奧爾森氏青黴 + -嗜松青黴 + 未作婁格法爾特氏青黴 + +疣孢青黴 + +盤多毛孢屬之種 未作 +多毛菌屬之種 + +Petromyces alliaceus + +新莖點黴 + -熱帶莖點黴 + +Phomopsis cirsii - +Phomopsis ilicis + +葉點黴屬之種 + -Plowrightia ribesia + +點孔座殼 + +淡黑假黑盤菌 + +磚火絲菌 + +柱隔孢屬之種 + -Seimatosporium lichenicola + -殼針孢屬之種 + 未作黃色踝節菌 + +Tubeufia amazonensis + -Tiarosporella phaseolina + +Tiarosporella sp.- +輪枝孢屬之種 + +巴西周刺座黴 + -炭角菌屬之種 + +玫瑰色伏革菌 + +裂褶菌屬之種 + +毛韌革菌 + +毛栓菌 + +Tubulicrinis subulatus + +Acrodontium crateriforme + -出芽短梗黴 + -Circinotrichum sp. - +Cryptocline sp. + -Ellisiopsis sp. + -黑色附球菌 - +粘帚黴屬之種 + -Helicorhoidion irregulare+ +殼蠕孢屬各種 + +Mariannaea sp. + -Microsphaeropsis sp. + -柱隔孢屬之種 + -Sarcopodium sp. + -Spadicoides sp. - +Speiropsis pedatospora + -Sporotrichum exile + +杆黴屬之種 + -單端孢屬之種 + +Trimmatostroma abietes + +Tubakia dryina + +Wiesneriomyces sp. + -美索尼氏接柄孢 + +Vialaea + 未作+陽性，-陰性實施例2Dichotomocladium hesseltinei XET的純化和鑑定在15個PDA瓊脂斜面接種Dichotomocladium hesseltinei(CBS164.61)，於26℃培養7天。用含有0.1％Tween80的約250ml無菌蒸餾水洗下菌體，用來接種80個含有培養基B(2-3ml/瓶)的搖瓶。搖瓶於26℃，200rpm振蕩培養5天，到時後，4000rpm離心培養液15分鐘。
用以下方法純化含有木糖葡聚糖內切轉糖基酶(XET)的上清液向經濾布過濾的培養液中加入助濾劑，將該溶液進一步用蔡氏深度濾盤過濾得到澄清溶液。調節濾液的pH至pH8.0，用去離子水稀釋濾液達到與20mM Tris/HCl(pH8.0)相同的導電率。
將XET酶上樣到用20mM Tris/HCl(pH8.0)平衡過的Q-SepharoseFF柱子中，採用線性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脫酶。XET活性物洗脫得到單個峰。匯集的XET經SephadexG25柱子換入20mM Tris/HCl(pH8.0)緩衝液中，再在經20mM Tris/HCl(pH8)平衡過的Q-SepharoseFF柱子層析。用線性增加的NaCl梯度(0→0.2M)洗脫柱子。匯集含XET的流分，加入(NH4)2SO4至終濃度為1.4M。在1.4M(NH4)2SO4，10mM琥珀酸(pH7.0)中平衡PhenylToyopearl 650S柱子，將XET酶上樣到這個柱子中，用線性降低的(NH4)2SO4梯度(1.4→0M)洗脫。匯集含XET的流分，在帶有再生纖維素膜(截留分子量10kDa)的超濾池上進行濃縮。將濃縮的酶上樣到在100mM H3BO3、10mM二甲基戊二酸、2mM CaCl2(pH7.0)中平衡過的Superdex200體積排阻層析柱子中。通過SDS-PAGE分析從Superdex200柱子洗脫下來的流分，匯集各純XET流分。
Diehotomocladium hesseltinei XET在SDS-PAGE上遷移形成Mr＝24kDa的一條帶。作SDS-PAGE並電印跡到PVDF膜上後，測定24kDa組分的N-末端胺基酸序列。推斷出如下N-末端胺基酸序列(SEQ ID NO.1)Ala-Glu-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Thr-Gln-Thr-Val-Gly-Asn-Tyr-Ile-Val-Tyr-Asn-Asn-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ala.
本發明還涉及含有SEQ ID NO.1所示胺基酸序列的微生物XET酶，或與SEQ ID NO.1胺基酸序列至少80％同源、優選至少85％同源、更優選至少90％同源，還要更優選至少95％同源，特別是至少98％同源的XET。
如果通過已知的算法(例如Lipman和Pearson在科學227(1985，1435頁)中描述的那種算法)將多肽與親本XET的相應胺基酸序列進行比較後顯示有X％相同，則認為它們之間的同源性為X％。
另外，對Dichotomocladium hesseltinei XET進行質譜分析得到其分子量為23006Da。
實施例3Tiarosporella phaseolina XET的純化和鑑定在15個PDA瓊脂斜面上接種Tiarosporella phaseolina(CBS446.97)，於26℃培養7天。用含有0.1％Tween80的約250ml無菌蒸餾水洗斜面，用來接種80個含有培養基B(2-3ml/瓶)的搖瓶。搖瓶於26℃，200rpm振蕩培養7天，到時後，於4000rpm離心培養液15分鐘。
用以下方法純化含有木糖葡聚糖內切轉糖基酶(XET)的上清液向經濾布過濾的培養液中加入助濾劑，將該溶液進一步用蔡氏深度濾盤過濾得到澄清溶液。濾液在截留分子量為3Kda的聚醚碸(polyethersulfone)膜上超濾濃縮，隨後用蒸餾水透析以降低導電率。將濃縮酶的pH調節至pH5.0。濃縮酶的導電率為1.7mS/cm。
將XET酶上樣到在20mM CH3COOH/NaOH(pH5.0)中平衡過的S-Sepharose FF柱子中，用線性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脫酶。XET活性成分以單一峰形式洗脫下來。匯集的XET經透析轉換緩衝液至20mM CH3COOH/NaOH(pH4.0)。將透析過的酶上樣到在20mMCH3COOH/NaOH(pH4.0)中平衡過的SOURCE 30S柱子中。柱子洗後，用線性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脫XET活性成分。匯集有XET活性的流分，對20mM Tris/HCl(pH8)進行透析。透析過的酶上樣到在20mM Tris/HCl(pH8)中平衡過的SOURCE 30Q柱子中。柱子洗後，用線性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脫XET活性成分。匯集有XET活性的流分，在帶有再生纖維素膜(截留分子量10kDa)的超濾池上進行濃縮。將濃縮過的酶上樣到在100mM H3BO3、10mM二甲基戊二酸、2mM CaCl2(pH7.0)中平衡過的Superdex200體積排阻柱子中。通過SDS-PAGE分析從Superdex200柱子中洗脫下的流分，匯集純XET流分。
Tiarosporella phaseolina XET在SDS-PAGE上遷移形成Mr＝24kDa的一條帶。作SDS-PAGE並電印跡到PVDF膜上後，測定該24kDa組分的N-端胺基酸序列。推斷出如下N-端胺基酸序列(SEQ IDNO2)Xaa-Asp-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Asn-Val-Lys-Asn-Gly-Pro-Tyr-Thr-Leu-Tyr-Asn-Asn-Leu-Gly-Gly-Lys本發明還涉及含有SEQ ID NO.2所示胺基酸序列的微生物XET酶或與SEQ ID NO.2胺基酸序列至少80％同源、優選至少85％同源、更優選至少90％同源、還要更優選至少95％同源、特別是至少98％同源的XET。
如果通過已知的算法(例如Lipman和Pearson在科學227(1985，1435頁)中描述的那種算法)將多肽與親本XET的相應胺基酸序列進行比較後顯示有X％相同，則認為它們之間的同源性為X％。
實施例4淡黑假黑盤菌XET的純化和鑑定在15個PDA瓊脂斜面上接種淡黑假黑盤菌(CBS444.97)，於26℃培養7天。用含有0.1％Tween80的約250ml無菌蒸餾水洗斜面，用來接種80個含有培養基B(2-3ml/瓶)的搖瓶。搖瓶於26℃，200rpm振蕩培養7天，到時後，於4000rpm離心培養液15分鐘。
用以下方法純化含有木糖葡聚糖內切轉糖基酶(XET)的上清液向經濾布過濾的培養液中加入助濾劑，將該溶液進一步用蔡氏深度濾盤過濾得到澄清溶液。將濾液調節至pH5.0，並用去離子水稀釋濾液，使其與20mM CH3COOH/NaOH(pH5.0)導電率相同。
將XET酶上樣到在20mM CH3COOH/NaOH(pH5.0)中平衡過的S-Sepharose FF柱子中，以線性增加的NaCl梯度(0→0.25M)洗脫該酶。XET活性成分以單一峰形式洗脫下來。收集的XET經SephadexG25柱子轉換緩衝液至20mM Hepes/NaOH(pH7.0)中，上樣到在20mM Hepes/NaOH(pH7.0)平衡過的S-Sepharose FF柱子中。以線性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脫柱子。匯集有XET活性的流分，經透析轉換緩衝液至20mM CH3COOH/NaOH(pH5.0)中。將SOURCE15S柱子在20mM CH3COOH/NaOH(pH5.0)中平衡，上樣透析過的酶。柱子洗後，以線性增加的NaCl梯度(0→0.2M)洗脫XET酶。匯集含XET的流分，在帶有再生纖維素膜(截留分子量10kDa)的超濾池上進行濃縮。將經過濃縮的酶上樣到在20mM CH3COOH/NaOH、100mMNaCl(pH5.0)中平衡過的Superdex200體積排阻柱子中。通過SDS-PAGE分析從Superdex200柱子洗脫下的流分，匯集純XET級分。
淡黑假黑盤菌XET在SDS-PAGE上遷移形成Mr＝58kDa的一條帶。作SDS-PAGE並電印跡到PVDF膜上後，發現該58kDa組分具有中斷的N-末端。
將高度純化的淡黑假黑盤菌XET製劑還原並烷基化。然後用Lys-C降解酶樣品。在SMART系統中，用TFA/AN在長Vydac C18上經RP-HPLC分離肽，並在TFA/異丙醇中重新純化。通過Edman降解分析選出的肽。
表1列出了所得8種肽的序列。發現兩種肽與葡聚糖酶樣和木聚糖酶樣酶同源，但大多未顯示出與已知序列有任何同源性或只有不相關的同源性。
表1淡黑假黑盤菌XET的Lys-C肽的序列
實施例5Dichotomocladium hesseltinei，Tiarosporellaphaseolina，淡黑假黑盤菌XET及木糖葡聚糖酶的pH曲線檢驗Dichotomocladium hesseltinei，Tiarosporellaphaseolina和淡黑假黑盤菌的木糖葡聚糖內切轉糖基酶的pH曲線。用pH3.0到11.0的緩衝液稀釋純酶，使最終稀釋液中的蛋白質濃度相同(即A280＝0.004)。用XET點印跡檢測(前面已描述)分析樣品中的XET。目測螢光斑點，評定為0-10級。因此圖1中所用單位是不定單位。
從圖1中可看到，在pH3到pH11範圍內，特別是pH4到pH9 XET都有活性。
檢測具有XET活性的所有分離物的木糖葡聚糖酶活性。兩種酶的比活在各分離物中是不同的。為了作出XET的pH活性曲線，將酶在相同的緩衝液中稀釋至相同的蛋白質終濃度，並檢測木糖葡聚糖酶活性。檢測中使用AZCL木糖葡聚糖。所用的木糖葡聚糖方法如下底物懸浮於脫鹽水中的0.4％AZCL-木糖葡聚糖。
緩衝液100mM H3BO3，10mM二甲基戊二酸，2mM CaCl2(pH7)分析-將Eppendorf恆溫器旋到40℃。
-將500μl 0.4％AZCL-木糖葡聚糖與500μl緩衝液混合，置冰上。
-加入20μl酶，在Eppendorf恆溫器中保溫，直到產生合適的顏色。
-再將樣品放回冰浴以防止樣品在0℃離心時進一步反應。
-將200μl樣品轉入微量滴定板中，於650nm測量藍色。
結果示於圖2。
實施例6來自Tiarosporella phaseolina(CBS編號446.97)的木糖葡聚糖內切轉糖基酶(XET)的克隆和表達保藏微生物Tiarosporella phaseolina CBS編號446.97。
其它菌株酵母菌株所用釀酒酵母為W3124(van den Hazel，H.B；Kielland-Brandt，M.C；Winter J.R；歐洲生物化學雜誌207，277-283，1992；(MATa；ura3-52；leu2-3，112；his3-D200；pep4-1137；prc1∷HIS3；prb1∷LEU2；cir+))。大腸桿菌菌株DH10B(Life Technologies)質粒
麴黴表達載體pHD414是質粒p775(EP238023有描述)的一個衍生物。pHD414的構建在WO93/11249中有進一步描述。
pYES2.0(Invitrogen)培養基YPD10g酵母提取物，20g蛋白腖，加水至900ml。高壓蒸汽滅菌，加入100ml 20％葡萄糖(過濾除菌)。
YPM10g酵母提取物，20g蛋白腖，加水至900ml。高壓蒸汽滅菌，加入100ml 20％麥芽糖糊精(過濾除菌)。
10×Basal鹽75g酵母氮鹼，113g琥珀酸，68g NaOH，加水至1000ml，過濾除菌。
SC-URA100ml 10×Basal鹽，28ml無維生素的20％酪蛋白胺基酸，10ml1％色氨酸，加水至900ml。高壓蒸汽滅菌後，加入3.6ml 5％蘇氨酸和100ml 20％葡萄糖或20％半乳糖。
SC-瓊脂SC-URA，加入20g/l瓊脂。
AZCL木糖葡聚糖(Megazyme，Australia)在酵母中克隆表達按照本文中引作參考文獻的H.Dalboege等(H.Dalboege等，分子與普通遺傳學1994，243253-260；WO93/11249；WO94/14953)所述進行酵母中的克隆表達。總RNA的提取、cDNA合成、綠豆核酸酶處理、用T4 DNA聚合酶形成平末端以及構建文庫等各個步驟均按照上述文獻進行。
發酵Tiarosporella phaseolina(CBS編號446.97)以分離mRNA從平板上將Tiarosporella phaseolina(CBS編號446.97)生長完全的菌絲體接種到含有100ml培養基B(參見培養基)的搖瓶中。培養液於26℃，200rpm培養7天，所得培養液經miracloth過濾，將菌絲體冷凍在液氮中。
按照H.Dalboege等(分子與普通遺傳學1994，243253-260；WO93/11249；WO94/14953)所述從該培養物的菌絲體中分離mRNA。
總RNA的提取是用硫氰酸胍處理，再經5.7M CsCl超速離心進行的，按照WO94/14953描述的步驟經Oligo(dT)-纖維素親和層析分離poly(A)+RNA。
cDNA合成用RNaseH方法(Gubler和Hoffman(1983)，基因25263-269，Sambrook等，(1989)分子克隆實驗指南，Cold Spring Harborlab.Cold Spring Harbor，NY)，從5mg poly(A)+RNA合成雙鏈cDNA。將poly(A)+RNA(在5μl DEPC處理過的水中含有5μg)在預先矽化過的無RNase的Eppendorph管中於70℃加熱8分鐘，在冰上驟冷，並與含有1mM dATP、dGTP、dTTP和0.5mM 5-甲基-dCTP(Pharmacia)、40單位人胎盤核糖核酸酶抑制劑(RNasin，Promega)、1.45μg Oligo(dT)18-NotI引物(Pharmacia)和1000單位SuperScript II RNaseH反轉錄酶(Bethesda ResearchLaboratories)的反轉錄酶緩衝液(50mM Tris-Cl(pH8.3)、75mMKCl、3mM MgCl2、10mM DTT，Bethesda Research Laboratories)合併至終體積50μl。將反應混合物置於45℃保溫1小時合成第一鏈cDNA。合成完成後，按照廠商說明用MicroSpin S-400 HR(Pharmacia)離心柱凝膠過濾mRNAcDNA雜合混合物。
凝膠過濾後，將雜合物稀釋到含有200μl各種dNTP，60單位大腸桿菌DNA聚合酶I(Pharmacia)，5.25單位RNaseH(Promega)以及15單位大腸桿菌DNA連接酶(Boehringer Mannheim)的250μl第二鏈緩衝液(20mM Tris-Cl，pH7.4，90mM KCl，4.6mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，0.16mM bNAD+)中。將反應管置於16℃保溫2小時，再在25℃保溫15分鐘，以合成第二鏈cDNA。加入EDTA至終濃度為20mM以終止反應，隨後進行酚/氯仿抽提。
綠豆核酸酶處理通過加入2體積96％EtOH，0.2體積10M NH4Ac，於-20℃沉澱雙鏈cDNA 12小時，再經離心回收，在70％EtOH中洗滌，乾燥並重懸於30μl含有25單位綠豆核酸酶(Pharmacia)的綠豆核酸酶緩衝液(30mM NaAc(pH4.6)、300mM NaCl、1mM ZnSO4、0.35mM DTT、2％甘油)中。反應於30℃保溫30分鐘以剪切單鏈髮夾DNA，隨後，加入70μl 10mM Tris-Cl(pH7.5)、1mM EDTA，進行酚抽提，用2體積96％EtOH、0.1體積3M NaAc(pH5.2)在冰上放置30分鐘進行沉澱。
用T4 DNA聚合酶形成平末端離心回收雙鏈cDNA，將反應混合物置於16℃保溫1小時，使在30ml含有0.5mM各種dNTP和5單位T4 DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)的T4 DNA聚合酶緩衝液(20mM Tris-乙酸鹽，pH7.9，10mMMgAc，50mM KAc，1mM DTT)中產生平末端。加入EDTA至終濃度20mM以終止反應，隨後進行酚/氯仿抽提，加入2體積96％EtOH、0.1體積3M NaAc(pH5.2)，在-20℃沉澱12小時。
銜接子連接，NotI消化和大小選擇填平反應完成後，離心回收cDNA，在70％EtOH中洗滌，進行乾燥。將cDNA沉澱重懸於25μl含有2.5μg非回文性BstXI銜接子(Invitrogen)和30單位T4連接酶(Promega)的連接緩衝液(30mMTris-Cl，pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP)中，於16℃保溫12小時。65℃加熱20分鐘C終止反應，然後置冰上冷卻5分鐘。通過加入20μl水，5μl 10×NotI限制酶緩衝液(New EnglandBiolabs)和50單位NotI(New England Biolabs)，隨後於37℃保溫2.5小時，從而用NotI限制酶消化連接好的cDNA。65℃加熱10分鐘終止反應。通過在0.8％SeaPlaque GTG低熔點瓊脂糖凝膠(FMC)上於1×TBE中進行凝膠電泳，對cDNA進行大小分級分離，從而分離出未連接的銜接子和小cDNA。選擇出分子量0.7kb以上的cDNA，並按照廠商說明用β-瓊脂糖酶(New England Biolabs)從凝膠中將其釋放出來，通過加入2體積96％EtOH和0.1體積3M NaAc(pH5.2)在-20℃放置12小時使cDNA沉澱。
構建文庫離心回收定向的經大小選擇過的cDNA，在70％EtOH中洗，乾燥後重懸於30μl 10mM Tris-Cl(pH7.5)，1mM EDTA中。經過MicroSpin S-300HR離心柱，按照廠商說明進行凝膠過濾，從而對cDNA進行脫鹽。在含有5μl雙鏈cDNA(反應管#1和#2)、15單位T4連接酶以及30ng(管#1)、40ng(管#2)和40ng(管#3，載體背景對照)BstXI-NotI切割的pYES2.0載體的10μl連接緩衝液(30mM Tris-Cl，pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP)中作三次檢測連接。於16℃保溫12小時進行連接反應，70℃加熱20分鐘，並向每個管加入10μl水。按照Sambrook等描述的方法(1989，分子克隆實驗指南，Cold Spring Harbor Lab.，ColdSpring Harbor NY)，通過電穿孔將每種連接混合物1μl導入40μl電感受態大腸桿菌DH10B細胞(Bethesda ResearchLaboratories)中。利用最適條件，在大腸桿菌中建立文庫，由各個群組成。將轉化的大腸桿菌鋪到瓊脂平板(LB+氨苄青黴素)上，密度為37℃溫育24小時後可形成15000-30000個菌落/板，這樣製得了各個群。向平板中加入20ml LB+氨苄青黴素，使細胞懸浮其中。將細胞懸液在一個50ml試管中於37℃振蕩1小時。按照廠商說明用QIAGEN質粒試劑盒從細胞中分離質粒DNA，保存在-20℃。
將來自每個群的1μl純化質粒DNA樣品(100ng/ml)經電穿孔(Becker和Guarante(1991)酶學方法194182-187)轉化釀酒酵母W3124，將轉化子鋪到含有2％葡萄糖的SC瓊脂平板上，並於30℃溫育。
鑑定陽性克隆通過尋找木糖葡聚糖酶陽性菌落間接篩選菌落的XET表達情況。
瓊脂平板生長3-5天後，將其影印到一組含有0.1％AZCL木糖葡聚糖的SC-URA瓊脂(加有20％半乳糖)平板上。將這些平板於30℃培養3-7天。周圍有藍色圈的菌落確定為木糖葡聚糖酶陽性菌落。
將來自酶陽性菌落的細胞鋪到瓊脂平板上以分離出單菌落，挑選每個鑑定到的產木糖葡聚糖酶菌落的產酶單菌落。
檢測所有木糖葡聚糖酶陽性克隆的XET，發現都是陽性。
分離cDNA基因以在麴黴中表達將產XET的酵母菌落接種到50ml玻璃試管中的20ml YPD培養液中。試管於30℃振蕩兩天。於3000rpm離心10分鐘收穫細胞。
按照WO94/14953分離DNA，並將其溶於50ml水中。經標準操作將DNA轉化到大腸桿菌中。用標準步驟從大腸桿菌中分離出質粒DNA，並進行限制酶分析。用限制酶BamHI和XbaI將cDNA插入片段切割下來，並連接到麴黴表達載體pHD414中，得到質粒pA2XG80。
用Applied Biosystems ABI PRISMTM377 DNA測序儀，按照廠商說明，將經Qiagen純化的pA2XG80(Qiagen，USA)質粒DNA中的cDNA插入片段測序，測序中使用Taq脫氧末端循環測序試劑盒(Perkin Elmer，USA)和合成寡核苷酸引物。
轉化米麴黴或黑色麴黴如此處引作參考文獻的WO95/02043(16頁，21行-17頁，12行)所述製備原生質體。
將100μl原生質體懸液與10μl STC(1.2M山梨醇，10mMTris-HCl，pH＝7.5，10mM CaCl2)中的5-25μg適當的DNA混合。將原生質體與p3SR2(攜帶構巢麴黴amdS基因的質粒)(ToveChristensen等，生物/技術，1419-1422頁，6卷，1988年12月)混合。混合液置室溫中25分鐘。加0.2ml 60％PEG4000(BDH29576)，10mM CaCl2和10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，小心混勻(兩次)，最後加入0.85ml同一溶液，小心混勻。混合液置室溫25分鐘，在2500g離心15分鐘，將沉澱重懸於2ml 1.2M山梨醇中。再沉澱一次後，將原生質體鋪在含有1.0M蔗糖(pH＝7.0)、10mM乙醯胺(作為氮源)以及20mM CsCl的基本平板(Cove，Biochem.Biophys.Acta 113(1966)51-56)上，以抑制背景生長。於37℃溫育4-7天後，挑出孢子，鋪平板以形成單菌落。重複該過程，將第二次重分離後得到的單菌落的孢子作為明確的轉化子保存起來。
檢測米麴黴轉化子將每株米麴黴轉化子接種在10ml YPM(參見下述)中進行增殖。於30℃培養2-5天後，除去上清。
用前面描述的XET點印跡檢測方法鑑定XET活性。
下列序列(SEQ ID No3)是pYES2.0中的XG80(得自Tiarosporella phaseolina的XET)的cDNA插入片段，其中包括克隆所用的BamHI和NotI識別位點GGATCCGAATTCCAACTATCCTGCCCTCCTTTCAAGCGAACACCATGAAGTTCTCCTCGGCTCTGTTTCTGGCCGCTACGGCGGTCTTGGCTTCCGCCGCGCCGCTTGAGCGCCGCGCCGACTTTTGTGGTCAATGGGACAACGTGAAGAACGGACCTTACACTCTTTACAACAACCTGTGGGGAAAAGATGCTTCCGGAGCCTCCGGATCGCAATGCACCGGCGTCGATAGCTTCAGCAGCAACACCATCGCTTGGCACACATCCTGGTCCTGGTCCGGTGCTCAGTACAATGTCAAGTCTTACGCAAACGTGGTCGTCGACATCACCTCTAAGAAACTCAGCGCCATCAGCAGCATTAACAGCATCTGGCGCTGGGCTTACACGGGTAGCAACATTGTTGCCAATGTTGCCTACGATATCTTCACTTCATCCACTGTCGGTGGTAGCGAGGAATATGAAATCATGATATGGGTTGGTGCTCTCGGTGGTGCTGGTCCGATCTCATCTACCGGCTCCCCTATTGCCACCGTTTCCCTTGCAGGCTCCTCGTGGAAGCTCTACAAAGGGCCCAACGGGCAGATGACCGTGTTCAGCTTCGTCGCCGAGTCCAACGTGAACAACTTCAGCGGTGACCTTAACGCTTTCATCAAGTACCTCACCGGCAACCAGGGCCTTCCCGCCTCGCAATACATCAAGAGCATTGGCGCTGGCACTGAGCCGTTCACGGGTTCCAACGCCAAGCTGACCACTTCCTCCTACACTGTCAGCTTCAGATAACTGTGAAGCTTTATGCTGCCCTTATGCATCATCCTTGTACATAGTTATCACCAGGGGACTCTTGTAAATACGATTGCCTTATTAACCGCCTGCATCTGCTTTCACACAATGGCATTTACCAATCAACAGTGCGCCTCGAATCCGTAAAAGGTGGCTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTCCTGCGGCCGC.下列序列(SEQ ID No4)是XG80編碼區的胺基酸序列MKFSSALFLAATAVLASAAPLERRADFCGQWDNVKNGPYTLYNNLWGKDASGASGSQCTGVDSFSSNTIAWHTSWSWSGAQYNVKSYANVVVDITSKKLSAISSINSIWRWAYTGSNIVANVAYDIFTSSTVGGSEEYEIMIWVGALGGAGPISSTGSPIATVSLAGSSWKLYKGPNGQMTVFSFVAESNVNNFSGDLNAFIKYLTGNQGLPASQYIKSIGAGTEPFTGSNAKLTTSSYTVSFR.
本發明還涉及包含SEQ ID NO4所示胺基酸序列的微生物XET酶，或與SEQ ID NO4胺基酸序列至少80％同源、優選與至少85％同源、更優選至少90％同源、還要更優選至少95％同源、特別優選至少98％同源的XET。
如果通過已知算法(例如Lipman和Pearson在科學227(1985，1435頁)中描述的那種算法)將多肽與親本XET的相應胺基酸序列進行比較後發現有X％相同，則認為它們的同源性為X％。
Cl.XG80克隆於1998年2月24日保藏在DSMZ(保藏號DSM12032)。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)姓名Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國家丹麥(F)郵政編碼(ZIP)DK-2880(G)電話45 4444 8888(H)傳真45 4449 3256(ii)發明題目微生物木糖葡聚糖內切轉糖基酶(iii)序列數4(iv)計算機可讀形式(A)培養基類型軟盤(B)計算機IBM PC可兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特徵(A)長度27個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Ala Glu Phe Cys Gly Gln Trp Asp Thr Gln Thr Val Gly Asn Tyr Ile1 5 10 15Val Tyr Asn Asn Leu Leu Gly Ala Gly ser Ala20 25(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特徵(A)長度24個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Asp Phe Cys Gly Gln Trp Asp Asn Val Lys Asn Gly Pro Tyr Thr1 5 10 15Leu Tyr Asn Asn Leu Gly Gly Lys20(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特徵(A)長度975個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3GGATCCGAAT TCCAACTATC CTGCCCTCCT TTCAAGCGAA CACCATGAAG TTCTCCTCGG 60CTCTGTTTCT GGCCGCTACG GCGGTCTTGG CTTCCGCCGC GCCGCTTGAG CGCCGCGCCG 120ACTTTTGTGG TCAATGGGAC AACGTGAAGA ACGGACCTTA CACTCTTTAC AACAACCTGT 180GGGGAAAAGA TGCTTCCGGA GCCTCCGGAT CGCAATGCAC CGGCGTCGAT AGCTTCAGCA 240GCAACACCAT CGCTTGGCAC ACATCCTGGT CCTGGTCCGG TGCTCAGTAC AATGTCAAGT 300CTTACGCAAA CGTGGTCGTC GACATCACCT CTAAGAAACT CAGCGCCATC AGCAGCATTA 360ACAGCATCTG GCGCTGGGCT TACACGGGTA GCAACATTGT TGCCAATGTT GCCTACGATA 420TCTTCACTTC ATCCACTGTC GGTGGTAGCG AGGAATATGA AATCATGATA TGGGTTGGTG 480CTCTCGGTGG TGCTGGTCCG ATCTCATCTA CCGGCTCCCC TATTGCCACC GTTTCCCTTG 540CAGGCTCCTC GTGGAAGCTC TACAAAGGGC CCAACGGGCA GATGACCGTG TTCAGCTTCG600TCGCCGAGTC CAACGTGAAC AACTTCAGCG GTGACCTTAA CGCTTTCATC AAGTACCTCA660CCGGCAACCA GGGCCTTCCC GCCTCGCAAT ACATCAAGAG CATTGGCGCT GGCACTGAGC720CGTTCACGGG TTCCAACGCC AAGCTGACCA CTTCCTCCTA CACTGTCAGC TTCAGATAAC780TGTGAAGCTT TATGCTGCCC TTATGCATCA TCCTTGTACA TAGTTATCAC CAGGGGACTC840TTGTAAATAC GATTGCCTTA TTAACCGCCT GCATCTGCTT TCACACAATG GCATTTACCA900ATCAACAGTG CGCCTCGAAT CCGTAAAAGG TGGCTTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA960AATTCCTGCG GCCGC 975(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特徵(A)長度244個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Phe Ser Ser Ala Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Val Leu Ala1 5 10 15Ser Ala Ala Pro Leu Glu Arg Arg Ala Asp Phe Cys Gly Gln Trp Asp20 25 30Asn Val Lys Asn Gly Pro Tyr Thr Leu Tyr Asn Asn Leu Trp Gly Lys35 40 45Asp Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ser Gln Cys Thr Gly Val Asp Ser Phe50 55 60Ser Ser Asn Thr Ile Ala Trp His Thr Ser Trp Ser Trp Ser Gly Ala65 70 75 80Gln Tyr Asn Val Lys Ser Tyr Ala Asn Val Val Val Asp Ile Thr Ser85 90 95Lys Lys Leu Ser Ala Ile Ser Ser Ile Asn Ser Ile Trp Arg Trp Ala100 105 110Tyr Thr Gly Ser Asn Ile Val Ala Asn Val Ala Tyr Asp Ile phe Thr115 120 125Ser Ser Thr Val Gly Gly Ser Glu Glu Tyr Glu Ile Met Ile Trp Val130 135 140Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Pro Ile Ser Ser Thr Gly Ser Pro Ile145 150 155 160Ala Thr Val Ser Leu Ala Gly Ser Ser Trp Lys Leu Tyr Lys Gly Pro165 170 175Asn Gly Gln Met Thr Val Phe Ser Phe Val Ala Glu Ser Asn Val Asn180 185 190Asn Phe Ser Gly Asp Leu Asn Ala Phe Ile Lys Tyr Leu Thr Gly Asn195 200 205Gln Gly Leu Pro Ala Ser Gln Tyr Ile Lys Ser Ile Gly Ala Gly Thr210 215 220Glu Pro Phe Thr Gly Ser Asn Ala Lys Leu Thr Thr Ser Ser Tyr Thr225 230 235 240Val Ser Phe Arg
權利要求
1.一種木糖葡聚糖內切轉糖基酶(XET)的生產方法，包括(a)在適宜的營養培養基中，有利於XET酶產生的條件下培養表達微生物XET的一種微生物，以及(b)隨後從培養基中回收XET酶。
2.根據權利要求1的方法，其中所述微生物是真菌或細菌。
3.根據權利要求2的方法，其中所述真菌是擔子菌，接合菌，子囊菌或有絲分裂孢子真菌。
4.根據權利要求3的方法，其中所述真菌是革蓋菌目、裂褶菌目、韌革菌目或Xenasmatales目的擔子菌菌株。
5.根據權利要求4的方法，其中所述真菌是選自屬於革蓋菌科、伏革菌科、裂褶菌科、韌革菌科和Tubulicrinaceae各科菌株的擔子菌。
6.根據權利要求4的方法，其中所述真菌是選自栓菌屬、伏革菌屬、裂褶菌屬、韌革菌屬(Stereum)或Tubulicrinis屬菌株的擔子菌。
7.根據權利要求6的方法，其中所述真菌是選自毛栓菌、玫瑰色伏革菌、裂褶菌屬之種、毛韌革菌和Tubulicrinis subulatus種菌株的擔子菌。
8.根據權利要求7的方法，其中所述真菌是裂褶菌屬之種，保藏號CBS443.97。
9.根據權利要求3的方法，其中所述子囊菌是選自屬於腔菌綱、盤菌綱、核菌綱和不整囊菌綱的菌株。
10.根據權利要求9的方法，其中所述子囊菌選自屬於座囊菌目、斑痣盤菌目、盤菌目、錘舌菌目、炭角菌目、肉座菌目、海殼目、黑痣菌目、腐皮殼菌目和散囊菌目各目的菌株。
11.根據權利要求10的方法，其中所述子囊菌選自屬於小球腔菌科、葡萄座腔菌科、小穴殼菌科、球腔菌科、毛筒殼科、斑痣盤菌科、肉盤菌科、火絲菌科、核盤菌科、圓孔殼科、Hyponectriaceae、炭角菌科、黑腐皮殼科、黑盤孢科、肉座菌科、海殼科、黑痣菌科和發菌科各科的菌株。
12.根據權利要求11的方法，其中所述子囊菌選自屬於盾殼黴屬、莖點黴屬、二孢屬、Plowrightia、葉點黴屬、殼針孢屬、毛筒殼屬、鏈格孢屬、Embellisia、Tiarosporella、Galiella、珠頭黴屬，假黑盤菌屬、火絲菌屬、葡萄孢屬、外殼孢屬、盤多毛孢屬、多毛菌屬、Chaetapiospora、孔座殼屬、Nodulisporium、炭角菌屬、殼囊孢屬、座盤孢屬、擬莖點黴屬、棒盤孢屬、Seimatosporium、鐮孢屬、輪枝孢屬、周刺座黴屬、Lulworthia、刺盤孢屬、麴黴屬、散囊菌屬、正青黴屬、青黴屬、Petromyces和踝節菌屬各屬的菌株。
13.根據權利要求12的方法，其中所述子囊菌選自屬於棉色二孢、Plowrightia ribesia、葉點黴屬之種、殼針孢屬之種、Tubeufia amazonensis、鏈格孢屬之種、Embellisia hyacinthi、新莖點黴、熱帶莖點黴、盾殼黴屬之種、橄欖色盾殼黴、當克盾殼黴、Tiarosporella sp.、Tiarosporella phaseolina、Galiellacelebica.、淡黑假黑盤菌、磚火絲菌、珠頭黴屬之種、灰色葡萄孢、外殼孢屬之種、盤多毛孢屬之種、多毛菌屬之種、點孔座殼、炭角菌屬之種、Nodulisporium sp.、腐皮鐮孢、輪枝孢屬之種、巴西周刺座黴、Chaetapiospora rhododendri、Lulworthiauniseptata、棘孢刺盤孢、Colletotrichum crassipes、殼囊孢屬各種、座盤孢屬之種、擬莖點黴屬之種、Phomopsis cirsii、慄棒盤孢、Seimatosporium lichenicola、塔木裡氏麴黴、Eurotiumchevalieri、爪哇正青黴、膠囊青黴、奧爾森氏青黴、嗜松青黴、婁格法爾特氏青黴、義大利青黴、疣孢青黴、變灰青黴、Petromycesalliaceus和黃色踝節菌各種的菌株。
14.根據權利要求13的方法，其中所述子囊菌選自屬於灰色葡萄孢保藏號CBS447.97、淡黑假黑盤菌保藏號CBS444.97、Tiarosporella phaseolina保藏號CBS446.97、盤多毛孢屬之種保藏號CBS445.97和Lulworthia uniseptata保藏號CBS442.97等種的菌株。
15.根據權利要求3的方法，其中所述接合菌選自屬於毛黴目的菌株。
16.根據權利要求15的方法，其中所述真菌是選自屬於絲枝黴科和毛黴科菌株的接合菌。
17.根據權利要求16的方法，其中所述真菌是選自屬於Dichotomocladium、放射毛黴屬、球託黴屬、Sporodiniella和毛黴屬各屬菌株的接合菌。
18.根據權利要求17的方法，其中所述真菌是選自屬於Dichotomocladium hesseltinei、雅致放射毛黴、卵形孢球託黴、米赫毛黴minor變種和Sporodiniella umbellata各種內菌株的接合菌。
19.根據權利要求18的方法，其中所述真菌是卵形孢球託黴保藏號CBS448.97。
20.根據權利要求2的方法，其中所述真菌是有絲分裂孢子真菌。
21.根據權利要求1的方法，其中所述微生物是Vialaeainsculpta。
22.根據權利要求2的方法，其中所述細菌是革蘭氏陽性細菌。
23.根據權利要求22的方法，其中所述革蘭氏陽性細菌是芽孢桿菌。
24.根據權利要求23的方法，其中所述革蘭氏陽性細菌是嗜鹼芽孢桿菌保藏號DSM11404。
25.根據權利要求1到24中任何一項得到的XET製劑用於處理纖維素材料的用途。
26.根據權利要求25的用途，其中所述處理能使纖維素材料具有改善的強度和/或提高的保形性能和/或更好的抗皺性能。
27.根據權利要求25的用途，其中所述纖維素材料是纖維素織物或紙和紙漿產品。
28.一種木糖葡聚糖內切轉糖基酶製劑，它能通過培養表達微生物XET的一種微生物產生。
29.根據權利要求28的製劑，其中所述XET具有SEQ ID NO.1所示胺基酸序列，或者該XET具有與SEQ ID NO.1至少80％同源的胺基酸序列。
30.根據權利要求28的製劑，其中所述XET具有SEQ ID NO.2所示胺基酸序列，或者該XET具有與SEQ ID NO.2至少80％同源的胺基酸序列。
31.根據權利要求28的製劑，其中所述XET具有SEQ ID NO.4所示胺基酸序列，或者該XET具有與SEQ ID NO.4至少80％同源的胺基酸序列。
32.根據權利要求28的製劑，其中所述XET在pH3到11、尤其是pH4到9有活性。
33.一種木糖葡聚糖內切轉糖基酶(XET)的生產方法，包括(a)在適宜的營養培養基中，有利於XET酶產生的條件下，培養表達微生物XET的一種轉化宿主微生物，以及(b)隨後從營養培養基中回收XET酶。
全文摘要
通過篩選分析,發現了大批在系統發生上比較分散的微生物能產生XET活性。因此,本發明涉及一種能夠通過培養表達XET的一種微生物而生產的木糖葡聚糖內切轉糖基酶製劑。
文檔編號C12N9/10GK1248287SQ9880275
公開日2000年3月22日 申請日期1998年2月26日 優先權日1997年2月26日
發明者R·I·尼爾森 申請人:諾沃挪第克公司