特異於類漿細胞樹突狀細胞的抗體的製作方法

2023-04-24 01:15:06

專利名稱：特異於類漿細胞樹突狀細胞的抗體的製作方法
技術領域：
本發明提供能夠結合類漿細胞樹突狀細胞(plasmacytoid dendrticcells，pDC)的免疫學試劑(抗體)，表達這種抗體的細胞系以及利用這種抗體從包含pDC的組織鑑定和純化類漿細胞樹突狀細胞的方法。
背景技術：
樹突狀細胞(DC)是引發T細胞依賴的免疫應答的抗原呈遞細胞(APC)(Steinman，1991，Ann.Rev.Immunol.9271-296)。在人類中，類漿細胞DC(pDC)是DC亞型，其特徵在於它們的超微結構類似於分泌Ig的漿細胞(Grouard等人，1997，J.Exp.Med.185(6)1101-1111)，它們獨特的表面表型(CD4+IL-3R++CD45RA+HLA-DR+)(Grouard等人，1997，J.Exp.Med.185(6)1101-1111；Facchetti等人，1999，Histopathology 35(1)88-9；Res等人，1999，Blood 94(8)2647-57)，以及它們應答病毒或包含特定CpG基序的寡脫氧核苷酸(ODN)刺激而產生高水平IFNα的能力(Siegal等人，1999，Science 284(5421)1835-7；Kadowaki等人，2001，J Immunol 166(4)2291-5)以及體外有效誘導遭遇病毒後幼稚T細胞的啟動(priming)和Th-1極化(Cella等人，2000，Nat Immunol 1(4)305-10；Kadowaki等人，2000，J Exp Med192(2)219-26)。據認為pDC起源於T細胞和B細胞的共同前體(Grouard等人，1997，J.Exp.Med.185，61101-1111；Res等人，1999.Blood 94，82647-57；Res等人，1999，Blood 94(8)2647-57；Bruno等人，1997，J.Exp.Med.185875-884；Bendriss-Vermare等人，2001，JCI 107835；Spits等人，2000，J.Exp.Med.192(12)1775-84)。
在小鼠中，最近已經有幾個小組將pDC鑑定為CD11clowB220hiGr1low細胞，其能夠應答病毒刺激而產生I型的IFN，平且顯示出類漿細胞形態學(Nakano等人，2001，J.Exp Med，194(8)1171-8；Paturel等人，2001，Nat Immunol.2(12)1144-1150；Bjorck，2001，Blood 98(13)3520-6)。也可通過在存在FLT3L時，使骨髓細胞分化成為樹突狀細胞而在體外大量地獲得小鼠pDC。
除其形態學、其IFNα產生及其假定的起源外，pDC在其弱的吞噬活性(Grouard等人，1997，J.Exp.Med.185，61101-1111)、其弱的IL-12生產能力(Rissoan等人，1999，Science 2831183-1186)，和誘導其活化的信號(Kadowaki等人，2001，J.Immunol 166(4)2291-5)方面與骨髓的DC有所不同。雖然活化pDC的募集將通過幼稚T細胞活化而引發免疫性，然而已經報導不成熟的或失活的DC可能通過誘導調節T細胞而誘導免疫耐受性(Jonuleit等人，2001，Trends Immunol.22394；Bell等人，2001，Trends Immunol 2211，Ronearolo等人，2001，JEM 193F5；Jonuleit等人，2000，JEM 1621213)。此外，已經顯示pDC誘導分泌IL-10的T細胞(Rissoan等人，1999，Science 2831183；Liu等人，2001，Nature Immunol 2585)和CD8調節T細胞(Gilliet等人，2002，J.ExpMed.195(6)695-704)。也已經顯示人天然產生IFN的細胞(HuIPC)在活化自然殺傷(NK)細胞以殺死受病毒感染的細胞中起重要作用(Bandyopadhyay等人，1986，J.Exp Med 164(1)180-95)。此外，最近pDC已經與自身免疫疾病，特別是紅斑狼瘡相關(Farkas等人，2001，Am.J.Pathol.159(1)237-43)。
I型幹擾素(IFN-α、β或ω)在寄主對病毒或微生物感染的抗性中發揮中心作用(Pfeffer等人，1998，Cancer Res 58(12)2489-99；van denBroek等人，1995，Immunol Rev 69(8)4792-6)。最近已經在MCMV和VSV感染模型中體內證明了pDC在病毒感染中的重要作用(Dalod等人，2002，J Exp Med 195(4)517-28；Barchet等人，2002，J Exp Med195(4)507-16)。實際上，當缺乏小鼠pDC時，在感染MCMV的小鼠中IFNα的水平顯著降低。在該研究中，用於排空pDC的抗-Gr1處理可能除排空嗜中性粒細胞外，也可能減少部分巨噬細胞和活化T細胞。然而，因為所有這些細胞不在體外產生IFN-α，並且T或B淋巴細胞不是體內產生IFN-α所需要的，這些數據證明要麼MIPC是能夠應答MCMV感染而體內產生I型IFN的唯一細胞，要麼I型IFN的初期產量是為從其他細胞類型引發IFN級聯生成所必需的(Dalod等人，2002，J Exp Med195(4)p.517-28)。
在人類中，已經顯示靜止的pDC特異表達BDCA-2和BDCA-4(Dzionek等人，2000，J.Immunol.165(11)6037-46)。在小鼠中，迄今為止還沒有鑑定出這種特異的標記物。為了監測、表徵和分離pDC，以及為了在動物模型中研究其體內功能，鑑定出特異於小鼠pDC的新標記物將是非常有用的。
發明概述本發明通過提供具有在2003年1月27日，以ATCC保藏號PTA-4957保藏的雜交瘤細胞系所產生的單克隆抗體的結合特性的結合化合物而填補了上述空白。在優選的實施方案中，該結合組合物是抗體或抗體片段。最優選地，該單克隆抗體是由雜交瘤ATCC No.PTA-4957產生的單克隆抗體120G8。
本發明也提供保藏號為PTA-4957的雜交瘤細胞系。
本發明進一步提供從含pDC的樣品純化pDC的方法，所述方法包括將所述的樣品與120G8抗體接觸，然後回收已經結合所述抗體的pDC。
最後，本發明提供從含pDC的樣品鑑定pDC的方法，包括將所述樣品與120G8抗體接觸以形成抗體/pDC複合物，以及檢測所述抗體/pDC複合物的存在以鑑定pDC的步驟。
發明詳述本發明部分地基於在小鼠中發現的特異識別pDC的抗體。
通過DC呈遞抗原的T細胞應答特性取決於所涉及的DC亞群和呈遞DC的成熟階段(Steinman等人，2000，J.Exp.Med.191(3)411-6)。不考慮功能可塑性，MDC和pDC能夠分別通過其分泌IL-12或不分泌IL-12的能力，使T細胞應答的類型向Th1或Th2應答極化(Rissoan等人，1999，Science 2831183-1186)。在應答病毒中伴隨MDC活化B細胞(Dubois等人，1999，J.Leukoc.Biol.66224-230)和NK細胞(Zitvogel等人，2002，J.Exp.Med.195(3)F9-14)，並且pDC產生大量天然的IFNs(Liu，Y.J.，2001，Cell 106(3)259-62)，2種DC亞類也在獲得性和先天性的免疫應答之間形成不同的連接。鑑於例如，在小鼠中缺乏能夠識別靜止和活化的pDC的特異標記物，本發明人已經製備出了直接針對小鼠pDC的mAb。
這個抗體已經命名為120G8，並且是由在2003年1月27日按照布達佩斯條約，以ATCC保藏號PTA-4957保藏的雜交瘤細胞系產生的。120G8mAb可用於從總體細胞中有選擇地分離pDC。它染色pDC，所述的pDC來自由離體的總體細胞或體外骨髓衍生的DC。它不僅識別起源自小鼠不同器官的pDC，而且識別起源自不同小鼠品系的pDC。它可用於激發螢光細胞分揀術(FACS)研究、免疫組織化學(IHC)或組織切片上的免疫組織螢光(IHF)染色。因為120G8mAb識別靜止和活化的pDC，它最有助於研究體外和體內的pDC應答活化。最後如表型和功能上所確定的，體內注射120G8 mAb排空了小鼠的pDC。
如在此所使用的術語″結合化合物″包括抗體及其功能性片段，其特異地結合pDC，並且具有與在此所述的120G8 mAb相同或相似的表位特異性。可通過它們與120G8 mAb競爭結合pDC的能力而鑑定具有與120G8 mAb相同或相似的表位特異性的結合化合物。
實施例本發明可通過下列非限制性的實施例加以說明，其可通過參考下列材料和方法更容易地進行理解。
小鼠、培養基和抗體從Charles River(Iffa-Credo，L』Arbresle，法國)購買無特殊病原體的BALB/cByJ、129SvPas、C57BI/6J、CBA/J、C3H/HeN、DBA/2J、BALB/c-6-8周齡雌性裸鼠。按照由設立的動物委員會許可的方案並且根據EEC委員會指令86/609以及制度化的動物護理和使用方針進行所有的小鼠實驗。
初級細胞於37℃，5％CO2中，生長在完全的RPMI1640培養基中RPMI1640(Life Technologies，Paisley Park，英國)，其補充有10％(v/v)熱滅活的胎牛血清(FCS，Life Technologies)，2mM L-穀氨醯胺(LifeTechnologies)，80μg/ml Gentallin(Schering Plough，Union，NJ)，10mMHepes(Life Technologies)，50μM β2-巰基乙醇(Sigma，St Louis，MO)。在補充有2mM L-穀氨醯胺，80μg/ml Gentallin的DMEM/F12(LifeTechnologies)中產生雜交瘤的高密度上清液。如果不指定則加入10％(v/v)馬血清(HS，Life Technologies)。除非另作說明，所有的抗體都來自於Pharmingen(San Diego，CA)。
組織製備和細胞排空通過吸入CO2殺死小鼠。該方法自始至終將分離的細胞維持在PBS-FCS-EDTA中補克有5％(v/v)熱滅活的FCS和0.5mM EDFA(Sigma)的PBS(Life Technologies)。通過處死後立即進行心臟穿刺而在過量的PBS-FCS-EDTA中收集血細胞。在PBS-FCS-EDTA中壓碎脾臟、胸腺、淋巴結(部位或外周的(匯集在腹股溝的、腋下的和部位的)、peyer′s小塊，並且通過25G的針。在NH4Cl溶液(Stem CellTechnologies，Vancouver，BC)中裂解紅血細胞5分鐘。用冷的PBS-FCS-EDTA從骨上衝洗下骨髓細胞。
為人類T和B細胞排空，用抗-CD3分子絡合物(17A2)的混合物使細胞在4℃培養30分鐘，備選使用抗-CD8β(53-5.8)、抗-CD19(1D3)或抗-紅血球(TER119)。於4℃連續攪動混合細胞和山羊抗-大鼠IgG-包被的Dyna珠子(Dynal，Oslo，挪威)15分鐘。利用Dynal磁體移出珠子和附著的細胞。
利用CD11c+微珠和MiniMacs(Myltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德國)從總的脾臟細胞、總的骨髓細胞或排空CD19、CD3、CD8β、TER119的細胞，通過陽性選擇純化CD11c+細胞。
為獲得FLT3L中骨髓體外衍生的DC(BM-DC)，將以106個細胞/ml接種在24-孔平板中的分離骨髓細胞，在補充有25ng/ml重組的鼠FLT3L(RD systems，Abingdon，英國)的完全RPM11640培養基中培養9天。每2-3天更新培養基。
用小鼠類漿細胞DC免疫接種大鼠使來自BALB/c小鼠的小鼠脾臟細胞與包括抗-CD3分子絡合物(17A2)、抗-CD8β(53-5.8)、抗-CD19(1D3)、抗-CD5(53-7.3)、抗-CD11b(M1/70)、和抗-紅血球(TER119)的大鼠mAb混合物在4℃培養30分鐘，然後利用Dyna珠子移出抗體包被的細胞。用大鼠抗-Ly6G/C(RB6-8C5)-藻紅蛋白(PE)、倉鼠抗-CD11c(HL-3)-生物素、和包含異硫氰酸螢光素(FITC)-標記的倉鼠抗-CD3ε(145-2C11)、大鼠抗-CD19(1D3)、抗-CD5(53-7.3)、抗-CD11b(M1/70)、和抗-pan NK細胞(DX5)的混合物在4℃染色排空的細胞30min。然後用鏈黴抗生物素蛋白-Pe-Cy5(Dako，Glostrup，丹麥)染色細胞，並且利用FACStar加流式細胞儀(Becton Dickinson，Moutain View，CA)分揀CD11c+Grl+CD3s-CD19-CD5-CD11b-DX5-細胞(pDC)。在PBS(LifeTechnology，Paisley Park，英國)中洗滌分揀的細胞3次，重懸浮在PBS中並且在-20℃冷凍以備註射使用。
用分揀的pDC免疫一隻4周齡的LOU雌性大鼠(Iffa Credo)。方案如下第0天腹膜內(ip)注射完全弗氏佐劑(CFA)中的106個細胞第14天ip注射不完全弗氏佐劑(IFA)中的106個細胞第21天ip注射PBS中的106個細胞第35天靜脈內(iv)注射PBS中的2.106個細胞第38天殺死大鼠並收集脾臟。
利用聚乙二醇-1000(Sigma)使脾臟細胞與鼠骨髓瘤細胞系SP20融合。將雜種細胞接種到96-孔平板中並且用補充有10％HS，2mM L-穀氨醯胺，80μg/ml Gentallin，1％培養基添加劑(CRTS，裡昂，法國)，10-5M重氮乙醯絲氨酸(Sigma)和5×10-5M次黃嘌呤的DMEM/F12培養。用離體分離的脾臟細胞、骨髓和脾的CD11c+樹突狀細胞篩選上清液的反應性。通過有限稀釋克隆所選擇的雜交瘤。
從無血清的高密度上清液通過在Hiload Q柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)上進行陰離子交換色譜純化mAb 120G8，並且利用標準方法與Alexa488和生物素偶聯。在Balb/c-裸鼠(Iffa Credo)中產生腹水。利用大鼠Ig亞類試劑盒(Pharmingen，San Diego，CA)通過ELISA確定Ig同種型。
FACS分析對於所有的FACS分析，首先將維持在PBS-FCS-EDTA中的細胞與未標記抗-CD16/32的大鼠Ab培養15分鐘以確保封閉Fc受體，然後用指明的Abs在4℃染色30分鐘。用FACScan流式細胞儀分析染色細胞。用同種型相配的大鼠或倉鼠Ig作為陰性對照。當沒有使用PerCpCy5.5染色時，利用FL3通路控制輸出(gated out)自發螢光的細胞。
對於120G8+細胞表面表型，用Alexa-488-標記的120G8，PE-標記的抗體(抗-CD3ε、CD19、DX5、CD11c、CD45R/B220、Lv6C、Lv6G/C(Gr1、RB6-8C5)、CD11b、I-Ad、H2-Kd)和APC-標記的倉鼠抗-CD11c(HL-3)染色分離的細胞。對於染色在FLT3L中培養指定天數的BM-DC，用120G8 Alexa488、抗-CD11c-PE、抗-CD11b-PerCpCy5.5和抗-CD45R/B220-APC染色細胞。對於不同器官中的120G8+和120G8-CD11c+細胞的表面表型，用120G8-Alexa488、抗-CD45R/B220-PE、抗-Ly6C-生物素和抗-CD11c-APC染色分離的細胞。用PerCP-Cy5.5鏈黴抗生物素蛋白(Pharmingen)顯示生物素醯化的抗-Ly6C。
為分析小鼠器官中的DC亞型細胞頻率，用大鼠120G8-Alexa488、抗-CD19和抗-CD3ε-PerCPCy5.5、抗-CD11c-APC和抗-CD8α-PE或抗-CD11b-PE染色在PBS-FCS-EDTA中維持的脾臟細胞。利用FL3通路控制輸出CD19+/CD3ε+細胞用於分析。結果表示為總的脾臟細胞中指定的細胞亞型的頻率。
細胞的活化和細胞因子的產生對於細胞活化，在缺乏或存在指明的刺激時，在完全的RPMI 1640培養基中培養指明的細胞(對於未分揀的細胞為106個細胞/ml，而對於分揀的細胞為0.5×106個細胞/ml)。以每ml 100個血球凝集素單位的終濃度向培養物加入甲醛-滅活的人流感病毒，菌株NK/TM/138/00(由N.Kuehn，Aventis Pasteur，Val de Reuil，法國惠贈)。除非另作說明，從MWGBiotech(慕尼黑，德國)購買硫代磷酸酯(phosphorothioate)CpG ODNs，(TCA TTG GAA AAC GTT CTT CGG GGC G)(SEQ IDNO1)並以10μg/ml的終濃度加以使用。以指明的終濃度使用重組的小鼠IFN-α(Hycult Biotechnology，Uden，荷蘭)。以2ng/ml的終濃度使用重組的小鼠IFN-γ(RD)。
對於120G8+細胞生產細胞因子，使脾臟細胞在4℃與包括抗-CD3分子絡合物、抗-CD8β、抗-CD19和抗-紅血球(TER119)的mAb混合物培養30分鐘，然後利用Dyna珠子移出抗體包被的細胞。用大鼠120G8-Alexa488、倉鼠抗-CD11c(HL-3)-藻紅蛋白(PE)在4℃染色排空的細胞30分鐘。然後利用FACStar加流式細胞儀(BectonDickinson)分揀細胞，進行洗滌並接種在96孔培養平板中，進行20-24h指明的刺激。在20-24h收集上清液並儲存在-20℃以備用於通過特異的ELISAs分析IFN-α和IL-12(p40或p70)(分別為PBL BiomedicalLaboratories，New Brunswick，NJ和RD Systems)。
對於細胞活化後的120G8表達，用指明的刺激培養分離細胞20-24h。然後染色經刺激的細胞，對於CD11c+活化的細胞用120G8-Alexa488、抗-CD11b-PerCpCy5.5和或和抗-CD45R/B220-PE染色，對於總的脾臟細胞用120G8-Alexa488和與PE偶聯的指明mAbs染色。對於後者的實驗，利用FL2通路控制輸入(gated in)指明的細胞。
組織切片上120G8的免疫染色將脾臟包埋在OCT-化合物(Miles)中，在液氮中快速冷凍，並且儲存在-80℃以備用於進一步的分析。將8微米厚的低溫切片於-20℃在80％丙酮(Sigma)中固定20分鐘，在室溫下乾燥並冷凍儲存直到染色。在PBS(Life Technology)中使切片再水合。分別利用特異的試劑盒(Vector Laboratory，Burlingame，CA)和0.3％的H2O2(Sigma)分別中和抗生物素蛋白/生物素和過氧化物酶組織含量。用2％的標準小鼠血清(Dako，Glostrup，丹麥)封閉切片，並在室溫下進行染色。對於各種小鼠組織中120G8+細胞的原位分布，順序地用未標記的120G8 Ab染色切片60分鐘、偶聯生物素的山羊抗-大鼠(Jackson Immunoresearch)染色60分鐘，偶聯過氧化物酶(Sigma)的外抗生物素蛋白(extravidin)染色30分鐘，並且用過氧化物酶底物(AEC，Sigma)顯示。用蘇木精(Vector Laboratory)進行復染。對於免疫組織螢光分析，順序地用未標記的120G8 Ab染色切片60分鐘，偶聯Alexa488的山羊抗-大鼠(Molecular Probes，Leiden，荷蘭)染色60分鐘，2％大鼠血清、偶聯生物素和鏈黴抗生物素蛋白-Alexa594的指明Abs(Molecular Probes)染色。
體內治療對於CpG處理，在注射入麻醉小鼠的眼窩後靜脈中之前將每隻小鼠30μL的陽離子脂質體製劑(DOTAP，Roche，曼海姆，德國)與170μLPBS中的5μg CpG ODN在聚苯乙烯試管中混合10分鐘。CpG注射6小時後，收集脾臟並且準備免疫染色。
對於體內排空120G8+細胞，用最適量的120G8腹水腹膜內注射小鼠。對於pDC排空的FACS分析，注射120G8後24h，分離脾臟細胞並且用抗-Ly6C-FITC、抗-CD45R/B220-PE，抗-CD11cAPC和抗-CD 19-PerCpCy5.5或抗-CD3ε-PerCpCy5.5染色。對於CpG處理後評估120G8+細胞體內協助產生細胞因子的實驗，在第-1天和在CpG處理的時候用120G8腹水腹膜內注射小鼠。CpG注射6h後，通過處死後立即進行心臟穿刺術而收集血液。通過在37℃凝固30分鐘和離心從全血製備血清，冷凍血清以備用於分析細胞因子含量。通過流式細胞光度術分離脾臟細胞以評估排空效率。
實施例1選擇針對小鼠pDC反應的單克隆抗體120G8篩選來自2400個雜交瘤的上清液與總的小鼠脾臟細胞製品中小於5％的細胞的反應性，並進一步篩選與排空CD3+、CD19+、TER119+、CD11b+細胞的脾臟的反應性。將由融合產生的25個平板中的5個96孔平板於-80℃冷凍在補充有10％DMSO的HS中。解凍這5個平板中的2個，如上所述用完全的DMEM F12餵養，並且通過在總的脾臟細胞上(小於5％)進行FACS染色來第二次篩選上清液。分析所選擇上清液在骨髓和脾臟CD11c+細胞上的反應性。發現來自命名為120G8的一個雜交瘤的上清液只與骨髓CD11c+細胞的主要亞型(60-70％)，和脾臟CD11c+細胞的次要CD11clow亞型(10-20％)起作用。通過有限稀釋克隆該雜交瘤。一旦選擇出與親本系具有相似反應性，所得到的克隆通過有限稀釋進一步加以克隆，並且選擇在小鼠CD11c+細胞上具有最高反應性的克隆，即具有產生Ab的最高能力的克隆(克隆6)。
該抗體是從腹水和高密度的上清液中的親本和克隆6產生的。如ELISA所確定的，發現Mab 120G8是IgG1/κ同種型。因為脾臟中的120G8+細胞似乎也是特別感興趣的CD11c+B220+Gr1+細胞(以前定義為小鼠pDC)，選擇mAb 120G8用於進一步研究。
實施例2120G8 mAb與產生小鼠IFN-α的細胞[pDC]是高度反應性的利用偶聯Alexa 488的120G8和譜系特異標記物的雙免疫螢光研究，進一步在未刺激的脾臟細胞上檢驗120G8 mAb的反應性。120G8 Ab染色在正向和側面散布中同質的新鮮分離的脾細胞小亞型。這個亞型不表達TER119(紅細胞譜系標記物)、CD19(B細胞譜系標記物)、CD3ε(T細胞譜系標記物)和DX5(Nk細胞譜系標記物)。所有的120G8+細胞也是CD11clow，證實Ab染色脾臟DC的亞型。這些結果代表至少3次實驗。
其次，體外測試120G8 mAb特異識別產生IFN-α的細胞(IPC)的能力。已經證明CD11c+脾細胞是應答流感病毒而體外產生下量IFNα的唯一細胞(Paturel等人，Nat Immunol，2001)。通過流式細胞術從排空CD3+CD19+CD8β+TER119+細胞的脾臟細胞純化CD11c+120G8+和CD11c+120G8-細胞。通過滅活的流感病毒或CpG如上所述體外刺激2種亞型。進行3次實驗並得到相似的結果。來自用培養基單獨培養的這兩種分揀群體的IFN-α和IL-12p40的產生低於ELISA檢測水平。在流感病毒和CpG刺激後只有CD11c+細胞的120G8+亞型產生IFN-α。由120G8-分揀細胞應答流感病毒和CpG產生的IFN-α的水平極低或觀察不到。120G8+細胞也能夠應答這兩種刺激而產生IL-12p40，但對於CpG刺激，其水平低於包括CD11ChighDC的120G8-細胞亞型。這與上述顯示CD8α+CD11chighDC能夠應答各種刺激而產生高量IL-12的上述數據相符合。
實施例3120G8+CD11c+脾細胞的表面表型先前已經描述小鼠pDC是脾臟中的CD11c+Gr1+B220+細胞(Paturel，2001，Nagano，2001，Bjorck，2001)，和從骨髓細胞體外衍生的DC中的CD11c+B220+CD11b-細胞。為了研究120G8+細胞的表面表型，與120G8-CD11c+DC相比較，用120G8、CD11c和幾個偶聯PE的Abs染色離體分離的CD11c+和在FLT3L中體外衍生的DC。當分析離體分離的脾臟CD11c+細胞時，120G8+細胞是B220high、Gr1low、Ly6Chigh、CD11b-、CD8αneg/low、IAdlow和H-2Kd+，而CD11c+120G8-細胞是B220neg/low、Grl-、Ly6Cneg/low、CD11b+/-、CD8αneg/hi、IAdlow/high和H-2Kd+。1208G8表型與先前描述的小鼠pDC表面表型符合。此外，120G8也染色先前鑑定的在FLT3L-刺激的骨髓細胞培養物中體外衍生的CD11b-CD11c+B220+小鼠pDC(BM-DC)。當分析BM-DC時，120G8+細胞是B220high、Gr1neg/low、Ly6Chigh、CD11b-，而120G8-細胞是B220neg/low、Gr1-、Ly6Cneg、CD11b+。
因此，120G8mAb對小鼠脾臟pDC和體外衍生的pDC均可染色。
實施例4120G8是小鼠pDC分化的早期標記物在pDC體外分化的第6天和第10天之間研究BM-DC(FLT3L)上的120G8 mAb染色。用120G8、CD11c、CD11b和B220染色細胞。從第6天到第10天，120G8 mAb不染色CD11c-細胞。然而，早在培養6天後所有的120G8+細胞都是CD11c+CD11b-B220+細胞。也可檢測到B220+CD11c+120G8-的亞型，其是CD11b+，並且最可能來源於CD11b+骨髓樣DC。雖然從第6天(70％)至第8天(90％)CD11c+細胞的百分比增加，並且直到第10天保持恆定，從第6天(23％)至第8天(38％)，CD11c+細胞中120G8+細胞的百分比緩慢增加，並且其後迅速降低(在第10天為4％)。這些結果表明120G8 mAb是小鼠pDC沿其體外分化的早期標記物。
實施例5各種淋巴器官中120G8+細胞的表面表型在來自Balb/c小鼠的脾臟、骨髓、血液、胸腺、外周和腸繫膜淋巴結中研究120G8 mAb的染色。用120G8、抗-CD45R/B220、抗-Ly6C和抗-CD11c Abs四重表面染色分析分離的細胞。研究在CD11c+120G8+和CD11c+120G8-細胞上的Ly6C和B220表達。在所有試驗的器官和血液中，CD11c+120G8+都是B220highLy6Chigh。相反地，沒有CD11c+120G8-是B220highLy6Chigh。這表明120G8mAb可識別小鼠pDC(CD11c+B22OhighLy6Chigh)細胞，而與pDC分離自哪些組織無關。
實施例6不同小鼠品系中120G8+細胞的頻率進一步研究120G8 mAb與來自不同小鼠品系的pDC反應的能力。120G8 mAb與分離自BALB/cByJ、129SvPas、C57BI/6J、CBA/J、C3H/HeN和DBA/2J小鼠的脾臟pDC起反應。進一步研究來自這6個不同小鼠品系的總的脾臟細胞當中120G8+DC亞型的頻率。從相同年齡的小鼠(每個小鼠品系3隻小鼠，進行兩次實驗)分離脾臟細胞，並用120G8、CD11c、CD19和CD3ε染色。控制輸出CD19/CD3ε+細胞用於分析。總的脾臟細胞當中pDC頻率的分析顯示其變化取決於所考慮的小鼠品系，例如C57/BI6小鼠顯示最低的脾臟pDC頻率(總的脾臟細胞的0.6％+/-0.06)，而129Sv小鼠顯示最高頻率(總的脾臟細胞的1.94％+/-0.37)。
實施例7組織切片上120G8的免疫組織化學染色通過免疫組織化學分析胸腺、脾臟、peyer′s小決、外周淋巴結、腸繫膜淋巴結來檢驗120G8+細胞的原位分布。在所有的這些器官中，可檢測到120G8+的單個細胞。在一些器官(例如胸腺)中，可在內皮細胞上檢測到一些低的染色。也在腸被絨毛上檢測到一些低的染色。
實施例8體外活化後在小鼠pDC上維持120G8BDCA2、CD123、BDCA4是3種通常用於檢測人pDC的標記物。然而眾所周知，在體外活化的人pDCs非常迅速地下調這些標記物。因此迄今為止很難原位檢測活化的pDC。在小鼠中，通常通過用抗-CD11c和抗-CD45R/B220復染來檢測pDC(靜止或活化的)，但是該組合染色其他的細胞，例如B細胞。為了評估靜止和活化的pDC上的120G8染色，在有或沒有滅活的流感病毒和CpG ODN 1668(TCC ATG ACG TTCCTG ATG CT)(SEQ ID NO2)時，體外培養來自129Sv小鼠的MACS純化的CD11c+脾細胞20h。在所有試驗的狀況中，120G8 mAb染色的平均螢光強度在小的CD11c+B22highCD11b-亞型(pDC)上保持恆定。儘管在流感病毒和CpG刺激後檢測到一些CD11c+B220hi120G8-，那些細胞也表達CD11b，表明一些骨髓樣DC可上調B220，而不是120G8，進一步證實pDC上120G8染色的特異性。
為了進一步證實120G8 mAb也可體內染色活化的pDC，如所描述的方法用CpG處理129Sv小鼠。在CpG注射後6h分離脾臟細胞，並且對DC亞型研究DC上表達的活化標記物。120G8+細胞上調DC活化分子，例如CD40、CD86，並且在用CpG體內刺激後調節至更少程度的CD8α和MHC類型II分子。在對照和CpG處理的小鼠中，那些細胞顯示相同水平的CD11c(低)和CD11b(陰性)，並且pDC中120G8染色的平均螢光強度保持恆定。因此120G8 mAb在體外和體內都識別靜止和活化的pDC。
實施例9在來自正常和CpG活化的小鼠脾臟的120G8+細胞定位雖然一些研究已經顯示人pDC位於T細胞區，應答HSV感染而產生IFNα的細胞位於小鼠脾臟的邊緣區(Eloranta，Alm，Scand J Immunol，1999)。如實施例7中呈現的免疫組織化學染色研究表明正常小鼠中脾臟的pDC位於T細胞區。由於120G8 mAb似乎是原位染色靜止和活化的pDC的獨特工具，為了在脾臟中追蹤小鼠pDC定位，我們如所描述的方法用CpG處理129Sv小鼠。通過用在CpG處理後6h的脾臟中用綠色螢光(Alexa488螢光染料)染色120G8+細胞和用紅色螢光(Alexa594螢光染料、抗-CD3ε、抗-CD19、抗-CD11c(N418克隆)和抗-CD11bmAbs)染色T、B、DC或巨噬細胞的共染色，進行免疫螢光原位分析來實現這個研究。我們注意到在該實驗條件下，由於pDC低表達CD11c，120G8+細胞不能被CD11c染色。因此通過CD11c原位染色只檢測到CD11chigh。用120G8分析連續切片的CD19、CD3或CD11b共染色。在靜止的動物中，120G8mAb染色來自T細胞區(CD3染色)和邊緣區(CD11b染色)的細胞。在B細胞區(CD19染色)沒有發現120G8+細胞。在紅漿(red pulp)和T細胞區之間的橋連通道中檢測到CD11chigh細胞(CD11c染色)，但是沒有顯示與pDC相同的分布模式。
在CpG活化的脾臟中，120G8 mAb染色來自邊緣區的細胞。在B或T細胞區沒有或幾乎沒有檢測到120G8+細胞。相反，在T細胞區可檢測到大流量的CD11chigh細胞。
因此，120G8mAb可用於直接地原位追蹤應答活化的pDC遷移。
實施例10120G8細胞的體內排空終止了IFN-α的產生在上述的研究中，已經通過用抗-Ly6G/C(Gr1)處理排空那些細胞而證明pDC在病毒感染中的作用。這個處理，除pDC和中性粒細胞外，也可能減少部分巨噬細胞和活化的T細胞。因此通過利用120G8特異地排空pDC可能對於體內研究具有很大的用途。腹膜內注射或不注射120G8 mAb的BALB/c小鼠，24h後，在未處理和120G8處理的小鼠(每組3隻小鼠)中分離脾臟細胞，用於FACS分析脾臟細胞中Ly6C+B220+CD11c+的頻率，以及CD19或CD3ε汙染細胞的水平。用120G8 Ab體內處理降低脾臟Ly6C+B220+CD11c+細胞的頻率。此外，剩餘的Ly6C+B220+CD11c+細胞不全是pDC，因為它們表達CD3(42％)並且表達較少的CD19(18％)。
為了評估120G8排空對IFNα生產的影響，在CpG處理129Sv小鼠(每組3隻小鼠)後6h，預先排空或不排空120G8+細胞來分析seric IFNα和IL 12的產生。對於兩個細胞因子，對照小鼠血清(單獨地DOTAP)都是陰性的。120G8處理完全消除了由CpG處理(對於正常的小鼠為13300pg/ml+/-1500，對於120G8處理的小鼠為小於150pg/ml)誘導的IFNα產生，同時導致對IL-12產生的小的抑制，p40和p70兩者(對於正常的小鼠為IL-12p701240pg/ml+/-540，對於120G8處理的小鼠為300pg/ml+/-74；對於正常的小鼠為IL-12p405806pg/ml+/-1135，對於120G8處理的小鼠為4250pg/ml+/-1170)。因此120G8 mAb可用於排除小鼠體內產生IFNα的細胞。
實施例11存在IFNα時在B細胞上120G8表達上調120G8 mAb只染色分離自正常小鼠的總的靜止細胞當中的pDC。我們研究其它的細胞是否在細胞因子活化後也可被120G8染色。從Balb/c小鼠分離脾臟細胞並且在存在細胞因子的情況下培養24h。然後在這些細胞上分析用120G8和抗-CD19、CD4、CD8β或CD11c mAbs的復染。利用FL3通路控制輸出自發螢光的細胞。這證明，在B細胞和CD11c+DC上，而不是在T CD4+或T CD8+DC上，應答100U/ml的IFN-α上調被120G8 mAb識別的抗原。在應答IFNγ、IL-12或TNFα中沒有觀察到這種上調。然而B細胞上120G8染色的平均螢光強度仍然保持比pDC上的低至少一個量級(log)。
對於本領域的技術人員來說，產生本發明的許多改進和變化而不背離其精神和範圍是顯而易見的。在此只是通過實施例的方式來提供所述的具體實施方案，並且本發明只受到所附權利要求的條款的限定，伴隨有這些權利要求的等同物所賦予的全部範圍。
序列表110Schering Corporation120特異於類漿細胞樹突狀細胞的抗體130SF06011WI01150US 60/443,2441512003-01-281602170PatentIn version 3.1210121125212DNA213人工序列220
223寡核苷酸(ODN)4001tcattggaaa acgttcttcg gggcg 25210221120212DNA213人工序列220
223寡核苷酸(ODN)4002cccatgacgt tcctgatgct 20
權利要求
1.一種結合化合物，其具有由ATCC保藏號PTA-4957保藏的雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體的結合特性。
2.權利要求1的結合化合物，其是抗體或抗體片段。
3.一種由ATCC保藏號PTA-4957保藏的雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體的抗原結合片段。
4.由以ATCC保藏號PTA-4957保藏的雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體。
5.以ATCC保藏號PTA-4957保藏的雜交瘤細胞系。
6.一種用於從包含類漿細胞樹突狀細胞的樣品中純化所述類漿細胞樹突狀細胞的方法，所述的方法包括將所述的樣品與權利要求1的結合化合物接觸，然後回收已經結合所述結合化合物的類漿細胞樹突狀細胞的步驟。
7.一種用於從包含類漿細胞樹突狀細胞的樣品中鑑定所述類漿細胞樹突狀細胞的方法，所述的方法包括將所述的樣品與權利要求1的結合化合物接觸，以形成抗體/類漿細胞樹突狀細胞複合物；以及檢測所述複合物的存在的步驟。
全文摘要
本發明提供能夠結合類漿細胞樹突狀細胞(pDC)的免疫學試劑(抗體)，表達這種抗體的細胞系以及利用這種抗體從包含pDC的組織鑑定和純化類漿細胞樹突狀細胞的方法。
文檔編號G01N33/563GK1745104SQ200480003047
公開日2006年3月8日 申請日期2004年1月26日 優先權日2003年1月28日
發明者C·帕圖雷爾, G·特林基裡, J·－J·賓 申請人:先靈公司