泌尿生殖道支原體分型檢測試劑盒的製作方法

2023-04-23 17:05:16 2

專利名稱：泌尿生殖道支原體分型檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因領域，具體是一種泌尿生殖道支原體分型檢測試劑盒。
背景技術：
性傳播疾病是一類嚴重危害人類健康的疾病。我國近20多年來，性傳播疾病病例逐年增高，其中以支原體感染率的增高尤為顯著。支原體是一類大小介於細菌與病毒的能在體外培養基中生長繁殖的最小的微生物，廣泛存在於動物、植物和人類。已確定的對人類有致病性的支原體主要有7種,它們是肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, Mpn)、解脲支原體(Ureaplasma urealyticum, Uu)、人型支原體(Mycoplasma hominis, Mh)、生殖支原體(Mycoplasma genitalium, Mg)、發酵支原體(Mycoplasma fermentans, Mf)、穿通支原體 (Mycoplasma penetrans, Mpe )和梨支原體(Mycoplasma pi rum, Mpi ),均可通過性傳播而導致男女泌尿生殖系統感染。支原體感染後可導致各種婦科炎症及非淋菌性尿道(陰道)炎(Nongonococcalurethritis，NGU)、附件炎、子宮內膜炎、絨毛膜羊膜炎及各種不良妊娠結局(自然流產、胎膜早破、早產、低體重新生兒)和男性不育、附睪炎、前列腺炎等，還可通過胎盤感染胎兒，使新生兒受累，發生新生兒肺炎、腦膜炎、敗血症等。此外發現Mpe、Mf、Mpi能增強HIV的複製，促進HIV的細胞毒作用，導致HIV感染進一步發展，也可引起全身感染、多器官功能衰竭及急性呼吸窘迫呼吸症，因此被認為是AIDS相關支原體。解脲支原體(Ureaplasma urealyticum, Uu)分為兩個生物群和14種血清型，即U. parvum (以前的 Biovarl/parvum 群，包括血清型 1、3、6、14)和 U. urealyticum (以前的Biovar2/T960群，包括血清型2、4、5、7 13)。有研究指出由於不同血清型的Uu毒力不同，其致病性亦不同，U. urealyticum或U. parvum多種血清型的混合感染更容易致病。臨床上檢出不同生物群Uu的治療與否、不同生物群Uu菌株體外抗菌藥物敏感性及臨床治療過程中抗菌藥物的合理選擇等一系列方面都可能存在差異，故有必要在臨床檢驗中對Uu進行生物分型。目前支原體檢測方法有形態學檢查法、培養法、免疫學方法和分子生物學方法。培養法是檢測支原體的金標準，但是培養的要求較高且培養的周期較長，並且由於培養基易被雜菌汙染，故在臨床普及較困難。生殖支原體的臨床分離培養更困難。免疫技術要有特異的抗血清，而且易出現交叉反應。PCR技術本身的優越性是無可厚非的，但是使用不當很容易引起交叉汙染，出現假陽性；如果反應條件控制不好也可能出現假陰性。以上的檢測方法除了自身固有的缺陷外，最大的問題就是只能檢測一種特定的支原體，而引起泌尿生殖道感染的支原體多為混合感染。各種支原體的耐藥性不一樣，為臨床治療帶來困難。因此研製和開發一種特異性強、敏感性高同時又快速、經濟，能同時檢驗多種支原體的支原體分型檢測方法顯得尤為重要，對性傳播疾病和愛滋病的診斷和治療起著重要的作用。

發明內容
本發明的目的是提供一種能簡單、快速和準確檢測7種致病支原體解脲支原體(Uu)、人型支原體(Mh)、生殖支原體(Mg)、肺炎支原體(Mpn)、穿通支原體(Mpe)、梨支原體(Mpi )、發酵支原體(Mf )，並能對解脲支原體進行血清分型的泌尿生殖道支原體分型檢測試劑盒。本發明的一種泌尿生殖道支原體分型檢測試劑盒，包括
(1)一個基因晶片，其上帶有
(i )不同種的支原體的核苷酸探針，其中探針至少是一個選自SEQ ID N0S:1-11和與SEQ ID Nos: 1-11互補的序列，探針序列如下
名稱序列序列號
Mpe-P 5' -atagctcaaacttcaaccgtgt-31(SEQ ID No. I)
Mpi-P 5' -ggactgcaatgcgaacact-3!(SEQ ID No. 2)
Mpn-P 5' -actcagctaatatctggcatctc-3!(SEQ ID No. 3)
Mf-P 5f -attagactatgaatacatgaacg-3!(SEQ ID No. 4)
Mh-P 5! -acctgcatcatcgcatgcaa-3!(SEQ ID No. 5)
Mg-P 5' -gacgcattcgctcgctaca-3!(SEQ ID No. 6)
Uuu-P 5! -gtaatatctaaacatagatataacaact-3! (SEQ ID No. 7)
Uupl-P 5! -actatcataattaatatagataataaact-3! (SEQ ID No. 8)
Uup3-P 5r -gttaatagattagcttatcttactgaat-3! (SEQ ID No. 9)
Uup6_P 5! - tattgtaactattatttaatataataaatc-3! (SEQ ID No. 10)
Uupl4-P 5' -gtgatataatagttaagtaaaatatt-3!(SEQ ID No. 11)
(ii)標記有生物素點的DNA序列(Bio)，用於監控雜交是否成功，序列為SEQIDNo. 12
Bio 5! -cgtccaaggggaaactgatct-3! (SEQ ID No. 12);
(iii)帶有編碼β-actin蛋白部分的DNA序列(1C)，作為內控點，用於監控PCR體系是否成功，序列為SEQ ID No. 13
IC5' -cacgagattcacaatgctca-3!(SEQ ID No. 13);
(2)各種引物，用於擴增臨床樣本中的DNA序列，選自SEQID Nos:14-22,其序列分別如下
(i)用於擴增Uuu、UupUUup3、Uup6、Uupl4的引物，針對支原體DNA的multiplebanded antigen gene 設計，其序列為 SEQ ID Nos: 14 -17
MBA-F 5' -gatatgcattctttatatattgtct-3! (SEQ ID No. 14)
MBA-R 5, -atttgttrttttcarctgagttac-3! (SEQ ID No. 15)
Uuu-R 5' -actaactgctcccactcc-3!(SEQ ID No. 16)
Uup-R 5! -gcactccaaccgaagtaccaat-3! (SEQ ID No. 17)
(ii)用於擴增Mh的引物，針對支原體DNA的16SrRNA基因設計，其序列為SEQ IDNos:18-20
Myco-F 5' -gtacctgkgatgaacctg-3!(SEQ ID No. 18)
Mh_F2 5' -cctgtgcaatgagagatccga-3! (SEQ ID No. 19)Mh-R2 5' -agttgtaccactgcactgc-3'(SEQ ID No. 20)
(iii)用於擴增Mg、Mpn、Mpe、Mpi的引物，針對支原體DNA的16SrRNA基因設計，其序列為 SEQ ID No. 18 和 SEQ ID No. 21
Myco-F 51 -gtacctgkgatgaacctg-31(SEQ ID No. 18)
MGP-680R 51 -tgtatgtctatytaacycagac-31 (SEQ ID No. 21)
(iv)用於擴增Mf的引物，針對支原體DNA的16SrRNA基因設計，其序列為SEQ IDNo.18 和 SEQ ID No. 22
Myco-F 51 -gtacctgkgatgaacctg-31(SEQ ID No. 18)Mf- 700R 51 -gaagtccttcctgaaggttg-31 (SEQ ID No. 22)
其中r表示a或g, k表示g或t, y表示c或t。本發明針對每一種支原體設計的探針有著合理的鹼基成分，探針的Tm值在42°C到48°C之間，相對比較均一，即11種探針和對應的PCR產物雜交時最適宜的溫度條件基本一致，有利於在同一雜交溫度下的同步性，不會因為溫度的問題而影響雜交的結果，使檢查的準確性大大增加。本發明上述的試劑盒，所述基因晶片包括用於定位探針的位置標記。本發明上述的試劑盒，所述基因晶片的探針是固定在尼龍膜上。本發明上述的試劑盒，所述引物SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 18、SEQ ID No. 20和SEQ ID No. 21的5'端標記有生物素。本發明所述基因晶片的製備方法，包括如下步驟
(1)DNA探針的製備合成與支原體DNA互補的5'末端經過胺基化的DNA片段
(2)固定探針將上述探針固定在活化處理好的尼龍膜上
先對尼龍膜進行活化處理，然後將探針點到膜上，通過探針末端的胺基與活化膜上的羧基形成共價結合，牢固地將探針固定在膜上；
(3)製備基因晶片利用氫氧化鈉停止反應，製得基因晶片。利用本發明所述的支原體分型檢測試劑盒檢測支原體感染的方法包括以下步驟利用支原體分型檢測試劑盒中含特定序列的引物PCR擴增臨床樣本中的DNA，對擴增後的DNA進行雜交；檢測基因晶片表面上結合的DNA。具體步驟如下
第一步擴增樣品
將臨床樣本中提取的DNA通過支原體分型檢測試劑盒進行擴增，所用的部分引物5'端標記有生物素，擴增得到的5'端帶有生物素標記的DNA產物；
第二步:雜交
使用導流雜交技術，將上述擴增得到的DNA與基因晶片上面分布的DNA探針、Bio和IC進行反應；
第三步顯色
在鹼性磷酸酶AP酶的作用下，利用NBT/BCIP系統顯色，肉眼直接觀察結果。在基因檢測中，由於操作步驟繁瑣，操作失誤難以避免，本發明在試劑盒中使用了標記有生物素點的DNA序列和帶有編碼β -actin蛋白部分的DNA序列，分別用於監控雜交和PCR體系是否成功，便於操作人員在檢測過程出錯時，快速區分是在PCR時出錯還是在雜交時出錯，以便迅速找出發生錯誤的原因，縮短檢測時間。另外，在現有技術中，由於探針載體多採用玻璃等，通透性差，一般只能使用傳統雜交方法進行雜交，操作起來較為麻煩，檢測時間長，一般至少都在6個小時以上，而且顯色結果的背景不乾淨；本發明使用尼龍膜做為探針載體，由於尼龍膜較其它固體支持物(如玻璃等)具有良好的通透性，不但利於導流雜交技術的應用，且具有很好的彈性，便於生產和操作，縮短了檢測時間，只需要I. 5小時左右，顯色結果的背景乾淨。本發明所述泌尿生殖道支原體分型檢測試劑盒能快速、準確地檢測出泌尿生殖道致病支原體感染及感染的類型，對於泌尿生殖道疾病的診斷和治療具有重要的意義。


以下是附圖的說明，便於理解上述發明的目的和具體特徵。圖I是表示基因晶片上探針和監控點的類型和具體的分布位置的圖片，「Bio」代表標記有生物素點的DNA序列；「IC」代表帶有編碼β -actin蛋白部分的DNA序列；Uuu表 示解脲支原體的 T960 群(包括血清型 2,4, 5，7,8,9, 10，11，12，13)；Uupl,Uup3,Uup6,Uupl4分別表示解脲支原體的血清型I，3，6和14 ;Mh表示人型支原體；Mg表示生殖支原體；Mf表示發酵支原體;Mpe表示穿通支原體;Mpn表示肺炎支原體;Mpi表示梨支原體,「 + 」代表位置標記。圖2是表示陰性的結果的圖片。圖3a是表示解脲支原體(Uu) Uuu感染的圖片。圖3b是表示解脲支原體(Uu) Uupl感染的圖片。圖3c是表示解脲支原體(Uu) Uup3感染的圖片。圖3d是表示解脲支原體(Uu) Uup6感染的圖片。圖3e是表示解脲支原體(Uu) Uup 14感染的圖片。圖4a是表示人型支原體(Mh)感染的圖片。圖4b是表示生殖支原體(Mg)感染的圖片。圖4c是表示發酵支原體(Mf)感染的圖片。圖4d是表示穿通支原體(Mpe)感染的圖片。圖4e是表示肺炎支原體(Mpn)感染的圖片。圖4f是表示梨支原體(Mpi)感染的圖片。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明進行詳細的說明。實施例中，20%的EDAC溶液、O. 1%SDS、0. 25%脫脂奶粉、O. 05%硫柳汞、O. 05%疊氮鈉均是指質量比，O. l%Tween20是指體積比。步驟I基因晶片的製備
根據人體泌尿生殖道感染致病支原體的情況，選擇了 7種致病支原體解脲支原體(Uu)、人型支原體(Mh)、生殖支原體(Mg)、肺炎支原體(Mpn)、穿通支原體(Mpe)、梨支原體(Mpi)、發酵支原體(Mf)，並對解脲支原體進行了血清分型檢測。針對每一種支原體，設計與合成5'端帶有胺基的特異性基因探針，並製備IC和Bio，用於泌尿生殖道支原體的檢測。
DNA基因晶片的製作步驟如下將製備的探針、IC和Bio首先溶解在超純水中，製成濃度為200M的母液，然後溶解在PH=8. 4的O. 5M Na2CO3和O. 5M NaHCO3的溶液中，使其最終濃度為2M。對尼龍膜進行處理，首先放入O. IM HCL溶液中浸泡30秒鐘，然後把已除去殘餘溶液的膜放進20%的EDAC溶液中浸泡15分鐘，最後放在洗膜盤中用200mL的純化水衝洗10秒鐘，此步驟重複3次，再放到吸水紙上除去多餘的殘液。轉入溫度為20°C、溼度為45%的烘乾箱內烘乾12小時。將已烘乾的尼龍膜用Kimwipes紙隔開，裝入封口薄膜袋中，放進點膜間的冰箱中，貯藏在4°C的溫度下，備用。通過微量移液設備將上述製備好的探針、IC和Bio分別點在上述處理過的尼龍膜上，每滴0.4L。點膜完成後，將膜放置於室溫15分鐘，進行反應。然後將膜轉入O. IM NaOH溶液中浸泡10分鐘，停止反應。將洗好的膜轉入溫度為20°C、溼度為45%的烘乾箱內放置12小時，即製得基因晶片。
步驟2樣品製備 步驟2-1陽性對照組樣品的製備
利用引物Myco-F，Mh-F2和Mh_R2對插入到pMD_T vector中的Mh DNA片段進行擴增。PCR 反應體系為 50L，包含 10Xbuffer，5. OL ;25mM MgC12,6. OL ；25mM dNTP，I. OL ;IOM 生物素標記引物 MBA-F，O. 5L ; IOM 引物 MBA-R, O. 5L ;IOM 引物 Uuu-R, O. 5L ; IOM 引物 Uup-R,O. 5L ;IOM生物素標記引物Myco-F，I. OL ;IOM引物Mh_F2，O. 5L ;10M生物素標記引物Mh_R2，O. 5L ； IOM 生物素標記引物 MGP-680R, O. 5L ; IOM 引物 Mf-700R, O. 5L ;內對照 DNA1. OL ；ddH20, 29. 5L ；5U/ L TaqDNA 聚合酶，O. 5L ;模板 DNA, 2. OL ;共 50L。PCR 反應程序為首先95°C變性9分鐘，然後95 °C，20秒；55°C，30秒；72°C，50秒；進行40個循環，最後72°C延伸5分鐘。步驟2-2支原體標準品的製備
同步驟2-1相似步驟製備生物素結合的擴增支原體DNA樣品，不同之處在於利用上述各種質粒作為模板。步驟2-3臨床樣本中DNA樣品的製備
利用煮沸和異丙醇沉澱法製備和純化臨床樣本中的DNA，然後參照步驟2-1中的方法擴增得到帶有生物素標記的DNA。步驟3利用DNA基因晶片檢測支原體DNA
利用導流雜交技術，將步驟2中擴增得到的DNA樣品用步驟I中製備的基因晶片進行檢測，DNA樣品和基因晶片中尼龍膜上的探針、Bio和IC反應，最後根據顯色情況進行判斷，有顯色的探針點表示相應的支原體類型，IC點顯色表示擴增成功，Bio點顯色表示雜交成功。進行臨床樣本檢測的同時，做支原體Mh陽性對照和陰性對照。將擴增獲得的50L產物95°C下變性5 10分鐘，迅速轉移到冰水混合物中，放置3分鐘。然後加入到事先溫浴到45°C的0.8mL雜交液中(2XSSC/0. 1%SDS)，混勻後加入到雜交儀的反應孔中，應用於步驟I製得的基因晶片，45°C雜交20分鐘。然後用WBl(I X SSC/0. 1%SDS)，45°C溫浴，清洗3遍。加入O. 5mL封阻液(O. 25%脫脂奶粉，O. 05%硫柳汞)，25°C封閉5分鐘。抽乾後加入O. 5mL的酶標液(TBS中溶解的帶有鏈黴親和素標記的AP酶)，酶標5分鐘。用O. 8mL溶液A (TBS, O. l%Tween 20及O. 05%疊氮鈉)清洗4遍，然後加入O. 5mL的顯色液(NBT/BCIP)，避光顯色5 分鐘。最後用雜交液(2XSSC/0. 1%SDS)衝洗3遍,晾乾,分析顯色情況,判讀結果。
權利要求
1.一種泌尿生殖道支原體分型檢測試劑盒，包括 (1)一個基因晶片，其上帶有 (i )不同種的支原體的核苷酸探針，其中探針至少是一個選自SEQ ID Nos: 1-11和與SEQ ID Nos:l-ll互補的序列； ( )標記有生物素點的DNA序列，序列為SEQ ID No. 12; (iii)帶有編碼β -actin蛋白部分的DNA序列，作為內控點，序列為SEQ ID No. 13; (2)各種引物，用於擴增臨床樣本中的DNA序列，選自SEQID Nos:14-22,其序列分別如下 (O用於擴增Uuu、UupU Uup3、Uup6、Uupl4的引物,針對支原體DNA的multiplebanded antigen gene 設計，其序列為 SEQ ID Nos: 14 -17 ； (ii)用於擴增Mh的引物，針對支原體DNA的16SrRNA基因設計，其序列為SEQ IDNos:18-20 ； (iii)用於擴增Mg、Mpn,Mpe, Mpi的引物，針對支原體DNA的16S rRNA基因設計，其序列為 SEQ ID No. 18 和 SEQ ID No. 21 ； (iv)用於擴增Mf的引物，針對支原體DNA的16SrRNA基因設計，其序列為SEQ IDNo.18 和 SEQ ID No. 22 ； 其中r表示a或g, k表示g或t, y表示c或t。
2.權利要求I所述試劑盒，其特徵在於，所述基因晶片包括用於定位探針的位置標記。
3.權利要求I所述試劑盒，其特徵在於，所述基因晶片的探針是固定在尼龍膜上。
4.權利要求I所述試劑盒，其特徵在於，所述引物SEQID No. 14、SEQ ID No. 18、SEQID No. 20和SEQ ID No. 21的5'端標記有生物素。
全文摘要
本發明公開了一種泌尿生殖道支原體分型檢測試劑盒，包括(1)一個基因晶片，其上帶有(ⅰ)不同種的支原體的核苷酸探針，其中探針至少是一個選自SEQIDNos:1-11和與SEQIDNos:1-11互補的序列；(ⅱ)標記有生物素點的DNA序列，序列為SEQIDNo.12;(ⅲ)帶有編碼β-actin蛋白部分的DNA序列，作為內控點，序列為SEQIDNo.13;(2)各種引物，用於擴增臨床樣本中的DNA序列，選自SEQIDNos:14-22。本發明試劑盒能快速、準確地檢測出泌尿生殖道致病支原體感染及感染的類型，對於泌尿生殖道疾病的診斷和治療具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK102864231SQ20121036324
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者陳偉堅, 梁秋菊, 謝龍旭 申請人:廣東凱普生物科技股份有限公司