一種檢測植物蛋白質亞細胞定位的方法

2023-05-02 00:31:46 2

一種檢測植物蛋白質亞細胞定位的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測植物蛋白質亞細胞定位的方法。該方法包括如下步驟：1）將融合基因（待測植物蛋白質基因-報告基因）克隆到植物表達載體，得到重組表達載體；2）將重組表達載體轉化農桿菌，得到重組農桿菌；3）向重組農桿菌中加入農桿菌侵染緩衝液，調節OD600為0.1～0.3，20-25℃靜置1-2h，得到侵染菌液；4）用針頭在植物葉片上避開葉脈扎孔，用無針頭注射器將侵染菌液從扎孔處注射至植物葉片內；5）培養植物2天，從注射部位取1-2cm2葉片；根據報告基因檢測待測植物蛋白質在植物中的亞細胞定位。實驗證明，本方法具操作簡單、快速、標記效果好、重複性好的優點；還可用於基因表達調控及內含子功能研究等，對研究新基因功能和表達調控奠定了技術基礎。
【專利說明】一種檢測植物蛋白質亞細胞定位的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，涉及一種檢測植物蛋白質亞細胞定位的方法。
【背景技術】
[0002]亞細胞定位是指某種蛋白或表達產物在細胞內的具體存在部位。例如在核內、胞質內或者細胞膜上存在。
[0003]蛋白質的亞細胞定位與其功能發揮密切相關。蛋白質是生物功能的直接體現者，有序分布的蛋白質是保證生命個體正常生長、發育的前提，所以了解這些過程的蛋白質亞細胞定位就是為了更好地了解生命過程。植物的生長發育，要適應生長階段的變化，並且能夠抵抗不良環境，這些過程的分子生物學和生物化學的基礎就是蛋白質。檢測植物蛋白質的亞細胞定位對於了解重要作物的抗逆、高產機理具有重要作用。
[0004]來源於水母的綠色突光蛋白(green fluorescent protein, GFP),其內源突光基團在受到紫外光或藍光激發時(395nm和479nm)可高效發射清晰可見的綠色螢光，是監測活細胞和組織內基因表達和蛋白質定位的理想探針。已被廣泛地用作報告基因，進行活體的細胞學實驗研究。
[0005]以往關於植物蛋白質在細胞中的定位研究中，大多數採用的是基因槍轉化法。然而，基因槍轉化方法對操作者的技術要求較高，並且基因槍操作中的耗材價格非常高，實驗準備複雜，成功率並不是特別高。
[0006]因此，急需一種可以快速準確檢測植物蛋白質亞細胞定位的方法。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一種檢測植物蛋白質亞細胞定位的方法。
[0008]本發明所提供的檢測植物蛋白質亞細胞定位的方法，具體可包括如下步驟:
[0009](I)將由待測植物蛋白質的編碼基因和報告基因融合而成的融合基因克隆到植物表達載體中，得到表達所述融合基因的重組表達載體；
[0010]其中，報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因。所述報告基因既可以融合於所述待測植物蛋白質的編碼基因的5』端，也可以融合於所述待測植物蛋白質的編碼基因的3』端。
[0011](2)將所述重組表達載體轉化至農桿菌感受態細胞中，得到重組農桿菌；
[0012](3)向所述重組農桿菌中加入農桿菌侵染緩衝液，調節0D_為0.1?0.3(如0.3)，20-250C (如25°C)靜置l_2h (如lh)，得到侵染菌液;
[0013](4)用注射器的針頭在植物葉片上避開葉脈扎孔，然後用除去所述針頭的所述注射器將所述侵染菌液從扎孔處注射至所述植物葉片內；
[0014](5)培養所述植物30h_48h (如48h)後，從注射部位切取l_2cm2的葉片作為待測材料；根據所述報告基因檢測所述待測材料中由所述融合基因編碼得到的蛋白質的亞細胞定位，從而確定所述待測植物蛋白質在所述植物中的亞細胞定位。[0015]在所述方法的步驟(4)中，用所述注射器的針頭在所述植物葉片上扎孔(如2個距離為3cm的孔)，以及用除去所述針頭的所述注射器將所述侵染菌液從扎孔處注射至所述植物葉片內，均是從所述植物葉片的背面進行操作的。
[0016]在所述方法的步驟(4)中，向所述植物葉片內注射所述侵染菌液時，注射量為每cm2葉片注射0.2mL所述侵染菌液。
[0017]在所述方法的步驟(I)中，所述報告基因為螢光蛋白的編碼基因；所述螢光蛋白具體為增強型綠色螢光蛋白(簡稱為EGFP，胺基酸序列為序列表中序列I)。相應的，步驟
(5)中，根據所述報告基因檢測所述待測材料中由所述融合基因編碼得到的蛋白質的亞細胞定位，為:將所述待測材料壓片後採用螢光顯微鏡或者雷射共聚焦顯微鏡通過成像分析對由所述融合基因編碼得到的蛋白質進行亞細胞定位。其中，將所述待測材料(從注射部位切取l-2cm2的葉片)進行壓片為:將葉片背面朝上置於載玻片上，並在所述載玻片上滴2-3滴蒸餾水，使葉片完全浸溼，蓋上蓋玻片。另外，採用螢光顯微鏡或者雷射共聚焦顯微鏡進行成像分析時，需要根據所述螢光蛋白的激發波長設置相應的顯微鏡使用參數。
[0018]在所述方法的步驟(I)中，所述植物表達載體可為任何用於植物表達的載體，如PBI121等。在本發明中，所述植物表達載體中啟動所述融合基因轉錄的啟動子為CaMV35S啟動子；終止所述融合基因轉錄的終止子為NOS終止子。更加具體的，所述植物表達載體為PCAMBIA2300 載體。
[0019]相應的，在所述方法的步驟(I)中，最終構建得到的所述重組表達載體為如下中任
[0020](al)在pCAMBIA2300載體的酶切位點SmaI和PstI之間插入序列表中序列4所示DNA分子的重組載體(命名為pCAMBIA2300-EGFP-BiP2)；
[0021](a2)在pCAMBIA2300載體的酶切位點SmaI和PstI之間插入序列表中序列3所示DNA分子的重組載體(命名為pCAMBIA2300-EGFP-PIP2; I)。
[0022](a3)在pCAMBIA2300載體的酶切位點SalI和PstI之間插入序列表中序列5所示DNA分子的重組載體(命名為pCAMBIA2300-EGFP-HDEL)。
[0023]在所述方法的步驟(2)中，將所述重組表達載體轉化至所述農桿菌感受態細胞中的方法為熱激法或電擊法。在本發明的一個實施例中，所採用的方法為熱激法。
[0024]所述農桿菌可為農桿菌GV3101、農桿菌LBA4404、農桿菌EHA105或農桿菌AGL1。在本發明的一個實施例中，所述農桿菌具體為農桿菌GV3101。
[0025]在所述方法的步驟(3)中，在向所述重組農桿菌中加入所述農桿菌侵染緩衝液前，還包括如下步驟:將步驟(2)所得的所述重組農桿菌接種於液體培養基中培養至對數生長期，離心(如6000rmp離心5min)收集菌體；
[0026]其中，所述對數生長期為所述重組農桿菌的比生長速率最大的時期；所述比生長速率為每小時單位質量的菌體所增加的菌體量。
[0027]所述液體培養基的溶劑為水，溶質及其濃度如下:酵母提取物10g/L、蛋白腖IOg/L、NaC15g/L，ρΗ7.4。
[0028]在所述方法的步驟(3)中，所述農桿菌侵染緩衝液的pH為5.4，溶劑為水，溶質及其濃度如下:D-葡萄糖5g/L、2-嗎啉乙磺酸50mM、Na3P04*12H202mM、乙醯丁香酮0.1mM。所述農桿菌侵染緩衝液不可高壓滅菌。[0029]在所述方法的步驟(4)中，所述注射器為ImL注射器。在本發明的一個實施例中，所述注射器具體為ImL一次性塑料注射器。
[0030]在所述方法的步驟(5)中，所述「培養所述植物30h_48h (如48h)」為:將所述植物在常規培養條件下正常培養30h-48h (如48h)。
[0031]在所述方法中，所述植物為雙子葉植物；所述雙子葉植物可為菸草或擬南芥。所述菸草具體可為本生煙(Nicotiana benthamiana)或者普通菸草(Nicotiana tobacum),所述擬南芥可為 Columbia (Col-O)或者 Landsberg erecta (Ler)。
[0032]在本發明的一個實施例中，所述植物為本生煙(Nicotiana benthamiana),具體為生長2個月本生煙(Nicotiana benthamiana)。相應的,在所述方法的步驟(5)中，所述「培養所述植物30h_48h (如48h)」為:將所述本生煙(Nicotiana benthamiana)在16小時光照/8小時黑暗，22°C恆溫的條件培養30h-48h (如48h)。
[0033]本發明的另一個目的是提供一種用於檢測植物蛋白質亞細胞定位的產品。
[0034]本發明所提供的用於檢測植物蛋白質亞細胞定位的產品，可包括獨立包裝的如下中的全部或部分:
[0035](a)以上所述的植物表達載體；
[0036](b)以上所述的農桿菌；
[0037](c)以上所述的農桿菌侵染緩衝液；
[0038](d)以上所述的液體培養基；
[0039](e)以上所述的注射器。
[0040]本發明提供了一種對植物蛋白質亞細胞定位進行簡單、快速分析的方法。本方法具有以下優點:1)操作簡單、快速:不需要複雜的儀器設備和試劑，對操作者技術要求低；2)標記效果好:農桿菌侵染方法可以獲得大量的螢光標記細胞，可以獲得基因槍方法無法達到的高效率；3)重複性好:本方法可以達到100%的成功率。本方法同樣適用於其它植物蛋白質亞細胞定位的分析。
[0041]本發明不僅可運用於蛋白質的亞細胞定位研究，而且還可以用於基因表達調控以及內含子功能研究等領域，因而對進一步研究其它新基因的功能和表達調控奠定了技術基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1為採用農桿菌介導的瞬時表達方法對植物蛋白質進行亞細胞定位檢測的流程示意圖。其中，E-1、E-2和E-3為依次為螢光檢測的三個不同植物蛋白HDEL、Β?Ρ2和PIP2; I蛋白的亞細胞定位圖像。
【具體實施方式】
[0043]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0044]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0045]pCAMBIA2300載體:記載於「鞏元勇，馮永坤，倪萬潮等.植物表達載體pCAMBIA2300-35S-GUS-CaMVterm的構建及驗證.中國生物工程雜誌，2013年03期」 一文，公眾可從中國科學院植物研究所獲得。[0046]本生煙(Nicotiana benthamiana):記載於「崔海濤,李春霞，王紅豔等.本生煙組織培養及遺傳轉化體系的建立.山東科學，2006年01期」一文，公眾可從中國科學院植物研究所獲得。
[0047]農桿菌GV3101:記載於「肖衛民，趙名琢，鄒敏等.擬南芥受傷和接種根癌農桿菌GV3101對轉錄的影響.農業生物技術學報，2013年05期」一文，公眾可從中國科學院植物研究所獲得。
[0048]實施例1、檢測植物蛋白質亞細胞定位
[0049]本實施例中，採用農桿菌介導的瞬時表達方法對植物蛋白質進行亞細胞定位檢測，其流程示意圖如圖1所示。
[0050]1、重組表達載體的構建及鑑定
[0051 ] 以擬南芥HDEL蛋白、BiP2蛋白和PIP2; I蛋白分別作為待測植物蛋白質，將蛋白的編碼基因和增強型綠色螢光蛋白(胺基酸序列如序列I所示)的編碼基因(增強型綠色螢光蛋白的核苷酸序列如序列2所示)融合而成的融合基因克隆到植物表達載體PCAMBIA2300中，得到表達所述融合基因的重組表達載體。具體操作如下:
[0052](I) pCAMBIA2300-EGFP 載體的構建
[0053]以增強型綠色螢光蛋白的編碼基因(序列2)為模板，採用引物EGFP-F和EGFP-R進行PCR擴增。
[0054]EGFP-F:5』-GTCGACATGGGCAAAGGAGAAGAACT-3』(下劃線部分為 Sal I 的識別序列，其後的序列為序列2的第1-20位)；
[0055]EGFP-R:5，-CTGCAGTTATTTGTATAGTTCATCCATGC-3，(下劃線部分為 Pst I 的識別序列，其後的序列為序列2的第695-717位的反向互補序列)。
[0056]將所得PCR產物用限制性內切酶Sal I和Pst I進行雙酶切，回收酶切產物，與經過同樣雙酶切的PCAMBIA2300載體骨架大片段相連，得到重組質粒。將經測序表明在PCAMBIA2300載體的酶切位點Sal I和Pst I之間插入了序列2所示DNA片段的重組質粒命名為 pCAMBIA2300-EGFP。
[0057](2)重組表達載體 pCAMBIA2300-EGFP-BiP2 的構建
[0058]以擬南芥BiP2蛋白的編碼基因(「序列4的第1-2007+TAA」)為模板，採用引物BiP2-F 和 BiP2-R 進行 PCR 擴增。
[0059]BiP2-F:5，~CCCGGGATGGCTCGCTCGTTTGGAGC~3，(下劃線部分為 Sma I 的識別序列，其後的序列為序列4的第1-20位)；
[0060]BiP2-R:5，-TCTAGAGAGCTCATCGTGAGACTCAT-3，(下劃線部分為 Xba I 的識別序列，其後的序列為序列4的第1987-2007位的反向互補序列)。
[0061]將所得PCR產物用限制性內切酶Sma I和Xba I進行雙酶切，回收酶切產物，與經過同樣雙酶切的PCAMBIA2300-EGFP載體骨架大片段相連，得到重組質粒。將經測序表明在PCAMBIA2300-EGFP載體的酶切位點Sma I和Xba I之間插入了序列4的第1-2007位所示DNA片段的重組質粒命名為pCAMBIA2300-EGFP-BiP2。
[0062]在重組表達載體pCAMBIA2300-EGFP-BiP2中，存在BiP2_EGFP融合蛋白的編碼基因(序列表中序列4所示)，啟動BiP2-EGFP融合蛋白的編碼基因轉錄的啟動子為CaMV35S啟動子，終止子為NOS終止子。[0063](3)重組表達載體 pCAMBIA2300-EGFP-BiP2 的構建
[0064]以擬南芥PIP2;1蛋白的編碼基因(「序列3的第1-861+TAA」)為模板，採用引物PIP2; 1-F 和 PIP2; 1-R 進行 PCR 擴增。
[0065]PIP2; 1-F:5，-CCCGGGATGGCAAAGGATGTGGAAGCCGTTC-3，(下劃線部分為 Sma I 的識別序列，其後的序列為序列3的第1-25位)；
[0066]PIP2:1-R:5』 -TCTAGAGACGTTGGCAGCACTTCTGAAT-3』 (下劃線部分為 Xba I 的識別序列，其後的序列為序列3的第840-861位的反向互補序列)。
[0067]將所得PCR產物用限制性內切酶Sma I和Xba I進行雙酶切，回收酶切產物，與經過同樣雙酶切的PCAMBIA2300-EGFP載體骨架大片段相連，得到重組質粒。將經測序表明在PCAMBIA2300-EGFP載體的酶切位點Sma I和Xba I之間插入了序列3的第1-861位所示DNA片段的重組質粒命名為pCAMBIA2300-EGFP-PIP2; I。
[0068]在重組表達載體pCAMBIA2300-EGFP-PIP2; I中，存在PIP2; 1-EGFP融合蛋白的編碼基因(序列表中序列3所示)，啟動PIP2; 1-EGFP融合蛋白的編碼基因轉錄的啟動子為CaMV35S啟動子，終止子為NOS終止子。
[0069](4)重組表達載體 pCAMBIA2300-EGFP-HDEL 的構建
[0070]以增強型綠色螢光蛋白的編碼基因(序列2 )為模板，採用引物EGFP-F和EGFP-HDEL-R 進行 PCR 擴增。
[0071]EGFP-F:5，-GTCGACATGGGCAAAGGAGAAGAACT-3，(下劃線部分為 Sal I 的識別序列，其後的序列為序列5的第1-20位)；
[0072]EGFP-HDEL-R:
[0073]5』-CTGCAGCTAGAGCTCATCGTGTTTGTATAGTTCATCCATGC-3』(下劃線部分為 Pst I 的識別序列，其後的序列為序列5的第695-729位的反向互補序列)。
[0074]將所得PCR產物用限制性內切酶Sal I和Pst I進行雙酶切，回收酶切產物，與經過同樣雙酶切的PCAMBIA2300載體骨架大片段相連，得到重組質粒。將經測序表明在PCAMBIA2300載體的酶切位點Sal I和Pst I之間插入了序列5所示DNA片段的重組質粒命名為 pCAMBIA2300-EGFP-HDEL。
[0075]在重組表達載體pCAMBIA2300-EGFP-HDEL中，存在EGFP-HDEL融合蛋白的編碼基因(序列表中序列5所示)，啟動EGFP-HDEL融合蛋白的編碼基因轉錄的啟動子為CaMV35S啟動子，終止子為NOS終止子。
[0076]2、重組農桿菌的獲得及鑑定
[0077]將步驟I獲得的重組表達載體pCAMBIA2300-EGFP-HDEL，pCAMBIA2300-EGFP-BiP2，pCAMBIA2300-EGFP-PIP2; I 分別通過熱激法轉化至農桿菌GV3101的感受態細胞中，得到重組農桿菌。熱激法轉化具體操作如下:將I μ L步驟I獲得的重組表達載體 pCAMBIA2300-EGFP-HDEL，pCAMBIA2300-EGFP-BiP2 或 pCAMBIA2300-EGFP_PIP2; I加入到含有30 μ L農桿菌GV3101感受態細胞的1.5mL離心管中，並置於冰上孵育30分鐘；孵育結束後，將離心管置於液氮中冷凍5分鐘，隨後37°C水浴中孵育5分鐘。加入800 μ LYEP液體培養基(配方:溶劑為水，溶質及其濃度如下:酵母提取物10g/L、蛋白腖10g/L、NaC15g/L，pH7.4)，在28°C搖床180rpm復甦2小時。復甦結束後，吸取100 μ L菌液塗布於YEP固體培養基上(添加50 μ M Kan和50 μ M Rif )，於28°C培養箱中培養2天。[0078]對所得重組農桿菌進行分子鑑定:採用引物EGFP-F和EGFP-R (序列同上)對重組農桿菌進行PCR擴增。將經鑑定表明含有大小約為700bp目的片段的重組農桿菌為陽性。依據所攜帶的重組表達載體的不同，將三種陽性農桿菌分別命名為 GV3101/pCAMBIA2300-EGFP-HDEL, GV3101/pCAMBIA2300-EGFP-BiP2 和 GV3101/PCAMBIA2300-EGFP-PIP2;I。
[0079]同時設置向農桿菌中轉入pCAMBIA2300-EGFP空載體的對照。將轉入PCAMBIA2300-EGFP 空載體的重組農桿菌命名為 GV3101/pCAMBIA2300_EGFP。
[0080]3、侵染菌液的製備
[0081]將步驟2 中鑑定陽性的重組農桿菌 GV3101/pCAMBIA2300-EGFP-HDEL，GV3101/pCAMBIA2300-EGFP-BiP2，GV3101/pCAMBIA2300-EGFP-PIP2; I 或GV3101/pCAMBIA2300-EGFP的單克隆菌落在YEP液體培養基(配方同上)中培養至對數生長期。6000rpm離心5min收集菌體。向所得菌體中加入農桿菌侵染緩衝液，重懸菌體至OD6tltl值為0.3，室溫(25°C)靜置Ih後，得到侵染菌液，用於侵染。 [0082]4、注射菸草葉片
[0083]供試植株:生長2個月的本生菸草(Nicotiana benthamiana)。
[0084]用ImL一次性塑料注射器(北京索萊寶科技有限公司產品，其產品目錄號為ZSQlmL)的針頭在本生煙(Nicotiana benthamiana)葉片背面扎兩個距離3cm的小孔,並且避開葉脈(以利於侵染菌液的滲透)。去掉注射器針頭，用無針頭的針管將所述侵染菌液從扎孔處注射至所述植物葉片內，緩慢將菌液注射進葉片的葉脈之間。注射量為每cm2葉片面積注射量為0.2mL。
[0085]5、亞細胞定位檢測
[0086]將步驟4獲得的注射後的菸草葉片於16小時光照/8小時黑暗，22°C恆溫條件下正常培養2天。然後，從注射部位切取l-2cm2的葉片，將葉片背面朝上置於載玻片上，並在所述載玻片上滴2-3滴蒸餾水，使葉片完全浸溼，蓋上蓋玻片。壓片結束後直接在雷射共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM510META)下觀察，Ar/Kr雷射，激發波長為488nm，接收光譜參數為BP500-550IR。每個樣品均取中軸光切面成像。
[0087]實驗重複三次。
[0088]結果顯示:在隨機選取的視野中觀察到了大量的螢光標記細胞(95%以上的細胞被標記螢光，基本上只要侵染液浸溼的葉片部位，幾乎都可發光)。EGFP蛋白信號定位於整個細胞，細胞質中及細胞膜上均有綠色螢光。EGFP-HDEL融合蛋白的綠色螢光信號定位於內質網(如圖1中E中的El所示)，BiP2-EGFP融合蛋白的綠色螢光信號定位於胞間連絲(如圖1中E中的E2所示)，PIP2; 1-EGFP融合蛋白的綠色螢光定位於細胞膜(如圖1中E中的E3所示)。以上採用本發明方法得到的三個蛋白的亞細胞定位與HDEL、Β?Ρ2和PIP2; I蛋白的亞細胞定位的相關報導一致(詳見「Yokota E, et al.(2008) An isoform of myosinXI is responsible for the translocation of endoplasmic reticulum in tobaccocultured BY_2cells.J.Exp.Bot.:ern280.，，、「Schirawski J, et al.(2005)EndoplasmicReticulum Glucosidase II Is Required for Pathogenicity of Ustilago maydis.Plant Celll7 (12):3532-3543.，，和 「Li X，et al.(2011) Single-molecule analysis ofPIP2;!dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasmamembrane aquaporin regulation.Plant Cell23 (10): 3780-3797.」)。可見，在本發明所提供的方法中，EGFP蛋白的存在並沒有影響待測蛋白的亞細胞定位，並且該方法成功率高，重複性好，三次重複實驗均得到相同的實驗結果。
【權利要求】
1.一種檢測植物蛋白質亞細胞定位的方法，包括如下步驟: (1)將由待測植物蛋白質的編碼基因和報告基因融合而成的融合基因克隆到植物表達載體中，得到表達所述融合基因的重組表達載體； (2)將所述重組表達載體轉化至農桿菌感受態細胞中，得到重組農桿菌； (3)向所述重組農桿菌中加入農桿菌侵染緩衝液，調節OD6tltl為0.1~0.3，20-25°C靜置l_2h，得到侵染菌液； (4)用注射器的針頭在植物葉片上避開葉脈扎孔，然後用除去所述針頭的所述注射器將所述侵染菌液從扎孔處注射至所述植物葉片內； (5)培養所述植物30-48h後，從注射部位切取l-2cm2的葉片作為待測材料；根據所述報告基因檢測所述待測材料中由所述融合基因編碼得到的蛋白質的亞細胞定位，從而確定所述待測植物蛋白質在所述植物中的亞細胞定位。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:步驟(4)中，用所述注射器的針頭在所述植物葉片上扎孔，以及用除去所述針頭的所述注射器將所述侵染菌液從扎孔處注射至所述植物葉片內，均是從所述植物葉片的背面進行操作的。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於:步驟(1)中，所述報告基因為螢光蛋白的編碼基因；所述螢光蛋白具體為增強型綠色螢光蛋白； 步驟(5)中，根據所述報告基因檢測所述待測材料中由所述融合基因編碼得到的蛋白質的亞細胞定位，為:將所述待測材料壓片後採用螢光顯微鏡或者雷射共聚焦顯微鏡通過成像分析對由所述融合基因編碼得到的蛋白質進行亞細胞定位。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特徵在於:步驟(1)中，所述植物表達載體中啟動所述融合基因轉錄的啟動子為CaMV35S啟動子；所述植物表達載體中終止所述融合基因轉錄的啟動子為NOS終止子； 所述植物表達載體具體為PCAMBIA2300載體。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特徵在於:步驟(2)中，將所述重組表達載體轉化至所述農桿菌感受態細胞中的方法為熱激法或電擊法；和/或 所述農桿菌為農桿菌GV3101、農桿菌LBA4404、農桿菌EHA105或農桿菌AGLl。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特徵在於:步驟(3)中，在向所述重組農桿菌中加入所述農桿菌侵染緩衝液前，還包括如下步驟:將步驟(2)所得的所述重組農桿菌接種於液體培養基中培養至對數生長期，離心收集菌體； 所述液體培養基的溶劑為水，溶質及其濃度如下:酵母提取物10g/L ;蛋白腖10g/L ；NaCl5g/L。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特徵在於:步驟(3)中，所述農桿菌侵染緩衝液的PH為5.4，溶劑為水，溶質及其濃度如下:D-葡萄糖5g/L、2-嗎啉乙磺酸50mM、Na3PO4.12H202mM、乙醯丁香酮 0.1mM。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特徵在於:步驟(4)中，所述注射器為ImL注射器。
9.根據權利要求1-8中任一所述的方法，其特徵在於:所述植物為雙子葉植物； 所述雙子葉植物具體為菸草或擬南芥。
10.用於檢測植物蛋白 質亞細胞定位的產品，包括獨立包裝的如下中的全部或部分:(a)權利要求1-9任一中所述的植物表達載體；(b)權利要求1-9任一中所述的農桿菌；(c)權利要求1-9任一中所述的農桿菌侵染緩衝液；(d)權利要求1-9任一中所述的液體培養基；Ce)權 利要求1-9任一中所述的注射器。
【文檔編號】G01N21/64GK103926226SQ201410155769
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月17日 優先權日:2014年4月17日
【發明者】林金星, 王曉華, 宋凱 申請人:中國科學院植物研究所