生產肽的方法

2023-04-24 07:17:51 2

專利名稱:生產肽的方法
本發明涉及重組體家蠶(Bombyx mori，蠶)核多角體病毒及應用這些重組體病毒生產肽的方法。
已經報導了利用Bombyx mori蠶體核多角體病毒(BmNPV)來生產肽的方法(見本文末尾所引用的參考文獻之參考文獻1)。
該方法的主要特徵包括應用重組體DNA技術，以一種期望的蛋白質結構基因置換多角體蛋白質編碼結構基因區段，以建造一種重組體BmNPV，並使這種重組體在培養的蠶(家蠶，Bombyx mori)體細胞中或活蠶(家蠶)體內繁殖，以便在其中積累期望的蛋白質。但是，這種方法在期望的蛋白質的產率方面仍不能使人滿意。
此外，融合的蛋白質的生產也曾在大腸桿菌(Escherichia coli)體中實施過，但是，其產率也不能說已經有了大的增長(參考文獻2-8)。
本發明就是關於一種重組體病毒，即是一種在Bombyx mori家蠶體核多角體病毒DNA的多角體蛋白質一個編碼結構基因區段中，具有所期望的蛋白質的結構基因的重組體蠶核多角病毒，它連接到整個或部分的多角體蛋白質一編碼結構基因中。該等基因之間具有或不具有中間插入的連接子鹼序列。
本發明也是關於在培養的Bombyx mori家蠶體細胞中或在活的Bombyx mori的家蠶體內，繁殖重組體病毒從而生產融合的蛋白質的一種方法。
本發明還進一步是關於在融合蛋白質的連接位點將其分割或分解，從而生產所期望的蛋白質的方法。
在本文的附圖中，圖1至圖6通過一個舉出的實例，用示意圖表明用於生產重組體病毒的某些質粒的建造圖解。
圖7及圖8是所期望的融合蛋白質的電泳圖示。
BmNPV是養蠶工作者所廣泛地知道的。T3菌株是由本發明者所分離來的一種典型的菌株。這種菌株的病毒DNA(BmNPV DNA)已經存放於在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，其登記號碼是ATCC 40188。
為了從這種病毒的DNA中分離出含多角體蛋白質的結構基因的一個區段，用限制性內切酶(EcoRI)的處理來處理是適合的，如參考文獻1所述，其中有一種帶有質粒pBmE36的大腸桿菌菌株(E.coli K12JM83 DGB-0036)，而質粒中含有病毒DNA的EcoRI-EcoRI片段〔約10.5千鹼基(kb)〕，該片段是在EcoRI分裂位點插入到質粒中。此種菌株現已存放到日本通商產業省，工業科學與技術廳，發酵研究所，登記號碼是FERM BP-813。
此外正如在參考文獻1所敘述的那樣，當應用HindⅢ處理pBmE36時，可得到含有多角體蛋白質的結構基因而長度約為3.9千鹼基(kb)的片段。然後將此片段插入一市售的質粒pUC9〔可由P-L生物化學藥品公司(Pharmacia P-L Biochemicals)買到〕。隨後的EcoRI分割，Bal31處理(在此，不同長度的片斷可通過調節處理時間而得到)此及進一步的HindⅢ分割，或者用一種相似的方法可提供包括全部或部份多角體蛋白質基因的片段。
應用一種適當的連接子(DNA)(參考文獻19)，可將所期望的蛋白質的一種結構基因，連接到整個或一部份多角體蛋白質基因上，而對所產生的融合蛋白質，當用一種適當的工具在由相應的連接子鹼基順序翻譯成的胺基酸或肽的位點上分割時，可生成期望的蛋白質，然後可用通常的方法將其分離。當這種融合蛋白質本身就可應用時，自然不需要分割的步驟，在這種情況下;連接子也不需存在。
眾所周知，在相當於連接子的肽或胺基酸(連接部份)及用於分割或分解融合蛋白質的各種工具之中所包括的分別是異亮-谷-甘-精的序列及能夠分割序列的凝血因子Xa(下面簡稱「F-Xa」);脯-Ama-甘-脯(其中Ama是任何一種胺基酸)及能夠分割序列的膠原酶;精氨酸或苯丙氨酸及能夠分割在融合蛋白質之後的肽鍵的胰蛋白酶;酪氨酸或苯丙氨酸及能夠分割在融合蛋白質之後的肽鍵的糜蛋白酶;脯氨酸-精氨酸及能夠分解在融合蛋白質之後的肽鍵的凝血酶;色氨酸及能夠分解融合蛋白質的N-溴代丁二醯亞胺;以及甲硫氨酸及能夠分解融合蛋白質的溴化氰(參考文獻2-10)。連接部份及分割或分解的工具並不限於上述者。許多其他的各種肽的組合物或胺基酸以及各種的化學的或酶促的方法均可分別用作連接區段及分割或分解的工具。
較理想的是，所期望的蛋白質不含有任何一種胺基酸或肽，而該胺基酸或肽暴露在上述的連接區段分割或分解的過程時則會被分解。但是，限制性地應用恰當地受限制及緩和的條件去分解融合蛋白質，則也可能藉此達到目的。
在此所用的名詞-「期望的蛋白質」-可以是一種真核生物蛋白質，較好的是一種哺乳動物蛋白質。期望的蛋白質的具體例子包括不同的生理活性物質及用作診斷試劑的物質，例如幹擾素(IFNs)，腫瘤壞死因子(TNF)，白細胞素及其他的淋巴細胞活素，胰島素，生長激素及其他的激素，肝炎疫苗，流感疫苗，及各種其他的抗原蛋白類，組織血纖維蛋白溶酶原活性因子(TPA)，促生長因子，工業上應用的酶例如甾類化合物轉化酶、醯基轉移酶，澱粉酶、脂酶等，食物添加劑及飼料添加劑，以及其他種種。在這些物質中，有些會有糖鏈加於其中。按照本發明，肽是由真核細胞產生的。當應用一種由真核生物殖生的基因，肽的生產可經歷與發生在真核生物體內相同的一種改性這或多種改性。因此，本發明所生產的產品與由細菌生產的產品相比較，可以說是具有較高的效益。
用於這些蛋白質的基因編碼，可以是由天然發生的物質分離出的染色體DNAs，也可以是通過天然衍生的mRNAs的中間體製備的cDNAs，由化學合成的DNAs，或由上述列舉的技術的適當組合(參考文獻18及19)而生產出的DNAs。
假如一種產品在胺基酸順序上與預期的物質在胺基酸順序上有些不同(取代，減少或增加)，但仍然具有所要求的功能(例如生理活性)的話，則可按需要去改變此種影響。例如當與上述連接區段有關的蛋氨酸被溴化氰分解時，存在於期望蛋白中的一個或多個蛋氨酸殘基可被另一個胺基酸殘基或其他的胺基酸殘基所置換或被取消。在這種情況下，檢驗按照上述的概念而設計出的鹼序列為基礎所產生的肽，看其活性是否適合所要達到的目的，這樣做是可取的。
在某些例子中，正如所看到的那樣，一種胺基酸殘基的部份，可以留在期望的蛋白質產品上，例如，在用2-硝基-5-硫氰基苯甲酸來化學分解半胱氨酸的情況就是如此。在這種情況下，最好也象上述那樣檢驗產品的活性，以確定產品是否符合預定的用途。
以一種鹼基序列插入其中的質粒(用於重組的質粒)，可以應用有關的那些質粒、限制性內切酶及市場上買得到的其他材料，以慣用的重組體DNA技術生產出來。這種鹼基序列包括Bombyx mori家蠶體核多角病毒DNA(BmNPV DNA)的全部或部份的多角體蛋白質基因與一個期望的蛋白質的結構基因結合在一起(有或沒有中間插入的連接子)，它即構成一種融合蛋白質的基因。這些質粒的生產可參考此文後面所述的例子按常規的方法來實施。
為了應用上述質粒來生產重組體病毒，可使一種規定的Bombyx mori蠶體細胞株的細胞，受到用於重組作用的一種質粒及BmNPV的混合感染，如果需要的話，接著用空斑方法(Plaque Method，參考文獻11)或稀釋方法(參考文獻12)分離重組體病毒。可以應用的適合的規定Bombyx mori蠶體細胞株中，包括已知的Bm細胞(在參考文獻1，11及13中所敘述的BM-N細胞，保藏於ATCC，保藏號CRL-8910)及保藏於ATCC(保存號為CRL-8851)的BM-N細胞。為了在蠶體內生產所需要的物質，通過將在培養的細胞中繁殖的病毒(用重組體或非重組體病毒混合物或者從其中分離出的重組體病毒)經皮膚法射或注射到蠶體的體腔內，或通過口腔將病毒餵入蠶體，而使蠶體受到病毒的感染。然後用人工飼料桑葉飼餵適當的天數，使其積累所期望的融合蛋白。通常，融合蛋白質不溶於水而懸浮於蠶體體液內，而可用慣用的方法如色層層析法(離子交換樹脂層析，親合層析，膠體滲透層析，等等)，離心法、萃取法等等進行分離或純化。
當將蠶體磨碎並與溶劑〔例如十二烷基硫酸鈉(SDS)水溶液，尿素水溶液，強鹼水溶液等等〕混合或與這些溶劑一起磨碎時，可用上面敘述的方法從溶液中將融合蛋白質分離或純化。當要將融合蛋白質分割時，其分割/分解的步驟可按上面敘述過的方法來進行。
下述的實例中〔在這些例子中期望的蛋白是胰島素相似物生長因子(IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ)及α-幹擾素〕用作進一步說明本發明。但是，必須指出，這些例子決不是意圖限制本發明範圍。質粒建造的示意圖在圖1-5中作了描述。除非有其他的說明，按照通常的慣例，DNA序列的5′末端(上行)表示於左側;而3′末端(下行)則表示於右側。
多角體蛋白質基因，用於生產期望的蛋白質基因，及用於生產融合蛋白質的基因的合成、分割、篩選、分離及其他處理，可應用在參考文獻1中所敘述的技術，以及常規應用的基因操作技術(參看例如參考文獻18及19)來進行。
實例1
A.脫除多角體基因的質粒的建造用EcoRI分割質粒pBmE36(參考文獻1)，並用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)在dNTPs(四脫氧核苷三磷酸類)存在下，使分割產物變成平整末端(blunt ended)。用HindⅢ部份消化，接著進行瓊脂糖凝膠電泳，得到含多角體基因片段。應用T4連接酶，使此片段與由EcoRI分裂pUC9而製備的pUC9片段相連接(pUC9可由P-L生化藥品公司買到)，應用Klenow片段使分割產品末端整平，並進一步用HindⅢ使之分割以生成一種連接產物。所得到的連結產物用於轉化大腸桿菌K-12JM83。然後回收質粒接並命名為p9BmE36，(參考資料19中敘述了上述方法)。
由活體外的突變，將一種EcoRV識別位點及一種Aat Ⅰ識別位點分別引進p9BmE36的起始密碼子ATG的位點及終止密碼子TAA的位點(參考文獻14)。於是在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓存在下，以脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)來處理p9BmE36，以生產一種具切斷口的質粒(參考文獻14)，然後此種質粒再與下面兩個化學合成的DNA片段退火(annealing)。
接著用聚合酶Ⅰ及T4連結酶處理，而生成異源雙鏈質粒，此質粒隨後用於轉化大腸桿菌K-12JM83。為了得到所希望的突變體，再進行一次轉化作用。這樣就得到了一種p9BmM36的質粒。
為了從p9BmM36上脫下多角體基因及插入聚連接子，用化學方法合成下面兩個片段(每個片段為38個單體)CTAAGAGCTCCCGGGAATTCCATGGATATCTAGATAGG 和CCTATCTAGATATCCATGGAATTCCCGGGAGCTCTTAG這兩個片段是互相輔助的，並有Sac Ⅰ，SmaⅠ，EcoRI，NcoⅠ，EcoRV及XbaⅠ識別位點。
應用T4激酶分別將上述兩個片段在5′末端磷酸化，然後一起退火。在T4連接酶存在下，退火的產物與用EcoRV及AatⅠ分割p9BmM36所得到的而沒有多角體基因的片段相連接。這一步驟結果使BglⅡ識別位點及AatⅠ識別位點分別在連接子的5′側及3′側形成，由此而產生的質粒用作轉變大腸桿菌K-12JM83，然後將其回收及命名為pBMO30。
現將pBMO30的DNA序列及在pBMO30的聚連接子區段上的分裂位點，與p9BmE36的多角體基因區段的對比，表示如下
B.具有部份缺陷的多角體基因的質粒的建造應用EcoRI分裂質粒p9H18(參考文獻1)，然後以Bal31處理，從而削去分裂位點每邊的一部份。由於用Bal31處理的時間不同，產生了不同長度的片段。用HindⅢ處理這些片段並經0.7%瓊脂糖膠電泳分離，然後經過萃取，即可得到不同長度的病毒衍生的DNA片段。
用SmaⅠ及HindⅢ處理質粒pUC9，接著將先前得到的DNA片段(具有一個平整末端及一個HindⅢ末端)相連接。應用由此而生成的質粒，將大腸桿菌K-12JM83轉變然後生長。回收質粒，應用一種引子(M13的15-鹼基序列的引子)，以二脫氧法(dideoxy method，參考文獻15)由每個病毒殖生的插入物DNA片段的3′側，檢驗鹼基順序，由此鑑定病毒多角體基因區段，從而在病毒殖生的DNA片段的鹼基順序中，發現了相對應於Serebryani等人(參考文獻16)所敘述的多角體蛋白質的胺基酸順序的鹼基順序。翻譯的起始密碼子ATG及終止實碼子TAA也得到鑑證。
由於Bal31的處理時間長短，所得到的不同的質粒(p9B系列質粒)之中，從失去多角體基因的翻譯始密碼子ATG，具下行的212鹼基對，338鹼基對，662鹼基對及727鹼基對的那些質粒，分別被命名p9B240，p9B120，p8B115及p9BO86。多角體基因的長度為738鹼基對，其中包括終止密碼子TAA。
123 40ATGCCGAATT ATTCATACAC CCCCACCATC GGGCGTACTTACGTGTACGA CAATAAATAT TACAAAAACT TGGGCTGTCTTATCAAAAAC GCCAAGCGCA AGAAGCACCT AGTCGAACATGAACAAGAGG AGAAGCAATG GGATCTTCTA GACAACTACATGGTTGCGCA AGATCCCTTT TTAGGACCGG GCAAAAACCA
GATACCATGA AGTTAATCGT CAACTGGAGC GGCAAAGAGTTTTTGCGTGA AACTTGGACC CGTTTTGTTG AGGACAGCTT
GTCGCCAACC TCAAACCCAC ACGCCCCAAC AGGTGCTACAAGTTCCTCGC TCAACACGCT CTTAGGTGGG AAGAAGACTACGTGCCCCAC GAAGTAATCA GAATTATGGA GCCATCCTACGTGGGCATGA ACAACGAATA CAGAATTAGT CTGGCTAAAAAGGGCGGCGG CTGCCCAATC ATGAACATCC ACAGCGAGTACACCAACTCG TTCGAGTCGT TTGTGAACCG CGTCATATGGGAGAACTTCT ACAAACCCAT CGTTTACATC GGCACAGACT
TTTCAAAATA AAGGAGTTTG CACCAGACGC GCCTCTGTTC
C.由多角體蛋白質及α-幹擾素組成的融合蛋白質基因的建造用Sma Ⅰ分裂pIFN2B310(參考文獻1)，用瓊脂糖凝膠電泳分離α-IFN-J片段。應用T4連接酶使此片段與經Sma Ⅰ-分割的pBMO30相連接。生成的質粒用於轉變大腸桿菌K-12JM83。重組體質粒被命名為pBT310，經證實，其中α-IFN-J基因是在正確的方位插入。
以Bgl Ⅱ分裂pBT310，用Klenow片段在dNTPs的存在下使分裂產品變成平整末端，然後用Sca Ⅰ分割。以瓊脂糖凝膠電泳分離含有α-IFN-J基因的片段。
用EcoRI及Sca Ⅰ分割p9BO86，用瓊脂糖凝膠電泳分離含有多角體基因的片段，應用S1核酸酶使此片段產生末端平整，並應用T4連接酶使此片段與上述含有α-IFN-J基因的片段連接。用生成的質粒轉化大腸桿菌K-12JM83。然後，用二脫氧方法證實應用此方法得到的質粒的連接區段的DNA順序是正確的。此種質粒命名為pIFNFO86。
連接部份的DNA順序是
D.用於由胰島素樣生長因子(IGF-Ⅰ)及多角體蛋白質所組成的融合蛋白質的基因的建造。
將由大腸桿菌K12 MC1016 IGF001(FERM BP-932)回收得到的質粒pIGF001用Sal Ⅰ分割。在dNTPs的存在下，用Klenow片段使分裂的產品末端平整，並用Ava Ⅱ分割之，用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離含IGF-Ⅰ基因的片段。
分別用EcoRV及Sac Ⅰ分割pBMO30。
可以看到，在融合蛋白質的生產中，必須將胺基酸順序異亮-谷-甘-精導入多角體蛋白質及IGF-Ⅰ之間，由此，融合蛋白質可被識別出並可被凝血因子Xa(F-Xa)分割。為此目的，用化學合成法合成下面兩個DNA片段ATTGAAGGCAGAG (13單體)GACCTCTGCCTTCAATAGCT (20單體)這兩條片段是互補的，在退火之後，在上行的一側形成了一個可與Sacl分裂末端連結的粘性末端，而在下行的一側則形成一個可與AvaⅡ分裂末端連接的粘性末端。
應用T4激酶使這兩條片段的5′末端磷酸化，然後在一起退火，將退火的產物，上述的IGF-Ⅰ片段與上述的分割pBMO30，用T4連接酶使之連接在一起。用此連接的產物使大腸桿菌K-12JM83轉變以生成一種質粒。用二脫氧方法證實，在此質粒(pIFG-IO30)上的IGF-Ⅰ基因與F-Xa識別位點之間連接的DNA排列順序是正確的。用BglⅠ分割pIGF-IO30，然後應用Klenow片段，在dNTPs的存在下使轉變成平整末端，用ScaⅠ分割，含有IGF-Ⅰ基因的片段則用瓊脂糖凝膠電泳分離。
分別用EcoRI及ScaⅠ分割p9B086，並用S1核酸酶使之轉變成平整末端，用瓊脂糖凝膠電泳將含多角體基因的片段分離，應用T4連接酶將此片段與上述含IGF-Ⅰ基因的片段相連接。應用所生成的質粒，使大腸桿菌K-12JM83轉變，可得到一個具有由正確的連接構造的融合蛋白質基的質粒，並命名為pIGF-IFO86。連接區段的DNA順序表示如下
E.由不同長度的多角體蛋白質及IGF-Ⅱ所組成的融合蛋白質基因的建造由大腸桿菌K12 MC1061 IGF002(FERM BP-933)回收得質粒pIGF002，以Sal Ⅰ部份消化，再用Klenow片段在dNTPs存在下使之變成平整末端，然後用Hae Ⅲ分割，接著用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，由此分離出一條含有IGF-Ⅱ基因的片段。應用T4連接酶使此片段與經SmaⅠ分裂的pBMO30連接，此連接產物用於大腸桿菌K-12JM83的轉變。作為以此方法得到的轉變物，它被證實帶有一個質粒(pIGF-IIO30)，其中由正確方位插入IGF-Ⅱ基因。
用EcoRI部份消化pIGF-ⅡO30，然後用ScaⅠ分割，用瓊脂糖凝膠電泳使含有IGF-Ⅱ基因的片段分離，在T4連接酶的存在下，這一片段與含有一部份多角體基因的片段連接，後者是在用EcoRI及ScaⅠ分割了p9B240，p9B120及p9B115之後用瓊脂糖凝膠電泳分離得到。
應用由前面的步驟中所得到的質粒轉變大腸桿菌K-12JM83。應用二脫氧方法測定DNA排列順序，證實由生成的轉變物所生成的各質粒中具有以正確方式建造的各個融合蛋白質基因。
這些質粒分別被命名為pIGF-IIF240，pIGF-IIF120及pIGF-IIF115。
在各個質粒中連接區段的DNA順序表示如下PIGF-IIF240
實例2Bm細胞的轉染BmNPV T株病毒DNA(ATTC保藏號40188)及PIFNF086(摩爾比為1∶100)與溶液Ⅰ和溶液Ⅱ相混合，溶液Ⅰ與Ⅱ分別有下列的組成溶液Ⅰ 蒸餾水 2.1毫升載體DNA(鮭精巢，1毫克/毫升) 50微升BmNPV DNA 10微升pIFNF086 DNA 50微克2M氯化鈣 300微克溶液Ⅱ 50mM HEPES 緩衝溶液(pH7.1) 2.5毫升(含0.28M氯化鈉)磷酸鹽緩衝溶液(35mM Na2HPO4-35mM NaH2PO4) 50微升將生成物懸浮液一份1毫升加入到4毫升的一種Bm細胞培養介質(含有10%的牛犢胎兒血清的TC-10介質;參考文獻17)，將此混合物加到Bm細胞中(ATTC保藏號CRL-8910，2×106個細胞)從而將上述DNA引入Bm細胞中。20小時後，換入新鮮的介質，經過再培養5天後，回收介質並離心分離，將上清液進行空斑測定(參考文獻11)，由此回收作為無性繁殖系的重組體病毒。將其命名為vIFNF086。
分別應用pIGF-IF086，pIGF-IIF240，pIGF-IIF120及pIGF-IIF115，以上述同樣的方法取得重組體病毒無性繁殖系，vIGF-IF086，vIGF-IIF240，vIGF-IIF120及vIGF-IIF115。
實例3在Bm細胞中融合蛋白質的表達向Bm細胞群(ATTC保藏號CRL-8910，2×106個細胞中)加入一種vIFNF086的懸浮液〔5×107空斑單位(pfu)〕，以使其受vIFNF086的感染。卅分鐘後，除去上清液，加入4.5毫升的新鮮介質一份並在25℃繼續培育四天。之後，用離心法(1000轉/分，經10分鐘)處理培養液得到一種沉澱。將500微升的新鮮介質一份加到沉澱中，經過5次重複的冰凍-解凍循環，離心分離混合物(15，000轉/分，10分鐘)，向以此法收集到的沉澱中加入200微升4%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-10%的巰基乙醇。用5微升的生成物溶液一份作為樣品，進行SDS-14%聚丙烯酸醯胺凝膠電泳。
電泳過後，凝膠中可觀察到與所期望的融合蛋白質相關的一條帶。因此，可以應用光密度計來測量該帶的密度並與每一個標誌物的密度相比較(每個標誌物帶含有1微克蛋白質)。這樣測定的產率是每一毫升第一次得到的細胞培養液中含有0.3毫克。由於計算出在此種融合蛋白質中IFN部分約佔40%(按分子量計)，這一產量在成功的分割及IFN回收後，應相當於0.12毫克/毫升產率的IFN。當該產率與在一份報告所給出的用於表達在家蠶體細胞中的IFN的數值即5×106單位/毫升(相當於0.005毫克/毫升)相比較，是後者的20倍(參考文獻1)。
同上述的同樣方法測定用vIGF-IF086，vPIGF-IIF240，vPIGF-IIF120及vIGF-IIF115感染Bm細胞而生產的融合蛋白質的產量分別是每毫升細胞培養液含0.5毫克，0.1毫克，0.4毫克及0.5毫克，或者當根據含於這些蛋白質中的IGF-Ⅰ或IGF-Ⅱ的數量來表示時，則分別是0.1毫克/毫升，0.05毫克/毫升，0.1毫克/毫升及0.1毫克/毫升。
實例4A.在Bm細胞中的融合蛋白質的表達向Bm細胞群(ATTC保藏號CRL-8910，2×106個細胞)中加入vIGF-IIF120懸浮液(5×107空斑單位)，使Bm細胞受到vIGF-IIF120之感染。卅分鐘後，將病毒除去，加入4.5毫升的新鮮介質一份，在25℃繼續培養4天，並離心分離(1，000轉/分，10分鐘)培養液。向離心後收集到的沉澱加入500微升訴鮮的介質。在重複5次冷凍-解凍循環後，將混合物離心分離(15，000轉/分，10分鐘)以取得沉澱，用蒸餾水洗滌沉澱，溶於0.5%SDS中，經高效液體色譜分離〔HPLCTSK凝膠苯基5PWRP〔由東洋曹達工業株式會社(Toyo soda Manufacturing co，Ltd.)生產〕;溶劑系統0.1%三氟乙酸-20-75%乙腈，線性濃度梯度。由此可收集到含有融合蛋白質的液分2毫升。
B.用溴化氰(BrCN)分割向此含融合蛋白質的液分加入50微升的1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，將混合物濃縮至幹，並將濃縮物溶於50徵升的蒸餾水中。取此溶液15微升並向其中加入35微升的甲酸及45微升70%的甲酸，接著進一步加入含有溴化氰溶液(200微摩爾/毫升)的70%的甲酸5微升。在室溫下反應24小時後，將反應混合物濃縮至幹，將濃縮物溶於7.5微升的蒸餾水中，並將此溶液電泳，檢測出有一相當於IGF-II的帶。
從而，用十二烷基硫酸鈉水溶液萃取受vIGF-IIF120感染的Bm細胞，並接著用高效液相色譜進行部份純化而取得的液份，在十二烷基硫酸鈉-16%聚丙烯醯胺凝膠電泳中，得到相當於由多角體蛋白質(部份)及IGF-II組成的融合蛋白質的一條約23K帶，而溴化氰分解產物則顯示約7K的帶(相當於IGF-II)與幾條在10-14K的帶一起，估計可能是由於多角體蛋白質的分解產物所致(見圖8;其中A是標誌物，B是融合蛋白，C是溴化氰分解產物)。
C.IGF-IP的N-末端的確定應用類似於上面所敘述的方法，從50毫升受vIGF-II120感染的Bm細胞的培養液中取得的20毫克融合蛋白質，用溴化氰分割此融合蛋白質，並濃縮此反應的混合物。
將此濃縮物溶於5毫升200毫摩爾的吡啶-醋酸緩衝液中(pH3.0)，用桂色譜〔SP-Toyopearl(東洋曹達工業株式會社生產);溶劑體系200毫摩爾吡啶-醋酸緩衝液(pH3.0)-2.0M吡啶-醋酸緩衝液(pH5.0)，線性濃度梯度〕進行分離。從而收集含有IGF-II的液份。將此液份冷凍乾燥後溶於蒸餾水中，並使之經過高效的液相色譜〔HPLC0DS-120T(東洋曹達工業株式會社生產);溶劑體系0.1%三氟醋酸-10-65%乙腈，線性濃度梯度〕。所得到的純IGF-II經過測定其肽順序排列〔470A蛋白質定序器(由Applied Biosytems生產)〕。由此確定IGF-II的氨基末端胺基酸排列順序表示於下Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly GluLeu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp ArgGly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser實例5A.在Bm細胞中融合蛋白質的表達從大腸桿菌K12 MC1061 IGF001(FERM BP-932)中回收質粒pIGF001，並用Sal Ⅰ分割。應用Klenow片段在dNTPs的存在下使分割的產物變成平整末端並用Ava Ⅱ分割，用聚丙烯醯胺凝膠電泳，將含有IGF-Ⅰ基因的片段分離。
分別用EcoRV及EcoRI分割pIGF-IIF120以除去含IGF-II基因片段。
可以看出，在製備融合蛋白質時，必須將胺基酸順序甘-脯-丙重複地引至多角體蛋白質與IGF-Ⅰ之間，因而使融合蛋白質可被膠原酶所識別及分割，這種酶識別胺基酸順序脯-Ama-甘-脯(Ama是指任何一種胺基酸)並在Ama與甘氨酸之間分割。為此目的用化學方法合成下面兩個DNA片段
(54單體)GACCTCTGCCTTCAATGAATTCACCCGCGGGACCAGCTGGACCAGCTGGGCCC(53單體)這兩個片段是互補的，在退火以後，在上行一側形成一個可與EcoRI分裂末端相連接的粘性末端，而在下行一側則形成一個可與Ava Ⅱ分裂末端相連接的粘性末端。
應用T4激酶使這兩個片段各在5′末端磷酸化，然後在一起退火。用T4連接酶使退火的產物，上述的IGF-Ⅰ片段與上述的分割的pIGF-IIF120連接在一起。用連接的產物轉變大腸桿菌K-12JM83，以產生一種質粒並命名為pIGF-IF120。用二脫氧法斷定DNA的排列順序，得知在此質粒中的IGF-Ⅰ基因與膠原酶識別位點之間的連接是正確的。連接區段的DNA順序可表示如下
應用pIGF-IF120，並使用與實例2中所敘述的相類似的方法，可取得重組體病毒vIGF-IF120。
應用在實例4(a)中所敘述的相似方法，用vIGF-IF120感染Bm細胞，將從50毫升培養液收集的Bm細胞冷凍-解凍之後，離心該細胞(15，000轉/分，10分鐘)以取得沉得沉澱。將沉澱溶於6M鹽酸胍溶液中並離心分離(15，000轉/分，5分鐘)以除去殘餘物。將溶液用蒸餾水滲析，用離心法收集所生成的沉澱(15，000轉/分，10分鐘)。
B.用膠原酶分割將由上面步驟中取得的沉澱溶於800微升的10M尿素溶液中，接著加入200毫摩爾的氯化鈣100微升，250毫摩爾的Tris-鹽酸緩衝液(pH7.4)200微升及膠原酶溶液900微升〔由兩格瑪化學公司(Sigma Chemical co.)生產〕(1，500單位/毫升)。在40℃培育兩小時之後，離心此混合物(15，000轉/分，5分鐘)以收集上清液，將此上清液進行離子交換色譜分析〔DEAE-Toyopearl(由東洋曹達工業株式會社生產;溶劑體系25毫摩爾的Tris-鹽酸緩衝液(pH7.4)〕。由此收集到含有IGF-Ⅰ而在其氨基末端有額外的胺基酸殘基(以下簡稱為「IGF-IP」)的液份。
C.IGF-IP的N-末端的鑑定將含有IGF-IP的液份濃縮，並將濃縮物進行高效液相色譜分析〔HPLC∶RPSC，由貝克曼公司(Beckman co.)生產;溶劑體系0.1%三氟乙酸-10-65%乙腈，線性濃度梯度〕。將所得到的純IGF-IP經過肽定序鑑定〔470A蛋白質定序器(由Applied Biosystems生產)〕，結果顯示膠原酶在所期望的位點分割融合蛋白質，由此確定的IGF-IP的氨基末端胺基酸序列表示如下Gly-Pro-Ala-Gly-Glu-Phe-Ile-Glu-Gly-Arg-Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Ala-Glu-Leu實例6在蠶類(家蠶)體中多角體-IGF-Ⅰ融合蛋白質的表達將vIGF-IF086的懸浮液經皮注射到5齡1天的蠶(家蠶)體中，其劑量為0.5毫升/只(107空斑單位)然後在25℃下以桑葉餵食3天。再用收集針插入腹肢，將所收集的體液放入一個冰凍的Eppendorf管中。離心該體液(15，000轉/分，10分鐘)，將沉降物溶於4%十二烷基硫酸鈉(SDS)-10%巰基乙醇混液200微升中，並將2微升的生成溶液一份作為樣本進行SDS-14%聚丙烯醯胺凝膠電泳。電泳之後在凝膠上有一條與融合蛋白質相應的帶。因此，用光密度計測定此帶的密度並將之與每一標誌物的密度相比較(每一標誌物含有1微克蛋白質)。這樣測定出的產率為5毫克/毫升體液。(以分子量為基礎計算表明，在IGF-Ⅰ從融合蛋白質中分離之後，IGF-Ⅰ可能的回收率為1毫克/毫升)。
在SDS-14%聚丙烯醯胺凝膠電泳中，從受BmNPV-T3株感染的家蠶所得到的體液，大約在相應於多角體蛋白質的30K處顯示出一清晰的帶，然而從經vIGF-IF086感染的家蠶體液中卻沒有顯示出相應於多角體蛋白質的任何帶，但卻顯示一條由多角體蛋白質及IGF-Ⅰ組成的融合蛋白質的特徵的約36K帶(見圖7其中A是標誌物，B是受vIGF-IF086感染的體液而C是受BmNPV-T3感染的體液)。
應用於上述各個實例中的IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ的每一個合成基因，與相應的胺基酸序列表示如下IGF-ⅠGly Pro Glu Thr Leu Cys Gly┄TCGAATTC ATG GGT CCA GAA ACC TTG TGT GGTAla Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe Val CysGCT GAA TTG GTT GAC GCT TTG CAA TTC GTT TGTGly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro ThrGGT GAC AGA GGT TTC TAC TTC AAC AAG CCA ACT
Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro GlnGGT TAC GGA TCC TCT TCC AGA AGA GCT CCA CAAThr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe Arg SerACT GGT ATC GTC GAT GAA TGT TGT TTC AGA TCTCys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys AlaTGT GAC TTG AGA AGA TTG GAA ATG TAC TGT GCTPro Leu Lys Pro Ala Lys Ser AlaCCA TTG AAG CCA GCT AAG TCT GCT TAG TCGACTGIGF-IIAla Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu-AATTC ATG GCT TAC AGA CCA TCT GAA ACC TTGCys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln PheTGT GGT GGT GAA TTG GTC GAC ACC TTG CAA TTCVal Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser ArgGTT TGT GGT GAC AGA GGT TTC TAC TTT TCC AGAPro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg GlyCCA GCC TCC AGA GTT TCT AGA AGA TCC AGA GGTIle Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys AspATC GTC GAA GAA TGT TGT TTC AGA TCC TGT GACLeu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr ProTTG GCT TTG TTG GAA ACT TAC TGT GCC ACC CCAAla Lys Ser GluGCC AAG TCC GAA TAG┉
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權利要求
1.一種重組體病毒，即在家蠶(Bombyx mori)核多角體病毒DNA(BmNPV DNA)的多角體蛋白質編碼結構基因區段中，具有期望的蛋白質結構基因的一種重組體家蠶(Bombyx mori)核多角體病毒，將所述基因連接到全部或部份的多角體蛋白質一編碼結構基因上，它們之間有或者沒有插入連接子鹼基序列。
2.一種生產肽的方法，它包括，建造一種重組體病毒，即在家蠶(Bombyx mori)核多角體病毒DNA(BmNPV DNA)的多角體蛋白質編碼結構基因區段中，具有所期望的蛋白質結構基因的一種重組體核多角體病毒，將上述基因連接到全部或部份的多角體蛋白質-編碼結構基因上，它們之間有或者沒有插入連接子鹼基序列，以及繁殖所述的病毒，以生產出一種融合蛋白質，此種融合蛋白質含有所述的期望蛋白質及全部或者部份多角體蛋白質，它們之間以插入或者不插入連接的胺基酸或者肽相連接。
3.一種生產期望的蛋白質的方法，它包括，建造一種重組件病毒，即在家蠶(Bombyx mori)核多角體病毒DNA(BmNPV DNA)的多角體蛋白質-編碼結構基因區段中，具有期望蛋白質結構基因的一種重組體家蠶核多角體病毒，將所述基因連接到全部或部份多角體蛋白質-編碼結構基因上，其間插入或沒有插入連接子鹼基序列，繁殖所說的病毒，以生產一種融合蛋白質，此種蛋白質含有所述的期望蛋白質及全部或部份的多角體蛋白質，它們之間以插入或沒有插入連接的胺基酸或肽相連接，然後在其連接位點，分割上述融合蛋白質，以生產期望的蛋白質。
4.一種質粒，它含有5′-上行鹼基序列，其中包括家蠶(Bmobyx mori)核多角體病毒DNA(BmNPV DNA)的啟動區段，全部或部份BmNPV DNA的多角體蛋白質-編碼結構基因，選擇性的一種連接子鹼基序列，一種期望的蛋白質的結構基因(選擇性地包括期望蛋白質的終止區的一種鹼基序列)，及含有一種3′-下行的鹼基序列(包括上述BmNPV DNA的終止區段)。
5.一種生產重組體家蠶(Bombyx mori)核多角體病毒DNA的方法，其中包括共轉染一種培養的家蠶細胞系或者帶有家蠶核多角體病毒DNA(BmNPV DNA)的家蠶的一種品系，以及一種質粒，質粒中含有5′-下行鹼基序列，其中包括家蠶核多角體病毒DNA(BmNPV DNA)的啟動區段，BmNPV DNA的全部或部份的多角體蛋白質-編碼結構基因，選擇性的一種連接子鹼基序列，一種期望的蛋白質的結構基因(選擇性地包括期望蛋白質的終止區的一種鹼基序列)，及含有上述BmNPV DNA的終止區段的一種3′-下行鹼基序列。
專利摘要
提供一種重組體病毒，即在家蠶核多角體病毒DNA的多角體蛋白質一編碼結構基因區段中，具期望的蛋白質的結構基因的重組體家蠶核多角體病毒，所述基因與全部或部分多角體蛋白質一編碼結構基因連接，其間插入或不插入連接子鹼基序列。在蠶體或蠶體的衍生細胞中繁殖上述病毒，生產一種由期望的蛋白質及全部或部分多角體蛋白質結合成的融合蛋白質，當其結合時，插入或不插入連接子胺基酸或肽。所期望的蛋白質由在連接位點上分割或分解融合蛋白質而得到。
文檔編號C12R1/91GK86107784SQ86107784
公開日1987年6月3日 申請日期1986年11月14日
發明者前田進, 古澤滿, 丸本恭正, 堀內正, 佐藤嘉生, 佐伯欣之 申請人:第一製藥株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan