抑制nkt細胞的方法

2023-05-01 22:20:06 3

專利名稱：抑制nkt細胞的方法
技術領域：
本發明受國立衛生院NIH-A1-0093號政府資助。政府在本發明中享有一定的權利。
NKT細胞組成T淋巴細胞的一個獨特的亞群，在人和鼠類中極其保守。NKT細胞表達一些NK特異的表面標誌物，如C型凝集素NKRP-1A，因此具有傳統NK細胞的一些特性。NKT細胞還表達一種半不變的T細胞受體，在人類中由優先與可變Vβ11鏈配對的不變Vα24JαQ重排組成。在小鼠中，NKT細胞表達一種不變Vα14Jα281重排，該重排與可變Vβ8、Vβ7或Vβ2配對。根據共同受體表達，不變的NKT細胞或者屬於淋巴細胞的單陽性CD4+亞型，或者屬於雙陰性CD4-CD8-TCRα/β+亞型。
儘管尚未鑑定NKT細胞的天然配體，但當這些細胞的TCR識別由CD1d遞呈的來源於海綿(marine sponge)的糖基神經醯胺時，這些細胞被激活。儘管這一組α糖基化的神經醯胺在哺乳動物中檢測不到，但它們同天然的CD1d配體可能有共同的關鍵的結構特徵，說明NKT細胞識別含有疏水(脂質)和親水部分的抗原。
NKT細胞的生物學作用並沒有完全確定。響應通過其T細胞受體的激活，NKT細胞分泌大量γ幹擾素(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)(例如，參見Hong等人.(1999)Immunol.Rev.169131，以及Singh等人.(1999)J Immunol.1632373)。在重複激活後，NKT細胞成為極化的細胞，主要產生IL-4。
還提示，NKT細胞在控制一些自身免疫性疾病的易感性方面具有免疫調節功能。例如，在一些疾病模型中，將NKT細胞轉入疾病易感者體內，預防了自身免疫性疾病的發展，提示NKT細胞的激活對自身免疫性疾病的免疫調節具有治療性幹預的作用(Sharif等人(2002)JMol.Med.80290-300)，這通過將普通T細胞極化為產生IL-4而實現。還有人報告，NKT細胞和IL-13(可能由NKT細胞產生)可以下調細胞毒性T淋巴細胞介導的腫瘤免疫監視(Terabe等人.(2000)NatImmunol.1(6)515-20)。
但是，還有人報告，NKT細胞的激活增強了Th1型免疫反應及自身抗體的分泌，有助於成年NZB/W小鼠狼瘡的發展(Zeng等人.(2003)J Clin Invest 1121211)。
NKT細胞在人類臨床狀況中的作用讓人非常感興趣。NKT細胞系統在物種之間具有高水平的保守性。α-半乳糖基神經醯胺可以刺激鼠和人的NKT細胞，而且小鼠和人的CD1d分子都能將α-半乳糖基神經醯胺遞呈給任一個種的NKT細胞，說明動物實驗與人的臨床試驗具有相關性。本發明提供關於操作NKT細胞反應的方法。
發明概述本發明提供用於抑制(「無應答化(anergizing)」)NKT細胞功能，從而抑制合成的或天然的激動劑所導致的NK T細胞激活的方法和組合物。向患者施用與NKT細胞抗原受體及其遞呈分子例如CD1相互作用從而使NKT細胞的免疫學功能被抑制的分子，用來抑制患者體內NKT細胞的激活。特別有意義的情況包括治療系統性紅斑狼瘡(SLE)以及包括哮喘在內的變應性疾病。在發明的某些實施方案中，抑制劑是一種具有無應答化作用的糖脂，其下調NKT細胞的抗原受體。這種糖脂可以在糖和脂質部分之間有一個β連接，例如β-半乳糖基神經醯胺。提供了這種糖脂的藥物製劑，其用於治療與不希望的NKT細胞激活相關的疾病。
附圖簡述

圖1A-1D。用β-半乳糖基神經醯胺體內治療降低了NKT細胞激活的效果，包括IFN-γ和IL-4的表達以及IgE的合成。不影響IgG2c的合成。
圖2A-B。用C12-β-半乳糖基神經醯胺治療阻斷了α-半乳糖基神經醯胺引起的AHR。
圖3A-C。用C12-β-半乳糖基神經醯胺治療降低了卵清蛋白/明礬引起的AHR。
圖4A-B。用抗-CD1d抗體(HB323)治療阻斷了卵清蛋白/明礬引起的氣道高反應性(AHR)。
圖5。β-半乳糖基神經醯胺的口服。
發明詳述本發明提供了用於抑制NKT細胞免疫功能，特別用於治療變應性疾病或系統性紅斑狼瘡的方法和組合物。向患者施用與NKT細胞抗原受體及其遞呈分子例如CD1特異性相互作用從而使NKT細胞的免疫學功能被抑制的分子，用來抑制激動劑引起的NKT細胞的激活反應。在發明的某些實施方案中，阻斷劑是一種具有無應答化作用的糖脂，其下調NKT細胞的抗原受體。這種糖脂可以在糖和脂質部分之間有一個β連接，例如β-半乳糖基神經醯胺。
術語「治療」是指對哺乳動物中的疾病的任何治療，該疾病包括但不限於，人和動物模中的變應性疾病，例如哮喘，系統性紅斑狼瘡等。治療包括防止疾病，即在引發疾病之前，通過施用保護性組合物導致疾病的臨床症狀不會發展；包括抑制疾病，即在引發事件之後但在臨床上表現或重新表現疾病之前，通過施用保護性組合物導致疾病的臨床症狀不會發展；包括阻止疾病，即在初期表現之後通過施用保護性組合物阻止臨床症狀的發展；和/或緩解疾病，即在初期表現之後通過施用保護性組合物使臨床症狀消退。
應當明白，在人用醫藥中，不總是能夠區分「防止」和「抑制」的差別，因為在事件發生之前，最終引發的事件未知、潛伏或者患者不確定。因此，常常利用與「治療」明顯不同的術語「預防」來包括本文定義的「防止」和「抑制」。在本文中使用的術語「治療」意思是包括「預防」。
術語「有效量」是指足以為所治療的疾病狀態提供治療的劑量。這根據患者、疾病及所進行的治療而變化。NKT細胞抑制劑用於治療疾病，可在作為例如降類固醇劑的共同製劑中使用，以利於使用較低的潑尼松或氫化可的松劑量。
用於治療疾病的體內活性可以如下證明通過在動物模型中，例如在誘發的動物哮喘模型中檢測抑制劑；或者具有遺傳狼瘡樣疾病的幾個近交小鼠系之一，在對照組及治療組中觀察ANA產生、病原性抗雙鏈DNA抗體、免疫複合物腎小球腎炎、淋巴結病、以及模擬人體狀況的B細胞及T細胞功能異常的出現。利用本領域技術人員所了解的方法，通過臨床試驗確定人的臨床功效。
定義應當明白，本發明不限於特定的方法、方案、細胞系、動物種或屬、構建體及所描述的試劑，因為這些可能會發生變化。還應當明白，這裡所用的術語只是為了描述特定的實施方案，並非限制本發明的範圍，本發明的範圍僅受權利要求書的限制。
這裡所用的單數形式「一個」、「一種」包括複數形式，除非本文中另有明確的說明。因此，例如，如果提到「一種構建體」則包括多個這樣的構建體，如果提到「該細胞」，則包括了一個或多個細胞以及本領域技術人員所了解的等同物，等等。本文所使用的所有技術和科學術語都與本發明所屬領域技術人員所了解的含意相同，除非另有明確的說明。
變態反應是指基於IgE的敏感性增加的一種傾向，導致抗免疫原的特定IgE抗體產生，該免疫原包括昆蟲毒液、塵蟎、花粉、黴、動物皮屑、食物抗原或乳膠。變應性反應是抗原特異性的，特徵在於產生Th2型細胞因子，如IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等。對特定變應原的致敏發生於有遺傳傾向的人在接觸抗原之後，吸菸及病毒性感染可能有助於這種致敏過程。
在該組中包含了與變態反應相關的哮喘患者，這些人所表現出的臨床疾病範圍從輕微的鼻炎到威脅生命的哮喘。在致敏之後，繼續暴露於變應原會導致哮喘傾向的明顯增強。一旦出現了致敏，重新暴露於變應原是哮喘惡化的危險因素。對變應性哮喘的有效控制常常需要藥物治療及遠離變應原。與變態反應相關的哮喘的具體生理學效應包括氣道炎症、嗜酸粒細胞增多及粘液產生，以及IL-4和抗原特異性IgE的產生。
肥大細胞，由在其所處的外周組織中經歷分化/成熟末期的造血前體細胞產生，表達細胞表面受體(FcRI)，FcRI使得它們可以高親和性地結合於IgE的Fc部分。這種IgE致敏的肥大細胞，在遇到可被其FcRI結合的IgE識別的特異的抗原時，分泌一些生物活性介質，包括預先形成的貯存於細胞質顆粒中的介質，例如，組胺、肝素及中性蛋白酶，新合成的脂類產物，例如前列腺素D2、白細胞三烯C4以及多種細胞因子等。許多這種可能由肥大細胞產生的介質可以促進可逆轉的氣管阻塞、支氣管高反應性、和/或氣管炎症。
但是，其他細胞類型，包括均能較好地說明哮喘患者氣管中慢性炎性浸潤的嗜酸粒細胞和Th2淋巴細胞，也能夠產生會導致疾病的許多特徵的細胞因子或其他介質。FcRI曾經被認為僅限於組織肥大細胞和嗜鹼粒細胞，但它也在單核細胞、循環的樹突狀細胞、朗格漢斯細胞以及嗜酸粒細胞表面表達，因此說明這些細胞有可能在各種IgE依賴的炎症反應過程中作為其他潛在的介質來源。(相關綜述，參見Galli(1997)J.E.M.186343-347，其公開內容和引用的參考文獻在此引入作為參考)。
變應原是具有免疫原性的化合物，在敏感個體中可以引起Th2型T細胞反應及IgE B細胞反應。具體的變應原可以是任何類型的化學化合物，例如多糖、脂肪酸部分、蛋白質等。變應原包括在諸如水果(例如，瓜、草莓、菠蘿及其他熱帶水果)、花生、花生油、其他堅果、牛奶蛋白質、蛋白、貝類、西紅柿等食品中發現的抗原；空氣傳播的抗原，例如草的花粉、動物皮屑、室內蟎的排洩物等；藥物抗原，例如青黴素及相關的抗生素、磺胺類藥物、巴比妥類、抗驚厥藥、胰島素製劑(特別是動物源的胰島素)、局部麻醉劑(例如奴佛卡因)、以及碘(在許多X射線對比染料中存在)；昆蟲毒液及引起由吸血性節肢動物導致的變應性皮炎的物質，該節肢動物包括蚊類(瘧蚊屬、伊蚊屬、脈毛蚊屬、庫蚊屬)、蠅類(白蛉屬、庫蠓屬)特別是黑蠅、斑虻和蠓、蜱類(Dermmacenter屬、鈍緣蜱屬、耳蜱屬)、蚤類(例如，蚤目，包括客蚤屬、蚤屬、貓櫛頭蚤)；以及乳膠。
過敏性變應原是在高敏感個體中導致過敏反應的風險的抗原。過敏是在個體對抗原敏感化之後發生的一種急性、全身的變態反應。過敏與產生高水平的IgE抗體有關，並且同組胺的釋放有關，引起肌肉攣縮、氣管收縮、血管擴張。過敏反應的症狀包括蕁麻疹、全身瘙癢、鼻充血、哮鳴、呼吸困難、咳嗽、發紺、頭暈、眩暈、意識錯亂、言語不清、脈搏加速、心悸、噁心嘔吐、腹部疼痛或絞痛、皮膚發紅或炎症、鼻漸張、肋間回縮等等。
如本文定義的哮喘是一種症候群，典型地具有三個基本特徵間斷性及可逆性氣管阻塞、氣管高反應性及氣管炎症，這可能是多種遺傳因素及環境因素相互作用的結果。哮喘以在氣管壁上出現如下幾種細胞為特徵嗜酸粒細胞、肥大細胞、嗜鹼粒細胞、及CD25+T淋巴細胞。由於細胞因子的活性，這些細胞之間有密切的相互作用，這些細胞因子具有交流及生物效應物等多種特性。趨化因子將細胞吸引到炎症部位，細胞因子激活它們，導致炎症及黏膜損害。在慢性過程中，會出現繼發的變化，如基膜增厚及纖維化。疾病以氣管對各種刺激物的高反應性增加以及氣管炎症為特徵。被診斷為哮喘的患者通常隨時間會具有多種指徵，包括哮鳴、哮喘發作、及對乙醯甲膽鹼刺激的陽性反應，即，對少於約4mg/ml的乙醯甲膽鹼刺激的PC20。診斷指南可見，例如，National Asthma Education Program Expert PanelGuidelines for Diagnosis and Management of Asthma(《國家哮喘教育計劃專家委員會控制及診斷指南》)，National Institutes ofHealth，1991，Pub.No.91-3042。
SLE。系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫性疾病，其特徵為多克隆B細胞激活，產生多種抗蛋白質及非蛋白質的自身抗體(關於該病的綜述，參見Kotzin等人.(1996)Cell 85303-306)。這些自身抗體形成免疫複合物，貯存於多種器官系統中，引起組織損害。SLE是一種難以研究的疾病，具有以惡化和減輕為特徵的可變的疾病過程。例如，有些患者可能主要表現為皮膚潮紅及關節疼痛，表現為自發性減輕，不太需要藥物治療。但其他一些患者則表現為嚴重的進展性的腎受累(腎小球腎炎)，需要用高劑量的類固醇及諸如環磷醯胺的細胞毒性藥物治療。
多種因素可能與SLE的發展有關。有幾個基因基因座可能導致易感性，包括組織相容性抗原HLA-DR2和HLA-DR3。兩者相同的中等一致率介於25％至60％之間，提示該遺傳傾向的多基因性質，以及環境因素的作用。
關於自身抗體產生的來源已經提出很多原因。提出的T細胞幫助抗雙鏈DNA抗體分泌的機制包括T細胞識別諸如組蛋白等DNA相關的蛋白質抗原，以及識別在II類MHC中的抗DNA抗體來源的肽。抗體的類別也可能是一種因素。在NZB/NZW遺傳性狼瘡小鼠中，陽離子的IgG2a抗雙鏈(ds)DNA抗體是病原性的。大約在六個月大時，這些動物體內的自身抗體分泌由IgM向IgG轉化，T細胞可能在調節IgG產生中起重要作用。
因免疫複合物沉積、白細胞凝血或血栓形成所造成的復發的血管損傷，導致疾病的表現。另外，細胞毒性抗體可以介導自身免疫性溶血性貧血和血小板減少，針對特定細胞抗原的抗體可以破壞細胞功能。後面的一個例子是抗神經元抗體和神經精神性SLE之間的相關性。
NKT細胞組成一個淋巴細胞亞群，在胸腺、脾、肝和骨髓中含量豐富，在肺中也有。它們在胸腺中由CD4+和CD8+祖細胞發育而來，在血液中循環，具有獨特的細胞質顆粒，可以通過它們在體外不需要提前免疫或激活即可殺死特定淋巴腫瘤細胞系的能力進行功能鑑定。NKT細胞的殺傷機制同在獲得性免疫應答中產生的細胞毒性T細胞所利用的機制相同；細胞毒性顆粒被釋放到結合的靶細胞的表面，它們所含的效應蛋白質穿透細胞膜引起程序性細胞死亡。
NKT細胞所表達的表面標誌物同時具有自然殺傷細胞(如NK1.1和CD161)及普通T細胞(如TCR)兩種特徵。一些NKT細胞識別由非多態性主要組織相容性複合物(MHC)I類樣蛋白CD1d遞呈的糖脂抗原，並在小鼠中表達不變的TCR。
NKT細胞抗原受體。NKT細胞抗原的受體是一種α:β T細胞受體，由T細胞受體α和T細胞受體β兩條蛋白質鏈組成。同普通T細胞上的受體一樣，相信NKT細胞受體不能識別原始狀態下的抗原。普通T細胞識別結合於MHC分子上的肽抗原的複合配體。認為NKT細胞抗原受體的遞呈分子是CD1d，CD1d常常與糖脂結合，而不是與肽片段結合。據信與其他MHC I類分子類似，結合的抗原是被夾在CD1d的兩個α螺旋片段之間。T細胞受體與其化合物配體相互作用，使其既同CD1d接觸又同抗原接觸。
T細胞受體的胺基酸序列顯示，兩條鏈都有一個與免疫球蛋白V域具有同源性的氨基末端可變(V)區，一個與免疫球蛋白C域具有同源性的恆定(C)區，以及一個短的鉸鏈區，其含有形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基。每一條鏈通過一疏水的跨膜域跨越脂雙層，並且以一短的細胞質尾結束。
TCRα基因座含有V和J基因區段(Vα和Jα)。TCRβ基因座除Vβ和Jβ基因區段之外還含有一個D基因區段。T細胞受體α和β鏈的第三個高變環(CDR3)由D和J基因區段所形成，組成了T細胞受體的抗原結合位點的中心；該位點的外周由CDR1和CDR2環的等同物組成，其在種系Vα和Vβ基因區段內編碼。
在人類中NKT細胞的T細胞受體由優先與可變Vβ11鏈配對的不變的Vα24JαQ重排組成。在小鼠中，NKT細胞表達與可變Vβ8、Vβ7或Vβ2配對的不變的Vα14Jα281重排。
CD1CD1是一種非多態性的、MHC I類分子類似的、非MHC編碼的分子，可以非共價地與β2微球蛋白(β2m)結合。在人類中，鑑定了CD1的5種同種型(CD1a，b，c，d和e)，已知人類B細胞表達CD1c和CD1d。在小鼠中，只鑑定了CD1d這一種同種型。已證實CD1分子是糖脂和疏水性肽的抗原遞呈分子。在本發明的一些實施方案中，CD1的同種型是CD1d，它與NKT細胞抗原受體相互作用。
已經克隆了人和小鼠的CD1同種型，並對它們的序列進行了表徵。可以從Genbank資料庫中找到人的CD1a的序列，登錄號是M28825。CD1b序列可以在2000年3月31日64.00版的蛋白質序列資料庫中的P1R1部分找到，登錄號是B39957、B45801和179470(Martin等人.(1987)Proc Natl Acad Sci U.S.A 84(24)9189-93)。CD1c序列可以在P1R1中找到，登錄號是C45801、C39957和179472(Aruffo和Seed(1989)J.Immunol.1431723-1730)。可以從Genbank資料庫中找到人的CD1d，登錄號是J04142(Balk等人.(1989)Proc NatlAcad Sci U.S.A 86(1)，252-256)。可以從Genbank資料庫中找到人的CDle序列，登錄號是X14975、X15110(Calabi等人.(1989)Eur.J.lmmunol.19(2)，285-292)。
為實現本發明的目的，應答化劑將結合於受治療的患者的抗原遞呈細胞上的CD1蛋白。也就是說，為用於對人的治療，無應答化劑將結合於人的CD1等之上。因為CD1不是高度多態性的，一名患者一般表達上述野生型蛋白質，儘管也可能存在一名患者表達變異形式的蛋白質的例外。
製劑可以特異地結合於一種或多種人CD1同種型之上，特別是那些在抗原遞呈細胞上表達的同種型，例如CD1d。在一個替代實施方案中，交叉反應性無應答化劑識別所有CD1同種型上的共同表位；或者同種型特異性抗原的一種混合體；通常用於結合所有在患者體內存在的同種型。
NKT細胞抑制劑是一種通過其抗原受體幹擾NKT細胞的激活的分子，例如，通過競爭性或非競爭性地結合於CD1胞外域、或結合於T細胞抗原受體、或阻斷已激活抗原的遞呈。通常，抑制劑的結合親和力至少在約100μM。抑制劑可以是肽、脂質例如糖脂、磷脂等，可以單獨存在或與某種肽聯合；有機小分子、擬肽、可溶性T細胞受體，等等。糖脂是一種優選的阻斷劑。
在本發明的一個實施方案中，NKT細胞抑制劑是一種導致無應答化的糖脂。目標糖脂具有如下通式結構G-L其中L是一種脂質，G是一種糖，該糖可以是己糖或戊糖，並且可以是單糖、雙糖、三糖、寡糖或多糖，或者是其衍生物。目標糖包括阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔羅糖、果糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖。糖和脂質之間的連接可以在任何O原子處，通常在1、2、3或4位，更常見的是在1位。該連接可以是α構型也可以是β構型，在一些特定的實施方案中，該連接是β構型。目標脂質包括神經醯胺，具有一個醯基鏈和一個鞘氨醇鏈。
例如，NKT細胞抑制劑可具有如下結構 其中L是脂質，R選自H、戊糖、己糖、寡糖或多糖；或烷基、芳基或烯基，例如C1到C6的低級烷基，該烷基任選地被取代，取代基可以包括但不並限於烷基、芳基、烯基、芳烷基、芳烯基、環烷基、環烷基烷基或環烷基烯基；並且可以包含一個或多個N、S或O雜原子。每一個O原子的方向可以是α或β，例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等等。
在本發明的一個實施方案中，G具有如下結構
其中G是半乳糖，並且與L的連接在1位(如圖所示)，為α構型或β構型。
一些脂質可以很好地用作L，包括C8至C30脂肪酸、長鏈仲醇、長鏈氨基醇、脂肪酸與長鏈二羥基或三羥基鹼的醯胺；等等。例如，糖基部分(一個或多個單位)可以與脂肪醇或羥基脂肪醇的一個羥基相連，或者與脂肪酸的羰基相連。適合的脂質的例子包括神經醯胺、神經鞘磷脂、腦苷脂等，包括神經鞘氨醇、二氫神經鞘氨醇、C20-二氫神經鞘氨醇、植物鞘氨醇、C20-植物鞘氨醇、脫氫植物鞘氨醇、sphingadienine等。
支鏈鞘氨基醇鹼在一些海洋無脊椎動物中有描述。因此，一種具有支鏈C19烷基鏈和三個雙鍵的鹼，2-氨基-9-甲基-4，8，10-十八烷基三烯-1，2-二醇，顯示存在於來自海星的葡糖苷醯鞘氨醇(Irie A等人.，J Biochem 1990，107，578)以及來自烏賊神經的鞘磷脂(Ohashi等人.J Lipid Res 2000，41，1118)中。具有兩個雙鍵的支鏈鹼已經在來自海葵的腦苷脂類中(Karlsson等人.Biochim Biophys Acta1979，574，79)以及來自真菌的菌絲體中(Kawai等人.J Lipid Res1985，26，338)發現。
神經醯胺是脂肪酸同長鏈的二羥基或三羥基鹼形成的醯胺，在動物中最常見的就是鞘氨醇，而在植物中則是植物鞘氨醇。神經醯胺的醯基通常是長鏈的飽和或單不飽和脂肪酸。在動物神經醯胺中所發現的最常見的脂肪酸是18:0、24:0和24:1(n-9)，也發現了長鏈羥基脂肪酸。
在一個實施方案中，NKT細胞抑制劑具有下述結構
其中R1和R2可以相同或不同，獨立地選自約8到30個碳原子的烷基或烯基，可以是直鏈的也可以是支鏈的，通常是直鏈的，通常不超過0、1、2或3個不飽和鍵，該鏈任選地可以被取代或磷酸化或硫酸化；或者是其衍生物，包括酯類等；並且每一個R可以相同或不同，獨立地選自H、OH、低級烷基、芳基或烯基的醚，該烷基任選地被取代，取代基包括但並不限於烷基、芳基、烯基、芳烷基、芳烯基、環烷基、環烷基烷基或環烷基烯基；並且可以包含一個或多個N、S或O雜原子、O連接的戊糖、O連接的已糖、O連接的寡糖或多糖；或者烷基、芳基、烯基，例如C1到C6低級烷基，該烷基可以任選地被取代，取代基包括但並不限於烷基、芳基、烯基、芳烷基、芳烯基、環烷基、環烷基烷基或環烷基烯基；並且可以包含一個或多個N、S或O雜原子。每一個R原子的方向可以是α或β，例如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等等。
在一個實施方案中，NKT細胞抑制劑具有下述結構
其中，R1是(i)氫；或(ii)-SO2R10，其中R10是滷素；羥基；OR11；OR12；氨基；NHR11；N(R11)2；NHR12；N(R12)2；芳烷基氨基；或任選地被以下基團取代的C1-C12烷基滷素、羥基、氧、硝基、OR11、OR12、醯氧基、氨基、NHR11、N(R11)2、NHR12、N(R12)2、芳烷基氨基、巰基、硫代烷氧基、S(O)R11、S(O)R12、SO2R11、SO2R12、NHSO2R11、NHSO2R12、硫酸根、磷酸根、氰基、羧基、C(O)R11、C(O)R12、C(O)OR11、C(O)NH2、C(O)NHR11、C(O)N(R11)2、含有0-3個R13的C3-C10環烷基、含有0-3個R13的C3-C10雜環基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C5-C10環烯基、C5-C10雜環烯基、含有0-3個R14的C6-C20芳基、或含有0-3個R14的C6-C20雜芳基；或者C3-C10環烷基、C3-C10雜環基、C5-C10環烯基、或C5-C10雜環烯基，其任選被一個或多個下述基團取代滷素、羥基、氧、OR11、OR12、醯氧基、硝基、氨基、NHR11、N(R11)2、NHR12、N(R12)2、芳烷基氨基、巰基、硫代烷氧基、S(O)R11、S(O)R12、SO2R11、SO2R12、NHSO2R11、NHSO2R12、硫酸根、磷酸根、氰基、羧基、C(O)R11、C(O)R12、C(O)OR11、C(O)NH2、C(O)NHR11、C(O)N(R11)2、烷基、滷烷基、含有0-3個R13的C3-C10環烷基、含有0-3個R13的C3-C10雜環基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C5-C10環烯基、C5-C10雜環烯基、含有0-3個R14的C6-C20芳基、或含有0-3個R14的C6-C20雜芳基；或者C2-C6烯基、C2-C6炔基、芳基或雜芳基，其任選地被一個或多個下述基團取代滷素、羥基、OR11、OR12、醯氧基、硝基、氨基、NHR11、N(R11)2、NHR12、N(R12)2、芳烷基氨基、巰基、硫代烷氧基、S(O)R11、S(O)R12、SO2R11、SO2R12、NHSO2R11、NHSO2R12、硫酸根、磷酸根、氰基、羧基、C(O)R11、C(O)R12、C(O)OR11、C(O)NH2、C(O)NHR11、C(O)N(R11)2、烷基、滷烷基、含有0-3個R13的C3-C10環烷基、含有0-3個R13的C3-C10雜環基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C5-C10環烯基、C5-C10雜環烯基、含有0-3個R14的C6-C20芳基、或含有0-3個R14的C6-C20雜芳基；或者(iii)-C(O)R10，其中R10的定義同上；或(iv)-C(R10)2(R15)，其中R10的定義同上；R15是氫、R10、或R15和R2一起在與之相連的碳和氮原子之間形成雙鍵；或(v)R1和R2一起形成任選被R10取代的3-10個環原子的雜環基；R2是氫，或者R2和R15一起在與之相連的碳和氮原子之間形成雙鍵，或者R2和R1一起形成任選被R10取代的3-10個環原子的雜環基。
R3、R4、R5、R6和R7是相互獨立的氫、C1-C6烷基、C6-C12芳烷基或C1-C6醯基；R8是-(CH2)XCH3；R9是直鏈或支鏈C3-C100烷基；R11是C1-C20烷基，任選地被以下基團取代滷素、羥基、烷氧基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、硫酸根或磷酸根；R12是芳基，任選地被以下基團取代滷素、滷代烷基、羥基、烷氧基、硝基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、硫酸根或磷酸根；每一個R13是獨立的滷素、滷代烷基、羥基、烷氧基、氧、氨基、烷氨基、二烷基氨基、硫酸根或磷酸根；每一個R14是獨立的滷素、滷代烷基、羥基、烷氧基、硝基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、硫酸根或磷酸根；X為1-100。
參考上述通式，上面描述的化合物的亞組是X為24、R9為n-十四烷基的那些化合物。
其他合適的取代基在PCT/US2003/008530中有描述，在此引入作為參考。PCT/US2003/008530涉及化合物的α形式，但這裡可對β形式進行同樣種類的取代。
篩選試驗可以篩選候選製劑抑制NKT細胞激活的能力。確定結合親和較和特異性的試驗在本領域中公知，包括競爭和非競爭性試驗。有用的試驗包括ELISA、RIA和流式細胞術等。結合試驗可以將CD1結合於固體基質上，然後將候選配體(製劑)加至結合的CD1上。可以通過等離子激元共振光譜法(Biacore試驗)測定結合親和力。另外，在諸如糖脂等競爭物的存在下，候選阻斷劑可以同已結合的CD1結合。
結合試驗還可用於確定候選製劑是否幹預分子與CD1的結合或者是否幹預NKT細胞受體與CD1/糖脂複合物之間的相互作用。一種確定候選製劑是否同NKT細胞受體(NKTCR)結合的試驗可以利用CD1二聚體或四聚體(參見Kronenberg等人.(2001)P.N.A.S.982950-2952)。例如，一個CD1四聚體可以負載一個候選製劑；然後使產生的複合物與NKTCR接觸，通常與NKT細胞接觸，並且通過如流式細胞術定量測定結合水平。作為陽性對照，可以定量測定CD1四聚體與α-半乳糖基神經醯胺的結合；或者在競爭結合試驗中使用。在一些實施方案中，目標製劑在這些條件下將結合NKTCR。
在另外一些實施方案中，目標製劑幹擾結合於CD1及TCR的激動劑。這種阻斷可以如下測定首先將陽性對照(激動劑，例如α-半乳糖基神經醯胺)加至CD1二聚體或四聚體上，該四聚體可以被可檢測地標記。用得到的試劑結合NKT細胞群體，例如通過流式細胞術定量測定其結合。為了顯示候選製劑阻斷了結合，四聚體同候選拮抗劑一同溫育，然後加入激動劑；並且比較得到的複合物與激動劑複合物結合NKT細胞的能力。在一些實施方案中，目標製劑將幹預激動劑與CD1的結合之間的相互作用。
通常在不同試劑濃度下平行進行多個試驗混合物，以獲得針對不同濃度的不同反應。一般這些濃度中有一個是陰性對照，即濃度為零或低於能檢測出的水平。
目標試驗直接針對能夠抑制NKT細胞免疫功能的製劑。目標試驗可以針對NKT細胞受體、和/或CD1的結合試驗；或者也可以利用針對評價NKT細胞激活的功能試驗、和/或用於NKT細胞激活的動物模型。
可以用於篩選抑制性化合物的體外功能試驗基於α-半乳糖基神經醯胺在免疫細胞混合物中激活NKT細胞的能力，例如小鼠脾細胞，其包括NKT細胞和抗原遞呈細胞。一般將α-半乳糖基神經醯胺加入到細胞培養物中24小時，然後通過細胞增殖及分泌IL-4和IFN-γ至培養上清液中的情況來測定激活。
可以通過下述方法篩選抑制性化合物，即將細胞混合物與候選抑制分子(拮抗劑)進行預溫育，然後加入α-半乳糖基神經醯胺激活分子(激動劑)，並測定細胞增殖。24小時後檢測上清液中細胞因子分泌的情況。通過增殖及細胞因子分泌的減少確定抑制能力。或者，細胞培養物可以包括純化的NKT細胞和純化的抗原遞呈細胞，特別是樹突狀細胞。
候選製劑的來源非常廣泛，包括從合成的及天然的化合物文庫中獲取。例如，可以通過多種手段隨機及定向地合成多種有機化合物及生物分子。此外，細菌、真菌、植物及動物提取物形式的天然化合物文庫也可以獲得或者很容易產生。另外，天然的或合成產生的文庫及化合物很容易通過常規的化學、物理及生物化學手段進行修飾。已知的藥學製劑可進行定向或隨機的化學修飾，例如醯基化、烷基化、酯化、醯胺化(amidification)，以產生結構類似物。
為了治療哮喘，CD1特異性抗體可用於抑制或阻斷NKT激活。可以通過用含有整個CD1蛋白或其一部分的肽免疫宿主動物來獲取合適的抗體。合適的宿主動物包括小鼠、大鼠、綿羊、山羊、倉鼠、兔等。蛋白質免疫原的來源可以是小鼠、人、大鼠、猴等。一般宿主動物是不同於免疫原的種，例如，小鼠CD1用於免疫倉鼠，人CD1用於免疫小鼠等。來源於高保守區的肽可用作免疫原產生交叉特異性抗體。免疫原可包含全蛋白質或其片段或衍生物。優選的免疫原包含人CD1的全部或一部分胞外域，這些殘基可能包含在天然CD1中發現的翻譯後修飾，例如糖基化。包含胞外域的免疫原採用本領域公知的技術獲得，例如，利用常規重組方法表達克隆的基因，從T細胞中分離，分選高水平表達CD1的細胞群體，等等。利用常規技術生產單克隆抗體。一般是，將被免疫的宿主動物的脾和/或淋巴結作為漿細胞來源。將漿細胞同骨髓瘤細胞融合實現無限增殖化，產生雜交瘤細胞。利用標準技術篩選來自各個雜交瘤的培養上清液，鑑定出那些產生具有期望的特異性的抗體的雜交瘤。用於生產人蛋白質的單克隆抗體的合適的動物包括小鼠、大鼠和倉鼠等。為了產生抗鼠蛋白質的抗體，一般動物為倉鼠、豚鼠或兔等。通過常規技術從雜交瘤細胞的上清液或腹水中純化抗體，例如，利用結合於不溶性支持物、蛋白Asepharose等的CD1進行親和層析。為了體內使用，特別是向人體內注射，期望降低阻斷劑的抗原性。受體針對阻斷劑的免疫應答將有可能縮短治療有效的時間範圍。有幾種方法可用於提供人或人源化的抗體，包括利用轉基因動物宿主生產人抗體、對動物抗體修飾使其「人源化」或「表面重建(resurface)」；或者是利用噬菌體展示篩選技術選擇人的抗體片段。在Vaugha等人.(1998)Nat.Biotech.16535中可以發現關於人及人源化抗體的綜述。將抗體人源化的方法是本領域公知的。可以通過重組DNA技術用相應的人序列替換其CH1、CH2、CH3、鉸鏈區、和/或框架區，從而對目標抗體進行工程化(參見WO92/02190；Roguska等人.(1994)P.N.A.S.91969-973；Jones等人.(1986)Nature 321522-525；Padlan(1991)Mol.Immunol.28489-498)。
在篩選試驗中可用到各種其他的試劑。這些試劑包括鹽、諸如白蛋白等天然蛋白質、去汙劑等，它們可用於促進最佳的蛋白質與DNA的結合和/或減少非特異性或背景幹擾。也可能用到改善試驗效果的試劑，例如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物劑等。
功能性試驗包括在體外及體內條件下對NKT細胞的功能性激活進行評價。可以通過如下指標測定激活NKT細胞的增殖、諸如IFN-γ和IL-4等細胞因子的釋放、對靶細胞的殺傷等。激活的陽性對照可以包括利用由表達CD1的抗原遞呈細胞遞呈的α-半乳糖基神經醯胺，或其無細胞類似物，如CD1四聚體。
可以利用多種親和方法從患者外周血中分離NKT細胞，例如流式細胞技術、免疫磁珠等。可以對NKT細胞克隆或NKT細胞雜交瘤進行激活試驗，例如利用人細胞、齧齒動物細胞等。監測NKT細胞激活的試驗是本領域技術人員公知的，包括增殖試驗及細胞因子釋放試驗，包括ELISA斑點試驗。
增殖試驗測定NKT細胞響應特定抗原的增殖水平。在一個示例性的試驗中，製備小鼠脾細胞、純化的NKT細胞與樹突狀細胞等的混合物，並冼滌，然後在諸如α-半乳糖基神經醯胺等激活劑的存在下培養。細胞的培養時間通常為24小時至幾天。通過監測培養物的DNA合成，例如在培養的最後18小時加入3H-胸苷，評估糖脂引起的增殖。
NKT細胞毒性試驗測定具有殺傷活性的細胞毒性NKT細胞的數目。測定NKT細胞殺傷其靶細胞的能力。在一個示例性的試驗中，用Na51CrO4標記靶細胞。然後將靶細胞加入到有可能激活的NKT細胞的懸液中。通過定量測定裂解細胞的Na51CrO4釋放來測定細胞毒性。在試驗中一般要包括自發釋放及總釋放的對照。比51Cr釋放百分比可以根據自發釋放的百分比來計算。
酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和其他免疫特異性的試驗可用於測定被激活的NKT細胞的細胞因子譜，並且可用於監測諸如IFN-γ、IL-4等細胞因子的表達。捕獲抗體可以是任何對目標細胞因子具有特異性的抗體，如上所述，NKT細胞培養物的上清液很方便地用作抗原的來源。在阻斷及洗滌之後，加入被標記的檢測抗體，作為結合的標記的函數確定存在的蛋白質的濃度。
製劑NKT細胞抑制劑可以在溶液中或以任何其他在藥學上適合於給藥的形式提供。配製該製劑用於以施用這些物質的常用方式給藥。典型的製劑是Remington’s Pharmaceutical Sciences，最新版，MackPublishing Company，Easton，PA中所給出的那些。給藥途徑的選擇基於施用的化合物、患者的狀態及被治療的疾病。一種化合物可以通過不同的途徑給藥，取決於疾病的嚴重程度，例如，急症的情況可能需要靜脈給藥，急性但還不至於威脅生命的情況可以口服治療，慢性治療可以通過氣霧劑給藥。
對於治療用途，特別是氣管疾病，優選局部給藥。與全身吸收的濃度相比，通過吸入或吹入氣霧劑給藥可以提供高水平的藥物濃度。另外，也可以通過注射給藥，包括肌肉、靜脈(IV)、皮下或腹膜注射，最優選IV和局部注射。但是，也可以使用其他給藥方式，使藥物進入系統循環，例如口服、透黏膜或透皮製劑，它們可作為栓劑、皮膚貼劑或鼻內應用。任何使藥物進入血流或局部進入肺的適合的製劑都可能適用。
對於注射，合適的製劑一般包括利用生理鹽水、Hank溶液或其他緩衝液製成的水溶液或懸液，任選地包括穩定製劑或其他少量成分。也可以使用脂質體製劑和其他形式的微乳劑。也可以將藥物以凍幹的形式提供，並重新配製進行給藥。透黏膜和透皮給藥一般包括促進通過黏膜或皮膚障礙的製劑，例如膽汁、鹽、夫西地酸及其類似物、各種去汙劑等。也可以進行口服給藥(例如，參見Miyamoto等人.2001Nature.413(6855)531-4)。
製劑的性質一定程度上取決於所選擇的藥物的性質。利用已知技術及本領域技術人員公知的配製原則製備合適的製劑。在特定藥物組合物中所含的藥物的百分比也取決於製劑的性質；該百分比可以在一個很寬的範圍內變化，從大約1重量％至大約85重量％。
可以藉助於用於吸入途徑的藥物遞送系統向患者給藥。化合物可以一種適合吸入給藥的方式配製。藥物遞送系統是適合通過將藥物局部施用至支氣管黏膜層而進行呼吸治療的系統。本發明可以利用依靠壓縮氣體的力量從容器中排出藥物的系統。氣溶膠或加壓包裝可以用於此目的。
這裡所用的術語「氣溶膠」指其傳統用意，即在壓力下由噴射氣體帶至治療應用部位的極細的液體或固體顆粒。當本發明中用到藥物氣溶膠時，氣溶膠中含有治療性的活性化合物，該活性化合物可以在流體載體和噴射劑的混合物中溶解、懸浮或乳化。氣溶膠可以是溶液、懸浮液、乳液、粉末或半固體製劑的形式。在本發明中用氣溶膠的目的是作為細的固體顆粒或流體霧經患者的呼吸道給藥。可以使用本領域技術人員熟知的各種類型的噴射劑。適合的噴射劑的例子包括但並不限於碳氫化合物或其他合適的氣體。在加壓的氣溶膠的情況下，可以通過提供一個遞送計量的量的值來確定劑量單位。
本發明也可以利用噴霧器實現，噴霧器是一種能夠產生非常細的在氣體中大小基本均一的流體粒子的裝置。優選地，含有藥物的流體以液滴的方式分散。小的液滴可以被氣流攜帶通過噴霧器的出管帶出。產生的霧可以滲透至患者的呼吸道。
含有藥物，含有或不含潤滑劑、載體或噴射劑的粉末組合物，可以向需要治療的哺乳動物施用。本發明的實施方案可以利用傳統的通過吸入施用粉末狀藥物組合物的裝置來實施。例如，化合物同諸如乳糖或澱粉等適合的粉末基質的粉末混合物可以在如膠囊或藥筒如明膠或泡罩包裝中以單位劑量形式存在，可以藉助吸入器由其施用粉末。
含有藥物的小顆粒可以乾粉的形式保存於容器中。在貯存或配製期間，它們可以同任何適合的藥學製劑、載體、填充劑等混合，它們可以通過產生具有用於最終治療用途的性質的產品所需的任何技術加工。特別是，可以遞送入肺的製劑顆粒的配製，例如利用可計量的劑量或乾粉吸入裝置，屬於本領域技術人員的公知技術。
這裡可以使用「藥學可接受的賦形劑」，該術語指的是用於製備藥物組合物的化合物，它通常是安全的，無毒的，且既不是生物學上不期望的也不是在其他方面不期望的，包括藥學用途可接受的賦形劑。在說明書及權利要求書中使用的藥學可接受的賦形劑包括一種或一種以上的這樣的賦形劑。合適的賦形劑的一些例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、磷脂醯膽鹼、纖維素、無菌水、糖漿及甲基纖維素。
製劑中還可以包括諸如滑石粉、硬脂酸鎂及礦物油等潤滑劑，溼潤劑，乳化劑及懸浮劑，及諸如甲基和丙基羥基-苯甲酸酯和苯甲醇等防腐劑。
含有本發明的活性製劑的製劑可以用各種賦形劑配製。藥學可接受的賦形劑有可能是揮發性的或非揮發性的。揮發性賦形劑，在加熱時，同時揮發、霧化並同抗組胺劑一同吸入。本領域公知這類賦形劑，包括但不限於氣體、超臨界流體、液態及固態溶劑。下面列出這一類中典型的載體水；萜，例如薄荷醇；醇，例如乙醇、丙二醇、甘油及其他類似的醇；二甲基醯胺；二甲基乙醯胺；蠟；超臨界的二氧化碳；乾冰；及其混合物。其他賦形劑的例子包括，僅作為例子，表面活性劑，是具有親脂性及親水性部分的雙親性分子，在這兩種特性之間具有不同的平衡。如果分子是親脂的，則該物質在水中的低溶解性可能會限制其應用。然而，如果親水部分佔絕對優勢，則分子的表面活性特性可能較小。因此，為使其有效，表面活性劑必須要打破充足的可溶性及充足的表面活性之間的平衡。所有的膽汁酸鹽及其衍生物(烏索脫氧膽酸鹽、牛磺膽酸鹽、甘氨膽酸鹽、及牛磺二氫夫西地酸的鈉鹽)可以有效地增強在肺中的吸收。
磷脂、糖苷、辛基吡喃葡萄糖苷、諸如硫代吡喃葡萄糖苷和吡喃麥芽糖苷等烷基糖苷、環糊精及其衍生物可以有效地增強鼻吸收，並且在肺中也可能發揮相似的作用。其他可能有效的表面活性劑是水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸鈉和諸如甘草酸鹽、植物皂甙和醯基肉毒鹼等天然存在的表面活性劑。
本發明製劑中可以使用脂質，僅作為例子，例如是合成的、半合成的或天然存在的脂質，包括磷脂、生育酚、類固醇、脂肪酸、諸如白蛋白等糖蛋白、帶負電荷的脂質及陽離子脂質。關於磷脂，可能包括下述脂質卵磷脂醯膽鹼(EPC)、卵磷脂醯甘油(EPG)、卵磷脂醯肌醇(EPI)、卵磷脂醯絲氨酸(EPS)、磷脂醯乙醇胺(EPE)和磷脂酸(EPA)；大豆相應物、大豆磷脂醯膽鹼(SPC)；SPG、SPS、SPI、SPE和SPA，氫化的卵及大豆相應物(例如HEPC、HSPC)、由含有12至26個碳原子鏈的脂肪酸在甘油2和3位和不同的首基(包括膽鹼、甘油、肌醇、絲氨酸、乙醇胺)在甘油的1位通過酯鍵連接組成的其他磷脂，以及相應的磷脂酸。這些脂肪酸的鏈可以是飽和的也可以是不飽和的，磷酯可以由不同鏈長度及不同不飽和度的脂肪酸所組成。特別是，製劑的組成可以包括DPPC，這是天然存在的肺表面活性劑的主要成份。其他例子包括二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)和二肉豆蔻醯磷脂醯甘油(DMPG)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)和二棕櫚醯磷脂醯甘油(DPPG)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)和二硬脂醯磷脂醯甘油(DSPG)、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)，和混合的磷酯，如棕櫚醯硬脂醯磷脂醯膽鹼(PSPC)和棕櫚醯硬脂醯磷脂醯甘油(PSPG)，及單醯化的磷酯，如單油醯磷脂醯乙醇胺(MOPE)。甾醇可以包括膽固醇、包括膽固醇半琥珀酸酯在內的膽固醇酯類、包括膽固醇硫酸氫鹽和膽固醇硫酸鹽在內的膽固醇鹽、麥角固醇、麥角固醇酯類包括麥角固醇半琥珀酸酯、麥角固醇鹽類包括麥角固醇硫酸氫鹽和麥角固醇硫酸鹽、羊毛脂醇、羊毛脂醇酯類包括羊毛脂醇半琥珀酸酯、羊毛脂醇鹽類包括羊毛脂醇硫酸氫鹽和羊毛脂醇硫酸鹽。生育酚類可以包括生育酚、包括生育酚半琥珀酸酯在內的生育酚酯類、包括生育酚硫酸氫鹽和生育酚硫酸鹽在內的生育酚鹽。術語「甾醇化合物」包括甾醇、生育酚等等。
利用的陽離子脂質可以包括脂肪酸的銨鹽、磷脂和甘油酯。脂肪酸包括碳鏈長為12至26個碳原子的脂肪酸，可以是飽和的也可以是不飽和的。一些具體的例子包括十四胺、十六胺、月桂胺和硬脂醯胺、二月桂醯乙基磷酸膽鹼(DLEP)、二肉豆蔻醯乙基磷酸膽鹼(DMEP)、二棕櫚醯乙基磷酸膽鹼(DPEP)和二硬脂醯乙基磷酸膽鹼(DSEP)、N-(2，3-二-(9-(Z)-十八碳烯氧基)-丙-1-基-N，N，N-三甲基氯化銨(DOTMA)和1，2-二(油醯氧基)-3-(三甲基銨基)丙烷(DOTAP)。可以利用的帶負電荷的脂質包括磷脂醯甘油(PG)、磷脂酸(PA)、磷脂醯肌醇(PI)和磷脂醯絲氨酸(PS)。例子包括DMPG、DPPG、DSPG、DMPA、DPPA、DSPA、DMPI、DPPI、DSPI、DMPS、DPPS和DSPS。
對於離子增強劑(例如上面描述的陰離子表面活性劑)，抗衡離子的性質可能比較重要。選擇特定的抗衡離子可能會影響該增強劑或任何含有該增強劑的製劑的粉末性質、溶解性、穩定性、吸水性及強化劑和局部/系統毒性。還可能影響與它結合的活性劑的穩定性和/或溶解性。通常，單價金屬離子例如鈉、鉀、鋰、銣、和銫、氨和有機胺。這些有機胺的例子包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、2-氨基-2-甲基乙胺、甜菜鹼、乙二胺、N，N-二苄基亞乙基四胺、精氨酸、六亞甲基四胺、組氨酸、N-甲基哌啶、賴氨酸、哌嗪、亞精胺、精胺和三(羥甲基)氨基甲烷。
在NKT細胞抑制劑製劑中可用的其他賦形劑可以是，僅作為舉例，澱粉微球和螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)的鈉鹽。
NKT細胞抑制劑/賦形劑(或NKT細胞抑制劑/賦形劑/稀釋劑)組合的優選比例可以由藥學領域普通技術人員根據標準方法很容易地確定，基於如下標準有效、一致地施用最佳劑量、副作用最小及吸收率可以接受。
有幾種不同類型的吸入方法可以用於本發明。本發明的拮抗劑可以配製為如下三種不同的吸入製劑類型。第一，可以用低沸點的噴射劑配製本發明的抑制劑。這種製劑通常通過傳統的計量劑量吸入器(MDI′s)給藥。但是，可以改進傳統的MDI′s以提高獲得可重複劑量的能力，這是通過測定患者的吸入量和流速的方法，如美國專利5,404,871和5,542,410所述。另外，本發明的抑制劑可以配製成水溶液或乙醇溶液，並通過傳統的噴霧器進行施用。但是，更優選的是將這些溶液製劑霧化，這使用如美國專利5,497,763、5,544,646、5,718,222和5,660,166所公開的設備和系統來實現。最後，本發明的抑制劑化合物可以配製成乾粉製劑。這種製劑可以通過在產生乾粉的氣溶膠霧後簡單地吸入乾粉製劑的方式給藥。其實現技術在1998年7月7日頒發的美國專利5,775,320及1998年4月21日頒發的美國專利5,740,794中有描述。
對於口服製劑，藥物可以單獨使用或者同合適的添加劑組合製成藥片、粉劑、顆粒或膠囊，例如，使用諸如乳糖、甘露糖、玉米澱粉、或馬鈴薯澱粉等傳統的添加劑，使用諸如結晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠等粘合劑，使用諸如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或羧甲基纖維素鈉等崩解劑，使用諸如滑石粉或硬脂酸鎂等潤滑劑，以及在一些實施方案中，使用稀釋劑、緩衝劑、溼潤劑、防腐劑及調味劑。
在本發明的一個實施方案中，口服製劑包含腸衣，所以活性製劑可以到達腸道。腸溶製劑通常用於保護活性成份不受胃內強酸的作用。這種製劑是利用在酸性環境中不溶而在鹼性環境中可溶的聚合物膜將固態的劑量形式包裹而產生的。膜的例子是醋酸鄰苯二甲酸纖維素、聚乙烯醋酸鄰苯二甲酸酯、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯和羥丙基甲基纖維素醋酸琥珀酸酯、異丁烯酸共聚物和醋酸鄰苯二甲酸纖維素。
其他腸溶製劑包括由生物可腐蝕性的聚合物製成的工程化的聚合物微球，其顯示出同胃腸黏膜和細胞層具有非常強的粘附作用，可以穿透黏膜吸收上皮及覆蓋派伊爾淋巴集結淋巴組織的濾泡相關上皮。聚合物保持同腸道上皮接觸較長的一段時間，並實際上通過細胞以及在細胞之間穿透。例如，參見Mathiowitz等人.(1997)Nature386(6623)410-414。藥物遞送系統也可以利用超多孔水凝膠(SPH)及SPH複合物(SPHC)的核，正如Dorkoosh等人.(2001)J ControlRelease 71(3)307-18中所描述的。
製劑通常以單位劑量形式提供，術語「單位劑量形式」指的是適合作為單一劑量用於人的物理上分離的單位，每一個單位包含一個預先確定的量，該量與藥學可接受的稀釋劑、運載體或載體聯合足以產生預想的效果。關於本發明的單位劑量形式的描述取決於所用的具體的藥物和將要達到的效果，以及在宿主中與每種複合物有關的藥效學。
共同製劑所述NKT細胞抑制劑可以同其他用來緩解SLE、哮喘等症狀的藥物配製在一起或聯合給藥。這些藥物包括非類固醇抗炎藥(NSAID)，例如乙醯水楊酸、布洛芬、甲氧萘丙酸、吲哚美辛、萘普酮、託美汀等。皮質激素用於減輕炎症並抑制免疫系統的活性。這類藥物中最常開具的是強的松。氯喹(Aralen)或羥氯喹(Plaquenil)對一些狼瘡患者也可能非常有效。它們最常用於狼瘡的皮膚及關節症狀硫唑嘌呤(依木蘭)和環磷醯胺(Cytoxan)抑制炎症並且有可能抑制免疫系統。這些藥物的副作用包括貧血、白細胞計數低、及增加感染的危險。其他的藥物，例如，甲氨喋呤和環孢黴素，用於控制狼瘡的症狀。這兩種藥都是免疫調節藥，有其自身的副作用。抗凝劑用於防止血液快速凝結。它們的範圍從防止血小板粘連的非常低劑量的阿斯匹林到肝素/香豆素。
可以與本發明的NKT細胞抑制劑聯合給藥的藥物包括任何可通過吸入施用的藥物，例如，諸如可待因、雙氫嗎啡、麥角胺、芬太尼或嗎啡等鎮痛藥，諸如地爾硫卓等抗咽痛藥，諸如色甘酸鹽、酮替芬或萘多羅米等抗變應性藥，諸如先鋒黴素類、青黴素類、鏈黴素、磺胺類、四環素類或噴他眯等抗感染藥，諸如美沙吡林等抗組胺劑，諸如倍氯米松、氟尼縮松、布地奈德、替潑尼旦、曲安奈德或氟替卡松等消炎藥，諸如那可丁等鎮咳藥，諸如麻黃素、腎上腺素、非諾特羅、福莫特羅及異丙腎上腺素、間羥異丙腎上腺素、苯腎上腺素、苯丙醇胺、吡布特羅、瑞普特羅、利米特羅、沙丁胺醇、沙美特羅、特布他林、乙基異丙腎上腺素、妥洛特羅、奧西那林或(-)-4-氨基-3，5-二氯-α-[[[6-[2-(2-吡啶基)乙氧基]己基]-氨基]甲基]苯甲醇等支氣管擴張劑，諸如阿米洛利等利尿藥，諸如異丙託銨、阿託品或氧託溴銨(oxitropium)等抗膽鹼能類藥，諸如可的松、氫化可的松或潑尼松龍等激素，諸如氨茶鹼、膽茶鹼、賴氨酸茶鹼或茶鹼等黃嘌呤類，以及諸如胰島素或高血糖素等治療性蛋白質或多肽。本領域技術人員應當清楚，適當時，為了優化藥物的活性和/或穩定性，藥物可以是鹽的形式(例如鹼金屬或者胺鹽或者酸加成鹽)或酯的形式(例如低級烷基酯)或溶劑化物的形式(例如水合物)。
將NKT細胞抑制劑施用於出現不希望的NKT細胞激活的患者，這些患者可能包括患有哮喘等變應性疾病、SLE等的個體。SLE患者的疾病指徵可能累及皮膚、關節、腎和/或中樞神經系統。在其他的實施方案中，癌症患者也可能因抑制NKT細胞的方法而受益，目的是減輕免疫監視的下調。動脈粥樣硬化患者也可能因本發明的方法而受益。
劑量可以使用各種給藥方法。製劑可以是吸入、血管內注射、皮下注射、腹腹內注射等。治療性製劑的劑量可以在較大範圍內變化，取決於疾病的性質、給藥頻率、給藥方式、給藥目的、藥物從宿主體內的清除率等等。給藥劑量取決於已知因素而變化，例如特定藥劑的藥效學特性，給藥的方式及途徑，受體的年齡、健康狀況及體重，症狀的性質及程度，同時的治療，治療的頻率及期望的效果。劑量可以一周或兩周一次不頻繁地給藥，或者將其分成較小的劑量並每日、每半周一次等給藥，以維持有效劑量水平。通常，活性成分的每日劑量可以是約0.1至100mg/kg體重。適合體內給藥的劑量形式通常是每單位含有約0.1mg至500mg活性成分。以組合物的總重量計，活性成分可以在0.5至95重量％之間變化。
以組合物的總重量計，活性成分可以在0.5至95重量％之間變化。
在一些實施方案中，以組合物的總重量計，活性成分的劑量可以少於20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％重量。
在一些實施方案中，以組合物的總重量計，活性成分的劑量可以大於20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.5 0％、17.2 5％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、1.25％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％重量。
在一些實施方案中，以組合物的總重量計，活性成分的劑量為大約0.0001％至大約50％、大約0.001％至大約40％、大約0.01％至大約30％、大約0.02％至大約29％、大約0.03％至大約28％、大約0.04％至大約27％、大約0.05％至大約26％、大約0.06％至大約25％、大約0.07％至大約24％、大約0.08％至大約23％、大約0.09％至大約22％、大約0.1％至大約21％、大約0.2％至大約20％、大約0.3％至大約19％、大約0.4％至大約18％、大約0.5％至大約17％、大約0.6％至大約16％、大約0.7％至大約15％、大約0.8％至大約14％、大約0.9％至大約12％、大約1％至大約10％重量。
在一些實施方案中，活性成分的劑量等於或少於每千克體重10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些實施方案中，活性成分的劑量多於每千克體重0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
在一些實施方案中，活性成分的劑量是每千克體重0.0001-10g、0.0005-9g、0.001-8g、0.005-7g、0.01-6g、0.05-5g、0.1-4g、0.5-4g或1-3g。
通常，活性成分的每日劑量可以是約0.1至100mg/kg體重。適合於內部給藥的劑量形式通常每單位包含約0.1mg至500mg活性成分。在本發明的一些實施方案中，活性成分的劑量可以是0.1-10mg/kg體重。在本發明的一些實施方案中，活性成分的劑量可以是0.1-5mg/kg體重。在本發明的一些實施方案中，活性成分的劑量可以是0.1-2mg/kg體重。在本發明的一些實施方案中，活性成分的劑量可以是0.5-10mg/kg體重。在本發明的一些實施方案中，活性成分的劑量可以是0.5-2mg/kg體重。
在本發明的一些方面，提供單位劑量製劑用於將NKT細胞抑制劑製劑施用於患者。例如，這種單位劑量可以具有少於50mL、40mL、30mL、20mL、10mL、9mL、8mL、7mL、6mL、5mL、4mL、3mL、2mL、1mL、0.9mL、0.8mL、0.7mL、0.6mL、0.5mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL、0.1mL、0.09mL、0.08mL、0.07mL、0.06mL、0.05mL、0.04mL、0.03mL、0.02mL、0.01mL、0.009mL、0.008mL、0.007mL、0.006mL、0.005mL、0.004mL、0.003mL、0.002mL、0.001mL、0.0009mL、0.0008mL、0.0007mL、0.0006mL、0.0005mL、0.0004mL、0.0003mL、0.0002mL或0.0001mL的總體積。在一些實施方案中，這種單位劑量可以具有超過0.2mL但少於500mL的總體積。在一些實施方案中，這種單位劑量可以具有少於0.1mL的總體積。在一些實施方案中，這種單位劑量可以具有0.1-0.2mL(包括0.1mL和0.2mL)的總體積。在一些實施方案中，這種單位劑量可以具有少於0.1和大於0.2的總體積。
在一些實施方案中，一個單位劑量具有每個靶部位0.0001-500mL、0.0005-400mL、0.001-300mL、0.005-200mL、0.01-100mL、0.05-90mL、0.06-80mL、0.07-70mL、0.08-60mL、0.09-50mL、0.1-40mL、0.2-30mL、0.3-29mL、0.4-28mL、0.5-27mL、0.6-26mL、0.7-25mL、0.8-24mL、0.9-23mL、10-22mL、11-21mL、12-20mL、13-19mL、14-18mL或15-17mL的總體積。
裝置為了在相對較短的給藥時間內遞送相對較少體積的本發明製劑供吸入，可以利用具有相對較高的氣溶膠輸出率的吸入裝置施用該製劑。有用的裝置還可以顯示高釋放劑量效能(即，在裝置中的低殘留量)。為了增加系統的總效能，釋放可能限制在患者實際吸入的時間範圍內(即，呼吸致動)。因此，傳統的空氣噴射噴霧器可能顯示3μl/sec、大約4μl/sec、大約5μl/sec或不少於大約8μl/sec的氣溶膠輸出率。本發明實踐中可用的吸入裝置可以釋放裝載劑量的至少大約55％、至少大約65％、至少大約75％、更優選至少大約80％、最優選至少大約85％作為氣溶膠供患者吸入。在一些實施方案中，本發明所用的吸入裝置可以是呼吸致動的，並將釋放含有NKT細胞抑制劑的製劑的氣溶膠顆粒限制在患者實際吸入的時間範圍內。吸入器可以是手持的、獨立的(self-contained)及易攜帶的吸入器。在本發明另外一些實施方案中，可用於輸送濃縮的本發明NKT細胞抑制劑製劑的裝置，包括與壓縮機連接的傳統的空氣噴射噴霧器，該壓縮機能產生比傳統更高的輸出壓力。
下述實施例僅作說明，不起限制的作用。
實施例實施例1將α半乳糖基神經醯胺(來源於Brigham Young大學，Provo，UT)腹膜內注射至C57BL/6小鼠內通過選擇性激活NKT細胞增加了IL-4和IFN-γ的血清水平。腹膜內注射C12β半乳糖基神經醯胺(AvantiLipids Inc.)拮抗α半乳糖基神經醯胺增加這些小鼠血清中IL-4、IFN-γ和lgE水平的能力。
年齡在8周左右的雄性C57BL/6小鼠，或者腹膜內注射100μg β半乳糖基神經醯胺、腹膜內注射0.1μg α半乳糖基神經醯胺、或者在腹膜內注射0.1μg α半乳糖基神經醯胺前一小時或同時腹膜內注射100μg β半乳糖基神經醯胺，或者不進行治療。β半乳糖基神經醯胺從Avanti Lipids Inc.獲得。糖脂在含有PBS的水溶液中。細胞因子的水平通過先前Zeng等(2003)(同上)所描述的ELISA方法測定。6小時後處死所有的小鼠，測定血清中IFN-γ和IL-4的水平，結果如圖1A和1B所示。
IFN-γ的試驗結果顯示，正常(未處理的)小鼠的水平大約為50pg/ml。注射上述β半乳糖基神經醯胺並沒有提高該水平，但僅注射α半乳糖基神經醯胺使該水平增加超過兩倍。但是，當在注射α半乳糖基神經醯胺前一小時或同時注射β半乳糖基神經醯胺時，水平低於40pg/ml。這些結果說明β半乳糖基神經醯胺阻斷了由α半乳糖基神經醯胺引起的增加。
在對血清IL-4水平的測定中也觀察到了類似的現象。未處理的小鼠含有大約100pg/ml的IL-4，僅用100μg β半乳糖基神經醯胺沒有提高該水平。但是，0.1μg α半乳糖基神經醯胺卻使水平增加了大約10倍達到了1000pg/ml。當在注射0.1μg α半乳糖基神經醯胺前一小時注射100μg β半乳糖基神經醯胺時，這種增加完全被阻斷，而當同時給予這兩種糖脂時，IL-4的水平大約是250pg/ml。這些結果說明，β半乳糖基神經醯胺不僅能抑制α半乳糖基神經醯胺引起的血清IFN-γ水平的增加，還可以抑制IL-4水平的增加。我們的結論是，通過細胞因子向血清中的分泌來判斷，β半乳糖基神經醯胺可以阻斷α半乳糖基神經醯胺引起的體內NKT細胞的激活。
在一個獨立的實驗中，對三隻C57BL/6小鼠組一次腹膜內注射單獨的0.1μg α半乳糖基神經醯胺、單獨的100μg β半乳糖基神經醯胺、或者在注射0.1μg α半乳糖基神經醯胺前一小時注射100μgβ半乳糖基神經醯胺，在注射前或10天後測定平均血清IgE水平。結果顯示於圖1C和1D中，證明單獨α半乳糖基神經醯胺能夠增加IgE水平約3倍達約500ng/ml，β半乳糖基神經醯胺引起較小的增加，至大約400μg/ml，而糖脂組合導致大約250μg/ml的水平。條棒顯示三份測定的平均值，線段顯示了標準差。通過對獨立均值的studentt檢驗判斷，只有單獨的α半乳糖基神經醯胺組觀察到了之前與之後血清水平的顯著性差異(p＜0.05)。我們的結論是，β半乳糖基神經醯胺阻斷了α半乳糖基神經醯胺引起的血清IgE水平的增加。對照lgG2c表達未見明顯變化。
實施例2β半乳糖基神經醯胺對於哮喘的效果在鼠哮喘模型中，將β半乳糖基神經醯胺施用於OVA免疫的BALB/c小鼠，或具有α半乳糖基神經醯胺所引起的氣道高反應性(AHR)的小鼠。
材料和方法動物從Jackson Labora tory，Bar Harbor，ME獲得BALB/cByJ小鼠。史丹福大學動物福利委員會批准了本研究中使用的動物方案。
單克隆抗體通過硫酸銨沉澱和離子交換層析從腹水中純化單克隆抗體。使用下述雜交瘤R46A2(抗-IFN-γmAb)，來自於ATCC(美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD)，XMG1.2(抗-IFN-γ抗體)，BVD4-1D11、BVD6-24G2(抗-IL-4mAb)。抗-38C13獨特型mAb 4G10(大鼠lgG2a)用作同種型對照。
免疫。用吸附於200μg明礬(Al[OH]3)上的OVA(100μg/小鼠)對BALB/c小鼠的足墊預處理。7、8、9天後，用在50μl NaCl0.9％中的50μg OVA鼻內激發小鼠。最後一次鼻內OVA激發後一天，在吸入增加濃度的乙醯甲膽鹼後，用全身體積描記器測定清醒小鼠的氣道高反應性。如上所述進行α半乳糖基神經醯胺的免疫。
為了在鼻內施用抗原的過程中促進肺吸入，用生理鹽水中的0.25ml氯胺酮(0.44mg/ml)/甲苯噻嗪(6.3mg/ml)對小鼠進行腹膜內(i.p.)輕度麻醉。隨後，在肺內可檢測到75％的鼻內施用的抗原(Tsuyuki等人.(1997)J.Exp.Med.1851671-9)。
細胞因子ELISA。按此前Macaulay等人.(1998)J.Immunol.1601694-1000中描述的方法進行ELISA。利用的抗體對如下，按捕獲/生物素化檢測列出IL-4，BVD4-1D11/BVD6-24G2；IFN-γ，R4-6A2/XMG1.2。重組細胞因子用作標準物，對於IL-4從500到39pg/ml，對於IFN-γ從20到2156ng/ml，以1∶2稀釋製作曲線。
抗OVA抗體同種型的測定。在殺死小鼠時取血，利用改進的抗原特異性ELISA測定OVA特異性抗體。為了測定OVA特異性IgG，用5μg/ml OVA包被平板，過夜。在冼滌和封閉後，將連續稀釋的血清加入平板中。經過一夜溫育後，將HRPO結合的山羊抗IgG亞類特異性抗體(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，ALA)加至平板。再次洗滌後，加入OPD底物，使平板顯色並在492nm下測定OD。利用抗OVA IgG1 mAb 6C1和抗OVAI gG2a mAb 3A11作為標準物定量測定每一種IgG亞類。通過ELISA測定OVA特異性IgE，利用大鼠抗小鼠IgE mAb EM95(5.0μg/ml)包被平板。在加入樣品並溫育過夜後，洗滌平板並加入生物素化的OVA(10μg/ml)。兩小時後，洗滌平板，並加入HRPO結合的鏈黴抗生物素蛋白(SouthernBiotechnology Associates)。用OPD底物使平板顯色並在492nm下測定OD。利用ELISA定量測定用明礬中的OVA超免疫的小鼠血清中的IgE，用OVA特異的IgE作為標準。
氣道反應性的測定。根據乙醯甲膽鹼誘發的氣流阻塞，評估置於全身體積描記器(型號PLY 3211，Buxco Electronics Inc.，Troy，NY)中的清醒小鼠的氣道反應性。利用下述公式根據Penh對肺氣流阻塞進行測定Penh=(TeRT-1)(PEFPIF),]]>其中，Penh＝增強的中止(無因次的)，Te＝呼氣時間，RT＝放鬆時間，PEF＝呼氣流峰值(ml/s)，PIF＝吸氣流峰值(ml/s)(Hamelmann等人.(1997)Am.J.Respir.Crit.Care Med.156766-75。由室壓獲得增強的中止(Penh)、分鐘量、潮氣量和呼吸頻率，室壓用連接前置放大器模塊(型號MAX2270)的換能器(型號TRD5100)進行測量，並利用XA軟體系統(型號SFT 1810)進行分析。通過將小鼠暴露於0.9％NaCl中2分鐘測定乙醯甲膽鹼反應性。
BAL液的收集和肺組織學。給動物腹膜內注射致死劑量的苯巴比妥(450mg/kg)。將導管插入氣管，然後用0.8ml PBS灌洗肺三次，收集液體。利用血細胞計數器計數灌洗液中的細胞，在用Hansel染液(Lide Laboratories，Florissant，MO)染色的載玻片上確定BAL細胞的區別。基於傳統的形態學標準通過光學顯微鏡檢查至少可以區分200種細胞。在一些動物中，不進行BAL，而是取出肺，用PBS衝洗，用10％福馬林固定，然後用蘇木精和伊紅染色。
結果用C12-β-半乳糖基神經醯胺處理阻斷了α半乳糖基神經醯胺引起的AHR。如圖2所示，在鼻內施用1.5μg α半乳糖基神經醯胺2小時前靜脈內施用100μg C12-β-半乳糖基神經醯胺靜脈，極大地減小了24小時的AHR。靜脈注射單獨的C12-β-半乳糖基神經醯胺並不誘導任何AHR。(b)在鼻內施用0.5μg α-半乳糖基神經醯胺之前2小時鼻內及靜脈施用50μg C12 β-半乳糖基神經醯胺，大大減小了24小時的AHR，但鼻內施用的C12 β-半乳糖基神經醯胺引起輕微的AHR。每一組最少要用4隻小鼠。
用C12-β-半乳糖基神經醯胺處理減少了OVA/明礬引起的AHR。如圖3所示，通過腹膜內注射100μg OVA及200μg氫氧化鋁(明礬)使小鼠致敏，然後用50μg OVA在7、8、9天後鼻內激發。(a)在第10天測定AHR。在OVA/明礬致敏前1天及在每次鼻內激發前6小時靜脈注射C12-β-半乳糖基神經醯胺(100μg)。這種處理顯示可以減小AHR。(b)在C12-β-半乳糖基神經醯胺處理組，血清OVA特異性IgE減少。(c)在用62.5μg/ml OVA(每個孔中5.0×106個細胞)培養4天後，C12-β-半乳糖基神經醯胺處理組的淋巴結細胞產生的IFN-γ稍多、IL-4較少。每一組測定4隻小鼠。
用抗CD1d抗體(HB323)處理阻斷了OVA/明礬引起的AHR。如圖4所示，(a)通過腹膜內注射100μg OVA及200μg氫氧化鋁(明礬)使小鼠致敏，然後用50μg OVA在7、8、9天後鼻內激發。在第10天測定AHR。在OVA/明礬致敏(500μg)前1天及恰好在鼻內激發(500μg)前腹膜內注射抗CD1d抗體。這種處理顯示可以降低AHR。(b)用抗CD1d抗體(HB323)處理減小了淋巴結細胞因子的產生。在OVA/明礬致敏及氣道激發後的第11天，每個孔中建立了5.0×105個細胞的淋巴結培養物。用125μg/ml的OVA處理培養物，用ELISA方法測定上清液中的細胞因子。每一組最少要用4隻小鼠，數據代表2次實驗。
在α半乳糖基神經醯胺引起AHR後，C12-β-半乳糖基神經醯胺引起更多的血清IFN-γ產生。組織學顯示，C12-β-半乳糖基神經醯胺治療可以減少細支氣管周嗜酸性細胞的炎症。重要的是，靜脈注射C12-β-半乳糖基神經醯胺本身並不導致任何肺部炎症。C12-β-半乳糖基神經醯胺處理組具有大的支氣管及縱膈淋巴結。這些小鼠在組織學上顯示減少但仍存在的肺嗜酸性細胞浸潤，伴隨可能比OVA/明礬陽性對照更多的中性白細胞增多。組織學還證明，在用抗CD1d處理的小鼠的肺中嗜酸性細胞炎症減少(但仍然存在)。HB323阻斷提供了最佳結果，利用1B1抗CD1d抗體也可以引起AHR的降低。
這些數據證實，NKT細胞參與了AHR和哮喘的發展，並進一步證實了阻斷劑β-半乳糖基神經醯胺和抗CD1d在治療這些疾病中的有效性。
實施例3抑制劑的口服口服劑量為100-800μg/小鼠的β-半乳糖基神經醯胺。利用此前Zeng等人.(2003)(同上)所描述的ELISA測定IFN-γ和IL-4細胞因子的水平。
IFN-γ實驗顯示，給藥後24小時，任何劑量都不導致血清水平的增加。測定血清IL-4水平也觀察到類似的結果。
如圖5所示，β-半乳糖基神經醯胺口服給藥導致在肝中NKT細胞標誌物的染色減少。
100-800μg/小鼠的劑量相當於劑量為4-32mg/kg。利用FDA關於人類等量的指南，人類的相當劑量為0.32-2.6mg/kg。
實施例4狼瘡的治療在系統性紅斑狼瘡的鼠模型，NZBxNZW小鼠中，這些動物每周兩次注射PBS、50μg/小鼠的β-半乳糖基神經醯胺、或100μg/小鼠的β-半乳糖基神經醯胺之一。分析動物的蛋白尿情況，蛋白尿是狼瘡發展的指徵。在15隻小鼠的對照組中，在38周時，約30％的小鼠未出現蛋白尿，而用高劑量β-半乳糖基神經醯胺治療的小鼠約有80％未出現蛋白尿。這些數據說明，β-半乳糖基神經醯胺可以抑制該模型中狼瘡的進展。
在本說明書中引用的所有出版物及專利申請均引入本文作為參考，如同每一單獨的出版物或專利申請都明確地並個別地引用作為參考。
儘管為了清楚理解的目的通過舉例說明和實施例對上述發明進行了較詳細的描述，但本領域技術人員根據本發明的教導顯然應當知道，可以對其進行一定的改變和調整，而不會偏離權利要求書的精神或範圍。
權利要求
1.一種治療哺乳動物中與不希望的NKT細胞激活相關的疾病的方法，該方法包括給予所述患者有效劑量的NKT細胞抑制劑，其中所述抑制劑的特徵是通過與抗原遞呈分子相互作用而抑制NKT細胞的免疫功能。
2.根據權利要求1的方法，其中所述疾病是系統性紅斑狼瘡或其動物模型。
3.根據權利要求1的方法，其中所述疾病是變應性疾病。
4.根據權利要求1的方法，其中所述疾病是哮喘。
5.根據權利要求1的方法，其中所述哺乳動物是人。
6.根據權利要求1的方法，其中所述哺乳動物是小鼠。
7.根據權利要求1的方法，其中所述NKT細胞抑制劑是一種具有如下通式結構的非激活的糖脂G-L其中L是一種脂質，G是一種糖。
8.根據權利要求7的方法，其中糖和脂質之間的連接可以在任何一個O原子處，並且是α或β構型。
9.根據權利要求8的方法，其中G是半乳糖。
10.根據權利要求8的方法，其中L選自C8至C30脂肪酸、長鏈仲醇、長鏈氨基醇、脂肪酸與長鏈二羥基或三羥基鹼的醯胺，它們之中的任何一種任選地被磷酸化或硫酸化。
11.根據權利要求10的方法，其中L是神經醯胺。
12.根據權利要求1的方法，其中所述NKT細胞抑制劑是β-半乳糖基神經醯胺。
13.一種篩選用於治療哮喘的治療劑的方法，該方法包括使候選製劑與NKT細胞接觸，以確定該製劑在抑制NKT細胞激活方面的有效性。
14.一種篩選用於治療系統性紅斑狼瘡的治療劑的方法，該方法包括使候選製劑與NKT細胞接觸，以確定該製劑在抑制NKT細胞激活方面的有效性。
15.根據權利要求13和14任一項的方法，其中所述候選製劑是一種具有如下通式結構的非激活的糖脂G-L其中L是一種脂質，G是一種糖。
16.根據權利要求15的方法，其中糖和脂質之間的連接可以在任何一個O原子處，並且是α或β構型。
17.根據權利要求15的方法，其中G是半乳糖。
18.根據權利要求15的方法，其中L選自C8至C30脂肪酸、長鏈仲醇、長鏈氨基醇、脂肪酸與長鏈二羥基或三羥基鹼的醯胺，它們中的任何一種任選地被磷酸化或硫酸化。
全文摘要
向患者施用與NKT細胞抗原受體及其對應的抗原遞呈分子相互作用，但抑制NKT細胞免疫功能的分子。特別有意義的情況包括治療系統性紅斑狼瘡(SLE)、癌症、動脈粥樣硬化及變應性疾病。在本發明的某些實施方案中，抑制劑是一種無應答的糖脂，例如β－半乳糖基神經醯胺。提供了這種糖脂的藥物組合物，其用於治療涉及不希望的NKT細胞激活的疾病。
文檔編號A61K31/70GK101031307SQ200580033099
公開日2007年9月5日 申請日期2005年11月2日 優先權日2004年11月2日
發明者S·斯特羅伯, E·H·邁耶, D·T·烏梅特蘇 申請人:小利蘭史丹福大學託管委員會