血紅素蛋白質的生產方法與流程

2023-05-02 11:10:26

本發明涉及血紅素蛋白質的生產方法。
背景技術：
：以往進行著使用微生物細胞等的有用人蛋白質的量產。使用大腸桿菌細胞等量產作為與藥物代謝相關的血紅素蛋白質的細胞色素P450等的技術也是其中之一。美國專利申請公開第2005-0130116號公開，在大腸桿菌表達系統中，通過添加作為血紅素的類似體的氯化血紅素製造內包血紅素的細胞色素P450的方法。技術實現要素：【發明要解決的技術課題】在如美國專利申請公開第2005-0130116號一樣以在培養基中培養細胞作為必須的技術中，有施用大量的氯化血紅素的必要。本發明人作為不以培養基作為必要的表達系統，關注蠶表達系統。本發明人在用蠶表達系統製造血紅素蛋白質的重組體時，對於由病毒感染等的方法表達誘導的蛋白質的產生量，追蹤不到蠶所具有的內源性的血紅素合成，結果發現，有主要產生出欠缺血紅素的蛋白質的問題。在大腸桿菌或昆蟲細胞等的培養表達系統中，取通過向培養基中添加輔因子補充血紅素的方法，但在蠶表達系統中未進行那樣的探討。【解決課題的技術方案】本發明人在重複銳意探討的結果發現，通過向重組蛋白質表達誘導後的鱗翅目昆蟲個體施用血紅素前體或血紅素類似物，內包血紅素的活性型的血紅素蛋白質的調製變得可能，由此可解決上述的課題，從而完成本發明。即，由本發明提供血紅素蛋白質的生產方法，其包括：嚮導入了編碼血紅素蛋白質的胺基酸序列的多核苷酸的鱗翅目昆蟲個體施用選自血紅素前體及血紅素類似物的至少1種，在所述鱗翅目昆蟲個體中使血紅素蛋白質產生的工序；及從所述鱗翅目昆蟲個體，取得所述血紅素蛋白質的工序。另外，由本發明提供含細胞色素P450、細胞色素P450還原酶和細胞色素的組合物的生產方法，其包括嚮導入了編碼細胞色素P450的胺基酸序列的多核苷酸和編碼細胞色素P450還原酶的胺基酸序列的多核苷酸的第1鱗翅目昆蟲個體、及導入了編碼細胞色素的多核苷酸的第2鱗翅目昆蟲個體的各自施用選自血紅素前體及血紅素類似物的至少1種，使在所述鱗翅目昆蟲個體中產生血紅素蛋白質的工序；從所述第1及第2鱗翅目昆蟲個體，各自取得含細胞色素P450和細胞色素P450還原酶的第1微粒體級分及含細胞色素的第2微粒體級分的工序；使所述第2微粒體級分增溶，取得增溶級分的工序；將所述第1微粒體級分和所述增溶級分混合，取得組合物的工序。【發明效果】由本發明提供在使用鱗翅目昆蟲的蛋白質產生系統中產生內包血紅素的活性型的血紅素蛋白質的方法。【附圖說明】【圖1】是載體pM01的載體圖譜。【圖2】是顯示純化CYP3A4蛋白質溶液的吸光光譜的圖。【圖3】是顯示氯化血紅素施用後的蠶蛹中的氯化血紅素分布的照片。【圖4】是顯示從在病毒感染後第4天或第5天施用氯化血紅素的蛹調製的微粒體級分的CYP3A4代謝活性的坐標圖。【圖5】是顯示在病毒感染起後第3天或第4天施用氯化血紅素的蛹調製的微粒體級分的CYP3A4代謝活性的坐標圖。【圖6】是顯示從施用氨基乙醯丙酸及鐵離子的蛹調製的微粒體級分的CYP3A4代謝活性的坐標圖。【圖7】是顯示從施用各種濃度的氨基乙醯丙酸的蛹調製的微粒體級分的CYP3A4代謝活性的坐標圖。【圖8】是顯示從施用氯化血紅素及/或氨基乙醯丙酸的蛹調製的微粒體級分的CYP3A4代謝活性的坐標圖。【圖9】是顯示從施用氨基乙醯丙酸的蛹純化的CYP3A4蛋白質溶液的吸光光譜的圖。【圖10】是顯示從施用氯化血紅素的蛹純化的細胞色素b5蛋白質溶液的吸光光譜的圖。【圖11】是顯示添加細胞色素b5的微粒體級分的CYP3A4代謝活性的坐標圖。【圖12】是蠶來源微粒體級分及市售微粒體級分的電泳圖。【圖13】是顯示從施用氯化血紅素及氨基乙醯丙酸的蛹調製的微粒體級分的CYP1A2代謝活性的坐標圖。【圖14】是顯示從施用氯化血紅素及氨基乙醯丙酸的蛹調製的微粒體級分的CYP2C8代謝活性的坐標圖。【圖15】是顯示從施用氯化血紅素及氨基乙醯丙酸的蛹調製的微粒體級分的CYP2C9代謝活性的坐標圖。【圖16】是顯示從施用氯化血紅素及氨基乙醯丙酸的蛹調製的微粒體級分的CYP2C19代謝活性的坐標圖。【圖17】是顯示從施用氯化血紅素及氨基乙醯丙酸的蛹調製的微粒體級分的CYP2D6代謝活性的坐標圖。【實施方式】本發明的血紅素蛋白質的生產方法包括嚮導入編碼血紅素蛋白質的胺基酸序列的多核苷酸的鱗翅目昆蟲個體施用選自血紅素前體及血紅素類似物的至少1種，在鱗翅目昆蟲個體中使血紅素蛋白質產生的工序。血紅素蛋白質只要是結合了被稱為血紅素的卟啉鐵絡合物的全蛋白質，就不特別限定。作為血紅素蛋白質，可舉出例如細胞色素P450、細胞色素、血紅蛋白、肌紅蛋白、過氧化物酶、細胞色素c、細胞色素b、CooA、HemT等。在本實施方式中，血紅素蛋白質優選是細胞色素P450及/或細胞色素。細胞色素P450優選為CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A5、CYP2J2、CYP4F2、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2D6*10、CYP2D6*39。再者，「*」表示基因多型。細胞色素優選為細胞色素b、細胞色素c。具體而言，可例示細胞色素b5(以下也稱為「細胞色素b5」)。另外，血紅素蛋白質中的血紅素和載脂蛋白的結合方式不特別限定。例如，可對載脂蛋白的空孔(有時稱為血紅素袋)配位鍵合，也可由疏水性相互作用或靜電相互作用結合。對於一部分的血紅素蛋白質進行立體結構解析，由此其呈現以血紅素內包在載脂蛋白的空孔的方式結合，所以在現有
技術領域：
中，有時將血紅素蛋白質的胺基酸序列部分(載脂蛋白)和血紅素結合而血紅素蛋白質化稱為「內包血紅素」。一般公知，血紅素蛋白質中血紅素成為活性中心，由血紅素蛋白質整體的結構產生出多樣的功能。作為這樣的功能，可舉出例如血紅蛋白或肌紅蛋白等的氧搬運－儲藏功能、細胞色素P450或過氧化物酶等的氧化酶的功能、細胞色素c及細胞色素b等的電子傳遞功能、CooA或HemT等的氣體傳感器功能等。在本實施方式中，血紅素蛋白質可有這些中的任何功能，也可有公知血紅素蛋白質可有的其他任何的功能。在本實施方式中，血紅素蛋白質可為例如以下的表1所示的蛋白質。編碼這些的血紅素蛋白質的基因只要是來源於有那些血紅素蛋白質的期望的動物種的單離的編碼血紅素蛋白質的基因，就不特別限定，但優選是人來源的編碼血紅素蛋白質的基因。【表1】在本發明中，血紅素是指含作為活體內存在的主要的血紅素的血紅素a、血紅素b及血紅素c。即，在本發明中意圖的血紅素蛋白質也可為結合有這些中任何的血紅素的蛋白質。在優選的實施方式中，血紅素蛋白質是在鱗翅目昆蟲的活體內合成的結合了血紅素的全蛋白質。鱗翅目昆蟲只要是對於重組蛋白質的表達適宜的公知的鱗翅目昆蟲，就不特別限定。例如可舉出蠶(Bombyxmori)、黃領麻紋燈蛾(Spilosomaimparilis)、柞蠶(Antheraeapernyi)、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)等。在它們之中也特別優選為蠶。鱗翅目昆蟲個體可為成蟲、蛹及幼蟲的任何的形態，從絲氨酸蛋白酶的活性及對杆狀病毒的感受性的觀點，優選使用蛹。在優選的實施方式中，由於使用蠶的蛹，與作為宿主的大腸桿菌或酵母或昆蟲來源的培養細胞株相比，可以少量的輔因子不需培養設備地製造含有純度高且高濃度的血紅素蛋白質的高比活性的微粒體級分。另外，由於是向蠶蛹直接施用輔因子的方法，與大腸桿菌或昆蟲細胞等使用培養基的表達系統比可降低高價的輔因子的使用量。在鱗翅目昆蟲個體中導入編碼血紅素蛋白質的胺基酸序列的多核苷酸。多核苷酸只要在鱗翅目昆蟲個體中表達血紅素蛋白質的胺基酸序列部分(載脂蛋白)，就可以任何的形態導入。優選為，多核苷酸被整合到有使鱗翅目昆蟲個體中的基因表達成為可能的啟動子，能在啟動子的下遊插入多核苷酸的載體DNA，更優選為，向能由與杆狀病毒DNA的同源重組製作重組杆狀病毒的轉移載體插入。這樣的載體DNA本身在現有技術中公知，可舉出例如pM01、pM02、pYNG、pBM030、pBM050、pVL1392等。在優選的實施方式中，使用pM01。pM01的載體圖譜示於圖1。再者，所述的啟動子可在現有技術中從公知的啟動子適宜選擇，可舉出例如多角體蛋白啟動子、p10啟動子、蠶肌動蛋白啟動子等。另外，在多核苷酸上也可融合編碼本領域技術人員公知的標籤的多核苷酸、例如編碼DDDDK標籤的多核苷酸、例如編碼SEQIDNO：1所示的胺基酸序列的多核苷酸等。這樣的標籤能使血紅素蛋白質的取得變得容易。在併入了編碼所述的血紅素蛋白質的胺基酸序列的多核苷酸的載體DNA中，在啟動子的下遊整合了編碼血紅素蛋白質的多核苷酸。其中，在此多核苷酸上融合編碼標籤的多核苷酸時，編碼標籤的多核苷酸也可向編碼血紅素蛋白質的胺基酸序列的多核苷酸的上遊或下遊插入。多核苷酸可根據本領域技術人員公知的方法人工地合成。在本發明的生產方法中，在鱗翅目昆蟲個體中使血紅素蛋白質的胺基酸序列部分(載脂蛋白)表達。在鱗翅目昆蟲個體中使載脂蛋白表達的手段不特別限定，可由本領域技術人員適宜決定。例如，可通過將載體DNA由公知的基因導入法直接轉染到鱗翅目昆蟲個體使載脂蛋白表達。在本發明的優選的實施方式中，可通過使由所述的載體DNA重組的杆狀病毒感染鱗翅目昆蟲個體使載脂蛋白表達。將杆狀病毒用有期望的鹼基序列的DNA重組的方法本身在現有技術中公知。例如，當載體DNA是轉移載體時，將由限制性內切酶等線性化的杆狀病毒DNA和整合了編碼血紅素蛋白質的胺基酸序列的多核苷酸的載體DNA向鱗翅目昆蟲的培養細胞共轉染，通過篩選感染細胞，可得到重組杆狀病毒。在本發明的實施方式中，杆狀病毒的種類只要是能感染所述的鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養細胞的病毒，就不特別限定，但優選是核多角體病病毒(NPV)或其改變病毒。具體而言，可例示BmNPV、HycuNPV、AnpeNPV、AcNPV、蠶蛾科的蠶(Bombyxmori)或夜蛾科的苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)等的感染兩宿主的重組杆狀病毒(參照特開2003-52371號公報)等。在優選的實施方式中，使用半胱氨酸蛋白酶缺損(CPd)杆狀病毒(參照特開平7-303488號)。使重組杆狀病毒感染鱗翅目昆蟲個體的手段不特別限定，可從在現有技術中公知的方法適宜選擇。例如，感染鱗翅目昆蟲時可舉出向該昆蟲注射含重組杆狀病毒的液的方法等。通過在使鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養細胞感染病毒後飼育或培養指定的期間(例如1～4天)，可使血紅素蛋白質的胺基酸序列部分(載脂蛋白)表達。在鱗翅目昆蟲中也可進一步導入編碼血紅素蛋白質的輔酶的胺基酸序列的多核苷酸。導入方法與對於血紅素蛋白質所述的方法相同。作為這樣的輔酶，可舉出例如細胞色素P450還原酶等。可使輔酶在血紅素蛋白質的近傍表達。在1個的實施方式中，輔酶是細胞色素P450還原酶(CPR)。編碼CPR的基因只要是來源於有CPR的期望的動物種的單離的CPR基因，就不特別限定，但優選是編碼人CPR的基因。再者，人CPR的胺基酸序列部分的基因的鹼基序列本身是公知的，例如，在由美國國立醫學圖書館的國立生物信息中心提供的資料庫中，以登錄號NM_000941登記。在別的實施方式中，輔酶是作為細胞色素之一的細胞色素b5。對於細胞色素b5是如上所述。在再別的實施方式中，輔酶是人CPR及細胞色素b5這兩者。在鱗翅目昆蟲個體中使輔酶表達的手段不特別限定，可由本領域技術人員適宜決定。例如，可通過將載體DNA由公知的基因導入法直接轉染到鱗翅目昆蟲個體使輔酶表達。在本發明的優選的實施方式中，通過使利用所述的載體DNA重組的杆狀病毒感染鱗翅目昆蟲個體而使載脂蛋白表達。此時，編碼輔酶的胺基酸序列的多核苷酸可向與編碼血紅素蛋白質的胺基酸的多核苷酸相同的載體DNA插入，也可向各自不同的載體DNA插入。另外，編碼血紅素蛋白質的胺基酸序列的多核苷酸和編碼輔酶的多核苷酸可整合到相同的杆狀病毒中，也可整合到各自不同的杆狀病毒中。在編碼血紅素蛋白質的胺基酸序列的多核苷酸和編碼輔酶的多核苷酸整合到不同的杆狀病毒上時，通過使這些杆狀病毒對1隻鱗翅目昆蟲個體共感染，可使血紅素蛋白質和輔酶共表達。另外，也可通過用這些的杆狀病毒分別感染各自2個鱗翅目昆蟲個體，在不同的鱗翅目昆蟲個體中表達。在使編碼血紅素蛋白質的胺基酸序列的多核苷酸和編碼輔酶的多核苷酸在相同的鱗翅目昆蟲個體中共表達時，它們的混合比率只要能產生血紅素蛋白質，就不特別限定。混合比率是例如以病毒效價500:1～1:500左右、優選為150:1～1:150左右。血紅素前體只要是可在活體內轉變為血紅素的分子，就不特別限定，但優選為分子量小的。優選為，血紅素前體是血紅素合成途徑的中間體。作為這樣的中間體，可舉出例如氨基乙醯丙酸(以下也稱為「ALA」)、膽染料原、羥甲基膽色烷、尿卟啉原III、糞卟啉原III、原卟啉原、原卟啉原IX等。更優選為，血紅素前體是氨基乙醯丙酸。作為血紅素類似物，只要是有與血紅素類似的結構及/或功能的分子，就不特別限定，但優選為分子量小的。作為血紅素類似物，旨在包含所謂的合成血紅素，可舉出向有卟啉骨架的化合物配位鐵的分子、例如氯化血紅素、高鐵血紅素等。血紅素前體或血紅素類似物可作為溶液施用，也可作為固體施用。優選為，作為溶液施用。在作為溶液施用時，作為溶劑，可舉出二甲基亞碸(DMSO)、水、生理鹽水、緩衝液及氫氧化鈉水溶液以及它們的混合物等。優選為，溶劑是二甲基亞碸。所述的溶劑也可還含溶解促進劑。這樣的溶解促進劑本身可為固體、液體或氣體的任一者，在是固體或氣體時可溶解於適宜溶劑而使用。作為溶解促進劑，可舉出例如碳原子數1～6的低級醇。作為碳原子數1～6的低級醇的具體例，可舉出乙醇、丙二醇、這些的混合物等。溶解促進劑是液體時，還可將溶解促進劑作為溶劑本身使用。除血紅素前體或血紅素類似物之外，也可再施用鐵。鐵可為2價，也可為3價。鐵可由本領域技術人員公知的方法製造。鐵可商業上得到。例如，可舉出氯化鐵(II)(Iron(II)chloride四水合物、和光純藥)、檸檬酸鐵(III)(Iron(III)citrate、Sigma-Aldrich)等。鐵本身可在任意的溶劑中作為離子存在，也可為固體。在優選的實施方式中，在與血紅素前體及/或血紅素類似物相同的溶劑中作為離子存在。對離子只要能產生血紅素蛋白質，就不特別限定。優選是氯離子或檸檬酸根離子。所述血紅素前體的施用量是只要能產生血紅素蛋白質，就不特別限定。血紅素前體的施用量的上限優選為每一個體0.7mg、更優選為每一個體0.27mg、再優選為每一個體0.067mg。血紅素前體的施用量的下限優選為每一個體0.001mg、更優選為每一個體0.0034mg、再優選為每一個體0.017mg。在本實施方式中，例如，以每1處50μl的量向2處施用作為血紅素前體2mM(0.34mg/ml)的濃度的氨基乙醯丙酸。即，在本實施方式中，每一個體施用0.034mg的氨基乙醯丙酸。所述血紅素類似物的施用量是只要能產生血紅素蛋白質，就不特別限定。血紅素類似物的施用量的上限優選為每一個體3mg、更優選為每一個體0.65mg、再優選為每一個體0.16mg。血紅素類似物的施用量的下限優選為每一個體0.001mg、更優選為每一個體0.02mg、再優選為每一個體0.04mg。在本實施方式中，例如，以每1處50μl的量向2處施用作為血紅素類似物1.25mM(0.82mg/ml)的濃度的氯化血紅素。即，在本實施方式中，每一個體施用0.082mg的氯化血紅素。所述血紅素前體及血紅素類似物的施用手段是只要能產生血紅素蛋白質，就不特別限定。例如，可由注射、經口、塗布等施用。優選為，由注射施用。在優選的實施方式中，將作為血紅素類似物的氯化血紅素、作為血紅素前體的氨基乙醯丙酸或它們的混合物向作為鱗翅目昆蟲個體的蠶蛹的腹部體節、更具體而言腹部體節4-5間及6-7間的2處施用。但是，此實施方式不排除向蠶蛹個體的其他場所施用血紅素類似物及血紅素前體。只要能產生血紅素蛋白質，就可向任何的場所施用。所述血紅素前體及血紅素類似物的施用時期是只要能產生血紅素蛋白質，就不特別限定。優選為，在多核苷酸的導入後第2～5天、更優選為第3～4天施用。作為所述血紅素前體及血紅素類似物施用2種以上的物質時，它們可混合，也可不混合而同時或分別施用，或者也可以任意的順序依次施用。血紅素前體及血紅素類似物被認為在鱗翅目昆蟲個體內分解等而轉變為血紅素，或者以原本的狀態與血紅素蛋白質的胺基酸序列部分(載脂蛋白)結合，產生血紅素蛋白質(全蛋白質)。以往，在使用蠶的血紅素蛋白質產生中，血紅素蛋白質的胺基酸序列部分(載脂蛋白)和血紅素的結合不良好地發生，得到的蛋白質處於載脂蛋白的狀態。本發明人認為，這是因為蠶體內的內源性的血紅素合成量上不足。本次、通過向蠶蛹施用血紅素前體或血紅素類似物，補充此內源性的血紅素合成的不足，在蠶表達系統中也可合成血紅素蛋白質是由本發明人的驚人的成果。本發明的生產方法大腸桿菌或如昆蟲細胞一樣的需要培養基的表達系統比，可抑制昂貴的輔因子的使用量。接下來，例示本發明的產生工序中涉及的優選的實施方式。但是，本發明不限於這些實施方式。在第1優選的實施方式中，作為血紅素蛋白質使用細胞色素P450。細胞色素P450是以脂質雙膜作為支架發揮功能的蛋白質，與藥物代謝相關。具體而言，將藥物的-H基轉變為-OH基，擔負藥物的代謝。在第1優選的實施方式中，嚮導入了編碼細胞色素P450的胺基酸序列的多核苷酸的蠶施用氯化血紅素、氨基乙醯丙酸或它們的混合物，在蠶中產生細胞色素P450。在第2優選的實施方式中，作為血紅素蛋白質使用細胞色素b5。細胞色素b5可作為以脂質雙膜作為支架的膜蛋白質發揮功能。在第2優選的實施方式中，嚮導入了編碼細胞色素b5的胺基酸序列的多核苷酸的蠶施用氯化血紅素、氨基乙醯丙酸或它們的混合物，在蠶中產生細胞色素b5。在第3優選的實施方式中，作為血紅素蛋白質使用細胞色素P450及作為輔酶使用細胞色素P450還原酶(CPR)。細胞色素P450還原酶在細胞色素P450的近傍發揮功能，向細胞色素P450提供在將NADPH轉變為NADP+的過程得到的電子。通過細胞色素P450還原酶存在於細胞色素P450的近傍，可發揮細胞色素P450的代謝功能，從而優選。在第3優選的實施方式中，嚮導入了編碼細胞色素P450的胺基酸序列的多核苷酸及編碼細胞色素P450還原酶的多核苷酸的蠶施用氯化血紅素、氨基乙醯丙酸或它們的混合物，在蠶中產生細胞色素P450及細胞色素P450還原酶。在第4優選的實施方式中，作為血紅素蛋白質使用細胞色素P450以及作為輔酶細胞色素P450還原酶及細胞色素b5。如上所述，細胞色素b5也可作為以脂質雙膜作為支架的膜蛋白質發揮功能，但通過增溶及/或純化而添加到含細胞色素P450及細胞色素P450還原酶的微粒體級分，也可作為在從膜游離的狀態下增大由細胞色素P450的藥物代謝活性的輔因子發揮功能。在第4優選的實施方式中，嚮導入了編碼細胞色素P450的胺基酸序列的多核苷酸及編碼細胞色素P450還原酶的多核苷酸的第1蠶、及導入了編碼細胞色素b5的多核苷酸的第2蠶各自施用氯化血紅素、氨基乙醯丙酸或它們的混合物，在這些蠶中產生細胞色素P450、細胞色素P450還原酶及細胞色素b5。本發明的血紅素蛋白質的生產方法包括從鱗翅目昆蟲個體取得血紅素蛋白質的工序。取得方法不特別限定，可根據生產的血紅素蛋白質的種類或性質由本領域技術人員適宜選擇。例如，在為了血紅素蛋白質發揮功能而需要脂質雙層的支架時，可通過得到微粒體級分而取得，在血紅素蛋白質在線粒體中發揮功能時，可通過得到線粒體級分而取得。取得的時期不特別限定，可根據生產的血紅素蛋白質或宿主鱗翅目昆蟲個體的種類或性質由本領域技術人員適宜選擇。例如可舉出，多核苷酸的導入起3～8天後，優選為4～6天後等。在優選的實施方式中，在多核苷酸導入起6天後取得血紅素蛋白質。在優選的實施方式中，血紅素蛋白質是以脂質雙層作為支架發揮功能的細胞色素P450。由於細胞色素P450在小胞體中多量存在，通過取得微粒體級分而取得血紅素蛋白質。更具體而言，首先，由磨碎、超聲波破碎或溶解於含表面活性劑等的細胞溶解劑的溶液等破碎鱗翅目昆蟲個體的細胞而調製勻漿，通過以1,000g程度的低轉數離心分離使核級分沉澱，再通過將該上清以9,000g程度的略高轉數離心分離使線粒體級分沉澱，再通過將該上清由100,000g程度的轉數的超離心分離使微粒體級分沉澱，可取得與脂質雙層的支架結合的狀態的細胞色素P450(血紅素蛋白質)。如上所述，在脂質雙層的支架結合的狀態下取得血紅素蛋白質等時，得到的血紅素蛋白質也可使用增溶劑進一步增溶。由增溶除去脂質雙層，可使血紅素蛋白質游離。增溶劑只要不給得到的血紅素蛋白質的結構及功能帶來影響，就不特別限定。作為增溶劑，例如，使用本領域技術人員公知的表面活性劑。更具體而言可舉出膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉等的陰離子系表面活性劑、十六烷基三甲基銨溴化物等的陽離子系統表面活性劑、CHAPS等的兩性表面活性劑、或者這些的混合物。增溶的原料不限於微粒體級分。破碎蠶蛹，從分級分離的任何的級分均可增溶。優選是微粒體級分。如上所述，增溶的血紅素蛋白質等也可使用層析法等的本領域技術人員公知的方法進一步純化。在優選的實施方式中，使用凝膠過濾層析法或陽離子交換層析法。增溶而得到的純化血紅素蛋白質等也可使用脂質體或Nanodisc等的本領域技術人員公知的方法在脂質雙膜上再構建。接下來，例示本發明的取得工序中涉及的優選的實施方式。但是，本發明不限於這些的實施方式。在第1優選的實施方式中，在產生工序中產生的血紅素蛋白質是細胞色素P450。如上所述，細胞色素P450是以脂質雙膜作為支架發揮功能的蛋白質，在小胞體中多量存在。從而，在取得工序中，取得微粒體級分。微粒體級分可根據如上所述的本領域技術人員公知的離心分離法取得。細胞色素P450優選在與脂質雙層的支架結合的狀態下取得。在第2優選的實施方式中，在產生工序中產生的血紅素蛋白質是細胞色素b5。如上所述，細胞色素b5是以脂質雙膜作為支架發揮功能的蛋白質，在小胞體中多量存在。從而，在取得工序中，取得微粒體級分。微粒體級分可根據如上所述的本領域技術人員公知的離心分離法取得。細胞色素b5優選在與脂質雙層的支架結合的狀態下取得。在第3優選的實施方式中，在產生工序中產生的血紅素蛋白質是細胞色素P450，輔酶是細胞色素P450還原酶。細胞色素P450還原酶也是以脂質雙層作為支架的膜蛋白質，在小胞體中多量存在。從而，在取得工序中，取得微粒體級分。微粒體級分可根據如上所述的本領域技術人員公知的離心分離法取得。細胞色素P450還原酶優選在與脂質雙層的支架結合的狀態下取得。在第4優選的實施方式中，在產生工序中產生的血紅素蛋白質是細胞色素P450，輔酶是細胞色素P450還原酶及細胞色素b5。如上所述，作為輔因子的細胞色素b5優選為，通過增溶及/或純化而添加到含細胞色素P450及細胞色素P450還原酶的微粒體級分，在從膜游離的狀態下增大由細胞色素P450的藥物代謝活性。從而，在此實施方式中，對於細胞色素P450及細胞色素P450還原酶，通過從1體的鱗翅目昆蟲個體取得微粒體級分而取得，一方面，對於細胞色素b5，優選從導入細胞色素b5的蠶，首先取得含作為膜蛋白質存在的細胞色素b5的微粒體級分，通過對得到的微粒體級分增溶及/或純化，從膜取得游離的狀態的細胞色素b5。這樣的純化細胞色素b5根據如上所述的本領域技術人員公知的方法取得微粒體級分後，可使用本領域技術人員公知的純化方法、優選為親和層析法、凝膠過濾層析法或陽離子交換層析法取得。在本發明的範圍內包括由所述的生產方法得到的血紅素蛋白質其本身。另外，在本發明的範圍內也包括含所述的血紅素蛋白質及/或輔酶的組合物及其生產方法。這樣的組合物是例如作為藥物代謝試驗用試劑有用。在血紅素蛋白質存在於微粒體級分中時，這樣的組合物可根據本領域技術人員公知的方法、通過破碎鱗翅目昆蟲個體的細胞、得到微粒體級分生產。得到的微粒體級分也可通過再增溶，純化而作為純化品的血紅素蛋白質。在血紅素蛋白質存在於核中時及存在於線粒體中時，組合物可根據如上所述的本領域技術人員公知的離心分離法、通過得到核級分或線粒體級分生產。得到的核級分或線粒體級分也可通過再增溶，純化而製成純化品的血紅素蛋白質。在血紅素蛋白質存在於細胞質中時，所述的組合物可根據本領域技術人員公知的方法、通過破碎鱗翅目昆蟲個體的細胞、取上清而生產。得到的組合物可濃縮而製成更高濃度的液體組合物，也可使溶劑蒸發或冷凍乾燥而製成固體組合物。另外，得到的組合物也可通過純化製成純化品的血紅素蛋白質。在優選的實施方式中，組合物可為微粒體級分本身或通過對其增溶及純化而得到的純化品。另外，也可將它們的純化品根據脂質體等的公知的方法再構建到脂質雙膜上。接下來，例示本發明的組合物中涉及的優選的實施方式。但是，本發明不限於這些實施方式。在第1優選的實施方式中，組合物含細胞色素P450。含細胞色素P450的組合物可通過從導入了編碼細胞色素P450的胺基酸序列的多核苷酸的鱗翅目昆蟲個體、取得微粒體級分而生產。如上所述，細胞色素P450是以脂質雙膜作為支架發揮功能的蛋白質。從而，組合物優選含與作為支架的脂質雙層結合的細胞色素P450。即，在組合物含細胞色素P450時，組合物優選為微粒體級分本身。第1優選的實施方式涉及的組合物，例如，可利用含細胞色素P450的組合物的生產方法生產，所述方法包括：嚮導入了編碼細胞色素P450的胺基酸序列的多核苷酸的鱗翅目昆蟲個體施用選自血紅素前體及血紅素類似物的至少1種，在所述鱗翅目昆蟲個體中使血紅素蛋白質產生的工序；從所述鱗翅目昆蟲個體，取得含細胞色素P450的微粒體級分的工序。在第2優選的實施方式中，組合物含細胞色素b5。含細胞色素b5的組合物可通過從導入了編碼細胞色素b5的胺基酸序列的多核苷酸的鱗翅目昆蟲個體、取得微粒體級分生產。如上所述，細胞色素b5是以脂質雙膜作為支架發揮功能的蛋白質。從而，組合物優選含與作為支架的脂質雙層結合的細胞色素b5。即，在組合物含細胞色素b5時，組合物優選為微粒體級分本身。第2優選的實施方式涉及的組合物，例如，可由含細胞色素b5的組合物的生產方法生產，所述方法包括：嚮導入了編碼細胞色素b5的胺基酸序列的多核苷酸的鱗翅目昆蟲個體施用選自血紅素前體及血紅素類似物的至少1種，在所述鱗翅目昆蟲個體中使血紅素蛋白質產生的工序；從所述鱗翅目昆蟲個體，取得含細胞色素b5的微粒體級分的工序。在第3優選的實施方式中，組合物含細胞色素P450及細胞色素P450還原酶。含細胞色素P450還原酶的組合物可通過從導入了編碼細胞色素P450還原酶的胺基酸序列的多核苷酸的鱗翅目昆蟲個體、取得微粒體級分生產。如上所述，細胞色素P450還原酶是以脂質雙膜作為支架發揮功能的蛋白質。從而，組合物優選含與脂質雙層的支架結合的細胞色素P450還原酶。即，在組合物含細胞色素P450還原酶時，組合物優選為微粒體級分本身。第3優選的實施方式涉及的組合物，例如，可由含細胞色素P450及細胞色素P450還原酶的組合物的生產方法生產，所述方法包括嚮導入了編碼細胞色素P450的胺基酸序列的多核苷酸及編碼細胞色素P450還原酶的多核苷酸的鱗翅目昆蟲個體施用選自血紅素前體及血紅素類似物的至少1種，在所述鱗翅目昆蟲個體中使血紅素蛋白質產生的工序；從所述鱗翅目昆蟲個體，取得含細胞色素P450及細胞色素P450還原酶的微粒體級分的工序。在第4優選的實施方式中，組合物含細胞色素P450、細胞色素P450還原酶及細胞色素b5。如上所述，作為輔因子的細胞色素b5優選為，通過增溶及/或純化而添加到含細胞色素P450及細胞色素P450還原酶的微粒體級分，在從膜游離的狀態下增大由細胞色素P450的藥物代謝活性。從而，在此實施方式中，對於細胞色素P450及細胞色素P450還原酶，通過從1體的鱗翅目昆蟲個體取得微粒體級分而取得，一方面，對於細胞色素b5，優選從導入細胞色素b5的蠶，首先取得含作為膜蛋白質存在的細胞色素b5的微粒體級分，通過對得到的微粒體級分增溶及/或純化，從膜取得游離的狀態的細胞色素b5，通過將含細胞色素P450及細胞色素P450還原酶的微粒體級分和增溶級分混合，取得組合物。更具體而言，這樣的組合物可由含細胞色素P450、細胞色素P450還原酶和細胞色素的組合物的生產方法生產，其包括嚮導入了編碼細胞色素P450的胺基酸序列的多核苷酸和編碼細胞色素P450還原酶的胺基酸序列的多核苷酸的第1鱗翅目昆蟲個體、及導入了編碼細胞色素b5的多核苷酸的第2鱗翅目昆蟲個體各自施用選自血紅素前體及血紅素類似物的至少1種，在所述鱗翅目昆蟲個體中使血紅素蛋白質產生的工序；從所述第1及第2鱗翅目昆蟲個體各自取得含細胞色素P450和細胞色素P450還原酶的第1微粒體級分及含細胞色素的第2微粒體級分的工序；使所述第2微粒體級分增溶，取得增溶級分的工序；將所述第1微粒體級分和所述增溶級分混合，取得組合物的工序。接下來，由實施例詳細地說明本發明，但本發明不限於這些實施例。【實施例】【實施例1：通過向蠶的氯化血紅素施用生產血紅素內包型CYP3A4】由人工合成(向FASMAC公司外包)製作向編碼人CYP3A4的完全長的基因附加編碼DYKDDDDK標籤序列的多核苷酸(5』-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3』；SEQIDNO：1)的DNA片段。此標籤序列配置為附加在人CYP3A4胺基酸序列的C末端。將此DNA片段整合到pM01載體(Sysmex株式會社)的多克隆位點(限制性內切酶BglII/XhoI)。將得到的質粒構建體稱為CYP3A4_pM01。重組杆狀病毒的製作通過改變Maeda等的方法(InvertebrateCellSystemandApplications,Vol.1,p.167-181,CRCPress,BocaRaton(1989))而進行。具體而言，使用脂轉染試劑(X-tremeGENE9DNA轉染試劑：Roche公司)，將所述的質粒構建體CYP3A4_pM01(50ng)和直鏈化的CPd杆狀病毒(半胱氨酸蛋白酶缺損病毒株、Sysmex)的DNA(20ng)向BmN細胞(Maeda,1989)共轉染。確認感染跡象後，回收培養上清。由此，得到整合了人CYP3A4基因的重組杆狀病毒。將重組杆狀病毒接種到蠶蛹(品種：錦秋鍾和,從上田蠶種公司購入蠶卵，由Sysmex株式會社人工飼育至蛹)，在病毒感染起經過3天後，對每1隻蛹2處、用注射法接種50μL的氯化血紅素溶液(二甲基亞碸(以下DMSO)中10mM的氯化血紅素(Hemin來自牛、Sigma-Aldrich))。2處的接種位置設為腹部體節4-5間及6-7間。病毒接種起6天後回收蛹而於-80℃冷凍。向每5隻冷凍的蛹加25mL的緩衝液(50mMTris醋酸、250mM蔗糖、蛋白酶抑制劑、pH7.6)，使用均漿器(ELMEX,型式SH-IIM,槳式破碎)破碎蛹而得到懸浮液。通過將此懸浮液用網過濾除去蛹表皮等的殘渣後，離心分離(1850×g,4℃,10分鐘)而回收上清，將此上清作為第1上清。另外，向離心分離後的沉澱物加25mL的緩衝液(50mMTris醋酸、250mM蔗糖、蛋白酶抑制劑、pH7.6)而懸浮後，用微量超聲波均漿器(QSonica,模型Q55)破碎。對含超聲波破碎物的懸浮液離心分離(1850×g,4℃,10分鐘)而回收上清，將此上清作為第2上清。將第1上清及第2上清混合後，離心分離(9000×g,4℃,20分鐘)而回收上清。對此上清超離心分離(100,000×g,4℃,60分鐘)後，除去上清，向沉澱物加緩衝液(50mMTris醋酸、250mM蔗糖、0.25mMEDTA,pH7.6)15mL而懸浮。再者，通過使用特氟隆均漿器(ASONE、轉數5000rpm,10下)破碎得到粗膜級分懸浮液。向此粗膜級分懸浮液加增溶溶液(1.2％膽酸鈉,100mM磷酸鉀,20％甘油,0.1mMDTT)15mL而於4℃溫育2小時後，離心分離(100,000×g,4℃,60分鐘)而回收上清，得到使標籤融合CYP3A4增溶的蛋白質溶液。向此溶液添加結合抗DDDDK肽抗體的樹脂(DDDDK-標籤化蛋白質純化凝膠,MBL,50％漿)4mL，使標籤融合CYP3A4與樹脂特異性地結合。通過向其競爭性地反應含0.1mg/mL的DDDDK肽的溶出液(100mM磷酸鉀,0.1mMDTT,0.1mMEDTA,0.6％膽酸鈉,pH7.6)，使標籤融合CYP3A4從樹脂游離而回收。將回收的蛋白質溶液用超濾膜(Apollo,MWCO：20kDa)濃縮至1mL(1.3mg/mL)。將得到的標籤融合CYP3A4蛋白質溶液以100μL/孔放入96孔板，測定280nm～600nm的吸收光譜。同時，測定緩衝液(100mM磷酸鉀,0.1mMDTT,0.1mMEDTA,0.6％膽酸鈉,pH7.6)的光譜，通過算出與蛋白質溶液的差分，得到標籤融合CYP3A4來源的光譜。再者，原本在使一氧化碳(CO)結合的狀態下測定，成為通過取CO差光譜而檢測450nm的峰，但由於設備上困難而未實施。調製的CYP3A4蛋白質溶液的光譜示於圖2。在由施用氯化血紅素的蛹調製的CYP3A4中觀測到在420nm附近具有尖銳的極大的光譜。此極大與內包血紅素的氧化型P450顯示的索雷譜帶的光譜一致。一方面，用從未施用氯化血紅素的蠶蛹純化的CYP3A4時，確認不到內包血紅素的P450來源的極大。另外，將氯化血紅素以終濃度225μM添加到純化CYP3A4蛋白質溶液時，觀察到氯化血紅素來源的寬泛的極大。在用向增溶－純化過程的緩衝液以終濃度100μM添加氯化血紅素的條件下調製的CYP3A4時，觀察到與氧化型P450類似的光譜，但極大波長是408nm。以上的探討結果提示，通過向蠶個體施用氯化血紅素，可取得內包血紅素的CYP3A4。【實施例2：氯化血紅素溶解劑和蠶蛹中的分布】與實施例1同樣向蠶蛹接種氯化血紅素溶液(10mM氯化血紅素、溶劑：DMSO)。另外，向每1隻蠶蛹2處用注射法接種與實施例1中使用的氯化血紅素溶液不同的溶劑的氯化血紅素溶液(10mM氯化血紅素,37.5mML-精氨酸,2.5％乙醇,10％丙二醇,PBS)。在氯化血紅素接種起2天後及3天後回收蛹，於-80℃冷凍。另外，作為對照，將未接種氯化血紅素的蛹於-80℃冷凍。將這些冷凍蛹用切割刀背切，對截面特寫拍攝。未接種氯化血紅素的蛹的截面示於圖3(1)，接種氯化血紅素溶液(DMSO中10mM氯化血紅素)的蛹的截面示於圖3(2)，接種氯化血紅素溶液(10mM氯化血紅素,37.5mML-精氨酸,2.5％乙醇,10％丙二醇,PBS)的蛹的截面示於圖3(3)。由於氯化血紅素(10mM)是濃茶褐色的溶液，通過將氯化血紅素來源的染料作為指標，觀察在蠶蛹體內的氯化血紅素的分布。在接種氯化血紅素時，觀察到在蛹內部氯化血紅素擴散的跡象。在使用溶解促進劑時，觀察到由蛹整體擴散的跡象。【實施例3：各種濃度的氯化血紅素施用時的CYP3A4代謝活性的測定】將在實施例1中製作的人CYP3A4表達用病毒及人CPR表達用病毒混合至以病毒效價成1:1的比率，向蠶蛹接種。其中，人CPR表達用病毒如下所述製作。首先，人工合成向編碼人CPR的基因附加編碼DYKDDDDK標籤序列的多核苷酸(5』-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3』；SEQIDNO：1)的DNA片段(向FASMAC公司外包)。此標籤序列配置為附加在人CPR胺基酸序列的C末端。通過將此DNA片段整合到pM01載體的多克隆位點(限制性內切酶BglII/XhoI)製作質粒構建體CPR_pM01，與所述同樣得到整合人CPR基因的杆狀病毒。病毒感染後，根據試驗區A(以下的表2)及試驗區B(以下的表3)，向每1隻蛹2處用注射法接種50μL的氯化血紅素溶液。在病毒接種起6天後回收蛹，於-80℃冷凍。使用冷凍的蛹而得到粗膜級分懸浮液。粗膜級分懸浮液的調製根據實施例1中記載的方法。使用市售P450-GloCYP3A4篩選系統(Promega公司)測定得到的粗膜級分的CYP3A4活性。代替所述測定試劑附帶的CYP3A4膜級分而使用自己調製的粗膜級分，其他的條件遵從測定試劑的手冊。再者，在檢測中使用板讀取器(ThermoFisherScientific,VarioSkan)，測定與CYP3A4的代謝活性相關的發光強度(RLU)。評價試驗區A(表2)來源的粗膜級分的CYP3A4代謝活性的結果，在病毒感染後第4天及第5天施用氯化血紅素的任何系統中，在0.63mM、2.5mM、10mM及40mM全部濃度，均相比未施用氯化血紅素的場合示更高的CYP3A4代謝活性(圖4)。接下來，為了進一步詳細地探討施用濃度，評價試驗區B(表3)來源的粗膜級分。結果，在病毒感染後第4天施用1.25mM氯化血紅素的條件中，示最高的活性。在病毒感染後第3天的施用和第4天的施用確認不到顯著差異(圖5)。【表2】試驗區A【表3】試驗區B【實施例4：各種濃度的氨基乙醯丙酸施用時的CYP3A4代謝活性的測定】將在實施例1中製作的人CYP3A4表達用病毒和在實施例3中製作的人CPR表達用病毒混合至以病毒效價成2:1的比率，向蠶蛹接種。在病毒感染起經過3天後向每1隻蠶蛹2處用注射法接種50μL的氨基乙醯丙酸(5-AminolevulinicAcid鹽酸鹽、和光純藥)溶液。氨基乙醯丙酸溶液根據試驗區A(以下的表4)及試驗區B(以下的表5)調製。在病毒接種起6天後回收蠶蛹而於-80℃冷凍。使用冷凍的蛹得到第1上清及第2上清。第1上清及第2上清的調製根據實施例1中記載的方法。將第1上清及第2上清混合後，離心分離(9000×g,4℃,20分鐘)而回收上清。超離心分離此高速離心上清(105,000×g,4℃,90分鐘)而除去上清後，向沉澱物加154mMKCl溶液30mL。通過移液器吸吐操作將沉澱物的微粒體級分(茶褐色的上層)從糖原級分(無色透明的下層)分離，僅回收微粒體級分後，用特氟隆均漿器(ASONE、轉數5000rpm、10下)調製微粒體級分懸浮液。對其超離心分離(105,000×g,4℃,60分鐘)而除去上清後，向沉澱物加緩衝液(50mMTris醋酸、250mM蔗糖、0.25mMEDTA、pH7.6)3mL。通過將此沉澱物用Dounce型均漿器破碎(30下)得到微粒體級分懸浮液。使用市售P450-GloCYP3A4篩選系統(Promega公司)測定得到的微粒體級分的CYP3A4活性。代替所述測定試劑附帶的CYP3A4膜級分而使用自己調製的微粒體級分，其他的條件遵從測定試劑的手冊。評價試驗區A(表4)來源微粒體級分的CYP3A4代謝活性的結果，在氨基乙醯丙酸(ALA)濃度是2mM時活性比在濃度是0.2mM時高。一方面，對於同時施用的鐵的種類，在氯化鐵(II)(Iron(II)chloride四水合物、和光純藥)和檸檬酸鐵(III)(Iron(III)citrate、Sigma-Aldrich)之間確認不到顯著差異。另外，鐵的施用濃度是在0.2mM和2mM之間確認不到顯著差異(圖6)。從而，在今後的探討中使用氯化鐵(II)。接下來，為進一步詳細地探討氨基乙醯丙酸施用濃度，評價試驗區B(表5)來源的微粒體級分。結果得知，通過施用氨基乙醯丙酸，活性升高。另外，在病毒感染後第2天的施用和第3天的施用中確認不到顯著差異(圖7)。從以上的探討結果判斷，在施用氨基乙醯丙酸的系統中，向病毒感染後第3天的蛹施用2mMALA,0.2mM氯化鐵(II)溶液的條件是最適的。【表4】試驗區A條件氨基乙醯丙酸(ALA)濃度鐵的種類和濃度10.2mMALA0.02mM檸檬酸鐵(III)20.2mMALA0.2mM檸檬酸鐵(III)30.2mMALA0.02mM氯化鐵(II)40.2mMALA0.2mM氯化鐵(II)52mMALA0.02mM檸檬酸鐵(III)62mMALA0.2mM檸檬酸鐵(III)72mMALA0.02mM氯化鐵(II)82mMALA0.2mM氯化鐵(II)【表5】試驗區B條件ALA濃度鐵濃度施用日14mMALA0.2mM氯化鐵(II)第2天28mMALA0.2mM氯化鐵(II)第2天34mMALA0.2mM氯化鐵(II)第3天48mMALA0.2mM氯化鐵(II)第3天【實施例5：氯化血紅素、氨基乙醯丙酸及氯化血紅素和氨基乙醯丙酸的混合物施用時的CYP3A4代謝活性的測定】將在實施例1中製作的人CYP3A4表達用病毒和在實施例3中製作的人CPR表達用病毒混合至以病毒效價成2:1的比率，向蠶蛹接種。病毒感染後，根據試驗區(以下的表6)向每1隻蛹2處用注射法接種50μL的血紅素蛋白質化溶液。在病毒接種起6天後回收蛹，於-80℃冷凍。使用冷凍的蛹調製微粒體級分懸浮液。微粒體級分懸浮液的調製根據實施例4中記載的方法。使用市售P450-GloCYP3A4篩選系統(Promega公司)測定得到的微粒體級分的CYP3A4活性。代替所述測定試劑附帶的CYP3A4膜級分而使用自己調製的微粒體級分，其他的條件遵從測定試劑的手冊。評價試驗區(以下的表6)來源微粒體級分的CYP3A4代謝活性的結果，在施用氯化血紅素時，施用氨基乙醯丙酸時，及施用氯化血紅素和氨基乙醯丙酸的兩方時，均可取得高活性的微粒體級分(圖8)。【表6】試驗區【實施例6：由氨基乙醯丙酸施用的血紅素內包型CYP3A4的生產】向蠶蛹接種在實施例1中製作的人CYP3A4表達用病毒。在病毒感染起經過3天後向每1隻蛹2處用注射法接種50μL的血紅素蛋白質化溶液(2mM氨基乙醯丙酸,0.2mM氯化鐵(II))。在病毒接種起6天後回收蛹，於-80℃冷凍。使用冷凍的蛹而得到第1上清。第1上清的調製根據實施例1中記載的方法。另外，向離心分離後的沉澱物加25mL的緩衝液(50mM磷酸鉀,6mM醋酸鎂,20％甘油,1mMDTT,1mMEDTA,pH7.4)而懸浮後，用微量超聲波均漿器(QSonica,模型Q55)破碎。對含超聲波破碎物的懸浮液離心分離(1850×g,4℃,10分鐘)而回收上清，將此上清作為第2上清。使用第1上清及第2上清得到微粒體級分懸浮液。此微粒體級分懸浮液的調製根據實施例4中記載的方法。向微粒體級分懸浮液24mL加增溶溶液(50mM磷酸鉀,20％甘油,1mMDTT,1mMEDTA,5％TergitolNP-10,pH7.4)6mL而於4℃溫育2小時後，離心分離(105,000×g,4℃,60分鐘)而回收上清，得到使DYKDDDDK標籤融合CYP3A4增溶的蛋白質溶液。向此溶液添加結合抗DDDDK肽抗體的樹脂(DDDDK-標籤化蛋白質純化凝膠,MBL,50％漿)8mL，使標籤融合CYP3A4與樹脂特異性地結合。通過向其競爭性地反應含0.1mg/mL的DDDDK肽的溶出液(100mM磷酸鉀,0.1mMDTT,0.1mMEDTA,0.2％TergitolNP-10,pH7.4)，使標籤融合CYP3A4從樹脂游離回收。將回收的蛋白質溶液用超濾膜(Millipore,AmiconUltra-15,MWCO：3kDa)濃縮至2mL後，使經歷凝膠過濾層析(柱：GEHealthcareSuperdex200Increase10/300GL、移動相：20mMTris-HCl,100mMNaCl,5％甘油,0.1％TergitolNP-10,pH7.5)，分子量依賴性地分離－純化。集中含目的蛋白質的級分的溶液，用超濾膜濃縮至2mL。將得到的標籤融合CYP3A4蛋白質溶液以100μL/孔放入96孔板，測定280nm～600nm的吸收光譜。同時，測定緩衝液(20mMTris-HCl,100mMNaCl,5％甘油,0.1％TergitolNP-10,pH7.5)的光譜，算出與蛋白質溶液的差分而得到標籤融合CYP3A4來源的光譜。調製的CYP3A4蛋白質溶液的光譜示於圖9。如在實施例1中所示，在用從未施用血紅素蛋白質化溶液的蠶蛹純化的CYP3A4時，確認不到極大波長，但在用由施用氯化血紅素的蛹調製的CYP3A4時，觀察到內包血紅素的氧化型P450來源的極大波長(420nm)(圖2)。在本實施例中，也同樣地，在施用氨基乙醯丙酸的蛹中，在420nm附近觀察到極大。由於氨基乙醯丙酸是在420nm附近無吸收的化合物，認為是從施用的氨基乙醯丙酸合成血紅素而內包於CYP3A4的結果。以上的探討結果提示，通過向蠶個體施用氨基乙醯丙酸，可取得內包血紅素的CYP3A4。【實施例7：由氯化血紅素施用的血紅素內包型細胞色素b5的生產】由人工合成(向FASMAC公司外包)製作向編碼人細胞色素b5的完全長的基因附加編碼DYKDDDDK標籤序列的多核苷酸(5』-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3』；SEQIDNO：1)的DNA片段。此標籤序列配置為附加在人細胞色素b5胺基酸序列的N末端。將此DNA片段整合到pM01載體(Sysmex株式會社)的多克隆位點(限制性內切酶BglII/XhoI)。將得到的質粒構建體稱為細胞色素b5_pM01。重組杆狀病毒的製作通過改變Maeda等的方法(InvertebrateCellSystemandApplications,Vol.1,p.167-181,CRCPress,BocaRaton(1989))而進行。具體而言，使用脂轉染試劑(X-tremeGENE9DNA轉染試劑：Roche公司)，將所述的質粒構建體CYP3A4_pM01(50ng)和直鏈化的CPd杆狀病毒(半胱氨酸蛋白酶缺損病毒株、Sysmex)的DNA(20ng)向BmN細胞(Maeda,1989)共轉染。確認感染跡象後，回收培養上清。由此，得到整合細胞色素b5基因的重組杆狀病毒。向蠶蛹接種重組杆狀病毒，在病毒感染起經過4天後向每1隻蛹2處用注射法接種50μL的氯化血紅素溶液(1.25mM氯化血紅素,4.7mML-精氨酸,0.31％乙醇,1.25％丙二醇,PBS)。在病毒接種起6天後回收蛹而於-80℃冷凍。使用冷凍的蛹而得到第1上清。第1上清的調製根據實施例4中記載的方法。另外，向離心分離後的沉澱物加25mL的緩衝液(10mM磷酸鉀,1mMEDTA,pH7.4)而懸浮後，用微量超聲波均漿器(QSonica,模型Q55)破碎。對含超聲波破碎物的懸浮液離心分離(1850×g,4℃,10分鐘)而回收上清，將此上清作為第2上清。使用第1上清及第2上清，用與實施例4同樣的方法調製微粒體級分懸浮液。向此微粒體級分懸浮液40mL加增溶溶液(10mM磷酸鉀,1mMEDTA,5％TergitolNP-10,pH7.4)10mL而於4℃溫育2小時後，離心分離(105,000×g,4℃,60分鐘)而回收上清。使此含細胞色素b5的膜蛋白質增溶的溶液經歷陽離子交換層析(柱：GEHealthcareHiTrapQHP、緩衝液(A)：20mMTris-HCl,1mMEDTA,0.2％TergitolNP-10,pH8.0、緩衝液(B)：20mMTris-HCl,1mMEDTA,0.2％TergitolNP-10,0.4MNaCl,pH8.0)，通過直線性地升高溶出緩衝液的鹽濃度分離－純化目的蛋白質。集中含細胞色素b5的級分的溶液，對其實施凝膠過濾層析(柱：GEHealthcareSuperdex200Increase10/300GL、移動相：20mM磷酸鉀,0.1mMEDTA,pH7.4)，分子量依賴性地分離－純化。集中含目的蛋白質的級分的溶液，用超濾膜(Millipore,AmiconUltra-15,MWCO：3kDa)濃縮至2mL。將得到的細胞色素b5蛋白質溶液以100μL/孔放入96孔板，測定280nm～600nm的吸收光譜。同時，測定緩衝液(20mM磷酸鉀,0.1mMEDTA,pH7.4)的光譜，算出與蛋白質溶液的差分而得到細胞色素b5來源的光譜。調製的細胞色素b5蛋白質溶液的光譜示於圖10。根據圖10，在用從未施用氯化血紅素溶液的蠶蛹純化的細胞色素b5時，確認不到極大波長，但在用由施用氯化血紅素的蛹調製的細胞色素b5時，觀察到血紅素來源的極大波長(409nm～426nm)，提示內包血紅素。以上的探討結果證明，通過向蠶蛹施用氯化血紅素而使血紅素內包於重組蛋白質的本方法不僅對於P450(CYP3A4)適用，對於細胞色素b5也適用，進而被認為能適用於血紅素蛋白質整體的調製。【實施例8：由細胞色素b5的活性升高效果的確認及與市售品(大腸桿菌表達系統)的活性比較】通過將作為P450的輔酶的細胞色素b5的純化物添加到用蠶表達系統調製的微粒體級分研究CYP3A4代謝活性升高與否。具體而言，與實施例5同樣地向蠶蛹接種CYP3A4表達用病毒和人CPR表達用病毒。在病毒感染後經過3天的時間點，向每1隻蛹2處用注射法接種血紅素蛋白質化溶液(1mM氯化血紅素,5mML-精氨酸,0.3％乙醇,1mM丙二醇,PBS,2mMALA,0.2mM氯化鐵(II))50μL。在病毒接種起6天後回收蛹。對於來自蛹的微粒體級分的調製，根據在實施例6中記載的方法。一方面，細胞色素b5的純化根據實施例7調製。對於總蛋白質濃度4.4mg/mL的微粒體級分，添加純化細胞色素b5蛋白質溶液至終濃度成16.3～326μg/mL(1.0～20nmol/mL)。使其在冰上反應4小時以上後，使用市售P450-GloCYP3A4篩選系統(Promega公司)測定細胞色素b5添加微粒體級分的CYP3A4活性。代替所述測定試劑附帶的CYP3A4膜級分而使用自己調製的微粒體級分，其他的條件遵從測定試劑的手冊。另外，作為比較對象，使用向用大腸桿菌表達系統調製的CYP3A4微粒體級分的市售品及同製品添加細胞色素b5的製品(細胞色素b5：5nmol/mL)。得到的CYP3A4代謝活性值用在測定中使用的各自的微粒體級分的總蛋白質濃度修正而作為比活性算出。評價微粒體級分的CYP3A4代謝活性的結果顯示，由細胞色素b5的添加而活性升高(圖11)。另外確認，用蠶表達系統調製的細胞色素b5，作為P450的輔酶，具備使CYP3A4代謝活性升高的功能。同時確認，用蠶表達系統調製的CYP3A4微粒體級分比市場廣泛使用的大腸桿菌來源的製品顯示更高的比活性。【實施例9：與市售微粒體級分(大腸桿菌表達系統)的表達量比較】對於用實施例8中調製的蠶表達系統CYP3A4微粒體級分及大腸桿菌表達系統調製的微粒體級分市售品，各自用Bradford法測定總蛋白質濃度。以得到的濃度為基準，使每1泳道2μg總蛋白質量的微粒體級分經歷聚丙烯醯胺凝膠，由電泳分離－分析蛋白質(圖12)。在以下的表7示向各泳道應用的樣品的詳細內容。如圖12所示，確認在從蠶表達系統得到的微粒體級分中，顯示由病毒感染強制表達的CYP3A4及人CPR的明確的條帶。一方面，在作為市售品的大腸桿菌來源微粒體級分中，在CYP3A4及人CPR的理論分子量附近確認不到明確的條帶。以上的結果提示，用蠶表達系統調製的微粒體級分中的CYP3A4及人CPR的表達量比大腸桿菌來源的市售品顯著地高。【表7】【實施例10：血紅素蛋白質化試劑的使用量比較(蠶表達系統vs大腸桿菌表達系統)】在用大腸桿菌表達系統調製CYP3A4微粒體級分時，使用的血紅素蛋白質化試劑(5-氨基乙醯丙酸鹽酸鹽)成為每1mg微粒體級分280～340μg(PritchardMP,McLaughlinL,FriedbergT.(2006)EstablishmentoffunctionalhumanCytochromeP450monooxygenasesystemsinEscherichiacoli.MethodsMolBiol.320,19-29)。一方面，在用蠶蛹表達系統調製同樣的微粒體級分時，使用的氨基乙醯丙酸是每1mg微粒體級分5.7～8.5μg(表8)。由此得知，在用蠶表達系統時，只要使用在大腸桿菌表達系統的血紅素蛋白質化試劑的使用量的1/40～1/50，就可取得同等量的微粒體。【表8】血紅素蛋白質化試劑的使用量比較大腸桿菌表達系統蠶表達系統開始條件100mL培養蠶蛹5隻氨基乙醯丙酸使用濃度0.5mM2.0mM氨基乙醯丙酸溶液量100mL100μL/只×5隻＝500μL氨基乙醯丙酸使用量8.5mg0.17mg微粒體級分的收量25～30mg20～30mg微粒體級分每1mg的氨基乙醯丙酸必要量280～340μg5.7～8.5μg【實施例11：CYP1A2代謝活性的與大腸桿菌表達系統的比較】由人工合成(向FASMAC公司外包)製作向編碼人CYP1A2的完全長的基因附加編碼DYKDDDDK標籤序列的多核苷酸(5』-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3』；SEQIDNO：1)的DNA片段。此標籤序列配置附加在人CYP1A2胺基酸序列的C末端。將此DNA片段整合到pM01載體(Sysmex株式會社)的多克隆位點(限制性內切酶BglII/XhoI)。將得到的質粒構建體稱為CYP1A2_pM01。與實施例1同樣地製作人CYP1A2表達用病毒，將此病毒和在實施例3中製作的人CPR表達用病毒混合至以病毒效價成1:0.125的比率，向蠶蛹接種。病毒感染後，向每1隻蛹2處用注射法接種50μL的血紅素蛋白質化溶液(含1mM的氯化血紅素(Hemin來自牛、Sigma-Aldrich)、2mM的5-氨基乙醯丙酸鹽酸鹽(5-AminolevulinicAcid鹽酸鹽、和光純藥)、0.2mM的氯化鐵(II)(Iron(II)chloride四水合物、和光純藥)、5mML-精氨酸、0.3％乙醇、1mM丙二醇的PBS)。與實施例1同樣地調製粗膜級分懸浮液，得到CYP1A2微粒體級分。對於如上所述用蠶表達系統調製的CYP1A2微粒體級分及用大腸桿菌表達系統調製的微粒體級分市售品，使用市售P450-GloCYP1A2測定系統(Promega公司)測定CYP1A2活性。代替所述測定試劑附帶的CYP1A2膜級分而使用自己調製的微粒體級分，其他的條件遵從測定試劑的手冊。結果示於圖13。如圖13所示，從蠶表達系統得到的微粒體級分的CYP1A2代謝活性高於從大腸桿菌表達系統調製的市售的微粒體級分的活性。【實施例12：CYP2C8代謝活性與大腸桿菌表達系統的比較】由人工合成(向FASMAC公司外包)製作向編碼人CYP2C8的完全長的基因附加編碼DYKDDDDK標籤序列的多核苷酸(5』-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3』；SEQIDNO：1)的DNA片段。此標籤序列配置為向人CYP2C8胺基酸序列的C末端附加。將此DNA片段整合到pM01載體(Sysmex株式會社)的多克隆位點(限制性內切酶BglII/XhoI)。將得到的質粒構建體稱為CYP2C8_pM01。與實施例1同樣地製作人CYP2C8表達用病毒，將此病毒和在實施例3中製作的人CPR表達用病毒混合至以病毒效價成1:0.0156的比率，向蠶蛹接種。病毒感染後，向每1隻蛹2處用注射法接種50μL的血紅素蛋白質化溶液(含1mM的氯化血紅素(Hemin來自牛、Sigma-Aldrich)、2mM的5-氨基乙醯丙酸鹽酸鹽(5-AminolevulinicAcid鹽酸鹽、和光純藥)、0.2mM的氯化鐵(II)(Iron(II)chloride四水合物、和光純藥)、5mML-精氨酸、0.3％乙醇、1mM丙二醇的PBS)。與實施例1同樣地調製粗膜級分懸浮液，得到CYP2C8微粒體級分。對於如上所述用蠶表達系統調製的CYP2C8微粒體級分及用大腸桿菌表達系統調製的微粒體級分市售品，使用市售P450-GloCYP2C8測定系統(Promega公司)測定CYP2C8活性。代替所述測定試劑附帶的CYP2C8膜級分而使用自己調製的微粒體級分，其他的條件遵從測定試劑的手冊。結果示於圖14。如圖14所示，從蠶表達系統得到的微粒體級分的CYP2C8代謝活性高於從大腸桿菌表達系統調製的市售的微粒體級分的活性。【實施例13：CYP2C9代謝活性與大腸桿菌表達系統的比較】由人工合成(向FASMAC公司外包)製作向編碼人CYP2C9的完全長的基因附加編碼DYKDDDDK標籤序列的多核苷酸(5』-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3』；SEQIDNO：1)的DNA片段。此標籤序列配置為附加在人CYP2C9胺基酸序列的C末端。將此DNA片段整合到pM01載體(Sysmex株式會社)的多克隆位點(限制性內切酶BglII/XhoI)。將得到的質粒構建體稱為CYP2C9_pM01。與實施例1同樣地製作人CYP2C9表達用病毒，將此病毒和在實施例3中製作的人CPR表達用病毒混合至病毒效價成1:0.0313的比率，向蠶蛹接種。病毒感染後，向每1隻蛹2處用注射法接種50μL的血紅素蛋白質化溶液(含1mM的氯化血紅素(Hemin來自牛、Sigma-Aldrich)、2mM的5-氨基乙醯丙酸鹽酸鹽(5-AminolevulinicAcid鹽酸鹽、和光純藥)、0.2mM的氯化鐵(II)(Iron(II)chloride四水合物、和光純藥)、5mML-精氨酸、0.3％乙醇、1mM丙二醇的PBS)。與實施例1同樣地調製粗膜級分懸浮液，得到CYP2C9微粒體級分。對於如上所述用蠶表達系統調製的CYP2C9微粒體級分及用大腸桿菌表達系統調製的微粒體級分市售品，使用市售P450-GloCYP2C9測定系統(Promega公司)測定CYP2C8活性。代替所述測定試劑附帶的CYP2C9膜級分而使用自己調製的微粒體級分，其他的條件遵從測定試劑的手冊。結果示於圖15。如圖15所示，從蠶表達系統得到的微粒體級分的CYP2C9代謝活性高於從大腸桿菌表達系統調製的市售的微粒體級分的活性。【實施例14：CYP2C19代謝活性與大腸桿菌表達系統的比較】由人工合成(向FASMAC公司外包)製作向編碼人CYP2C19的完全長的基因附加編碼DYKDDDDK標籤序列的多核苷酸(5』-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3』；SEQIDNO：1)的DNA片段。此標籤序列配置為附加在人CYP2C19胺基酸序列的C末端。將此DNA片段整合到pM01載體(Sysmex株式會社)的多克隆位點(限制性內切酶BglII/XhoI)。將得到的質粒構建體稱為CYP2C19_pM01。與實施例1同樣地製作人CYP2C19表達用病毒，將此病毒和在實施例3中製作的人CPR表達用病毒混合至以病毒效價成1:0.0313的比率，向蠶蛹接種。病毒感染後，向每1隻蛹2處用注射法接種50μL的血紅素蛋白質化溶液(含1mM的氯化血紅素(Hemin來自牛、Sigma-Aldrich)、2mM的5-氨基乙醯丙酸鹽酸鹽(5-AminolevulinicAcid鹽酸鹽、和光純藥)、0.2mM的氯化鐵(II)(Iron(II)chloride四水合物、和光純藥)、5mML-精氨酸、0.3％乙醇、1mM丙二醇的PBS)。與實施例1同樣地調製粗膜級分懸浮液，得到CYP2C19微粒體級分。對於如上所述用蠶表達系統調製的CYP2C19微粒體級分及用大腸桿菌表達系統調製的微粒體級分市售品，使用市售P450-GloCYP2C19測定系統(Promega公司)測定CYP2C8活性。代替所述測定試劑附帶的CYP2C19膜級分而使用自己調製的微粒體級分，其他的條件遵從測定試劑的手冊。結果示於圖16。如圖16所示，從蠶表達系統得到的微粒體級分的CYP2C19代謝活性高於從大腸桿菌表達系統調製的市售的微粒體級分的活性。【實施例15：CYP2D6代謝活性與大腸桿菌表達系統的比較】由人工合成(向FASMAC公司外包)製作向編碼人CYP2D6的完全長的基因附加編碼DYKDDDDK標籤序列的多核苷酸(5』-GACTATAAAGACGACGATGATAAA-3』；SEQIDNO：1)的DNA片段。此標籤序列配置為附加在人CYP2D6胺基酸序列的C末端。將此DNA片段整合到pM01載體(Sysmex株式會社)的多克隆位點(限制性內切酶BglII/XhoI)。將得到的質粒構建體稱為CYP2D6_pM01。與實施例1同樣地製作人CYP2D6表達用病毒，將此病毒和在實施例3中製作的人CPR表達用病毒混合至以病毒效價成1:0.0078的比率，向蠶蛹接種。病毒感染後，向每1隻蛹2處用注射法接種50μL的血紅素蛋白質化溶液(含1mM的氯化血紅素(Hemin來自牛、Sigma-Aldrich)、2mM的5-氨基乙醯丙酸鹽酸鹽(5-AminolevulinicAcid鹽酸鹽、和光純藥)、0.2mM的氯化鐵(II)(Iron(II)chloride四水合物、和光純藥)、5mML-精氨酸、0.3％乙醇、1mM丙二醇的PBS)。與實施例1同樣地調製粗膜級分懸浮液，得到CYP2D6微粒體級分。對於如上所述用蠶表達系統調製的CYP2D6微粒體級分及用大腸桿菌表達系統調製的微粒體級分市售品，使用市售P450-GloCYP2D6測定系統(Promega公司)測定CYP2D6活性。代替所述測定試劑附帶的CYP2D6膜級分而使用自己調製的微粒體級分，其他的條件遵從測定試劑的手冊。結果示於圖17。如圖17所示，從蠶表達系統得到的微粒體級分的CYP2D6代謝活性高於從大腸桿菌表達系統調製的市售的微粒體級分的活性。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp