幹細胞因子的製作方法

2023-05-01 20:08:01

專利名稱：幹細胞因子的製作方法
本申請是申請日為1990年10月16日，申請號為90109647.4，發明名稱為「幹細胞因子」的發明專利申請的分案申請。
本發明總地涉及刺激包括早期造血祖細胞在內之原始祖細胞的新因子，以及編碼這些因子的DNA順序。具體地說，本發明涉及這些新因子、其片段和多肽類似物，以及編碼它們的DNA順序。
人類造血系統由各種白血細胞(包括中性細胞、巨噬細胞、嗜鹼細胞、肥大細胞、嗜伊紅細胞、T和B細胞)、紅血細胞(紅細胞)和血塊形成細胞(巨核細胞、血小板)組成。
據信少量的某些造血生長因子可使少量「幹細胞」分化成各種血細胞的先祖細胞，並使之大量增殖，最後由這些細胞系分化成成熟的血細胞。在正常情況下，造血再生系統可很好地完成其功能。但當受到化學治療、放射線照射或患有先天性骨髓功能失調的壓力時，病人就會發生嚴重的白細胞減少、貧血或血小板減少等病徵。在這一危險期發展和使用造血生長因子即可加速骨髓再生。
在某些病毒誘發的紊亂中，如獲得性自發免疫缺陷症(AIDS)T細胞等血液成分可能受到特異地破壞。對於這些病例，治療的目的在於增加T細胞的產生。
因為造血生長因子只以極小量存在，故須依靠一系列檢測方法來檢測和鑑定這些因子，目前只能在人為條件下根據對培養之細胞的刺激作用來區分不同的因子。
應用基因重組技術已使人們對個別生長因子的生物學活性有了更清楚的了解。例如，現已弄清了可刺激紅細胞產生之促紅細胞生成素(EPO)的胺基酸與DNA順序(參見Lin,U.S.Patent4,703,008，該專利列為本文參考文獻)。也已利用重組方法分離出人粒細胞集落刺激因子即G-CSF(Souza,U.S.Patent4,810,643，列為本文參考文獻)和人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)[Lee et al.,Proc.Natl.AAcad.Sci.USA,82,4360-4364(1985)；Wong et al.,Science,228,810-814(1985)]、小鼠G和GM-CSF[Yokota et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,1070(1984)；Fung,et al.,Nature,307,233(1984)；Gough,et al.,Nature,309,763(1984)]以及人巨噬細胞集落刺激因子(CSF-1)[Ka-wasaki,et al.,Science,230,291(1985)]的cDNA。
已用高增殖性潛在集落生成細胞(HPP-CFC)分析系統試驗了這些因子對早期造血先祖細胞的作用[Zont,J.Exp.Med.,159,679-690(1984)]。該文獻中有許多關於在HPP-CFC試驗中有活性之因子的報告。表1中示出了這些因子的來源。下面討論已明顯定性的因子。
已將一種在人脾細胞條件培養基中有活性的物質定名為協同因子(SF)。有幾種人組織和人及小鼠細胞系可產生稱為SF-1的SF，其可與CSF-1協同作用刺激最早期的HPP-CFC。已報導了存在於由人脾細胞、人胎盤細胞、5637細胞(一種膀胱癌細胞系)、EMT-6細胞(一種小鼠乳腺癌細胞系)限制的培養基中的SF-1。已經確定了SF-1的特性。早期研究證明，白細胞介素-1與得自細胞系5637[Zsebo et al.,Blood,71,962-968(1988)的SF-1有交叉活性。但另外的報告則證明聯合使用白細胞介素-1(IL-1)和CSF-1,不能同使用CSF-1加部分純化之5637條件培養基製劑一樣刺激同種細胞集落的生成[Mc-Niece,Blood,73,919(1989)]。
存在於妊娠小鼠子宮提取物內的協同因子是CSF-1。WEHI-3細胞(小鼠髓單核細胞白血病細胞系)產生一種似乎與IL-3完全相同的協同因子。CSF-1和IL-3均刺激比SF-1之靶細胞更為成熟的造血祖細胞。
已證明在TC-1細胞的條件培養基中存在另一類協同因子。該細胞系可產生能刺激早期髓樣和淋巴樣細胞型的因子。已將其定名為血淋巴組織生成性生長因子1(HLGF-1)。其表觀分子量為120,000[McNiece et al.,Exp.Hematol.,16,383(1988)]。
已根據其在HPP-CFC試驗中具有活性而鑑定了已知之白細胞介素和CSF中的IL-1、IL-3及CSF-1。尚沒有從結構上鑑定表1中所示協同活性的其他來源。基於對多肽順序和生物學活性的分析結果,可知本發明所涉及的是一種不同於IL-1、IL-3、CSF-1和SF-1的分子。
表1含有在HPP-CFC試驗中有活性之因子的製劑來源1參考文獻人脾CM [Kriegler,Blood,66,503(1982)]小鼠脾CM[Bradley,Exp.Hematol.Today Baum,ed.,285(1980)]
來源1參考文獻大鼠脾CM [Bradley,supra,(1980)]小鼠肺CM [Bradley,supra,(1980)]人胎盤CM [Kriegler,supra,(1982)]妊娠小鼠子宮 [Bradley,supra,(1980)]GTC-CCM[Bradley,supra,(1980)]RH3CM [Bradley,supra,(1980)]PHA PBL[Bradley,supra,(1980)]VEHI-3B CM [McNiece,Cell Biol.Int.Rep.,6,243(1982)]EMT-6 CM [McNiece,Exp.Hematol.,15,854(1987)]L-Cell CM [Kriegler,Exp.Hematol.,12,844(1984)]5637 CM[Stanley,Cell,45,667(1986)]TC-1 CM[Song,Blood,66,273(1985)]1CM=條件培養當經胃腸道外途徑給藥時，蛋白質常常由循環中迅速清除，因此可引發相對短期的藥理學活性。這樣就需要多次注射相對大劑量的生物活性蛋白質，以維持治療效果。已知與相應未修飾的蛋白質相比，蛋白質與聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸等水溶性聚合物共價結合被修飾後，在血液內的半壽期明顯延長[Abuchowski et al.,「Enzymes as Drug」,Holcenberg et al.,eds.Wiley-Inters-cience,New York,NY,367-383(1981)；Newmark et al.,J.Appl.Biochem.4:185-189(1982)；Kattre et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,1487-1491(1987)]。這種修飾作用也可增加蛋白質在水溶液中的溶解度，消除分子聚集，提高蛋白質的物理和化學穩定性，大大降低蛋白質的免疫原性和抗原性。從而，與使用未經修飾的蛋白質相比，以較少次數和較低劑量使用這種聚合物-蛋白質加合物即可達到所期望的體內生物學活性。
因為聚乙二醇(PEG)在哺乳動物體內毒性很低，所以將PEG與蛋白質結合是特別適宜的[Carpenter et al.,Toxicol.Appl.Pharmacol.,18,35-40(1971)]。例如，在美國已獲準使用腺嘌呤脫氨酶的PEG加合物治療人的嚴重聯合免疫缺陷綜合症。結合PEG所帶來的第二個優點是可以有效地降低異源蛋白質的免疫原性和抗原性。例如，可用人蛋白質的PEG加合物治療其他種哺乳動物的疾病，而沒有激發嚴重免疫反應的危險。
PEG等聚合物可以共價連接到蛋白質分子中的一個或多個反應性胺基酸殘基上，如氨基末端胺基酸的α氨基基團，賴氨酸側鏈的ε-氨基基團、半胱氨酸側鏈的巰基基團、天冬氨醯和穀氨醯側鏈的羧基基團、羧基末端胺基酸的α羧基基團及酪氨酸側鏈等，或者連接到與某些天冬醯胺、絲氨酸或蘇氨酸殘基相連之糖基鏈的活化衍生物上。
已描述了適合與蛋白質直接反應的許多活化形式的PEG。可與蛋白質氨基基團反應的適用PEG試劑包括羧酸的活性酯或碳酸酯衍生物，特別是那些其中離去基團為N-羥基琥珀醯亞胺、對位硝基苯酚、咪唑或1-羥基-2-硝基苯-4-磺酸酯的衍生物。含有馬來醯亞胺基或滷乙醯基團的PEG衍生物是適於修飾無巰基基團之蛋白質的有用試劑。同樣，含有氨基、肼或醯肼基團的PEG試劑則適合與蛋白質中碳水化合物基團經高碘酸氧化所產生的醛反應。
本發明的目的在於提供一種引起早期造血祖細胞生長的因子。
本發明提供了本文稱為「幹細胞因子」(SCF)的新因子，該因子具有刺激包括早期造血祖細胞在內之原始祖細胞生長的能力。這些SCF也能夠刺激神經幹細胞和原生殖幹細胞等非造血幹細胞。這樣因子包括純化的、天然存在的幹細胞因子。本發明還涉及具有與天然存在之幹細胞因子完全相同的胺基酸順序的非天然多肽，從而使之具有天然幹細胞因子的造血生物學活性。
本發明還提供了適於在原核和真核宿主細胞中表達多肽產物的離體DNA順序，該多肽產物完全複製了天然存在之幹細胞因子的胺基酸順序，從而具有天然幹細胞因子的造血生物學活性。這樣的DNA順序包括a)


圖14B、14C、15B、15C、42和44中列出的DNA順序或其互補鏈；b)可與(a)中限定之DNA順序或其片段雜交的DNA順序以及c)除非有遺傳密碼子的簡併外，可與(a)和(b)中限定的DNA順序雜交的DNA順序。
本發明還提供了含有這些DNA順序的載體、用這些載體轉化或轉染的宿主細胞。本發明也包括以重組技術生產SCF的方法，以及治療疾病的方法。另外，也提供了包含SCF的醫藥組合物以及與SCF特異結合的抗體。
本發明還涉及由含SCF的材料中有效地回收幹細胞因子的方法，該方法包括離子交換層析和/或反向液相層析分離步驟。
本發明還提供了可延長體內半壽期並提高在哺乳動物體內之效力的生物學活性加合物，其包括共價結合到聚乙二醇或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物等水溶性聚合物上的SCF，其中所說的聚合物是在一端未被烷基基團取代或被取代的。本發明的另一個方面是涉及製備上述加合物的方法，該方法包括使SCF與至少具有一個反應性末端基團的水溶性聚合物反應、純化所得到的加合物，以產生延長了循環半壽期並提高了生物學活性的產物。
圖1是純化哺乳動物SCF的陰離子交換層析圖譜。
圖2是純化哺乳動物SCF的凝膠過濾層析圖潛。
圖3是純化哺乳動物SCF的麥胚凝集素-瓊脂糖層析圖譜。
圖4是純化哺乳動物SCF的陽離子交換層析圖譜。
圖5是純化哺乳動物SCF的C4層析圖譜。
圖6顯示圖5中C4柱洗脫物的十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)(SDS-PAGE)結果。
圖7是哺乳動物SCF的分析性C4層析圖譜。
圖8顯示圖7中C4柱洗脫物的SDS-PAGE結果。
圖9顯示純化的哺乳動物SCF和去糖基化哺乳動物SCF的SDS-PAGE。
圖10是純化之哺乳動物SCF的分析性C4層析圖。
圖11顯示由蛋白質順序測定得出的哺乳動物SCF的胺基酸順序。
圖12顯示A．大鼠SCFcDNA的寡核苷核；B．人SCFDNA的寡核苷酸；C．通用的寡核苷酸。
圖13顯示A．聚合酶鏈反應(PCR)擴增大鼠SCFcDNA的流程；B．PCR擴增人SCF cDNA的流程。
圖14顯示A．測定大鼠基因組DNA順序的程序；B．大鼠基因組DNA的核酸順序；C．大鼠SCF cDNA的核酸順序和大鼠SCF蛋白質的胺基酸順序。
圖15顯示A．測定人基因組DNA順序的程序；B．人基因組DNA的核酸順序；C．人SCF cDNA的複合核酸順序及SCF蛋白質的胺基酸順序。
圖16顯示一一對應排列的人、猴、狗、小鼠和大鼠SCF蛋白質的胺基酸順序。
圖17顯示哺乳動物細胞表達載體V19.8SCF的結構。
圖18顯示哺乳動物CHO細胞表達載體pDSVE.1的結構。
圖19顯示大腸桿菌表達載體pCFM1156的結構。
圖20顯示A．哺乳動物SCF的放射免疫分析結果；B．免疫沉澱之哺乳動物SCF的SDS-PAGE結果。
圖21顯示重組人SCF的Western印跡。
圖22顯示重組大鼠SCF的western印跡。
圖23顯示COS-1細胞產生的重組大鼠SCF對骨髓移植之影響的直方圖。
圖24顯示重組大鼠SCF治療Steel小鼠巨細胞性貧血的效果。
圖25顯示用重組大鼠SCF處理之Steel小鼠的外周血白血細胞計數(WBC)。
圖26顯示用重組大鼠SCF處理之Steel小鼠的血小板計數。
圖27顯示用重組大鼠SCF1-164PEG25處理之Steel小鼠的分化WBC計數。
圖28顯示用重組大鼠SCF1-164PEG25處理之Steel小鼠的淋巴細胞亞群。
圖29顯示重組人順序SCF處理正常靈長目動物後提高外周血WBC計數的效果。
圖30顯示重組人順序SCF處理正常靈長目動物後提高血細胞比容和血小板計數的效果。
圖31顯示下列圖譜A．用重組人SCF1-162刺激的人骨髓細胞集落；B．圖31A所示集落中Wright-Giemsa染色的細胞。
圖32顯示圖33中所示層析圖之S-Sepharose柱洗脫物的SDS-PAGEA．加還原劑；B．無還原劑。
圖33是對大腸桿菌產生之重組人SCF所作S-Sepharose柱層析的層析圖。
圖34顯示對圖35所示層析圖中C4柱洗脫物所作SDS-PAGE分析的結果A．加還原劑；B．無還原劑。
圖35是對大腸桿菌產生之重組人SCF所作C4柱層析的層析圖。
圖36是對CHO產生的重組大鼠SCF所作Q-Sepharose柱層析的層析圖。
圖37是CHO產生的重組大鼠SCF之C4柱層析的層析圖。
圖38顯示對圖37所示層析圖中C4柱洗脫物所作SDS-PAGE分析的結果。
圖39顯示CHO產生的、純化的重組大鼠SCF在去糖基化前後所作SDS-PAGE分析的結果。
圖40所示A．重組大鼠聚乙二醇化SCF1-164反應混合物的凝膠過濾層析圖； B．未修飾的重組大鼠SCF1-164的凝膠過濾層析圖。
圖41顯示結合到新鮮白血病母細胞上的標記的SCF。
圖42顯示得自HT1080纖維肉瘤細胞系的人SCF cDNA順序。
圖43顯示表達人SCF1-248之COS-7細胞和表達人SCF1-164之CHO細胞的放射自顯影圖譜。
圖44顯示得自5637膀胱癌細胞系的人SCF cDNA順序。
圖45顯示受放射線照射小鼠經SCF處理後提高了存活期。
圖46顯示受幅射小鼠在作5％股骨骨髓移植和SCF處理後提高了存活期。
圖47顯示在作0.1和20％股骨骨髓移殖及SCF處理後，提高了受幅射之小鼠的存活期。
下文以優選方案的形式給出了實踐本發明的舉例說明，本領域內技術人員將會從以下的詳細描述中了解到本發明的許多方面及優點。
根據本發明，提供了新的幹細胞因子以及編碼這些SCF之全部或其部分順序的DNA順序。術語「幹細胞因子」或「SCF」是指天然存在的SCF(如天然人SCF)及非天然存在的多肽(即與天然SCF不同者)，後者具有天然存在之幹細胞因子的胺基酸順序及該順序的糖基化複製本，從而使之具有天然存在之幹細胞因子的造血生物學活性。於細胞因子具有刺激早期造血祖細胞生長的能力，使之能夠成熟為紅細胞樣細胞、巨核細胞、粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞。用SCF處理哺乳動物可使髓樣和淋巴樣譜系的造血細胞數絕對增加。幹細胞的一個特徵性標誌是它們能夠分化成髓樣和淋巴樣細胞[Weis-sman,Science,241,58-62(1988)]。用重組大鼠SCF處理Steel小鼠(實施例8B)可以增加粒細胞、單核細胞、紅細胞、淋巴細胞及血小板數。用重組人SCF處理正常靈長目動物可增加髓樣和淋巴樣細胞數(實施例8C)。
在成黑素細胞、生殖細胞、造血細胞、腦和脊素細胞的遷移途徑及固定部位中，有細胞對SCF的胚胎期表達。
早期造血祖細胞巳富集在用5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的哺乳動物骨髓中。化學治療藥物(5-FU)可選擇性地消耗後期造血祖細胞。SCF對5-FU處理後的骨髓具有活性。
SCF的生物活性和組織分布的型式說明了其在治療各種幹細胞缺失的胚胎發生和血生成，以及其容量中的重要作用。
本發明提供的DNA順序包括摻入適於經選擇之非哺乳動物宿主表達的「優選的」密碼子；規定限制性核酸內切酶的切割位點；提供便於構建易表達之載體的其他起始、終止或中間DNA順序。本發明還提供編碼SCF之多肽類似物或衍生物的DNA順序，前者在一個或多個胺基酸的特性或定位上不同於天然存在者(即含有比指定之SCF有較少殘基的缺失類似物；取代類似物，其中一個或多個指定的殘基被其他殘基取代；以及其中有一個或多個胺基酸殘基被加到多肽之末端或中間部分上的加成類似物)，且其可共有天然存在形式的某些或全部特性。本發明特別提供了編碼SCF之全長未加工胺基酸順序的DNA順序以及編碼已加工形式者的DNA順序。
本發明的新的DNA順序包括用於在原核和真核宿主細胞中表達多肽產物的順序，該多肽產物至少具有天然存在之SCF的一部分原始結構構象以及一種或多種生物學特性。本發明的DNA順序具體地包括(a)
圖14B、14C、15B、15C、42和44中列出的DNA順序或其互補鏈；(b)與
圖14B、14C、15B、15C、42和44中所示DNA順序或其片段雜交(在實施例3所述的雜交條件或更為嚴格的條件下)的DNA順序；以及(c)除存在基因密碼子的簡併性的情況外，可與
圖14B、14C、15B、15C、42和44中所示DNA順序雜交的DNA順序。(b)和(c)部分中所具體包括的是編碼SCF之等位基因變異形式和/或編碼其他種哺乳動物SCF的基因組DNA順序，以及人工製造的編碼SCF、SCF片段和SCF類似物的DNA順序。該DNA順序可摻入利於微生物宿主中信使RNA轉錄和翻譯的密碼子。可按照Alton等人的方法(PCT已公開的專利申請WO83/04053)很容易地構建這種人造的順序。
根據本發明的另一個方面，本文描述的編碼有SCF活性之多肽的DNA順序，還具有信息資料價值，其提供了迄今尚不能得到的哺乳動物蛋白質的胺基酸順序。該DNA的價值還在於它可作為一種以種種重組技術大規模合成SCF的有用產品。換句話說，本發明提供的DNA順序可用於產生新的和有用的病毒及環形質粒DNA載體、新的和有用的被轉化或轉染的原核和真核宿主細胞(包括培養生長的細菌、酵母細胞和哺乳動物細胞)，以及培養這些可表達SCF和其相關產物之宿主細胞的方法。
本發明的DNA順序也是用作標記探針的合適材料，該探針可用來分離編碼SCF的人基因組DNA和編碼相關蛋白質的其他基因，以及分離其他種哺乳動物的cDNA和基因組DNA順序。DNA順序也可用於合成蛋白質(如在昆蟲細胞內)的各種可替代的方法中，或用於人或其他哺乳動物的基因治療。可望將本發明的DNA順序用於產生新的轉基因哺乳動物，以其作為大量生產SCF和SCF產品的真核「宿主」[總地參見Palmiter et al.,Science,222,809-814(1983)]。
本發明提供了純化的和分離的天然SCF(即具有與天然形式相同一級、二級和三級構象的純化或人工產物，且糖基化特徵亦與天然材料完全相同者)，以及具有天然幹細胞因子之一級結構構象(即胺基酸殘基的連續順序)並完全復現了天然幹細胞因子的糖基化作用，從而使之具有天然SCF之造血生物學活性的非天然多肽。這樣的多肽包括衍生物及類似物。
在一優選方案中，對SCF的定性是經基因組或cDNA克隆方法或基因合成方法得到外源DNA順序，然後製取該順序在原核或真核宿主內表達的產物(如由培養的細菌、酵母、較高等植物、昆蟲及哺乳動物細胞中表達)，進而證實其存在。即是說，在一優選實施方案中SCF是「重組的SCF」。在典型酵母菌(如釀酒酵母)或原核細胞(如大腸桿菌)宿主中表達的產物是與任何哺乳動物蛋白質都沒有關聯的。而在脊椎動物[如非人類哺乳動物(如COS或CHO)和鳥類]細胞中表達的產物也與任何人蛋白質沒有關聯。根據使用的宿主不同，本發明的多肽是由哺乳動物或其他真核生物的碳水化合物糖基化的，或者是非糖基化的。可使用Lee等人所述的技術[J.Biol.Chem.,264,13848(1989)]改換宿主細胞。本發明的多肽還可包括起始蛋氨酸殘基(在位置-1處)。
除天然存在的SCF的等位基因形式外，本發明還包括其他SCF產物，如SCF的多肽類似物。所說的類似物包括SCF的片段。依照上述已公開的Alton等人的方法(WO83/04053)，可以很容易地設計並製得編碼適於微生物表達之多肽的基因，這樣的多肽就其一個或多個殘基的特性或定位來說，具有不同於本文指定之多肽的一級構象(如取代、末端和中間加入及缺失)。另外，可以用已知的位點特異性誘交技術很容易地對cDNA和基因組基因進行修飾，用以產生SCF的類似物和衍生物。這些產物至少有一種SCF的生物學性質，而在其他方面則有所不同。例如本發明產物包括經缺失而縮短的；或對水解作用更為穩定的(因此也可以比天然產物有延長的或持續更長時間的效果)；或業經改變而加入或缺失一個或多個潛在的O-糖基化和/或N-糖基化作用的位點；或者有一個或多個缺失的半胱氨酸殘基或被丙氨酸、絲氨酸等殘基所取代，並使之更易於以活牲形式由微生物體系中分離出來；或者具有一個或多個被苯丙氨酸取代的酪氨酸殘基，從而能較為容易地結合到靶蛋白質或靶細胞的受體上。本發明還包括只重複SCF內一部分連續胺基酸順序或二級構象的多肽片段，該片段可具有SCF的一種特性(如受體結合)而沒有其他特性(如早期造血細胞生長活性)。值得注意的是，對於本發明的一種或多種產物來說，在用於治療[見Weiland et al.,Blut,44,173-175(1982)]或其他目的(如在SCF拮抗作用的檢測中)時，有的活性並不是必不可少的。競爭性拮抗物是非常有用的，例如在過量產生SCF的情況下，或者在人白血病病例中惡性細胞過度表達SCF受體時(如實施例13所述白血病母細胞中可過度表達SCF受體)。
本發明的多肽類似物的適用性是具有報導中所說的合成肽的免疫學特性，該合成肽基本上複製了天然蛋白質、糖蛋白和核蛋白的胺基酸順序。更具體地說，已證明有相對低分子量的多肽可參予在持續時間和程度上與生理學上有意義的蛋白質(如病毒抗原、多肽激素等)所引起之免疫反應相似的反應。這些多肽參予的免疫反應包括誘發免疫學活性動物體內特異抗體的生成[Lerner et al.,Cell,23,309-310(1981)；Ross et al.,Nature,294.654-656(1981)；Walteret al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,5197-5200(1980)；Lerner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,3403-3407(1981)；Walter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,4882-4886(1981)；Wong et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,5322-5326(1982)；Baron et al.,Cell,28,395-404(1982)；Dressmanet al.,Nature,295,185-160(1982)；Lerner,Scientific Ame-rican,248,66-74(1983)]。另外,Kaiser等人[Science,223,249-255(1984)]述及合成多肽的生物學和免疫學性質，提到其具有肽激素的二級結構，而沒有它們的一級結構構象。
本發明還包括一類由互補於人cDNA或SCF基因組DNA順序的一部分DNA編碼的多肽，即Tramontano等人所述的「互補性倒轉蛋白質」(＂complementary inverted proteins＂Nocleic AcidRes.,12,5049-5059(1984))。
本發明的代表性SCF多肽包括但不僅限於
圖15C中所示的SCF1-148、SCF1-162、SCF1-164、SCF1-165、和SCF1-183；圖42中所示的SCF185、SCF1-188、SCF1-189和SCF1-248；以及圖44中所示的SCF1-157、SCF1-160、SCF1-161和SCF1-220。
可使用本領域內已知的技術純化SCF。本發明的目的包括由條件培養基或人尿、血清等含SCF的材料中純化SCF的方法，該方法包括下述的一個或多個步驟對含SCF的材料進行離子交換層析(包括陽離子或陰離子交換層析)，對含SCF的材料進行反向液相層析(如使用固相化C4或C5樹脂)、對液體材料進行固相化凝集素層析(即將SCF結合到固相凝集素上，並使用可競爭這種結合的糖進行洗脫)。有關這些方法的詳細描述可參見涉及SCF純化方法的實施例1、10和11。也可用Lai等人的美國專利4,667,016實施例2中所述的技術純化幹細胞因子。
可使用標準技術，如美國系列申請號421,444(共同申請人、題目為促紅細胞生成素異構型，申請日1989年10月13日，已列為本文參考文獻)中所述的技術分離異構型SCF。
本發明還包括用於作SCF治療的醫藥組合物，該組合物包含治療有效量的本發明的多肽產物，以及適當的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。這裡所說的「治療有效量」是指在一定條件和給藥途徑下，足以產生治療效量的用藥量。該組合物可以是液體或凍幹品或乾燥製劑，且包含有不同緩衝液成分(如Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強度的稀釋劑、防止吸附於表面上的白蛋白或明膠等添加劑、去汙劑(如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、膽酸鹽)、增溶劑(如甘油、聚乙二醇)、抗氧劑(如抗壞血酸、焦亞硫酸鈉)、防腐劑(如乙基汞硫代水楊酸鈉、苯甲醇、parabens)、填充劑或張力校正劑(如乳糖、甘露糖)、且包括聚乙二醇等聚合物與蛋白質的共價結合(以下實施例12所述)、與金屬的絡合、或活性材料摻入到多聚化合物(如聚乳酸、聚羥基乙酸、水凝膠等)中或其顆粒製劑的表面上，或摻入脂質體、微乳劑、膠粒、單片層或多片層囊泡、血影細胞或原生素的結合物可直接用於抗腫瘤治療(實施例13)或作為骨髓移植的條件攝生劑。
當用可檢測的標記物(如放射性標記和非同位素標記如生物素)標記後，本發明的核酸產物可用於雜交過程中，用以確定SCF基因或任何相關基因家族在染色體圖中的位置。它們也可用於在基因水平上鑑定人SCF基因紊亂，並可作為基因標記物用於鑑定相鄰基因及其紊亂。人SCF基因位於第12對染色體上，鼠SCF基因則位於第10對染色體的S1位點上。
單獨使用SCF或SCF與其他治療結合使用，可有效地治療多種造血功能紊亂。單獨使用SCF或結合使用一種或多種附加造血因子，如EPO、G-CSF、GM-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IGF-Ⅰ或LIF，可用於治療造血功能系亂。
可用SCF治療一系列因毒性、輻射或免疫損傷造成的特徵在於功能性骨髓細胞亞群數目減少的幹細胞功能異常。再生障礙性貧血也是一種幹細胞功能失調症，其表現為造血組織被脂肪所代替以及各類血細胞減少。SCF可增加造血細胞數，故可有效地治療再生障礙性貧血(實施例8B)。可用Steel小鼠作為人再生障礙性貧血的模型[Jones,Exp.Hematol.11,571-580,(1983)]。在治療再生障礙性貧血中，利用相關的細胞激活素、GM-CSF已獲得了理想的效果[Antin,et al.,Blood,70,129a(1987)]。陣發性夜間血紅蛋白尿症(PNH)是一種以形成有缺陷的血小板和粒細胞及異常紅細胞為特徵的幹細胞功能失調症。質球中。這樣的組合物將影響到SCF的物理狀態、溶解度、穩定性、體內釋放速率以及體內清除速率。對組合物的選擇將依據於有SCF活性之蛋白質的物理和化學性質。例如，由膜結合形式之SCF製得的產品可要求使用含去汙劑的配方。控制或維持釋放的組合物應有親脂性包裹物(如脂肪酸、蠟、油)。本發明還包括用聚合物(如polo-xamers或poloxamines)和SCF包層的顆粒組合物，其中SCF是與抗組織特異性受體的抗體配基或抗原偶聯的，或與組織特異性受體的配基偶聯的。有關本發明組合物的其他實施例涉及適於非胃腸道、肺、鼻和口腔等不同給藥途徑的顆粒形式、保護性包衣、蛋白酶抑制劑或滲透增強劑等。
本發明還包括含一種或多種其他造血因子的組合物，這些附加因子包括EPO、G-CSF、GM-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IGF-1或LIF(白血病抑制因子)。
本發明的多肽可以是通過與可檢測的標記物質結合而「被標記的」(如用125I放射標記的或生物素化的)，以提供用於檢測或定量分析固體組織及血液或尿液樣品中之SCF或其細胞受體的試劑。
生物素化的SCF可與固相化鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)合用，用以清除自體骨髓移植之骨髓中的白血病母細胞。生物素化的SCF還可與固相化鏈黴抗生物素蛋白合用，以在自體或異體骨髓移植中富集自體或異源幹細胞。SCF的毒素結合物，如與蓖麻蛋白[Uhr,Prog.Clin,Biol.Res.,288,403-412(1989)]、白喉內毒素[Moolten,J.Natl.Con.Inst.,55,473-477(1975)]及放射性同位可用SCF治療許多疾病。這些疾病包括脊髓纖維化症、脊髓硬化症、骨硬化症、轉移性癌、急性白血病、複合性骨髓瘤、何杰金氏病、淋巴瘤、(Gaucher氏病、尼曼氏病、累-塞二氏病、頑固性低色貧血、Di Guglielmo綜合症、黑熱病、結節病、原發性脾各類血細胞減少、粟粒性結核、暴發性敗血症、播散性真菌病、瘧疾、VB12和葉酸缺乏症、VB6缺乏症、先天再生障礙性貧血、高色素生成性疾病如花斑症和白瘢風。實施例8B和8C中舉例說明了SCF對類紅細胞、巨核細胞和粒細胞的刺激作用。
SCF可促進原始生殖細胞、神經脊衍生的黑素細胞、後脊素產生的連合軸突、消化道濾泡細胞、中腎和後腎小管以及嗅球的生長，當這些部位出現特異性組織損傷時是特別有用的。SCF可用於治療神經損傷，並且是神經細胞的生長因子。SCF可用於體外受精過程或治療不育症。SCF還可用於治療因放射治療或化療引起的腸道損傷。
可用SCF、抗SCF抗體或SCF-毒素結合物治療幹細胞骨髓增殖性疾病，如真性紅細胞增多、慢性髓細胞白血病、特發性骨髓外髓細胞化生、原發性血小板減少及急性白血病。
有許多病例記載造血細胞生長因子G-CSF、GM-CSF和IL-3促進了白血病細胞的增殖[Delwel et al.,Blood,72,1944-1949(1988)]。因為許多化學治療藥物的成功取決於惡性細胞生活周期比正常細胞更活躍這一事實，所以單用SCF或結合其他因子使用，可以作為惡性細胞的生長因子，使之對化學治療藥物更為敏感。實施例13中即顯示了白血病母細胞上可過度表達SCF受體。
目前正在研究許多重組造血因子提高因化學或放射治療所造成的白細胞降低的能力問題。儘管這些因子在這方面是很有用的，但也存在著受到損傷的早期造血間隔期(特別是因輻射引起的)，因此必須在這些較晚作用的生長因子能發揮其最適作用之前使之再次增殖。單獨使用SCF或與這些因子聯合使用可進一步減少或消除因化療或放射治療引起的白細胞與血小板的降低。此外，SCF可使病人耐受更強力的抗腫瘤或放射治療(實施例19)。
在同源、同種或自體骨髓移植中，可使用SCF增加造血祖細胞。已表明使用造血生長因子可以減少骨髓移植後嗜中性細胞數恢復的時間[Donahue et al.,Nature,321,872-875(1986)；Welte et al.,J.Exp.Med.,165,941-948(1987)]。對於骨髓移植，可單獨或聯合使用以下三種方案在抽骨髓或外周血白色體形成之前單用SCF或聯合使用其他造血因子處理供體；移植前於體外處理骨髓，以活化或擴增細胞數；最後，可處理接受體以提高供體骨髓的植入量。
可基於轉染(或用反錄病毒感染)造血幹細胞，用SCF提高基因治療的效能。SCF可以促進被轉染之早期造血祖細胞的生長和增殖。可單用SCF或聯合使用IL-6、IL-3(或這兩者)處理培養物。一旦被轉染後，即可將這些骨髓移植物中的細胞輸入有遺傳疾病的病人體內[Lim,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8892-8896(1989)]。可用於治療遺傳病的基因包括腺嘌呤脫氨酶、葡糖腦苷脂酶、血紅蛋白及囊性纖維變性基因。
SCF可單獨或聯合其他因子如IL-7用於治療獲得性免疫缺陷症(AIDS)或嚴重的聯合免疫缺陷狀態(SCID)(實施例14)。這種作用的例證在於SCF治療可以提高循環T輔助細胞CD4+,OKT4+)的絕對水平。這些細胞是導致愛滋病病人免疫缺陷之人免疫缺陷病毒(HIV)的主要靶細胞[Montagnier,＂Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus＂,ed.R.C.Gallo,ColdSpring Harbor,New York,369-379(1984)]。此外,SCF可用於對抗AZT等抗HIV藥物的骨髓抑制作用[Gogu,Life Sciences,45,No.4(1989)]。
急性失血後可用SCF加速造血功能的恢復。
用SCF作體內治療，可加強免疫系統抗腫瘤能力。Rosenberg等人(N.Eng.J.Med.,313,1485(1987)]描述了用最近克隆的細胞激活素(IL-2)直接增強免疫功能，即是這種療實用性的一個例子。
SCF與一種或多種其他造血因子合用時，可間隔短時間分開給藥或一同給藥。在用SCF治療前，先擴增祖細胞群體，而後者可以對終末起作用的造血因子(如G-CSF或EPO)起反應。給藥途徑可以是靜脈內、腹腔內、皮下或肌肉內。
本發明還涉及與幹細胞因子特異結合的抗體。下文實施例7描述了生產多克隆抗體的方法。本發明進一步的實施方案涉及與SCF特異結合的單克隆抗體(見實施例20)。與常用的(多克隆)抗體製劑(其典型地包括針對不同抗原決定基的不同抗體)相反，每種單克隆抗體都是針對抗原上單一決定基的。單克隆抗體可用於改善藉助抗原-抗體結合之診斷和分析方法的選擇性和特異性。另外，還可用於中和或從血清中除去SCF。單克隆抗體的第二個優點是它們可由培養的雜交瘤細胞合成，而沒有其他免疫球蛋白汙染。可從培養的雜交瘤細胞或腹腔內注射了雜交瘤的小鼠腹水液中製取單克隆抗體。最初由Kohler和Milstein[Eur.J,Immunol.6,511-519(1976)]描述的雜交瘤技術業已廣泛用於產生能高水平分泌抗許多特異抗原之單克隆抗體的雜交細胞系。
下列實施例旨在進一步舉例描述本發明,而不構成對本發明範圍的限制。
實施例1由Buffalo大鼠肝細胞條件培養基中純化/鑑定幹細胞因子A．體外生物學試驗1．HPP-CFC試驗天然哺乳動物大鼠SCF和重組大鼠SCF蛋白質具有多種不同的生物學活性。活性之一是其對早期造血細胞的影響。可用高增殖性潛在集落形成細胞(HPP-CFC)檢測法檢測到這種活性[Zsebo,etal.,supra(1988)]、為了研究這些因子對早期造血細施的影響，HPP-CFC檢測系統中須使用從5-氟尿嘧啶(5-FU)處理後2天的動物體內得到的小鼠骨髓細胞。化療藥物5-FU可選擇性地殺滅晚期造血祖細胞，因而檢測早期祖細胞及作用於這些細胞的因子。在CSF-1或IL-6存在下將大鼠SCF接種到半固體培養物中。該瓊脂培養物含有McCoys完全培養基(GIBCO)、20％胎牛血清、0.3％瓊脂和2×105個骨髓細胞/ml。McCoys完全培養基含有下列成分1×McCoys培養基中添加0.1mM丙酮酸鹽、0.24×必需胺基酸、0.24×非必需胺基酸、0.027％碳酸氫鈉、0.25×維生素、0.72mM甘氨醯胺、25μg/mlL-絲氨酸和12μg/mlL-天冬醯胺。骨髓細胞得自靜脈注射了150mg/Kg5-FU的Batb/c小鼠。用5-FU處理後2天收穫小鼠股骨衝洗出骨髓。鋪板前用紅細胞溶解劑(BectonDickeson)溶解紅細胞。將含上述混合物的試驗物質鋪敷在30mm平皿中。14天後刮下含數千個細胞的集落(直徑大於1mm)。該檢測法用於天然哺乳動物細胞產生之大鼠SCF的整個純化過程。
在一典型試驗中，大鼠SCF引起所鋪敷的每200,000個細胞約有50個HPP-CFC增殖。大鼠對5-FU處理的小鼠骨髓細胞有協同增效活性；該檢測中，如只存在單一因子而沒有合用SCF和CSF-1或SCF和IL-6(有活性)則將不形成HPP-CFC集落。
2．MC/9檢測法天然產生的和重組的大鼠SCF的另一個有用的活性是能夠引起IL-4依賴性小鼠肥大細胞系MC/9(ATCC CRL8306)的增殖，按照ATCC CRL8306法將MC/9細胞與一種IL-4源一起培養。該生物檢測法中使用的培養基是RPMI-1640.4％胎牛血清、5×10-5M2-巰基乙醇和1×穀氨醯胺-Pen-strep。不需加另外的生長因子，MC/9細胞即可對SCF有增殖反應。檢測這種增殖的方法是，首先在沒有生長因子的條件下將細胞培養24小時，在含試驗樣品之96小井培養板各小井內加5000個細胞培養48小時，用0.5μCi3H-胸苷(比放射活性為20Ci/mmol)脈衝處理4小時，將細胞收穫到玻璃纖維濾膜上，然後測定特異結合的放射活性。在本實施例C2部分所述的ACA54凝膠過濾步驟之後，用該方法檢測哺乳動物細胞衍生之大鼠SCF的純化過程。一般說來，SCF可使cpm數超出本底4-10倍。
3．CFU-GM
已經確定了在沒有幹擾集落刺激因子(CSF)的情況下純化的天然和重組哺乳動物SCF對正常未耗盡之小鼠骨髓細胞的作用。用CFU-GM檢測法[Broxmeyer et al.,Exp.Hematol.,5,87(1977)]估測SCF對正常骨髓的影響。簡單地說，在溶解紅血細胞後將整個骨髓細胞鋪敷在含有試驗物質的半固態瓊脂培養基上。10天後記錄含多於40個細胞簇的集落。可將瓊脂培養物置於玻片上乾燥、經特殊組織學染色確定細胞的形態學。
對於正常小鼠骨髓，純化的哺乳動物大鼠SCF是一種多潛能CSF，其可在無需加其他因子的情況下刺激含成熟細胞、中性白細胞、巨噬細胞、嗜酸性細胞及巨核細胞之集落的生長。在鋪敷的200,000個細胞中，有100多個細胞集落生長了10天以上。大鼠及人重組SCF與EPO合用可刺激紅細胞樣細胞的產生(見實施例9)。B．條件培養基將得自美國典型培養物保藏中心的Buffalo大鼠肝(BRL)3A細胞(ATCC CRL 1442)培養在20升灌注培養系統內的微載體上，以產生SCF。除用濾網固定微載體和充氧管路外，該系統還使用一個Biolafitte發酵器(ICC-20型)。通過一個阻隔閥和計算機控制的泵系統，定時反向衝洗，以保持75微米篩網不被微載體阻塞。每個篩網都可起到培養基供入和收集網的作用。這種振蕩流動方式可確保篩網不被阻塞。通過一個裝有矽酮管(長50英尺、內徑0.25英時，壁厚0.03英時)的螺旋管提供氧合作用。用於培養BEL 3A細胞的生長培養基是最低基本培養基(含Earle氏鹽)(GIBCO)、2mM穀氨醯胺、3g/L葡萄糖、磷酸胰蛋白腖(2.95g/L)、5％胎牛血清和5％小牛血清。除沒有血清外，收穫培養基與之相同。用生長於旋轉瓶內並經胰酶消化除去的3×109個BRL 3A細胞接種含Cytodex 2微載體(Pharmacia，濃度為5g/L)的反應器。使細胞附著於微載體上並在其上生長8天。必要時可根據葡萄糖消耗情況通過反應器輸注生長培養基。葡萄糖濃度維持在大約1.5g/L。8天後，向反應器內輸注6倍體積的無血清培養基以去除大部分血清(蛋白濃度＜50μg/ml)。反應器分批工作直到葡萄糖濃度降到2g/L以下。此後，使反應器以大約10升/天的連續輸注速率工作。通過調整CO2流速將培養物的pH維持在6.9±0.3。必要時通過補充純氧使溶解氧維持在20％以上。溫度維持在37±0.5℃。
由上述系統中產生大約336升無血清條件培養基，用作純化天然哺乳動物細胞衍生之大鼠SCF的起始材料。C．純化除特別說明者外，所有純化工作均在4℃下進行。
1．DEAE-纖維素陰離子交換層析通過0.45μ Sartocapsules(Sartorius)過濾，澄清無血清培養BRL 3A細胞所產生的條件培養基。以相似方法，對不同批量的培養基(41升、27升、39升、30.2升、37.5升和161升)分別進行濃縮、滲濾/緩衝液交換和DEAE-纖維素陰離子交換層析。然後合併DEAE纖維素收集物，並在本實施例C2-5部分中作為一批作進一步加工。為舉例說明，按下述方法處理41升這一批使用有4個截留分子量為10,000之聚碸膜盒的Millipore Pellicon正切流動式超濾裝置(總膜面積20ft2、泵速～1095ml/min，過濾速度250-315ml/min)將條件培養基濃縮到大約700ml。然後向濃縮物內加入500ml50mM Tris-HCl(pH7.8)、使用正切流動式超濾裝置重新濃縮到500ml，並將此處理過程重複6次來完成滲濾/緩衝液交換，以準備陰離子交換層析。最後使濃縮/滲濾的製劑恢復列700ml。將製劑加到已用50mM Tris-HCl(pH7.8)緩衝液平衡的DEAE纖維素陰離子交換柱(5×20.4cm；Whatman DE-52樹脂)上。加樣後，用2050ml Tris-HCl緩衝液洗柱，並應用鹽梯度
，以167ml/小時的流速，每管收集15ml。層析結果如
圖1所示。HPP-CFC集落數代表HPP-CEC試驗中呈現的生物學活性；對各管分別取100μ作檢測分析。圖中沒有顯示加樣和洗柱期間收集的洗脫部分，這些部分中未檢測出生物學活性。
受到濃縮、滲濾/緩衝液交換和陰離子交換層析的各批條件培養基的行為均相似。以牛血清白蛋白作標準品，用Bradford方法[Anal.Biochem.72,248-254(1976)]測得各批製劑的蛋白質濃度範圍為30-50μg/ml。用於該製備過程之條件培養基的總體積約為336升。2．ACA54凝膠過濾層析合併按上述方法對六批條件培養基作DEAE纖維素柱層析得到的有生物學活性部分(如
圖1所示第87-114管)，並用Amicon攪拌槽和YM10超濾膜將其濃縮到終體積74ml。將該材料加到用50mM Tris-HCl、50mM NaCl(pH7.4)平衡過的ACA54(LKB)凝膠過濾柱上(圖2)。以70ml/小時的流速洗脫並以14ml為一管收集。由於抑制因子與活性部分一同被洗脫，故活性峰(HPP-CEC集落數)出現分離現象；但根據先前的層析圖，活性成份是與主蛋白峰共洗脫的，因此可得到一份活性部分的集合物。
3．麥胚凝集素-瓊脂糖層析合併由ACA54凝膠過濾柱洗脫的第70-112管(500·ml)。將其分成兩等份，每份均使用在20mM Tris-HCl、500mM NaCl(pH7.5)中平衡過的麥胚凝集素-瓊脂糖柱(5×24.5cm；樹脂得自E-Y Laboratories,San Mateo,CA；麥胚凝集素可識別某些碳水化合物結構)進行層析。上樣後，用約2200ml柱緩衝液洗柱，然後加入350mM溶於柱緩衝液中的350mMN-乙醯-D-葡糖胺溶液，由圖3所示約第210管開始洗脫結合的材料。以122ml/小時的流速洗脫並以每管13.25ml收集之。圖3中顯示其中一份的層析情況。將檢測部分對磷酸鹽緩衝鹽水透析；取5μl經過透析的材料作MC/9檢測(cpm值如圖3所示)，10μl作HPP-CFC檢測(集落數如圖3所示)。從中可以看出，活性材料被結合到柱上且可用N-乙醯-D-葡糖胺洗脫，而上樣和洗柱期間大部分汙染材料已通過了層析柱。
4．S-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析合併圖3所示得自麥胚凝集素-瓊脂糖層析的第211-225管和得自第二次層析的同等部分(375ml)，並對25mM甲酸鈉(pH4.2)透析。為使接觸低pH的時間減小到最大限度，透析過程要對5升緩衝液進行8小時以上，且此期間換4次透析液。在此透析過程結束時，樣品體積為480ml，樣品的pH和導電率接近於透析緩衝液的pH和導電率。透析期間樣品中出現了沉澱的材料。離心(22,000g,30分鐘)除去沉澱物，並將上清液加到預先用甲酸鈉緩衝液平衡的S-Sepharose Fast FloW陽離子交換柱(3.3×10.25cm；樹脂購自pharmacia公司)上。流速465ml/小時；每管收集14.2ml。上樣後，用240ml柱緩衝液洗柱，並提供0-750mM NaCl梯度(NaCl溶於緩衝液中，總梯度體積為2,200ml)，由圖4所示約第45管開始洗脫結合的材料。圖4中給出了洗脫曲線。加入200μl0.9 7M Tris鹼，將收集的部分調到pH7-7.4。圖4中的cpm數還是指示MC/9生物學檢測的結果；所指出的部分對磷酸鹽緩衝鹽水透析，並取20μl進行分析。從圖4中可以看出，大部分生物活性材料通過了柱(未結合)；而大部分汙染材料則在鹽梯度中被洗脫(已結合)。
5．使用矽結合之碳氫化合物樹脂的層析合併圖4所示由S-Sepharose柱洗脫的第4-40管(540ml)。450ml集合物與等體積緩衝液B(100mM乙酸銨(pH6)∶異丙醇=25∶75)混合併以540ml/小時的流速加於用緩衝液A(60mM乙酸銨(pH6)∶異丙醇=62.5∶37,5)平衡過的C4柱(Vydac Proteins C4；2.4×2cm)上。上樣後，使流速降至154ml/小時，並用200ml緩衝液A洗柱。施加緩衝液A到緩衝液B的線性梯度(總體積140ml)並以每管9.1ml收集。將經S-Sephrose層析得到的合併部分、C4柱起始樣品、過柱合併收集物、以及洗柱合併物均經加入適當體積的1mg/ml儲備液使之達到含40μg/ml牛血清白蛋白，然後對磷酸鹽緩衝鹽水透析，得到用於生物學檢測的製劑。同樣，將40μl等分的梯度洗脫物與360μl含16μg牛血清白蛋白的磷酸鹽緩衝鹽水混合，然後對磷鹽緩衝鹽水透析以備作生物學檢測。用MC/9檢測法檢測各部分的生物學活性(6.3μl等分的製備的梯度洗脫部分；cpm數示於圖5中)。檢測結果還表明，回收的活性中有大約75％在過柱和洗柱部分中，而25％則在梯度洗脫部分中(見圖5)。圖6中顯示了各部分等分樣品的SDS-PAGE[Laemmli,Nature,227,680-685(1970)；堆積膠含4％(W/V)丙烯醯胺；分離膠含12.5％(W/V)丙烯醯胺〕。對於所述凝膠來說，等分樣品在加入凝膠上之前均於真空下乾燥，然後用20μl樣品處理緩衝液(未還原，即沒有2-巰基乙醇)重新溶解並煮沸5分鐘。泳道A和B分別代表柱起始材料(890ml中取75μl)和過柱洗脫物(880ml中取75μl)；圖中左側的數碼標記代表分子量(Mr)為所示數據103倍之標記物的遷移位置(還原的)；其中標記物是磷酸化酶b(Mr為97,000)、牛血清白蛋白(Mr為66,200)、卵白蛋白(Mr為42,700)、碳酸酐酶(Mr為31,000)、大豆胰蛋白酶抑制物(Mr為21,500)以及溶菌酶(Mr為14,400)；泳道4-9代表梯度洗脫時收集的相應部分(9.1ml中取60μl)。對凝膠進行銀染色[Morrissey,Anal.Biochem.,117,307-310(1981)]。比較泳道A和B可以看出，大部分可染色的材料均通過了柱。正好位在Mr31,000分子量標準品之上和下方的第4-6管中的被染色材料與在梯度洗脫部分中測知的生物學活性相符，且代表了生物學活性材料。應注意的是，該材料可在泳道4-6中看到，但在泳道A和/或B中則沒有看到，這是因為前者上樣量佔了總體積的較大部分(4-6泳道佔0.66％，而泳道A和B僅佔0.0084％)。合併由該柱上洗脫的第4-6管。
如上所述，約有75％被回收的活性物質通過了圖5的C4柱。基本上按上述方法，使用C4樹脂再次層析分離該材料，不同的是使用的柱子較大(1.4×7.8cm)，且流速較慢(50-60ml/小時)。回收的活性中約50％在通過柱子的樣品中，且有50％在梯度洗脫物中，其在SDS-PAGE上的表現與圖6中的活性梯度洗脫部分相似。合併各活性部分(29ml)。
基本上按上述方法進行分析性C4柱層析，並以兩種生物檢測法分析之。如圖7所指出的由該分析性層析柱上洗脫的各管，其MC/9和HPP-CFC生物活性是共洗脫的。SDS-PAGE分析(圖8)顯示，在顯示有兩種生物學活性的柱洗脫部分中存在分子量約31,000的蛋白質。
已用C4柱層析法純化了見於S-Sepharose層析之第二個(相對小的)活性峰中的活性材料(如圖4所示之第62-72管，即鹽梯度早期洗脫的部中)。其在SDS-PAGE上與過S-Sepharose柱後又經C4柱層析所得到的材料有相同的行為，並且有同樣的N末端胺基酸順序(見實施例2D)。
6．對純化的總結表2中給出了上面1-5中所述純化步驟的總結。
表2哺乳動物SCF純化法概述
1．所給出的值代表文中所述不同批量之值的總和。
2．如該實施例中所述，經離心法除去S-Sepharose層析製備中透析該樣品時出現的沉澱材料。離心後(480ml)樣品含264mg總蛋白。
3．合併按上述順序作兩次C4柱層析後得到的活性梯度洗脫部分。
4．下-步驟只使用450ml這種材料(該實施例見上述)。
5．除另外指出之外，均用Bradford方法(supra,1976)測定。
6．估計值，基於SDS-PAGE後銀染色的強度，以及實施例2的K部分中所述的胺基酸組成分析。D．SDS-PAGE和糖苷酶處理圖9中顯示了對兩次大量C4柱層析後得到的集合之梯度洗脫物所作SDS-PAGE分析的結果。
取第一次C4柱洗脫集合物中的60μl上樣(泳道1)，並取第二次C4柱洗脫集合物中的40μl上樣(泳道2)。這些凝膠均進行銀染色。分子量標誌物同圖6所示。如上所述，在Mr31,000標誌物位置上下分散遷移的材料代表了生物學活性材料；表現異質性在很大程度上是由於糖基化作用的異質性。
為了證明糖基化作用的特徵，用125I標記純化的材料，用各種糖苷酶處理，並以放射自顯影術經SDS-PAGE法(還原條件)分析之。結果示於圖9中。泳道3和9為未經糖苷酶處理之125I標記的材料泳道4-8代表用糖苷酶處理之125I標記的材料(見下述)。泳道4，神經氨酸苷酶；泳道5，神經氨酸苷酶和O-聚糖酶；泳道6，N-聚糖酶；泳道7，神經氨酸苷酶和N-聚糖酶；泳道8，神經氨酸苷酶、O-聚糖酶和N-聚糖酶。條件是在5mM3-[(3-膽醯胺丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸酯(CHAPS)、33mMα-巰基乙醇、10mM Tris-HCl(pH7-7.2)中，37℃下3小時。所用種經氨酸苷酶(來源於Arthrobacter Ureafaciens；Calbiochem)終濃度為0.23單位/ml。O-聚糖酶(Genzyme；內-α-N-乙醯基-氨基半乳糖苷酶)為45毫單位/ml。N-聚糖酶(Genzyme；肽N-糖苷酶F；肽-N4[N-乙醯基-β-葡糖胺基]天冬醯胺醯胺酶)為10單位/ml。
用糖苷酶處理未標記的純化SCF，並在SDS-PAGE後經銀染色對產物作觀察，可得到與圖9所示者相似的結果。
必要時可作各種對照保溫。這些包括在適當但沒有糖苷酶的緩衝液中保溫，以證明結果是否因加入糖苷酶製劑所致；加已知為糖苷酶底物的糖基化蛋白質(如糖基化重組人促紅細胞生成素)保溫，以證明所用糖苷酶是否有活性；以及加糖苷酶但不加底物保溫，以證明糖苷酶本身並未產生可見的凝膠帶或使該譜帶模糊不清。
也可用內-β-N-乙醯葡糖醯胺酶F(endo F；NEN Dupont)及用內-β-N-乙醯氨基葡糖苷酶H(endo H；NEN Bupont)，再加適當的對照保溫完成糖苷酶處理。內endo F處理的條件是在1％(W/V)SDS、100mM2-巰基乙醇、100mM EDTA、320mM磷酸鈉(pH6)存在下煮沸3分鐘，然後用Nonidet P-40(終濃度1.17％,V/V)、磷酸鈉(終濃度200mM)和endo F(終濃度7單位/ml)的混合液作3倍稀釋。endo H處理的條件與之相似，不同的是所用SDS濃度為0.5％(W/V)，endo H濃度為1μg/ml。用endo F處理的結果與用N聚糖酶處理結果相同，而endo H對純化的SCF無影響。
由上述糖苷酶處理實驗可以得出多個結論。用N-聚糖酶[其可除去複合物及高甘露糖N-連接的碳水化合物(Tarentino et al.,Biochemistry,24,4665-4671)(1985)]、endo F[其作用與N-聚糖酶相似(Elder and Alexander,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79.4540-4544)(1982)]、endo H(其可除去高甘露糖和某些雜合型N-連接的碳水化合物][Tarentino et al.,Methods Enzymol.,50C,574-580(1978)]、神經氨酸苷酸(其可除去唾液酸殘基)及O-聚糖酶(其可除去某些O-連接的碳水化合物(Lambin et al.,Biochem.Soc.Tran.,12,599-600,(1984)]所作的各種處理提示存在N連接的和O連接的碳水化合物、大多數N連接的碳水化合物是複合物形式的，而且存在唾液酸，至少有些唾液酸是O連接部分的一部分。可從胺基酸順序資料中得到關於N結合鍵之可能位點的某些信息(實施例2)。用N-聚糖酶、endo F和N-聚糖酶/神經氨酸苷酶處理可將SDS-PAGE顯現的異源材料轉化為更為同源之快速遷移形式，這一事實與所有材料均代表同一種多肽、且異質性系因糖基化作用的異質性所致的這一結論相符合。還值得提到的是，相對於SDS-PAGE中所用分子量標誌物來說，聯合用各種糖苷酶處理所得到的最小形式的分子量範圍為18,000-20,000。
證實在SDS-PAGE上分子量31,000位置附近分散遷移的材料均代表了具有相同鹼性多肽鏈的生物學活性材料，是根據得自在該區域內遷移之材料(如電泳轉移並用溴化氰處理之後；實施例2)的胺基酸順序資料與已證明用重組DNA方法表達分離的基因所產生的生物活性材料的胺基酸順序(實施例4)相匹配之一事實而得出的。
實施例2哺乳動物SCF的胺基酸順序分析A．對純化蛋白質的反相高效液相層析(HPLC)使用C4小孔徑柱(Vydac，孔徑300A,2mm×15cm)對實施例1中純化的約5μgSCF(濃度=0.117mg/ml)進行反相HPLC分析。在70分鐘內用從97％流動相A(0.1％三氟乙酸)/3％流動相B(90％乙腈溶於0.1％三氟乙酸中)到30％流動相A/70％流動相B的線性梯度洗脫蛋白質，然後以每分鐘0.2ml的流速再進行10分鐘等臨界洗脫(craticelution)。減去緩衝液空白層析分析值後，SCF表現為滯留時間70.05分鐘的單一對稱峰(見
圖10)。在這些條件下沒有檢測到大的汙染蛋白峰。B．電泳轉移蛋白帶的順序測定按下述方法用N-聚糖酶(一種特異性裂解共價結合到蛋白質上的Asn連接的碳水化合物部分的酶)處理實施例1中純化的SCF(0.5-1.0nmol)(見實施例1D)。於真空下乾燥6ml由圖5所示C4柱洗脫之第4-6管得到的材料。然後加入150μl的14.25mM CHAPS、100mM2-巰基乙醇、335mM磷酸鈉(pH8.6)，並於37℃下保溫95分鐘。再加入300μl的74mM磷酸鈉、15單位/mlN-聚糖酶(pH8.6)，繼續保溫19小時。然後使樣品通過9-18％SDS-聚丙烯醯胺梯度凝膠(厚0.7mm；20×20cm)。使用10mM Caps緩衝液(pH10.5)以0.5安培的恆定電流電泳1小時[Matsudaira,J.Biol.Chem.,261,10035-10038(1987)]將凝膠中的蛋白質轉移到聚二氟乙烯(PVDF.Millipore Corp.)上。經考馬斯蘭染色後即可看到被轉移的蛋白帶。這些帶存在於分子量約29,000-33,000及約26,000處，即只產生了部分地去糖基化作用(參見實施例1D，圖9)；前面一條帶代表未被消化的材料，後面一條帶代表已除去了N連接之碳水化合物的材料。切下這些帶並直接加於(40％為Mr29,000至33,000蛋白質；80％為Mr26,000蛋白質)蛋白質順序測定儀上(Applied Biosystems Inc.,477型)。按照廠商推薦的程序進行蛋白質順序分析(Hewick et al.,J.Biol.Chem.,256,7990-7997(1981)],並使用微孔徑C18反相HPLC連續分析所釋放的乙內醯苯硫脲基胺基酸。兩條帶對20-28次順序測定循環沒有呈現信號，揭示兩者使用Edman化學降解法均不能作順序測定。每次順序測定的本底水平都在1-7pmol之間，此遠低於存在於帶中的蛋白量。這些數據表明存在於帶中的蛋白質是N末端被封閉的。C．電泳轉移之蛋白質的原位CNBr裂解和順序測定為了進一步證實蛋白質確實是被封閉的，由順序測定儀(B部分)上去掉膜並對印跡轉移的蛋白質進行原位溴化氰(CN·Br)裂解[CNBr(5％，W/V)在70％甲酸中，45℃處理1小時]，然後乾燥並作順序分析。測出了強順序信號，其代表經CNBr裂解甲硫氨醯肽鍵所得到的內肽。
在前5次操作過程中，兩條帶產生下列完全相同的混合順序信號。
已鑑定的胺基酸Cycle 1:Asp；Glu；Val；Ile；LeuCycle 2:Asp；Thr；Glu；Ala；Pro；ValCycle 3:Asn；Ser；His；Pro；LeuCycle 4:Asp；Asn；Ala；Pro；LeuCycle 5:Ser；Tyr；Pro直到第20次操作周期對，兩條帶仍產生相似的信號。Mr26,000帶的初始產率為40-115pmol,Mr29,000-33,000帶為40-150pmol。這些值與原來加到順序分析儀上的蛋白質摩爾量差不多。結果進一步證實相當SCF的蛋白帶含有被封閉的N末端。用於獲得N末端被封閉蛋白質之順序信息的方法包括(a)使N末端去封閉(見D部分)；(b)用CNBr(見E部分)、胰蛋白酶(見F部分)和金黃色葡萄球菌(V-8菌株)蛋白酶(Glu-c)(見G部分)進行內部裂解產生肽。可在去除被封閉的N末端胺基酸或分離肽片段之後進行順序分析。有關實施例詳述如下。D．用焦穀氨酸氨基肽酶處理之BRL幹細胞因子的順序分析存在於SCF氨基末端的封閉部分的化學性質是難以預測的。封閉可發生在體內轉譯之後[F.Wold,Ann.Rev.Biochem.,50,783-814(1981)]或體外純化過程中。有兩種轉譯後修飾作用是最為常見的。在N-α-乙醯轉移酶催化下，可發生某些N末端胺基酸如Ala、Ser等的乙醯化作用。此可通過分離和質譜分析N末端封閉肽得以證實。如果蛋白質的氨基末端是穀氨醯胺，則可能發生其r-醯胺的脫氨基作用。可使用焦穀氨酸氨基肽酶檢測焦穀氨酸。該酶可除去焦穀氨酸殘基，留下從第二個胺基酸開始的游離氨基末端。然後用Edman化學降解法進行順序測定。
SCF(按實施例1所述純化的；400pmol)在50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.6，含有二硫蘇糖醇和EDTA)中與1.5單位小牛肝焦穀氨酸氨基肽酶(pE-AP)37℃下保溫16小時。反應後將混合物直接加到蛋白質順序分析儀上。經46次循環即可鑑定出主要順序。初產率約為40％，重複得率為94.2％。含N末端焦穀氨酸之SCFN末端順序是pE-AP裂解位點↓10pyroGlu-Glu-Ile-Cys-Arg-Asn-Pro-Val-Thr-Asp-ASn-Val-Lys-Asp-Ile-Thr-Lys-20 30Leu-Val-Ala-Asn-Leu-Pro-Asn-Asp-Tyr-Met-Ile-Thr-Leu-Asn-Tyr-Val-40Ala-Gly-Met-Asp-Val-Leu-Pro-Ser-His-xxx-Trp-Leu-Arg-Asp-….
xxx，在第43位上沒有給出具體的胺基酸這些結果表明SCF含有作為其N末端的焦穀氨酸。E．CNBr肽的分離和順序分析按實施例1所述用N聚糖酶處理實施例1中純化的SCF(20-28μg；1.0-1.5nmol)。在該過程中完成向Mr26,000材料的轉化。乾燥樣品並在70％甲酸(5％)中室溫下用CNBr處理18小時。用水稀釋消化產物、乾燥並重新溶解在0.1％三氟乙酸中。使用C4小孔徑柱經反相HPLC法分離CNBr肽，洗脫條件同本實施例A部分所述。收集幾個主要肽部分並作順序分析。結果示於下表中肽滯留時間(分)順序4CB-4 15.5 L-P-P---CB-6122.1 a.I-T-L-N-Y-V-A-G-(M)b.V-A-S-D-T-S-D-C-V-L-S---L-G-P-E-K-D-S-R-V-S-V-(_)-K----CB-8 28.0 D-V-L-P-S-H-C-W-L-R-D-(M)CB-10 30.1 (含有CB-8的順序)CB-15243.0 E-E-N-A-P-K-N-V-K-E-S-L-K-K-P-T-R-(N)-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-D3-R-S-I-D-A------CB-14 37.3和CB-16 兩個肽都含有CB-15的相同順序1．12、13和25位上的氨基末測出。肽b沒有分析到末端。2．CB-15中的(N)未測出；它是根據可能的N連接之糖基化位點推斷的。該肽順序沒有測完。3．基於N-聚糖酶除去N連接的糖而認定Asn的位點可能已被轉化為Asp。4．所用單字母胺基酸代碼分別是A,Ala；C,Cys；D,Asp；E,Glu；F,Phe；G,Gly；H,His；I,Ile；K,Lys；L,Leu；M,Met；N,Asn；P,Pro；Q,Gln；R,Arg；S,Ser；T,Thr；V,Val；W,Trp；Y,Tyr。F．BRL幹細胞因子之胰蛋白酶消化片段的分離和順序測定用1μg胰蛋白酶對實施例1中純化的SCF(20μg，在150μl0.1M碳酸氫銨中)37℃下消化3.5小時。將消化產物直接加在小孔徑C4柱中進行反相HPLC分離，所用洗脫條件同本實施例A部分所述。所有被洗脫肽的峰值滯留時間均不同於未消化的SCF(A部分)。被分離肽的順序分析結果如下所示肽 滯留時間(分) 順序T-1 7.1 E-S-L-K-K-P-E-T-RT-2128.1 V-S-V-(_)-KT-3 32.4 I-V-D-D-L-V-A-A-M-～E-E-N-A-P-KT-4240.0 N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(_)-RT-5346.4 a．L-V-A-N-L-P-N-D-Y-M-I-T-L-N-Y-V-A-G-M-D-V-L-P-S-H-C-W-L-Rb．S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D-T-S-D-C-V-L-s-(_)-(_)-L-G----T-7472.8 E-S-L-K-K-P-E-T-R-(N)-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(_)-RT-8 73.6 E-S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-D-R1．4位的胺基酸未確定。2．12位的胺基酸未確定。3．肽T-5的b中，20和21位胺基酸未確定；假定它們是O連接的糖的連接位點。4．10位的胺基酸未測出；根據可能的N連接的糖基化位點推測其為Asπ。21位的胺基酸未測出。G 金黃色葡萄球菌Glu-C蛋白酶裂解後BRL幹細胞因子肽的分離和順序測定以酶對底物1∶20的比例，37℃下用Glu-C蛋白酶將實施例1中純化的SCF(20μg，在150μl0.1M碳酸氫銨中)消化18小時。立即用反相小孔徑C4柱HPLC分離消化產物。收集5個主要肽部分並作順序測定(下示)肽 帶留時間 順序S-1 5.1 N-A-P-K-N-V-K-ES-2127.7 S-R-V-S-V-(_)-K-P-F-M-L-P-P-V-A-(A)S-3246.3 順序未測知S-5371.0 S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(N)-R-S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-DS-6372.6 S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(N)-R-S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D-T-S-D1．S-2肽的6位胺基酸未給出；其可能是O連接的糖的連接位點。只以低得率測到S-2肽之16位上的Ala。2．肽S-3可能是衍生於SCF之N末端的N末端封閉肽。3．括號內的N可能是N連接的糖的連接位點。H．BNPS-糞臭素裂解後BRL幹細胞因子的順序分析經真空離心使溶於10mM碳酸氫銨中的SCF(2μg)物底乾燥，然後重新溶解於100μl冰醋酸中。向溶液內加入10-20倍摩爾過量的BNPS-糞臭素，並將混合物於50℃下保溫60分鐘。然後經真空離心乾燥反應混合物。先用100μl水，繼之用50μl水提取乾燥的殘留物。然後按上述方法對合併的提取物作順序分析。測得的順序如下10Leu-Arg-Asp-Met-Val-Thr-His-Leu-Ser-Val-Ser-Leu-Thr-Thr-Leu-20Leu-Asp-Lys-Phe-Ser-Asn-Ile-Ser-Glu-Gly-Leu-Ser-(Asn)-Tyr-30 40Ser-Ile-Ile-Asp-Lys-Leu-Gly-Lys-Ile-Val-Asp----28位胺基酸未被明確測出，基於可能的N連接的糖基化位點而將其定為Asn。Ⅰ．BRL幹細胞因子的C末端胺基酸測定將等份的SCF蛋白(500pmol)的緩衝液交換成10mM乙酸鈉(pH4.0)(終體積90μl)，並加入Brij-35至0.05％(W/V)。取5μl等分樣品作蛋白定量。用上述緩衝液將40μl樣品稀釋到100μl。以酶對底物1∶200的比例加入羧基肽酶P(來源於penicillium janthinellum)。於25℃下進行消化並於0、15、30、60和120分鐘時各取20ml等分樣品。在不同的時間點加入三氟乙酸到終濃度為5％，以終止消化。乾燥樣品並於70℃下與溶於0.2M NaHCO3(pH9.0)中的Dabsyl氯化物(二甲基氨基偶氮苯磺醯基氯)反應12分鐘，以衍生釋放的胺基酸[Chang et al.,Methods Enzymol.,90,41-48(1983)]。用Chang等人改進的小孔徑反相HPHL法[Techniques in Proteinchemistry,T.Huglied.,Acad.Press,NY(1989),PP.305-311]分析衍生的胺基酸。與衍生的胺基酸標準品(1pmol)比較後得到各時間點胺基酸組成的定量結果。在O時間可測到汙染的甘氨酸。丙氨酸是唯一隨保溫時間延長而增加的胺基酸。保溫2小時後,測得Ala總量為25pmol，相當於每摩爾蛋白質釋放0.66mol Ala。這一結果表明天然哺乳動物SCF分子含有作為其羧基末端的Ala，此與對含C末端Ala之C末端肽S-2的順序分析結果相符。這一結論也與已知的羧基肽酶P的特異性相一致[lu et al.,J.Chromatog.,447,351-364(1988)]。例如，如果遇有Pro-Val時，裂解即停止。肽S-2具有順序S-R-V-S-V-(T)-K-P-F-M-L-P-P-V-A-(A)，並推測其為SCF的C末端肽(參見本實施例的J部分)。該C末端順序---P-V-A-(A)限制了蛋白酶只裂解丙氨酸。肽S-2的胺基酸組成表明存在1個Thr、2個Ser、3個Pro、2個Ala、3個Val、1個Met、1個Leu、1個Phe、1個Lys和1個Arg，總共16個殘基。測得2個Ala殘基表明該肽的C末端可能有兩個Ala殘基(見G部分的表)。因此BRL SCF終止在Ala164或Ala165。J．SCF的順序結合對(1)除去N末端焦穀氨酸後的完整幹細胞因子，(2)CNBr肽，(3)胰蛋白酶肽，以及(4)Glu-C肽酶片段所作順序分析的結果，推斷出N末端順序和C末端順序(
圖11)。N末端順序開始於焦穀氨酸並終止在Met-48處。C末端順序含有84/85個胺基酸(82位至164/165位)。在各分離的肽中均未測出49位至81位的順序。但在按本實施例H部分所述方法以BNPS一類臭素裂解BRL SCF後測出了一個大肽的順序。由這些附加數據以及從大鼠SCF測得的DNA順序(實施例3)，可將N和C末端順序一一對準地列出，並可列出整個順序(如
圖11所示)。分別經焦穀氨酸氨基肽酶消化和羧基肽酶P消化進一步證實分子的N末端是焦穀氨酸，且C末端是丙氨酸。
根據這些順序資料，可知Asn-72是糖基化了的；Asn-109和Asn-120在某些分子中可能是糖基化的，但在另一些分子則不是。在作順序分析時可測到Asn-65，因此其可能只是部分(而不是全部)糖基化的。根據DNA順序推測，在胺基酸順序分析期間可以測出Ser-142、Thr-143和Thr-155,因此其可能是O連接的碳水化合物的連接位點。
圖11中指出了這些可能的碳水化合物連接位點；實體字母指示N連接的碳水化合物，開放黑體字母指示O連接的碳水化合物。K．BRL幹細胞因子的胺基酸組成分析經濃縮並將緩衝液換成50mM碳酸氫銨製備用於胺基酸組成分析的、得自圖7所示C4柱洗脫物的材料。
兩份70μl樣品分別在含有0.1％苯酚和0.05％ 2-巰基乙醇的6N HCl中110℃下真空水解24小時。乾燥水解產物，重新溶解在檸檬酸鈉緩衝液中並使用離子交換層析(Beckman6300型胺基酸分析儀)分析之。結果如表3所示。用164個胺基酸(據蛋白質順序分析資料)計算胺基酸組成可比使用193個胺基酸(如根據PCR得到的DNA順序分析資料推測的，
圖14C)更好地與預測值相符合。
表3哺乳動物SCF的定量胺基酸組成每摩爾蛋白質中推測的每分子殘基數2胺基酸胺基酸組份的摩爾數1Run#1 Run#2 (A) (B)Asx 24.46 24.26 2528Thr 10.37 10.43 1112Ser 14.52 14.30 1624Glx 11.44 11.37 1010Pro 10.90 10.85 910Gly 5.816.20 4 5Ala 8.628.35 7/88Cys nd nd4 5Val 14.03 13.96 15 15Met 4.053.9967Ile 8.318.339 10Leu 17.02 16.97 16 19Tyr 2.862.8437Phe 7.967.9288His 2.112.1123Lys 10.35 11.28 12 14Trp nd nd 11Arg 4.934.9956續表3每摩爾蛋白質中推測的每分子殘基數2胺基酸胺基酸組份的摩爾數1Run＃1 Run#2 (A) (B)Total158 158 164/165193計算的分子量 18,42431．基於蛋白質順序分析測知的158個胺基酸(不包括Cys和Trp)。2．根據蛋白質順序資料(A)或DNA順序資料(B)計算的理論值。3．基於1-164胺基酸順序。在胺基酸組成分析中，包括已知量的內部標準品亦可定量樣品中的蛋白質；被分析樣品得出的數值為0.117mg/ml。
實施例3克隆大鼠和人SCF基因A．大鼠SCF cDNA片段的擴增和順序分析確定了大鼠SCF蛋白質片段的胺基酸順序，便有可能設計出對大鼠SCF特異的混合的系列寡核苷酸。用該寡核苷酸作為雜交探針篩選大鼠cDNA和基因組文庫；並作為引物使用聚合酶鏈反應(PCR)方法擴增部分cDNA[Mullis et al.,Methods inEnzymol.,155,335-350(1987)]。用氨基磷酸酯法[Beaucage et al.,Tetrahedron Lett.,22,1859-1862(1981)；McBride et al.,Te-trahedron Lett.,24,245-248(1983)]合成寡脫氧核苷酸；其順序示於
圖12A中。其中A代表腺嘌呤；T代表胸腺嘧啶；C代表胞嘧啶；G代表鳥嘌呤；I代表次黃苷。圖中星號代表含限制性核酸內切酶識別順序的寡核苷酸。順序是按5＇→3＇方向寫出的。
使用32P標記的基於實施例2中得到之胺基酸順序合成的混合的寡核苷酸探針，219-21和219-22(
圖12A)，篩選大鼠基因組文庫、大鼠肝cDNA文庫及兩個BRL cDNA文庫。在這些使用cDNA克隆的標準方法[Maniatis et al.,Molecular Cloning,ColdSpring Harbor,212-246(1982)]所作的實驗中，沒有分離到SCF克隆。
分離SCF核酸順序的-個可替代的方法包括使用PCR技術。該方法學中，在有脫氧核苷三磷酸存在的熱循環控制裝置(cycler)中，通過多次由適當DNA聚合酶(如Tag I DNA聚合酶)催化的重複過程，於體外選擇性地擴增兩個DNA引物所包括的DNA區域。PCR擴增的特異性是以兩個側接在被擴增的DNA片段上並與相反鏈雜交的寡核苷酸引物為基礎的。對複雜混合物中特定DNA區域有雙側特異性的PCR是使用兩個有對該區域特異之順序的引物完成的。有單側特異性的PCR則是利用了一個區域特異性引物和第二個能在靶位點上起引發作用的引物，其中所說的靶位點存在於特定混合物之許多或所有DNA分子上[Loh et al.,Science,243,217-220(1989)]。
成功地PCR擴增反應的DNA產物是DNA順序資料的來源[Gyllensten,Biotechniques,7,700-708(1989)]，並可用以製得比寡核苷酸探針具有更大長度和更高特異性的標記的雜交探針。也可用適當的引物順序設計PCR產物，將其克隆到質粒載體中，用以表達被編碼的肽產物。
圖13A中概略說明了獲得大鼠SCF cDNA之DNA順序的基本方案。小箭頭指示PCR擴增，大箭頭則指示DNA順序測定反應。PCR90.6和96.2與DNA順序測定相結合，用以獲得大鼠SCF cDNA的部分核酸順序。用於這些PCR的引物是基於
圖11中所示胺基酸順序的混合的寡核苷酸。使用由PCR90.6和96.2得到的順序資料，製成特有的順序引物(224-27和224-28，
圖12A)並用於繼後的擴增和順序測定反應。使用單側特異性PCR在PCR90.3、96.6和625.1中得到含有cDNA之 5＇末端的DNA。在PCR90.4中得到另一個接近SCF蛋白之C末端的DNA順序。按本實施例C部分中所述的方法，由PCR產物630.1、630.2、84.1和84.2中得到大鼠SCFcDNA之其餘編碼區的DNA順序。用以獲得大鼠SCF cDNA的技術如下所述。
按Okayama等人所述方法[Methods in Enzymol.,154,3-28(1987)]由BRL細胞製備RNA。按照Jacobson所述方法[Methods inEnzymol.,152,254-261(1987)]用Oligo(dT)纖維素柱分離poly A+RNA。
用1μg BRL polyA+RNA作模板,(dT)12-18作引物，按照Mo-MLV反轉錄酶提供者(Bethesda Research Labora-tories)推薦的方法合成第一條cDNA鏈。RNA鏈用0.14MNaOH於84℃下降解10分鐘，或在沸水浴中降解5分鐘。加入過量醋酸銨中和該溶液，先用苯酚/氯仿，再用氯仿/異戊醇提取cDNA，然後用乙醇沉澱之。為了使Oligo(dc)相關引物在PCR中有單側特異性，按照以前所述方法[Deng et al.,Methods in Enzy-mol.,100,96-103(1983)],用得自小牛胸腺的末端轉移酶[BoeringerMannheim]在第一條cDNA鏈的3′末端加上一個poly(dG)尾部。
除特別指出者外，各次PCR循環中的變性步驟均在94℃下進行1分鐘；鏈延長反應在72℃下進行3或4分鐘。退火的溫度和時間對每次PCR來說均不相同，通常根據同時進行的幾個不同PCR的大致條件而定。當引物濃度降低致使引物製品的積聚量下降時[Watson,Amplifica-tions,2,56(1989)]，表明需要較長退火時間；當PCR產物的濃度高時，則要使用較短的退火時間和較高的引物濃度以增加得率。決定退火溫度的主要因素是引物-靶聯繫的Td估算值[Suggs et al.,＂Developmental Biology Using PurifiedGenes＂,eds.Brown,D.D.and Fox,C.F.(Academic,New York)PP.683-693(1981)]。用於擴增的酶可購自下列任一個製造廠商Stratagene,Promega或Per-kin-Elmer Cetus。反應化合物均按廠商推薦的方法使用。擴增反應可在Coy Tempcycle或Perkin Elmer Cetus DNA熱循環控制裝置中進行。
通常是在溴乙錠存在下，通過瓊脂糖凝膠電泳對SCF cDNA片段的擴增進行分析，並經用紫外光照射DNA譜帶，激發螢光後觀察之。在某些提前產生小片段的情況下，可用聚丙烯醯胺凝膠電泳法分析PCR產物。可在用一個或多個內部套裝引物(internally-nestedprimers)進行下一次擴增時觀察適當的DNA帶，來進一步確定所觀察到的代表SCF cDNA片段的帶。最後則要根據對PCR產物的二脫氧順序測定[Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463-5467(1977)]結果，並將預略的翻譯產物與SCF肽順序資料相比較來證實之。
在最初的PCR實驗中，使用了基於SCF蛋白質順序[Gould,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,1934-1938(1989)]含成的混合寡核苷酸。下面敘述用於得到大鼠cDNA編碼胺基酸-25到162之DNA順序資料的PCR擴增方法。
在PCR90.6中,各用4pmol反應體積為20μl的22211和223-6擴增BRL cDNA。取一等份PCR90.6產物在瓊脂糖凝膠上作電泳分離，並觀察有預期大小的帶。進一步用各20pmol反應體積為50μl的引物222-11和223-6擴增1μlPCR90.6產物，反應進行15次，退火溫度為45℃。然後在引物222-11和219-25(PCR96.2)存在下使該產物的一部分擴增25次，經瓊脂糖凝膠電泳後可見產生了一條主產物帶。用同樣兩個引物對PCR96.2的產物進行不對稱擴增可產生被成功地編定了順序的模板。在222-11和套裝引物219-21存在下，經產物的PCR擴增過程進一步完成對96.2產物中SCF順序的選擇性擴增。用該PCR的產物作為模板進行不對稱擴增並製備放射標記的探針(PCR2)。
為了分離大鼠SCF cDNA的5′端，利用含有(dC)n順序並互補於cDNA poly(dG)尾部的引物作為非特異性引物。用含有(dC)12(10pmol)和223-6(4pmol)的PCR90.3作引物並用BRL cDNA作為模板。該反應產物很象一個有很高分子量的聚集體，在瓊脂糖凝膠電泳中保留在接近點樣孔的位置上。在體積為25μl的25pmol(dC)12和10pmol 223-6存在下，對1μl產物溶液再進行15次擴增循環，退火溫度為45℃。然後用內部套裝引物219-25和201-7(PCR96.6)對0.5μl該產物再進行25次擴增。201-7的順序示於
圖12C中。瓊脂糖凝膠電泳未觀察到可見的帶。以40℃退火溫度再次進行25次PCR後，可見到一條明顯的帶。進行Southrern印跡分析後觀察到一條明顯的雜交帶。使用201-7和套裝引物224-27，以45℃退火溫度再次進行20次PCR(625.1)。經PCR不對稱擴增後作順序測定，得到超出假定的前SCF信號肽編碼順序之推測氨基末端的順序。用該順序設計含有大鼠SCF cDNA編碼區之5′末端的寡核苷酸引物227-29。同樣，測定PCR90.4的順序可得到終止在胺基酸162處的3′DNA編碼順序(見
圖13.A)。B．克隆大鼠幹細胞因子基因組DNA用按上面A部所述對編碼大鼠SCF的cDNA作PCR擴增製得的探針篩選含有大鼠基因組順序的基因文庫(得自CLONTECHLaboratories,Inc.；catalog No.RL1022J)。使用得自成年雄性Spraque-Dawley大鼠的DNA在噬菌體λ載體EMBL-3 SP6/T7中構建該庫。據提供者鑑定，該庫含2.3×106個平均插入段大小為16Kb的獨克隆。
用PCR法產生用於篩選該基因組文庫的32P標記的探針。在含有16.7μM32P[α]-dATP、200μM dCTP、200μM dGTP、200μM dTTP、由Perkin Elmer Cetus提供的反應緩衝液、0.05單位/ml的Taq聚合酶(Perkin Elmer Cetus)、0.5μM219-26、0.05μM223-6和1μl含有兩引物之靶位點模板90.1的反應混合物中製備探針PCR1(
圖13A)。除改變引物和模板外，使用相似反應條件製備探針PCR2。該探針製備中使用了0.5μM222-11、0.05μM219-21和1μl得自PCR96.2的模板。
按照Maniatis等人[supra(1982)]所述方法接種約106個噬菌體。按廠商推薦的方法將噬斑轉移到已變性的Gene Screen PlusTM濾膜(22cm×22cm,NEN/Dupont)上，中和並乾燥之。對每個平皿均作兩次濾膜轉移。
濾膜在1M NaCl、1％SDS、0.1％牛血清白蛋白、0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮(雜交溶液)中65℃下預雜交約16小時並於-20℃下保存。將濾膜轉移到含有32P標記的PCR1探針(1.2×105cpm/ml)的新鮮雜交溶液中，65℃下雜交14小時。室溫下在0.9M NaCl、0.09M檸檬酸鈉、0.1％SDS(pH7.2)(洗滌溶液)中將濾膜洗2小時，然後再於65℃下在新鮮洗滌溶液中洗30分鐘。由平皿上除去相當於放射自顯影圖譜上放射活性點之平皿區域中的噬菌體克隆，並再次用探針PCR1和PCR2篩選之。
用限制性核酸內切酶BamHⅠ、SphⅠ或SstⅠ消化得自陽性克隆的DNA，將所得片段再克隆到pUC119中，然後作順序分析。
圖14A中圖解顯示了對大鼠基因組SCF DNA進行順序分析的戰略(方案)。該圖中，頂部的線代表編碼SCF的大鼠基因組DNA區域。線上的缺口指示已測定了順序的區域。大方框代表具有上面各方框指示的相應被編碼胺基酸之SCF基因編碼區域的外顯子。箭頭代表已確定順序並用以組裝大鼠SCF基因之相符順序的個別區域。大鼠SCF基因的順序如
圖14B中所示。
使用PCR1探針篩選大鼠基因組文庫，分離出相應於編碼胺基酸19至176之外顯子的克隆。為了得到胺基酸19編碼區上遊之外顯子的克隆，可使用寡核苷酸探針228-30篩選該基因庫。按前述方法用同一組濾膜與探針PCR1預雜交，並在含有32P標記之寡核苷酸228-30(0.03pmole/ml)的雜交溶液中50℃下雜交16小時。室溫下在洗滌溶液中洗濾膜30分鐘，然後再在新鮮洗滌溶液中於45℃下洗15分鐘。由平皿上除去相當於放射自顯影圖上放射活性點之區域內的噬菌體克隆並用探針228-30重新篩選之。用限制性核酸內切酶消化得自陽性克隆的DNA並再克隆之。使用探針228-30，得到相當於編碼胺基酸-20至18之外顯子的克隆。
為分離相當於含5′未轉譯區和胺基酸-25至-21編碼區之外顯子的克隆而作了幾種嘗試。結果沒有分離到大鼠SCF基因這個區域的克隆。C．克隆適於在哺乳動物細胞內表達的大鼠cDNA設計哺乳動物細胞表達系統，以確定大鼠SCF的活性多肽產物是否能在哺乳動物細胞內表達並被分泌出來。所設計的系統用於表達大鼠SCF之剪短的轉譯產物(SCF1-162和SCF1-164)以及根據
圖14C所示基因順序之翻譯推測的蛋白質(SCF1-193)。
用於這些研究工作中的表達載體是含有pUC119、SV40和HTLVI順序的穿梭載體。設計這些載體，使之可以在大腸桿菌和哺乳動物細胞內自身複製，並在病毒DNA順序的控制下表達被插入的外源DNA。該存在於大腸桿菌DH5中的定名為V19.8的載體已寄存在美國典型培養物保藏中心(12301 ParklawnDrive,Rockville,Md.)(ATCC No.68124)。該載體是Souza的美國專利4,810,643號(已列為本文參考文獻)中所述之pSVDM19的衍生物。
將大鼠SCF1-162cDNA插入到質粒載體V19.8中。該cDNA順序如
圖14C中所示。如
圖13A所示，在PCR反應630.1和630.2中合成用於該構建過程的cDNA。這些PCR代表了獨立的擴增並利用了合成的寡核苷酸引物227-29和227-30。這些引物的順序是按本實施例A部分所示由PCR產生的cDNA中獲得的。反應混合物體積為50μl，其由1×反應緩衝液(得自Perkin Elmer Cetus試劑盒)、250μm dATP、250μMdCTP、250μM dGTP和250μM dTTP、200ng oligo(dT)引導的cDNA、1pmol 227-29、1pmol 227-30以及2.5單位Taq聚合酶(Perkin Elmer Cetus)組成。經在94℃下變性1分鐘、37℃下退火2分鐘及7-2℃下鏈延長反應1分鐘，對該cDNA進行10個周期的擴增。在經過這些最初的PCR擴增周期後，向各反應內加入10pmol的227-29和10pmol的227-30。將退火溫度改為55℃，繼續按上述方法進行30個周期的擴增。用限制性核酸內切酶HindⅢ和SstⅡ消化PCR的產物。同樣用HindⅢ和SstⅡ消化V19.8，且其中一種情況是用小牛腸鹼性磷酸酶處理業經消化的質粒載體；而另一種情況下則由瓊脂糖凝膠中分離消化後產生的大片段。使用T4多核苷酸連接酶將該cDNA連接到V19.8上。按已述方法[Okayama et al.,supra(1987)]將此連接產物轉化到感受態大腸桿菌株DH5中。用Sanger的二脫氧方法測定由個別細菌克隆製備之DNA的順序。
圖17顯示了V19.8SCF的構建過程。按實施例4和5中所述用這些質粒轉染哺乳動物細胞。
用構建上述表達SCF1-162之載體的相似的方法構建用於表達大鼠SCF1-164的載體，其中包括使用PCR擴增法合成cDNA，然後插入V19.8中。用含SCF1-162cDNA的V19.8(V19.8:SCF1-162)作模板，227-29作基因之5′端的引物，237-19作基因之3′端的引物，以PCR擴增法合成用於該構建過程的cDNA。重複的反應混合物(50μl)含有1×反應緩衝液、250μM dATP、dCTP、dGTP和dTTP、2.5單位Taq聚合酶、20ng V19.8:SCF1-162和各20pmol引物。經於94℃下變性1分鐘、55℃下退火2分鐘和72℃下鏈延長2分鐘，對cDNA作35個周期的擴增。用限制性核酸內切酶HindⅢ和SstⅡ消化擴增的產物並插入V19.8中。所得載體含有SCF胺基酸-25至164的編碼區，繼後是終止密碼子。
同時使用用於大鼠SCF1-162的相似方法，將193胺基酸形式的大鼠SCF(大鼠SCF1-193是根據
圖14C所示DNA順序的翻譯產物推測的)的cDNA插入到質粒載體V19.8中。用於該構建過程的cDNA是利用寡核苷酸227-29和230-25在PCR反應84.1和84.2(
圖13A)中合成的。兩反應代表了由不同的RNA製備物開始的獨立擴增。通過本實施例A部分中所述的PCR反應得到227-29的順序，並由大鼠基因組DNA(
圖14B)得到引物230-25的順序。反應混合物(50μl)由1×反應緩衝液(得自Perkin Elmer Cetus試劑盒)、250μMdATP、250μM dCTP、250μM dGTP、和250μM dTTP、200ng Oligo(dT)引導的cDNA、10pmol227-29、10pmol 230-25及2.5單位Taq聚合酶(Perkin ElmerCetus)組成。使用下列條件將該cDNA擴增5個周期94℃下變性1_分鐘，50℃下退火2分鐘，72℃下鏈延長2分鐘。經過這些最初的擴增周期後，再於60℃的退火溫度下，按上述條件繼續進行35個周期的擴增。用限制性核酸內切酶HindⅢ和SstⅡ消化PCR擴增的產物。用HindⅢ和SstⅡ消化V19.8DNA並由瓊脂糖凝膠電泳帶中分離消化後的大片段。使用T4多核苷酸連接酶將該cDNA連接到V19.8上。將此連接產物轉染到感受態大腸桿菌菌株DH5中並測定由個別克隆製備之DNA的順序。按實施例4中所述用這些質粒轉染哺乳動物細胞。D．人SCF cDNA PCR產物的擴增和順序分析如
圖13B所示，使用PCR擴增法由肝癌細胞系Hep G2(ATCCHB8065)中得到人SCF cDNA。其基本方案是用有由大鼠SCFcDNA推知之順序的引物，經PCR來擴增人cDNA。
按Maniatis等人[supra(1982)]所述方法製備RNA，並按廠商推薦的方法使用Oligo dT纖維素製備Poly A+RNA(CollaborativeResearch Inc.)。
按上述製備BRL cDNA的方法製備第一股cDNA鏈，不同的是用2μM寡核苷酸228-28(見
圖12C)引導合成，該引物在連接到較長特有順序的3′端處有一個短的隨機順序。該228-28的特有順序部分提供了一個用引物228-29作非特異性引物經PCR進行擴增的靶位點。至少與大鼠SCF順序的一部分有關的人cDNA順序是使用引物227-29和228-29經PCR由HepG2 cDNA擴增的(PCR22.7，見
圖13B；於60℃下，退火進行15次擴增，然後再於55℃下退火進行15次擴增)。瓊脂糖凝膠電泳沒有出現清楚的帶，只看到一個模糊不清的顯然是異源的DNA。進一步使用內部套裝的大鼠SCF引物222-11和引物228-29，與1μlPCR22.7產物進行PCR(PCR24.3；於55℃退火條件下進行20次擴增)，以試圖優先擴增與大鼠SCFcDNA密切相關的順序。結果在瓊脂糖凝膠上只觀察到一個模糊的異源DNA產物。用引物222-11和227-30雙側特異性擴增PCR24.3產物(PCR25.10；20次)，產生了一條與相應的大鼠SCF cDNA PCR產物有同樣大小的主產物帶。使用224-24作為順序分析引物測定非對稱PCR產物(PCR33.1)的順序，測出了大約有70個鹼基的人SCF順序。
相似地，首先用引物224-25和228-29(PCR24.7.20次)，然後用引物224-25和227-30(PCR41.11)擴增1μl PCR22.7產物，結果產生了一條與相應的大鼠SCF產物有同樣大小的主帶，而且在非對稱擴增(PCR42.3)之後產生了與大鼠SCF高度同源的順序(使用224-24作為順序分析引物)。合成有針對人SCF cDNA之獨特順序的寡脫氧核苷酸，其順序如
圖12B中所示。
為了得到大鼠SCF PCR產生之編碼順序的人對應物(用於表達和活性研究)，用引物227-29和227-30在50μl反應混合物中對1μl PCR22.7產物進行PCR(PCR39.1)。擴增反應在Coy Tempcycler中完成。因為對人SCF cDNA和大鼠SCF特定引物227-30之間的錯配程度尚不明了，所以在前三個反應周期裡使用了低嚴格的退火條件(37℃)；然後才在55℃下退火。結果顯現了一條與大鼠同系物有同樣大小的清晰的帶(約590bp)，然後進一步稀釋小部分PCR39.1產物並與同一引物進行PCR(PCR41.1)。因為在PCR41.1的產物中觀察到了一個以上的帶，故進一步與內部套裝的引物進行PCR，以在克隆之前至少確定其一部分順序。經用引物231-27和227-29進行23次PCR循環(PCR51.2)後，出現一條很明顯的帶。用引物227-29和231-27進行菲對稱PCR並作順序分析，進一步證實了人SCF cDNA順序的存在。按上文C部分所述克隆大鼠SCF1-162PCR片段的方法，將PCR41.1SCF DNA克隆到表達載體V19.8中。用Sanger的二脫氧方法測定個別細胞克隆的DNA順序。E．複製人幹細胞因子基因組DNA使用擴增cDNA製得的PCR7探針(
圖13B)篩選含人基因組順序的基因庫。使用互補於人SCF cDNA之一部分的核糖探針(riboprobe)(見下述)再次篩選陽性噬斑。用PCR41.1(
圖13B)的產物起始製備PCR7探針。進一步用引物227-29和227-30擴增PCR41.1的產物。由瓊脂糖凝膠上洗脫所得的590bp片段並再次用同一引物(PCR58.1)擴增之。在含有10pmol 233-13的50μl反應混合物中將PCR58.1的產物稀釋1,000倍並擴增10次。向該反應混合物中加入10pmole227-30後，繼續進行20次PCR。再加入80pmole 233-13，使反應體積增加到90μl並繼續進行15次PCR。以50μl反應體積將反應產物稀釋200倍，加入20pmole 231-27和20pmole 233-13，使用48℃的退火溫度以反應96.1進行35次PCR。使用相似於製備PCR1的反應條件製備32P標記的PCR7，其中不同的是以50μl的反應體積將PCR96.1稀釋100倍；用5pmole的231-27作單一引物；以94℃下變性1分鐘、48℃下退火2分鐘及72℃下鏈延長2分鐘的反應條件，進行45次PCR。
核糖探針(核糖探針1)是一種32P標記的互補於
圖15B所示入SCF DNA之核苷酸2-436的單鏈RNA。為了構建產生該探針的載體，用HindⅢ和EcoRⅠ消化PCR41.1(
圖13B)產物DNA並克隆到質粒載體pGEM3(Promega,Madison,Wisconsin)的多聚接頭中。然後用HindⅢ消化將重組pGEM3:hSCF質粒DNA切成線形。按照Promega公司產品說明書所述使用方法用T7RNA聚合酶經脫落(run-off)轉錄由線性化的質粒DNA製備32P標記的核糖探針1。反應混合物(3μl)含有250ng線性化質粒DNA和20μM32P-rCTP(catalog #NEG-008H,New England Nuc-lear(NEN))(沒有未標記的CTP)。
從Stratagene公司(La Jolla,CA；catalog＃:946203)得到人基因組庫。該文庫是使用由白種人男性胎盤製得的DNA在λ噬菌體FixⅡ載體中構建的。由提供者鑑定的該文庫特徵是含有2×106個平均插入段長度大於15Kb的初級噬斑。按Maniatis等人[supra(1982)]所述方法鋪敷大約106個噬菌體。按照廠商推薦的方法將斑轉移到Gene Screen PlusTM濾膜上。(22cm2；NEN/Dupont)。每個平皿作兩片濾膜轉移。
濾膜在6×SSC(0.9M NaCl、0.09M檸檬酸鈉，pH7.5)、1％SDS中，於60℃下預雜交，並於62℃下在6×SSC、含有32P標記之PCR7探針(2×105cpm/ml)的1％SDS溶液中雜交20小時。濾膜於62℃下在6×SSC、1％SDS中洗16小時。從相當於放射自顯影圖上放射活性點的平皿區域內除去噬菌體積結物並用探針PCR7和核糖探針1再次篩選。用PCR7探針再次篩選的條件基本上同上所述。用核糖探針1再次篩選的方法是濾膜在6×SSC、1％SDS中預雜交，並於62℃下在0.25M Na3PO4(pH7.5)、0.25MNaCl、0.001M EDTA、15％甲醯胺、7％SDS和1×106cpm/ml的核糖探針中雜交18小時。濾膜於62℃下在6×SSC、1％SDS中洗30分鐘，再在1×SSC、1％SDS中(62℃)洗30分鐘。用限制性核酸內切酶BamHⅠ、SphⅠ或SstⅠ消化陽性克隆的DNA，並將所得片段再克隆到PUC119中，之後進行順序測定。
使用探針PCR7，得到一個包含編碼胺基酸40至176之外顯子的克隆，該克隆已保藏在ATCC(保藏號40681)。為得到其他SCF外顯子的克隆，用核糖探針2和寡核苷酸探針235-29篩選人基因組文庫，篩選方法大致同前，但其中不同的是於37℃下與探針235-29雜交並於37℃下將該雜交濾膜洗1小時，再於44℃下洗1小時。用核糖探針2、核糖探針3和寡核苷酸探針235-29與236-31重新篩選陽性克隆。使用產生核糖探針1的相似方法製得核糖探針2和3，其中不同的是(a)用限制性核酸內切酶PvuⅡ(核糖探針2)或PstⅠ(核糖探針3)將重組pGEM3:hSCF質粒DNA切成線形，以及(b)使用SP6RNA聚合酶(Promega)合成核糖探針3。
圖15A顯示用於確定人基因組DNA順序的戰略。該圖中，頂部的線代表人基因組DNA編碼SCF的區域。線上的缺口指示已測定了順序的區域。大方框代表SCF基因編碼區的外顯子，並在每個方框上方標出了相應的被編碼的胺基酸。該人SCF基因的順序如
圖15B所示。
圖15C中顯示了用PCR技術得到之人SCF cDNA的順序。F．人SCF cDNA 5′區的順序對由兩個基因特異性引物引導PCR得到的產物作順序分析，揭示了兩個引物之3′末端結合區域的順序。如實施例3A所述，一側PCR可產生側翼區域的順序。一側PCR被用於擴展人SCFcDNA之5′未翻譯區的順序。
按實施例3D所述，用寡核苷酸228-28(
圖12C)作探針，由得自人膀胱癌細胞系5637(ATCC HTB9)的polyA+RNA製備第一條cDNA鏈。用dG殘基為該cDNA接尾，然後使用含(dC)n順序的引物連同SCF特異性引物進行一側PCR擴增，結果沒有產生延伸已知順序之(5 ＇)上遊區的cDNA片段。
對寡核苷酸228-28引導合成第二條鏈的產物進行PCR擴增，可得到小量順序信息。上述未接尾的5637第一股cDNA鏈(50ng)和2pmole 228-28與Klenow聚合酶及各0.5mMdATP、dCTP、dGTP和dTTP在10μl 1×缺口翻譯緩衝液[Maniatis et al.,Molecular Cloning,a Laboratory ManuaCold Spring Harbor Laboratory(1982)]中10-12℃保溫30分鐘。用引物228-29連同套裝SCF引物(依次使用235-30、233-14、236-31和235-29)經連續一側PCR擴增所得的cDNA，產生了在瓊脂糖凝膠上顯現模糊的複雜產物混合物。當用兩個SCF引物(227-29和235-29，例如產生一大約150bp的產物)擴增差不多體積的連續一側PCR產物時，可觀察到有漸漸增加密度的特異性產物帶，表明大量富集了SCF相關的cDNA片段。試圖通過去掉瓊脂糖凝膠上模糊不清的部分，並經PCR再次擴增以選擇有特定大小範圍的產物，結果在多數情況下都沒有產生含有SCF相關順序的確切的帶。
一個只含有235-29引物的反應(PCR16.17)，正如用限制性酶PvuⅡ和PstⅠ作酶切分析和用套裝引物進行PCR分析所顯示的，結果產生了顯然是在除預期位點之外的一個編碼區5′端的未知位點上由235-29引導產生的帶。用凝膠電泳法純化該產物並用引物235-29再次擴增，同時嘗試使用32P標記的引物228-30，以Sanger氏雙脫氧法測定其順序。所得順序即為設計寡核苷酸254-9(
圖12B)的基礎。當將該3′定向引物與5′定向SCF引物合用於繼後的PCR時，則得到有預期大小的帶。對這些PCR產物進行直接Sanger法順序分析，得到了
圖15C所示人SCF-cDNA順序的核苷酸180至204。
為了得到更多的hSCF cDNA5′端順序，使用SCF特異性引物(2pmol的233-14)，在16μl含0.2單位MMLV逆轉錄酶(購自BRL)和各500μM dNTP的反應混合物中由5637polyA+RNA(約300ng)製備第一股cDNA鏈。經過標準的苯酚-氯仿和氯仿提取及乙醇沉澱(從1 M乙酸銨中)步驟後，將核酸懸浮在20μl水中，在沸水浴中5分鐘，然後冷卻並在8μMdATP存在下子含CoCl2緩衝液中用末端轉移酶接尾[Deng andWu,Methods in Enzymology,100,pp96-103]。經苯酚-氯仿提取和乙醇沉澱以純化所得產物(dA)n接尾的第一股cDNA鏈，並懸浮在20μl 10mM Tris(pH8.0)和1mM EDTA中。
按下述方法由大約20ng(dA)n接尾的5637cDNA中富集並擴增人SCF相關的cDNA5′末端片段於SCF特異性引物236-31和在3′端或其附近含有(dT)n順序的引物或引物混合物，如引物221-12或引物220-3、220-7及220-11(
圖12C)的混合物存在下，進行最初的26次一側PCR循環。然後在第二組PCR中，用引物221-12和235-29擴增這些PCR的產物(1μl)。經瓊脂糖凝膠分析後，均觀察到一條約370bp的主產物帶。用巴斯德吸管的尖端由凝膠上吸出含該帶之一部分的凝膠栓，並轉移到小的微量離心管中。加入10μl水並於84℃加熱鍋中熔化該凝膠栓。將含有引物221-12和235-29(各8pmole)的PCR混合物在40μl反應體積中與2μl熔化並稀釋的凝膠栓一起保溫。15個反應周期後，經瓊脂糖凝膠分析可見到一大約370bp的輕微彌散的帶。進行非對稱PCR以產生頂和底鏈順序測定模板各反應混合物均含有4μlPCR反應產物和40pmole引物221-12或235-29，並在總反應體積100μl中進行25次PCR(1分鐘、95℃；30秒，55℃40秒，72℃)。用32P標記的引物262-13(
圖12B)對221-12引發的PCR產物混合物作直接順序分析(於標準的提取和乙醇沉澱步驟之後)，得到從核苷酸1到179的5′順序(
圖15C)。G．對幹細胞因子之第一編碼外顯子位點處的人基因組DNA的擴增和順序分析用SCF寡核苷酸探針篩選人基因組文庫，沒有發現任何含有第一編碼外顯子之已知部分的克隆。然後使用一側PCR技術擴增並克隆該外顯子周圍的基因組順序。
使用非SCF引物如228-28或221-11，並藉助DNA聚合酶Ⅰ(Klenow酶，大片段；Boehringer-Mannheim)，於適合在許多不同位點上引導的非嚴格(低溫度)條件下(如12℃)對熱變性的人胎盤DNA(購自Sigma公司)進行引物延伸。然後用含有Taq聚合酶和各100μM dNTP的Taq DNA聚合酶緩衝液將各反應混合物稀釋5倍，並於72℃下使DNA鏈延伸反應進行10分鐘。然後於SCF第一外顯子寡核苷酸(如254-9)和適當的非SCF引物(228-29或221-11)存在下，經PCR富集符合幹細胞因子第一外顯子順序的產物。瓊脂糖凝膠電泳結果表明，大多數產物都是短鏈的(小於300bp)。為富集較長的產物，切下相當於長度大於300bp之瓊脂糖凝膠部分，並以電泳法洗脫之。經乙醇沉澱後重新懸浮在水中，將該凝膠純化的PCR產物作為HindⅢ至SfiⅠ的片段克隆到含有SfiⅠ位點的pGEM4衍生物中。
用SCF第一外顯子寡核苷酸篩選細胞集落。鑑定出幾個陽性集落並用Sanger氏法測定出插入段的順序。如
圖15B所示，所得順序通過相符外顯子-內含子交界點由第一外顯子向下遊延伸到相鄰內含子。H．對小鼠、猴和狗的SCF cDNA編碼區的擴增和順序測定由得自猴肝細胞(購自Clontech)和NIH-3T3細胞系(小鼠，ATCC CRL1658)及D17(狗，ATCC CCL183)的總RNA或poly A+RNA製備第一條cDNA鏈。用於合成第一條cDNA鏈的引物是非特異性引物228-28或SCF引物(227-30,237-19,237-20,230-25或241-6)。用引物227-29和引物227-30、237-19或237-20之一進行PCR擴增，得到了一個有預期大小的片段，然後直接或於克隆到V19.8中或pGEM載體中之後測定其順序。
利用SCF特異性引物連同254-9或228-29一起，經PCR擴增得到接近SCF cDNA之5′端的附加順序。使用230-25或241-6，必要時還使用3′定向SCF引物，對230-25引導的cDNA(對於小鼠細胞來源者)或241-6引導的cDNA(對於猴細胞來源者)進行PCR擴增後，得到SCF編碼區之3′端的附加順序。在擴增D17 cDNA的相似實驗中，沒有得到SCF PCR產物帶。使用非特異性引物228-28由D17總RNA合成第一條鏈，並用3′定向的SCF引物(如227-29或225-31)連同228-29一起經PCR富集所得複雜產物混合物中的SCF相關順序。用SfiⅠ切割該產物混合物，並作為SfiⅠ位點到平端的片段將其克隆到含有SfiⅠ位點的pGEM4(Promega,Madison,Wisconsin)衍生物中。用放射標記的237-20篩選所得的異質性文庫，測定幾個陽性克隆的DNA順序，得到狗SCF3′端順序。
圖16中顯示了一一對應之人(圖42)、猴、狗、小鼠和大鼠SCF成熟蛋白質的胺基酸順序。
已知的SCF胺基酸順序就其大部分順序來說都是高度同源的。在所有5個種的編碼區中，都存在同樣的相符信號肽順序。圖中數字1指示的是通過據大鼠SCF類推，預期為成熟蛋白質之氨基末端的胺基酸。狗cDNA順序含有一個不明確的密碼子(密碼子129)，致使相應胺基酸順序中有一未定的纈氨酸/亮氨酸。人、猴、大鼠和小鼠胺基酸順序均成一線並列，而沒有任何插入或缺失。與其他種動物相比較，狗順序在130位上有一個多出的殘基。人和猴只在一個位置上有所不同，即130位的纈氨酸(人)被丙氨酸(猴)保守取代。在殘基164附近的位點處進行假想的加工之前或之後，各個種之間的推測的SCF順序是高度保守的。
實施例4重組大鼠SCF在COS-1細胞中的表達為在COS-1細胞(ATCC CRL1650)中進行暫時表達，將含有大鼠SCF1-162和SCF1-183基因的載體V19.8(實施例3C)轉染到重複的60mm平皿中(Wigler et al.,Cell,14,725-731(1978)]。質粒V19.8SCF如
圖17中所示。作為對照，也用沒有插入段的載體進行轉染。在翻譯後的不同時間點收穫組織培養物上清液並分析其生物學活性。表4總結了HPP-CFC生物檢測的結果，表5總結了由各典型轉染實驗得到的MC/93H-胸苷攝入數據。用下列質粒轉染的COS-1細胞上清液所作生物檢測的結果如表4和5所示C末端在胺基酸162位之C末端剪短形式的大鼠SCF(V19.8大鼠SCF1-162)、在81位含穀氨酸的SCF1-162[V19.8大鼠SCF1-162(Glu81)]，以及在19位上含有丙氨酸的SCF1-162[V19.8大鼠SCF1-162(Ala19)]。這些胺基酸取代是實施例3所述的大鼠SCF1-162擴增過程中進行PCR反應的產物。測定個別V19.8大鼠SCF1-162克隆的順序，發現兩個克隆有胺基酸取代。從表4和5中可以看出，重組大鼠SCF在用以純化天然哺乳動物SCF(實施例1)的生物檢測法中是有活性的。
表4對大鼠SCF DNA轉染之COS-1細胞的培養物上清液所作的HPP-CFC檢測樣品分析CM的體積(μl)集落數/200,000細胞V19.8(無插入段) 100050 025 012 0V19.8大鼠SCF1-62100＞5050 ＞5025 ＞5012 ＞506 303 8V19.8大鼠SCF1-162100 26(Glu81) 50 1025 212 0V19.8大鼠SCF1-162100 41(Ala19) 50 1825 5
樣品分析CM的體積(μl)集落數/200,000細胞1206030表5對大鼠SCF DNA轉染之COS-1細胞的培養物上清液所作的MC/93H-胸苷攝入試驗樣品 分析CM的體積(μl)cpmV19.8(無插入段)25 1,93612 2,2526 2,1823 1,682V19.8SCF1-16225 11,64812 11,3226 11,4823 9,638V19.8SCF1-16225 6,220(Glu81)12 5,3846 3,6923 1,980V19.8SCF1-16225 8,396(Ala19)12 6,6466 4,5663 3,182在用於檢測正常骨髓細胞增殖作用的人CFU-GM[Broxmeyeret al.,supra(1977)]試驗中分別檢測重組大鼠SCF及其他因子，結果如表6所示。表6中顯示了用V19.8SCF1-162及其他因子轉染4天後，對培養物的COS-1上清液所作檢測的結果。集落數為三份重複培養物的平均值。
在CFU-GM試驗中，重組大鼠SCF對正常人骨髓具有協同活性。在表6所示的實驗中，SCF與人GM-CSF、人IL-3及人CSF-1均有協同作用。在其他試驗中，還觀察到G-SCF的協同活性。使用大鼠SCF處理14天後，可見有人骨髓的增殖；但這些群落均不足40個細胞。用天然哺乳動物衍生的SCF獲得了相似的結果。
表6
實施例5重組SCF在中國倉鼠細胞內的表達本實施例涉及一種用於由CHO細胞(DHFR-；ATCCCCL61)分泌SCF的穩定的哺乳動物表達系統。A．重組大鼠SCF用以產生SCF的表達載體是V19.8(
圖17)。用以建立穩定轉化體的可選擇標誌物是質粒pDSVE.1中的二氫葉酸還原酶基因。質粒pDSVE.1(
圖18)是pDSVE的衍生體，是用限制酶SalⅠ消化pDSVE，並連接到由兩個寡核苷酸，即5′TCGAC CCGGA TCCCC3′和3′G GGCCT AGGGG AGCT 5′組成的寡核苷酸片段上而構建的。
美國專利系列申請號025,344和152,045中已描述了載體pDSVE。V19.8和pDSVE.1的載體部分包含一個較長的同源部分，其包括細菌COIEⅠ複製原點、氨苄青毒素抗性基因以及SV40複製原點。這種交迭可在轉化過程中導致同源重組，以利於共轉化。
在有或沒有10μg載體小鼠DNA的情況下，使用1.0或0.1μg已用限制酶PvuⅠ切成線性的pDSVE.1和10μgV19.8SCF，完成V19.8SCF構建物和pDSVE.1的磷酸鈣共沉澱[Wigler et al.,supra(1978)]。基於來自pDSVE.1之DHFR基因的表達來選擇集落。使用克隆唧管摘取能在沒有加入——和胸苷的培養基中生長的集落，並擴充為獨立的細胞系。以MC/93H-胸苷摻入試驗檢測個別細胞系的細胞上清液。典型實驗的結果示於表7中。
表7對大鼠SCF DNA轉染的穩定的CHO細胞上清液所作的MC/93H胸苷摻入試驗轉染的DNA 檢測的條件培養基的體積 cpmV19.8SCF1-1622533,9261234,9736 30,6573 14,7141.5 7,160None25694121,0826 8803 6721 1,354B．重組人SCF還使用共同專利申請系列號No.501,904(申請日1990年3月29日)中所述的表達載體pDSVRα2來實現SCF在CHO細胞內的表達。該載體包含一個基於DHFR基因的表達進行克隆選擇和擴增的基因。經過兩個步驟產生克隆pDSRα2SCF。用限制酶BamHⅠ化V19.8SCF，並將SCF插入段連接到pGEM3的BamHⅠ位點上。用HindⅢ和SalⅠ消化pGEM3 SCF的DNA，並連接到用HindⅢ和SalⅠ消化的pDSRα2中。重複同樣方法，以得到在
圖15C所示順序之162、164和183位胺基酸和圖42所示順序之248位上編碼羧基末端的人基因。用10nM氨甲喋呤攻擊已建立的細胞系[Shimke,＂Methods in Enzymology,151,85-104(1987)]，以提高DHFR和相鄰SCF基因的表達水平。用放射免疫法(如在實施例7中)，和/或用人外周血淋巴細胞體外誘導集落形成法來檢測重組人SCF的表達水平。該試驗基本上按實施例9(表12)中所述方法進行，不同的是使用外周血代替骨髓，並於人EPO(10單位/ml)存在下，在20％O2、5％CO2和75％N2環境下進行保溫。表8中顯示了典型實驗的結果。表達人SCF1-164的CHO克隆已於1990年9月25日保藏在ATCC(CRL10557)，並定名為Hu164SCF17。
表8對用人SCF DNA轉染的穩定CHO細胞系之條件培養基所作的hPBL集落檢測轉染的DNA 檢測的培養基(μl) 集落數/105細胞pDSRα2hSCF1-1645053254512.5 276.25 13pDSRα2hSCF1-16210435 442.5 311.25 170.625 21None(CHO對照) 504實施例6重組SCF在大腸桿菌中的表達A．重組大鼠SCF本實驗涉及藉助表達[Met-1]大鼠SCF1-193(
圖14C)編碼的DNA順序在大腸桿菌中表達SCF多肽。雖然可使用任何一種適於用該DNA進行蛋白質表達的載體，但這裡所選用的質粒是pCFM1156(
圖19)。
可很容易地由pCFM836(參見已列為本文參考文獻的美國專利4,710,473號)構建該質粒，其大致方法是用T4聚合酶進行末端充填，以破壞兩個內源性NdeⅠ限制性位點，然後進行平端連接，並用下示的小寡核苷酸取代唯一ClaⅠ和KpnⅠ限制性位點間的小DNA順序5′CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3′3′TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5′藉助合成的λPL啟動子控制pCFM1156質粒中的蛋白質表達，其中前者本身則處於溫度敏感性λCI857抑制基因[如由大腸桿菌菌株FM5(ATCC保藏號53911)或K12△Htrp中得到的]的控制下。構建pCFM1156，使之具有一個含最適化核糖體結合位點和直接接在合成PL啟動子3′端上的起始密碼子的DNA順序。含有ATG起始密碼子的唯一NdeⅠ限制性位點，位於其後接有λt-oop轉錄終止順序之多限制性位點克隆群的前面。
用BglⅡ和SstⅡ消化如實施例3中所述由PCR擴增的cDNA(
圖14C)克隆的含大鼠SCF1-183基因之質粒V19.8SCF1-193，並分離一個603bp DNA片段。為了提供Met起始密碼子並保留大鼠SCF多肽之前三個胺基酸殘基(Gln、Glu和Ile)的密碼子，製得有NdeⅠ和BglⅡ粘性末端的合成的寡核苷酸接頭5′TATGCAGGA 3′ACGTCCTCTAG 5′，將此小寡核苷酸和大鼠SCF1-193基因片段在
圖19所示質粒的唯一NdeⅠ和SstⅡ位點處插入pCFM1156中。此連接反應的產物即為表達質粒pCFM1156大鼠SCF1-193。
將pCFM1156大鼠SCF1-193質粒轉化到感受態FM5大腸桿菌宿主細胞中。基於pCFM1156載體上攜帶的抗生素(卡那黴素)抗性標誌選擇含質粒的細胞。由培養的細胞中分離質粒DNA，經DNA順序分析進一步確定合成寡核苷酸的DNA順序及其與大鼠SCF基因相接處的DNA順序。
為構建編碼[Met-1]大鼠SCF1-162多肽的質粒pCFM1156大鼠SCF1-162，由V19.8大鼠SCF1-162中分離EcoRⅠ至SstⅡ的限制性片段，並經連接反應，在唯一的EcoRⅠ和SstⅡ限制性位點上插入到質粒pCFM大鼠SCF1-193中，從而取代大鼠SCF基因羧基末端的編碼區。
為了構建分別編碼[Met-1]大鼠SCF1-164和[Met-1]大鼠SCF1-165多肽的質粒pCFM1156大鼠SCF1-164及pCFM1156大鼠SCF1-165，由PCR擴增的編碼SCF基因之3′末端的DNA中分離EcoRⅠ至SstⅡ的限制性片段，並設計在編碼SCF基因之羧基末端區域的DNA中引入位點特異性改變。在pCFM1156大鼠SCF1-164的構建中使用寡核苷酸引物227-29和237-19，在pCFM1156大鼠SCF1-165的構建中使用227-29和237-20，以進行DNA擴增。B．重組的人SCF本實施例涉及藉助編碼[Met-1]人SCF1-164和[Met-1]人SCF1-183的DNA順序(
圖15C)在大腸桿菌中表達人SCF多肽。用含有人SCF1-162基因的質粒V19.8人SCF1-162作為PCR擴增人SCF基因的模板。用寡核苷酸引物227-29和237-19產生PCR DNA，然後用限制性核酸內切酶PstⅠ和SstⅡ消化之。為了提供Met起始密碼子並保留人SCF多肽之前四個胺基酸殘基(Glu、Gly、Ile、Cys)的密碼子，製備具有NdeⅠ和PstⅠ粘性末端的合成寡核苷酸接頭5′TATGGAAGGTATCTGCA 3′3′ ACCTTCCATAG 5′經連接反應將此小寡聚接頭和PCR衍生的人SCF基因片段在
圖19所示質粒的唯一NdeⅠ和SstⅡ位點處插入表達質粒pCFM1156(如前所述)中。
將pCFM1156人SCF1-164質粒轉化到感受態F5大腸桿菌宿主細胞內。基於攜帶在pCFM1156載體上的抗生素(卡那黴素)抗性標誌選擇含質粒的細胞。由培養的細胞中分離質粒DNA並經DNA順序分析進一步確定人SCF基因的DNA順序。
為了構建編碼[Met-1]人SCF1-183(
圖15C)多肽的質粒pCFM1156人SCF1-183，由pGEM人SCF114-183(見下述)中分離編碼人SCF基因之羧基末端的EcoRⅠ至HindⅢ限制性片段，由pCFM1156人SCF1-164中分離編碼人SCF基因之氨基末端的SstⅠ至EcoRⅠ限制性片段，並從pCFM1156中分離大的HindⅢ至SstⅠ限制性片段。將這三個DNA片段連接在一起，形成pCFM1156人SCF1-183質粒，然後將其轉化到FM5大腸桿菌宿主細胞內。利用卡那黴素抗性選擇細胞集落後，分離質粒DNA並經DNA順序分析進一步確定其正確DNA順序。pGEM人SCF114-183質粒是含有EcoRⅠ-SphⅠ片段之pGEM3的衍生物，其中EcoRⅠ-SphⅠ片段包括如
圖15C所示的人SCF cDNA順序的核苷酸609至820。用寡核苷酸引物235-31和24-6(
圖12B)以及PCR22.7(
圖13B)作模板，由PCR中分離該質粒中的EcoRⅠ-SphⅠ插入段。引物241-6的順序是以人基因組順序至含胺基酸176密碼子之外顯子的3′側為基礎的。C．發酵培養產生人SCF1-164的大腸桿菌在16升發酵罐內發酵培養含有質粒pCFM1156人SCF1-164的FM5大腸桿菌K12宿主，以製備SCF1-164。種子培養物於-80℃下保存在含17％甘油的Luria培養液內。為製備接種物，將100μl融化的種子儲備物轉移到裝在2升埃倫美厄培養瓶內的500ml Luria培養液中，並在搖庫(250RPM)上使之30℃生長過夜。
為製備大腸桿菌細胞糊狀物，用以作為純化本實施例所述人SCF1-164的起始材料，可使用下述的發酵條件。
將接種培養物無菌操作下轉移到含8升分批培養基(見表9)的16升發酵器內。使培養物以批量方式生長，直到其OD-600約為3.5。此時，使用蠕動泵將無菌發酵原料(發酵原料1，表10)送入發酵器以控制進料速度。進料速度隨時間成指數增加達到生長速度為0.15/小時。生長期間溫度控制在30℃。通過控制空氣流速、攪拌速度、管內回流壓力及補氧量，將發酵器內溶解氧的濃度自動控制在50％飽和度。使用磷酸和氫氧化銨將pH自動控制在7.0。在OD-600約為30時，將發酵器內溫度提高到42℃，以誘導發酵的生產期。同時停止供給發酵原料1，而以200ml/小時的速度加入發酵原料2(表11)。約6小時後，將發酵器內容物冷卻到15℃。SCF1-164的產率約為30mg/OD-L。在BeckmanJ6-B轉子中以3000g離心1小時收穫細胞沉澱物。收穫的細胞糊狀物於-70℃下冷凍保存。
生產SCF1-164的優選方法與上述者相似，不同的是作了如下改動1)直到培養物的OD-600值達到5-6時方開始加入發酵原料1。
2)原料1的給料速度增加更為緩慢，以使生長速度更慢(約0.08)。
3)OD-600為20時開始誘導培養物。
4)向發酵器內引入原料2的速度為300ml/小時。
其他所有操作，包括培養基均與上述者相似。
使用該方法，在OD=25時所達到的產率約為35-40mg/OD-L。
表9分批培養基的組成酵母浸膏 10ag/L葡萄糖 5K2HPO43.5KH2PO44MgSO4·7H2O 1NaCl 0.625Dow P-2000消泡劑 5ml/8L維生素溶液b2ml/L微量金屬元素溶液c2ml/La．除特別註明者外，所有成分均以g/L為單位。b．維生素溶液核黃素，0.42g/L；泛酸5.4g/L；煙酸，6g/L；吡哆醇，1.4g/L；生物素，0.06g/L；葉酸，0.04g/L。c．微量金屬元素溶液FeCl3·6H2O,27g/L；ZnCl2·4H2O,2g/L；CaCl2·6H2O,2g/L；Na2MoO4·2H2O,2g/L；CuSO4·5H2O,1.9g/L；濃鹽酸，100ml/L。
表10原料培養基1的組成
a．除特別註明者外，所有成分均以g/L為單位。
b．微量金屬元素溶液FeCl3·6H2O,27g/L；ZnCl2·4H2O,2g/L；CaCl2·6H2O,g/L；Na2MoO4·2H2O,2g/L；CuSO4·5H2O,1.9g/L；濃鹽酸，100ml/L。
c．維生素溶液核黃素，0.42g/L；泛酸5.4g/L；煙酸，6g/L；吡哆醇，1.4g/L；生物素，0.06g/L；葉酸，0.04g/L。
表11原料培養基2的組成
a．所有成分均以g/L為單位。
實施例7免疫檢測法檢測SCF按下述程序完成定量測定SCF的放射免疫檢測法(R1A)。
將如實施例1中所述由BRL3A細胞中純化的SCF製劑與抗血清一起，於37℃下保溫2小時。保溫2小時後，在冰上冷卻樣品管，加入125I-SCF，並在4℃下至少保溫20小時。各試管均含有500μl由50μl稀釋的抗血清、約60,000cpm125I-SCF(3.8×107cpm/μg)、5μl trasylol和0-400μl SCF標準品組成的保溫混合物[加緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽水、0.1％牛血清白蛋白、0.05％Triton X-100、0.025％疊氮化物)補足體積]。抗血清是用得自BRL3A條件培養基的50％純天然SCF製劑免疫兔，並由第二次試驗採血血樣製得的。試驗中所用的終抗血清稀釋度為1∶2000。
加入150μl Staph A(Calbiochem)沉澱抗體結合的125I-SCF。室溫下保溫1小時後，離心樣品並用0.75ml含0.15MNaCl、2mM EDTA和0.05％Triton X-100的10mMTris-HCl(pH8.2)洗細胞沉澱物兩次。洗過的沉澱物在r計數器上計數，以確定125I-SCF結合的百分比。由全部最終數值中減去無血清管的結合計數，以糾正非特異性沉澱誤差。圖20中顯示了一典型RIA的結果。由未標記之標準品產生的對125I-SCF結合的百分抑制率是劑量依賴性的(圖20A)，而且如圖20B所示，當用SDS-PACE和放射自顯影技術檢驗免疫沉澱物時，可見125I-SCF蛋白質帶受到競爭。圖20B中，泳道1是125I-SCF，泳道2、3、4和5是分別受到0、2、100和200ng SCF標準品競爭的免疫沉澱的125I-SCF。正如根據RIA管中抗體可沉澱之cpm數值減少，以及免疫沉澱的125I-SCF蛋白帶(約在Mr31,000處遷移)減弱所看出的，該多克隆抗血清能夠誤別按實施例1所述方法純化的SCF標準品。
也可用Western印跡法檢測在大腸桿菌、COS-1和CHO細胞中表達的重組SCF。用SDS-PAGE法分離部分純化之大腸桿菌表達的大鼠SCF1-193(實施例10)、COS-1細胞表達的大鼠SCF1-162和SCF1-193以及人SCF1-162(實施例4和9)和CHO細胞表達的大鼠SCF1-162(實施例5)。電泳後，使用Bio-Rad Transblot裝置將蛋白帶轉移到0.2μm硝化纖維素濾膜上(60V,5小時)。在含有10％羊血清的PBS(pH7.6)中封閉硝化纖維素濾膜4小時，然後加入1∶200稀釋的兔預免疫或免疫血清(免疫方法同上所述)，室溫下保溫14小時。加入辣根過氧化物酶結合的羊抗兔IgG試劑(Veclor Laboratories)和4-氯代-1-萘酚顯色劑後即可顯現出抗體-抗血清複合物。
圖21和22中給出了兩次Western分析的結果。圖21中，泳道3和5是200μl COS-1細胞產生的人SCF1-162；泳道1和7是200μl COS-1細胞產生的人EPO(用V19.8EPO轉染的COS-1細胞)；泳道8是預染色的分子量標誌物。泳道1-4與預免疫血清保溫，泳道5-8加免疫血清保溫。該免疫血清可特異地識別表觀分子量約30,000道爾頓的彌散帶，後者來自產生人SCF1-162的COS-1細胞，而不是來自產生人EPO的COS-1細胞。
在圖22所示的Western印跡中，泳道1和7是1μg大腸桿菌中產生之大鼠SCF1-193的部分純化製劑；泳道2和8是麥胚凝集素-瓊脂糖純化之COS-1細胞產生的大鼠SCF1-193；泳道4和9是麥胚凝集素-瓊脂糖純化之COS-1細胞產生的大鼠SCF1-162；泳道5和10是麥胚凝集素-瓊脂糖純化之CHO細胞產生的大鼠SCF1-162；泳道6是預染色的分子量標誌物。泳道1-5和泳道6-10分別加預免疫和免疫血清保溫。大腸桿菌產生的大鼠SCF1-193(泳道1和7)以表觀分子量約24,000道爾頓遷移，而COS-1細胞產生的大鼠SCF1-193(泳道2和8)則以表觀分子量約24-36,000道爾頓遷移。這種分子量上的差異是可以想見的，因為哺乳動物細胞能夠產生糖基化作用，而細菌細胞則不能。用編碼大鼠SCF1-162的順序轉染COS-1(泳道4和9)或CHO細胞(泳道5和10)可比用編碼SCF1-183的順序轉染泳道2和8表達有更低平均分子量的SCF。
COS-1和CHO細胞表達的大鼠SCF1-162產物是一系列表觀分子量為24-36,000道爾頓的帶。被表達的SCF的這種異質性很可能是由於碳水化合物的變異，致使SCF多肽受到不同程度的糖基化作用。
總地說來，Western分析表明用天然哺乳動物SCF免疫之兔的免疫血清可識別大腸桿菌、COS-1和CHO細胞中產生的重組SCF，但不能識別包含COS-1細胞產生之EPO的對照樣品中的帶。另外，同一兔的預免疫血清沒有與任何大鼠或人SCF表達產物反應，也進一步證明了SCF抗血清的特異性。
實施例8重組SCF的體內活性A．骨髓移植中使用大鼠SCF按實施例4所述，進行用V19.8 SCF1-162轉染COS-1細胞的大容量實驗(T175cm2培養瓶代替60mm培養皿)。收穫約270ml上清液。基本上按實施例1中所述，在麥胚凝集素-瓊脂糖柱和S-Sepharose柱上層析分離該上清液。在基於小鼠W/Wv遺傳學的骨髓移植模型中估測重組SCF的活性。W/Wv小鼠具有幹細胞缺陷，而導致巨細胞性貧血(大紅細胞)，並可以由正常動物體內移植骨髓而不必照射受體動物[Russel et al.,Science,144,844-846(1964)]。移植後正常供體幹細胞比有缺陷的受體細胞生長快。
下列實施例中，各組均包括6隻年令相當的小鼠。由正常供體小鼠體內收集骨髓並移植到W/Wv小鼠體內。在移植後不同時間化驗全血血象，並根據受體外周血細胞向供體表現型的轉化來確定供體骨髓是否已被接受。而受體向供體表現型的轉化則是藉助於監測紅細胞的前向散射圖形(FASCAN,Becton Dickenson)而確定的。在每個時間點比較各移植動物與供體和受體末移植動物的血象。使用以Kolmogorov-Smirnov統計學為基礎的電腦程式分析得自血流系統的直方圖來完成這一比較[Young,J.Histochem.and Cytochem.,25,935-941(1977)]。移植物生長的一個獨立的定性指徵是通過對受體血液的血紅蛋白電泳分析所確定的血紅蛋白類型[Wong et al.,Mol.and Cell.Biol.,9,798-808(1989)]，此與根據Kolmogorov-Smirnov統計學分析得出的良好結果完全符合。
將大約3×105個細胞在沒有作SCF處理(圖23對照組)的情況下由C56BL/6J供體小鼠移植給W/Wv受體動物。第二組則接受3×105個已用SCF(600單位/ml)於37℃下處理20分鐘並被一同注射的供體細胞(圖23預處理組)。(1單位SCF定義為在MC/9生物檢測法中產生的最大半刺激量)。第三組中，移植3×105個供體細胞後，以每天大約400單位SCF的劑量給受體小鼠作皮下注射(sub-Q)三天(圖23皮下注射組)。如圖23所示，在兩個SCF處理組中供體骨髓接植比未處理的對照組快。移植後29天時，SCF預處理組已轉化為供體表現型。這一實例說明了SCF在骨髓移植中的治療作用。B．大鼠SCF在Steel小鼠體內的活性S1位點的突變可導致造血細胞、色素細胞和生殖細胞的缺失。造血細胞缺乏的明顯表現是紅細胞[Russell,In Al Gorden,Regu-lation of Hematopoiesis,Vol.1,649-675,Appleton-Century-Crafts,New York(1970)]、中性白細胞[Ruscetti,Proc,Soc.Exp,Biol.Med.,152,398(1970)]、單核細胞[Shibata,J.Immunol.,135,3905(1985)]、巨核細胞[Ebbe,EXP,Hematol.,6,201(1978)]天然殺傷細胞[Clark,Immuno Genetics,12.601(1981)]及肥大細胞[Hayashi,Dev.Biol.,109,234(1985)]數目的減少。Steel小鼠支持幹細胞的能力差，因此是一種骨髓移植的不良受體[Bannerman,Prog.Hematol.,8,131(1973)]。Steel(S1/S1)小鼠體內缺乏編碼SCF的基因。
Steel小鼠對SCF活性有體內敏感性。利用Steel-Dickie(S1/S1d)小鼠對各種不同的重組SCF蛋白質作不同時間的檢測。由JackenLabs,Bar Harbor,ME購得6至10周令的Steel小鼠。用SYSMEX F-800微型細胞計數器(Baxtor,Irvine,CA)檢測外周血紅細胞、白紅蛋白和血小板。用Coulter Channelyzer 256(Coulter Elec-tronics,Marietta,GA)細胞計數裝置計數外周血白細胞(WBC)。
在圖24所示的實驗中，用大腸桿菌產生的、按實施例10所述方法純化的SCF1-164，以每天每公斤體重100μg的劑量給Steel-dickie小鼠注射30天，然後再以每天每公斤體重30μg的劑量注射20天。注射時用生理鹽水(Abbott Labs,North Chiacago,IL)+0.1％胎牛血清配製該蛋白質。每目皮下注射1次。在圖24中所示的時間採集約50μl尾血檢驗外周血象。將採集的血樣放入3％EDTA包被的注射器中並分散到塗擦EDTA粉末的微量離心管內(Brinkman,Westburg,NY)。相對於對照組，處理組動物可發生非常明顯的巨大紅細胞性貧血。停止治療後治療組動物又回復到原來的巨紅細胞性貧血狀態。在圖25和26所示的實驗中，用上述各種重組形式的SCF以100μg/公斤/天的劑量給Steel小鼠注射20天。按實施例10所述方法製備兩種形式的大腸桿菌產生的大鼠SCF，即SCF1-164和SCF1-183。另外，還檢測按實施例12所述方法製得的結合了聚乙二醇的大腸桿菌SCF1-164(即SCF1-164PEG25)。還檢測了按實施例5所述方法製備並按實施例11所述方法純化的CHO產生的SCF1-162。用3％EDTA包被的注射器經心臟穿刺由動物體內採血並分散到用EDTA粉擦過的試管中。處理20天後的外周血象如圖25、26所示，其中圖25顯示白細胞(WBC)、圖26顯示血小板。SCF1-164PEG25組的WBC差異如圖27所示。可見有中性白細胞、單核細胞、淋巴細胞和血小板數的絕對增多。使用SCF1-164PEG25可顯示出最為突出的效果。
還對不同類型的淋巴細胞亞群作了檢測，所得數據如圖28所示。人CD4的鼠類等同物，或T輔助細胞的標誌物是L3T4[Dialynas,J.Immunol.,131,2445(1983)]。LYT-2是細胞毒性T細胞上的鼠抗原[Ledbetter,J.Exp.Med.,153,1503(1981)]。用抗這兩種抗原的單克隆抗體來估測治療組動物的T細胞亞類。
按下述方法染全血中的T淋巴細胞亞群從個別動物體內抽取200μl全血並加到EDTA處理過的試管中。每份血樣品均用無菌去離子水溶解60分鐘，然後製成10×Dulbecco′s磷酸鹽緩衝鹽溶液(PBS)(Gibco,Grand Island,NY)的等滲液。用含有0.1％胎牛血清(Flow Laboratory,Mclean,VA)和0.1％疊氮鈉的1×PBS(Gibco,Grand Island,NY)將溶解的血樣品洗兩次。使各份血樣品沉澱到96孔園底群集皿中，並離心之將細胞沉澱物(含2-10×.05細胞)重新懸浮於20μl結合有藻紅蛋白(PE)(Becton Dickinson,MountainView,CA)的大鼠抗小鼠L3T4和20μl結合有異硫氰酸螢光素的大鼠抗小鼠Lyt-2中，並在冰上(4℃)保溫30分鐘。保溫後在上述1×PBS中洗細胞2次。然後在FACScan細胞分析系統(Becton Dickinson,Mountain View,CA)中分析各血樣。使用標準自動補償方法和校準小珠(Calibrite beads)(Becton Dickin-son,Mountain View,CA)對該系統進行校正使之標準化。所得數據表明了輔助性T細胞群和細胞毒性T細胞數目的絕對增加。C．SCF在靈長類動物體內的活性檢測大腸桿菌中表達的(實施例6B)並按實施例10中所述方法純化的同種人SCF1-164在正常靈長類動物體內的活性。將成年雄性狒狒(Papiosp.)分成三組進行研究未治療組，n=3；SCF100μg/公斤/天給藥組，n=6；SCF30μg/公斤/天給藥組，n=6。治療組每天接受一次SCF皮下注射。在氯胺酮麻醉下自動物體內採血。在給藥的第1、6、11、15、20和25天採集血樣並作全血細胞計數、網織紅細胞計數和血小板計數。
所有被治療動物均存活，並且對SCF無任何不良反應。如圖29中所示，給予100μg/公斤/體重的動物表現白細胞數增加。圖29中還列出了外周血塗片經Wright-Giemsa染色後，作人工計數所得到的不同細胞計數值。可見中性白細胞、淋巴細胞及單核細胞均呈現絕對增多。如圖30所示，100μg/公斤體重治療組的血細胞比容和血小板數也有所增加。
以200μg/Kg/天的劑量，給正常狒狒連續靜脈輸注人SCF(按實施例12中所述方法用聚乙二醇修飾的hSCF1-164)，檢測其在動物體內的作用並與未修飾的蛋白質比較。從0天開始給藥，共處理28天。所得外周血WBC計數結果如下表所示。從中可以看出，PEG修飾的SCF可比未經修飾的SCF更早地引起外周血WBC數目的增加。
用每天每公斤體重200μg hSCF1-164處理動物#M 88320 動物#M 88129天數 WBC數 天數 WBC數0 58000 6800+710700 +7 7400+14 12600 +14 20900+16 22000 +21 18400+22 31100 +23 24900+24 28100 +29 13000+29 9600+30 23000+36 6600+37 12100+43 5600+44 10700+51 7800用每天每公斤體重200μg PEG-hSCF1-164處理動物#M 88350 動物#M89116天數 WBC數 天數WBC數-7 12400 -5 7900-2 11600 0 7400+4 24700 +6 16400+7 20400 +9 17100+11 24700 +13 18700+14 32600 +16 19400
動物#M 88350 動物#M 89116天數WBC數天數WBC數+1833600+2027800+2126400+2320700+2516600+2720200+2826900+2918600+329200 +337600實施例9重組人SCF的體外活性按實施例4中所述表達大鼠SCF的方法，在COS-1細胞中表達經實施例3D所述PCR反應製得的相應於胺基酸1-162的人SCF的cDNA。用人骨髓及小鼠HPP-CFC和MC/9檢測法檢測COS-1上清液。在小鼠檢測法中，於所試濃度下該人蛋白質沒有活性，但它對人骨髓是有活性的。檢測所用的培養條件如下以Ficoll-Hypaque梯度(Pharmacia)離心取自健康自願者的人骨髓並培養在2.1％甲基纖維素、30％胎牛血清、6×10-5M2-巰基乙醇、2mM穀氨醯胺、ISCOVE氏培養基(GIBCO)、20U/ml EPO中，並在含有7％O2、10％CO2和83％N2的溼氣中以1×105細胞/ml的濃度培養14天。表12中顯示了由重組人和大鼠SCF COS-1上清液產生的集落數。其中只計數那些大小等於或大於0.2mm的集落。
表12在對SCF反應中入骨髓細胞集落的生長轉染的質粒檢測的CM體積μl 集落數/100,000細胞±SDV19.8未插入 100050 0V19.8人SCF1-162100 33±750 22±3V19.8大鼠SCF1-162100 13±15010圖31A中顯示了生長14天後的集落(放大12倍)。箭頭指示一典型集落。這些集落就其大體積(平均0.5mm)來說相似於小鼠HPP-CEC集落。由於存在EPO，使得某些集落血紅蛋白化。當使用Cytospin(Shandon)分離集落並離心在玻片上，然後用WrightGiemsa染色時，可見主要細胞類型為如圖31B中所示具有大核胞漿比例的未分化細胞(放大400×)。圖31B中箭頭分別指示下列結構箭頭1，胞漿；箭頭2，核；箭頭3，液泡。未成熟細胞為一類大細胞，當其成熟時細胞逐漸變小[Diggs et al.,The Morpho-logy of Human Blood Cells,Abbott Labs,3(1978)]。造血成熟過程中，早期細胞的核相對於胞漿來說要大些。另外，用Wright-Giemsa染色後，未成熟細胞的胞漿比核深些。而當細胞成熟時，核染色則比胞漿深些。從含重組人SCF之培養物得到的人骨髓細胞的形態學看，可以認為SCF作用的靶細胞的直接產物是相對未成熟的造血祖細胞。
在瓊脂集落檢測中，試驗了重組人SCF與上述其他生長因子對人骨髓細胞的作用，結果如表13所示。就個別CSF來說，SCF與G-CSF、GM-CSF、IL-3和EPO有協同作用可加速骨髓靶細胞的增殖。
表13重組人SCF與其他人集落刺激因子的協同作用集落數/105細胞(14天)空白對照 0hG-CSF 32±3hG-CSF+hSCF 74±1hGM-CSF 14±2hGM-CSF+hSCF108±5hIL-323±1hIL-3+hSCF 108±3hEPO 10±5hEPO+IL-317±1hEPO+hSCF86±10hSCF 0重組人SCF的另一活性是能夠引起軟瓊脂中人急性髓性白血病(AML)細胞系KG-1(ATCC CCL246)的增殖。基本上按已述的KG-1瓊脂克隆法[Koeffler et al.,Science,200,1153-1154(1978)]試驗得自轉染細胞的COS-1上清液，方法上不同的是鋪板細胞濃度為3000個/ml。表14中給出了各組三份培養物的統計學數據。
表14KG-1軟瓊脂克隆試驗轉染的質粒 分析的體積集落數/3000細胞±SDV19.8(未插入段) 25 2±1V19.8人SCF1-16225 14±012 8±06 9±53 6±41.5 6±6V19.8大鼠SCF1-16225 6±1人GM-CSF50(5ng/ml) 14±5實施例10在大腸桿菌中表達的重組SCF產物的純化按實施例6C所述方法發酵培養可表達人SCF1-164的大腸桿菌。將收穫的細胞(912g溼重)懸浮在水中至體積為4.6升，然後使之三次通過實驗室勻漿器(Gaolin Model 15MR-8TBA)(8000psi)。離心(17700×g,30分鐘，4℃)得到破碎的細胞團塊，用水洗一次(再次懸浮並離心)，然後懸浮在水中至體積為400ml。將含有不溶性SCF(約10-12g SCF)的細胞碎片加到3950ml適當混合物中，該混合物內各組分及終濃度分別為8M尿素(超純品)、0.1mM EDTA、50mM乙酸鈉，pH6-7；估計SCF濃度為1.5mg/ml。室溫下保溫4小時以溶解SCF。離心(17700g,30分鐘，室溫)除去其餘的不溶性物質。為使已溶解的SCF重新拆迭/再氧化，攪拌下將上清部分緩緩加入39.15升適當混合物中，該混合物內的各成分及其終濃度為2.5M尿素(超純品)、0.01mM EDTA、5mM乙酸鈉、50mM Tris-HCl(PH8.5)、1mM穀胱甘肽、0.02％(重量/體積)疊氮鈉。SCF的濃度約為150μg/ml。室溫下攪拌約60小時後[也可以是較短時間，如約20小時]，使用有3個截留分子量為10000之聚碸膜(總面積15平方英尺)的Millipore Pellicon超濾裝置將該混合物濃縮2倍，然後對7倍體積的20mM Tris-HCl(pH8)透析。濃縮/超濾期間的溫度為4℃，泵送速率為5升/分鐘，過濾速度為600ml/分鐘。回收之滯留物的終體積為26.5升。用SDS-PAGE法檢測樣品有或沒有還原，此證明大多數(＞80％)細胞碎片SCF經與8M尿素保溫而被溶解，並如對未還原樣品所作SDS-PAGE分析中看到的，在拆迭/氧化之後存在多種形式的SCF。如圖9所示，代表正確氧化之主要形式的SCF(見下述)，相對於分子量標誌物(還原的)，其遷移的表觀分子量約為17,000(未還原的)。其他形式包括以表觀分子量約18-20,000遷移的材料(未還原的)，其代表有不正確鏈內二硫鍵的SCF；而以表觀分子量範圍為37,000(未還原的)遷移的帶(或更大的帶)則被認為是代表不同的SCF形式，它們具有可導致這樣一些SCF多肽鏈的鏈內二硫鍵，即它們可以共價連接以分別形成二聚體或較大的寡聚體。經分離步驟後，可除去餘留的大腸桿菌汙染物和不要的SCF形式，從而得到生物學活性構象上有明顯均質性的純化的SCF。
加入375ml10％(體積/體積)乙酸，將超濾滯留物的pH調到4.5，從而出現可見的沉澱物質。60分鐘後，大部分沉澱物即已沉到容器底部，棄去上層之24升並通過CunoTM30SP深濾器以500ml/分鐘的速度過濾，直到完全澄清。然後用水將濾液稀釋1.5倍，並於-4℃下加至在25mM乙酸鈉(pH4.5)中平衡過的S-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia)上。在4℃下，以5L/h流速進行柱層析。加入樣品後，用5倍柱床體積(約6升)的柱緩衝液洗柱，並用在緩衝液中的0至0.35M NaCl梯度洗脫。總梯度體積為20升，所收集的每部分(管)為200ml。洗脫曲線如圖33所示。用SDS-PAGE法分析從S-Sepharose柱中收集的各等份(10μ)還原(圖32A)和未還原(圖32B)的樣品。由分析可以看出，實際上在280nm處的所有吸收(圖32和33)都是由於SCF材料的存在。
在主吸收峰(第22-38管，圖33)中，是以正確氧化的形式佔優勢。見於各部分中的次要形式包括在SDS-PAGE分析中表觀分子量為18-20,000的非正確氧化的物質(未還原的)，其出現於主吸收峰的前肩部(第10-21管，圖32B)；且二硫鍵結合的二聚體材料則存在於整個吸收區域(第10-38管，圖32B)中。
合併由S-Sepharose柱上收集的第22-38部分(管)，加入約11毫升6NHCl將其pH調到2.2，並於4℃下加到用50％(體積/體積)乙醇、12.5mM HCl(溶液A)平衡的VydacC4柱(高8.4cm，直徑9cm)上。柱樹脂的製備是先將幹樹脂懸浮於80％(體積/體積)乙醇、12.5mM HCl(溶液B)中，然後用溶液A平衡之。加樣品之前，用溶液A到溶液B(總體積6升)的空白梯度過柱，然後再用溶液A平衡。加樣品之後，用2.5升溶液A洗柱，並以2670ml/小時的流速用溶液A至溶液B的梯度(總體積18升)洗脫結合在柱上的SCF材料。以每管50ml收集286管，並按上述方法用280nm吸光率(圖35)和SDS-PAGE法(每管25μl)分析各等分部分(圖34A，還原條件；圖34B，非還原條件)。合併含有高純度正確氧化之SCF的第62-161管[其後在該梯度中洗脫了小量分子量約18-20,000的非正確氧化的單體(未還原的)(約為第166-211管)及後來的二硫鍵結合的二聚體(約為第199-235管，圖35)]。
為了由第62-161管的集合物中除去乙醇並濃縮SCF，繼後須使用Q-Sepharose Fast Flow離子交換樹脂(Pharmacia)。用水稀釋集合物(5升)至15.625升，使乙醇濃度約達到20％(體積/體積)。然後加入1M Tris鹼(135ml)至pH8，再加入1M Tris-HCl,pH8(23.6ml)，使總Tris濃度達到10mM。進一步加入10mM Tris-HCl,pH8(約15.5升)，至總體積為31.25升，乙醇濃度約為10％(體積/體積)。將所得材料於4℃加至用10mM Tris-HCl(pH8)平衡的Q-SephoroseFast Flow柱(高6.5cm，直徑7cm)上，然後用2.5升柱緩衝液洗柱。加樣品和洗柱期間的流速約為5.5升/小時。為洗脫結合的SCF，以反方向通過柱泵入200mM NaCl、10mMTris-HCl(pH8)，流速約200ml/小時。各管約收集12ml，並按上述280nm吸光率及SDS-PAGE法分析之。合併第16-28管(157ml)。
將含有SCF的合併物加至兩個分離的、用4℃鹽酸緩衝鹽水平衡的Sephacryls-200 HR(Pharmacia)凝膠過濾柱(5×138cm)上(各加78.5ml)。以大約75ml/小時的流速收集，每管約收集15ml。各層析柱上，根據280nm吸光率洗脫的主峰各管大致相當於1370至1635ml的洗脫體積。將兩個柱上相當於吸收峰的各管合併，約得到525ml集合物，其中約含有2.3gSCF。使用Millipore Millipak 20膜性濾筒過濾除菌。
另外，也可在過濾除菌前超濾濃縮並滲析緩衝液交換C4柱洗脫的材料。
分離的重組人SCF1-164材料是高純度的(對SDS-PAGE膠塊作銀染色證明純度＞98％)，並可看作是醫藥級的。使用實施例2中所述方法，發現該材料的胺基酸組成與根據SCF基因推測者一致，並且如所期望的，其N末端胺基酸順序為Met-Glu-Gly-Ile…，並保有由起始密碼子編碼的Met。
使用與回收在大腸桿菌中表達之人SCF1-164的相近方法，可以具有高生物學特異活性的純化狀態回收大鼠SCF1-164(發酵後也在細胞內以不溶性形式存在)。同樣也可以回收人SCF1-183和大鼠SCF1-183。在拆迭/氧化期間，大鼠SCF1-193傾向於形成各種形式氧化的品種，而且更難於經層析除去不需要的形式。
在回收早期階段，即溶解和拆迭/氧化階段，大鼠SCF1-183和人SCF1-183傾向於蛋白水解降解。蛋白水解作用的主要部位在殘基160和170之間。可經適當控制操作條件(如SCF濃度、pH值、加入2-5mM的EDTA或其他蛋白酶抑制劑)來減小蛋白水解作用，並可通過適當的分級分離步驟除去已存在的部分降解物。
雖然較好方案是，在拆迭/氧化期間使用尿素溶解(如前所述)，但也可以有效地利用其他助溶劑，如鹽酸胍(如溶解期間用6M，拆迭/氧化期間用1.25M)和月桂醯肌氨酸鈉。拆迭/氧化後除去所用試劑，繼之可使用適當分離步驟回收經SDS-PAGE證實的純化之SCF。
此外，雖然拆迭/氧化期間使用1mM穀胱甘肽是一優選方案但也可以利用具有相同或相近效果的其他條件。例如，這些條件包括用2mM穀胱甘肽加0.2mM氧化態穀胱甘肽，或4mM穀胱甘肽加0.4mM氧化態穀胱甘肽，或用1mM2-巰基乙醇或其他硫醇試劑代替1mM穀胱甘肽。
除上述層析方法外，用於回收純化之活性SCF的其他方法包括疏水相互作用層析法[如使用苯基-Sepharose(Pharmacia)，於1.7M硫酸銨存在下，中性pH時加樣，並用降低硫酸銨的梯度洗脫]、固相化金屬親合層析法[如使用帶有Cu2+離子的螯合-Sepharose(Pharmacia)，在接近中性pH並存在1mM咪唑的條件下加樣，並用增加咪唑的梯度洗脫]、羥基磷灰石層析[在中性pH和1mM磷酸鹽存在下加樣，並用增加磷酸鹽的梯度洗脫]，以及其他本領域技術人員已知的方法。
也可以在大腸桿菌中表達相當於由圖42中胺基酸1-248編碼的全部或部分開放讀碼，或相當於由可能存在之切接mRNA編碼的開放讀碼(如由圖44中cDNA順序代表者)的其他形式的人SCF，並按本實施例中所述的相似方法或其他本領域已知方法以純化形式回收之。
包括如實施例16所述之所謂跨膜區的其他形式SCF的純化和配製方法，可涉及利用去汙劑(包括非離子型去汙劑)和脂質(包括含磷脂的脂質體結構)。
實施例11來自哺乳動物細胞的重組SCFA．發酵培養產生SCF的CHO細胞在20升灌注培養系統中，在微載體上培養重組的中國倉鼠卵(CHO)細胞(CHOpDSRα2 hSCF1-162細胞株)以產生人SCF1-162。其發酵器系統與培養BRL3A細胞(實施例1B)所用者相似，不同的是用於培養CHO細胞的生長培養基是Dulbecco氏改良的Eagle培養基(DMEM)與Ham氏F-12營養混合物以1∶1比例混合的混合培養基(GIBCO)，其中添加了2mM穀氨酸胺、非必需胺基酸(用1∶100稀釋的Gibco#320-1140使已有濃度加倍)及5％胎牛血清。除去掉血清外，收穫培養基完全相同。用生長於兩個3升轉瓶中的5.6×109個CHO細胞接種反應器。使細胞生長至濃度為4×105細胞/ml。此時將100g預滅菌的cytodex-2微載體(pharmacia)作為3升在磷酸鹽緩衝鹽水中的懸液，加到反應器內。使細胞接觸微載體並在其上生長4天。可根據葡萄糖消耗情況，通過反應器灌注生長培養基。葡萄糖濃度維持在大約2.0g/L。四天後向反應器內加入六倍體積的無血清培養基，以除去大部分血清(蛋白質濃度＜50μg/ml)。然後不連續分批工作，直到葡萄糖濃度降至2g/L以下。從該點之後，反應器以大約20升/天的連續灌注速率進行工作。調整CO2流速使培養物的pH保持在6.9±0.3。必要時經補充純氧以使溶解氧保持在20％空氣飽和度。溫度保持在37±0.5℃。
由上述體系中約產生450升無血清條件培養基，並用作純化重組人SCF1-162的起始材料。
使用細胞株CHO pDSRα2 rSCF1-162，也可按相似方式產生約589升無血清條件培養基，並用作純化大鼠SCF1-162的起始材料。B．純化重組哺乳動物細胞表達的大鼠SCF1-162除特別指出者外，所有純化工作均在4℃下進行。1．濃縮和透濾(diafiltration)通過0.45μ Sartocapsules(Sartorius)過濾以澄清上文A部分所述無血清培養細胞株CHO pDSRα2大鼠SCF1-162所產生的條件培養基。對幾批材料(36升、101升、102升、200升和150升)分別進行濃縮和透濾/緩衝液交換。下面以36升批份為例說明操作方法。使用有3個截留分子量為10,000之醋酸纖維素膜卡盒的Millipore Pellicon正切流動超濾裝置，將過濾的條件培養基濃縮至大約500ml(總膜面積15ft2，泵速～2,200ml/min，過濾速度～750ml/min)。然後向濃縮物內加入1000ml 10mM Tris-HCl(pH6.7-6.8)、再使用正切流動超濾裝置濃縮至500ml，並如此再重複5次，以完成陰離子交換層析製備中的滲濾/緩衝液交換。最後回收的濃縮/滲濾之製劑體積為1000ml。受到濃縮和透濾/緩衝液交換之各批條件培養基的行為均相似。按Bradford方法[Anal.Bioch.,72,248-254(1976)]，用牛血清白蛋白作標準品測得各批份的蛋白質濃度為70-90μg/ml。用於該製備之條件培養基的總體積約為589升。
2．Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析合併按上述方法由5批條件培養基濃縮/透濾的製劑(總體積5,000ml)。加入1M HCl將pH調到6.75。使用2000ml 10mM Tris-HCl(pH6.7)，使導電率達到約0.700mmho。將該製劑加到已用10mM Tris-HCl(pH6.7緩衝液)平衡的Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(36×14cm；Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow樹脂)上。加樣後，用28,700mlTris緩衝液洗柱；再用23,000ml 5mM醋酸/1mM甘氨酸/6M尿素/20μM CuSO4(約pH4.5)洗柱；然後用10mM Tris-HCl、20μM CuSO4、pH6.7緩衝液洗柱，使pH回復到中性並除去尿素，再加以鹽梯度(0-700mM NaCl在10mM Tris-HCl、20μM CuSO4,pH6.7緩衝液中；總體積40升)。以大約3,250ml/小時的流速，按每部分490ml收集。層析圖形如圖36所示。「MC/9cpm」是指MC/9檢測中的生物學活性；所指示各部份每份檢測5μl。圖中未顯示加樣和洗柱期間收集的洗脫物；在這些部分中測不出生物學活性。
3．使用矽結合的碳氫化合物樹脂層析合併圖36中所示的第44-66部分(11200ml)，並加入EDTA到終濃度為1mM。將該材料以大約2000ml/小時的流速加到用緩衝液A(10mM Tris,pH6.7/20％乙醇)平衡的C4柱(Vydac Proteins C4；7×8cm)上。加樣後用1000ml緩衝液A洗柱。然後加以從緩衝液A到緩衝液B(10mM Tris,pH6.7/94％乙醇)的線性梯度(總體積6000ml)，並按30-50ml分段收集。在製備進行生物學分析的製劑時，除0.5ml等分梯度洗脫部分外，C4柱起始樣品、過柱集合物和洗滌集合物均對磷酸鹽緩衝鹽水透析。用MC/9檢測法檢測上述各部分(5μl等份的梯度洗脫部份；cpm數示於圖37中)。圖38顯示了各部分之等分樣品的SDS-PAGE[Laemmli,Nature 227,680-685(1970)；堆積膠含有4％(W/V)丙烯醯胺，分離膠含有12.5％(W/V)丙烯醯胺]結果。所示各凝膠均於真空下乾燥等分樣品(100μl)，然後用20μl樣品處理緩衝液重新溶解(還原，即用2-巰基乙醇)並在加到凝膠上之前煮沸5分鐘。圖左側的編號標誌代表分子量標誌物(還原的)的遷移位置(同圖6)。編號泳道代表加最後一部分梯度洗脫液時收集的相應部分。對凝膠進行銀染色[Morrissey,Ahal.Bioch,117,307-310(1981)]。
4．Q-Sepharose Fast How陰離子交換層析合併由圖37中所示C4柱上收集的第98-124部分(管)(1050ml)。用10mM Tris,pH6.7緩衝液按1∶1稀釋合併的洗脫物，以降低乙醇濃度。然後將稀釋的集合洗脫物加至已用10mMTris-HCl(pH6.7)緩衝液平衡的Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(3.2×3cm,Phrmacia Q-Sepharose Fast Flow樹脂)上。流速為463ml/小時。上樣後用135ml柱緩衝液洗柱並用10mM Tris-HCl、350mM NaCl(pH6.7)洗脫結合的材料。倒轉柱內的流動方向以減小被洗脫物的體積，並在洗脫時收集到7.8ml洗脫部分。
5．Sephacryl S-200HR凝膠過濾層析合併鹽洗脫Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱得到的含被洗脫蛋白質的各部分(31ml)。將30ml洗脫物加到在磷酸鹽緩衝鹽水中平衡的Sephacryl S-200 HR(Pharmacia)凝膠過濾柱(5×55.5cm)上。以68ml/小時的流速收集6.8ml部分。合併相當於280nm吸光率峰值的各部分，即為最後純化的材料。
該純化過程的總結示於表15中。
表15對哺乳動物細胞表達之大鼠SCF1-162純化過程的總結
*用Bradford方法(文獻同上，1976)測定。
**使用與實施例2中所述者相似的方法，經定量胺基酸分析測定為47.3mg。
用實施例2所述方法測定純大鼠SCF1-162之N末端胺基酸順序大約一半是Gln-Glu-Ile…，一半是pyroGlu-Glu-Ile…。這一結果表明大鼠SCF1-162是在
圖14C中所示殘基(-1)(Thr)和(+1)(Gln)之間蛋白水解加工/裂解的產物。相似地，由轉染的CHO細胞條件培養基純化者(下方)具有N末端胺基酸順序Glu-Gly-Ile，此表明其為在
圖15C所示殘基序號(-1)(Thr)和(+1)(Glu)之間加工/裂解的產物。
使用上述方法，可產生在CHO細胞內表達之重組形式的或天然衍生的純化人SCF蛋白。
適用於純化哺乳動物細胞衍生之重組SCF的其他純化方法包括實施例1和10中所述者，以及本領域技術人員熟知的其他方法。
也可以在哺乳動物細胞中表達相當於由圖42所示胺基酸1-248編碼的全部或部分開放讀碼，或相當於由可能存在之裂接mRNA編碼之開放讀碼(如由圖44中cDNA順序代表者)的其他形式的人SCF，並可按與該實施例中所述相似的方法，或其他本領域已知的方法，以純化的形式回收之。
C．SDS-PAGE的糖苷酶處理圖39中顯示了合併的Sephacryl S-200 HR凝膠過濾柱洗脫部分的SDS-PAGE結果。裝柱量為2.5μl集合物(泳道1)。該泳道是經過銀染色的。分子量標誌物(泳道6)同圖6所示。上方不同的遷移材料和稍下方分子量31,000標誌物位置代表了生物學活性材料；這種表觀異源性在很大程度上是由於糖基化作用的異源性。
為鑑定糖基化作用的特徵，對純化的材料用各種糖苷酶處理、用SDS-PAGE法分析(還原條件)並經銀染色作肉眼觀察。結果示於圖39中。泳道2，神經氨酸酶；泳道3，神經氨酸酶和O-聚糖酶；泳道4，神經氨酸酶、O-聚糖酶和N-聚糖酶；泳道5，神經氨酸酶和N-聚糖酶；泳道7,N-聚糖酶；泳道8,N-聚糖酶(沒有底物)；泳道9,O-聚糖酶(沒有底物)。條件是加10mM3-[(3-乙醇氨基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸內酯(CHAPS)、66.6mM2-巰基乙醇、0.04％(W/V)疊氮鈉、磷酸鹽緩衝鹽水，37℃保溫30分鐘，然後在糖苷酶存在下，加入所述濃度的一半37℃保溫18小時。所用神經氨酸酶(得自Arthrobacterureafaciens,由Calbiochem公司提供)濃度為0.5單位/ml,O-聚糖酶(Genzyme；內-α-N-乙醯基-氨基半乳糖苷酶)濃度為7.5毫單位/ml,N-聚糖酶(Genzyme；肽N-糖苷酶F；肽-N4[N-乙醯基-β-葡糖胺基]天冬醯胺酶)濃度為10單位/ml。
可根據需要進行各種對照保溫。可加糖苷酶保溫，以證實所得結果系由於加入了糖苷酶製劑所加致；入已知為糖苷酶底物的糖基化蛋白質(如糖基化重組人促紅細胞生成素)保溫，以證實所用糖苷酶是有活性的；加糖苷酶而不加底物保溫，以判定糖苷酶製劑呈現或掩敝可見的凝膠帶(圖39，泳道8和9)。
由上述實驗可得出多個結論。用N-聚糖酶[其可除去複合物及高甘露糖N連接的碳水化合物(Tarentino et al.,Biochemistry 24,4665-4671(1988)]、神經氨酸酶(其可可除去唾液酸殘留物)、及O-聚糖酶〔其可除去某些O連接的碳水化合物(Lambin et al.,Biochem.,Soc.Trans.12,599-600(1984)]所作各種處理提示存在N連接的和O連接的碳水化合物，且存在唾液酸，同時至少有些是O連接之部分的一部分。事實上用N-聚糖酶處理可以將經過SDS-PAGE分析顯現的異質性材料轉化為較快速遷移的形式，後者同源性更好表明所有材料均代表同一種多肽，且這種異質性主要是因糖基化作用的異質性所致。
實施例12重組SCF1-164PEG的製備用按照實施例6A和10所述方法由重組大腸桿菌表達系統純化的大鼠SCF1-164作為進行下述聚乙二醇修飾的起始材料。
將溶於0.327ml去離子水中的甲氧聚乙二醇-琥珀醯亞氨基-琥珀酸酯(18.1mg=3.63μmol；SS-MPEG=Sigma Chemcal Co.no.M3152，分子量～5,000)加至溶於1.0ml 138mM磷酸鈉、62mM NaCl、0.62mM乙酸鈉(pH8.0)中的13.3mg(0.727μmol)重組大鼠SCF1-164內。室溫下將所得溶液輕輕搖動(100rpm)30分鐘。然後將1.0ml等分的最終反應混合物(10mg蛋白質)加到Pharmacia Superdex 75凝膠過濾柱(1.6×50cm)上，並於室溫幹用100mM磷酸鈉(pH6.9)以0.25ml/分鐘的速率洗脫。棄去前10ml柱洗脫物，然後以每管1.0ml收集。連續監測柱洗脫物的UV吸光率(280nm)，結果如圖40A所示。合併第25至27管，通過0.2μ聚碸膜(GelmanSciences no.4454)超濾除菌並將所得物定名為PEG-25。同樣地合併第28至32管內容物，超濾除菌並定名為PEG-32。根據1.0mg/ml未修飾大鼠SCF1-164溶液的吸光率為0.66，由A280測定結果算出合併的PEG-25部分含有3.06mg蛋白質，且合併的PEG-32部分含有3.55mg蛋白質。在第34至37管中洗脫得到佔反應混合物內總蛋白11.8％的未處理的大鼠SCF1-164。於相似的層析條件下，洗脫出未經修飾的大鼠SCF1-164，其為一個滯留體積45.6ml的主峰(圖40B)。第77至80管(圖40A)含有N-羥基琥珀醯亞胺，其為大鼠SCF1-164與SS-MPEG反應的付產物。
大鼠SCF1-164中的潛在反應性氨基基團包括12個賴氨酸殘基和N末端穀氨醯胺殘基的α氨基基團。按Habeeb所述方法[Anal.Biochem.14:328-336(1966)]，用三硝基苯磺酸(TNBS)作分光光度滴定，測得合併的PEG-25部分內每摩爾蛋白質含9.3mol反應性氨基基團。同樣，合併的PEG-32部分每摩爾蛋白質含有10.4mol反應性氨基基團，且未修飾的大鼠SCF1-164含有13.7mol反應性氨基基團。可見，合併的PEG-32部分內平均有3.3(13.7減10.4)個大鼠SCF1-164的氨基基團經與SS-MPEG反應而受到修飾。相似地，合併的PEG-25部分中則平均有4.4個大鼠SCF1-164的氨基基團被修飾。也使用上述方法對實施例10中產生的人SCF(hSCF1-164)作了修飾。具體地說是使714mg(38.5μmol)hSCF1-164與溶於75ml0.1M磷酸鈉緩衝液(pH8.0)的962.5mg(192.5μmol)SS-MPEG室溫下反應30分鐘。將該反應混合物加到Sephacryl S-200HR柱(5×134cm)上並用PBS(沒有CaCl2和MgCl2的Gibco Dulbecco′s磷酸鹽緩衝鹽水)以102ml/小時的流率洗脫，然後以每管14.3ml收集。將相似於上述PEG-25集合物(圖40A)的第39-53管合併，發現其中共含有354mg蛋白質。圖8C中顯示了該經過修飾的靈長目動物SCF的體內活性。
實施例13白血病母細胞上的SCF受體表達由混合譜系白血病病人的外周血中收穫白血病母細胞。用密度梯度離心法純化細胞並除去粘附。按實施例7中所述方法碘化人SCF1-164。按已述方法[Broudy，Blood,75,1622-1626(1990)]將細胞與不同濃度碘化的SCF一起保溫。該受體結合實驗的結果示於圖41中。估計受體密度約為70,000個受體/細胞。
實施例14大鼠SCF對早期淋巴樣前體細胞的活性在小鼠骨髓的瓊脂膠培養物中研究了重組體大鼠SCF1-164(rrSCF1-164)與IL-7協同作用以提高淋巴樣細胞增殖的能力。該試驗中，只加rrSCF1-164所形成的集落含有單核細胞、嗜中性白細胞和母細胞，而單用IL-7或與rrSCF1-164聯合刺激的集落則主要含有前B細胞。使用螢光標記的抗B220抗原[Coffman,Immunol.Rev.,69,5(1982)和抗表面Ig(FITC-羊抗-K,SouthernBiotechnology Assoc.,Birmingham,AL)抗體對合併的細胞進行FACS分析，鑑定特徵為B220+、sIg-、Cu+的前B細胞；並使用螢光標記的抗體(TRITC-羊抗-μ,Southern BiotechnologyAssoc.，)對胞漿μ表達進行Cytospin玻片分析。重組人IL-7(rhIk-7)得自Biosource International(Westlake Village,CA)。當將rrSCF1-164與前B細胞生長因子結合加入時，可觀察到其對集落形成有協同促進作用(表16)，進而表明rrSCF1-164對早期B細胞的祖細胞有刺激作用。
表16:rrSCF1-164與hIL-7對前B細胞集落形成的刺激作用生長因子集落數1鹽水 0rrSCF1-164200ng 13±2100ng 7±450ng 4±2rhIL-7 200ng 21±6100ng 18±650ng 13±625ng 4±2rhIL-7 200ng+rrSCF1-164200ng60±0100ng+ 200ng48±4850ng+200ng24±1025ng+200ng21±21每5×104個鋪板的小鼠骨髓細胞形成的集落數。
各數值均為三份重複樣品的平均值±SD。
實施例15SCF受體的鑑定A．C-kit是SCF1-164的受體為試驗SCF1-164是否為C-kit的配體，使用得自SCF1-164反應性肥大細胞系MC/9[Nabel et al.,Nature 291,332-334(1981)的DNA與根據已公開之順序設計的引物進行PCR反應，以擴增整個小鼠C-kit[Qiu et al,EMBO J.7,1003-1011(1988]的cDNA。使用相似技術克隆來自人紅白血病細胞系HEL[Martinand Papayannopoulou,Science,216,1233-1235(1982)],由胺基酸1-549編碼的人c-kit的配基結合和跨膜區域[Yarden etal.,EMBO J.,6,3341-3351(1987)]。將c-kit cDNA插入轉染到COS-1細胞內的哺乳動物表達載體V19.8中，並按照下文B和C部分所述的方法，製備使用大鼠或人125I-SCF1-164進行結合試驗的膜材料。表17顯示了典型結合試驗的數據。其中未測知125I人SCF1-164能特異地結合到只用V19.8轉染的COS-1細胞上。但表達人重組C-kit配基結合加跨膜區(hckit-LTI)的COS-1細胞則結合了125I-hSCF1-164(表17)。加入200倍摩爾過量的未標記人SCF1-164可降低結合至本底水平。相似地，用全長小鼠c-kit(mckit-L1)轉染的COS-1細胞可與大鼠125I-SCF1-164結合。在只用V19.8轉染的COS-1細胞中可檢測到小量大鼠125I-SCF1-164結合，而且也已在未轉染的細胞中觀察到相似結果(未示出)，此表明COS-1細胞可表達內源性c-kit。這一發現是與c-kit表達的廣泛細胞分布相一致的。大鼠125I-SCF1-164可相似地與人和小鼠c-kit結合，而人125I-SCF1-164則以較低活性與小鼠c-kit結合(表17)。這一數據符合於種間SCF1-164交叉反應性的特徵。大鼠SCF1-164可誘導人骨髓的增殖，其比活性相似於人SCF1-164；而人SCF1-164則可誘導小鼠肥大細胞的增殖，其比活性比大鼠蛋白質小800倍。
總之，這些發現進一步證實由W或S1突變小鼠表達的表型異常是c-kit受體/配基相互作用之基本缺陷的結果，而這些對於各種各樣細胞型的發育都是很關鍵的。
表17:SCF1-164與COS-1細胞內表達之重組c-kit的結合轉染的質粒 結合的CPMa人SCF1-164大鼠SCF1-164125I-SCFb125I-SCF+Coldc125I-SCFd125I-SCF+ColdeV19.8 2,160 2,150 1,100 550V19.8:hckit-LT1 59,3502,380 70,000 1,100V19.8:mckit-L1 9,500 1,100 52,700 600a．顯示重複測定的平均值；已獨立完成實驗，且三次結果均相似。b．1.6nM人125I-SCF1-164c．1.6nM人125I-SCF1-164+320nM未標記的人SCF1-164d．1.6nM大鼠125I-SCF1-164e．1.6nM大鼠125I-SCF1-164+320nM未標記的大鼠SCF1-164B．COS-1細胞中重組c-kit的表達分別由人紅白血病細胞系HEL和MC/9細胞中經酸性苯酚/氯仿提取法[Chomczynsky and Sacchi,Anal.Biochem.,162,156-159(1987)]分離總RNA,然後用PCR技術[Saiki et al.,Science,239,487-491(1988)]從中分別得到人和小鼠c-kitcDNA克隆。根據已公開的人和小鼠c-kit順序設計有獨特順序的寡核苷酸。使用c-kit反義寡核苷酸作引物，依照已述使用酶，Mo-MLV反向轉錄酶(Bethesda Research Laboratories,Bethesda,MD)的方法由總RNA合成第一股cDNA。使用適當的c-kit引物對，擴增c-kit配基結合區和酪氨酸激酶區的交迭區域。將這些區域克隆到適於在COS-1細胞內表達的哺乳動物表達載體V19.8中(
圖17)。對幾個克隆的DNA順序分析結果表明，RCR擴增期間各克隆可能產生獨立突變。通過裝配來自分立之克隆的非突變限制片段，而構建成一個沒有這些突變的克隆。在所有或大約一半的克隆中，出現了不同於已公開之順序的某些差異，這些可能是所用細胞系內存在的真正順序差異，並可能代表了不同於已公開順序的等位基因差異。在V19.8中構建了下列質粒V19.8:mckit-LT1，其為完整的小鼠c-kit；以及V19.8:hckit-L1，其含有人c-kit的配基結合加跨膜區(胺基酸1-549)。
大致按實施例4中所述方法將質粒轉染到COS-1細胞中。C．125I-SCF1-164與表達重組c-kit之COS-1細胞的結合轉染兩天後，從培養皿上刮下COS-1細胞，在PBS中洗滌並冷凍備用。熔融後，將細胞懸浮在含有1mM PMSF、100μg/ml aprotinin、25ug/ml抑酶醛肽、2μg/ml抑胃肽和200μg/ml TLCK-HCl的10mM Tris-HCl、1mM MgCl2中。用吸管吸入並滴下5次以使懸液分散均勻，在冰上保溫15分鐘，然後用Dounce勻漿器上下往復15-20次將細胞製成勻漿。向勻漿液內加入蔗糖(250mM)，並離心(500g,5分鐘)沉澱出核和殘留未破碎的細胞。再以25,000g離心(4℃)30分鐘進一步除去殘留的細胞碎片。使用氯胺T法[Hunterand Greenwood,Nature,194,495-496(1962)]以放射性碘標記人和大鼠SCF1-164。在含有RPMI培養基並添加1％牛血清白蛋白和50mM HEPES(pH7.4)的結合緩衝液中，加或不加200倍過量(摩爾量)的未標記SCF1-164，使COS-1細胞膜部分與人或大鼠125I-SCF1-164(1.6nM)於22℃下一起保溫1小時。在結合保溫終止時，將膜製劑輕輕鋪敷在150μl鄰苯二甲酸酯油上，並在Beckman微量離心管11中離心20分鐘，直到由游離125I-SCF1-164中分離出膜結合的125I-SCF1-164。剪除沉澱碎片並測定膜結合的125I-SCF1-164。
實施例16分離人SCF cDNAA．HT-1080 cDNA文庫的構建用酸式硫氰酸鈲-苯酚-氯仿提取法[Chomczynski et al.,Anal.Biochem.162,156(1987)]由人纖維肉瘤細胞系HT-1080(ATCC CCL121)中分離總RNA，並使用購自Clontech公司的Oligo(dT)柱回收poly(A)RNA。在提供者推薦的條件下，用BRL(Bethesda Research Laboratory)cDNA合成試劑盒由2μg poly(A)RNA製備雙鏈cDNA。將大約100ng平均大小約2kb的柱分離之雙鏈cDNA連接到300ng Sa1Ⅰ/NotⅠ消化的載體pSPORT1[D′Alessio et al.,Focus,12,47-50(1990)]上，並用電穿孔法[Dower et al.,Nucl.Acids Res.,16,6127-6145(1988)]轉化到DH5α(BRL,Bethesda,MD)細胞中。B．cDNA文庫的篩選將大約2.2×105個初級轉化體分成44份，各含有～5000個克隆。用已述的CTAB-DNA沉澱法[Del Sal etal.,Biotechniques,7,514-519(1989)]由各份集合物中製備質粒DNA。由各質粒DNA池中各取2μg用限制酶NotⅠ消化並經凝膠電泳分離之。將線性化DNA轉移到Gene Screen Plus膜(DuPont)上，在前述條件下[Lin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7580-7584(1985)]與32P標記的PCR產生的人SCF cDNA(實施例3)雜交。根據雜交結果鑑定出三個含陽性信號的集合物。以集落雜交法[Lin et al.,Gene,44,201-209(1986)]再次篩選這些集落集合物，直至由其中各自得到單個集落。這三個分別克隆之cDNA的大小約在5.0到5.4kb之間。對5-未端所作限制酶消化和核苷酸順序測定的結果表明，其中有兩個克隆是相同的(10-1a和21-7a)。它們均含有編碼區和大約200bp的5′非翻譯區(5′UTR)。第三個克隆(26-1a)5′端約比另外兩個克隆短400bp。該人SCF cDNA的順序示於圖42中。應特別提到的是，疏水跨膜區順序由胺基酸186-190的區域開始並終止在胺基酸212處。C．pDSRα2 hSCF1-248的構建按下述方法使用質粒10-1a(見實施例16B)和pGEM3hSCF1-164製得pDSRα2 hSCF1-248將得自pGEM3hSCF1-164的HindⅢ插入段轉移到M13mp18上。使用反義寡核苷酸
5′-TCT TCT TCA TGG CGG CGG CAA GCT T 3′和購自Amersham公司的寡核苷酸指導的體外誘交系統試劑盒及操作程序，經定點誘變將ATG起始密碼子相連的上遊核苷酸由tttccttATG改變為gccgccgccATG，以產生M13mp18hSCFK1-164。用HindⅢ消化該DNA並插入已用HindⅢ消化的pDSRα2中。該克隆被稱為pDSRα2hscFK1-164用XbaⅠ消化pDRα2hSCFK1-164的DNA並加入Klenow酶和四種dNTP將此DNA修成平頭。該反應終止後，進一步用SpeⅠ酶消化之。用DraⅠ消化克隆10-1a以在插入段內產生3′端至開放讀碼的平頭，同時用可在pDSRα2 hSCFK1-164和10-1a之基因內同一位點切割的SpeⅠ酶消化之。將這些DNA連接在一起，以得到pDSRα2 hSCFK1-248。D．用pDSRα2 hSCFK1-248DNA轉染並免疫沉澱COS細胞用如上構建的DNA轉染COS-7(ATCC CRL1651)細胞。用10μg pDSRα2 hSCFK1-248DNA或10μg pDSRα2載體DNA(載體對照)以1600V對0.8mlDMEM+5％FBS中的4×106個細胞進行電穿孔。電穿孔後，將細胞重新鋪敷在兩個60mm培養皿中。24小時後更換新鮮培養基。
轉染72小時後，按照改良的Yarden等人的方法(PNAS,87,2569-2573,1990)用35S-培養基標記各培養皿。用PBS洗細胞(一次)，然後加入無蛋氨酸、無半胱氨酸DMEM(met-cys-DMEM)保溫30分鐘。除去培養基後向各平皿內加入1ml含100μCi/ml Tran35S標記(ICN)的met-cys-DMEM。於37℃下保溫8小時。收穫培養基，離心除去細胞碎片並於-20℃下冷凍保存。
按照Yarden等人改良的方法(EMBO,J.,6,3341-3351,1987),將COS/pDSRα2 hSCFK1-248和COS/pDSRα2載體對照的標記的條件培養基等分樣品與35S-標記的CHO/pDSRα2 hSCF1-164克隆17細胞(見實施例5)一起進行免疫沉澱。用10μl預免疫兔血清(＃1379P.I.)處理各1ml條件培養基樣品。樣品於4℃下保溫5小時。向各管內加入100微升在0.15M NaCl、20mM Tris(PH7.5)、0.2％Triton X-100中的金黃色葡萄球菌(Pansor-bin,Calbiochem.)的10％懸浮液。樣品於4℃下繼續保溫1小時。以13,000g離心5分鐘以沉澱免疫複合物。將上清移入新的試管中，並與5μl實施例11中純化的、抗CHO衍生之hSCF1-162的兔多克隆抗血清4℃下保溫過夜。加入100μl Pansorbin保溫1小時，並按前述方法沉澱免疫複合物。沉澱物用溶解緩衝液(0.5％脫氧膽酸鈉、0.5％NP40、50mM NaCl、25mM Tris,pH8)洗1次，用洗滌緩衝液(0.5M NaCl、20mM Tris pH7.5、0.2％Triton X-100)洗3次，再用20mM Tris(pH7.5)洗1次。然後懸浮於50μl 10mM Tris pH7.5、0.1％SDS、0.1M β-巰基乙醇中。經煮沸5分鐘洗提SCF蛋白。樣品以13,000g離心5分鐘，然後回收上清液。
按下述方法完成糖苷酶處理過程向25μl免疫複合物樣品中加入3微升含1.6mU O-聚糖酶、0.5UN-聚糖酶和0.02U神經氨酸苷酶的75mM CHAPS，並於37℃下保溫3小時。加入等體積2×PAGE樣品緩衝液並將樣品煮沸3分鐘。經消化和未經消化的樣品均在15％SDS聚丙烯醯胺還原凝膠上以8mA電泳過夜。在甲醇-乙酸中固定凝膠，用Enlightening增強劑(NEN)處理30分鐘、乾燥並於-70℃下與Kodok XAR-5膠片接觸曝光。
圖43顯示所得的放射自顯影圖譜。泳道1和2是對照COS/pDSRα2培養物樣品；泳道3和4得自COS/pSRα2hSCFk1-248；泳道5和6得自CHO/pDSRα2 hSCF1-164。泳道1、3和5是未經消化的免疫沉澱物；泳道2、4和6是已用聚糖酶消化過的(見上述)。分子量標誌物的位置示於左側。SCF在pDSRα2 hSCFK1-248轉染的COS細胞內的加工非常類似於由pDSRα2 hSCF1-164轉染之CHO細胞分泌的hSCF1-164(實施例11)。這一現象提示由細胞釋放的SCF天然蛋白水解加工位點是在胺基酸164附近。
實施例17人SCF的四級結構分析校準按實施例1所述用於由BRL細胞培養基中純化SCF的凝膠過濾柱(ACA 54)(加有分子量標準品)，並由其他校準的凝膠過濾柱洗脫純化的SCF後，可以看出由BRL細胞培養基純化的SCF相對於分子量標準品，表觀分子量約為70,000-90,000。反之，經SDS-PAGE分析測得的表觀分子量約為28,000-35,000。雖然可以了解到糖基化蛋白質在此種分析中可能有異常行為，但這些結果卻提示，在菲變性條件下，BRL衍生的大鼠SCF可以作為非共價結合的二聚體存在。重組SCF形式(如由大腸桿菌產生的大鼠和人SCF1-164和得自CHO細胞的大鼠和人SCF1-162)也顯示相似結果，其中在非變性條件下以凝膠過濾法估計的分子大小約為在變性條件下(如存在SDS)以凝膠過濾法或特殊情況時使用SDS-PAGE法估計的分子大小的兩倍。另外用沉降速度分析法(該方法可準確地測定溶液中材料的分子量)測得大腸桿菌產生之重組人SCF1-164的分子量約為36,000。該值仍約為SDS-PAGE測得值(約18,000～19,000)的兩倍。因此，儘管存在多種寡聚態(包括一聚態)，但在一定的溶解條件下顯然以二聚態佔優勢。
實施例18分離得自5637細胞系的人SCF cDNA克隆A．5637 cDNA文庫的構建用酸性硫氰酸鈲-苯酚-氯仿提取法[Chomczynski et al.,Anal.Biochem.,162,156(1987)]由人膀胱癌細胞系5637(ATCCHTB-9)中分離總RNA，並使用購自Clontech的Oligo(dT)柱回收poly(A)RNA。在提供者推薦的條件下用BRL cDNA合成試劑盒由2μg poly(A)RNA製備雙鏈cDNA。將經80ng約經柱層析分離的、平均大小為2kb的雙鏈cDNA連接到300ng SalⅠ/NotⅠ消化的載體pSPORTl(D′Alessio et al.,Focus,12,47-50(1990)]上並用電穿孔法[Dower et al.,Nucl.AcidsRes.,16,6127-6145(1988)]轉化到DH5α細胞中。B．cDNA文庫的篩選將大約1.5×105個初級轉化體分成30份集合物，其中各約含5,000個克隆。用已述的CTAB-DNA沉澱法[Del Salet al.,Biotechniques,7,517-519(1989)]由各集合體製備質粒DNA。各取2微克質粒DNA用限制酶NotⅠ消化並以凝膠電泳法分離之。將線性化的DNA轉移到Gene Screen Plus膜(DuPont)上，並於前述條件[Lin et al.,PNAS USA,82,7580-7584(1985)]下與32P標記的得自HT1080細胞系(實施例16)的全長人SCF cDNA雜交。根據雜交結果鑑定出七份含陽性信號的集合物。用32P標記的PCR、經集落雜交法[Lin et al.,Gene,44,201-209(1986)]產生的人SCF cDNA再次篩選集落池(集合物)，直到由四個集落池中得到單個集落。這四個分離的克隆之插入段的大小約為5.3kb。對克隆之5′端所作限制酶消化及核苷酸順序分析表明，這四個克隆都是相同的。圖44中顯示了該人cDNA的順序。圖44所示cDNA編碼的多肽中，圖42所示順序的胺基酸149-177被一個Gly殘基所取代。
實施例19致死量放射線照射後SCF提高存活期的作用A．致死放射線照射後，SCF對存活期的影響試驗了致死量放射線照射後，SCF對小鼠存活期的影響。所用小鼠為10至12周令雌性Balb/c。所有實驗中小鼠均按5隻一組，各實驗內所用小鼠的體重均相近。以850或950拉得(rad)為一次劑量照射小鼠。單用因子或因子加正常Balb/c骨髓細胞注射。第一種情況下，於照射後24小時給小鼠靜脈內注射由大腸桿菌中純化並按實施例12所述加聚乙二醇修飾的大鼠PEG-SCF1-164(20μg/Kg)，或注射鹽水作為對照組。對於骨髓移植模型，則於照射後4小時注射各種細胞劑量的正常Balb/c骨髓。為了用大鼠PEG-SCF1-164處理，於注射前向細胞懸液內加入200μg/Kg大鼠PEG-SCF1-164，然後再以因子加細胞作一次靜脈注射。
850拉得照射後，給小鼠注射大鼠PEG-SCF1-164或鹽水。結果如圖45所示。與對照組動物相比，注射大鼠PEG-SCF1-164可顯著延長小鼠的存活時間(P＜0.0001)。注射鹽水小鼠的平均存活7.7天，而注射大鼠PEG-SCF1-164者則平均存活9.4天(圖45)。圖45所示結果代表了對每個處理組30隻小鼠，共四次實驗的總結。
用大鼠PEG-SCF1-164處理小鼠提高了存活期，此提示SCF對被照射小鼠之骨髓細胞的影響。對這些動物之血象參數的初步研究顯示，在照射後5天時血小板水平較對照組稍有增加，而在照射後7天時則與對照組無明顯差異。已測知PBC或WBC水平或骨髓細胞活力無差異。B．用SCF處理之接受移植小鼠的存活期將10％劑量的正常Balb/c骨髓細胞移植到經過850拉得射線照射的小鼠體內，結果可挽救90％或更多的動物(數據未示出)。因此使用850拉得的照射劑量和5％的移植物劑量來研究大鼠PEG-SCF1-164對存活期的影響。這一細胞劑量是可行的，這樣較大比例未接受SCF的小鼠將不能存活；如大鼠PEG-SCF1-164能刺激被移植的細胞，存活期便可增加。如圖46所示，約30％的對照組動物於照射後存活了8天。用PEG-SCF1-164處理，則使這些小鼠中95％以上的存活期顯著提高到至少30天(圖46)。圖46所示結果代表對對照組和大鼠PEG-SCF1-164處理組各20隻小鼠所作的4次實驗的總結。在使用更高照射劑量時，用大鼠PEG-SCF1-164結合骨髓移植物處理動物，也可提高存活期(圖47)。以950拉得照射並移植10％骨髓的對照組小鼠在第8天死亡，而用大鼠PEG-SCF1-164處理的小鼠約有40％存活了20天或更長。只有20％移植了20％骨髓的對照組小鼠存活20天以上，而rSCF處理組則有80％存活20天以上(圖47)。
實施例20抗SCF單克隆抗體的生產8周令雌性Balb/c小鼠(Charles River,Wilmington,MA)皮下注射20μg由大腸桿菌表達的人SCF1-164[在完全弗氏佐劑(H37-Ra；Difco Labaratories,Detroit,MI)中]。於第14、38和57天時將50μg同一抗原加到不完全弗氏佐劑中經皮下給藥作加強免疫。未次注射後3天，殺死兩隻小鼠取其脾細胞，按Nowinski等人所述方法[Virology,93,111-116(1979)]與sp2/0骨髓瘤細胞融合。
用於培養sp2/0和雜交瘤細胞的培養基是添加20％熱失活胎牛血清(Phibro Chem.,Fort Lee,NJ)、110mg/ml丙酮酸鈉、100U/ml青黴素和100mcg/ml鏈黴素(Gibco)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基(DMEM)(Gibco,ChagrinFalls,Ohio)。融合後在含有10-4M次黃嘌呤、4×10-7M氨甲嘌呤和1.6×10-5M胸苷的HAT培養基中培養2周，然後在含有次黃嘌呤和胸苷的培養基中培養2周，以選擇雜交細胞。
按下述方法篩選雜交瘤室溫下用存在於50μl50mM碳酸氫鹽緩衝液(pH9.2)中的0.25μg人SCF1-164(E.coli)致敏聚乙烯小井(Coster,Cambridge,MA)2小時，然後4℃過夜。室溫下用5％BSA(在PBS中)將培養板封閉30分鐘，然後在37℃下與雜交瘤培養物上清液保溫1小時。棄去溶液並使結合的抗體與1∶500稀釋的、結合了辣根過氧化物酶(Boehringer Mannheim Biochemi-cals,Indianapolis,IN)的羊抗小鼠IgG於37℃下保溫1小時。用洗滌溶液(KPL,Gaithersburg,MD)洗培養板後加H2O2和ABTS(KPL)的混合物顯色。測405nm的吸光率(比色)。
同雜交瘤篩選法一樣，用ELISA法試驗分泌抗人SCF1-164(E.coli)特異抗體的雜交瘤細胞培養物，看是否其分泌產物與人SCF1-162(CHO)有交叉反應。用有限稀釋法再次克隆雜交瘤細胞。所試驗的55個小井的雜交瘤上清液與人SCF1-164(E.coli)呈強陽性反應；其中有9個與人SCF1-162(CHO)有交叉反應。
已克隆的幾株雜交瘤細胞如下所示單克隆IgG異型與人SCF1-162(CHO)的反應性4G12-13IgG1無6C9A IgG1無8H7A IgG1有雜交瘤4G12-13和8H7A已於1990年9月26日寄存在ATCC。
* * *雖然本發明已描述了上述優選實施方案，但應明確是，任何改動和變更對本領域技術人員來說都將是顯而易見的。因此，其待批權利要求傾向於復蓋這些等效變動，且後者亦應屬本發明之範圍內的。
權利要求
1．一種生物功能質粒或病毒DNA載體，包括用於在原核或真核宿主細胞中表達一種多肽的DNA序列，所述多肽具有天然存在的幹細胞因子一級結構的全部或部分，和天然存在的幹細胞因子的造血生物活性，所述DNA序列選自(a)
圖14B、
圖14C、
圖15B、
圖15C給出的DNA序列或它們的互補鏈；(b)與(a)中DNA序列雜交的DNA序列或其片段；和(c)如果沒有遺傳密碼的簡併性，可與(a)和(b)中限定的DNA序列雜交的DNA序列，並且所述序列編碼具有所述胺基酸序列的多肽。
2．一種生物功能質粒或病毒DNA載體，包括用於在原核或真核宿主細胞中表達一種多肽的DNA序列，所述多肽具有天然存在的幹細胞因子一級結構的全部或部分，和天然存在的幹細胞因子的造血生物活性，所述DNA序列選自(a)圖42給出的DNA序列或它的互補鏈；(b)與(a)中DNA序列雜交的DNA序列或其片段；和(c)如果沒有遺傳密碼的簡併性，可與(a)和(b)中限定的DNA序列雜交的DNA序列，並且所述序列編碼具有所述胺基酸序列的多肽。
3．一種生物功能質粒或病毒DNA載體，包括用於在原核或真核宿主細胞中表達一種多肽的DNA序列，所述多肽具有天然存在的幹細胞因子一級結構的全部或部分，和天然存在的幹細胞因子的造血生物活性，所述DNA序列選自(a)圖44給出的DNA序列或它的互補鏈；(b)與(a)中DNA序列雜交的DNA序列或其片段；和(c)如果沒有遺傳密碼的簡併性，可與(a)和(b)中限定的DNA序列雜交的DNA序列，並且所述序列編碼具有所述胺基酸序列的多肽。
4．根據權利要求1、2或3的生物功能質粒或病毒DNA載體，其中DNA序列包含一個或多個適於在非哺乳動物細胞中表達的密碼子。
5．根據權利要求4的生物功能質粒或病毒DNA載體，其中DNA序列包含一個或多個適於在大腸桿菌細胞中表達的密碼子。
6．根據權利要求1、2或3的生物功能質粒或病毒DNA載體，其中DNA序列包含一個或多個適於在酵母細胞中表達的密碼子。
7．根據權利要求1、2或3的生物功能質粒或病毒DNA載體，其中DNA序列編碼人SCF的表達。
8．根據權利要求1或2的生物功能質粒或病毒DNA載體，其中DNA序列編碼人SCF多肽的表達，根據圖42的編號，所述多肽選自SCF1-162、SCF1-164、SCF1-165和SCF1-248。
9．根據權利要求3的生物功能質粒或病毒DNA載體，其中DNA序列編碼人SCF多肽的表達，根據圖44的編號，所述多肽選自SCFmet1-157、SCF1-157、SCFmet1-160、SCF1-160、SCFmet1-161、SCF1-161、SCFmet1-220、SCF1-220。
10．根據權利要求1、2或3的生物功能質粒或病毒DNA載體，其中DNA序列編碼所述多肽成熟形式的N末端甲硫氨醯殘基的表達。
11．根據權利要求1-10中任一項的生物功能質粒或病毒DNA載體，其中DNA序列與可檢測標記共價結合。
12．根據權利要求11的生物功能質粒或病毒DNA載體，其中DNA序列被放射性標記。
13．一種原核或真核宿主細胞，其用權利要求1至10中任一項的DNA序列轉化或轉染，使得宿主細胞表達所述多肽產物。
14．根據權利要求13的宿主細胞，其中宿主細胞是大腸桿菌。
15．根據權利要求13的宿主細胞，其中宿主細胞是哺乳動物細胞。
16．一種藥物組合物，其含有有效量的多肽和藥用稀釋劑、佐劑或載體，其中多肽是用特徵如下的方法製備的在適當的營養條件下培養原核或真核宿主細胞，所述細胞用權利要求1至10中任一項的DNA序列轉化或轉染，使得宿主細胞表達所述多肽，分離DNA序列表達的所需多肽產物。
17．用權利要求16中的方法製備的多肽在製備用於向哺乳動物提供造血治療的藥物中的應用。
18．根據權利要求17的應用，其中所述治療選自白血球減少、血小板減少、貧血、移植時促進骨髓的移入、在放射性治療中促進骨髓的恢復、化學品或化療引發的骨髓發育不全或骨髓抑制、使細胞對化療敏感。
19．根據權利要求17的應用，其中造血治療包括向供體施用所述藥物，以在骨髓吸入或外周血leucopheresis後增加用於移植的細胞的數量。
20．用權利要求16中的方法製備的多肽在製備用於向哺乳動物提供如下治療的藥物中的應用治療AIDS、脊髓纖維化、脊髓硬化、骨硬化、轉移性癌、急性白血病、複合性骨髓瘤、何杰金氏病、淋巴瘤、Gaucher氏病、尼曼氏病、累一塞二氏病、頑固性低色貧血、Di Guglielmo綜合症、黑熱病、充血性脾大、黑熱病、類肉瘤、原發性脾各類血細胞減少、粟粒性結核、播散性真菌病、暴發性敗血症、瘧疾、VB12缺乏症、葉酸缺乏症和pyrodoxine缺乏症。
21．用權利要求16中的方法製備的多肽在製備用於向患有神經損傷、不育或腸損傷的哺乳動物提供治療的藥物中的應用。
22．用權利要求16中的方法製備的多肽在製備用於向哺乳動物提供治療低色素生成性疾病的藥物中的應用。
23．根據權利要求17至22中任一項的應用，其中治療包括施用選自EPO、G-CSF、GM-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7和IGF-1的至少一種附加的造血因子。
24．根據權利要求17至22中任一項的應用，其中治療包括施用選自IL-8、IL-9和IL-10的至少一種附加的造血因子。
25．根據權利要求17至22中任一項的應用，其中治療包括施用選自IL一11和LIF的至少一種附加的造血因子。
26．用外源DNA轉染造血細胞的方法，包括(ⅰ)使造血細胞與一種多肽進行培養，所述多肽具有
圖15C、42、44或14C給出的序列一級結構的部分或全部，並具有天然存在的幹細胞因子造血生物活性；(ⅱ)用外源DNA轉染培養的細胞。
27．含有用於培養骨髓細胞或外周血祖細胞的組分的試劑盒，所述試劑盒包括(ⅰ)任選地在藥用載體中的一種多肽，所述多肽具有
圖15C、42、44或14C給出的序列一級結構的部分或全部，並具有天然存在的幹細胞因子造血生物活性；(ⅱ)適於製備用於培養骨髓細胞或外周血祖細胞的培養基的組分。
28．根據權利要求27的試劑盒，其中組分包括選自EPO、G-CSF、GM-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7和IGF-1的至少一種附加的造血因子。
29．根據權利要求27的試劑盒，其中組分包括選自IL-8、IL-9和IL-10的至少一種附加的造血因子。
30．根據權利要求27的試劑盒，其中組分包括選自IL-11和LIF的至少一種附加的造血因子。
31．一種體外培養造血細胞的方法，所述方法包括(ⅰ)將細胞置於適當的培養基中，所述適當培養基含有一種多肽，該多肽具有
圖15C、42、44或14C給出的序列一級結構的部分或全部，並具有天然存在的幹細胞因子造血生物活性；(ⅱ)提供造血細胞生長的適當條件。
32．根據權利要求31的方法，其中適當的培養基含有選自EPO、G-CSF、GM-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7和IGF-1的至少一種附加的造血因子。
33．根據權利要求32的方法，其中附加的造血因子是IL-3、IL-6和G-CSF。
34．根據權利要求31的方法，其中適當的培養基含有選自IL-8、IL-9和IL-10的至少一種附加的造血因子。
35．根據權利要求31的方法，其中適當的培養基含有選自IL-11和LIF的至少一種附加的造血因子。
36．根據權利要求31至35中任一項的方法，其中造血細胞是骨髓細胞。
37．根據權利要求31至35中任一項的方法，其中造血細胞是外周血幹細胞。
38．含有與水溶性聚合物共價結合的多肽的組合物，所述多肽具有
圖15C、42、44或14C給出的序列一級結構的部分或全部，並具有天然存在的幹細胞因子造血生物活性。
39．根據權利要求38的組合物，其中聚合物選自聚乙二醇，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
全文摘要
本發明公開了新的幹細胞因子、編碼這些因子的寡核苷酸,以及其生產方法。還公開了治療與血細胞有關之功能失常的醫藥組合物和治療方法。
文檔編號C12N15/19GK1306007SQ00130978
公開日2001年8月1日 申請日期2000年11月14日 優先權日1989年10月16日
發明者克裡茨汀娜·M·齊塞, 羅伯特·A·博塞曼, 雪梨·沃恩·薩格斯, 弗朗西斯·霍爾·馬丁 申請人:安姆根有限公司