老年大鼠腦血管內皮細胞原代培養方法

2023-05-01 16:08:41 2

專利名稱：老年大鼠腦血管內皮細胞原代培養方法
技術領域：
本發明涉及老年大鼠腦血管內皮細胞原代培養方法，屬於生物技術技術領域。
背景技術：
現有的大鼠腦血管內皮細胞原代培養，取材來源均為新生鼠(〈10天，35 50g)， 幼年鼠(<3weeks，80 IOOg)或2_3月年輕成年鼠(200g 300g)，而且培養的腦血管內皮細胞只能傳代一次，不能凍存，利用大鼠腦血管內皮原代培養細胞作為實驗材料導致消耗時間長和成本高的缺點，如Bowman PD, Betz AL, Ar D, Wolinsky JS, Penney JB, Shivers RR, Goldstein Gff. 1981. Primary Culture of Capillary Endothelium From Rat Brain.1N VITRO. 17(4), 353-362o
老年大鼠(19 22月，900g 1200g)腦血管內皮細胞培養成功的先例至今未見報導；現有的取材對象和培養技術不能滿足體外建立老年血腦屏障模型，研究老年血腦屏障的生理特性，以及老年神經系統疾病與血腦屏障相關的退行性病變的要求。發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種老年大鼠腦血管內皮細胞原代培養方法。
本發明技術方案如下
一種老年大鼠腦血管內皮細胞原代培養方法，步驟如下
(I)將20 22月齡的老年大鼠斷頭後，剝去大鼠頭部皮膚，然後把大鼠頭浸泡在 (TC的含2% (體積百分數)胎牛血清(FBS)的分離液中5 10分鐘，取出，取出腦組織，取灰質部分，製得樣品組織；
(2)把樣品組織置於5ml冰冷的含8% (體積百分數)FBS的分離液的培養皿中剪成樣品組織小塊，補加8% (體積百分數)FBS的分離液至25ml，經吹打分散和生物酶消化後， 製得分散細胞；
(3)向步驟(2)製得的分散細胞補加10ml8·% (體積百分數)FBS的分離液，混勻後第一次離心；移去上清，加20ml含20% (體積百分數)BSA (牛血清白蛋白，購自Sigma公司， 商品號a3059)的DMEM培養基，吹打混勻後，第二次離心，取最下層的沉澱，製得毛細血管；
(4)將步驟(3)製得的毛細血管重懸於Iml的分離液中，再加入7. 9ml的分離液， 經生物酶消化後，製得毛細血管懸液；
(5)將步驟(4)製得的毛細血管懸液，經第三次離心後，移去上清，沉澱重懸於2ml 的分離液中，然後輕輕地把懸液置於Percoll濃度梯度離心液的頂部；在4°C，IOOOg離心 10分鐘，分為六層，取第三層懸濁液即為腦血管內皮細胞；
(6)將步驟(5)製得的腦血管內皮細胞溶於Iml的內皮細胞培養液中，於在IOcm 的培養板或6孔板中培養，正常條件下培養I天，然後用I XPBS緩衝液洗除去死亡的細胞， 用含3 4 μ M/ml嘌呤黴素的內皮細胞培養液純化2 3天後,更換為正常的腦血管內皮細胞培養液培養7 10天，用0. 01% (重量百分數)胰酶(Typsin)或含ImM EDTA的PBS消化傳代或凍存即可。
所述培養板或6孔板製備方法如下先用IXCollagen IV鋪板30分鐘，然後再用 I XFibronectin 鋪板 30 分鐘。
根據本發明優選的，所述步驟(I)中分離液為在DMEM培養基的基礎上，每百毫升加入如下組分
Iml青黴素-鏈黴素溶液；100 μ I硫駿慶大黴素。
根據本發明優選的，所述步驟(I)中取出腦組織，取灰質部分按如下步驟操作切開兩個大腦半球，分別把兩個腦半球在消毒的普通濾紙上滾動一周，然後去除腦幹和白質部分，保留灰質部分。
根據本發明優選的，所述步驟(2)中的樣品組織小塊體積為l_2mm3。
根據本發明優選的，所述步驟(2)中生物酶消化按如下步驟操作
將吹打分散的樣品組織小塊加入2. 5ml的膠原酶和250 μ I的DNA酶溶液，在36°C 的水浴搖床中100rpm/min消化90分鐘；然後吹打分散後，繼續消化30分鐘。
根據本發明優選的，所述步驟(3)中的第一次離心為在4°C，600g離心8分鐘；第二次離心為在4°C，IOOOg離心20分鐘。
根據本發明優選的，所述步驟(4)中的經生物酶消化按如下步驟操作
Iml的膠原酶和100 μ I的DNA酶溶液，混勻後在37°C、100rpm/min的條件下水浴搖床中消化90分鐘。
根據本發明優選的，所述步驟(5)中用長的腰椎穿刺針取第三層液體。
根據本發明優選 的，所述步驟(5)中離心液組分如下
Percoll 8ml+lXPBS 15. 2ml+10XPBS (不含鈣鎂)0. 8ml+FBS 0.8ml。
根據本發明優選的，所述步驟(5)中的第三次離心為在4°C，600g離心5分鐘。
根據本發明優選的，所述步驟(6)中的內皮細胞培養液為在每百毫升DMEM培養基的基礎上加入如下組分
20ml血漿來源的血清，100 μ I青黴素_鏈黴素溶液，1. Oml L-穀氨醯胺，100 μ I硫駿慶大黴素，1. Oml肝素，150 μ I鹼性纖維生子因子，1. Oml內皮細胞生長補充因子，300 μ I 維生素C，100-150y I血管內皮生長因子，100-150μ I胰島素樣生長因子-1，100-150μ I內皮生子因子。
上述試劑如無特殊說明，均為本領域常用市售產品。
有益效果
1、本發明採用Collagen Type IV和Fibronectin雙鋪板法,細胞生長狀態比單鋪板好，尤其是對老年大鼠腦血管內皮細胞的生長更為重要。
2、本發明採用加入了 8%FBS的分離液，與傳統的分離液DMEM或PBS不同，FBS的加入保護了腦血管內皮細胞，可使後期的培養，腦血管內皮細胞存活率增高。
3、本發明採用低濃度O. 01%的胰酶(通常為O. 25%胰酶)或含ImM EDTA的PBS消化細胞，用此方法細胞可傳代3次而仍保持腦血管內皮細胞的特性。
4、本發明製得的老年大鼠腦血管內皮細胞，可至少凍存復甦一次，仍可保持腦血管內皮細胞的純度和特性；因此，可大量培養一次，大批凍存，以節省大量的時間和金錢。
5、本發明可傳代的老年大鼠腦血管內皮細胞原代培養方法的成功建立，不僅為實驗研究節約了大量的時間和資金，而且還為體外模擬老年性血腦屏障模型，研究老年性神經系統疾病，特別是研究老年性腦中風血腦屏障破壞的分子機制提供了更真實，更方便的實驗模型。
6、本發明所述內皮細胞培養液採用ros (血漿來源的血清)代替了傳統培養液中的FBS (胎牛血清)或小牛血清(BCS)或馬血清(HS)，使腦血管內皮細胞純度增加30% ;主要原因是由於FDS中不含TOGF (血小板源性生長因子)，而I3DGF有利於混入腦血管內皮細胞中的平滑肌細胞，纖維細胞和膠質細胞的分裂和增殖；用PDS消除了這一影響。
7、本發明在內皮細胞培養液中加入了維生素C和嘌呤黴素，這使腦血管內皮細胞生長更快更純。
8、本發明在內皮細胞培養液中還加入了血管內皮生長因子，胰島素樣生長因子-1，內皮生子因子，這些因子可使腦血管內皮細胞生長得更快更健康，尤其是對老年大鼠腦血管內皮細胞的生長更為重要。


圖1、本發明製得的老年大鼠腦血管內皮細胞經原代培養傳3代與傳統方法製備的老年大鼠腦血管內皮細胞原代培養傳3代的存活率的柱狀比較圖2、本發明製得的老年大鼠腦血管內皮細胞經凍存復甦後與傳統方法製備的老年大鼠腦血管內皮細胞經凍存復甦後的存活率的柱狀比較圖3:本發明製得的老年大鼠腦血管內皮細胞與傳統方法製備的老年大鼠腦血管內皮細胞細胞純度的柱狀比較圖。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護範圍不限於此。
原料來源
19-22月的老年大鼠購自北京維通利華實驗動物技術中心；
配製老年大鼠腦血管內皮細胞培養基各種試劑的來源
DMEM培養基，購自Gibico公司，商品號11995-065 ；
血眾來源的血清(PDS, Plasma-Derived Serum),購自Bioquote公司，商品號 BT-214-10 ；
青黴素-鏈黴素溶液，購自sigma公司，商品號p0718 ;
L-穀氨醯胺,購自Sigma公司，商品號G7513 ;
硫駿慶大黴素，購自sigma公司，商品號G1397 ；
肝素,購自Sigma公司，商品號H3149 ;
鹼性纖維生子因子( bFGF),購自Sigma公司，商品號F9786 ;
內皮細胞生長補充因子(ECGS)，購自Sigma公司，商品號E2759 ;
維生素C，購自Sigma公司，商品號C1768 ;
血管內皮生長因子(VEGF),購自Lonza公司，商品號cc4176 ；
胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)購自Lonza公司，商品號cc4176 ;
內皮生子因子(EGF)購自Lonza公司，商品號cc4176 ；
嘌呤黴素(Puromycin),購自Sigma公司，商品號p8833。
各種酶及其他相關試劑的來源
胎牛血清(FBS)購自Invitrogen公司，商品號10437-028 ；
膠原酶(Collagenase)購自Invitrogen 公司，商品號 17101 ;
DNA 酶(DNase)購自 Sigma-Aldrich 公司，商品號 D4263 ;
胰酶(Typsin)購自Sigma-Aldrich 公司，商品號 T3053 ;
牛血清白蛋白(BSA)購自Sigma-Aldrich公司，商品號a3059 ;
膠原IV (Collagen IV)購自 Sigma-Aldrich 公司，商品號 C5533 :
纖連蛋白(Fibronectin)購自Sigma-Aldrich 公司，商品號 F1141 ；
Percoll 購自 Sigma-Aldrich 公司，商品號 4937 ；
腰椎穿刺針(Lumbarpuncture needle)購自 BD 公司，商品號 405182。
實施例1
一種老年大鼠腦血管內皮細胞原代培養方法，步驟如下
(I)將20月齡的老年大鼠斷頭後，剝去大鼠頭部皮膚，然後把大鼠頭浸泡在0°C的含2% (體積百分數)胎牛血清(FBS)分離液中5分鐘，取出，切開兩個大腦半球，分別把兩個腦半球在消毒的普通濾紙上滾動一周，然後去除腦幹和白質部分，保留灰質部分，製得樣品組織；
分離液為在DMEM培養基的基礎上，每百毫升加入如下組分1ml青黴素-鏈黴素溶液；100 μ I硫駿慶大黴素；
(2)把樣品組織置於5ml冰冷的含8% (體積百分數)FBS分離液的培養皿中剪成 I 2mm3的樣品組織小塊，補加8% (體積百分數)FBS分離液至25ml，經吹打分散，然後將吹打分散的樣品組織小塊加入2. 5ml的膠原酶和250 μ I的DNA酶溶液，在36°C的水浴搖床中100rpm/min消化90分鐘；然後吹打分散後，繼續消化30分鐘，製得分散細胞；
(3)向步驟(2)製得的分散細胞補加IOml 8% (體積百分數)FBS的分離液，混勻後在4°C，600g離心8分鐘；移去上清，加20ml含20% (體積百分數)BSA的DMEM培養基，吹打混勻後，4°C，IOOOg離心20分鐘；取最下層的沉澱，製得毛細血管；
(4)將步驟(3)製得的毛細血管重懸於Iml的分離液中，再加入7. 9ml的分離液， Iml的膠原酶和100 μ I的DNA酶溶液，混勻後在37°C水浴搖床中(100rpm/min)消化90分鐘，製得毛細血管懸液；
(5)將步驟(4)製得的毛細血管懸液在4°C，600g離心5分鐘；移去上清，沉澱重懸於2ml的分離液中，然後輕輕地把懸液置於Percoll濃度梯度 離心液的頂部；4°C，IOOOg 離心10分鐘，分為六層(第一層透明的分離液；第二層透明的Percoll但在靠分離液處有些浮渣；第三層消化好的腦血管內皮細胞層；第四層透明的Percoll ;第五層紅細胞層；第六層=Percoll晶體)，用長的腰椎穿刺針取第三層懸濁液，第三層懸濁液體即為腦血管內皮細胞；
(6)將步驟(5)製得的腦血管內皮細胞溶於Iml的內皮細胞培養液中，然後轉移到 IOcm的培養板或6孔板中，正常條件下培養I天，然後用IXPBS緩衝液洗兩次除去死亡的細胞，用含3 μ M/ml嘌呤黴素的內皮細胞培養液純化2天後,更換為正常的腦血管內皮細胞培養液培養7天，用O. 01%胰酶(Typsin)消化傳代或凍存即可；
所述內皮細胞培養液為在每百毫升DMEM培養基的基礎上加入如下組分
20ml血漿來源的血清，100 μ I青黴素_鏈黴素溶液，1. Oml L-穀氨醯胺，100 μ I硫駿慶大黴素，1. Oml肝素，150 μ I鹼性纖維生子因子，1. Oml內皮細胞生長補充因子，300 μ I 維生素C，100 μ I血管內皮生長因子，100 μ I胰島素樣生長因子-1，100 μ I內皮生子因子；
所述培養板或6孔板製備方法如下先用IXCollagen IV鋪板30分鐘,然後再用 I XFibronectin 鋪板 30 分鐘。
實施例2
一種老年大鼠腦血管內皮細胞原代培養方法，步驟如下
(I)將22月齡的老年大鼠斷頭後，剝去大鼠頭部皮膚，然後把大鼠頭浸泡在0°C的含2% (體積百分數)胎牛血清(FBS)分離液中10分鐘，取出，切開兩個大腦半球，分別把兩個腦半球在消毒的普通濾紙上滾動一周，然後去除腦幹和白質部分，保留灰質部分，製得樣品組織；
分離液為在DMEM培養基的基礎上，每百毫升加入如下組分1ml青黴素-鏈黴素溶液；100 μ I硫駿慶大黴素；
(2)把樣品組織置於5ml冰冷的含8% (體積百分數)FBS分離液的培養皿中剪成 I 2mm3的樣品組織小塊，補加8% (體積百分數)FBS分離液至25ml，經吹打分散，然後將吹打分散的樣品組織小塊加入2. 5ml的膠原酶和250 μ I的DNA酶溶液，在36°C的水浴搖床中100rpm/min消化90分鐘；然後吹打分散後，繼續消化30分鐘，製得分散細胞；
(3)向步驟(2)製得的分散細胞補加IOml 8% (體積百分數)FBS的分離液，混勻後在4°C，600g離心8分鐘；移去上清，加20ml含20% (體積百分數)BSA的DMEM培養基，吹打混勻後，4°C，IOOOg離心20分鐘；取最下層的沉澱，製得毛細血管細胞；
(4)將步驟(3)製得的毛細血管細胞重懸於Iml的分離液中，再加入7. 9ml的分離液，Iml的膠原酶和100 μ I的DNA酶溶液，混勻後在37°C水浴搖床中(100rpm/min)消化90 分鐘，製得毛細血管懸液；
(5)將步驟(4)製得的毛細血管懸液在4°C，600g離心5分鐘；移去上清，沉澱重懸於2ml的分離液中，然後輕輕地把懸液置於Percoll濃度梯度離心液的頂部；4°C，IOOOg 離心10分鐘，分為六層(第一層透明的分離液;第二層:透明的Percoll但在靠分離液處有些浮渣；第三層消化好的腦血管內皮細胞層；第四層透明的Percoll ;第五層紅細胞層；第六層=Percoll晶 體)，用長的腰椎穿刺針取第三層液體，第三層液體即為腦血管內皮細胞；
(6)將步驟(5)製得的腦血管內皮細胞溶於Iml的內皮細胞培養液中，然後轉移到 IOcm的培養板或6孔板中，正常條件下培養I天，然後用IXPBS緩衝液洗兩次除去死亡的細胞，用含4 μ M/ml嘌呤黴素的內皮細胞培養液純化3天後,更換為正常的腦血管內皮細胞培養液培養7 10天，用O. 01%胰酶(Typsin)消化傳代或凍存即可；
所述內皮細胞培養液為在每百毫升DMEM培養基的基礎上加入如下組分
20ml血漿來源的血清，100 μ I青黴素-鏈黴素溶液，1. Oml L-穀氨醯胺，ΙΟΟμ I硫駿慶大黴素，1. Oml肝素，150 μ I鹼性纖維生子因子，1. Oml內皮細胞生長補充因子，300 μ I 維生素C，150 μ I血管內皮生長因子，150 μ I胰島素樣生長因子-1，150 μ I內皮生子因子；
所述培養板或6孔板製備方法如下先用IXCollagen IV鋪板30分鐘，然後再用 I XFibronectin 鋪板 30 分鐘。
對比例
按傳統培養方法製備新生鼠，幼年鼠或年輕成年大鼠腦血管內皮細胞，具體步驟如下
(I)取新生鼠(〈10天，35 50g)，幼年鼠(<3weeks，80 IOOg)或2-3月年輕成年鼠(200g 300g)的大腦，浸泡在DMEM分離液中。(100ml DMEM分離液100ml DMEM+Iml青黴素-鏈黴素溶液);
(2)把大腦皮層取出，剪成組織小塊，並用玻璃勻漿器進行勻漿。勻漿液在4°C， IOOOg離心10分鐘；取沉澱，把沉澱重懸在含15%右旋糖苷的DMEM中(15%Dextran的DMEM， Dextran的分子量為146，OOODa), 4000g離心10分鐘；取最下層的沉澱，製得毛細血管；
(3)將步驟(2)製得的毛細血管重懸於含O. 05%(重量體積比)分散酶(dispase) 的DMEM消化液中，在每分鐘100-125轉的搖床上，37°C消化4小時；然後800g，離心5分鐘；
(4)將步驟(3)製得的沉澱重懸於含O. 1%的膠原酶和O. OP/oDNA酶的DMEM溶液中，在每分鐘100-125轉的搖床上，37°C消化16小時；消化液在700g離心5分鐘。
(5)沉澱重懸於分離液中，然後輕輕地把懸液置於Percoll濃度梯度離心液的頂部；在41，55(^離心10分鐘，取第三層懸濁液即為腦血管內皮細胞；
(6)將步驟(5)製得的腦血管內皮細胞溶於內皮細胞培養液中，種植在IOcm的培養板或6孔板中培養，正常條件下培養I天，然後用I XPBS緩衝液洗除去死亡的細胞，更換為正常的腦血管內皮細胞培養液培養7 10天，即可應用。
傳統腦血管內皮細胞培養液組分如下
44ml DMEM,44ml Ham，s_F12，IOml FBS，1. Oml肝素鈉，1. Oml 內皮細胞生長補充因子° (該配方記載於 Tunkel AR et al. Blood-brain barrier alterations in bacterial meningitis: development of an in vitro model and observations on the effects of lipopoIysaccharide.1n Vitro Cell Dev Biol.199127A(2):113-20)。
結果分析
實施例1所述老年大鼠腦血管內皮細胞原代培養方法與傳統方法傳3代存活率的比較(見圖1)
權利要求
1.一種老年大鼠腦血管內皮細胞原代培養方法，其特徵在於，步驟如下(1)將20 22月齡的老年大鼠斷頭後，剝去大鼠頭部皮膚，然後把大鼠頭浸泡在0°C 的含2% (體積百分數)胎牛血清的分離液中5 10分鐘，取出，取出腦組織，取灰質部分， 製得樣品組織；(2)把樣品組織置於5ml冰冷的含8%(體積百分數)胎牛血清的分離液的培養皿中剪成樣品組織小塊，補加8% (體積百分數)胎牛血清的分離液至25ml，經吹打分散和生物酶消化後，製得分散細胞；(3)向步驟(2)製得的分散細胞補加10ml8%(體積百分數)胎牛血清的分離液，混勻後第一次離心；移去上清，加20ml含20% (體積百分數)牛血清白蛋白的DMEM培養基，吹打混勻後，第二次離心，取最下層的沉澱，製得毛細血管；(4)將步驟(3)製得的毛細血管重懸於Iml的分離液中，再加入7.9ml的分離液，經生物酶消化後，製得毛細血管懸液；(5)將步驟(4)製得的毛細血管懸液，經第三次離心後，移去上清，沉澱重懸於2ml的分離液中，然後輕輕地把懸液置於Percoll濃度梯度離心液的頂部；在4°C，IOOOg離心10分鐘，分為六層，取第三層懸濁液即為腦血管內皮細胞；(6)將步驟(5)製得的腦血管內皮細胞溶於Iml的內皮細胞培養液中，於在IOcm的培養板或6孔板中培養，正常條件下培養I天，然後用I XPBS緩衝液洗除去死亡的細胞，用含 3 4 μ M/ml嘌呤黴素的內皮細胞培養液純化2 3天後,更換為正常的腦血管內皮細胞培養液培養7 10天，用O. 01% (重量百分數)胰酶或含ImM EDTA的PBS消化傳代或凍存即可。所述培養板或6孔板製備方法如下先用IXCollagen IV鋪板30分鐘，然後再用 I XFibronectin 鋪板 30 分鐘。
2.如權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述步驟(I)中分離液為在DMEM培養基的基礎上，每百毫升加入如下組分Iml青黴素-鏈黴素溶液；100 μ I硫駿慶大黴素。
3.如權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述步驟(I)中取出腦組織，取灰質部分按如下步驟操作切開兩個大腦半球，分別把兩個腦半球在消毒的普通濾紙上滾動一周， 然後去除腦幹和白質部分，保留灰質部分。
4.如權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述步驟(2)中生物酶消化按如下步驟操作將吹打分散的樣品組織小塊加入2. 5ml的膠原酶和250 μ I的DNA酶溶液，在36°C的水浴搖床中100rpm/min消化90分鐘；然後吹打分散後，繼續消化30分鐘。
5.如權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述步驟(3)中的第一次離心為在4°C， 600g離心8分鐘；第二次離心為在4°C，IOOOg離心20分鐘。
6.如權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述步驟(4)中的經生物酶消化按如下步驟操作Iml的膠原酶和100 μ I的DNA酶溶液，混勻後在37°C、100rpm/min的條件下水浴搖床中消化90分鐘。
7.如權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述步驟(5)中離心液組分如下Percol 18ml+l XPBS 15. 2ml+10XPBS (不含鈣鎂)0. 8ml+FBS 0.8ml。
8.如權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述步驟(5)中的第三次離心為在4°C， 600g離心5分鐘。
9.如權利要求1所述的培養方法，其特徵在於，所述步驟(6)中的內皮細胞培養液為在每百毫升DMEM培養基的基礎上加入如下組分·20ml血漿來源的血清，100 μ I青黴素-鏈黴素溶液，1. Oml L-穀氨醯胺，100 μ I硫駿慶大黴素，1. Oml肝素，150 μ I鹼性纖維生子因子，1. Oml內皮細胞生長補充因子，300 μ I維生素C，100-150y I血管內皮生長因子，100-150μ I胰島素樣生長因子-1，100-150μ I內皮生子因子。
全文摘要
本發明涉及老年大鼠腦血管內皮細胞原代培養方法，步驟如下(1)取出老年大鼠腦組織的灰質部分，製得樣品組織；(2)置於胎牛血清的分離液的培養皿中經吹打分散和生物酶消化後，製得分散細胞；(3)離心，製得毛細血管；(4)將毛細血管重懸於分離液中，經消化後，製得毛細血管懸液；(5)離心後，沉澱重懸於分離液中，經Percoll濃度梯度離心，製得腦血管內皮細胞；(6)置於培養液中，經培養後，經消化傳代或凍存即可。本發明採用低濃度胰酶或含1mM EDTA的PBS消化細胞，使細胞可傳代3次而仍保持腦血管內皮細胞的特性；並且經凍存復甦後仍可保持腦血管內皮細胞的純度和特性；因此，可節省大量的時間和金錢。
文檔編號C12N5/071GK103060265SQ20131002607
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月23日 優先權日2013年1月23日
發明者王麗梅, 崔敏, 王越, 陳哲宇 申請人:山東大學