利用集光多發色團的多核苷酸的檢測和分析的方法以及組合物的製作方法

2023-05-01 22:12:56

專利名稱：利用集光多發色團的多核苷酸的檢測和分析的方法以及組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及在樣品中檢測和分析多核苷酸的方法、商品和組合物。
背景技術：
允許實時和高靈敏度地檢測DNA序列的方法具有很大的科學和經濟利益1，2，3。它們的應用包括醫學診斷、遺傳突變的鑑定、基因送遞監控和特定的基因組技術4。陽離子有機染料如溴化乙錠和噻唑橙，當插入雙鏈DNA(dsDNA)的溝槽中時發射，並作為直接的DNA雜交探針而起作用，但是缺乏序列特異性5，6。進行鏈特異性分析的能量/電子傳遞發色團對存在，但需要兩種核酸的化學標記，或相同變化鏈的雙重修飾(例如分子信標)7，8。在標記兩種DNA位點中的困難導致了低得率、高成本和單一標記的雜質，這降低了檢測敏感性9。
本領域需要檢測和分析樣品中特定多核苷酸的方法，以及在這種方法中有用的組合物和生產商品。
發明概述提供檢測和分析樣品中目標多核苷酸的方法、組合物和生產的商品。
將一種懷疑含有目標多核苷酸的樣品與聚陽離子多發色團和一種同該目標多核苷酸互補的傳感器多核苷酸相接觸。傳感器多核苷酸包含一個陰離子主鏈，如一般的磷酸糖類主鏈，並與一種信號發色團綴合。在樣品中目標多核苷酸存在的情況下，信號發色團能夠從激發的聚陽離子多發色團中更有效地獲得能量並發出增加的能夠檢測的光或信號。目標多核苷酸能夠當其在樣品中出現時得到分析，或能夠在分析之前或結合分析進行擴增。
儘管陰離子傳感器能夠與陽離子多發色團在缺少目標的情況下結合，相對於由非互補序列混合物所產生的信號，在結合目標多核苷酸以形成雙鏈複合物之後已發現令人驚訝的信號增強。這種信號的增強能夠用來在測試樣品中目標多核苷酸的檢測方法中進行應用。
提供了含有對於實施本發明方法有用的試劑的溶液，以及含有這種試劑的試劑盒。還提供了由多發色團和傳感器多核苷酸形成的傳感或檢測複合物。這些方法能夠用於多重配置中，其中多個不同的傳感器多核苷酸用於測試多個不同的目標多核苷酸。這些方法能夠任選在一種表面上進行，例如利用一種表面結合的聚陽離子多發色團；該表面可以是一種傳感器。這些方法還能夠以均一的形式提供。本文所述的這些方法和商品能夠用作其它檢測多核苷酸技術的替代物。
附圖簡述

圖1描述了聚合物1和一種螢光素綴合傳感器多核苷酸的吸收(a(點狀線)和c(短劃線))和發射(b(正方形)和d(圓圈))光譜。分別對聚合物1和傳感器多核苷酸於380nm和480nm進行激發。於380nm激發的聚合物1和傳感器多核苷酸的能量傳遞複合物也以黑色(e，實線)顯示。
圖2給出了傳感器系統的發射光譜，所述傳感器系統於pH＝8的10mmol檸檬酸鈉和100mmol氯化鈉緩衝液中包含雜交的(實線)和未雜交的(點狀線)傳感器多核苷酸。光譜相對於聚合物1的發射進行標準化。
圖3描述了由多發色團(聚合物1)的激發以及向傳感器多核苷酸的能量傳遞以及隨後向多核苷酸特異性染料(溴化乙錠)的能量傳遞所產生的傳感器系統的發射光譜，所述傳感器系統包含雜交的(實線)和未雜交的(點狀線)傳感器多核苷酸。測量是在磷酸鉀-氫氧化鈉緩衝溶液(50mM，pH＝7.40)中。見實施例4。
圖4描述了在傳感器系統中一種多核苷酸特異性染料(溴化乙錠，EB)的放大的發射光譜，所述傳感器系統包含雜交的(實線)傳感器多核苷酸。放大的發射信號是多發色團(聚合物1)的激發以及向傳感器多核苷酸的能量傳遞以及隨後向EB的能量傳遞的結果。在雙鏈DNA(點狀線)中的直接的EB發射以及由傳感器多核苷酸激發以及隨後向EB的能量傳遞所產生的發射(短劃線)證明了由聚陽離子多發色團所提供的增強的信號。測量是在磷酸鉀-氫氧化鈉緩衝溶液(50mM，pH＝7.40)中。見實施例5。
圖5給出了在磷酸鉀-氫氧化鈉緩衝溶液(50mM，pH＝7.40)中EB以及雜交的(實線)和未雜交的(點狀線)傳感器多核苷酸都存在的情況下，在聚合物1激發後EB的發射光譜。見實施例6。發射是僅僅在雜交的雙鏈DNA的情況下由聚陽離子多發色團向插入的EB的能量傳遞的結果。
發明詳述目前的DNA和RNA傳感器的技術(包括「基因晶片」和「DNA晶片」)依賴於螢光標記(生光團)與DNA單鏈的共價附著，從而依賴於樣品或樣品組分的標記，具有由樣品間標記反應效率的不同所產生的不可避免的問題，因而需要複雜的相互校準。其它的系統依賴於多重標記的探針(例如，分子信標，Taqman、Scorpion探針、Eclipse探針)，從而需要生光團和猝滅劑與精確設計的序列之間的多重附著。
發明方法包括將樣品與包含至少兩種組分的水溶液相接觸；(a)一種集光的、聚陽離子的、發光的多發色團系統如，例如一種綴合的聚合物、半導體量子點狀或樹狀結構，它是水溶性的，和(b)一種與發光信號發色團(稱作「寡-C*」)綴合的傳感器多核苷酸。具有信號發色團波長特性的光的發射表明具有與傳感器多核苷酸序列互補的鹼基序列的目標多核苷酸溶液的存在。通過利用具有不同鹼基序列和不同信號發色團的多個傳感器多核苷酸(寡1-C1*、寡2-C2*等)，能夠獨立地檢測多個各自具有特異性鹼基序列的多核苷酸。可以引入第三種組分如多核苷酸特異性染料以通過進一步將能量從傳感器多核苷酸傳遞給多核苷酸特異性染料來提高選擇性。
選擇集光發色團和信號發色團(C*)以便兩個物種的吸收波段具有最小的重疊，從而兩個物種的發光發射光譜具有不同的波長。當在水溶液中進行製備時，集光和發光多發色團系統帶正電(例如帶正電的綴合聚合電解質)。通過靜電引力確保帶負電傳感器多核苷酸和帶正電集光和發光多發色團系統之間的接近。當暴露於具有集光發色團吸收波段中波長的入射輻射時，有來自信號發色團的發射，例如通過Frster能量傳遞機制。在加入目標多核苷酸如具有與傳感器多核苷酸序列相互補的鹼基序列的單鏈DNA(ssDNA)之後，ssDNA與傳感器多核苷酸雜交，導致沿著DNA鏈負電荷密度的升高10，11。在這些環境下，並考慮到嚴格的靜電力，傳感器多核苷酸和帶正電的集光多發色團系統之間的相互作用將是有利的，導致有效的能量傳遞和來自信號發色團的強烈發射。當加入具有與傳感器多核苷酸序列不相互補的鹼基序列的ssDNA時，不發生鹼基對雜交。通過與非互補ssDNA的競爭來篩選集光多發色團系統與傳感器多核苷酸之間的靜電絡合。因而，集光多發色團系統和寡-C*之間的平均距離在非互補序列存在的情況下較大，導致較低效率的向信號發色團的能量傳遞。當在其互補目標存在的情況下信號寡-C*的發射比在其非互補鏈存在的情況下要強烈。整個方案提供了一種傳感器以在試驗溶液中檢測具有特異性鹼基序列的目標多核苷酸的存在。通過使用具有不同鹼基序列和不同信號發色團的多個傳感器多核苷酸，能夠單獨檢測多個目標。
除了所述的方法，發明還提供含有至少兩種組分的主要含水的溶液；(a)一種陽離子多發色團，和(b)一種包含與信號發色團綴合的陰離子多核苷酸的「傳感器多核苷酸」(寡-C*)。
如在實施例中所表明的，由水溶性多發色團如綴合的聚合物所提供的光學放大能夠用來檢測多核苷酸與傳感器多核苷酸的雜交。這种放大能夠通過利用較高分子量的水溶性綴合聚合物或其它結構如本文所述的聚陽離子多發色團增強。發明能夠以利用螢光檢測法的簡易性的均一形式提供。發明能夠用於檢測擴增的目標多核苷酸或，由於大的信號放大，用作一種單獨鏈的分析，而不需要多核苷酸的擴增。
不像基因晶片技術，本發明不必需要在分析之前通過將生光團或發色團共價結合到包含於或源於樣品的多核苷酸而對每個待分析樣品進行標記。那些偶聯方法在偶聯效率的重複性上具有固有的困難並且產生對樣品間相互校準的需要。
本文所述的發明對於任何測試都是有用的，在所述測試中能夠關於目標多核苷酸對樣品進行分析。一般的測試包括測定樣品中目標多核苷酸的存在或其相對量，或者測試可以是定量的或半定量的。
發明的方法都能夠以多種形式實施。通過與各個傳感器多核苷酸綴合的不同信號發色團的應用，可以使用多種不同的傳感器多核苷酸來檢測樣品中相應不同的目標多核苷酸。利用2、3、4、5、10、15、20、25、50、100、200、400或更多不同傳感器多核苷酸提供多種方法，所述傳感器多核苷酸能夠同時用來測試相應不同的目標多核苷酸。
這些方法能夠在基片上，以及溶液中實施，儘管由於擴散問題溶液形式預計更快。因而測試能夠，例如，在基片上以陣列形式實施，所述基片可以是一種傳感器。這能夠通過將一種測試組分錨定於或整合入基片，例如傳感器多核苷酸、聚陽離子多發色團或二者之上。這些基片可以是玻璃、矽、紙、塑料的表面，或用作光電轉換器的光電半導體(如，但不限於，摻銦的硝酸鎵或聚合的聚苯胺等)的表面。給定的傳感器多核苷酸的定位可以是已知的或在陣列形式中是可測定的，並且陣列形式可以是可微尋址的(microaddressable)或可納尋址的(nanoaddressable)。在一種變異型中，能夠將一個或多個含有擴增產物的樣品附著於基片，並且基片能夠與一種或多種標記的傳感器多核苷酸以及聚陽離子多發色團相接觸。
在進一步詳述本發明之前，應理解本發明並不限於所述的特定方法、設備、溶液或裝置，因為這些方法、設備、溶液或裝置當然能夠變化。還應理解本文所用的術語僅僅是為了描述特定的實施方案的目的，並不限制本發明的範圍。
單數形式的使用包括複數含義，除非上下文清楚地另外指定。因而，例如，「一種目標多核苷酸」的含義包括多種目標多核苷酸，「一種信號發色團」的含義包括多種這類發色團，「一種傳感器多核苷酸」的含義包括多種傳感器多核苷酸等。此外，特定複數寫法，如「二」、「三」等的使用理解為相同事物的較大數目，除非上下文清楚地另外指定。
術語如「連接的」、「附著的」和「鍵合的」在本文中可交換使用並且包括直接以及間接的連接、附著、鍵合或綴合，除非上下文清楚地另外指定。當敘述一個範圍的值時，應理解在所敘述的該範圍的上限和下限之間的每一個中間整數值及其每個分數值也與這些值之間的小範圍一起得到具體地公開。任何範圍的上限和下限都能夠獨立地包括在該範圍之內或排除於該範圍之外，並且每個其中包括一個、零個或兩個界限的範圍也包括在發明之內。在討論值具有固有的界限時，例如在一種組分能夠以0-100％的濃度存在時，或在水溶液的pH值能夠由1到14時，對那些固有的界限進行具體地公開。在明確敘述一個值時，應理解與所敘述的值相同量的值也在發明的範圍內，基於該值的範圍也在發明的範圍內。當公開一種組合時，該組合的要素的每種亞組合也得到具體地公開並且在發明的範圍之內。相反地，在公開了不同的要素或要素組時，其組合也得到公開。在一個發明的任何要素公開為具有多個選擇時，該發明的實施例也由此得到公開，所述發明中單一地將每一種選擇或與其它選擇組合排除在外；一個發明的一種以上的要素能夠具有這類排除，並且由此也公開了具有這類排除的要素的所有組合。
除非另外定義或上下文清楚地另外指定，本文所用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域普通技術人員所通常理解的相同意義。儘管能夠將與本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料用於發明的實施或測試上，現在還是要描述優選的方法和材料。
為了公開和描述參考文獻所引的特定的材料和方法，在此將所提及的所有出版物引入作為參考。本文所討論的出版物僅是基於其公開內容在本申請的申請日之前而提供。本文沒有內容可以解釋為承認本發明無權依靠優先權發明而早於這些公開內容。
定義在描述本發明中，將會用到以下術語，並且如下所示進行定義。
術語「多核苷酸」、「寡核苷酸」、「核酸」和「核酸分子」在本文中可以交換使用指一種任何長度的核苷酸的聚合形式，並且可以包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸及其類似物，或其混合物。這些術語僅指分子的一級結構。因而，這些術語包括三鏈、雙鏈和單鏈脫氧核糖核苷酸(「DNA」)，以及三鏈、雙鏈和單鏈核糖核苷酸(「RNA」)。它還包括多核苷酸的例如通過烷基化和/或通過加帽反應修飾的和未修飾的形式。
不論是修飾的還是未修飾的，傳感器多核苷酸都是陰離子化的並且能夠在不存在目標多核苷酸的情況下與陽離子多發色團相互作用。目標多核苷酸在理論上能夠加上電荷或去除電荷，儘管它一般預期是陰離子化的，例如RNA或DNA。
更具體地，術語「多核苷酸」、「寡核苷酸」、「核酸」和「核酸分子」包括多脫氧核糖核苷酸(包含2-脫氧-D-核糖)，多核糖核苷酸(包含D-核糖)，包括剪接的或未剪接的tRNA、rRNA、hRNA和mRNA，和其它類型的嘌呤或嘧啶鹼基的N-或C-糖苷多核苷酸，和其它包含磷酸或其它聚陰離子主鏈的聚合物，和其它合成的序列特異性核酸聚合物，前提是該聚合物包含構型允許如在DNA或RNA中所發現的鹼基配對和鹼基堆積的核鹼基。在術語「多核苷酸」、「寡核苷酸」、「核酸」和「核酸分子」，之間沒有長度上的區別，且這些術語在本文可互換使用。這些術語僅僅指分子的一級結構。因而，這些術語包括，例如3』-脫氧-2』，5』-DNA、寡脫氧核糖核苷酸N3』P5』氨基磷酸酯、2』-O-烷基取代RNA、雙鏈和單鏈DNA，以及雙鏈和單鏈RNA，及其雜交物包括例如DNA和RNA之間的雜交物，並且還包括已知類型的修飾，例如標記、烷基化、「帽」、一個或多個用類似物進行的核苷酸的替代，核苷酸間修飾如，例如那些以帶負電的鍵合(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)進行的修飾、那些包含側基部分例如蛋白質(包括酶(例如核酸酶)、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等)的修飾、那些包含插入物(例如，吖啶、補骨脂素等)的修飾、那些包含螯合物(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、那些包含烷基化物的修飾、那些具有改進的鍵合(例如，α異頭核酸等)的修飾、以及多核苷酸或寡核苷酸的未修飾形式。
應當理解如本文所用的術語「核苷」和「核苷酸」將包括那些不但包含已知的嘌呤和嘧啶鹼基，還包含其它已進行修飾的雜環鹼基的部分。這類修飾包括甲基化的嘌呤或嘧啶、醯化的嘌呤或嘧啶，或其它雜環。經修飾的核苷或核苷酸還能夠包括在糖部分上的修飾，例如，其中一個或多個羥基為滷素、脂肪族所取代，或功能化為醚、胺等。術語「核苷單位(nudeotidic unit)」包括核苷和核苷酸。
另外，對核苷單位的修飾包括重排、添加、替代或在嘌呤或嘧啶鹼基上改變功能基，所述功能基與各自互補的嘧啶或嘌呤形成氫鍵。得到的經修飾的核苷單位可以任選地與其它這種經修飾的核苷單位但不與A、T、C、G或U形成鹼基對。可以整合不會阻止多核苷酸功能的脫鹼基位點；優選多核苷酸不包含脫鹼基位點。在多核苷酸中的一些或全部殘基能夠任選以一種或多種方式進行修飾。
在允許形成分別在胸腺嘧啶核苷的N3-H和C4-氧與腺嘌呤核苷的N1和C6-NH2之間和分別在胞嘧啶核苷的C2-氧、N3和C4-NH2與鳥嘌呤核苷的C2-NH2、N′-H和C6-氧之間的氫鍵的條件下，標準的A-T和G-C鹼基對形成。因而，可以修飾鳥嘌呤核苷(2-氨基-6-氧-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)以形成異鳥嘌呤核苷(2-氧-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)。這種修飾產生了一種核苷鹼基，它不再有效地與胞嘧啶形成標準的鹼基對。但是，修飾胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氧-4-氨基-嘧啶)以形成異胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧-嘧啶)產生一種修飾的核苷酸，它將不會有效地與鳥嘌呤核苷形成鹼基對但將與異鳥嘌呤核苷形成鹼基對。異胞嘧啶由Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)可購得；異胞嘧啶核苷可以通過Switzer等(1993)Biochemistry 3210489-10496和其中引用的參考文獻中所述的方法製備；2′-脫氧-5-甲基-異胞嘧啶核苷可以通過Tor等(1993)J.Am.Chem.Soc.1154461-4467和其中引用的參考文獻的方法製備；而異鳥嘌呤核苷酸可以利用Switzer等(1993)，同上，和Mantsch等(1993)Biochem.145593-5601所述的方法，或通過在授予Collins等的美國專利號5,780,610中所述的方法製備。其它非天然的鹼基對可以通過在Piccirilli等(1990)Nature34333-37中所述的合成2，6-二氨基嘧啶及其互補體(1-甲基吡唑-[4，3]嘧啶-5，7-(4H，6H)-二酮)的方法進行合成。其他這種形成獨特鹼基對的修飾的核苷單位是已知的，如在Leach等(1992)J.Am.Chem.Soc.1143675-3683和Switzer等，同上中所描述的。
「優選結合」或「優先雜交」指與樣品中非互補性聚合物相比，一種多核苷酸或PNA結合到樣品中它的互補體上的增強的傾向。
雜交條件將一般包括小於大約1M的鹽濃度，更通常小於大約500mM並且優選小於大約200mM。在肽核酸和多核苷酸之間雜交的情況下，雜交能夠在含有小量或不含鹽的溶液中進行。雜交溫度能夠低至5℃，但一般大於22℃，更通常大於大約30℃，並且優選超過大約37℃。較長的片段可以需要較高的雜交溫度以進行特異性雜交。其它因素可以影響雜交的嚴格性，包括鹼基組成和互補鏈的長度，有機溶劑的存在以及鹼基錯配的程度，並且所用參數的組合比任何單一參數的絕對測量更加重要。對於一種給定測試形式的適當的雜交條件能夠由本領域技術人員進行測定；可以進行調節的非限制性參數包括測試組分的濃度、所用的鹽及其濃度、離子強度、溫度、緩衝液類型和濃度、溶液pH、降低背景結合封閉劑如重複序列或封閉蛋白質溶液的存在和濃度、去汙劑的類型和濃度、提高多核苷酸相對濃度的分子如聚合物、金屬離子及其濃度、螯合劑及其濃度，以其其它本領域公知的條件。
「多重性的」在此指一種測試或其它分析性方法，其中能夠同時測試多個被分析物。
「任選的」或「任選地」意為隨後所述的事件或環境可以發生或可以不發生，以及說明書包括發生了事件或環境的情況和其未發生的情況。
樣品含有或懷疑含有目標多核苷酸的樣品的部分能夠是任何來源的生物學材料，它含有能夠直接或間接獲自一種活體生物的多核苷酸，所述生物包括細胞、組織或流體，以及由該生物所遺留的沉積物，包括病毒、支原體和化石。樣品可以包含通過合成方法製備的完整的或部分的多核苷酸。一般地，樣品在一種主要含水的介質中獲得或分散在該介質中。樣品的非限制性例子包括血液、尿液、精液、乳、痰、粘液、口腔棉拭、陰道棉拭、直腸棉拭、吸出物、針刺活組織檢查、例如通過外科手術或屍體解剖所獲組織的切片、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外分泌物、眼淚、口水、腫瘤、器官、體外細胞培養組分樣品(包括但不限於源自細胞培養基中細胞生長的條件培養基、推定為病毒感染的細胞、重組細胞和細胞組分)以及包含多核苷酸序列的重組文庫。樣品可以存在於本文所述基片上。基片可以是包含樣品的載玻片，如用在螢光原位雜交(FISH)中的載玻片。
樣品可以是一種陽性對照樣品，它已知包含目標多核苷酸或其替代品。也能夠使用一種陰性對照樣品，儘管預期其不含目標多核苷酸，但懷疑包含它(通過一種或多種試劑的汙染)或能夠產生假陽性的其它組分，並通過用於給定分析中的試劑的目標多核苷酸進行試驗從而確認沒有汙染，以及測定一套給定的分析條件是否產生假陽性(即使在樣品中沒有目標多核苷酸的情況下的陽性信號)。
樣品能夠進行稀釋、溶液、懸浮、提取或另外進行處理來溶解和/或純化任何存在的目標多核苷酸或使它易為用於擴增方案中的試劑或檢測試劑所接近。在樣品包含細胞的情況下，能夠將細胞裂解或透化以釋放細胞內的多核苷酸。能夠使用一步透化緩衝液裂解細胞，它允許在裂解後直接進行進一步的步驟，例如聚合酶鏈反應。
目標多核苷酸和由其產生的擴增產物目標多核苷酸可以是單鏈的、雙鏈的，或更高級的，並可以是線性的或環狀的。例示性的單鏈目標多核苷酸包括mRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、ssRNA或ssDNA病毒基因組，儘管這些多核苷酸可以包含內部互補序列和顯著的二級結構。例示性的雙鏈目標多核苷酸包括基因組DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、dsRNA或dsDNA病毒基因組、質粒、噬菌體和類病毒。目標多核苷酸能夠合成製備或由生物來源純化。可以對目標多核苷酸進行純化以去除或減少一種或多種不希望的樣品組分或濃縮目標多核苷酸。相反地，在目標多核苷酸太濃而不能進行特定分析的情況下，可以稀釋目標多核苷酸。
在樣品收集和任選的核酸提取之後，含有目標多核苷酸的樣品核酸部分能夠進行一種或多種預備性反應。這些預備性反應能夠包括體外轉錄(IVT)、標記、片段化、擴增和其它反應。能夠在檢測和/或擴增之前首先以反轉錄酶和引物處理mRNA以產生cDNA；這能夠在體外以純化的mRNA進行或原位進行，例如在附著於載玻片上的細胞或組織中。核酸擴增提高了目的序列如目標多核苷酸的拷貝數。多種擴增方法適於應用；適合的擴增反應的非限制性例子包括聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、自動維持序列擴增(3SR)、基於核酸序列的擴增(NASBA)、Q Beta複製酶的使用、反轉錄、切口平移等。
在目標多核苷酸為單鏈的情況下，擴增的第一個循環形成了與目標多核苷酸互補的引物延伸產物。如果目標多核苷酸為單鏈RNA，在第一擴增中使用具有反轉錄酶活性的聚合酶以將RNA反轉錄成DNA，另外的擴增循環就能夠進行以拷貝引物延伸產物。PCR的引物當然必須設計為與在其相應模板中將產生可擴增片段的區域雜交；因而，每個引物必須雜交以便其3』核苷酸與在其互補模板鏈中的一個核苷酸配對，所述核苷酸位於用來在PCR中複製該互補模板的引物的3』核苷酸的3』。
目標多核苷酸一般通過將一種或多種目標多核苷酸的鏈與引物和聚合酶相接觸來擴增，所述聚合酶具有延伸引物並拷貝目標多核苷酸以生產全長互補的多核苷酸或其較小部分的活性。可以使用任何具有能夠拷貝目標多核苷酸的聚合酶活性的酶，包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、反轉錄酶、具有一種以上類型聚合酶活性的酶，並且酶可以是不耐熱的或熱穩定的。還能夠使用酶的混合物。例示性的酶包括DNA聚合酶如DNA聚合酶I(″PolI″)、PolI的克列諾片段、T4、T7、SequenaseT7、SequenaseVersion 2.0T7、Tub、Taq、Tth、Pfx、Pfu、Tsp、Tfl、Tli和火球菌屬物種(Pyrococcus sp) GB-D DNA聚合酶；RNA聚合酶如大腸桿菌(E.coli)、SP6、T3和T7RNA聚合酶；和反轉錄酶如AMV、M-MuLV、MMLV、RNAse、H-MMLV(SuperScript)、SuperScriptII、ThermoScript、HIV-1和RAV2反轉錄酶。所有這些酶都是商業上現有的。具有多重特異性的例示性聚合酶包括RAV2和Tli(exo-)聚合酶。例示性的熱穩定聚合酶包括Tub、Taq、Tth、Pfx、Pfu、Tsp、Tfl、Tli和火球菌屬物種GB-D DNA聚合酶。
選擇適當的反應條件以允許進行目標多核苷酸的擴增，包括pH、緩衝液、離子強度、一種或多種鹽的存在和濃度、反應物和輔因子如核苷酸和鎂和/或其它金屬離子(例如，錳)的存在和濃度、任選的助溶劑、溫度、包含一個聚合酶鏈反應的擴增方案的熱循環曲線，並且可以部分依賴所用的聚合酶以及樣品的性質。助溶劑包括甲醯胺(一般於大約2％到大約10％)、甘油(一般於大約5％到大約10％)和DMSO(一般於大約0.9％到大約10％)。可以在擴增方案中使用技術從而使假陽性產物或擴增過程中產生的假象最小化。這些包括″降落(touchdown)″PCR、熱啟動技術、使用嵌套引物或設計PCR引物使它們在引物二聚體形成的結果中形成莖環結構並因而不被擴增。能夠利用加速PCR的技術，例如離心PCR，它允許在樣品中更強的對流，並且包括紅外加熱步驟以進行樣品的快速加熱和冷卻。能夠進行一個或多個擴增循環。能夠使用過量的一種引物以在PCR過程中產生過量的一種引物延伸產物；優選地，過量產生的引物延伸產物是待檢測的擴增產物。可以使用多種不同的引物以擴增不同的目標多核苷酸或樣品中特定目標多核苷酸的不同區域。
擴增的目標多核苷酸可以進行擴增後處理。例如，在一些情況下，希望在雜交之前將目標多核苷酸片段化從而提供更易接近的片段。核酸的片段化能夠通過任何產生在實施的分析中有用大小的片段的方法進行；適當的物理、化學和酶學方法是本領域公知的。
擴增反應能夠在允許傳感器多核苷酸在一個擴增循環的至少一部分過程中雜交到擴增產物上的條件下進行。當分析以這種方式進行時，通過監控來自信號發色團的光發射的變化能夠進行這種雜交事件的實時檢測，該光發射基於該擴增方案過程中的雜交而發生。聚陽離子多發色團由於它們包含的多個發色團，集光多發色團系統已證實是有效的光吸收劑。例子包括，但不限於綴合的聚合物、綴合分子的聚集體、附著於飽和聚合物上的發光染料、半導體量子點狀和樹狀結構。例如，在綴合聚合物上的每個重複單位能夠認為是一個起作用的發色團，量子點由許多原子組成，飽和的聚合物能夠為在側鏈上的許多發光染料分子所功能化，包含許多共價連接的個體發色團的樹枝狀化合物(dendrimer)能夠得到合成。發色團組件附著於固體支持物，如聚合物珠或表面上，也能夠用於集光。
集光多發色團系統能夠將能量有效地傳遞給附近的發光物(例如，「信號發色團」)。能量傳遞的機制包括，例如，共振能量傳遞(Frster(或螢光)共振能量傳遞，FRET)、量子電荷交換(Dexter能量傳遞)等。但是一般地，這些能量傳遞機制是相對短範圍的；即，需要集光多發色團系統密切接近信號發色團以進行有效的能量傳遞。在進行有效能量傳遞的條件下，當集光多發色團系統中的個體發色團數目很大時會發生來自信號發色團發射的擴大；即，當入射光(「泵光(pump light)」)處於集光多發色團系統吸收的波長時來自信號發色團的發射比當信號發色團被泵光直接激發時更加強烈。
綴合聚合物(CPs)的特徵是非定域電子結構，它能夠用作化學和生物學目標的高度易傳感的光學報導分子12，13。因為有效的綴合長度基本上比聚合物鏈的長度短，所以骨架在靠近處包含大量的綴合片段。因而，綴合的聚合物對集光是有效的並使得通過Frster能量傳遞進行光學放大成為可能14。
已經對陽離子聚電解質和DNA之間自發的共聚體絡合進行過描述，並且主要是協同靜電力的結果15，16，17。近來還認定了在芳香族聚合物單元和DNA鹼基之間的疏水相互作用18，19。聚電解質/DNA相互作用的自由能受與溶液變量相關使用的參與物的結構控制，所述變量如pH、離子強度和溫度20。近來對這些相互作用的強度和特異性進行了協調以識別質粒DNA的三級結構21。
用於本發明的多發色團是聚陽離子的並能夠與傳感器多核苷酸靜電相互作用。可以在所述方法中使用任何能夠吸收光並將能量傳遞給傳感器多核苷酸上信號發色團的聚陽離子多發色團。能夠使用的例示性的多發色團包括綴合的聚合物、飽和的聚合物或以任何活的方式整合多個發色團的樹枝狀化合物，以及半導體納晶體(SCNCs)。可以製備綴合的聚合物、飽和的聚合物和樹枝狀化合物以整合多個陽離子物或使它們在合成後衍生化為聚陽離子的；可以通過將陽離子物加至它們的表面上使半導體納晶體聚陽離子化。
在一個優選的實施方案中，使用一種綴合的聚合物作為聚陽離子多發色團。一個具體的例子示於結構1中，其中可溶於水的陽離子綴合聚合物是具有碘化物相反陰離子的聚(9，9-雙(6′-N，N，N-三甲基銨)-已基)-亞苯基芴(fluorene phenylene))22。這種聚合物的特定大小並不重要，只要它能夠吸收光並將能量傳遞給帶至近處的信號發色團。一般的「n」值落入2到大約100,000的範圍內。這種具體的分子結構並不重要；能夠使用任何具有足夠發光量子效率的水溶性陽離子綴合聚合物。
水溶性綴合寡聚體也能夠用作聚陽離子多發色團。這種具有碘化物相互陰離子的水溶性陽離子發光綴合寡聚體的一個例子示於下面(這裡表示為寡聚體2) 儘管較小的寡聚體2並不呈現一種高分子量聚合物的大的信號放大特性，但這種小分子對於使結構特性關係簡單化(deconuolute)是有用的，所述關係由於固有的多分散性和在聚合物中所發現的一批批之間的變化而難以測定。另外，在含水介質中寡聚體如2比它們的多聚對應體更加可溶，並且預計疏水相互作用對於2比對於聚合物結構更不重要。因而可以如願地利用寡聚體的集合進行特異性的應用。加入有機溶劑，例如一種可混於水的有機溶劑如乙醇能夠導致背景C*發射的減少。有機溶劑的存在能夠降低疏水相互作用並減弱背景C*發射。
傳感器多核苷酸提供一種陰離子性的和與待測目標多核苷酸互補的，並且具有預定序列的傳感器多核苷酸。傳感器多核苷酸可以是帶分枝的、多聚體的或環狀的，但一般是線性的，並且可以包含非天然鹼基。可以製備具有任何期望的鹼基序列的傳感器多核苷酸。將信號發色團附著於傳感器多核苷酸多核苷酸上的化學方法是本領域公知的23。具體的傳感器多核苷酸結構，包括綴合到發色團上的結構，能夠利用商業來源進行定做或進行化學合成。
信號發色團本文所述的在發明中有用的發色團包括任何能夠在適當溶液中吸收來自聚陽離子多發色團的能量並發射光的物質。為了進行多重分析，可以使用多種具有可檢測不同發射光譜的不同信號發色團。發色團可以是生光團或螢光團。一般的螢光團包括螢光染料、半導體納晶體、鑭系元素螯合物、多核苷酸特異性染料和綠色螢光蛋白。
例示性的螢光染料包括螢光素、6-FAM、羅丹明、德克薩斯紅、三甲基羅丹明、羧基羅丹明、羧基羅丹明6G、羧基對甲氨基酚、羧基羅丹明110、Cascade藍、Cascade黃、香豆素、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy-Chrome、藻紅蛋白、PerCP(多甲藻素葉綠素a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基螢光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-羅丹明)、HEX、螢光黃、Marina藍、俄勒岡綠488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、Alexa Fluor350、AlexaFluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor633、AlexaFluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BIODIPYFL、BIODIPYFL-Br2、BIODIPY530/550、BIODIPY558/568、BIODIPY564/570、BIODIPY576/589、BIODIPY581/591、BIODIPY630/650、BIODIPY650/665、BIODIPYR6G、BIODIPYTMR、BIODIPYTR、其綴合物以及其組合物。例示性的鑭系元素螯合物包括銪螯合物、鋱螯合物和釤螯合物。
許多螢光半導體納晶體(「SCNCs」)是本領域公知的；在公開於1999年5月27日的PCT公開號WO99/26299，發明人Bawendi等；1999年11月23日授權給Weiss等的美國專利號5,990,479；和Bruchez等，Science2812013，1998中描述了生產和利用半導體納晶體的方法。能夠獲得具有充分定義的峰發射波長的非常窄的發射波段的半導體納晶體，從而允許在同一分析中將大量不同的SCNCs任選與其它非SCNC類型的信號發色團結合用作信號發色團。
例示性的多核苷酸特異性染料包括吖啶橙、吖啶同型二聚體、放線菌素-D、7-氨基放線菌素D(7-AAD)、9-氮基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)、BOBOTM-1碘化物(462/481)、BOBOTM-3碘化物(570/602)、BO-PROTM-1碘化物(462/481)、BO-PROTM-3碘化物(575/599)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚、二氫氯化物(DAPI)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，二乳酸鹽(DAPI，二乳酸鹽)、二氫乙錠(氫乙錠)、溴化乙錠、二疊氮氯化乙錠、乙錠同型二聚體-1(EthD-1)、乙錠同型二聚體-2(EthD-2)、單疊氮溴化乙錠(EMA)、hexidium iodide、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、Hoechst S769121、羥司替巴脒、甲磺酸鹽、JOJOTM-1碘化物(529/545)、JO-PROTM-1碘化物(530/546)、LOLOTM-1碘化物(565/579)、LO-PROTM-1碘化物(567/580)、NeuroTraceTM435/455、Neu roTraceTM500/525、NeuroTraceTM515/535、NeuroTraceTM530/615、NeuroTraceTM640/660、OliGreen、PicoGreenssDNA、PicoGreendsDNA、POPOTM-1碘化物(434/456)、POPOTM-3碘化物(534/570)、PO-PROTM-1碘化物(435/455)、PO-PROTM-3碘化物(539/567)、碘化丙啶、RiboGreen、SlowFade、SlowFadeLight、SYBRGreen I、SYBRGreenII、SYBRGold、SYBR101、SYBR102、SYBR103、SYBRDX、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、TOTO-1、 TOTO-3、YO-PRO-1(唑黃)、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、TO、SYTOXBlue、SYTOXGreen、SYTOXOrange、SYTO9、SYTOBC、SYTO40、SYTO41、SYTO42、SYTO43、SYTO44、SYTO45、SYTOBlue、SYTO11、SYTO12、SYTO13、SYTO14、SYTO15、SYTO16、SYTO20、SYTO21、SYTO22、SYTO23、SYTO24、SYTO25、SYTOGreen、SYTO80、SYTO81、SYTO82、SYTO83、SYTO84、SYTO85、SYTOOrange、SYTO17、SYTO59、SYTO60、SYTO61、SYTO62、SYTO63、SYTO64、SYTORed、紡錘菌素、偏端黴素、吖啶橙、3，4-苯並芘、噻唑橙、TOMEHE、道諾黴素、吖啶、戊基-TOTAB和丁基-TOTIN。非對稱性花青染料可以用作多核苷酸特異性染料。其它目標染料包括由Geiersta nger，B.H.和Wemmer，D.E.，Annu.Rev.Vioshys.Biomol.Struct.1995，24，463-493，由Larson，C.J.和Verdine，G.L.，BioorganicChemistryNudeic Acids，Hecht，S.M.編輯，牛津大學出版社紐約，1996，第324-346頁，和由Glumoff，T.和Goldman，A.Nudeic Acids iuChem istryand Biology，第二版，Blackburn，G.M.和Gait，M.J.，編輯，牛津大學出版社牛津，1996，第375-441頁所介紹的那些染料。多核苷酸特異性染料可以是一種嵌入性染料，並對雙鏈多核苷酸是特異性的。其它染料和螢光團在www.probes.com(Molecular Probes，Inc.)中進行了描述。
術語「綠色螢光蛋白」指天然多管水母屬(Aequorea)綠色螢光蛋白和已經鑑定為顯示變化了的螢光特性的突變型，包括變化的激發和發射最大值，以及不同形狀的激發和發射光譜(Delagrave，S.等(1995)Bio/Technology 13151-154；Heim，R.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112501-12504；Heim，R.等(1995)Nature 373663-664)。Delgrave等分離了具有向紅效應的激發光譜的克隆的水母(Aequoreavictoria)GFP的突變型。Bio/Technology 13151-154(1995)。Heim，R.等報導了一種具有藍色螢光的突變型(Tyr66變為His)(Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)USA 9112501-12504)。
在一種變型中，利用第二信號發色團接收來自起始信號發色團的能量，所述第二信號發色團可以直接或間接附著於另一種分析組分和/或基片上。在具體的應用中，這能夠提供顯著的額外選擇性。例如，能夠將一種多核苷酸特異性染料用作起始或第二信號發色團，並且可以是對於雙鏈序列特異性的。隨後能夠將能量由激發的陽離子多發色團傳遞至起始信號發色團，所述起始信號發色團接下來以一種目標選擇性的總體形式將能量傳遞至第二信號發色團。這種信號發色團的級聯理論上能夠延伸為利用任何數目的具有相容的吸收和發射特徵的信號發色團。在這種變型的一個實施方案中，利用一種對於雙鏈多核苷酸特異的嵌入性染料作為第二信號發色團，並將一種能夠傳遞能量至第二信號發色團的起始信號發色團綴合到傳感器多核苷酸上。嵌入性染料提供額外的選擇性要求，即傳感器和目標多核苷酸在其補充到檢測複合物中之前雜交。在目標存在的情況下，形成雙螺旋，吸收染料，並且多發色團的激發引起來自第二信號發色團的信號。
基片本文所述的方法能夠在任何形式的基片上進行。基片可以包括廣泛的材料，既可以是生物的、非生物的、有機的、無機的，也可以是任何這些材料的組合。例如，基片可以是一種聚合的L-B膜、功能化玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改性矽或任何一種廣泛變化的凝膠或聚合物如(聚)四氟乙烯、(聚)偏1，1-二氟乙烯、聚苯乙烯、交聯的聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、聚烴乙酸、交酯乙交酯共聚物、聚酐、聚甲基丙烯酸甲酯、乙烯醋酸乙烯酯共聚物、聚矽氧烷、聚合矽石、膠乳、葡聚糖聚合物、環氧物、聚碳酸酯、瓊脂糖、聚(丙烯醯胺)或其組合物。能夠使用導電性的聚合物和光電導性物質。
基片可以是平面晶狀基片如基於矽的基片(例如玻璃、石英等)，或用於例如半導體和微處理器產業中的晶狀基片，如矽、砷化鎵、摻銦的GaN等，並且包括半導體納晶體。
基片可以取光電二極體、光電傳感器，或生物晶片的形式，所述光電傳感器如光電半導體晶片或光電薄膜半導體。個別傳感器多核苷酸在基片上的定位可以是可尋址的；這能夠以高密形式實現，並且定位可以是可微尋址的或可納尋址的。
矽石氣凝膠也能夠用作基片，並能夠通過本領域公知的方法製備。氣凝膠基片可以用作自由固定基片或用作塗布了其它基片物質的表面。
基片可以取任何形式並且一般為盤、載玻片、珠、小球、圓盤、顆粒、微米顆粒、納米顆粒、束條(strand)、沉澱物、任選有孔的凝膠、薄片、管、球、容器、毛細管、墊、切片、膜、晶片、多孔板或盤、光纖等。基片可以是任何剛性或半剛性的形式。基片可以包含凸起的或降低的區域，在其上定位傳感器多核苷酸或其它分析組分。基片的表面能夠使用公知技術進行蝕刻以提供希望的表面特徵，例如溝壕、v-溝、臺式結構等。
基片的表面可以由與基片相同的材料組成或者可以由不同材料製成，並可以通過化學或物理方法偶聯到基片上。這種偶聯的表面可以由任何的廣泛多種材料組成，例如，聚合物、塑料、樹脂、多糖、矽石或基於矽的材料、碳、金屬、無機玻璃、膜，或任何上面所列的基片材料。表面可以是光學透明的並可以具有表面Si-OH功能性，如在矽石表面所發現的那些。
選擇基片和/或其任意表面以提供對於所用的合成和/或檢測方法合適的光學特徵。基片和/或表面可以是透明的以允許基片暴露於來知多個方向應用的光。可以為基片和/或表面提供反射性的「鏡面」結構以增強光的回收。
基片和/或其表面通常耐受，或經處理以耐受它在應用中所暴露的條件，並且能夠任選地進行處理以在暴露於這類條件後去除任何耐受性材料。
能夠通過任何適當方法將傳感器多核苷酸裝配或附著於基片上，例如在美國專利號5,143,854、PCT公開號WO92/10092、遞交於1990年12月6日的美國專利申請系列號07/624,120(目前放棄)、Fodor等，Science，251767-777(1991)和PCT公開號WO90/15070中所描述的方法。利用機械合成策略合成這些陣列的技術在例如PCT公開號WO93/09668和美國專利號5,384,261中進行了描述。
更進一步的技術包括基於珠的技術，如那些在PCT申請號PCT/US93/04145中所描述的那些，和基於針的方法，如在美國專利號5,288,514中所描述的那些。
在遞交於1992的11月20日的美國專利申請系列號07/980,523，和美國專利號5,384,261中描述了其它的可用於將傳感器多核苷酸附著於基片上的流體通道或點樣法。通過(1)在定義於預定區域的通道內流動或(2)在預定區域上″點樣″將試劑遞送給基片。可以在要保護的基片的部分上使用保護性塗層如親水性的或疏水性的塗層(依賴於溶劑的性質)，有時在其它區域與促進由反應溶液進行溼潤的材料結合。以這種方式，流動溶液進一步避免了流出它們設計的流動途徑。
一般的分配器包括一種任選由機器人控制的微量移液器、一種噴墨印表機、一系列管、一種複式接頭、陣列移液器等從而能夠將多種試劑順序地或同時地遞送到反應區域。
發色團的激發和檢測可以使用任何提供能夠激發聚陽離子多發色團並短於發射波長的波長的儀器來進行激發。激發源優選不會直接顯著激發信號發色團。該源可以是一種寬帶紫外光源如具有適當濾光器的氘燈、在穿過單色儀以提取出期望波長後的光源如氙燈或氘燈的輸出、連續波(cw)氣體雷射器、固態二極體雷射器，或任何脈衝雷射器。來自信號發色團的發射光能夠通過任何適當的設備或技術進行檢測，許多適當的方法是本領域公知的。例如，可以使用螢光計或分光光度計檢測試驗樣品是否在多發色團的激發之後發出信號發色團的波長特徵的光。
試劑盒還提供包含對於實施本發明方法有用的試劑的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒包含與目標多核苷酸互補的單鏈傳感器多核苷酸和聚陽離子多發色團。傳感器多核苷酸綴合到信號發色團上。在樣品中目標多核苷酸存在的情況下，傳感器多核苷酸與目標雜交，導致能夠檢測的來自信號發色團能量的增強的發射。
試劑盒的組分保持在一個包裝(housing)裡。使用該試劑盒以實施本發明的方法的說明書可以與包裝一起提供，並且可以在任何固定的介質中提供。說明書可以位於包裝之內或包裝之外，並且可以在形成包裝的任何表面的裡面或外面進行印刷，這使得說明書印刷易讀。試劑盒可以是多重形式，含有多數一種或多種能夠與相應不同的目標多核苷酸雜交的不同傳感器多核苷酸。
實施例給出下列實施例從而為本領域普通技術人員提供如何生產和使用本發明的完全的描述，並且不會限制視為本發明的範圍。已經進行了努力以確保關於所用數字的精確性(例如，量、溫度等)，但一些實驗誤差和偏差應當進行估計。
除非另外指出，份是重量的份、溫度是攝氏度而壓力是大氣壓或接近大氣壓，並且所有的材料是商業上可獲得的。
實施例1.FRET方案的鑑定利用陽離子水溶性綴合聚合物聚(9，9-雙(6′-N，N，N-三甲基銨)-己基)-亞苯基芴)即具有碘化物相反陰離子的聚合物1證明雜交試驗，所述雜交試驗利用由集光多發色團系統到信號發色團的能量傳遞。傳感器多核苷酸序列為5』-GTAAATGGTGTTAGGGTTGC-3』，相應於炭疽(炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis))芽孢包裹質粒pX02，在5』位置具有螢光素，形成寡-C*的一個例子24。聚合物和信號發色團的吸收和發射光譜示於圖1中。數據顯示了在DNA和螢光素的吸收之間的聚合物1激發的一個光學窗口。如圖1所示，聚合物1的直接激發導致向螢光素的能量傳遞(ET)。選擇螢光素與聚合物1激發的吸收重疊部分以確保FRET25。ET的程度通過整合的受體與供體發射的比率進行評估。
實施例2.在目標多核苷酸存在的情況下證明FRET寡-C*探針的雜交導致ET比率的變化。在等摩爾量的含有互補的20個鹼基對序列的一種40個鹼基對鏈5′-CATCTGTAAATCCAAGAGTAGCAACCCTAACACCATTTAC-3′，和相同模式的具有序列5′-AAAATATTGTGTATCAAAATGTAAATGGTGTTAGGGTTGC-3′的非互補的40個鹼基鏈存在的情況下，將傳感器多核苷酸([寡-C*]＝2.1×10-8M)在低於其Tm(58.4℃)2℃下進行退火。所得螢光的直接比較顯示了一個高於雜交DNA 6倍大的ET比率。參見圖2。在10mmol檸檬酸鈉和100mmol氯化鈉緩衝液存在時觀察到這些光學差異也是具有高度意義的。緩衝離子掩蔽了互補DNA上的電荷，這促進雜交但弱化CPs和相反電荷的螢光猝滅劑之間的靜電相互作用26。使用一種裝備了標準PMT的氙燈螢光計，雜交的DNA提供了比非雜交DNA超過3倍高的ET比率，[傳感器多核苷酸]＝2.8×l0-9M。
實施例3.能量傳遞的優化通過改變聚合物1與寡-C*的比率來優化能量傳遞。在[寡-C*]＝2.1×10-8M的濃度下，聚合物的起始添加引起ET比率的立即升高，當聚合物1的量開始遠遠超過寡-C*的量時ET比率降低。ET比率的最大值相應於聚合物鏈對寡-C*的近乎1∶1的比例。在高聚合物濃度下並非每條鏈都緊密地複合至寡-C*上並且供體發射比信號發色團發射升高得更快。這樣的關係是預料中的，因為當[聚合物1]/[寡-C*]＜1時，並非所有的傳感器多核苷酸鏈都能夠有效地複合到獨立的聚合物鏈上。相反地，在[聚合物1]/[寡-C*]＞1時，並非所有的由聚合物1(供體)束縛的光子都能傳遞給寡-C*(受體)。一旦聚合物-寡-C*的重複單位達到大約100，報告發色團的光致發光不再增強，顯示受體的飽和。在此比率的整合的螢光發射比在聚合物1缺失的情況下直接激發(480nm)的探針發射高大約4倍，給出了信號放大進一步的證據。
實施例4.從多發色團通過傳感器多核苷酸到多核苷酸染料的FRET傳遞以提高選擇性寡-C*探針(5′-Fl-ATCTTGACTATGTGGGTGCT-3′)的雜交導致兩種不同傳感器發色團ET比率的差異。在等摩爾量的含有互補的20個鹼基對序列的20個鹼基對鏈(5′-AGCACCCACATAGTCAAGAT-3′)，和相同模式的具有序列(5′-CGTATCACTGGACTGATTGG-3′)的非互補的20個鹼基對鏈存在的情況下，將傳感器多核苷酸([寡-C*]＝1×10- 8M)在低於其Tm(58.5℃)2℃下進行退火。兩種DNA混合物與溴化乙錠([EB]＝1.1×10-6M)於室溫下在一價磷酸鉀-氫氧化鈉緩衝溶液(50mM，pH＝7.40)中進行混合，其中EB的插入發生在雜交DNA對的雙鏈體結構之內。在水中加入聚合物1([1]＝1.6×10-7M)以及隨後1的激發(380nm)導致從1到傳感器多核苷酸的能量傳遞以及隨後從傳感器多核苷酸到EB的能量傳遞。產生的螢光的比較提示傳感器溶液僅僅顯示在雜交DNA存在時來自插入的染料EB的發射。參見圖3。該結果證明本發明的DNA序列傳感器能夠通過在聚陽離子多發色團的激發之後檢測來自多核苷酸特異性染料的發射而檢測目標單鏈DNA的存在，所述目標單鏈DNA具有與傳感器多核苷酸序列互補的特異性鹼基序列。選擇用於本實施例的發色團以尋求在多發色團和兩種信號發色團之間能量上的適當重疊。
實施例5.利用來自多發色團系統的FRET進行多核苷酸染料光學放大的證明在1、傳感器多核苷酸和多核苷酸特異性染料(溴化乙錠，EB)的溶液中的1的激發導致EB的發射強度，它比直接激發(500nm)包含在相同雙鏈DNA序列中的EB高大約8倍，所述相同雙鏈DNA序列缺少在傳感器多核苷酸上的信號發色團。信號寡-C*的直接激發(480nm)，在聚合物1不存在時，僅提供大約4倍的插入EB的感光作用。總之，本實施例顯示了通過從聚陽離子多發色團(綴合的聚合物1)到診斷性EB報導分子的FRET的信號放大的證據。參見圖4。
實施例6.向多核苷酸染料的FRET傳遞利用1和溴化乙錠(「EB」)作為信號發色團的實驗證明從1到EB的直接能量傳遞能夠在雙鏈DNA存在的情況下顯示。在等摩爾量的含有互補的20個鹼基對序列的20個鹼基對鏈(5′-AGCACCCACATAGTCAAGAT-3′)，和相同模式的具有序列(5′-CGTATCACTGGACTGATTGG-3′)的非互補的20個鹼基對鏈存在的情況下，將缺少信號發色團的傳感器多核苷酸(5』-ATCTTGACTATGTGGGTGCT-3』)([寡]＝1×10-8M)在低於其Tm(58.5℃)2℃下進行退火。兩種DNA混合物與溴化乙錠([EB]＝1.1×10-6M)於室溫下在一價磷酸鉀-氫氧化鈉緩衝溶液(50mM，pH＝7.40)中進行混合，其中EB的插入發生在雜交DNA對的雙鏈體結構之內。在水中加入聚合物1([1]＝1.6×10-7M)以及隨後1的激發(380nm)僅僅在雜交的或雙鏈DNA存在的情況下導致從1到插入的EB的能量傳遞。僅對於雜交的序列在聚合物1的激發之後檢測到來自EB的發射。參見圖5。
儘管已經關於優選的實施方案在一些細節上對發明進行了描述，但是本領域技術人員將認識到，根據本文的教導，能夠進行某些變化和改進而不背離發明的精神和範圍。因此，發明僅為權利要求書所限制。
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權利要求
1.測試方法，包括提供懷疑含有目標多核苷酸的樣品；提供在激發後能夠將能量傳遞給信號發色團的聚陽離子多發色團；提供單鏈的並且與目標多核苷酸互補的陰離子性傳感器多核苷酸，所述傳感器多核苷酸綴合到信號發色團上，其中所述傳感器多核苷酸與多發色團相互作用並且發射光能夠在目標多核苷酸缺失的情況下於多發色團激發之後由信號發色團產生，並且其中在目標多核苷酸存在的情況下多發色團激發後由信號發色團產生更大量的發射光；在傳感器多核苷酸能夠與倘若存在的目標多核苷酸雜交的條件下，將樣品與傳感器多核苷酸和多發色團在溶液中進行接觸；對該溶液應用能夠激發多發色團的光源；以及檢測由信號發色團發射的光是否在樣品存在的情況下增強。
2.權利要求1的方法，其中多發色團包含選自飽和的聚合物、綴合的聚合物、綴合分子的聚集體、樹枝狀化合物和半導體納晶體的結構。
3.權利要求2的方法，其中多發色團包含飽和的聚合物。
4.權利要求2的方法，其中多發色團包含樹枝狀化合物。
5.權利要求2的方法，其中多發色團包含半導體納晶體。
6.權利要求2的方法，其中多發色團包含綴合分子。
7.權利要求6的方法，其中綴合的聚合物具有結構。
8.權利要求2的方法，其中多發色團是綴合分子的聚集體。
9.權利要求8的方法，其中聚集體包含具有結構 的分子。
10.權利要求1的方法，其中樣品在足量有機溶劑存在下與傳感器多核苷酸和多發色團相接觸以減少傳感器多核苷酸和多發色團之間的疏水相互作用。
11.權利要求1的方法，其中樣品與多種不同的具有相應不同序列的傳感器多核苷酸相接觸，所述不同的傳感器多核苷酸包含相應不同的信號發色團，其中每種所述不同的傳感器多核苷酸都能夠選擇性地與相應不同的目標多核苷酸雜交。
12.權利要求1的方法，其中信號發色團是螢光團。
13.權利要求12的方法，其中螢光團選自半導體納晶體、螢光染料和鑭系元素螯合物。
14.權利要求13的方法，其中螢光團是半導體納晶體。
15.權利要求13的方法，其中螢光團是螢光染料。
16.權利要求15的方法，其中螢光染料是螢光素。
17.權利要求13的方法，其中螢光團是鑭系元素螯合物。
18.權利要求1的方法，其中目標多核苷酸是DNA。
19.權利要求1的方法，其中目標多核苷酸是RNA。
20.權利要求1的方法，其中樣品包含單鏈目標多核苷酸。
21.權利要求1的方法，其中樣品包含雙鏈目標多核苷酸。
22.權利要求1的方法，其中目標多核苷酸通過擴增反應生產。
23.多核苷酸傳感溶液，包含信號發色團；和聚陽離子多發色團，當將其接近信號發色團時所述多發色團能夠在激發後將能量傳遞給信號發色團，其中當多發色團被激發時在被傳感的多核苷酸存在的情況下由信號發色團能夠產生更大量的能量。
24.測試樣品中目標多核苷酸的試劑盒，包含單鏈的並且與目標多核苷酸互補的傳感器多核苷酸；信號發色團；聚陽離子多發色團，當將其接近信號發色團時所述多發色團能夠在激發後將能量傳遞給信號發色團，其中所述傳感器多核苷酸與多發色團相互作用並且在目標多核苷酸存在的情況下多發色團激發後由信號發色團產生可檢測到的更大量的發射光；和一個容納試劑盒試劑的包裝。
25.權利要求1的方法，其中由信號發色團發射的高於閾值水平的光顯示目標多核苷酸存在於樣品中。
26.權利要求1的方法，其中由信號發色團發射的光的量被量化並且用於測定樣品中的目標多核苷酸的量。
27.權利要求12的方法，其中螢光團是綠色螢光蛋白。
28.權利要求1的方法，其中不對目標多核苷酸進行擴增。
29.權利要求1的方法，其中在基片上實施該方法。
30.權利要求29的方法，其中基片選自微球體、晶片、載玻片、多孔板、光纖、任選有孔的凝膠基質、光電二極體和光電裝置。
31.權利要求30的方法，其中基片為載玻片。
32.權利要求30的方法，其中基片為光電裝置。
33.權利要求30的方法，其中基片為任選有孔的凝膠基質。
34.權利要求33的方法，其中基片為溶膠-凝膠。
35.權利要求30的方法，其中基片是可納尋址的。
36.權利要求30的方法，其中基片是可微尋址的。
37.權利要求30的方法，其中基片綴合到多種不同的具有相應不同序列的傳感器多核苷酸上，其中每種所述的不同傳感器多核苷酸都能夠選擇性地與相應不同的目標多核苷酸雜交。
38.權利要求1的方法，其中該方法包含進行螢光原位雜交(FISH)。
39.權利要求22的方法，其中擴增反應包含聚合酶鏈反應。
40.權利要求1的方法，進一步包括將溶液中的樣品與傳感器多核苷酸、多發色團和第二信號發色團接觸，所述第二發色團在目標存在的情況下能夠從信號發色團吸收能量並發射光，並且其中檢測由信號發色團發射的光是否在樣品存在的情況下增強包括檢測由第二信號發色團發射的光是否在樣品存在的情況下增強。
41.權利要求40的方法，其中第二信號發色團是多核苷酸特異性染料。
42.由權利要求1的方法形成的信號複合物。
43.權利要求42的複合物，進一步包含第二信號發色團。
44.權利要求23的多核苷酸傳感溶液，進一步包含第二信號發色團，所述第二信號發色團在目標存在的情況下能夠吸收來自信號發色團的能量並且發射光。
45.權利要求44的多核苷酸傳感溶液，其中第二信號發色團是多核苷酸特異性染料。
46.由權利要求29的方法形成的基片結合複合物。
47.權利要求46的基片結合複合物，進一步包含第二信號發色團。
48.權利要求24的試劑盒，進一步包含第二信號發色團，所述第二信號發色團在目標存在的情況下能夠吸收來自信號發色團的能量並且發射光。
49.權利要求48的試劑盒，其中第二信號發色團是多核苷酸特異性染料。
50.權利要求24的試劑盒，進一步包含與所述包裝一起提供的說明書，它介紹如何使用試劑盒的組分來測試樣品中的目標多核苷酸。
51.傳感複合物，包含單鏈的並且與目標多核苷酸互補的傳感器多核苷酸，所述傳感器多核苷酸附著於信號發色團上；聚陽離子多發色團，當將其接近信號發色團時所述多發色團能夠在激發後將能量傳遞給信號發色團，其中所述傳感器多核苷酸與多發色團相互作用並且在目標多核苷酸缺失的情況下多發色團激發後能夠由信號發色團產生發射光；並且其中在目標多核苷酸存在的情況下多發色團激發後由信號發色團產生更大量的發射光。
52.權利要求23的多核苷酸傳感溶液，進一步包含單鏈的並且與目標多核苷酸互補的傳感器多核苷酸。
53.權利要求23的多核苷酸傳感溶液，其中信號發色團是多核苷酸特異性染料，它能夠在目標存在的情況下吸收來自多發色團的能量並且發射光。
54.權利要求23的多核苷酸傳感溶液，其中信號發色團是多核苷酸特異性染料，它能夠在目標存在的情況下吸收來自多發色團的能量並且將能量傳遞給第二信號發色團，所述第二信號發色團綴合到隨後發射光的傳感器多核苷酸上。
55.權利要求3的方法，其中飽和的聚合物附著於發光染料上。
全文摘要
提供了測定樣品中目標多核苷酸的方法、組合物和生產的商品。將一種懷疑含有目標多核苷酸的樣品與聚陽離子多發色團和同目標多核苷酸互補的傳感器多核苷酸相接觸。傳感器多核苷酸包含一種信號發色團以接收來自受到激發的多發色團的能量並且在目標多核苷酸存在的情況下增強發射。該方法能夠以多種形式進行利用。還提供包含實施此方法的試劑的試劑盒。
文檔編號C07H21/00GK1694967SQ03824651
公開日2005年11月9日 申請日期2003年8月26日 優先權日2002年8月26日
發明者G·C·巴贊, B·S·蓋洛德, S·王 申請人:加州大學評議會