含有人甲狀旁腺激素的藥物成分及含有該成分的用於鼻內給藥的藥物組合物的製作方法

2023-05-23 16:48:16

專利名稱：含有人甲狀旁腺激素的藥物成分及含有該成分的用於鼻內給藥的藥物組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有人甲狀旁腺激素的藥物成分，該藥物成分具有優良的穩定性，在用作藥物組合物的成分時能保證良好的使用感。另一方面，本發明涉及一種含有人甲狀旁腺激素的用於鼻內給藥並且適於長期使用的藥物組合物。
降鈣素和二磷酸鹽或用於治療骨質疏鬆的治療劑均通過抑制骨吸收發揮其治療效果，而hPTH(1-84)和hPTH(1-34)則刺激骨形成或刺激與骨形成有關的骨代謝。因此人們期望這些肽類能用作新的骨質疏鬆症治療劑(Lane等人，臨床研究雜誌(J.Clin.Invest.)，1998年，102卷，1627-1633頁)。
據報導，當以一定的劑量每周一次向人類皮下給藥hPTH(1-34)時，將會升高骨的礦物質含量，而當相同的試劑以類似的給藥方法以前者1/5的劑量每天一次連續給藥五天時，將同樣顯著增加骨的礦物質密度(BMD)(Sone等人，礦物質及電解質的代謝(Miner.Electrolvte Metab.)，1995年，21卷，232-235頁)。動物實驗表明當hPTH以一定的劑量一周一次皮下給藥時，引起的骨BMP的增加要小於分割給藥時觀察到的增加情況(Tawaragi等人，Osteoporosis International，1996年，6卷，增補版1，245頁)。該結果顯示，當hPTH長時間的以小劑量每日給藥時所達到的最大治療效果要大於短時間內以大劑量給藥並且每次劑量之間有長的間隔時所達到的治療效果。如果長時間內連續給予小劑量的hPTH能保證與短時間內間歇給予大劑量獲得同樣甚至要更好的效果，這一處方從小劑量的hPTH可避免給藥高劑量hPTH時對消化道與心血管器官所產生的副作用的觀點來看也是非常有利的。
同樣的，通過注射對通常需要長期治療的骨質疏鬆症患者進行治療也是不適宜的，這是因為患者之後必須在醫生的管理下接受治療；患者在治療過程中會感到或多或少的疼痛；並且為了治療而拜訪醫生的辦公室也將成為患者的負擔。
鑑於此，人們需要一種能允許患者輕鬆的在家裡長期每日使用並且不會對患者產生過多疼痛與負擔的鼻腔用藥物。
然而，為了使鼻腔用藥物能夠長時間連續安全地使用，藥物必須滿足如下條件藥物應能平穩地通過鼻黏膜吸收；對鼻黏膜沒有刺激作用；具有優良的使用感，這是因為鼻黏膜對於藥物或其添加劑的刺激作用非常敏感。尤其是，對於這樣一種由hPTH製備而得並希望能在長時間使用時具有治療效果的藥物，在其準備用於鼻內給藥時，優良的使用感是非常重要的。為了製備一種即便是長時間連續使用也能易於接受的鼻腔用藥物，以藥物或其鹽形式存在的活性成分以及適宜添加劑的選擇、確定它們的有效濃度、以及優化其組合都是很重要的。鼻腔用藥物使用感的影響因素與藥物的氣味及刺激性有關。由此，製備鼻腔用藥物的藥物或添加劑的種類及其濃度都是非常受限的。
可購買到的由hPTH製備的產品是一種含有hPTH(1-34)的5-乙酸酯的注射劑，其用作分析甲狀旁腺功能活性的診斷劑(其通用名是乙酸特立帕肽，由旭化成工業株式會社提供)。然而，由於氣味和刺激性的原因，迄今還沒有基於hPTH而製得的並能提供令人滿意的使用感的鼻內藥物。
日本專利特開昭64-16799描述了如下內容當將hPTH純化時，它將會混有純化過程中所使用的乙酸，不同批號的產品中乙酸的含量差異很大，難以獲得均勻乙酸含量的產品，並且還描述了在產品中引入乙酸將會導致產品活性的降低。
此文還公開了一種適用於改進hPTH(1-34)穩定性的方法，其中使用了一種冷凍乾燥的以酒石酸為基礎的hPTH(1-34)的組合物。然而，酒石酸的酸性很強，含有酒石酸的藥物不適宜於鼻內給藥。
日本專利特開平2-111公開了一種用於鼻內給藥的粉末狀組合物，該組合物含有一種為了改進生物活性肽例如hPTH(1-34)的鼻腔吸收而開發的水溶性有機酸。然而，該組合物並不適於長期使用，因為它會直接刺激鼻黏膜，這取決於共存的有機酸的種類和含量。
如上所述，還沒有開發出即使長時間使用仍可被接受的、能保證優良的使用感以及良好的穩定性和吸收性的由hPTH製得的鼻內藥物。
發明詳述本發明的目的是提供一種含有hPTH且非常穩定的藥物成分，當其用作藥物組合物的成分時，具有優良的使用感。在另一方面，本發明的目的在於提供一種含有hPTH的用於鼻內給藥並能長期使用的藥物組合物。
為了實現提供如上所述的用於鼻內給藥的藥物組合物的目的，本發明發明人進行了大量研究，並發現按傳統方法製備的hPTH配製品並不能令人滿意，因為它在向鼻黏膜給藥時有酸性氣味和刺激性，並且這種不便是由於在純化過程中使用的並作為hPTH鹽的組成部分或附著物以很少的量存在的乙酸而引起的。根據這些發現，他們製備了一種藥物成分，其中的乙酸含量與先前的產品相比有所降低，評價該成分後驚奇的發現所述成分在製備成藥物組合物時非常穩定，並能提供優良的使用感，並能與適宜量的用於改進吸收和穩定性的功能性成分安全地混合，也能與製備藥物時常用的載體和賦形劑安全地混合。由此，他們完成了本發明。
更明確地說，本發明涉及一種藥物成分，該藥物成分含有hPTH和乙酸，所述乙酸的含量保持在相對於hPTH的重量的某一化學當量以下。另一方面，本發明涉及一種用於鼻內給藥的藥物組合物，該組合物含有hPTH作為其活性成份，並且含有其含量保持在相對於hPTH的重量的某一化學當量以下的乙酸。
圖2顯示的是乙酸含量為2.9％的hPTH(1-34)配製品在40℃下保存6個月後的反相HPLC色譜圖。
圖3顯示的是不同乙酸含量的hPTH(1-34)配製品在80℃下保存15小時後的分解產物(副產物)B、C、D的含量。
圖4顯示的是不同乙酸含量的hPTH(1-34)配製品在80℃下保存15小時後的hPTH(1-34)的純度。
圖5顯示的是乙酸含量為12.3％的hPTH(1-84)配製品在80℃下保存15小時後的反相HPLC色譜圖。
圖6顯示的是不同乙酸含量的hPTH(1-84)配製品在80℃下保存15小時後的分解產物(副產物)的含量。
圖7顯示的是不同乙酸含量的hPTH(1-84)配製品在80℃下保存15小時後的hPTH(1-84)的純度。
例如，該hPTH可包括hPTH(1-84)(Biochemistry 17，5723(1978)；Kimura等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，第114卷，493頁，1983年)、hPTH(1-38)(日本專利公開號57-81448)、hPTH(1-34)(日本專利公開號9-29600；Takai等人，Peptide Chemistry，第187頁，1979年)、hPTH(1-34)NH2(日本專利公開號58-96052)、[Nle8，18]hPTH(1-34)以及[Nle8，18，Tyr34]hPTH(1-34)(日本專利公開號55-113753)、[Nle8，18]hPTH(1-34)NH2(日本專利公開號61-24598)、[Nle8，18，Tyr34]hPTH(1-34)NH2(日本專利公開號60-34996)、hPTH(1-37)(日本專利公表號5-505594)、hPTH(2-84)、hPTH(3-84)、hPTH(4-84)、hPTH(5-84)、hPTH(6-84)、hPTH(7-84)以及hPTH(8-84)(日本專利公表號4-505259)等。這些hPTH物質可以通過上述文獻中記載的基於基因工程技術或者化學合成技術的方法製得，或者通過與前者相當的方法製得。
一般說來，當通過基因工程技術或者化學合成技術來純化一種生理學活性肽時，需要用到柱色譜。然而，由於hPTH是一種鹼性肽，如果隨意地將其上到色譜柱上，它將被吸附在構成色譜柱的樹脂上。為了防止hPTH被吸附並提高其溶解度，要使用一種酸作為洗脫劑。當肽類被用作藥物組合物中的材料時，必須將其製成一種凍幹的組合物以用作製備藥物組合物的起始原料。為了適應這種需要，這種酸必須是可揮發性的，該性質限制了可使用酸的種類。
為了說明情況，讓我們假設例如，將鹽酸用於本發明目的。鹽酸即使在很低的濃度時仍具有很強的酸性，因此極易導致水解等副反應，並極具腐蝕性。因此，鹽酸並不適用於本發明目的。如果為實現本發明目的而使用一種有機酸，其可選自低沸點的三氟乙酸、甲酸和乙酸。然而，為了安全，不希望將三氟乙酸制摻入到藥物組合物中去。甲酸的使用也由於其可降低活性而受到限制，並且其不能與hPTH等肽類相容和。
相反的，由於其安全性和化學性質，乙酸最適宜用作藥物組合物的材料，並且已經用作鹼性肽的最終純化步驟中不可缺少的酸。例如，基於反相高效液相色譜(反相HPLC)或尺寸排阻柱色譜的純化方法使用含乙酸的洗脫劑進行操作並獲得了良好的結果。在操作過程中，乙酸以足以防止hPTH被吸附到柱子上的濃度加入，因此，從乙酸水溶液中洗脫出來的樣品，即目的肽級分，以及由此製備的凍幹組合物含有的乙酸濃度要高於僅作為鹼性胺基酸殘基的鹽的組成部分而存在的乙酸的濃度，即，乙酸不僅作為hPTH鹽的組成部分存在，還作為粘附的附著物形式存在。
也即，乙酸在以hPTH為基礎的藥物成分中存在有兩種形式作為hPTH鹽的組成部分以及粘附的附著物而存在。由於乙酸是一種揮發性物質，因此很難將凍幹組合物中乙酸的含量保持在恆定的水平，因為凍幹組合物中乙酸的含量會隨著冷凍乾燥的條件、冷凍乾燥前原溶液中乙酸的濃度或原溶液中共存的hPTH的濃度而變化。
本發明的藥物成分包含hPTH和乙酸，其中以hPTH鹽的組成部分和附著物的形式存在的乙酸的含量有所降低。由於乙酸含量的降低，該藥物成分改善了hPTH的穩定性，並能保證在製成用於鼻內給藥的藥物組合物並以此形式使用時具有良好的使用感。
在本發明的藥物成分中，乙酸含量降低的定義是乙酸的含量低於某一特定的化學當量。
因為hPTH(1-34)含有9個鹼性胺基酸殘基(包括色氨酸殘基)，一個hPTH(1-34)分子可最多與9個一元酸(乙酸及其它酸)分子相結合成鹽。然而，它也含有4個酸性的胺基酸殘基，其可在同一分子內與鹼性殘基相結合成鹽。因此，就本發明的hPTH(1-34)而言，剩下的5個鹼性的胺基酸殘基被認為是可用來與乙酸相結合的，從中可得出與一個hPTH(1-34)分子相結合所需的乙酸重量或乙酸對hPTH(1-35)的化學當量。乙酸的含量可根據乙酸和人甲狀旁腺激素肽的重量通過式I計算而得，式I乙酸的重量×100(％)/人甲狀旁腺激素肽的重量。乙酸相對於hPTH(1-34)的化學當量約為7.3％(重量％，除非另有說明)。
類似的，由於hPTH(1-84)含有19個鹼性的胺基酸殘基(包括色氨酸殘基)和12個酸性胺基酸殘基，在製備本發明hPTH(1-84)配製品時，推測一個分子中有7個過多的鹼性胺基酸殘基可用於與乙酸相結合，由此可得到與一個hPTH(1-84)相結合而所需的乙酸重量或者乙酸對hPTH(1-84)的化學當量。乙酸的含量可通過式I計算而得，乙酸相對於hPTH(1-84)的化學當量約為4.5％。
即，根據本發明，乙酸的含量低於其化學當量是指，除去作為附著物的量，而僅僅是作為hPTH鹽的組成部分的量，其重量百分比要低於其化學當量。
本發明通過控制其乙酸的含量提供了一種含有hPTH的穩定的藥物成分，以及一種用於鼻內給藥的含此藥物成分的藥物組合物。
此外，本發明還提供了一種含有hPTH的藥物成分，其中控制乙酸的含量使其維持在一定的水平內；以及一種用於鼻內給藥的含有此藥物成分的藥物組合物。
由於肽在溶液中通常是不穩定的，通常使用其冷凍乾燥的產品作為藥物成分。如果將以含有乙酸或者作為鹽的組成部分的揮發性物質的鹽存在的肽如hPTH溶解於水或者稀釋的乙酸中，並將其冷凍乾燥的產品用作製備藥物成分的原料，則藥物成分中的乙酸含量將不會保持在穩定的水平內，這就提出了難題。本發明可製備所含乙酸含量降低的hPTH水溶液，因此能製備出含有hPTH並同時含有穩定的特定量的乙酸的藥物成分。由此，本發明從生產穩定性的角度來看也非常有優勢。
對於本發明的藥物成分，乙酸含量相對於hPTH的重量維持在化學當量以下。例如，對於基於hPTH(1-34)成分，從穩定性和效用的觀點來看，乙酸含量相對於hPTH的重量維持在約7.3％以下，更優選的為約6.0％或以下，特別是約4.0％或以下，或者從生產穩定性來看，更優選為約4.0％或以下，特別是約3.0％或以下。從製備穩定性的觀點來看，乙酸的含量控制在過低水平以下是不適宜的，因為雖然該成分能提供優良的穩定性和使用感，但是不易在較高的pH(hPTH的等電點為8.2，pI＝8.2)下溶解。乙酸的含量優選保持在約0.5％或更高，特別是約1.0％或以上。另一方面，對於基於hPTH(1-84)的組分，從穩定性和效用的觀點來看，乙酸的含量應保持在約4.5％以下，優選約3.0％或以下，從生產穩定性的觀點來看更優選為約0.1％或以上。
本發明的藥物成分可通過任一公知的方法或通過任一與前者相當的方法製備。即，將作為hPTH鹽的組成部分或作為附著物存在的乙酸的含量降低至一特定水平以下的操作可通過向純化hPTH的過程中適當的引入一種熟知的方法，如透析、電滲析、離子交換色譜、尺寸排阻柱色譜、反相HPLC等實現，其中hPTH是通過以基因工程為基礎的工藝或者以化學合成為基礎的工藝獲得的。
當通過如透析、電滲析、離子交換色譜等方法將過量的乙酸除去時，調節乙酸的含量至任一所需的水平可通過直接監測hPTH溶液的pH值或溶液中的乙酸濃度而實現，這樣就可以獲得含有所需濃度乙酸的hPTH溶液。
例如，hPTH水溶液中的乙酸含量可依據溶液中乙酸的含量與溶液pH值的關係進行調節。
透析可按下文操作將通過基於基因工程或者基於化學合成工藝獲得的hPTH的水溶液、或者pH值已調節至5-9的相同水溶液，在加入了鹼性溶液如氫氧化鈉或氨的水溶液後置於筒狀的可通過低分子量組分的透析膜中；溶液中的溶質基於簡單的擴散機理進行透析；通過該操作可除去所含的乙酸。例如，透析初始溶液直至透析膜之外的溶液pH達到約6.5為止，得到hPTH(1-34)(乙酸含量2％)溶液。
電滲析可按下文操作將通過基於基因工程或者基於化學合成工藝獲得的hPTH的水溶液、或者pH值已調節至5-9的相同水溶液，在加入了鹼性溶液如氫氧化鈉或氨的水溶液後，在暴露於電場中的可通過分子量為300或以下組分的兩層透析膜之間循環；乙酸離子將向陰極遷移並在陰極蓄積，而游離的hPTH鹼性離子將向陽極遷移並在陽極蓄積；低分子量的乙酸離子將穿出薄膜以外，而高分子量的游離的hPTH鹼性離子仍在透析系統中循環。因此便有可能通過監測透析溶液的pH值或離子強度並由此方法檢查已降低了的乙酸濃度來生產含特定乙酸含量的hPTH溶液。例如，對初始溶液實施電滲析直至透析溶液的pH值達到約6.5為止，得到hPTH(1-34)溶液(乙酸含量約為2％)。
在離子交換色譜操作中，乙酸通過與鹼性離子交換樹脂相結合而被其吸附從而被除去。例如，將通過基於基因工程或者基於化學合成的工藝獲得的hPTH的水溶液置於由季銨或仲銨樹脂製成的鹼性離子交換樹脂柱上，乙酸通過離子-離子的結合方式與樹脂相結合；回收可輕易通過柱子的非吸附性部分可得到已降低了乙酸含量的hPTH溶液。可根據溶液中hPTH的重量調節離子交換樹脂的量來獲得具有特定乙酸含量的hPTH溶液。例如，若要獲得hPTH(1-34)溶液(乙酸含量約為2％)，需要使用重量大到足夠能調節洗脫液的pH值至6.5的樹脂。
尺寸排阻柱色譜可按下文操作將通過基於基因工程或者基於化學合成工藝獲得的hPTH的水溶液、或者pH值已調節至5-9的相同水溶液，在加入了鹼性溶液如氫氧化鈉或氨的水溶液後置於柱子中，用含有有機溶劑如乙腈的水溶液進行洗脫；這樣可除去其中的乙酸。通過調節準備上到柱子上的hPTH水溶液的pH值獲得特定乙酸含量的hPTH溶液。例如，若要獲得一種hPTH(1-34)溶液(乙酸含量約為2％)，需要將hPTH水溶液調節至pH至約為6.5後再經過柱子，並回收由hPTH(1-34)洗脫液組成的級分。
在反相HPLC操作中，使用通過基於基因工程或者基於化學合成工藝獲得的hPTH的水溶液、或者pH值已調節至5-9的相同水溶液，並加入鹼性溶液如氫氧化鈉或氨的水溶液。將該溶液上到用水預先處理的C18或C4柱子之上，然後例如用水作為洗脫劑洗脫有機鹽類。之後，使含有有機溶劑如乙腈的水溶液流過柱子以洗脫吸附在柱子上的hPTH；由此獲得降低了乙酸含量的hPTH溶液。
具有特定乙酸含量的hPTH溶液可通過調節準備上到柱子上的hPTH水溶液的pH而獲得。也可以通過這樣的方法來獲得特定乙酸含量的hPTH溶液製備乙酸含量很小的hPTH溶液，例如該方法所允許的低含量，之後加入所需量的乙酸以獲得一種含有特定乙酸含量的hPTH溶液。例如，將被過量去除了乙酸的hPTH(1-34)溶液用水稀釋至10mg/mL；向溶液中加入乙酸至溶液的pH值到達6.5；由此可獲得hPTH(1-34)溶液(乙酸含量約為2％)。
將通過上述方法製得的hPTH水溶液用傳統方法冷凍乾燥以生產本發明的藥物成分。
本發明的藥物成分可包含水溶性的有機酸，或優選至少一種選自檸檬酸、己二酸和乙醇酸的酸，以改善該成分的黏膜吸收性。藥物成分可進一步的含有在經過非腸道途徑給藥時，尤其是在經鼻給藥時，可保證其高穩定性並能保證其優良使用感的有機酸。
因此，本發明的藥物成分可用作適於長期使用的鼻內給藥的藥物組合物的成分。
此外，本發明的用於鼻內給藥的藥物組合物具有與各種功能性組分以及載體、賦形劑、增粘劑、防腐劑、穩定劑、抗氧劑、粘合劑、崩解劑、溼潤劑、潤滑劑、著色劑、調味劑、矯味劑、致懸劑、乳化劑、增溶劑、緩衝劑、張力調節劑、表面活性劑、鎮痛劑(soothing agent)、含硫還原劑等相容的特性。因此，本發明的藥物組合物能很好的經受起加入多種有可能相應的改善吸收和穩定性的功能性組分。
載體或賦形劑包括易溶或微溶於水的物質如糖類、多糖、糊精、纖維素、合成或半合成聚合物、胺基酸、聚胺基酸、蛋白質以及磷脂。
糖類(單糖類、寡糖類)可包括，例如，D-甘露醇、葡萄糖、乳糖、果糖、肌醇、蔗糖、麥芽糖等，多糖類可包括葡聚糖、普魯蘭、藻酸、透明質酸、果膠酸、植酸、非汀等等。糊精類可包括α-環糊精、β-環糊精、γ-環糊精、糊精、羥丙基澱粉、羥乙基澱粉等。
纖維素可包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉等等。
合成或半合成聚合物可包括聚乙烯醇、羧乙烯聚合物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酸鈉、聚乳酸等等。
胺基酸類可包括甘氨酸、牛磺酸，聚胺基酸可以包括聚穀氨酸、聚天冬氨酸、聚甘氨酸、聚亮氨酸等等。
蛋白質可包括明膠或其他。此外，也包括殼多糖和脫乙醯殼多糖。
在這些載體和賦形劑中，特別優選的是蔗糖、麥芽糖、α-環糊精、β-環糊精、糊精、D-甘露醇、肌醇、乳糖、葡聚糖、甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙烯醇、普魯蘭等等。
除此之外，還可以有山梨酸；苯扎氯銨；鯨蠟基氯化吡啶鎓；氯化苄乙氧銨；對羥基苯甲酸酯類如對羥苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯等；阿拉伯膠；山梨醇；硬脂酸鎂；滑石粉；二氧化矽；微晶纖維素；澱粉；磷酸鈣；植物油；羧甲基纖維素；十二烷基硫酸鈉；水；乙醇；甘油；和糖漿。
表面活性劑的典型示例列於下文中。其中，單獨一種或兩種以上的這些表面活性劑的組合可加入到本發明的製劑中。
非離子型表面活性劑可包括脫水山梨醇脂肪酸酯，例如，脫水山梨醇單辛酸酯、脫水山梨醇單月桂酸酯、脫水山梨醇單棕櫚酸酯等等；以及脂肪酸甘油酯，例如甘油單辛酸酯、甘油單肉豆蔻酸酯、甘油單硬脂酸酯等等；以及脂肪酸聚甘油酯，如單硬脂酸十聚甘油酯(decaglycerylmonstearate)、二硬脂酸十聚甘油酯、單亞油酸十聚甘油酯等等；以及聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇三硬脂酸酯等等；以及聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四月桂酸酯等等；以及聚氧乙烯脂肪酸甘油酯，如聚氧乙烯單硬脂酸甘油酯；以及聚乙烯脂肪酸甘油酯，如聚氧乙烯二硬脂酸甘油酯；以及聚氧乙烯烷基醚，如聚氧乙烯月桂基醚；以及聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚，如聚氧乙烯聚氧丙二醇醚、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚等等；以及聚氧乙烯烷基苯基醚，如聚氧乙烯壬基苯基醚；以及聚氧乙烯蓖麻油類，如聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油；以及聚氧乙烯蜂蠟衍生物，例如聚氧乙烯山梨醇蜂蠟；以及聚氧乙烯羊毛脂類衍生物，例如聚氧乙烯羊毛酯；以及HLB值為6至18的聚氧乙烯脂肪酸醯胺，如聚氧乙烯硬脂醯胺。
陰離子表面活性劑可包括烷基硫酸(C10至C18)鹽，例如，鯨蠟基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、油基硫酸鈉等等；以及聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽，其中加入的環氧乙烷的平均摩爾數為2至4且烷基的碳數為10-18，例如聚氧乙烯月桂醚硫酸鈉；以及其中的烷基鏈長為8-18的烷基磺基琥珀酸酯鹽，例如月桂基磺基琥珀酸酯鈉。
天然表面活性劑可包括卵磷脂；甘油磷脂；鞘脂，如神經鞘脂；以及(C12-C18)脂肪酸蔗糖脂。
含硫還原劑可包括N-乙醯半胱氨酸、N-乙醯高半胱氨酸、硫辛酸、硫代乙醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、巰基乙酸及其鹽、硫代硫酸鈉、穀胱甘肽、含有巰基的硫代鏈烷酸(C1-C7)。
抗氧劑可包括異抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁基羥基苯甲醚、α-生育酚、乙酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、棕櫚酸L-抗壞血酸酯、硬脂酸L-抗壞血酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食酸子酸三戊酯、沒食酸子酸丙酯、以及螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)鈣二鈉、焦磷酸鈉、偏磷酸鈉等等。
對於本發明的藥物組合物，hPTH的含量約為0.01-20％，優選約為0.05-10％，需要時可加入有機酸。後者在使用前的濃度約為0.05-99.5％，優選約為0.1-99.0％。在需要時可加入藥物製備中常用的載體或賦形劑，或者在使用前以約0.01-99.5％存在。其它各種功能性組分也可在需要時加入，或者在使用前以約0.05-99.5％存在。
本發明的鼻內給藥的藥物組合物可以通過公知的方法製備。
例如，降低了乙酸含量的基於hPTH的藥物成分可用於藥物組合物中。或者，向乙酸含量降低的基於hPTH的藥物成分中，可加入在醫藥產品的製備中常用的載體或賦形劑、有機酸及其它各種功能性組分，所得的混合物可用作藥用組分。有機酸可代替乙酸加入，或者僅僅是加入。例如，向hPTH藥物成分中加入在製備藥物中常用的載體或賦形劑、有機酸、各種功能性組分，所得混合物在蒸餾水中一次溶解，將溶液冷凍乾燥，由此可得一種均一的組合物。
或者，將hPTH藥物成分和藥物製備中常用的載體或賦形劑在蒸餾水中一次溶解，之後向溶液中加入有機酸和各種功能性組分，將所得溶液冷凍乾燥，由此獲得一種均一的組合物。作為另一種改變形式，將hPTH藥物成分、有機酸以及各種功能性組分在蒸餾水中一次溶解，將溶液冷凍乾燥，按需將適宜量的凍幹混合物與藥物製備中常用的載體或賦形劑一起溶解，由此獲得一種均一的組合物。
本發明的藥物成分可以根據所需不同的給藥途徑製成各種劑型可製成適於向直腸、鼻、腔、口腔黏膜等施用的形式。本發明的用於鼻內給藥的藥物組合物優選製成適於鼻內使用的形式。
本發明的鼻內給藥的藥物組合物的優選實例可製成可在需要時(on-demand)溶解的形式，其中的凍幹部分含有本發明的凍幹的藥物組合物，並附帶有用於溶解前者的溶液部分。
用以促進吸收的有機酸如檸檬酸、己二酸或乙醇酸可以hPTH鹽的構成物、附著物或添加劑的形式存在。或者，有機酸可溶於溶解用的溶液部分中。
本發明的鼻內給藥的藥物組合物的給藥可通過公知方法實施。例如，用於鼻內給藥的藥物組合物可噴霧給藥組合物可置於一容器中；噴霧器與一噴嘴相連；將噴嘴尖端伸入鼻腔中；然後噴出藥物組合物。
本發明藥物組合物的劑量視疾病種類、患者年齡及體重、病情嚴重程度以及組合物給藥途徑而定。例如，如果經鼻給藥含有hPTH的組合物，可以每日一次或以按比例減少的劑量每日多次給藥，持續一段時間。hPTH(1-34)組合物的單次劑量優選在10-5000μg範圍內。在治療期間，應當插入一段稱為「洗除期」的時間段，然後可重新開始治療。
在實施例中使用的測試方法和裝置以以下描述為基礎，除非另有說明。
1、通過HPLC分析hPTH
使用反相HPLC測定組合物中被研究肽的含量，並檢測在組合物中是否有任何分解產物(副產物)，所用裝置和條件列於如下。儀器島津LC-9A體系柱YMC Protein-RP(4.6mmΦ×150mm)柱溫40℃洗脫劑0.1％三氟乙酸中的乙腈濃度在30分鐘內從25％線性變化至40％。流速1mL/分鐘檢測器UV(210nm)進樣量50μL2、乙酸的分析使用離子交換色譜測定凍幹組合物和透析溶液中的乙酸含量，所用條件列於如下。儀器島津LC-9A體系。柱島津IC-A1(4.6mmΦ×100mm)柱溫40℃洗脫劑0.84％鄰苯二甲酸水溶液與0.58％三羥甲基氨基甲烷水溶液以1∶1混合的混合物流速1.5mL/分鐘檢測器電導檢測器進樣量10μL3、質量分析在以下所列條件下使用儀器裝置測定hPTH、hPTH的分解產物(副產物)及其酶消化物的質量。儀器Finnigan MAT TSQMS離子源ESI檢測方式正性噴射電壓4.5kV毛細管溫度250℃流動相0.2％乙酸和甲醇(1∶1)混合物流速0.2mL/分鐘檢測範圍m/z550-8504、胺基酸測序hPTH分解產物(副產物)及其酶消化物的胺基酸序列可以通過以下儀器測定。儀器PerkinElmer477A型測序儀5、胺基酸組成分析hPTH及其分解產物(副產物)以及它們的酶消化物的胺基酸組成使用以下儀器測定。儀器日立L-8500型胺基酸分析儀6、樣品的保存(穩定性測試)測試樣品在以下條件下保存在貯藏器中。儀器LH-30-14，Nagano Science Co.Ltd。溫度設置1)40±1℃，2)60±1℃，3)80±2℃，7、冷凍乾燥儀器共和真空技術株式會社RL-903BS小瓶15mL玻璃小瓶參考實施例1hPTH(1-34)的製備(1)通過插入編碼含有Kex2蛋白酶或加工酶的切割位點(Lys-Arg)的接頭的DNA片段將編碼源自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的衍生物的DNA片斷和編碼hPTH(1-34)的DNA片斷相連接，由此獲得含有編碼hPTH(1-34)嵌合蛋白的基因的表達質粒pG117S4HPPH34(日本專利特開平9-29660)，將該表達質粒導入到大腸桿菌M25菌株的細胞中(W3110/ompTSugimura等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，第153卷，1988年，753-759頁)。將轉型的大腸桿菌M25株的細胞在20L培養池中的含有2％酵母提取物的培育基中培養。
持續培養直至細胞濃度到達OD660＝12。將回收的細胞在添加了1mMEDTA的10mM Tris-HCl緩衝液(pH8.2)中通過高壓均化器(Manton-Gaullin)碎成碎片，離心，洗滌，得到約625mL含有約100g填充了嵌合蛋白的包函體的混懸液。向250mL含40g包函體的混懸液中加入100mL 1M Tris-HCl(pH8.2)、50mL 5M NaCl、500mL去離子水以及900g尿素，混合物在30℃下攪拌以溶解包函體。
溶液用去離子水稀釋至5L，並向其中加入50mL 250mM CaCl2。然後，向溶液中加入Kex2-660直至其濃度到達20kU/mL或以上；Kex2-660中含有指定的胺基酸編號為1-660的胺基酸殘基(日本專利特開平10-229884)，是一種源於Kex2蛋白酶的衍生物。將混合物輕輕攪動2小時，hPTH(1-34)可從嵌合蛋白中切割下來。加入乙酸將反應液調整至pH6.4；之後用去離子水稀釋兩倍，使嵌合蛋白和β-半乳糖苷酶不與沉澱發生反應；將所得產物離心以獲得含6.7g hPTH(1-34)的上清液。向上清液中加入乙酸調節pH至5.0；將溶液置於已用10mM乙酸鈉平衡了的陽離子交換樹脂(Tosoh公司的SP Toyopearl)上，使hPTH(1-34)吸附於樹脂之上；樹脂用10mM乙酸鈉緩衝液洗滌；使用0.4M的NaCl獲得含6.0g hPTH(1-34)的級分。
向該級分中加入乙酸至3v/v％；將該溶液置於預先用3v/v％乙酸平衡了的低壓反相ODS(Soken ODS-W，綜研化學株式會社)柱上；使用30v/v％含有3v/v％乙酸的乙腈洗脫hPTH(1-34)。減壓濃縮含有hPTH(1-34)的洗脫液；產物置於反相HPLC柱(TSKgel10DS120T，尺寸為55mm×600mm，Tosoh公司生產)上；使溶於5v/v％乙酸的乙腈溶液以40mL/分鐘的流速流過柱子60分鐘，同時乙腈的濃度從16％線性變化至32％，以洗脫hPTH(1-34)。由此得到含有4g hPTH(1-34)的純化級分。
剩餘的60g包函體用相同方法處置，將從中得到的含5g hPTH(1-34)的純化級分與前者混合；減壓除去混合物中的乙腈；所得產物用5v/v％乙酸稀釋以使hPTH(1-34)濃度降至10mg/mL。在每一小瓶中放置15mL該溶液；將所有含此溶液的小瓶進行冷凍乾燥得到總共9g hPTH(1-34)(150mg×60小瓶)。
ESI-MS4117.7(理論值為4117.8)、用6N鹽酸水解後的胺基酸組成Asx-4.0(4)；Ser-2.6(3)；Glx-4.9(5)；Gly-1.0(1)；Val-3.0(3)，Met-2.0(2)；Ile-1.0(1)；Leu-5；Phe-1.1(1)；Lys-30(3)；His-3.0(3)；Arg-2.0(2)；Trp沒有檢測到(1)。參考實施例2hPTH(1-34)的製備(2)將與參考實施例1所使用的相似的活的微生物在200L的培養箱中培養。持續培養直至細胞濃度到達OD660＝160。將回收的細胞在添加了1mMEDTA的10mM Tris-HCl緩衝液(pH8.2)中通過高壓均化器(Manton-Gaullin)碎成碎片，離心，洗滌，獲得約10L含有約5kg填充了嵌合蛋白的包函體的混懸液。
向4.0L含有2kg包函體的混懸液中加入1.6L 1M Tris-HCl緩衝液(pH8.2)、0.8L 5M NaCl、15L去離子水以及13kg尿素，所得混合物在30℃下攪拌以使包函體溶解。
溶液用去離子水稀釋至80L，並向其中加入0.8mL 250mM CaCl2。然後，向此溶液中加入Kex2-660(日本專利特開平10-229884)直至其濃度達到10kU/mL或以上。將混合物輕輕攪拌1小時，使hPTH(1-34)從嵌合蛋白中切割下來。加入乙酸將反應溶液調節至pH6.3；然後將其用去離子水稀釋兩倍，使得嵌合蛋白與β-半乳糖苷酶不與沉澱發生反應；將所得產物加壓過濾得到含hPTH(1-34)的上清液。
向上清液中加入乙酸調節pH至5.0；將溶液置於已用10mM乙酸鈉緩衝液平衡了的陽離子交換樹脂柱上(5L)(Poros 50HS，PerSeptiveBiosystems，美國)，使hPTH(1-34)吸附於柱子上；將柱子用10mM乙酸鈉緩衝液洗滌；使用0.4M的NaCl獲得含hPTH(1-34)的級分。向該級分中加入乙酸至3v/v％；將該溶液置於預先用3v/v％乙酸平衡了的低壓反相ODS(Soken ODS-W，綜研化學株式會社)柱(5L)上；使用30v/v％含有3v/v％乙酸的乙腈洗脫hPTH(1-34)。
減壓濃縮含有hPTH(1-34)的洗脫液，產物通過0.22μm濾器過濾；將濾液置於反相HPLC柱(TSK ODS 80Ts 20μm，105mmID×550mm，Tosoh公司)；在存在3v/v％乙酸的情況下使用濃度梯度變化的乙腈以洗脫hPTH(1-34)。合併所獲得的多份洗脫液，減壓蒸餾除去溶液中的乙腈，獲得10.4L含有70g hPTH(1-34)的純度為99.6％的hPTH(1-34)濃縮液。在剩餘的3kg包函體中，將2kg用相同的純化方法操作，得到hPTH(1-34)純度為99.6％的11.6L hPTH(1-34)濃縮液。參考實施例3hPTH(1-34)的製備通過插入編碼含有Kex2蛋白酶或加工酶的切割位點(Lys-Arg)的接頭的DNA片段將編碼源自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的衍生物的DNA片斷和編碼hPTH(1-84)的DNA片斷相連接，由此獲得含有編碼hPTH(1-84)嵌合蛋白的基因的表達質粒pGP#19(日本專利特開平9-29660)，將該表達質粒導入到大腸桿菌M25菌株的細胞中。將轉型的大腸桿菌M25株的細胞在3L的培養池中於37℃下培養。持續培養直至培養溶液的濁度(OD660)變為OD660＝1。之後加入異丙基β-硫代半乳糖苷(IPTG)至其濃度為1.0mM。
之後繼續培養4小時。通過離心回收細胞；然後將所得細胞混懸於TE(pH值8.0的10mM Tris和1mM EDTA溶液)之中。細胞通過FrenchPress碎成碎片，反覆離心並重新混懸，洗滌，獲得包函體。將含有此包函體的混懸液溶解於含有8.0M尿素和10mM Tris的溶液(pH8.0)中；離心；所得上清液置於Toyopearl柱(Toso公司)上，使用濃度梯度為0M至0.4M的NaCl洗脫富集的hPTH(1-84)。此溶有富集的包函體的溶液通過限度為10000MW的超濾法進一步濃縮。稀釋所得產物獲得含有50mM pH6.8的BisTris、1.0mM的CaCl2以及5mg/mL嵌合蛋白的溶液。加入Kex2-660至其濃度為2kU/mL，並在30℃下反應1小時以從中切割出hPTH(1-84)。
加入乙酸調整反應液pH值為5.0；之後用去離子水稀釋兩倍；使得其中的嵌合蛋白和β-半乳糖苷酶衍生物不與沉澱發生反應；將產物離心獲得含有hPTH(1-84)的上清液。向上清液中加入乙酸至其濃度為3v/v％；將溶液置於預先用3v/v％乙酸平衡了的TSK凝膠ODS 80 Ts(21mm ID×250mm，Tosoh公司)上進行純化。將含有98％或以上的hPTH(1-84)的級分合併；除去所得溶液中的溶劑；將殘餘物冷凍乾燥後得到500mghPTH(1-84)。該物質的分子量和胺基酸組成如下所示。在這些數據的基礎上，可將此物質確定為hPTH(1-84)。
ESI-MS9424.7(理論值為9424.7)。用6N鹽酸水解後的胺基酸組成Asx-10.1(10)；Thr-1.1(1)；Ser-6.3(7)；Glx-11.0(11)；Pro-2.9(3)；Gly-4.1(4)；Ala-7.0(7)；Val-8.0(8)，Met-1.9(2)；Ile-1.0(1)；Leu-10；Phe-1.0(1)；Lys-8.9(9)；His-3.9(4)；Arg-5.0(5)；Trp沒有檢測到(1)。
實施例1、除去hPTH(1-34)中的乙酸(1)(1)將相當於150g參考實施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解於30mL蒸餾水中，得到5mg/mL的hPTH(1-34)水溶液(pH4.7)。該溶液用包著電滲析膜AC-130-10(旭化成工業株式會社)的GI微型酸透析儀(microacilyzer)(旭化成工業株式會社)對蒸餾水(100mL)進行透析。連續透析以除去乙酸直至透析液的pH值為5.0。將含有6.8％乙酸的濃縮溶液冷凍乾燥後，得到相當於約150mg hPTH(1-34)的乾燥物質，其中的乙酸含量為4.8％。
(2)將相當於150g參考實施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解於30mL蒸餾水中，得到5mg/mL的hPTH(1-34)水溶液(pH4.7)。將該溶液作如實施例1中所述的電滲析處理持續透析以除去乙酸，直至透析液的pH值變為5.5。將含有4.6％乙酸的濃縮溶液冷凍乾燥後，得到相當於約150mghPTH(1-34)的乾燥物質，其中的乙酸含量為3.8％。
(3)將相當於150g參考實施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解於30mL蒸餾水中，得到5mg/mL的hPTH(1-34)水溶液(pH4.7)。將該溶液作如實施例1中所述的電滲析處理持續透析以除去乙酸，直至透析液的pH值變為5.9。將含有3.1％乙酸的濃縮溶液冷凍乾燥後，得到相當於約150mghPTH(1-34)的乾燥物質，其中的乙酸含量為2.9％。
(4)將相當於150g參考實施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解於30mL蒸餾水中，得到5mg/mL的hPTH(1-34)水溶液(pH4.7)。將該溶液作如實施例1中所述的電滲析處理持續透析以除去乙酸，直至透析液的pH值變為7.0。將含有1.6％乙酸的濃縮溶液冷凍乾燥後，得到相當於約150mghPTH(1-34)的乾燥物質，其中的乙酸含量為1.6％。
從上述結果可以得出，乙酸的含量降低的同時，冷凍乾燥導致的乙酸含量的遞減將變少；並且在乙酸含量降低的同時，乙酸含量的分級遞減也將減少。因此，hPTH組份中乙酸含量的減少將有利於製備按常規方法難以獲得的含有特定乙酸含量的hPTH藥物成分。實施例2除去hPTH(1-34)中的乙酸(2)向含有相當於約150mg參考實施例2中得到的hPTH(1-34)的配製品的溶液中加入5N NaOH至pH為5.5。將四分之一的溶液上到預先用5v/v％乙腈水溶液平衡了的低壓反相ODS(Soken ODS-W(800mL)綜研化學株式會社)柱上，使hPTH(1-34)吸附於柱子上。使4L 5v/v％的乙腈水溶液流過柱子以洗脫乙酸鈉；之後使50v/v％的乙腈水溶液流過柱子以洗脫hPTH(1-34)。對四份溶液中的每一份重複進行該項操作，將四份溶液中富含hPTH(1-34)的溶液合併得到8.2L幾乎不含乙酸而含有122.5ghPTH(1-34)的級分(乙酸含量為hPTH(1-34)的1.13％)。
向此級分中加入蒸餾水得到10mg/mL的hPTH(1-34)溶液，向此溶液中加入2.3g乙酸以使所得溶液含有122.5g的hPTH(1-34)和3％的乙酸；充分攪拌所得混合物。所得溶液分裝入小瓶中，每一小瓶含有150mg的hPTH(1-34)；將小瓶中的hPTH(1-34)溶液冷凍乾燥，得到的hPTH(1-34)中含有2.1％乙酸。實施例3除去hPTH(1-34)中的乙酸(3)(1)將相當於300mg參考實施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解於30mL蒸餾水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。將此含有9.5％乙酸的溶液(pH4.7)置於三個玻璃小瓶之中，每瓶2mL；將其置於內壓保持在0.13mBar或以下的FZ-6冷凍乾燥機(Laboconco公司)之中；將其進行初步乾燥(箱內溫度，-20℃，12小時)與二次乾燥(箱內溫度，25℃，48小時)以完成冷凍乾燥操作。二次乾燥完成後，向冷凍乾燥室內衝入氮氣；並將小瓶自動帽封。向每一小瓶中注入2mL蒸餾水，所得溶液通過離子交換HPLC測定其中的乙酸含量。所得結果示於表1中。
(2)將相當於300mg參考實施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解於30mL蒸餾水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。將溶液(pH4.7)用包著電滲析膜AC-130-10(旭化成工業株式會社)的微型酸透析儀(旭化成工業株式會社)進行電滲析。持續透析以除去乙酸直至透析液的pH值變為5.0(進行透析的溶液中乙酸含量為7.3％)。將除去乙酸的溶液置於三個玻璃小瓶中，每瓶2mL；並將其按照實施例(1)的描述冷凍乾燥；通過離子交換HPLC測定每一樣品中的乙酸含量。所得結果示於表1中。
(3)將相當於300mg參考實施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解於30mL蒸餾水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。將溶液(pH4.7)用包著電滲析膜AC-130-10(旭化成工業株式會社)的微型酸透析儀(旭化成工業株式會社)進行電滲析。持續透析以除去乙酸直至透析液的pH值變為5.5(進行透析的溶液中乙酸含量為4.6％)。將除去乙酸的溶液置於三個玻璃小瓶中，每瓶2mL；並將其按照實施例(1)的描述冷凍乾燥；通過離子交換HPLC測定每一樣品中的乙酸含量。所得結果示於表1中。
(4)將相當於300mg參考實施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解於30mL蒸餾水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。將溶液(pH4.7)用包著電滲析膜AC-130-10(旭化成工業株式會社)的微型酸透析儀(旭化成工業株式會社)進行電滲析。持續透析以除去乙酸直至透析液的pH值變為6.3(進行透析的溶液中乙酸含量為2.0％)。將除去乙酸的溶液置於三個玻璃小瓶中，每瓶2mL；並將其按照實施例(1)的描述冷凍乾燥；通過離子交換HPLC測定每一樣品中的乙酸含量。所得結果示於表1中。
(5)將相當於300mg參考實施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解於30mL蒸餾水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。將溶液(pH4.7)用包著電滲析膜AC-130-10(旭化成工業株式會社)的微型酸透析儀(旭化成工業株式會社)進行電滲析。持續透析以除去乙酸直至透析液的pH值變為7.0(進行透析的溶液中乙酸含量為1.1％)。將除去乙酸的溶液置於三個玻璃小瓶中，每瓶2mL；並將其按照實施例(1)的描述冷凍乾燥；通過離子交換HPLC測定每一樣品中的乙酸含量。所得結果示於表1中。
(6)將相當於300mg參考實施例1中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解於30mL蒸餾水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。將溶液(pH4.7)用包著電滲析膜AC-130-10(旭化成工業株式會社)的微型酸透析儀(旭化成工業株式會社)進行電滲析。持續透析以除去乙酸直至透析液的pH值變為7.6(進行透析的溶液中乙酸含量為0.5％)。將除去乙酸的溶液置於三個玻璃小瓶中，每瓶2mL；並將其按照實施例(1)的描述冷凍乾燥；通過離子交換HPLC測定每一樣品中的乙酸含量。所得結果示於表1中。
從表1中可明顯看出，隨著樣品在冷凍乾燥前的乙酸含量的降低，冷凍乾燥操作中乙酸含量的遞減將變小，並且隨著樣品在冷凍乾燥前的乙酸含量的降低，凍幹後不同樣品或批次間乙酸含量的變化也變小。因此，證明了低乙酸含量的hPTH有利於製備使用常規工藝難以獲得的具有特定乙酸含量的藥用hPTH成分。
表1冷凍乾燥引起的乙酸含量的變化結果
實施例4除去hPTH(1-34)中的乙酸(4)(1)將與參考實施例1中使用的活體微生物相似的微生物在200L培養箱中培養。將細胞破碎成碎片，離心，洗滌；得到4.8kg填充有嵌合蛋白的包函體。將其中的2.4g使用參考實施例2中的Kex2-660消化以獲得hPTH(1-34)。產物通過陽離子交換色譜純化，通過反相ODS色譜脫去鹽分；最終通過反相HPLC純化。然後，按照實施例2的方法，向純化的級分中加入5N氫氧化鈉至pH5.5；所得溶液上到低壓反相ODS柱上。使5v/v％的乙腈水溶液流過柱子以除去乙酸鈉；然後使50v/v％的乙腈水溶液流過柱子以洗脫hPTH(1-34)。由此得到了5.4L含有58g hPTH(1-34)的溶液(hPTH(1-34)中含有1.2％的乙酸)。向此溶液中加入1.0g乙酸，從而使溶液中含有58g hPTH(1-34)和3％的乙酸；充分攪拌該混合物。溶液分裝入小瓶中，每一小瓶中含有150mg hPTH(1-34)；將所有小瓶中的hPTH(1-34)溶液進行冷凍乾燥，得到57.8g hPTH(1-34)，乙酸的含量為2.5％(385個小瓶)。
(2)將相當於150mg實施例(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品溶解於3mL三氟乙醇中；加入30mL乙醚進行沉澱。所得的粉末在含氫氧化鈉小球的乾燥器內減壓乾燥24小時，得到130mg的hPTH(1-34)，其中的乙酸含量為2.0％。
(3)向含有相當於150mg實施例(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿著小瓶內壁加入1.53μL乙酸，注意不要使注射器與hPTH(1-34)相接觸。將小瓶置於80℃下5分鐘將乙酸汽化；將小瓶用渦流混合器攪動，並將小瓶中的hPTH(1-34)製成極細的粉末，由此得到乙酸含量為3.6％的hPTH(1-34)配製品。
(4)向含有相當於150mg實施例(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿著小瓶內壁加入3.78μL乙酸，注意不要使注射器與hPTH(1-34)相接觸。將小瓶置於80℃下5分鐘將乙酸汽化；將小瓶用渦流混合器攪動，並將小瓶中的hPTH(1-34)製成極細的粉末，由此得到乙酸含量為5.1％的hPTH(1-34)配製品。
(5)向含有相當於150mg實施例(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿著小瓶內壁加入5.28μL乙酸，注意不要使注射器與hPTH(1-34)相接觸。將小瓶置於80℃下5分鐘將乙酸汽化；將小瓶用渦流混合器攪動，並將小瓶中的hPTH(1-34)製成極細的粉末，由此得到乙酸含量為6.2％的hPTH(1-34)配製品。參考實施例4(1)向含有相當於150mg實施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿著小瓶內壁加入7.23μL乙酸，注意不要使注射器與hPTH(1-34)相接觸。將小瓶置於80℃下5分鐘將乙酸汽化；將小瓶用渦流混合器攪動，並將小瓶中的hPTH(1-34)製成極細的粉末，由此得到乙酸含量為7.5％的hPTH(1-34)配製品。
(2)向含有相當於150mg實施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿著小瓶內壁加入9.48μL乙酸，注意不要使注射器與hPTH(1-34)相接觸。將小瓶置於80℃下5分鐘將乙酸汽化；將小瓶用渦流混合器攪動，並將小瓶中的hPTH(1-34)製成極細的粉末，由此得到乙酸含量為9.1％的hPTH(1-34)配製品。
(3)向含有相當於150mg實施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿著小瓶內壁加入10.53μL乙酸，注意不要使注射器與hPTH(1-34)相接觸。將小瓶置於80℃下5分鐘將乙酸汽化；將小瓶用渦流混合器攪動，並將小瓶中的hPTH(1-34)製成極細的粉末，由此得到乙酸含量為7.5％的hPTH(1-34)配製品。
(4)向含有相當於150mg實施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿著小瓶內壁加入14.28μL乙酸，注意不要使注射器與hPTH(1-34)相接觸。將小瓶置於80℃下5分鐘將乙酸汽化；將小瓶用渦流混合器攪動，並將小瓶中的hPTH(1-34)製成極細的粉末，由此得到乙酸含量為12.5％的hPTH(1-34)配製品。
(5)向含有相當於150mg實施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿著小瓶內壁加入16μL乙酸，注意不要使注射器與hPTH(1-34)相接觸。將小瓶置於80℃下5分鐘將乙酸汽化；將小瓶用渦流混合器攪動，並將小瓶中的hPTH(1-34)製成極細的粉末，由此得到乙酸含量為13.7％的hPTH(1-34)配製品。
(6)向含有相當於150mg實施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿著小瓶內壁加入22.6μL乙酸，注意不要使注射器與hPTH(1-34)相接觸。將小瓶置於80℃下5分鐘將乙酸汽化；將小瓶用渦流混合器攪動，並將小瓶中的hPTH(1-34)製成極細的粉末，由此得到乙酸含量為18.3％的hPTH(1-34)配製品。
(7)向含有相當於150mg實施例4(1)中得到的hPTH(1-34)的配置品的小瓶中，用一微型注射器沿著小瓶內壁加入100μL乙酸，注意不要使注射器與hPTH(1-34)相接觸。將小瓶置於80℃下5分鐘將乙酸汽化；將小瓶用渦流混合器攪動，並將小瓶中的hPTH(1-34)製成極細的粉末，由此得到乙酸含量為72.5％的hPTH(1-34)配製品。實施例5除去hPTH(1-84)中的乙酸(1)將相當於50mg參考實施例3中製備的乙酸含量為5.4％的hPTH(1-84)的配製品溶解於10mL蒸餾水中。得到5mg/mL的hPTH(1-84)水溶液(pH4.7)。將此溶液用包著電滲析膜AC-130-10(旭化成工業株式會社)的微型酸透析儀(旭化成工業株式會社)在室溫下對100mL蒸餾水進行透析。持續透析以除去乙酸，直至透析溶液中的pH值變為5.0。將富集的溶液冷凍乾燥後，得到相當於約50mg hPTH(1-84)的配製品，其中的乙酸含量為3.9％。
(2)將相當於50mg參考實施例3中製備的乙酸含量為5.4％的hPTH(1-84)的配製品溶解於10mL蒸餾水中。得到5mg/mL的hPTH(1-84)水溶液(pH4.7)。將此溶液按照與實施例(1)相同的方法進行電滲析。持續透析以除去乙酸，直至透析溶液中的pH值變為6.0。將富集的溶液冷凍乾燥後，得到相當於約50mg hPTH(1-84)的配製品，其中的乙酸含量為2.5％。
(3)將相當於50mg參考實施例3中製備的乙酸含量為5.4％的hPTH(1-84)的配製品溶解於10mL蒸餾水中。得到5mg/mL的hPTH(1-84)水溶液(pH4.7)。將此溶液按照與實施例1相同的方法進行電滲析。持續透析以除去乙酸，直至透析溶液中的pH值變為7.0。將富集的溶液冷凍乾燥後，得到相當於約50mg hPTH(1-84)的配製品，其中的乙酸含量為1.3％。
(4)將相當於50mg參考實施例3中製備的乙酸含量為5.4％的hPTH(1-84)的配製品溶解於10mL蒸餾水中。得到5mg/mL的hPTH(1-84)水溶液(pH4.7)。將此溶液按照與實施例1相同的方法進行電滲析。持續透析以除去乙酸，直至透析溶液中的pH值變為8.0。將富集的溶液冷凍乾燥後，得到相當於約50mg hPTH(1-84)的配製品，其中的乙酸含量為0.9％。實施例6除去hPTH(1-84)中的乙酸(2)(1)將相當於100mg參考實施例3中製備的含有5.4％乙酸的hPTH(1-84)的配製品溶解於500μL三氟乙醇中；加入20mL乙醚進行沉澱。通過過濾回收沉澱物；產物在含有氫氧化鈉小球的乾燥器中減壓乾燥24小時，得到相當於約90mg hPTH(1-84)的乾燥物質，乙酸含量為1.6％。
(2)精確稱量5.49mg實施例6(1)中的乾燥物質，置於5mL小瓶中；用微型注射器加入0.3μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量為2.2％的配製品。
(3)精確稱量5.58mg實施例6(1)中的乾燥物質，置於5mL小瓶中；用微型注射器加入0.6μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量為2.7％的配製品。
(4)精確稱量4.96mg實施例6(1)中的乾燥物質，置於5mL小瓶中；用微型注射器加入1.0μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量為3.8％的配製品。參考實施例5(1)精確稱量5.05mg實施例6(1)中的乾燥物質，置於5mL小瓶中；用微型注射器加入1.7μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量為5.2％的配製品。
(2)精確稱量5.59mg實施例6(1)中的乾燥物質，置於5mL小瓶中；用微型注射器加入2.5μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量為6.4％的配製品。
(3)精確稱量5.01mg實施例6(1)中的乾燥物質，置於5mL小瓶中；用微型注射器加入3.0μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量為8.0％的配製品。
(4)精確稱量5.48mg實施例6(1)中的乾燥物質，置於5mL小瓶中；用微型注射器加入4.4μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量為10.2％的配製品。
(5)精確稱量5.47mg實施例6(1)中的乾燥物質，置於5mL小瓶中；用微型注射器加入5.5μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量為12.3％的配製品。
(6)精確稱量5.10mg實施例6(1)中的乾燥物質，置於5mL小瓶中；用微型注射器加入10.2μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量為22.9％的配製品。
(7)精確稱量5.53mg實施例6(1)中的乾燥物質，置於5mL小瓶中；用微型注射器加入16.6μL的10vol％的乙酸/二氯甲烷，得到乙酸含量為33.6％的配製品。實驗1hPTH(1-34)的穩定性(1)測定除去了以hPTH鹽的組成部分或者以附著物形式存在的乙酸後的hPTH配製品的穩定性。
將相當於約150mg參考實施例1中製備的乙酸含量為9.5％的hPTH(1-34)的配製品置於玻璃小瓶中並用蓋子封口，在LH-30-14儲藏庫(Nagano Science Co.)中，在40±1℃下儲存6個月。將儲存之前的部分小瓶和剩餘的儲存後的小瓶進行反相HPLC，由此分離出儲存前後的分解產物(副產物)並對其進行結構分析。結果示於表2中。
儲存後樣品的反相HPLC譜圖示於

圖1中。高的峰代表hPTH(1-34)，其後有三個峰(保留時間為13至17分鐘)，將其標記為B、C和D。如表2所示，峰B的面積％為3.9％，峰C為6.9％，峰D為3.0％。總計為13.8％，它們是造成產品變質的主要原因。用結構分析法確定各個峰的化合物，結果表明B峰代表[Nε-乙醯基-Lys13]-hPTH(1-34)與[Nε-乙醯基-Lys26]-hPTH(1-34)的混合物，C峰代表[Nα-乙醯基-Ser1]-hPTH(1-34)，D峰代表[Nε-乙醯基-Lys27]-hPTH(1-34)。
然後，按照上述相同的方法研究實施例1(3)中乙酸含量為2.9％的hPTH(1-34)配製品的穩定性。
將相當於150mg乙酸含量為2.9％的hPTH(1-34)的配製品置於玻璃小瓶中並用蓋子密封，在LH-30-14儲藏庫(Nagano Science Co.)中，在40±1℃下儲存6個月。將儲存之前的部分小瓶和剩餘的儲存後的小瓶進行反相HPLC，由此分離出儲存前後的分解產物(副產物)並對其進行結構分析。結果示於表3中。
儲存後樣品的反相HPLC譜圖示於圖2中。從圖2中可明顯看出，與乙酸含量為9.5％的hPTH(1-34)相比，峰B、C、D的面積都有所下降。峰B、C、D的總面積為0.2％，與乙酸含量為9.5％的hPTH(1-34)中所觀察到的對應值相似。儲存後的峰面積的總值為3.6％，遠低於在乙酸含量為9.5％的hPTH(1-34)中所觀察到的對應值(13.8％)。
以上證明了乙醯基體是從hPTH中衍生而來的主要分解產物，因此降低以hPTH(1-34)鹽的組成部分形式和附著物形式存在的乙酸的含量將改善hPTH的穩定性。即，降低hPTH配製品中的乙酸含量將有利於製備具有優良穩定性的基於hPTH的藥物成分。
表2hPTH(1-34)的穩定性(乙酸含量9.5％，在40℃下儲存6個月)
*峰B代表混合物表3hPTH(1-34)的穩定性(乙酸含量2.9％，在40℃下儲存6個月)
*峰B代表混合物實驗2hPTH(1-34)的穩定性(2)將實施例4和參考實施例4中得到的各自的乙酸含量如實施例4和參考實施例4所述的hPTH(1-34)配製品在80℃下保存15小時；向各配製品中用注射器加入15mL蒸餾水；並在儲存前後對每一配製品的分解產物(副產品)的含量進行測定。所得結果示於表4中。將儲存後的每一hPTH(1-34)配製品中的乙醯基體(B、C、D)含量作為其乙酸含量的函數作圖，示於圖3中。
從表4和圖3中可明顯看出，伴隨著乙酸含量的降低，衍生自乙醯基體的分解產物B、C和D也下降。
將hPTH(1-34)配製品的純度作為hPTH(1-34)乙酸含量的函數作圖，示於圖4中。從圖4中可明顯看出，曲線呈S型，在化學當量(乙酸含量等於約7.3％)處有偏差點，如果將乙酸含量保持在化學當量以下，產品的穩定性將大大提高。
即，hPTH(1-34)配製品中乙酸含量的降低將有利於製備具有優良穩定性的基於hPTH的藥物成分。
表4hPTH(1-34)的穩定性(在80℃下儲存15個小時)
ND未檢測到*在儲存後為液態X1[Met(O)8-hPTH(1-34)X2[Met(O)18-hPTH(1-34)B[Nε-AcLys18]-hPTH(1-34)與[Nε-AcLys26]-hPTH(1-34)的混合物C[Nα-AcSer1]-hPTH(1-34)D[Nε-AcLys27]-hPTH(1-34)試驗3hPTH(1-84)的穩定性將實施例6和參考實施例5中得到的各自的乙酸含量如實施例6和參考實施例5所述的hPTH(1-84)配製品在80℃下保存15小時；讓每一配製品在室溫下放置1分鐘以使二氯甲烷氣化，之後密封。將含有不同乙酸含量的hPTH(1-84)配製品在80℃下儲存15小時；用注射器向每一配製品中加入1mL蒸餾水以進行溶解；並在儲存前後對每一配製品的分解產物(副產品)的含量進行測定。結果示於表5中。儲存後的樣品的反相HPLC譜圖示於圖5中。另外，將儲存後的每一hPTH(1-84)配製品中的分解產物(副產物)含量作為其乙酸含量的函數作圖，示於圖6中。
如圖5所示，儲存的結果是產生了標記為R1至R6的分解產物(副產S物)。從表5和圖6中證實，除了標記為R5之外的其它分解產物均以乙酸含量的函數形式增加。
將hPTH(1-84)配製品儲存後的純度作為乙酸含量的函數作圖，示於圖7中。hPTH(1-84)配製品的純度隨著其乙酸含量的降低而增加，並當乙酸含量降至化學當量(約4.5％)以下時急速增加。上述結果顯示儘管hPTH(1-84)配製品含有某些分解產物其含量不依賴於與其共存的乙酸，但是大多數的分解產物與以hPTH(1-84)鹽的組成部分形式與附著物形式存在的乙酸密切相關。即，降低hPTH配製品中的乙酸含量將有利於製備具有優良穩定性的hPTH藥物成分。
表5hPTH(1-84)的穩定性(在80℃下儲存15個小時)
ND未檢測到實驗4感覺測試(1)對於基於hPTH的藥物成分，通過將其施用於鼻腔內來評估其使用感。
將參考實施例1中製備的hPTH(1-34)配製品溶於0.6w/v％檸檬酸水溶液或者溶於水中達到10mg/mL；將所得溶液置於螺口玻璃瓶中；在玻璃瓶上接上一個噴嘴(50μL)(Valois公司)；將50μL溶液噴於鼻腔內；評估由鼻腔噴入而引起的氣味和刺激(測試者為12位健康正常的成年男子)。根據測試人的嗅覺將氣味分為「有酸性氣味」、「有輕微酸性氣味」、「檢測到輕微氣味」、「未檢測到氣味」四個級別。刺激分為「疼痛刺激」、「強烈刺激」、「微弱刺激」、「極微弱刺激」四個級別。然後，根據等級給氣味和刺激打分。使用生理鹽水作為對照。所得結果示於表6中。
如表6中明顯可見，溶解於檸檬酸水溶液中的hPTH(1-34)配製品以及hPTH(1-34)配製品的水溶液都引起強烈的酸性氣味，讓測試者感覺不舒服。
然後，製備不同有機酸的水溶液，以判斷導致配製品在施用於鼻腔時產生氣味和刺激的決定因素。所使用的有機酸包括乙酸、檸檬酸以及酒石酸；草酸、馬來酸、鄰苯二甲酸、抗壞血酸、己二酸以及乙醇酸。
配製0.1v/v％、0.2v/v％、0.3v/v％和0.6v/v％的乙酸水溶液，以及0.6w/v的檸檬酸、酒石酸、草酸、馬來酸、鄰苯二甲酸、抗壞血酸、己二酸以及乙醇酸的水溶液。將溶液噴入鼻腔；用上述同樣的方法(測試者為四個健康正常的成年男子)評估氣味和刺激。所得結果示於表6中。從表6中可明顯看出，0.3v/v或更高濃度的乙酸水溶液可產生強烈的酸性氣味，並且當乙酸濃度為0.3v/v或更高時，刺激作用也迅速增加。
另一方面，其它有機酸的水溶液不會引起任何可檢測到的氣味，並且由檸檬酸水溶液和抗壞血酸、己二酸和乙醇酸水溶液引起的鼻腔內的刺激與生理鹽水引起的刺激是相同的。
參考實施例1中製得的乙酸含量為9.5％的hPTH(1-34)配製品，其中所含的乙酸含量與此測試中所用的hPTH(1-34)溶液和0.1v/v％乙酸水溶液的對應值大致相同。
從上述結果可以看出，既然0.6w/v％檸檬酸水溶液本身不產生任何可檢測到的氣味，則溶解於0.6w/v％檸檬酸水溶液中的hPTH配製品所產生的氣味應歸因於配製品中以hPTH(1-34)鹽的組成部分形式或鹽的附著物形式存在的乙酸，即便hPTH配製品中所含的乙酸如果以水溶液的形式存在的話，即，與水相結合的話，不會引起任意可檢測到的氣味。
將實施例1(3)中乙酸含量為2.9％的hPTH(1-34)配製品溶解於0.4w/v檸檬酸水溶液中，濃度為5mg/mL。按照上文同樣的方法，將測試溶液施用於鼻腔中，評估其引起的氣味和刺激(測試者為12個健康正常的成年男子)。所得結果示於表6中。從表6在可明顯看出，配製品中乙酸含量的降低將抑制配製品的氣味和刺激，因此，乙酸含量降低了的配製品可以成為在製備實際使用的藥物組合物時能保證具有優良使用感的藥物成分。
表6hPTH(1-34)和各種有機酸的水溶液的刺激性和氣味
++++疼痛刺激+++強烈刺激++微弱刺激+極微弱刺激*1溶於0.6w/v％檸檬酸水溶液的10mg/mL hPTH(1-34)溶液(乙酸含量為9.5％)
*210mg/mL hPTH(1-34)水溶液(乙酸含量為9.5％)*3溶於0.4w/v檸檬酸水溶液的5mg/mL hPTH(1-34)溶液(乙酸含量為2.9％)實驗5感覺測試(2)(1)測試液的製備將相當於300mg參考實施例1中製得的乙酸含量為9.55％的hPTH(1-34)的配製品溶解於30mL蒸餾水中，得到10mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。將該溶液用包裹著AC-130-10(旭化成工業株式會社)的微型酸透析儀(旭化成工業株式會社)進行電滲析以除去乙酸直至透析液的pH值為5.0(乙酸含量為7.3％)。由此得到除去了相當多的乙酸的hPTH(1-34)水溶液。
對部分hPTH(1-34)的水溶液進行相同的電滲析直至達到pH6.0(乙酸含量2.9％)，得到除去了相當多的乙酸的hPTH(1-34)水溶液。對相同的hPTH(1-34)水溶液進行相同處理直至達到pH7.6(乙酸含量0.5％)，得到除去了大量乙酸的hPTH(1-34)水溶液。
(2)感覺測試向按照此測試實施例(1)中製備的1.5mL每一測試液中加入1.5mL含有270mg精製蔗糖、12mg檸檬酸以及0.3mg苯扎氯銨的水溶液，將該混合物作為用於鼻內使用的測試液。將溶液置於帶塞子的螺旋型玻璃小瓶中；在小瓶上接一個噴嘴(50μL)(Valois)用於測試(測試者是5個健康正常的成年男子)。氣味分級為「A幾乎未檢測到任何乙酸性氣味」、「B檢測到微弱的乙酸性氣味」、「C檢測到強烈的乙酸性氣味」。刺激分級為「A無刺激感」、「B有或多或少的刺激感覺」、 「C強烈的刺激感覺」。然後，按照其分級對氣味和刺激進行打分。所得結果示於表7中。
從表7中可明顯看出，配製品中乙酸含量的降低將抑制配製品的氣味和刺激性，因此，乙酸含量降低了的配製品在用作製備實際使用的藥物組合物的藥物成分時，能保證具有長期使用的優良使用感。
表7不同乙酸含量的hPTH(1-34)藥物產品的感覺測試
氣味A幾乎未檢測到任何乙酸性氣味B檢測到微弱的乙酸性氣味C檢測到強烈的乙酸性氣味刺激A無刺激感B有或多或少的刺激感覺C強烈的刺激感覺實驗6不同有機酸對於hPTH配製品穩定性的影響可通過上文所述的電滲析法除去hPTH配製品中的乙酸，也可以將乙酸換成其它的有機酸。
如果hPTH配製品中的乙酸組分被其它的有機酸所代替，則需要評估新引入的有機酸對hPTH配製品的穩定性產生的影響。
在此項測試中使用的有機酸包括公知的用作吸收促進劑的己二酸、檸檬酸和乙醇酸，在實施例4中發現它們能提供良好的使用感。加入有機酸以替代乙酸與hPTH相結合，其加入的濃度要與乙酸的化學當量相等。一個hPTH(1-34)分子含有9個鹼性胺基酸殘基和4個酸性胺基酸殘基，即，一個hPTH(1-34)分子具有5個可與酸結合成鹽的正電荷。由此，1mol的hPTH(1-34)(分子量4117.8)可與5/2mol己二酸(分子量146.14)、5/3mol檸檬酸(分子量192.13)、5mol乙醇酸(分子量76.05)結合成鹽。向所測試的hPTH配製品中加入己二酸、檸檬酸或乙醇酸，以滿足上述各摩爾比。
使用實施例1(3)中獲得的乙酸含量為2.9％的hPTH(1-34)配製品來製備5mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。
向2mL該溶液(10mg或2.43μmol的hPTH(1-34))中加入888μg己二酸(2.43×5/2μmol)、778μg檸檬酸(2.43×5/3μmol)或924μg乙醇酸(2.43×5μmol)。將每份溶液用蒸餾水調節至所得溶液的肽含量為1mg/mL。將溶液凍幹，得到含有10mg hPTH(1-34)的凍幹樣品。按照此方法製備的樣品，其中的一些進行反相HPLC處理，得到hPTH儲存前的純度；其餘的則在60℃下儲存3周；然後將其進行同樣的反相HPLC處理，得到儲存後的hPTH純度；比較儲存前和儲存後的純度值以評估hPTH配製品的穩定性。用實施例1(3)中乙酸含量為2.9％的hPTH(1-34)配製品作為對照。所得結果示於表8中。
乙酸含量為2.9％的hPTH配製品的儲存後的純度為92.7％，在儲存前加入了己二酸、檸檬酸和乙醇酸的相同配製品在儲存後的純度值分別為92.0、93.9和90.3％。結果表明加入了己二酸、檸檬酸和乙醇酸的hPTH藥物成分非常穩定，並可提供與以hPTH鹽的組成部分形式和附著物形式存在的乙酸的含量降低了的hPTH藥物成分相同的優良使用感。
同時還表明用某種有機酸替代存在於hPTH配製品中以鹽的組成部分或附著物形式存在的乙酸，可作為與乙酸含量降低了的hPTH配製品相似的藥物成分使用。其還進一步的表明，如果將該高穩定性且能保證優良使用感的成分製成藥物組合物，其還可與為改善成分的吸收而加入的有機酸相容。
表8各種有機酸對hPTH(在60℃下儲存3周)穩定性的影響
*酸含量＝酸重量×100(％)/hPTH肽重量實驗7鼻黏膜吸收測試當將配製品設計成鼻內給藥的藥物組合物時，製劑通過鼻黏膜的吸收就變成了一個重要的因素。鑑於此，需要測試配製品通過鼻黏膜的吸收。在測試實施例4中證實具有優良使用感的檸檬酸和抗壞血酸在加入到hPTH配製品中後對hPTH的鼻腔吸收的影響根據hPTH血漿濃度-時間曲線的曲線下面積(AUC)和hPTH的生物利用度進行評估。
將實施例1(3)中製得的乙酸含量為2.9％的hPTH(1-34)配製品溶解於0.3和0.6w/v％的抗壞血酸水溶液以及0.2、0.3、0.4、和0.6w/v％的檸檬酸水溶液中，得到5mg/mL的hPTH溶液。相似的，將實施例5(4)中製得的乙酸含量為0.9％的hPTH(1-34)配製品溶解於0.6w/v％的檸檬酸水溶液中，得到10mg/mL的肽溶液。作為對照，將實施例1(3)中製得的乙酸含量為2.9％的hPTH(1-34)配製品和實施例5(4)中製得的乙酸含量為0.9％的hPTH(1-34)配製品溶解於生理鹽水中。
此外，將實施例1(3)中製得的乙酸含量為2.9％的hPTH(1-34)配製品溶解於0.3 w/v％或0.6w/v％的檸檬酸水溶液中，向此溶液中加入公知作為蛋白酶抑制劑的卡莫司他甲磺酸鹽至濃度為0.3w/v％；所得溶液用於測試。
將七至九周大的Sprague-Dawley雄性大鼠(CrjCD，Charles RiverJapan，Inc.)置於溫度為22±5℃、相對溼度為30-70％、每12小時晝夜交替的金屬廂中，可自由取食食物小丸和自來水。在測試前24小時開始禁食(每組5隻大鼠)。
鼻內給藥時，將戊巴比妥麻醉下的大鼠通過股動脈插入套管；將5μL測試溶液或者10μL含有蔗糖的苯扎氯銨通過Pipetman(TM)導入到鼻腔中。血樣通過套管採集到含有抗凝劑和蛋白酶抑制劑的試管中；將血液離心後得到血漿。血漿中的hPTH(1-34)和hPTH(1-84)的濃度使用抗PTH(1-34)抗體(Chemicon International Inc.)通過RIA法測定。
皮下給藥時，對大鼠背部皮下注射1mL/kg測試溶液，血漿中的hPTH濃度按照鼻內給藥相同的方法進行測定。
hPTH(1-34)和hPTH(1-84)的生物利用度通過計算皮下給藥3小時(hPTH(1-34))後或6小時(hPTH(1-84))後的血漿濃度分別與相應的血漿濃度-時間曲線的AUC的比值而得到。結果示於表9中。
儘管hPTH(1-34)單獨皮下給藥時的生物利用度是1.4％，但當其作為0.3至0.6w/v％抗壞血酸或0.2至0.6w/v％檸檬酸溶液的溶解物給藥時，其生物利用度將升高至5至10％、或12至19％。
當作為0.6w/v％檸檬酸水溶液的溶解物使用時，hPTH(1-84)的生物利用度約為30％、此外，當hPTH(1-34)溶於加入了卡莫司他甲磺酸鹽或蛋白酶抑制劑的溶液中使用時，其生物利用度為27至31％。
以上表明加入少量有機酸能顯著的改善hPTH配製品通過鼻黏膜的吸收。同樣，加入吸收促進劑也能進一步改善hPTH配製品的鼻內吸收。作為結論，含有hPTH藥物成分的hPTH藥物組合物是適於鼻內使用的，因為在有意降低了其中以鹽的組成部分和附著物形式存在的乙酸的含量後，藥物成分具有高的穩定性，並能在鼻內給藥時保證優良的使用感。
表9hPTH(1-34)和hPTH(1-84)的經鼻吸收(大鼠)
製劑實施例1將40.5g精製蔗糖(日本藥典)溶於124.2g純淨水(日本藥典)中得到150mL 27w/v％的精製蔗糖水溶液。另一方面，將相當於1.5g實施例2中製得的乙酸含量為2.1％的hPTH(1-34)(10個小瓶)的配製品溶解於約75mL純淨水(日本藥典)中作為藥物成分。通過反相HPLC測得hPTH(1-34)的濃度為20.4mg/mL。向72.0mL溶液中加入25.9mL純淨水調整濃度至15mg/mL。由此製得97mL 15mg/mL的hPTH(1-34)溶液，所得溶液與先前準備的48.5mL 27w/v％的精製蔗糖水溶液相混合，得到約145mLhPTH(1-34)水溶液，其中精製蔗糖的濃度為9w/v％，hPTH(1-34)的濃度為10mg/mL。向47個小瓶中各注入3mL溶液，並在FZ-6型冷凍乾燥機(Labconco公司)中冷凍乾燥，得到每瓶含有270mg精製蔗糖和30mghPTH(1-34)的穩定的藥物組合物。製劑實施例2將40.5g精製蔗糖(日本藥典)溶於124.2g純淨水(日本藥典)中得到150mL 27w/v％的精製蔗糖水溶液。另一方面，作為藥物成分，將相當於750mg實施例2中製得的乙酸含量為2.1％的hPTH(1-34)(5個小瓶)的配製品溶解於約146mL純淨水(日本藥典)中，得到hPTH(1-34)濃度為5.1 mg/mL的hPTH(1-34)水溶液。然後，將54mL純淨水(日本藥典)加入到水溶液中並充分攪拌以調節hPTH(1-34)的濃度至3.8mg/mL(200mL)。將所得的200mL hPTH(1-34)濃度為3.8mg/mL的溶液與100mL預先配製的27w/v％精製蔗糖水溶液相混合，得到300mL hPTH(1-34)水溶液，其中的蔗糖濃度為9w/v％，hPTH(1-34)的濃度為2.5mg/mL。向90個小瓶中各注入3mL溶液，並在FZ-6型冷凍乾燥機(Labconco公司)中冷凍乾燥，得到每瓶含有270mg精製蔗糖和7.5mg hPTH(1-34)的穩定的藥物組合物。製劑實施例3將22.5g甘露醇(日本藥典)溶於124.2g純淨水(日本藥典)中得到150mL15％的甘露醇水溶液。另一方面，將相當於1.5g實施例2中製得的乙酸含量為2.1％的hPTH(1-34)(10個小瓶)的配製品溶於約75mL純淨水(日本藥典)中作為藥物成分。通過反相HPLC測得溶液中hPTH(1-34)的濃度為20.4mg/mL。向72.0mL溶液中加入25.9mL純淨水調整濃度至15mg/mL。由此製得97mL 15mg/mL的hPTH(1-34)溶液，所得溶液與先前準備的48.5mL 15％的甘露醇水溶液相混合，得到145mL hPTH(1-34)水溶液，其中甘露醇的濃度為5％，hPTH(1-34)的濃度為10mg/mL。向47個小瓶中各注入3mL溶液，並在FZ-6型冷凍乾燥機(Labconco公司)中冷凍乾燥，得到每瓶含有150mg甘露醇和30mg hPTH(1-34)的穩定的藥物組合物。製劑實施例4作為藥物成分，稱取805mg(粉末重量)實施例2中製得的乙酸含量為2.1％的hPTH(1-34)配製品的凍乾產品並將其溶於360mL純淨水(日本藥典)中，得到經反相HPLC測定hPTH(1-34)濃度為2mg/mL的水溶液。另一方面，稱取1g甘露醇(日本藥典)溶於50mL純淨水(日本藥典)中製得甘露醇水溶液。
將預先製備的50mL甘露醇水溶液與50mL hPTH(1-34)水溶液(2mg/mL)充分混合。向每一小瓶中分裝1mL溶液並在FZ-6型冷凍乾燥機(Labconco公司)中冷凍乾燥，得到每瓶含有1mg hPTH(1-34)和10mg甘露醇的穩定的藥物組合物。製劑實施例5作為藥物成分，稱取805mg(粉末重量)實施例2中製得的乙酸含量為2.1％的hPTH(1-34)配製品的凍乾產品並將其溶於360mL純淨水(日本藥典)中，得到經反相HPLC測定hPTH(1-34)濃度為2mg/mL的水溶液。另一方面，稱取5g甘露醇(日本藥典)溶於50mL純淨水(日本藥典)中製得甘露醇水溶液。
將預先製備的50mL甘露醇水溶液與50mL hPTH(1-34)水溶液(2mg/mL)充分混合。向每一小瓶中分裝1mL溶液並在FZ-6型冷凍乾燥機(Labconco公司)中冷凍乾燥，得到每瓶含有1mg hPTH(1-34)和50mg甘露醇的穩定的藥物組合物。製劑實施例6作為藥物成分，稱取約11mg(粉末重量)實施例2中製得的乙酸含量為2.1％的hPTH(1-34)配製品的凍乾產品，向其中加入注射用水(WFI)(日本藥典)調整體積至500mL，製得經反相HPLC測定為20μg/mL的hPTH(1-34)水溶液(溶液A)。將5g精製蔗糖(日本藥典)和100mg苯索氯銨溶於注射用水(日本藥典)中並將體積調節至100mL(溶液B)。將溶液A和溶液B各30mL相混合。向每一小瓶中分裝1mL所得到的溶液並在FZ-6型冷凍乾燥機(Labconco公司)中冷凍乾燥，製得每瓶含有10μg hPTH(1-34)、25mg精製蔗糖和0.5mg苯索氯銨的穩定的藥物組合物。製劑實施例7
作為藥物成分，稱取約50mg(粉末重量)實施例5(2)中製得的乙酸含量為2.5％的hPTH(1-84)配製品的凍乾產品，向其中加入注射溶劑(日本藥典)，得到經反相HPLC測定為2mg/mL的hPTH(1-84)水溶液(25mL)。
另一方面，向2g精製蔗糖(日本藥典)中加入注射用水(日本藥典)得到100mL精製蔗糖水溶液。將20mL hPTH(1-84)水溶液(2mg/mL)與20mL預先製備的精製蔗糖溶液(2w/v％)混合。所得溶液加入35個小瓶中，每瓶1mL，並在FZ-6型冷凍乾燥機(Labconco公司)中冷凍乾燥，製得每瓶含有1mg hPTH(1-84)和10mg精製蔗糖的穩定的藥物組合物。製劑實施例8用於前述製劑實施例1-7中得到的藥物組合物的用時溶解型製劑中所附帶的溶劑的製備如下。
稱取0.35g苯扎氯銨(日本藥典)和21.0g檸檬酸(日本藥典)並溶解於3500mL純淨水中。將所得溶液以3mL的量分裝到各聚丙烯瓶中製得附帶的溶劑。製劑實施例9用於前述製劑實施例1-7中得到的藥物組合物的用時溶解型製劑中所附帶的溶劑的製備如下。
稱取0.70g苯索氯銨(日本藥典)和14.0g檸檬酸(日本藥典)並溶解於3500mL純淨水中。將所得溶液以3mL的量分裝到聚丙烯瓶中製得附帶的溶劑。製劑實施例10用於前述製劑實施例1-7中得到的藥物組合物的用時溶解型製劑中所附帶的溶劑的製備如下。
稱取0.35g苯索氯銨(日本藥典)和21.0g己二酸(日本藥典)並溶解於3500mL純淨水中。將所得溶液以3mL的量分裝到聚丙烯瓶中製得附帶的溶劑。製劑實施例11用於前述製劑實施例1-7中得到的藥物組合物的用時溶解型製劑中所附帶的溶劑的製備如下。
稱取0.70g鯨蠟基氯化吡啶鎓(日本藥典)和14.0g己二酸(日本藥典)並溶解於3500mL純淨水中。將所得溶液以3mL的量分裝到聚丙烯瓶中製得附帶的溶劑。製劑實施例12作為藥物成分，將相當於900mg實施例4(1)中製得的乙酸含量為2.5％的hPTH(1-34)(6個小瓶)的配製品溶於18mL注射用水(日本藥典)(50mg/mL)。另一方面，將12g檸檬酸(日本藥典)溶於注射溶劑(日本藥典)得到1000mL溶液(1.2w/v％檸檬酸水溶液)。使用所得的溶液按照以下方法製備液體藥物。1.pH值為3，hPTH(1-34)為5mg/mL，檸檬酸為0.6w/v％的溶液的製備將6mL 1.2w/v％的檸檬酸水溶液與1.2mL 50mg/mL的hPTH(1-34)水溶液混合，並加入95μL 1N NaOH將所得溶液的pH值調整為3。然後，向溶液中加入注射用水使溶液體積達到12mL。將所得的溶液通過0.22μm的過濾器過濾得到本標題的藥物組合物。0.pH值為3.5，hPTH(1-34)為5mg/mL，檸檬酸為0.6w/v％的溶液的製備將6mL 1.2w/v％的檸檬酸水溶液與1.2mL 50mg/mL的hPTH(1-34)水溶液混合，並加入210μL 1N NaOH將所得溶液的pH值調整為3.5。然後，向溶液中加入注射用水使溶液體積達到12mL。將所得的溶液通過0.22μm的過濾器過濾得到本標題的藥物組合物。1.pH值為4，hPTH(1-34)為5mg/mL，檸檬酸為0.6w/v％的溶液的製備將6mL 1.2w/v％的檸檬酸水溶液與1.2mL 50mg/mL的hPTH(1-34)水溶液混合，並加入350μL 1N NaOH將所得溶液的pH值調整為4.0。然後，向溶液中加入注射用水使溶液體積達到12mL。將所得的溶液通過0.22μm的過濾器過濾得到本標題的藥物組合物。2.pH值為4.5，hPTH(1-34)為1mg/mL，檸檬酸為0.4w/v％的溶液的製備將4mL 1.2w/v％的檸檬酸水溶液、0.24mL 50mg/mL的hPTH(1-34)水溶液以及約5mL純淨水混合，並加入335μL 1N NaOH將所得溶液的pH值調整為4.5。然後，向溶液中加入注射用水使溶液體積達到12mL。將所得的溶液通過0.22μm的過濾器過濾得到本標題的藥物組合物。
工業實用性本發明提供了一種降低了其乙酸含量的藥物成分，其具有很高的穩定性，在用作藥物組合物的成分時能保證良好的使用感。
本發明的藥物成分可以承受加入適量的在藥物生產中常用的各種功能性組分以及載體或賦形劑，可以摻入到各種劑型的藥物組合物之中，也可以將其本身製成各種劑型。
根據本發明，提供了一種適於長期使用的用於鼻內給藥的藥物組合物。
序列表序列表110三得利株式會社120含有人甲狀旁腺激素的藥物成分及含有該成分的用於鼻內給藥的藥物組合物130160210121184212PRT213人223人甲狀旁腺激素的胺基酸序列(hPTH(1-84))4001Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn15 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe Val Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Pro Arg Asp Ala Gly Ser35 40 45Gln Arg Pro Arg Lys Lys Glu Asp Asn Val Leu Val Glu Ser His Glu50 55 60Lys Ser Leu Gly Glu Ala Asp Lys Ala Asp Val Asn Val Leu Thr Lys65 70 75 80Ala Lys Ser Gln210221134212PRT213人223C-末端截短的人甲狀旁腺激素的胺基酸序列(hPTH(1-34))4002Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn15 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe
權利要求
1.一種藥物成分，含有人甲狀旁腺激素肽或其衍生物，並且所含乙酸的量低於其相對於人甲狀旁腺激素肽或其衍生物的化學當量。
2.權利要求1所述的藥物成分，含有人甲狀旁腺激素肽或其衍生物與乙酸所成的鹽，其中乙酸的含量低於其相對於人甲狀旁腺激素肽或其衍生物的化學當量。
3.權利要求1或2所述的藥物成分，其中，如果人甲狀旁腺激素肽或其衍生物是一種含有標記為胺基酸編號1-84的胺基酸殘基的肽，則藥物成分含有相對於肽的重量的3重量％或以下的乙酸以及肽，如果人甲狀旁腺激素肽或其衍生物是一種含有標記為胺基酸編號1-34的胺基酸殘基的肽，則藥物成分含有相對於肽的重量的6重量％或以下的乙酸以及肽。
4.權利要求1-3中任一項所述的藥物成分，其中，如果人甲狀旁腺激素肽或其衍生物是一種含有標記為胺基酸編號1-34的胺基酸殘基的肽，則藥物成分含有相對於肽的重量的4重量％或以下的乙酸以及肽。
5.權利要求1-4中任一項所述的藥物成分，其中的藥物成分是冷凍乾燥的組合物。
6.權利要求1-5中任一項所述的藥物成分，其中的藥物成分是用於鼻內給藥的。
7.一種含有人甲狀旁腺激素肽或其衍生物作為活性成分的用於鼻內給藥的藥物組合物，其特徵在於藥物組合物中含有權利要求1-6中任一項所述的藥物成分。
8.一種含有冷凍乾燥的部分和所附帶的溶解用溶液部分的可在使用前溶解的藥物產品，其中，在冷凍乾燥部分中含有權利要求1-6中任一項所述的藥物成分。
全文摘要
一種藥物成分，其特徵在於含有人甲狀旁腺激素肽或其衍生物和乙酸，並且所含乙酸的量低於相對於人甲狀旁腺激素肽或其衍生物的化學計算量；以及含有這些成分的藥物組合物。在這些藥物成分中，以人甲狀旁腺激素肽或其衍生物的附著物形式存在的乙酸的量降低至其相對於肽或其衍生物的化學計算量以下。因此，這些成分具有高度的穩定性，並且在用於藥物組合物中時能提供優良的使用感。
文檔編號C07K14/635GK1440294SQ01812063
公開日2003年9月3日 申請日期2001年6月29日 優先權日2000年6月30日
發明者南竹義春, 小野哲, 川西耕二, 鈴木雄司 申請人:第一三得利製藥株式會社