由代謝工程化酵母進行的丁醇生產的製作方法

2023-04-26 04:31:51 1

專利名稱：：由代謝工程化酵母進行的丁醇生產的製作方法200780051627.8說明書聲明如下，我們(下文列出了姓名、住址、和國籍)發明了以下說明書中描述的、題為"由代謝工程化酵母進行的丁醇生產"的發明。UviniGimawardena住址帕薩迪納，力口利福尼亞國籍斯裡蘭卡PeterMeinhold住址帕薩迪納，力口利福尼亞國籍德國MatthewW.Peters住址帕薩迪納，加利福尼亞國籍美國JfunUrano住址卡爾弗城，加利福尼亞國籍美國ReidM.RennyFeldman<主址洛杉A幾，加利福尼亞國籍美國本申請要求(l)JunUrano等人於2006年12月21日提交的美國臨時專利申請流水號60/871，427,"由代謝工程化酵母進行的丁醇生產"(BUTANOLPRODUCTIONBYMETABOLICALLYENGINEEREDYEAST);(2)JimUrano等人於2007年2月2日提交的美國臨時專利申請流水號60/888，016,"由代謝工程化酵母進行的正丁醇生產"(N-BUTANOLPRODUCTIONBYMETABOLICALLYENGINEEREDYEAST);和(3)UviniP.Gunawardena等人於2007年5月8日提交的美國臨時專利申請流水號60/928,283，"由代謝工程化酵母進行的丁醇生產，，(BUTANOLPRODUCTIONBYMETABOLICALLYENGINEEREDYEAST)的權益。在此通過述及將上述每一篇申請收入本文。發明領域本發明涉及代謝工程改造的酵母細胞，用於以高產率生產正丁醇，作為替代的且可再生的運輸燃料，及用於其它應用。本發明的酵母被工程化改造成包含將諸如葡萄糖和/或其它可代謝碳水化合物的碳源以及生物質等等轉化成正丁醇的代謝途徑。發明背景當前，美國每年消費大約1400億加侖汽油，而全世界每年消費大約3400億加侖汽油。這些消費數量還在增加中。2005年能源政策法案(EnergyPolicyActof2005)規定了到2012年要在汽油中使用75億加侖可再生燃料。在他的2007年國情諮文(2007StateoftheUnionaddress)中，總統要求提高可再生燃料標準(renewableflielstandard)(RFS)的大小和擴大可再生燃料標準的範圍，要求在2017年使用350億加侖可再生的替代燃料。能源部已經設定了到20！30年用生物燃料替換美國當前汽油消耗的30%的目標(即"30X30"提案)。在2007年5月，巴西和美國籤署了"乙醇協議，，(theEthanolAgreement),以促進美洲生物燃料的開發，聯合世界最大生物燃料生產商-當前佔世界乙醇生產的70%。生物燃料不僅具有降低美國對外國石油輸入的依賴性(這對於國土安全是至關重要的)的潛力，而且具有顯著降低與全球變暖有關的溫室氣體排放的潛力。自基於碳的原料的轉化能獲得生物燃料。農業原料被認為是可再生的，原因在於，雖然它們在燃燒時釋放二氧化碳，但是它們通過光合作用捕獲幾乎相等量的二氧化碳。在美國，乙醇日益用作標準汽油的氧化添加劑，作為曱基叔丁基醚(MTBE)的替代品，後一種化學品難以自地下水和土壤汙染中收回。在10%混合物，通過提高辛烷值，乙醇降低發動機爆震(engineknock)的可能性。10%乙醇汽油的使用在有些城市是強制性的，在這些城市中有害水平的汽車排氣的可能性是有可能的，尤其是在冬季的幾個月裡。北美車輛自大約1980年起無需改裝就能以10%乙醇/90。/o汽油(即E10)運行。9然而，為了以更高濃度使用乙醇，必須專門地工程化改造或改裝車輛的發動機和燃料系統。設計了可變燃料車輛(flexibleflielvehicle)(FFV)，以汽油或者以高至85。/。乙醇(E85)的混合物運行。然而，因為一加侖乙醇含有的能量比一加侖汽油少，所以FFV在以E85作為燃料時通常每加侖荻得的裡程少大於20-30%。可獲得轉化包，用於將常規車輛轉化成FFV，其通常包括電子裝置以提高每個循環所注入的燃料體積(因為乙醇的能含量較低)和有些情況中的化學處理以保護髮動機免於腐蝕。當前美國有超過400萬輛可變燃料車輛在路上行駛，雖然2002年的研究發現這些車輛所消費的燃料中E85少於1%。丁醇作為燃料具有數項勝過乙醇的優點。雖然它能自與乙醇相同的原料來製備，但是與乙醇不同，它與汽油和柴油在任意比例相容。丁醇還能在現有汽車中無需改裝用作純燃料，而且Virgin航空公司的RichardBranson爵士小組已經提出將丁醇用作噴氣發動機燃料。與乙醇不同，丁醇不吸收水，而且如此能在現有的石化基礎設施中儲存和配給。由於其較高的能含量，燃料經濟(每加侖裡程)好於乙醇。還有，丁醇-汽油混合物具有比乙醇-汽油混合物低的蒸氣壓，這在降低蒸氣碳氫化合物排放中是重要的。這些特性為丁醇提供了以與汽油完全相同的方式使用的潛力，而無需改裝車輛且消費者沒有不得不更頻繁補充燃料的負擔。使用經由自丁醯-CoA通向正丁醇的途徑而天然生成正丁醇的梭菌屬(C/o欣^/m)菌抹，能生成正丁醇。梭菌屬菌抹的一項缺點在於正丁醇生成以兩個步驟的過程發生，其牽涉酸生成生長期和之後的溶劑生成期。還有，在這種過程中生成大量的副產物，諸如氫、乙醇、和丙酮，如此將正丁醇的化學計量產率限制為大約0.6mol正丁醇每mol消耗的葡萄糖。另外，梭菌屬菌抹喪失了它們在連續培養條件下生成溶劑的能力(Comillot等，/5acten'o/.179:5442-5447，1997)。圖l中顯示了梭菌途徑，顯示了丙酮丁醇梭菌(C/ayW^maceto^O^cwm)中葡萄糖轉化成酸和溶劑，包括自乙醯-CoA生成正丁醇的途徑。發明概述在一個實施方案中，提供了如下代謝工程化酵母，其能夠代謝碳源以生成正丁醇，至少一種途徑配置成生成相對於野生型酵母所生成的另一胞質乙醯-CoA量增加的胞質乙醯-CoA量，且至少一種異源基因編碼並表達能夠利用NADH來將乙醯-CoA轉化成正丁醇的代謝途徑的至少一種酶。在另一個實施方案中，提供了生產正丁醇的方法，該方法包括(a)提供如下代謝工程化酵母，其能夠代謝碳源以生成正丁醇，至少一種途徑配置成生成相對於野生型酵母所生成的另一胞質乙醯-CoA量增加的胞質乙醯-CoA量，且至少一種異源基因編碼並表達能夠利用NADH來將乙醯-CoA轉化成正丁醇的代謝途徑的至少一種酶；並(b)培養該代謝工程化酵母，培養的時間和條件用以生成正丁醇。在又一個實施方案中，提供了使用酵母生產正丁醇的方法，該方法包括(a)代謝工程改造酵母以提高胞質乙醯-CoA生成；(b)代謝工程改造酵母以表達將碳源轉化成正丁醇的代謝途徑，其中該途徑需要至少一種對於該酵母而言非天然的酶，其中步驟(a)和(b)可以以任一次序實施；並(c)培養該酵母，培養的時間和條件用以生成可回收量的正丁醇。在還有一個實施方案中，提供了使用酵母生產正丁醇的方法，該方法包括(a)培養代謝工程化酵母，培養的時間和條件用以生成酵母細胞生物質但不激活正丁醇生成；並(b)在另一段時間改變培養條件，培養的時間和條件用以生成可回收量的正丁醇。在另一個實施方案中，提供了如下代謝工程化酵母，其能夠代謝碳源並生成相對於野生型酵母所生成的乙醯-CoA量增加的乙醯-CoA量。在又一個實施方案中，提供了提高酵母的代謝活性的方法，該方法包括酵母生成相對於野生型酵母所生成的另一胞質乙醯-CoA量增加的胞質乙醯-CoA量。在還有一個實施方案中，提供了如下代謝工程化酵母，其具有至少一種途徑配置成生成相對於野生型酵母所生成的另一胞質乙醯-CoA量增加的胞質乙醯-CoA量。還公開了其它實施方案。附圖簡述附圖中圖示了本發明的例示性實施方案，其中圖l圖示了丙酮丁醇梭菌中葡萄糖、戊糖、和澱粉粒(granulose)轉化成酸和溶劑中所牽涉的代謝途徑。己糖(例如葡萄糖)和戊糖被轉化成丙酮酸、ATP和NADH。隨後，丙酮酸被丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶氧化性脫羧成乙醯-CoA。在此步驟中所生成的還原當量被只含鐵的氫化酶(iron-onlyhydrogenase)轉化成氫。乙醯-CoA是分支點中間產物，通向有機酸(乙酸和丁酸)和溶劑(丙酮、丁醇和乙醇)的生成。圖2圖示了在酵母中生成丁醇的化學途徑。圖3圖示了釀酒酵母(Sacc/zraw;/(^scerew's/ae)生成乙醯-CoA所使用的途徑。圖4和5圖示了可用於依照本^^開內容表達各種酶的各種例示性質粒。圖4圖示了可用於如表l中所描述的依照本公開內容表達各種酶的示例性質粒。圖5圖示了可用於如表2中所描述的依照本公開內容表達各種酶的示例性質粒。圖6圖示了Gevo1099和Gevo1103隨時間的正丁醇生成，與只含載體的對照隔離群、Gevo1110和Gevo111l相比較，如下(,)Gevo1099;(』—)Gevo1103;(')Gevo1110;和(翌)Gevo1111。圖7圖示了含有來自丙酮丁醇梭菌的k^/、W/Zk和"/a基因的pGV1090質粒，所述基因插入在五coRl和S"wHI位點處和改良的噬菌體XLacO-l啟動子(Pl-^)的下遊。該質粒還攜帶pBR322的複製起點基因和氯黴素抗性基因。圖8圖示了用於表達來自丙酮丁醇梭菌的丁醛脫氫酶(Z^/7B)的pGV1095質粒，該丁醛脫氫酶插入在EcoRI和BawHI位點處和改良噬菌粒XLacO-1啟動子(PL-bc)的下遊。該質粒還攜帶CoIEI複製起點基因和氯黴素抗性基因。圖9圖示了用於表達來自丙酮丁醇梭菌的巴豆酸酶(cW)的pGVl094質粒，該巴豆酸酶插入在五coRI和5"wHI位點處和改良噬菌體iLacO-1啟動子(PWac)的下遊。該質粒還攜帶ori基因和氯黴素抗性基因。圖10圖示了用於表達來自丙酮丁醇梭菌的羥丁醯-CoA脫氫酶(MJ)的pGV1037質粒，該羥丁醯-CoA脫氫酶插入在EcoRI和5amHI位點處和改良噬菌體XLacO-l啟動子(Pi^c)的下遊。該質粒還攜帶ori基因和氯黴素抗性基因。圖11圖示了用於表達來自丙酮丁醇梭菌的硫解酶(A/)的pGVl03l質粒，該硫解酶插入在五coRI和SawHI位點處和LacZ基因的下遊。該質粒還攜帶pBR322的複製起點基因和氨千青黴素抗性基因。圖12圖示了用於表達來自拜氏梭菌(C7o^WwwZ^i/m'"cM)的巴豆酸酶(cW)的pGV1049質粒，該巴豆酸酶插入在五coRI和SawHI位點處和改良噬菌體XLacO-1啟動子(PWac)的下遊。該質粒還攜帶ori基因和氯黴素抗性基因。圖13圖示了用於表達來自拜氏梭菌的羥丁醯-CoA脫氫酶(/^力的pGV1050質粒，該羥丁醯-CoA脫氫酶插入在五coRI和^w7HI位點處和改良噬菌體XLacO-1啟動子(PWac)的下遊。該質粒還攜帶ori基因和氯黴素抗性基因。圖14圖示了用於表達來自拜氏梭菌的醇脫氫酶O^")的pGV1091質粒，該醇脫氫酶插入在///w^in和SamHI位點處和改良噬菌體iLacO-1啟動子(PL.huO的下遊。該質粒還攜帶氯黴素抗性基因。圖15圖示了用於表達來自拜氏梭菌的醇脫氫酶(aW/0的pGV1096質粒，該醇脫氫酶插入在五coRI和BamHI位點處和改良噬菌體XLacO-l啟動子(Pwac)的下遊。該質粒還攜帶ori基因和氯黴素抗性基因。發明詳述描述了被工程化改造成以高產率將碳源轉化成正丁醇的重組酵母微生物。具體而言，描述了能夠代謝碳源以理論值的至少5。/。的產率和有些情況中超過理論值的50%的產率生成正丁醇的重組酵母微生物。如本文中所使用的，術語"產率，，指摩爾產率。例如，當l摩爾葡萄糖被轉化成l摩爾正丁醇時，產率等於100%。具體而言，術語"產率"定義為每摩爾碳源單體獲得的產物摩爾數，而且可表述為百分比。除非另有說明，產率表述為理論產率的百分比。"理論產率"定義為根據用於生成產物的代謝途徑的化學計量的規定，每摩爾指定底物能生成的產物最大摩爾數。例如，葡萄糖變成正丁醇的一種典型轉化的理論產率為100%。因此，葡萄糖變成正丁醇的產率為95%會表述為理論產率的95%或95%理論產率。用異源表達的酶來以高產率生成正丁醇的微生物。丁醇產率取決於碳源變成乙醯-CoA的高產率轉化和後續的乙醯-CoA變成丁醇的高產率轉化。本發明涉及這兩個方面的組合，導致以高產率生成正丁醇的微生物。如本文中所使用的，術語"微生物"包括原核的和真核的微生物物種，13其來自細菌和真核生物範疇(Domains5acten'aand￡Wao;ofe)，後者包括酵母和絲狀真菌、原生動物、藻類、或高等原生生物。術語"細胞"和"微生物細胞"可以與術語"微生物"互換使用。在一個優選的實施方案中，微生物是酵母(例如啤酒糖酵母/釀酒酵母(^cc/2aram少c^ce"Ws/ae)或乳酸克魯維酵母(幻^yveram少ce/acto))或大腸埃希氏菌/大腸桿菌(￡.co//)。"酵母"指真核生物體的一個範疇，在系統發生學上位於真菌界中，在子嚢菌和擔子菌門(phylaAscomycotaandBasidiomycota)下。迄今描述了大約1500種酵母物種。酵母主要是單細胞微生物，主要通過無性芽殖來繁殖，儘管描述了一些多細胞酵母和通過二元裂殖來繁殖的酵母。大多數物種被歸類為需氧菌，但是兼性的和厭氧的酵母也是眾所周知的。與酵母發酵性生理學有關，酵母被歸類為兩組Crabtree陽性的和Crabtree陰性的。簡言之，Crabtree效應定義為在需氧條件下培養時由於高葡萄糖濃度(例如50克葡萄糖/L)的存在微生物的氧消耗受到抑制。如此，由於葡萄糖的存在，具有Crabtree陽性表型的酵母細胞繼續發酵，不管氧的可得性，而具有Crabtree陰性表型的酵母細胞不展現葡萄糖介導的對氧消耗的抑制。通常具有Crabtree陽性表型的酵母細胞的例子包括但不限於酵母屬OSacc/wraw少ce力、接合酵母屬(Zygayacc/^ramyce力、有孢圓酵母屬(7^"/0^0^)和德克酵母屬(DeMera)的酵母細胞。通常具有Crabtree陰性表型的酵母細胞的例子包括但不限於克魯維酵母屬(尺/^veram少c")、畢赤酵母屬(屍/c/z&)、漢遜酵母屬(/forae"M/a)和假絲酵母屬(C""^fo)的酵母細胞。在本申請中所使用"某些術語的定義之後，下文例示了本發明的某些詳細方面和實施方案。術語"碳源"一般指適合用作酵母細胞生長的碳來源的底物或化合物。碳源可以是各種形式，包括，但不限於聚合物諸如木聚糖和果膠、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、胺基酸、肽等。此類碳源更具體地包括，例如，各種單糖諸如葡萄糖和果糖、寡糖諸如乳糖或蔗糖、多糖、纖維素材料、飽和的或不飽和的脂肪酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇，或其混合物和來自可再生原料的未純化混合物，諸如乾酪乳清滲透物(cheesewheypermeate)、玉米漿(cornsteepliquor)、甜菜糖蜜(sugarbeetmolasses)、禾口大麥芽。充當用於生成正丁醇產物的合適起始材料的碳源包括，但不限於，生物質水解產物、葡萄糖、澱粉、纖維素、半纖維素、木糖、木質素、右旋糖、果糖、半乳糖、玉米、液化玉米粉、玉米漿(玉米溼磨工藝的副產品，其含有浸泡期間自玉米浸出的營養物)、糖蜜、木質纖維素、和麥芽糖。光合生物體能另外生成碳源，作為光合作用的產物。在一個優選的實施方案中，碳源可選自生物質水解產物和葡萄糖。葡萄糖、右旋糖和澱粉可以來自內源的或外源的來源。應當注意，可以用其它更加易得的和/或便宜的碳源替代葡萄糖，這對宿主微生物的改動是較為微小的。例如，在某些實施方案中，使用其它可再生的和經濟上可行的底物可能是優選的。這些包括農業廢物、基於澱粉的包裝材料、玉米纖維水解產物、大豆糖蜜、水果加工業廢物、和乳清滲透物等。五碳糖只被能夠加工這些糖的微生物菌林用作碳源，例如大腸桿菌B。在一些實施方案中，可以使用甘油(glycerol)(—種三碳碳水化合物)作為生物轉化的碳源。在其它實施方案中，可以使用甘油(glycerin)或通過水解來自植物和動物脂肪和油的甘油三酸酯得到的不純的甘油作為碳源，只要任何雜質不會對宿主微生物產生不利影響。術語"酶"，如本文中所使用的，指任何催化或促進一種或多種化學或生物化學反應的物質，其通常包括完全或部分由多肽構成的酶，但是可以包括由不同分子(包括多核苷酸)構成的酶。術語"多核香酸"在本文中可以與術語"核酸"互換使用，指由兩個或更多個單體(包括核普酸、核苷或其類似物)構成的有機聚合物，包括但不限於單鏈的或雙鏈的、有義的或反義的任何長度脫氧核糖核酸(DNA)及適當時單鏈的或雙鏈的、有義的或反義的任何長度核糖核酸(RNA)，包括siRNA。術語"核苷酸"指數種由核糖或脫氧核糖與嘌呤或嘧咬i成基及與磷酸基團相連接而組成的化合物之任一，其是核酸的基本結構單元。術語"核苷"指由噪呤或嘧咬鹼基與脫氧核糖或核糖相組合而組成的化合物(像鳥苷或腺苷)，其尤其見於核酸。術語"核脊酸類似物"或"核苷類似物"分別指其中一個或多個單獨的原子被不同的原子或被不同的官能團替換的核苷酸或核苷。因而，術語多核苷酸包括任何長度的核酸、DNA、RNA、其類似物和片段。三個或更多個核苷酸的多核苷酸也稱作核苷酸寡聚物或寡核苷酸。術語"蛋白質"或"多肽"，如本文中所使用的，指由兩個或更多個胺基酸單體和/或其類似物構成的有機聚合物。如本文中所使用的，術語"胺基酸"或"胺基酸單體"指任何天然的和/或合成的胺基酸，包括甘氨酸和D或L兩種光學異構體。術語"胺基酸類似物"指其中一個或多個單獨的原子被不同的原子或不同的官能團替換的胺基酸。因而，術語多肽包括任何長度的胺基酸聚合物，包括全長蛋白質，和肽以及其類似物和片段。三個或更多個胺基酸的多肽也稱作蛋白質寡聚物或寡肽。術語"異源"或"外源"，如本文中關於分子(特別是酶和多核苷酸)所使的分子，無關乎表達水平，其可以低於、等於或高於該分子在天然微生物中的表達水平。另一方面，術語"天然"或"內源"，如本文中關於分子(特別是酶和多核香酸)所使用的，指在它們起源的或在自然界中發現它們的生物體中表達的分子，無關乎表達水平，其可以低於、等於或高於該分子在天然微生物中的表達水平。在某些實施方案中，天然的、未工程化改造的微生物不能將碳源轉化成正丁醇或一種或多種其代謝中間產物，因為，例如，此類野生型宿主缺乏正丁醇生成途徑中所需要的一種或多種酶。在某些實施方案中，天然的、未工程化改造的微生物只能夠以小於理論產率的0.1%的產率將微量的碳源轉化成正丁醇。例如，樣i生物諸如大腸桿菌或酵母屬菌種(6Wcc/7aram;;cay^.)—般不具有將糖諸如葡萄糖轉化成正丁醇的代謝途徑，但是有可能將來自生成正丁醇的菌林(例如梭菌)的正丁醇生成途徑轉移入細菌的或真核的異源宿主中，諸如大腸桿菌或酵母屬菌種，並使用所得重組微生物來生產正丁醇。微生物，一般而言，作為宿主是合適的，如果它們擁有內在特性，諸如溶劑抗性，這會容許它們在含有溶劑的環境中代謝碳源。術語"宿主"、"宿主細胞，，和"重組宿主細胞"在本文中可以互換使用，不僅指特定的受試細胞而且指這樣的細胞的後代或潛在後代。因為在後續世代中由於突變或環境影響可能發生某些修飾，所以這樣的後代事實上與親本細胞可能不是同樣的，但是仍然包括在如本文中所使用的該術語的範圍內。對於生產正丁醇有用的宿主可以是真核的或原核的微生物。酵母細胞是優選的宿主，諸如，但不限於釀酒酵母或乳酸克魯維酵母。在某些實施方案中，其它合適的酵母宿主微生物包括，但不限於畢赤酵母屬(屍/c/^)、西洋蓍黴屬(KjroH7'")、麴黴屬(y4j/e^7'〃"j)、克魯維酵母屬(《/wyver0w7c")、管嚢酵母屬(屍ac/z;^o^")、糹工酵母屬(i/2odoto/^/a)、"l妄合酵母屬(Zygosacc/zarom7ce"、半乳糖黴屬(G^/actom_yce>y)、裂殖酵母屬(iSb/zizwacc/wrawj/ces)、青黴屬(戶em'c/〃/MW)、有孢圓酵母屬(rww/as/ora)、德巴利酵母屬(De6a70myce力、擬威爾酵母屬(附仏'op^)、德克酵母屬(De^:era)、克勒克酵母屬(尺/oed^ra)、梅奇酵母屬(MeKc/w汰ovWa)和假絲酵母屬(Gaw/Wa)物種。具體而言，本文中所公開的重組微生物被工程化改造以活化(特別是表達)能在正丁醇生產中使用的異源酶。具體而言，在某些實施方案中，該重組微術語"活化"，如本文中關於生物學活性分子(諸如酶)所使用的，指微生物的基因組和/或蛋白質組中提高該微生物中的生物學活性分子的生物學活性的任何修飾。例示性的活化包括但不限於導致分子從生物學無活性形式變成生物學有活性形式及從生物學有活性形式變成生物學更有活性形式的轉化的修飾，及導致生物學活性分子在微生物中表達的修飾，其中該生物學活性分子先前不表達。例如，生物學活性分子的活化可以如下來實施，即在微生物中表達編碼生物學活性分子的天然的或異源的多核苷酸，在微生物中表達編碼生物學活性分子的合成途徑中所牽涉的酶的天然的或異源的多核苷酸，在微生物中表達增強生物學活性分子的表達的天然的或異源的分子。即它在天然情況中不是野生型微生物的基因組的一部分，則該基因或DNA序列對於該微生物而言是"異源的"。舉例而言且不加限制，對於釀酒酵母，認為編碼以下任一項的DNA是異源的。大腸桿菌蛋白質或酶、來自釀酒酵母以外的任何其它微生物的蛋白質或酶、非轉錄和翻譯的控制序列、及突變的或其它方式修飾的釀酒酵母蛋白質或RNA，無論突變體是通過選擇而產生的，或者是被工程化改造入釀酒酵母中的。另外，認為具有在異源調節元件(誘導型啟動子、增強子等)的轉錄和/或翻譯控制下的野生型釀酒酵母蛋白質的構建體也是異源DNA。當碳源的氧化反應期間所生成的NADH等於被利用來將乙醯-CoA轉化成代謝終產物的NADH時，說碳源的代謝是"平衡的"。只有在這些條件下，所有NADH才是循環的。在沒有循環的情況中，NADH/NAD+比變得失衡(即升高)，這能將生物體引向最終死亡，除非有替代的代謝途徑來維持平衡的NAD匿AD+比。在某些實施方案中，如果微生物不使用需氧或厭氧呼吸，那么正丁醇產率最高，因為在這些情況中碳以二氧化石友的形式流失(Iost)。17醇，使得碳不以二氧化碳的形式流失。術語"需氧呼吸，，指其中氧是最終電子受體且能量通常以ATP分子的形式生成的呼吸途徑。術語"需氧呼吸途徑"在本文中與措詞"需氧代謝"、"氧化性代謝"或"細胞呼吸"可互換使用。另一方面，術語"厭氧呼吸，，指其中氧不是最終電子受體且能量通常以ATP分子的形式生成的呼吸途徑。這包括其中氧以外的有機或無機分子(例如硝酸、延胡索酸、二曱亞碸、含硫化合物諸如硫酸和金屬氧化物)是最終電子受體的呼吸途徑。措詞"厭氧呼吸途徑"在本文中與措詞"厭氧代謝"和"厭氧呼吸，，可互換使用。"厭氧呼吸"必須與"發酵"區分開。在"發酵"中，NADH將其電子貢獻給由生成NADH中攜帶的電子的同一代謝途徑所生成的分子。例如，在大腸桿菌的發酵性途徑之一中，通過糖酵解生成的NADH將其電子轉移給丙酮酸，產生乳酸。在發酵性條件下運行的微生物只能在發酵是"平衡"的情況中代謝碳源。在碳源的氧化反應期間所生成的NADH等於乙醯-CoA轉化成發酵終產物所利用的NADH時，說發酵是"平衡"的。只有在這些條件下，所有NADH才是再循環的。如果沒有再循環，NADH/NAD+比會變得不平衡，這導致生物體最終死亡，除非有可用的備選代謝途徑來維持平衡NADH/NAD+比。在氧化期間所生成的氫等於轉移給發酵終產物的氫時，則說書面發酵(writtenfermentation)是"平衡，，的。只有在這些條件下，所有NADH和還原型鐵氧還蛋白才再循環成氧化形式。重要的是要知道，發酵是否是平衡的，因為如果不是這樣，那麼整體書面反應是不正確的。厭氧條件是高產率地生成正丁醇的微生物所優選的。圖2圖示了酵母中依照本發明的實施方案將碳源轉化成正丁醇的途徑。此途徑可視為具有兩個獨特部分，其包括(l)碳源轉化成乙醯-CoA，和(2)乙醯-CoA轉化成正丁醇。由於酵母(和其它真核生物)中代謝反應的區室化和為了確保自葡萄糖生成足量的乙醯-CoA以驅動該途徑的第二部分，胞質溶膠中乙醯-CoA的生成是必要的，而且因此在本文中所公開的某些工程化變體中是升高的。關於部分(l)即碳源轉化成丁醇，可以工程化改造酵母微生物以提高胞質溶膠中丙酮酸變成乙醯-CoA的通量。如圖3中所示，釀酒酵母在線粒體中和在胞質溶膠中生成乙醯-CoA。因為乙醯-CoA變成正丁醇的轉化發生在胞質溶膠中，所以在工程化細胞中胞質溶膠中的乙醯-CoA生成升高了。任選的是，可降低或遏制線粒體中的乙醯-CoA生成。在一個實施方案中，通過提高穿過胞質"丙酮酸脫氫酶旁路"(Prank等，(1996).Yeast12(16):1607)的通量，可以自丙酮酸生成乙醯-CoA,如圖3步驟l-3所圖示的。為了提高穿過此路徑的通量，可以過表達丙酮酸脫羧酶(PDC)、醛脫氫酶(ALD)、和乙醯-CoA合酶(ACS)中的一種或多種酶。此提高"PDH旁路"路徑的活性或通量的操作能導致超過理論最大值的5%的丁醇產率的實現。因為此乙醯-CoA生成路徑生成乙醛作為中間產物，所以優選將乙醛進入遠離乙醯-CoA合成的途徑的分流降至最低，主要是通過醇脫氫酶(ADH)的活性將乙醛進一步還原成乙醇。因此，降低或消除ADH活性可進一步提高丙酮酸脫氫酶旁^各途徑的乙醜-CoA生成。例如，Crabtree陽性酵母釀酒酵母的基因組含有7種已知的ADH基因。其中，力D/Z7是胞質ADH活性的主要來源，而且刪除了爿D/77的細胞不能夠厭氧生長(Drewke等，(1990)./細^油gy172(7):3909)。如此，可能優選刪除^D/^以將乙醛變成乙醇的轉化降至最低。然而，其它ADH同等型可催化乙醛變成乙醇的還原，而且本發明也涵蓋它們的降低或刪除。此降低乙醛變成乙醇的轉化的操作單獨地或與上文所述"PDH旁路"通量升高組合地能導致超過理論最大值的10%的丁醇產率的實現。另外，丙酮酸脫氬酶催化丙酮酸變成乙醯-CoA和C02的直接轉化，同時將NAD+還原成NADH。如此在某些實施方案中，在酵母胞質溶膠中過表達丙酮酸脫氫酶。或者，將丙酮酸轉化成曱酸和乙醯-CoA,並且通過曱酸脫氫酶(其也將NAD+還原成NADH)的活性將所得曱酸進一步代謝成C02。因為上述乙醯-CoA生成路徑利用丙酮酸作為底物，所以優選將丙酮酸進入其它代謝途徑的分流降至最低。丙酮酸脫羧酶(PDC)活性代表了丙酮酸代謝的主要細胞質路徑。因此，降低或消除PDC活性可進一步提高上述路徑的乙醯-CoA生成。與消除PDC活性(如此消除"PDH旁路"路徑)組合地，對將丙酮酸轉化成乙醯-CoA的代謝途徑的操作可實現超過理論最大值的50%的丁醇產率。此改善是對酵母細胞天然代謝途徑的三項重要操作的結果(l)消除經由乙醇生成的碳流失；(2)消除細胞中在消耗大量能量的乙醯-CoA合成酶活性；和(3)平衡葡萄糖變成丁醇的轉化中所牽涉的整個途徑的輔因子(例如NAD+ZNADH)的生成和消耗(葡萄糖變成乙醯-CoA生成4個NADH，而乙醯-CoA變成丁醇的轉化消耗4個NADH)。通過提高宿主酵母細胞的整體代謝適NAD"/NADH比失衡來促進丁醇途徑功能，後兩種操作會對產率升高貢獻最大。關於部分(2)，即碳源變成丁醇的轉化，可工程化改造酵母以將乙醯-CoA轉化成丁醇。在一個所例示的實施方案中，乙醯-CoA-乙醯轉移酶將乙醯-CoA轉化成乙醯乙醯-CoA，羥丁醯-CoA脫氬酶將乙醯乙醯-CoA轉化成羥丁醯-CoA,巴豆酸酶將羥丁醯-CoA轉化成巴豆醯-CoA，丁醯-CoA脫氫酶(bcd)將巴豆醯-CoA轉化成丁醯-CoA。為了偶聯巴豆醯-CoA的還原與NADH的氧化，Bed需要電子轉移蛋白(etfA和etffi)的存在和活性。然後丁醛脫氫酶/丁醇脫氫酶將丁醯-CoA轉化成丁醛並將丁醛轉化成丁醇。該酶可來自丙酮丁醇梭菌。2007年12月3日提交的美國專利申請流水號11/949,724(在此通過述及收入本文)中記載了使用異源表達的途徑及來自產溶劑細菌(例如梭菌屬物種)的基因將乙醯-CoA轉化成正丁醇的途徑的第二部分的例子。在一些實施方案中，重組微生物可表達一種或多種異源基因，其編碼賦予生成正丁醇的能力的酶。例如，重組微生物可表達編碼厭氧活性丙酮酸脫氬酶(Pdh)、丙酮酸曱酸裂合酶(Pfl)、NADH依賴性曱酸脫氫酶(Fdh)、乙醯-CoA-乙醯轉移酶(硫解酶)、羥丁醯-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、丁醯-CoA脫氫酶、丁醛脫氬酶、正丁醇脫氫酶、雙功能丁醛/正丁醇脫氫酶中的一種或多種的異源基因。此類異源DNA序列優選是自異源微生物(諸如丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌)獲得的，而且可以使用常規分子生物學技術將這些異源基因中的一種或多種導入適宜宿主。這些異源DNA序列使得重組微生物能夠生成正丁醇，至少以比野生型對應孩i生物所生成的量大的量生成正丁醇或其代謝中間產物。在某些實施方案中，本文中所公開的重組微生物表達異源硫解酶或乙醯-CoA-乙醯轉移酶，諸如由來自梭菌屬的&/基因所編碼的。^i解酶(E.C.2.3丄19)或乙醯-CoA乙醯轉移酶是催化乙醯基縮合到乙醯-CoA分子上的酶。該酶在丙酮丁醇梭菌中由基因A/編碼(GenBank登錄號U08465,蛋白質IDAAA82724.1),在其它酶中，該酶在大腸桿菌中在其用於丙酮生成的天然啟動子下過表達(Bermejo等，y4;p/.￡>vz>o".Mz'ra6z'o/.64:1079-1085,1998)。同源酶也已經鑑定，而且通過實施針對上文蛋白質序列的BLAST搜索能容易地鑑定。這些同系物(homolog)也能充當異源表達的正丁醇途徑中的合適硫解酶。僅舉幾例，這些同源酶包括，但不限於那些來自以下各項的丙酮丁醇衝炎菌(例如，蛋白質IDAAC26026.1)，巴氏梭菌(C./7aWewn'a"Mm)(例如，蛋白質IDABA18857.1)，拜氏4炎菌(例如，蛋白質IDEAP599041或EAP59331,1),產氣莢膜梭菌(C/oWnWwm;e/^/"ge"力(例如，蛋白質IDABG86544.1,ABG83108.1)，艱難梭菌(C/a^z'cZ/wwt/驕"7e)(例如，蛋白質IDCAJ67900.1或ZP—01231975.1),熱解糖熱厭氧桿菌(772e/"woawaera6ofc/e〃'Mm//^/"way"cc/z"ra/;^CMW)(例長口，蛋白質IDCAB07500.1)，騰衝熱厭氧桿菌(77^m7oawaeraki!cfer^"gco"gera/s)(例如，AAM23825.1),生氫氧化碳嗜熱菌(Ca^oxy(iw/2em7附/z;^rage"q/^W(my)(例^口，蛋白質IDABB13995.1)，Z)esw//otomacw/MWredwce"sMI-1(例》口，蛋白質IDEAR45123.1),熱帶假絲酵母(C朋(iWa^rap/ca/h)(例如，蛋白質IDBAA02716.1或BAA02715.1)，釀酒酵母(例如，蛋白質IDAAA62378.1或CAA30788.1),芽孢桿菌屬菌種，埃氏巨球形菌(Mega;y^aerae/Wem7),和溶纖維丁酸弧菌(^^n'vz^7'oy^^o/vms)。另外，內源釀酒酵母硫解酶在異源表達的正丁醇途徑(ScERGIO)中也可以是有活性的。根據NCBI的BLAST的計算，共享至少約55%、60%、65%、70%、75%或80%序列同一性，或至少約65%、70%、80%或90%序列同源性的同系物是能在本發明的重組微生物中使用的合適硫解酶同系物。此類同系物包括(但不限於)拜氏梭菌NCIMB80S2(ZPJ)0卯^M.1或ZP—0090"89.1),丙酮丁醇梭菌ATCC824(NP—149242.1)，破傷風才炎菌(C/oWrWwwfeto"/)E88(NP—781017.1)，產氣莢膜梭菌菌林13(NP—563111.1)，產氣莢膜梭菌5VWW(YP—699470.1),巴氏梭菌(ABA18857.1)，熱解糖熱厭氧桿菌(CAB04793.1)，艱難梭菌QCD-32g58(ZP—01231975.1)，和艱難梭菌630(CAJ67900.1)。在某些實施方案中，本發明的重組-微生物表達異源3-羥基丁醯-CoA脫氫21酶，諸如由來自梭菌屬的/zZ^基因所編碼的。3-羥丁醯-CoA脫氬酶(BHBD)是催化乙醯乙醯-CoA轉化成3-羥基丁醯-CoA的酶。此酶存在生成3-羥基丁醯-CoA的(S)或(R)異構體的不同變體。本領域技術人員通過例如實施針對上文丙酮丁醇梭菌BHBD的BLAST搜索能容易地鑑定同源酶。所有這些同源酶能充當異源表達的正丁醇途徑中的BHBD。這些同源酶包括，但不限於以下各項克氏梭菌(C/os^WwmA:/w"en'),其表達此酶的兩種不同形式(Miller等，/B"c/en'o/.138:99-104,1979);和解纖維丁酸弧菌(Bw/)Ww力n'o/^^o/ve"力，其含有MM基因，其組織在其丁酸途徑剩餘部分的相同基因座內(Asanuma等，Cwre"fM/craWo/ogy51:91-94,2005;Asanuma等，Cwre",M/cro^.o/ogy47:203-207，2003)。編碼短鏈醯基-CoA脫氬酶(SCAD)的基因克隆自埃氏巨球形菌並在大腸桿菌中表達。能測定體外活性(Becker等，傷oc/ze脂;^732:10736-10742，1993)。在其它梭菌屬菌林中鑑定了其它同系物，諸如克氏梭菌(Hillmer等，F五5S丄e".21:351-354，1972;Madan等，五mk/5/oc&w.32:51-56,1973)、拜氏梭菌、熱解糖梭菌(C./7e，osacc/2ara/,'c應)、破傷風梭菌。在某些實施方案中，其中表達BHBD,選擇與上遊〃琉解酶或下遊巴豆酸酶起源相同的生物體的酶可能是有益的。這可避免在表達來自不同生物體的酶時對該途徑中鄰近蛋白質之間的潛在蛋白質-蛋白質相互作用的破壞。在某些實施方案中，本文中所公開的重組微生物表達異源巴豆酸酶，諸如由來自梭菌屬的cW基因所編碼的。巴豆酸酶或烯醯-CoA水合酶是催化順式和反式烯醯-CoA底物可逆水合成相應的(3-羥醯CoA衍生物的酶。在丙酮丁醇梭菌中，丁酸代謝的這個步驟由cw基因所編碼的EC4.2.1.55來催化(GenBank蛋白質編號AAA95967，Kanehisa,Kanehisa,Mnw"他^Sy附;.247:91-101,2002;討i侖01陽3，19-28,244-52)。來自丙酮丁醇梭菌的巴豆酸酶(Crt)已經純化至均質並得到了表徵(Waterson等，/5"/.CTzem.247:5266-5271，1972)。它在天然的和變性的狀態都表現為均質的蛋白質。該酶表現出作為四聚體發揮功能，亞基分子量為28.2kDa和261個殘基(Waterson等報導了分子量為40kDa和長度為370個殘基)。純化的酶在緩沖溶液中在4。C保存時或在冷凍時喪失活性(Waterson等，J5/o/.C7e肌247:5266-5271，1972)。該酶的最適pH為pH8.4(Schomburg等，7Vwc/e/c爿"'Ai仏32:D431-433，2004)。與具有廣泛底物特異性的哺乳動物巴豆酸酶不同，細菌的酶只水合巴豆醯-CoA和己烯醯-CoA。為巴豆醯-CoA得到了^w和7Q值為6.5x1(^摩爾每分每摩爾和3x1(T5M。該酶在巴豆醯-CoA濃度高於7x15M時受到抑制(Waterson等，J所o/.C/2e附.247:5252-5257,1972;Waterson等,/歷o/.C/;ew.247:5258-5265,1972)。已經解析出了巴豆酸酶家族的許多酶的結構(Engel等，《/Mo/.5"/.275:847-859,1998)。cW基因在大腸桿菌中高表達，而且展現出比在丙酮丁醇梭菌中所看到的更高的比活(187.5U/mg勝過128.6U/mg)(Boynton等，/i5a"en'o/.178:3015-3024,1996)。真核生物和原核生物中編碼了巴豆酸酶的許多不同同系物，它們作為丁酸代謝、脂肪酸合成、(3-氧化和其它相關途徑的一部分發揮作用(Kanehisa,Mnw"toFoM"t/5^m/7.247:91-101,2002;討論01-3，19-28,244-52;Schomburg等，A^c/e/c^c/AA"32:D431-433,2003)。這些酶中許多已經被深入研究。來自牛肝的烯醯-CoA水合酶得到了極度深入的研究和徹底的表徵(Waterson等，/B/o/.C7ze附，247:5252-5257，1972)。生成了來自細菌的巴豆酸酶的20種最親近直向同系物的ClustalW比對。同系物的序列同一性的從40%到85%不等。根據NCBI的BLAST的計算，共享至少約45%、50%、55%、60%、65%或70%序列同一性，或至少約55%、65%、75%或85%序列同源性的同系物是能在本發明的重組微生物中使用的合適Crt同系物。此類同系物包括，但不限於破傷風梭菌E88(NP—782956.1)，產氣莢膜梭菌SMW(YP_699562.1),產氣莢膜梭菌菌林13(NP—563217.1),拜氏梭菌NCIMB8052(ZP—00909698.l或ZP—00910124.1),沃氏共養單胞菌沃氏亞種哥廷根菌抹OS^"fra//zowo"ossm6s;.wo^e/Goe"/"gew)(YP—754604.1)，Desw^btomacw/mwredwce"sA/7-7(ZP—01147473.1或ZP—01149651.1),熱解糖熱厭氧桿菌(CAB07495.1),和生氬氧化碳嗜熱菌Z-2901(YP_360429.1)。在梭菌中進行的研究證明了編碼巴豆酸酶的cW基因是作為更大的BCS操縱子的一部分編碼的。然而，對溶纖維丁酸弧菌(及/ZWoso/vera)(—種來自瘤胃的生成丁酸的細菌)的研究顯示了略有不同的排列。雖然I型溶纖維丁酸弧菌具有作為操縱子的部分而簇集和排列的^/、cW、ZzM、6cd、e^和e/B基因，但是II型菌抹具有類似的簇但缺少cW基因(Asanuma等，Cwr.Mfcra&o/.51:91-94，2005;Asanuma等，Cwr.M/cra&o/.47:203-207,2003)。既然該蛋白質在大腸桿菌中充分表達且徹底表徵，那麼丙酮丁醇梭菌酶是異源表達的正丁醇途徑所優選的酶。其它可能的靶物是來自聚核梭桿菌文氏亞種(T^yo6"c/en.wwwwc/efl似wW"ce""/)(Q7P3U9-Q7P3U9—FUSNV)、艱難氺麥菌(P45361-CRTj:LODI)、巴氏梭菌(P81357-CRT—CLOPA)、和馬爾他布魯氏菌(Sr"ce〃ame/"ms/力(Q8YDG2-Q8YDG2一BRUME)的同源基因。在某些實施方案中，本文中所公開的重組微生物表達異源丁醯-CoA脫氫酶和必要時相應的電子傳遞蛋白，諸如由來自梭菌屬的6c麼d/丄和e(/B基因所編碼的。丙酮丁醇梭菌丁醯-CoA脫氫酶(Bcd)是催化巴豆醯-CoA中的碳-碳雙鍵還原以產生丁醯-CoA的酶。此還原偶聯NADH的氧化。然而，該酶需要兩種電子傳遞蛋白，即e^4和e^/B(Bennett等，FemsMfcraWo/ogy/eWews17:241-249，1995)。丙酮丁醇梭菌ATCC824的編碼酶(3-羥基丁醯-輔酶A(CoA)脫氫酶、巴豆酸酶和丁醯-CoA脫氫酶的基因在BCS操縱子上簇集，其GenBank登錄號為U17110。丁醯-CoA脫氫酶(Bcd)蛋白質序列(GenBank登錄號AAA95968.1)顯示於SEQIDNO:3。根據NCBI的BLAST的計算，共享至少約55%、60%、65%、70%、75%或80°/。序列同一性，或至少約70%、80%、85%或90°/。序列同源性的同系物是能在本發明的重組微生物中使用的合適Bcd同系物。此類同系物包括，但不限於破傷風梭菌E88(M^782955.1或NP—781376.1)，產氣莢膜梭菌菌林13(NP—563216.1)，拜氏梭菌(AF494018—2)，拜氏梭菌NCIMB8052(ZP—00910125.1或ZPJ)0909697.1),和熱解糖熱厭氧桿菌(CAB07496.1)，騰衝熱厭氧桿菌M54(NP—622217.1)。根據NCBI的BLAST的計算，共享至少約45%、50%、55%、60%、65%或70°/。序列同一性，或至少約60%、70%、80%或90%序列同源性的同系物是能在本文中所描述的重組微生物中使用的合適Hbd同系物。此類同系物包括，但不限於丙酮丁醇梭菌ATCC824(NP—349314.1)，破傷風梭菌E88(NP—782952.1)，產氣莢膜梭菌5"M7W(YP—699558.1),產氣莢膜梭菌菌林13(NP—563213.1)，糖丁酸衝炎菌(C7o"nWwmsacc/wra^O^cwm)(AAA23208.1),拜氏梭菌NCIMB8052(ZP—00910128.1)，拜氏梭菌(AF494018—5)，騰衝熱厭氧桿菌MS4(NP—622220.1)，熱解糖熱厭氧桿菌(CAB04792.1),和^汰a/^H7wweto〃/mi/geweygl^MF(ZP—00802337.1)。Bcd對丁醯-CoA的尺m為5。丙酮丁醇梭菌k^和編碼相應ETF的基因已經克隆入大腸桿菌-丙酮丁醇梭菌穿梭載體中。在用此質粒轉化的丙酮丁醇梭菌ATCC824中檢測到升高的Bed活性(Boynton等，Jowma/o/Ba"en'o/ogy178:3015-3024，1996)。丙酮丁醇梭菌P262Bcd對丁醯-CoA的^^為大約6jaM(DiezGo歸lez等，CWreWM/cra6油^34:162-166,1997)。Bcd的同系物(homologues)和相關ETF已經在生成丁酸的厭氧生物埃氏巨形菌(Williamson等，Aoc/zem/ca//owma/218:521-529，1984)、埃氏消化鏈球菌(屍eptoW/^ptococcz^e/scfem.0(Engel等，5/oc/zew/ca/Jowma/125:879，1971)、布氏共養生孑包菌0Syw^ra//7os/oraf6/^aw")(Dong等,^"om'eKw丄eewwew/2oeA:/w^7加'owfl/Jbw72fl/o/Gewera/朋(iMo/ecw/arM/craZn'o/ogy67:345-350，1995)、禾口5貴々蟲密蟲累^走體(7e/owema//zagecfewes)(George等，J0M/77a/o/Ba"eWo/ogy152:1049-1059，1982)中鑑定。埃氏巨球形菌Bcd的結構已經解析(Djordjevic等，J^oc/^w/W/j34:2163-2171，1995)。丙酮丁醇梭菌ATCC824Bed的BLAST搜索在極其多個物種中鑑定了大量同源序列，本文中上文列舉了同系物中的一些。任何編碼這些同系物的基因都可用於本發明。注意到，在一種微生物(諸如大腸桿菌)中異源表達這些基因時可產生表達問題和/或電子傳遞問題，但是在另一種微生物中則不然。另外，一種同源酶可在給定微生物中具有表達和/或電子傳遞問題，但是其它同源酶則可不然。不同的、大體等同的基因的可得性在工程化改造重組微生物時提供了更多設計選擇。一種早已在大腸桿菌中克隆和表達的有前途的Zcd來自埃氏巨球形菌，而且所表達的酶的體外活性能測定(Becker等，5/oc/^/m;^y32:10736-10742，1993)。O'Neill等報導了e^4和e/詔基因在大腸桿菌中的克隆和異源表達及對所編碼的來自埃氏巨球形菌的蛋白質的功能表徵(O'Neill等，J所o/.C/zew.273:21015-21024，1998)。用ETF測定法測量了活性，該測定法將NADH氧化與巴豆醯-CoA的還原經Bcd偶聯起來。含Bcd的重組ETF在ETF測定法中的活性與如Whitfield和Mayhew所報導的天然酶活性類似。因此，利用埃氏巨球形菌Bcd及其ETF蛋白提供了合成丁醯-CoA的解決方案。埃氏巨球形菌Bcd在重組表達時的Km測量為5pM,而在天然宿主中表達時為14(iM(DuPlessis等，所oc/zem&^y37:10469-77，1998)。埃氏巨球形菌Bcd表現出在極低濃度受到乙醯乙酸抑制C^為0.1uM)(Vanberkel等，五w■/B/oc/ze附.178:197-207，1988)。在含有A/、cW、/zk/、6c丄d/丄和"yB的基因簇。與丙酮丁醇梭菌相比，這些蛋白質的胺基酸序列相似性是高的(Asanuma等,Cwrew/Af/cra6/o/ogy51:91-94，2005;Asanuma等，Cwrew/M/cra^o/ogy47:203-207,2003)。在哺乳動物系統中，在線粒體中找到了牽涉短鏈脂肪酸氧化的類似的酶。在某些實施方案中，本文中所公開的重組微生物表達異源"反式-2-烯醯-CoA還原酶"或"TER"。反式-2-烯醯-CoA還原酶或TER是能夠催化巴豆醯-CoA轉化成丁醯-CoA的蛋白質。在某些實施方案中，重組微生物表達與來自梭菌屬和其它細菌物種的Bcd/EtfA/Etffl催化相同反應的TER。來自纖細眼蟲(五.grac/fe)的線粒體TER已有描述，而且衍生自許多物種的許多TER蛋白和具有TER活性的蛋白質已經鑑定，形成TER蛋白質家族(美國專利申請2007/0022497,Cirpus等；Hoffmeister等，/仏o/.C7iew.，280:4329-4338，2005,在此通過提述將它們完整併入本文)。纖細眼蟲基因的截短cDNA已經在大腸桿菌中功能性表達。此cDNA或來自其它微生物的同系物的基因能與正丁醇途徑基因A/、ac//7￡2、和/k/一起表達，用以在大腸桿菌、釀酒酵母或其它宿主中生成正丁醇。TER蛋白還可通過普遍公知的生物信息學方法來鑑定，諸如BLAST。TER蛋白的例子包括，但不限於，來自諸如以下物種的TER:眼蟲屬(五wg/e"fl^p.)，包括但不限於纖細眼蟲；氣單胞菌屬C4eramo"osw/.)，包括但不限於嗜水氣單胞菌(A/7j^rap/z^);冷單胞菌屬CP^c/zramo"os^;.)，包括但不限於深海冷單月包菌CP/wgra/zam");發光桿菌屬(屍/zoto6a"en'wws/p.)，包括但不限於深海發光桿菌CP;ra/Mw^m);弧菌屬(J^n'o^p.)，包括但不限於ra"gw/ww、霍亂弧菌(Kc/w/erae)、解藻朊酸弧菌(Ka/g/"o/y"c附)、副溶血弧菌(Kpara/wrewo/;^/cz^)、創傷弧菌(Kvw/"^cz^)、費氏弧菌(K/^c/en')、杣爛弧菌(K5p/e"(i/(iw力；希瓦氏菌屬(^S7zew""e〃as/p.),包4舌4旦不卩艮於51.flwazo"e"szi,51.woot/少/，5*.yh'g/(i/man'"a,5"./ae/eaw"，51.6a//ca，反石肖4匕希瓦氏菌(5*.tie"anyca"^;海;羊蟲累菌屬(Ocefl"os/7/n.〃M附sp/.);黃單月包菌屬(^￥13"//20附0"05W.)，包括但不限於稻黃單胞菌(Xow加e)、田野黃單胞菌(義cam/e^^);色鹽桿菌屬(C7zramo/za/okzcew/;.),包括但不限於需鹽色鹽桿菌(C.^/ex/ge"力；/(i/owan)"s/p.,包才舌4旦不卩艮於/.Zw/"cfl;交替J^單刀包菌屬(屍""(ioa/fera附o"ayWP.)，包括但不限於大西洋交替假單胞菌(AW/a"&");交替單胞菌屬(^4//era附。"oy5//.);iSacc/z"ra/7/zagMSsp/.,包^^旦不卩艮於51.^fegrat/am1,5".gammapro/eo6acfen'wwz，51./ro/eo6acter/ww，^艮單月包菌屬(i^ewc/omowas包括但不限於銅綠假單胞菌CPaen^/woM)、惡臭假單胞菌(Ppi^&)、焚光假單胞菌CP/7womscera);伯克霍爾德菌屬CSwA/zoWen'aw;.)，包括但不限於5.p/^to/^mara,新洋蔥伯克霍爾德氏菌(及ce"ocepac/a)，洋蔥伯克霍爾德、氏菌(5.ce;ac/"),5.<37^6^/^7'",越南伯克霍爾德、氏菌(5.v/ef"amem7》，5.mw/"wrams5.<io/as<3;曱基桿菌屬(Me^y/kc/〃uss;^.)，包括4旦不卩艮於M^age/Za^s;寡養單胞菌屬(5fewo/rop/zowo"as^;.),包括但不限於嗜麥芽糖寡養單胞菌OS.ma/to//2///a);聚集桿菌屬(Cb"greg/k"er^;.)，包括但不限於C.//torafc;沙雷氏菌屬(5fem2"a)，包括^旦不限於變形斑沙雷氏菌(S.prafea附oat/ara);;每洋單月包菌(iWlar/Mowo"as5p/.);J^e〃asp/.，包4舌^旦不卩艮於義/as"ie/"efea5pp.;科爾韋爾氏菌屬(Co/we〃/aspp.),包括但不限於C.p^c/^o^/zraea;耶爾森氏菌屬(rera/m'a^sp/.)，包括但不限於鼠疫耶爾森氏菌(Z/e幼》、々i結核耶爾森氏菌(7;wew(ioft^m^/a^);曱基菌屬(Me/Zi[y/c^ac/〃i^)，包括但不限於My7age〃a^s;喧纖維菌菌屬(Cytop/2agaWP.)，包括4旦不限於p合氏嗟纖維菌(C/mfc/H'mom'0;黃桿菌屬(F/awk"en'"wWP.)，包括但不限於Fyo/z"so"/ae;微顫菌屬(肘/<^05"7/0^/^.)，包括但不限於Mman'wa;才及i也4幹菌屬CPo/an'6a"ers/p.)，包4舌4旦不卩艮於/！/rgera";衝炎菌屬，包括但不限於丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、解纖維梭菌；柯克斯體屬(Co:aW/aW/.)，包括但不限於貝氏柯克斯體(C.6ww^7)。在前述之外，術語"反式-2-烯醯-CoA還原酶"或"TER"指能夠催化巴豆醯-CoA轉化成丁醯-CoA且根據使用預設參數的NCBIBLAST的計算，與截短的纖細眼蟲TER或全長的嗜水氣單胞菌TER之任一或二者共享至少約400/0、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列同一性，或至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大序列相似性的蛋白質。如本文中所使用的，"序列同一性"指所比對的序列中同一位置中完全相同核苦酸或胺基酸的存在。"序列相似性"考慮到了大致匹配，而且只在依照"差異"或"相同性"的一些量度對此類替代打分時有意義，在所述度量中保守的或高度可能的替代被賦以比非保守的或不大可能的替代更有利的得使用TER代替Bcd/EtfA/Etffi的另一個優點是TER在單體形式是有活性的，而且蛋白質表達和酶自身都對氧不敏感。如本文中所使用的，"反式-2-烯醯-CoA還原酶(TER)同系物"指來自其它生物體(例如，屬於眼蟲或氣單胞菌類(phylum))的酶同源多肽，其具有與上文所定義的相同的TER本質特徵，但是共享小於40°/。的序列同一性和50%的序列相似性標準，如上文所討論的。突變涵蓋一個或多個胺基酸殘基的替代、添加、刪除、倒位或插入。這容許需氧生長和正丁醇過程的表達階段期間的酶表達，能潛在容許更加高效的生物燃料生成過程。在某些實施方案中，本文中所公開的重組微生物表達異源丁醛脫氫酶/正丁醇脫氫酶，諸如由來自梭菌屬的M/"/k//^、aa丄或^//7￡2基因所編碼的。丁醛脫氬酶(BYDH)是催化丁醯-CoANADH依賴性還原成丁醛的酶。丁醛進一步被正丁醇脫氫酶(BDH)還原成正丁醇。此還原也伴有NADH氧化。丙酮丁醇梭菌含有已經顯示出將丁醯-CoA轉化成正丁醇的數種酶的基因。這些酶之一由a^/編碼(Nair等，JBa"eWo/.176:871-885,1994)。此基因在丙酮丁醇梭菌菌林DSM792中稱作a^五。該酶是犯/操縱子的一部分，而且它編碼雙功能BYDH/BDH(Fischer等，Jow7za/o/Sa"en'o/ogy175:6959-6969,1993;Nair等，JBac&Wo/.176:871-885,1994)。G^/的基因產物在大腸桿菌中功能性表達。然而，在需氧條件下，所得活性保持很低，指示氧敏感性。根據對丁醛的活性相對於對乙醛的活性為超過100倍高，Aad的主要作用在正丁醇的形成中而非乙醇(Hair等，Jowr"a/o/Ja"er油gy176:5843-5846,1994)。根據NCBI的BLAST的計算，共享至少約50%、55%、60%或65%序列同一性，或至少約70%、75%或80%序列同源性的同系物是能在本文中所公開的重組微生物中使用的合適同系物。此類同系物包括(但不限於):破傷風梭菌E88(NP—781989.1)，產氣莢膜梭菌菌林13(NP—563447.1),產氣莢膜梭菌ATCC13124(YP—697219.1),產氣莢膜梭菌SM101(YP—699787.1)，拜氏梭菌NCIMB8052(ZP_00910108.1)，丙酮丁醇梭菌ATCC824(NP_149199.1)，艱難梭菌630(CAJ69859.1),艱難梭菌QCD-32g58(ZP_01229976.1),和熱纖維梭菌(C7o^rWwmAerwoce〃ww;)ATGC27405(ZP—00504828.1)。另外兩種NADH依賴性正丁醇脫氬酶(BDHI，BDHII)已經純化，而且它們的基因(6WAM/z5)已經克隆。BDHI的GenBank登錄號是AAA23206,1,28而蛋白質序列顯示於SEQIDNO:10。BDH1I的GenBank登錄號是AAA23207.1,而蛋白質序列顯示於SEQIDNO:11。這些基因在染色體上是相鄰的，但是由它們自己的啟動子轉錄(Walter等，GWe134:107-111，1993)。BDHI利用NADPH作為輔因子，而BDHII利用NADH。然而，注意到相對輔因子偏愛是pH依賴性的。在自質粒表達M/L4後在大腸桿菌裂解物中觀察到BDHI活性(Petersen等，Jow"a/o/Bac/m'o/ogy173:1831-1834,1991)。BDHII據報導具有的對丁醛的活性是對乙醛的活性的46倍高，而且在逆方向的活性低50倍。BDHI對丁醛的活性只為對乙醛的活性約2倍高(Welch等，爿rc/z/veso/所oc/ze附/W^朋d5z'c^/z;w'c^273:309-318，1989)。如此，在一個實施方案中，在異源表達的正丁醇途徑中使用BDHII或BDHII同系物。另外，這些酶在5.5的相對較低pH最有活性，在選擇合適的宿主和/或工藝條件時可考慮此性狀。雖然上文所述基因在產溶劑的條件下轉錄，一種不同的基因，aW五2在產醇的條件下轉錄(Fontaine等，/Ba"en'o/.184:821-830，2002,GenBank登錄號AF321779)。這些條件在相對中性的pH存在。該酶已經在大腸桿菌的厭氧培養中過表達，且具有高NADH依賴性BYDH和BDH活性。在某些實施方案中，此酶是優選的酶。此酶的蛋白質序列(GenBank登錄號AAK09379.1)顯示於SEQIDNO:1。根據NCBI的BLAST的計算，共享至少約50%、55%、60%或65%序列同一性，或至少約70%、75%或80%序列同源性的同系物是能在本文中所公開的重組微生物中使用的合適同系物。此類同系物包括，但不限於產氣莢膜梭菌SM川7(YP—699787.1)，產氣莢膜梭菌菌抹13(NP_563447.1),產氣莢膜梭菌ATCC13124(YP一697219.1)，破傷風梭菌E88(NP—781989.1),拜氏梭菌NCIMB8052(ZP—00910108.1),艱難梭菌QCD-32g58(ZP—01229976.1),艱難梭菌630(CAJ69859.1),丙酮丁醇梭菌ATCC824(NP—149325.1),和熱纖維梭菌ATCC27405(ZP_00504828.1)。在某些實施方案中，可以使用與任何上述多肽至少約70%、80%、90%、95%、99%同一的，或共享至少約60%、70%、80%、90%、95%序列同源性(相似的)的任何同源酶代替這些野生型多肽。這些共享必需序列同一性或相似性的酶可以是來自不同生物體的野生型酶，或者可以是人工的重組的酶。在某些實施方案中，可以使用編碼具有與任何上述酶相同活性的酶的任何基因代替編碼上述酶的基因。這些酶可以是來自不同生物體的野生型酶，或者可以是人工的、重組的、或工程化改造的酶。另外，由於遺傳密碼的內在簡併性，也可以使用編碼基本上相同的或功能上等同的胺基酸序列的其它核酸序列來克隆和表達編碼此類酶的多核苷酸。本領域技術人員會理解，修飾編碼序列以增強其在特定宿主中的表達會是有利的。在一種物種中最常被利用的密碼子稱作最佳密碼子(optimalcodon)，而不太經常利用的密碼子歸為罕見或低使用率密碼子。可以替代密碼子以反映宿主優選的密碼子選擇，即有時稱作"密碼子優化，，或"控制物種密碼子偏好"的過程。提供了為植物中的表達而優化核苷酸序列的方法學，例如，在美國專利No.6,015，891及其中引用的參考文獻中。在某些實施方案中，本文中所公開的重組微生物具有一種或多種來自產溶劑的梭菌屬，諸如丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌的異源DNA序列。例示性的丙酮丁醇梭菌是菌抹ATCC824,而例示性的拜氏梭菌是菌林NCIMB8052。基因的表達可以通過常規分子生物學手段來實現。例如，異源基因可以在誘導型啟動子或組成性啟動子的控制下。異源基因可以整合入宿主微生物的染色體中，或者作為能穩定傳遞("遺傳")給子細胞的染色體外遺傳元件存在。此類染色體外遺傳元件(諸如質粒、BAC、YAC等)可以另外含有確保此類遺傳元件在子細胞中的存在的選擇標誌。在某些實施方案中，本文中所公開的重組微生物還可生成正丁醇生成途徑的一種或多種代謝中間產物，諸如乙醯乙醯-CoA、羥基丁醯-CoA、巴豆醯-CoA、丁醯-CoA、或丁醛，和/或其衍生物，諸如丁酸。在一些實施方案中，本文中所描述的為生成正丁醇而被工程化改造以活化一種或多種上文所述異源酶的重組微生物經異源途徑生成正丁醇。如本文中所使用的，術語"途徑"指包括一種或多種受酶控制的、將底物轉化成產物的化學反應的生物學過程。因而，用於將碳源轉化成正丁醇的途徑是包括一種或多種受酶控制的、將碳源轉化成正丁醇的反應的生物學過程。"異源途徑"指其中至少一種或多種化學反應之至少一種由至少一種異源酶催化的途徑。另一方面，"天然途徑"指其中的一種或多種化學反應由天然酶催化的途徑。在某些實施方案中，本文中所公開的重組微生物被工程化改造以活化生成正丁醇的異源途徑(在本文中也稱作正丁醇途徑)，其包含(1)2個乙醯-CoA轉化成乙醯乙醯-CoA，(2)乙醯乙醯-CoA轉化成羥基丁醯-CoA,(3)羥基丁醯-CoA轉化成巴豆醯-CoA，("巴豆醯-CoA轉化成丁醯-CoA，(5)丁醛轉化成正丁醇(見圖2例示性圖解)。2個乙醯-CoA轉化成乙醯乙醯-CoA可通過在重組微生物中表達編碼乙醯-CoA-乙醯轉移酶(硫解酶)或Thl的天然或異源基因來實施。在本文中所公開的重組微生物中合適的例示性硫解酶由如下基因編碼來自丙酮丁醇梭菌(具體而言來自菌抹ATCC824)的A/,或來自巴氏梭菌、拜氏梭菌(具體而言來自菌抹NCIMB8052或菌林BA101)、熱帶假絲酵母、芽孢桿菌屬、埃氏巨球形菌、或解纖維丁酸弧菌的編碼同源酶的基因，或選自/""或atoB的大腸桿菌硫解酶基因。乙醯乙醯-CoA轉化成羥基丁醯-CoA可通過在重組微生物中表達編碼羥基丁醯-CoA脫氬酶Hbd的天然或異源基因來實施。在本文中所公開的重組微生物中合適的例示性Hbd由如下基因編碼來自丙酮丁醇梭菌(具體而言來自菌抹ATCC824)的/zk/，或來自克氏梭菌、拜氏梭菌(具體而言來自菌抹NCIMB8052或菌抹BA101)、熱解糖梭菌、破傷風梭菌、解纖維丁酸弧菌、埃氏巨球形菌、或大腸桿菌(/a必)的編碼同源酶的基因。羥基丁醯-CoA轉化成巴豆醯-CoA可通過在重組微生物中表達編碼巴豆酸酶或Crt的天然或異源基因來實施。在本文中所公開的重組微生物中合適的例示性cW由來自丙酮丁醇梭菌(具體而言來自菌林ATCC824)的cW，或來自溶纖維丁酸弧菌、聚核梭桿菌文氏亞種、艱難梭菌、巴氏梭菌、或馬爾他布魯氏菌的編碼同源酶的基因編碼。巴豆醯-CoA轉化成丁醯-CoA可通過在重組孩史生物中表達編碼丁醯-CoA脫氬酶的天然或異源基因來實施。在本文中所公開的重組微生物中合適的例示性丁醯-CoA脫氫酶由來自丙酮丁醇梭菌(具體而言來自菌抹ATCC824)的k^/e//4/e〖/B，或來自埃氏巨球形菌、埃氏消化鏈球菌、布氏共養生孢菌、潰蝕密螺旋體、解纖維丁酸弧菌的編碼同源酶的基因，或哺乳動物線粒體Bcd同系物編碼。丁醛轉化成正丁醇可通過在重組微生物中表達編碼丁醛脫氫酶或正丁醇脫氬酶的天然或異源基因來實施。在本文中所公開的重組微生物中合適的例示性丁醛脫氫酶/正丁醇脫氫酶由來自丙酮丁醇梭菌(具體而言來自菌抹ATCC824)的W/zAM/zB、aa丄或^//^2,或來自拜氏梭菌(具體而言來自菌抹NCIMB8052或菌抹BA101)的編碼ADH-1、ADH-2、或ADH-3的基因編碼。在某些實施方案中，自乙醯-CoA至正丁醇的代謝途徑的酶是(i)硫解酶(Thl),(ii)羥基丁醯-CoA脫氫酶(Hbd)，(iii)巴豆酸酶(Crt)，(iv)醇脫氬酶(AdhE2),或正丁醇脫氬酶(Aad)或丁醛脫氬酶(Ald)加之單功能正丁醇脫氫酶(BdhA/BdhB)中的至少一種，和(v)反式-:2-烯醯-CoA還原酶(TER)(圖2)。在某些實施方案中，Thl、Hbd、Crt、AdhE2、Ald、BdhA/BdhB和Aad來自梭菌屬。在某些實施方案中，梭菌屬是丙酮丁醇梭菌。在某些實施方案中，TER來自纖細眼蟲或來自嗜水氣單胞菌。在某些實施方案中，一種或多種異源基因編碼乙醯-CoA-乙醯轉移酶(硫解酶)、羥丁醯-C0A脫氬酶(/26力、巴豆酸酶(cr0、和醇脫氫酶(ad/^2)、丁醯-CoA脫氫酶(6c力、丁醛脫氫酶(M/L4/Z^/^)/丁醇脫氫酶(aa力、和反式-2-烯醯-CoA還原酶(TER)中的一種或多種。例如，乙醯-CoA-乙醯轉移酶(硫解酶)可以是來自丙酮丁醇梭菌的A/，或來自巴氏梭菌、拜氏梭菌、熱帶假絲酵母、芽孢桿菌屬菌種、埃氏巨球形菌、或溶纖維丁酸弧菌的同源酶，或選自fadA或atoB的大腸桿菌硫解酶。羥丁醯-CoA脫氬酶可以是來自丙酮丁醇梭菌的hbd，或來自克氏梭菌、拜氏梭菌、熱解糖梭菌、破傷風梭菌、解纖維丁酸弧菌、埃氏巨球形菌、或大腸桿菌(fadB)的同源酶。巴豆酸酶可以是來自丙酮丁醇梭菌的crt,或來自溶纖維丁酸弧菌、聚核梭桿菌文氏亞種、艱難梭菌、巴氏梭菌、或馬爾他布魯氏菌的同源酶。丁醯-CoA脫氫酶可以是來自丙酮丁醇梭菌的bcd/etfA/etffi，或來自埃氏巨球形菌、埃氏消化鏈球菌、布氏共養生孢菌、潰蝕密螺旋體、解纖維丁酸弧菌的同源酶，或真核線粒體bcd同系物。丁醛脫氫酶/丁醇脫氫酶可以是來自丙酮丁醇梭菌的bdhA、bdhB、aad、或adhE2，或來自拜氏梭菌的ADH-1、ADH-2、或ADH-3。反式-2-烯醯-CoA還原酶(TER)可以來自纖細眼蟲或嗜水氣單胞菌。一種或多種異源DNA序列可以來自選自丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌的產溶劑梭菌，或來自艱難梭菌、巴氏梭菌、克氏梭菌、熱解糖梭菌、破傷風梭菌、熱帶假絲酵母、芽孢桿菌屬菌種、馬爾他布魯氏菌、埃氏巨球形菌、溶纖維丁酸弧菌、聚核梭桿菌文氏亞種、埃氏消化鏈球菌、布氏共養生孢菌、32在某些實施方案中，丙酮丁醇梭菌是菌林ATCC824，而拜氏梭菌是菌林NCIMB8052或菌抹BA101。在某些實施方案中，共享至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%序列同一性，或至少約50%、60%、70%、80%、90。/o序列同一性(根據NCBIBLAST的計算，使用預設參數)的同系物對於本發明是合適的。部分(l):工程化改造丙酮酸變成乙醯-CoA的轉化如上所述，丙酮酸變成乙醯-CoA的轉化可通過兩種一般路徑發生在工程化細胞中(A)如上所述的"PDH旁路"路徑或(B)胞質溶膠中通過PDH或通過PFL進行的丙酮酸變成乙醯-CoA的直接轉化。(A)經"PDH旁路，，路徑生成乙醯-CoA關於自丙酮酸生成乙醯-CoA的路徑(A)，胞質乙醯-CoA生成途徑是由三種酶催化的，如圖3中步驟1、2和3所示。通過提高那些限速的酶的活性實現了生成乙醯-CoA的更有效途徑。例如，在釀酒酵母中，如果ALD活性在途徑中是限制性的，那麼^LD6的過表達會由此提高通過該途徑的整體通量。經以下機制之一或其組合實現了胞質溶膠中升高的乙醯-CoA形成在一個實施方案中，通過丙酮酸脫羧酶基因(例如，釀酒酵母屍Z)C7、屍DC5和/或屍DC6;步驟l)的過表達可生成升高的乙醯-CoA。在另一個實施方案中，通過乙醛脫氫酶基因(例如，釀酒酵母^丄Z^;步驟2)的過表達可生成升高的乙醯-CoA。在又一個實施方案中，通過乙醯-CoA合酶基因(例如，釀酒酵母JGS/或^CS2或二者；步驟3)的過表達可生成升高的乙醯-CoA。在一個不同的實施方案中，ALD和ACS(釀酒酵母JZD6;步驟2)二者的同時過表達可生成升高的乙醯-CoA(步驟2和3)。在另一個實施方案中，PDC、ALD、和ACS基因的同時過表達可生成升高的乙醯-CoA生成(步驟l-3)。為了進一步提高乙醯-CoA生成，可以降低或消除酵母中的主要胞質乙醇生成途徑。在Crabtree陽性釀酒酵母中，這是通過刪除v4D/7/來實現的，JD///是胞質ADH活性的主要來源。刪除了^DH7的細胞不能夠厭氧生長(Drewke等，(1990).J.Bacteriology172(7):3909),而且如此可能優選刪除^D/Z/以將乙醛變成乙醇的轉化降至最低。消除此途徑選擇性驅動乙醛通向乙酸且隨後通向乙醯-CoA生成(圖3，步驟5)。因此，可以在具有降低的或消除的ADH活性的細胞中實施上文所述基因的過表達。類似的，可以在Crabtree陰性酵母諸如乳酸克魯維酵母中通過刪除ADHI或ADHII降低或消除胞質ADH活性，用以提高經"PDH旁路"路逕自丙酮酸至乙醯-CoA的通量。因此，在此生物體中，與上文對釀酒酵母所提議的類似，可以經由單獨的或組合的尺M丄D6、AX4CS7或AX4GS7的過表達來提高經過"PDH旁路"路徑的通量。(B)自丙酮酸直接生成乙醯-CoA關於自丙酮酸生成乙醯-CoA的路徑(B),可以通過形成完整PDH複合物的基因的過表達來提高乙醯-CoA生成。例如，過表達的基因可以來自大腸桿菌(aceE、aceF、和/p^4)、運動發酵單胞菌(Z少mcwowosmo&7z》(^//z/4ot、/c/^4y5、/<i/i6、和&力、金黃色葡萄球菌(5!top/^/ococcw51"wm^y)(/<i/L4、/<i^S、—/7C、和、才古草芽孑包4幹菌(5acz'〃wss"6"fc)、谷氛酸氺奉#幹菌(Co/7"e6acen'wwg/wto附/cwm)、或4同糹錄"f叚單月包菌(屍sewiiomomMaerwg/wos")(步驟4)。丙酮酸脫氫酶複合物催化丙酮酸變成乙醯-CoA的轉化。在釀酒酵母中，此複合物定位在線粒體內膜空間中。因此，在釀酒酵母的細胞質中獲得更高水平乙醯-CoA的另一種方法是工程化改造細胞以過表達能在細胞質中發揮功能的真核的或原核的丙酮酸脫氫酶複合物(步驟4)。在某些實施方案中，本文中所公開的重組微生物包括在厭氧或微需氧條件下有活性的丙酮酸脫氫酶(Pdh)。丙酮酸脫氫酶或NADH依賴性曱酸脫氫酶對於重組微生物而言可以是異源的，即編碼這些酶的編碼序列是異源的，或轉錄調節區是異源的(包括人工的)，或所編碼的多肽包含包含序列變化，其使得該酶對某些代謝中間產物或底物帶來的反饋抑制有抗性。直到最近，才廣泛接受了Pdh在厭氧條件下不發揮功能，但是數份最近的報告證明了情況並非如此(deGraef，M.等，1999，JournalofBacteriology,181，2351-57;Ver證i，G.N.等，2002,AppliedandEnvironmentalMicrobiology,68,1715-27)。此外，其它微生物諸如糞腸球菌CE"&racocc^/aecafc)即使在厭氧條件下也展現出Pdh複合物的高體內活性，前提是生長條件使得穩態NAD應AD+比足夠低(Snoep，J.L.等，1991，F^twMkro&o/ogy81，63-66)。代替調節Pdh表達和功能的氧，已經顯示了Pdh受到NADH/NAD+比的調節(deGraef,M.等，1999，/ow"a/o/5a"enb/ogy，181,2351-57)。如果在宿主細胞中表達的正丁醇途徑消耗NADH快得足以在細胞內部維持低NADH/NAD+水平，那麼內源或異源表達的Pdh可維持活性和提供NADH，其足以平衡該途徑。這些Pdh酶能在本文中所公開的重組微生物中平衡正丁醇途徑。在厭氧條件下功能性的Pdh的表達預期提高每摩爾葡萄糖獲得的NADH摩爾數。Kim等記載了Pdh使得在大腸桿菌中消耗每摩爾葡萄糖可得到多達4摩爾NADH(Kim，Y.等(2007).jpp/.五"Wramw.M/cra&o/"73，1766-1771)。也可以工程化改造酵母，以表達來自各式各樣細菌來源的PDH複合物。例如，來自糞腸球菌的Pdh與來自大腸桿菌的Pdh類似，但是在低得多的NADH/NAD+水平被滅活。另外，有些生物體諸如枯草芽孢桿菌和幾乎所有乳酸細菌菌抹在厭氧代謝中使用Pdh。如果正丁醇生成途徑能與內源發酵性途徑竟爭的話，那麼在表達厭氧活性Pdh的微生物中表達正丁醇生成途徑預期導致大於1.4%的正丁醇產率。或者，可以通過過表達兩種細菌酶，即丙酮酸曱酸裂合酶(例如大腸桿菌py/B)和曱酸脫氫酶(例如博伊丁氏假絲酵母(Caw^feZ)oWw7)/^7)，在胞質溶膠中生成乙醯-CoA。使用此途徑，丙酮酸被轉化成乙醯-CoA和曱酸。然後曱酸脫氫酶催化曱酸變成二氧化碳的NADH依賴性轉化。這些反應的淨結果與丙酮酸脫氬酶複合物將丙酮酸轉化成乙醯-CoA的情況相同丙酮酸+NAD十—乙醯-CoA+NADH+C02。NADH依賴性甲酸脫氫酶(Fdh;EC1.2丄2)催化曱酸變成0)2的氧化和同時的NAD+變成NADH的還原。Fdh可依照本發明用於提高宿主微生物內的NADH胞內可得性，而且可用於在NADH方面平tf正丁醇生成途徑。具體而言，可以在宿主微生物中活化(具體而言是過表達)生物學活性NADH依賴性的Fdh。在存在這種新引入的曱酸脫氫酶途徑時，l摩爾曱酸轉化成二氧化碳時會形成1摩爾NADH。在某些實施方案中，在天然微生物中，曱酸脫氫酶將曱酸轉化成C02和H2，不牽涉輔因子。另外，可以使用本領域技術人員已知的方法對任何編碼外來酶的基因(或本文中所提及的任何其它的)(或任何控制或調控其表達的調節元件)進行另外，為了調控此途徑，可以表達來自其它真菌和細菌物種的丙酮酸脫羧酶、乙醯-CoA合成酶、和乙醛脫氬酶基因。多種生物體能充當這些酶的來源，包括，但不限於酵母屬菌種，包括釀酒酵母突變林和葡萄汁酵母(5*.mwwm);克魯維酵母屬，包括耐熱克魯維酵母(KAemoto/eram)、乳酸克魯維酵母、和馬克思克魯維酵母(尺man:/amw);畢赤酵母屬；漢遜酵母屬，包括多形漢遜酵母(7/:;o/;;wc^/w);假絲酵母屬；絲孢酵母屬(7Hc/20^ora")、y"ma(iaz戸af，包括Ks印/to;7brw/os/ora/reton'em^;粟酒裂殖酵母(Sc/z/zasacc/zaram少ce;函6e);隱球菌屬菌種(Oj^/ococctws/.);麴黴屬菌種；脈孢菌屬菌種(A^wms:;oraw.)或黑粉菌屬菌種(as"/agow.)。有用丙酮酸脫羧酶的例子是那些來自貝酵母(5^cc/2Cfraw少CM6a少a"w)(1PYD)、Ca"t/Wag/a6rato、乳酸克魯維酵母(KIPDC1)、或構巢麴黴(Ap^^〃附m'血/ara)(PdcA)、和來自白色假絲酵母(C朋tfefoa/Wcara)、粗糙脈孢菌(A^Mmy/oracrowa)、構巢麴黴、或乳酸克魯維酵母(ACSl)的乙醯-CoA合酶，和來自黑麴黴C4werg/〃wsm'ge"(ALDDH)、白色假絲酵母、新生隱球菌(Oj;tococc^"eq/b，am)(alddh)的乙醛脫氫酶。有用原核酶的來源包括，但不限於大腸桿菌、運動發酵單胞菌、芽孢桿菌屬菌種、梭菌屬菌種、假單胞菌屬菌種、乳^求菌屬菌種(丄actococcws;.)、腸4幹菌屬菌種(五"&raZfl"ers/.)和沙、門氏菌屬菌種(&^0"6//0平)。通過工程化改造這些酶以實現增強的活性，可獲得此途徑的進一步增強，其通過定點誘變和其它進化方法(這包括本領域技術人員已知的技術)來實現。原核生物，諸如，但不限於，大腸桿菌、運動發酵單胞菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌屬菌種、梭菌屬菌種、棒桿菌屬菌種、假單胞菌屬菌種、乳球菌屬菌種、腸桿菌屬菌種、和沙門氏菌屬菌種，能充當這種酶複合物的來源。例如，來自大腸桿菌(aceE、aceF、和//^4)、運動發酵單胞菌(pdhAoc、pdhA(3、pdhB、和Ipd)、金黃色葡萄球菌(pdhA、pdhB、pdhC、和pdhC)、枯草芽孢桿菌、穀氨酸棒桿菌、和銅綠假單胞菌的丙酮酸脫氫酶複合物可用於此目的。培養和操作酵母的方法是本領域公知的。在酵母細胞中過表達基因、以各種較低的水平表達基因、遏制基因表達、或刪除基因的方法是本領域公知的，而且本發明涵蓋任何此類方法用於構建本發明的酵母菌抹。可使用任何方法來將外源核酸分子導入酵母中，而且許多此類方法是本領域技術人員公知的。例如，轉化、電穿孔、接合、和原生質體融合是用於將核酸導入酵母細胞的常用方法。參見例如Ito等，《/5ac/era/.153:163-16836(1983);Durrens等，Cwr.18:7-12(19卯)；及Becker和Guarente,M"/wA/"五"2^wo/ogy194:182-187(1991)。在一個實施方案中，感興趣基因進入DNA片段或靶基因的整合依照同源重組的原理發生。依照這個實施方案，含有包含至少一種酵母標誌基因的模塊、有或無待整合基因(內部模塊)的整合盒任一側翼均為與靶定整合位點的末端同源的DNA片段(致重組序列)。通過適宜方法用該盒轉化酵母后，致重組序列之間的同源重組可導致內部模塊替換基因組中與整合盒的致重組序列對應的兩個位點之間的染色體區域。在一個實施方案中，為了刪除基因，整合盒可包括適宜的酵母選擇標誌，其側翼為致重組序列。在一個實施方案中，為了異源基因整合入酵母染色體中，整合盒包括在適宜啟動子和終止子控制下的異源基因，與選擇標誌一起，側翼為致重組序列。在一個實施方案中，異源基因包含適宜的天然基因，期望提高天然基因的拷貝數。選擇標誌基因可以是任何在酵母中使用的標誌基因，包括，但不限於，來自釀酒酵母的WM3基因或同源基因；或潮黴素抗性基因，它們分別用於對轉化細胞進行基於營養缺陷型互補或抗生素抗性的選擇。可以隨意選擇致重組序列，這取決於適合於期望應用的期望整合位點。另外，在一個實施方案中，使用本領域技術人員公知的技術自基因組中清除某些被導入的標誌基因。例如，通過將含有^^43的細胞在含有？0八(5-氟-乳清酸)的培養基中塗板，並選擇FOA抗性菌落，能獲得WL43標誌丟失(Boeke,J.等，1984，Mo/.197，345-47)。可以將包含在本公開內容酵母細胞內的外源核酸分子以任何形式維持在該細胞內。例如，可以將外源核酸分子整合入細胞的基因組中，或維持在附加體狀態，其能穩定地傳遞("遺傳")給子細胞。此類染色體外遺傳元件(諸外，可以穩定地或瞬時地轉化酵母細胞。另外，本文中所描述的酵母細胞可含有單拷貝或多拷貝的如上所述特定外源核酸分子。用於自外源核酸分子表達多肽的方法是本領域技術人員公知的。此類方法包括但不限於構建核酸，使得調節元件促進編碼期望多肽的核酸序列的表如此，調節元件包括但不限於啟動子、增強子等等。例如，外源基因可以在誘導型或組成性啟動子的控制下。此外，用於在酵母中自外源核酸分子表達多肽的方法是本領域技術人員公知的。例如，能夠在克魯維酵母屬(參見例如美國專利No.4,859,596和4，943,529,通過述及將每一篇完整收入本文)和酵母屬(參見例如Gelissen等，1卯(1):87…7(199乃)中表達外源多肽的核酸構建體是公知的。在另一個實施方案中，異源控制元件可用於活化或遏制內源基因的表達。另外，在要遏制或消除表達時，可以通過已知的刪除技術來消除有關酶、蛋白質或RNA的基因。如本文中所描述的，本公開內容範圍內的酵母可通過對所表達的、過表達的或遏制的特定酶特異性的選擇技術來鑑定。鑑定具有期望表型的菌林的方法是本領域技術人員公知的。此類方法包括但不限於PCR和核酸雜交技術諸如Northern和Southern分析，在特定基底(substrate)上或在存在特定底物(substrate)、化學品、選擇劑等時改變的生長能力。在有些情況中，可使用免疫組織化學和生物化學技術通過檢測所編碼多肽的表達來測定細胞是否含有特定核酸。例如，可使用對所編碼的酶具有特異性的抗體來測定特定酵母細胞是否含有該所編碼的酶。另外，可使用生物化學技術通過檢測作為酶多肽表達的結果而生成的產物來測定細胞是否含有編碼酶多肽的特定核酸分子。例如，用編碼乙醯-CoA合成酶的載體轉化細胞並檢測到升高的胞質乙醯-CoA濃度指示載體存在且基因產物有活性。用於檢測特定酶活性或特定產物的存在的方法是本領域技術人員公知的。例如，可以如Dalluge等，爿"a/.歷o，fl/.C&m.374(5):835-840(2002)所記載的來測定乙醯-CoA的存在。本發明的酵母細胞具有降低的酶活性，諸如降低的醇脫氫酶活性。術語"降低的"，如本文中關於細胞和特定酶活性所使用的，指比在相同物種的可比較酵母細胞中所測量到的水平要低的酶活性。如此，缺乏醇脫氫酶活性的酵母細胞視為具有降低的醇脫氫酶活性，因為大多數(如果不是所有的話)可比較的酵母菌抹具有至少一些醇脫氫酶活性。此類降低的酶活性的原因可以是較低的酶濃度、較低的酶比活、或其組合。許多不同方法可用於使得酵母具有降低的酶活性。例如，可以工程化改造酵母細胞，以具有遭到破壞的編碼酶的基因座，其使用常用誘變或敲除技術來實現。參見例如MethodsinYeastGenetics(1997年版)，Adams,Gottschling,Kaiser，和Stems,ColdSpringHarborPress(1998)。或者，可使用反義技術來降低酶活性。例如，可以工程化改造酵母，以含有編碼反義分子的cDNA,該反義分子阻止酶生成。術語"反義分子"，如本文中所使用的，涵蓋任何含有與內源多肽編碼鏈對應的序列的核酸分子。反義分子還可具有側翼序列(例如調節序列)。如此，反義分子可以是核酶或反義寡核苷酸。核酶可具有任何通用結構，包括，但不限於，髮夾、錘頭、或斧頭(axhead)結構，前提是該分子切割RNA。具有降低的酶活性的酵母可使用任何方法來鑑定。例如，可使用常用方法來容易地鑑定具有降低的醇脫氫酶活性的酵母，例如通過經氣相層析測量乙醇形成。在一個實施方案中，可以使用兩步過程自本公開內容的代謝工程化菌株之一生成正丁醇。因為高水平的丁醇(例如在培養基中為1.5%,這一般隨酵母和菌種而變化)對於細胞可以是有毒性的，一種獲得大量正丁醇的策略是培養能夠在其中不生成丁醇或只生成不顯著的、無毒性的量的丁醇的條件下生成正丁醇的菌林。此步驟容許大量活細胞的積累，即顯著量的生物質，然後可以將其轉換成其中生成正丁醇的生長條件。這樣的策略容許在毒性問題變得重要和減緩細胞生長之前生成大量正丁醇。例如，可以在需氧條件下培養細胞(其中正丁醇生成受到遏制或缺失)，然後轉換成厭氧或微需氧條件以生成正丁醇(例如通過活化已經依照本發明被工程化改造入菌種中的適宜的代謝途徑)。或者，有關酶的表達可以在誘導型控制下，例如熱敏感性啟動子或其它熱敏感性步驟(諸如酶自身的熱穩定性)，使得第一個步驟發生時伴有有關途徑或酶關閉(即無活性)，誘導發生(例如溫度轉變)和正丁醇生成。用於對基因進行誘導型控制的方法是公知的。熱穩定的酶是已知的，或者可以通過本領域已知方法來選擇。正如在本公開內容的其它過程中那樣，一旦生成正丁醇，就可以依照一個實施方案回收它。用於自微生物(包括酵母)回收正丁醇的過程披露於2007年12月3日提交的美國臨時申請流水號11/949,724，通過述及收入本文。本領域技術人員會領會，可以對上文所描述的發明進行各種省略、添加和修改，而不偏離本發明的範圍，而且所有此類修改和變化意圖落在所附權利要求書限定的發明範圍內。在此通過述及將所引用的所有參考文獻、專利、專利申^青、和其它文件收入本文。實施例表l列舉了實施例l-38中所描述的一組基因。給出了可用於擴增每一種基因的有關引物(正向的和反向的)、以及每一種引物的序列。基因是依照對每一種物種適宜的命名規則列舉的；在某些所列舉的基因前面有兩個字母，它們代表了給定基因起源的屬和種的第一個字母。對於某些基因名稱，附有後綴"-co"，指示使用細菌大腸桿菌或酵母釀酒酵母優選的密碼子使用率構建了經過密碼子優化的合成基因，正如正文中所指明的。表l基因SEQIDNO:SEQID70:基因引物名稱引物序列155Gevo-3"42ICilGCiACJAIUAAAAAUAlIIIItilA(JIltiUAUGevo-17543AATTGGATCCTTATTTAGAATAATCATAGAATCCTCb-crt156Gevo-31244GTTCTTGTCGACATGGAATTAAAAAATGTTATTCTTGGevo-17145AAIIGGAIGCIIAIIIAIIIIGAAAAIIUIIICJIGGOb掘157Gevo-31346CAAGAGGTCGACATGAATTTCCAATTAACTAGAGAACGevo-31447GCGTCCGGATCCCTATCTTAAAATGCTTCCTGCG158Gevo-31548CGGAAAGTCGACATGAATATAGCAGATTACAAAGGCGevo-17349AATTGGATCCTTATTCAGCGCTCTTTATTTCTTTA159Gevo-31650CAAAATGTCGACATGAATATAGTAGTTTGTGTAAAACGevo-31751IAAIIIG(JAIGGIIAGAIGIA(JIGIIIIICIIIIAAICb-a掘160Gevo-31952GAACCAGTCGACATGGCACGIIIIACTTTACCAAGGevo-17753AATTGGATCCTTACAAATTAACTTTAGTTCCATAGGb-a她161Gevo-31854TCCATAGTCGACATGAATAAAGACACACTAATACCTGevo-24955AATTGGATCCTTAGCCGGCAAGTACACATCTTCTTTGTCTCa-加162Gevo-30856GATCGAGTCGACATGAAAGAAGTTGTAATAGCTAGGevo-30957GTTA'IAGGAICCCIAGCA(JIIII(JIAGCJAAIAIIGCa-,163Gevo-28158GTGGATGTCGACATGAAAAAGGTATGTGTTATAGGTGGevo-16159AAI圖AIOJIIAIlIIGAAIAAIUJIA(JAAAaJICa-crt164Gevo-28260TCCTACGTCGACATGGAACTAAACAATGTCATCCTGevo-28361TAACT丁GGAICCCIAI(JIAIIIIICJAAGCXIl(JAAICa-6cc/165Gevo-28462CAAGAGGTCGACATGGATTTTAATTTAACAAGAGAACGevo-28563CAATAAGGA丁CCTTATCTAAAAATTTTTCC丁GAAATAACCa-e鵬166Gevo-28664CGGGAAGTCGACATGAATAAAGCAGATTACAAGGGCGevo-28765GTTCAAGGATCCTTAATTATTAGCAGCTTTAAC丌GCa-e他167Gevo-28866CAAAATTGTCGACATGAATATAGTTGTTTGTTTAAAACGevo-28967(JlIIIAGGAICX;iIAAAIAIAGI(ilIGIl(JIIIIAAIIIItableseeoriginaldocumentpage41tableseeoriginaldocumentpage42tableseeoriginaldocumentpage43表2列舉了一組質粒構建體及其有關特徵，正如實施例中所描述的。表中包括有關質粒名稱(pGV);存在的原養型標誌，其對於質粒在適宜的營養缺陷型菌種中的選擇和維持是有用的；啟動子序列(來自給定釀酒酵母基因區域)；前述啟動子控制下的基因；另外的啟動子+基因組合，如果存在的話。tableseeoriginaldocumentpage43tableseeoriginaldocumentpage44tableseeoriginaldocumentpage45表3描述了攜帶各種質粒並由此表達一組所導入的基因(如列舉的)的酵母釀酒(菌林W303a)酵母中所生成的丁醇表3:釀酒酵母轉化體的丁醇生成tableseeoriginaldocumentpage45所有基因克隆和組合規程最初是使用已建立的方法(Miller，J.H.，1992;Sambrook，J.等，2001)在大腸桿菌中實施的。對於在酵母釀酒酵母中的表達有用的一組載體先前已有記載(Mumberg,D.等(1995)Gene156:119-122;Sikorski和Heiter(1989)Genetics122:19-27)。具體而言，這些出版物記載了一組選擇標誌(7/ZS3、Z^tT2、77屍/、f/W力和釀酒酵母複製起點，它們在表2中所列舉的許多載體中也有使用。實施例1:用於在酵母釀酒酵母中表達丁醇途徑基因的質粒構建使用剛好在起始密碼子上遊引入5^/I位點和剛好在終止密碼子之後引入Sam/7I位點的引物，通過PCR自來自釀酒酵母菌林W303a的基因組DNA克隆了釀酒酵母硫解酶基因五WG川。將此PCR產物用5^/I和5am/7I消化並克隆入pUC19(Yanisch-Perron，C，Vieira，J.,1985,G匿，33，103-19)的相同位點以生成pGV1120。分別使用質粒pGV1031、pGV1037、pGV1094、和pGV1095作為PCR擴增丙酮丁醇梭菌基因(Oz-)Q-A/、Ca-ZzM、Ca-cw、和Ca-Z^/z5的模板。使用pGV1090作為PCR擴增O^c丄Ca-"/4、和Oz-e(/B的模板。使用梭菌ATCC824的基因組DNA來擴增Ca-6WA將擴增片段用5WI和^^7/I消化並克隆入pUC19的相同位點。此方案生成質粒pGV1121、pGV1122、pGV1123、pGV1124、pGV1125、pGV1126、pGV1127、pGV1128，它們分別含有基因C"-/W、Ca誦/^丄Qz-cW、Ca-6c丄Ga-e^4、Ca-e(/B、07-6J/l4、和G3扁^Z/z5。使用設計成剛好在起始密碼子上遊引入Sa/I位點和剛好在終止密碼子下遊引入5am/ZI位點的引物，通過PCR擴增拜氏梭菌(C6-)基因C6-Z^丄O)-cW、C6-k^、C6-e(/^、C6-e(/B、0-aW/z、和CZw^/z丄分別使用質粒pGV1050、pGV1049、pGV1096和pGV1091作為PCR擴增C6-Z2M、C6-cW、07-aW/z、和C6-atZ/^的模板。使用拜氏梭菌ATCC51743的基因組DNA作為C6-k^、C6-e^4、和C6-e/B的模板。將PCR擴增片段用Sa/I和^^/7I消化並克隆入pUC19的相同位點。此規程生成質粒pGV1129、pGV1130、pGV1131、pGV1132、pGV1133、pGV1134、和pGV1135，它們分別含有基因CW26丄cw、C6-6cc/、CZ-"/4、C6-"/B、C6畫"W/7、和0-a^L4。還克隆了為在大腸桿菌中表達進行過密碼子優化的(-co)丙酮丁醇梭菌和埃氏巨球形菌(Me-)基因。這些基因包括Ca-thl-co、Ca-hbd-co、Ca-crt-co、Ca-bcd-co、Ca-etfA-co、Ca-etfB隱co、Ca-adhE2-co、Me-bcd-co、Me-etfA-co、和Me-etffi-co。使用設計成剛好在起始密碼子的上遊引入5^/I位點和剛好在終止密碼子下遊引入Sam別位點的引物，擴增除了Ca-thl-co和Me-etffi-co以外的這些基因。在Ca-thl-co和Me-etffl-co的情況中，引物設計成剛好在起始密碼子的上遊引入五coiI位點和剛好在終止密碼子的下遊引入5amM位點。將所得PCR產物用適宜的限制酶消化0S(3/I和5am/yi或&o/I和萬am/7I)並克隆入pUC19的相同位點以生成質粒pGV1197、pGV1198、pGV1199、pGV1200、pGV1201、pGV1202、pGV1203、pGV1205、pGV1206，它們分別含有基因Ca-thl-co、Ca-hbd-co、Ca-crt-co、Ca-bcd-co、Ca-etfA-co、Ca-etffi-co、Ca-adhE2-co、Me-etfA-co、和Me-etffl-co。將Me-bcd-co基因作為片段直接克隆入pGV1103中以生成pGV1214。將上述基因克隆入高拷貝酵母表達載體pGV1099、pGV1100、pGV1101、pGV1102、pGV1103、pGV1104、pGV1105和pGV1106。表2中描述了用於基因克隆的載體和所得質粒構建體的特性。使用Sa/I和BamHI分別自pGV1120和pGV1121釋放硫解酶基因五/G^和a^/z/並克隆入pGV1099(攜帶/7ZS^標誌)以生成pGVli:3S和pGV1139。使用五coRI和5am/TI自pGV1197取出經過密碼子優化的硫解酶基因Ca-AZ-co並克隆入pGV1099以生成pGV1207。如此，這些基因克隆成符合兩個拷貝的AU1標籤(SEQIDNO:172)的讀碼框並使用釀酒酵母7^F7啟動子區(SEQIDNO:175)表達。使用Sa/I和Bamm分別將羥丁醯-CoA-脫氫酶基因Ca-;zk/(來自pGVl122)、0>-/7k/(來自pGVl129)、和Ca-/zk/-co(來自pGVl198)克隆入pGV1100(攜帶Z^"2標誌)以生成pGV1140、pGV1141、和pGV1208。這導致這些基因克隆成符合HA標籤(SEQIDNO:173)的讀碼框並使用r五F/啟動子表達。使用&/1和^^附//1分別將巴豆酸酶基因Ca-cW(來自pGV1123)、O-cW(來自pGV1130)、C"-cW-co(來自pGV1199)克隆入pGV1101(攜帶77屍/標誌物)以生成pGV1142、pGV1143、和pGV1209。如此，這些基因克隆成符合兩個拷貝的AU1標籤的讀碼框並使用7^F7啟動子表達。將丁醯-CoA脫氬酶和相應的電子傳遞基因和e/B克隆到myc標籤(SEQIDNO:174)後面，使用來自釀酒酵母的77)/B啟動子區(SEQIDNO:176)表達。將0^c《來自pGV1124)、C6-k^(來自pGV1131)、Ca-kY/-co(來自pGV1200)和Me-bcd-co基因克隆入pGV1103(攜帶77753標誌)以生成pGV1144、pGV1145、pGV1210、和pGV1214。分別將C"-"/^(來自pGV1125)、Ca-e(/B(來自pGV1126)、C6-"/^(來自pGV1132)、C6-e(/B(來自pGV1133)、Ga扁e(/B-co(來自pGV1202)、和Me-e^-co(來自pGV1205)基因克隆入pGV1104(攜帶丄五C/2標誌)以生成pGV1146、pGV1147、pGV1148、pGV1149、pGV1212、和pGV1215。分別將Oz-"^-co(來自pGV1201)和Me-^/B-co(來自pGV1206)克隆入pGV1104(攜帶7T屍7標誌)以生成pGV1211和pGV1216。將醛脫氫酶基因C6-aW/z(來自pGVl134)克隆入pGVl102(攜帶t7/L43標誌)以生成pGV1150。將C6-aW/2基因放置成符合HA標籤(SEQIDNO:173)的讀碼框，使用7E^7啟動子表達。將雙功能醛/醇脫氫酶Cfl-a"t/、Ca-^/;^2、和Ca-ac/Z^2-co及特定醇脫氫酶Oz-M/l4、C"-6^B、和C6-a^^克隆到myc標籤後面，在7D/D啟動子控制下表達。使用設計成剛好在起始密碼子上遊引入5b/I位點和剛好在終止密碼子下遊引入Mrt位點的引物，通過PCR擴增O-aad和Ca-^Z/^:入使用質粒pGV1089作為Ca-aad的模板，而4吏用丙酮丁醇梭菌基因組DNA作為Ca-ad/^2的模板。使用5^/I和iVM將這些PCR產物克隆入pGV1106(攜帶WM3標誌)以生成pGV1136(Ca-aa力和pGV1137(Ca-a^￡2)。使用51"/1和56^//1將經過密碼子優化的0-^//^2《0(來自pGV1203)克隆入pGV1106以生成pGV1213。使用Sa/I和BawM分別將醇脫氫酶Ca-M/"(來自pGV1127)、Ca-k/;^(來自pGV1128)、和C6-a^v4(來自pGV1135)克隆入pGV1106以生成pGV1151、pGV1152、和pGV1153。因此，將丁醯-coA脫氫酶、電子傳遞蛋白A、電子傳遞蛋白B、和特定醇脫氫酶的上文所述酵母表達基因與7EF7啟動子驅動的硫解酶、羥丁醯-CoA脫氫酶、巴豆酸酶、或醛脫氫酶以成對方式組合，如表2中所匯總的。為此目的，分別將來自pGV1144(7Z>//3啟動子和C"-k^)和來自pGV1145(7P//3啟動子和C6-6c力的￡co/C7^I至Wol片段克隆入pGV1138的用Klenow填平)至A7/oI位點以生成pGV1167(￡WG^+Ca4ccO和pGV1168(￡7G70+C6-k^)。還分別將這些相同的五co/CiI至^7zoI片段類似地克隆入pGV1139以生成pGV1169(a^W+Ca-6c力和pGV1170(0-A/+C6-6cc0。使用相同的策略，分別將來自pGVl146(7X)/7_5啟動子和、pGV1148(n)/D啟動子和Ca-e(/B)、pGV1147(7P/D啟動子和C6-"/v4)、和pGVl149(7D7/3啟動子和CZ)-e(/B)的五co/C7I至^7zo1片段克隆入pGVl140、pGV1141、pGV1142、pGV1143的iVort(用Klenow填平)至^7oI位點以生成pGV1171(C"-編+Oz-e剣、pGV1172(CW什Ca-e卿、pGV1173(C^-M^+0-W/v4)、和pGVlH4(C6-cW+C6-e/B)。類似地通過分別將來自pGV1151(7T)/B啟動子和Ca-、pGV1152(H)//3啟動子和Oz-k//^)和卩0￥1153(7//3啟動子和0)-^/^)的&0/01至屈01片段克隆入？0￥1150的(用Klenow填平)至Iol位點以生成pGV1175(C6-aW/z+a-M/")、pGV1176(C6-aW/7+C"-k//7B)、和pGV1177(C6-aW/2+C6-fl^L4)，將醛脫氫酶和醇脫氬酶組合。在經過密碼子優化的基因的情況中，分別將來自？0￥1210(7^//3啟動子和Ca-k^-co)、pGV1211(77)/W啟動子和C"-"/4-co)、pGV1212(7D/D啟動子和a-e^B-co)的五co/C7I至WoI片段克隆入pGV1207、pGV1208、和pGV1209的5am別(用Klenow補平)至^7zoI位點以生成pGV1220(Ca-A/-co+Ca-6o/-co)、pGV1217(0-/2Z^-co+Ca-"/4-co)、和pGV1218(Ca匿cW-co+Q-e/S-co)。分別將來自pGV1214(7D//3啟動子和Me-bcd-co)、pGV1215(7D/73啟動子和Me-etfA-co)、pGV1216(r/)/0啟動子和Me-etfB-co)的五co/C7I至扇oI片段克隆入同一組載體以生成pGV1224(Oz-A/-co+Me-bcd-co)、pGV1221(0-/2^/-co+Me-etfA-co)、和pGV1222(Ca-cW-co+Me-etfB-co)。另夕卜，將來自卩0￥1210(7!)//3啟動子和07-k^-co)和來自pGV1214(7D/73啟動子和Me-k^-co)的五co/C7I至^oI片段克隆入pGVl138的萬am/ZI(用Klenow補平)至JWzoI位點以生成pGV1223(EAG76l+a^c^-co)和pGV1219(￡扁0+MeU-co)。在上述途徑之外，生成了利用k^/e^4/e《/B複合物的替代物，即反式-烯醯還原酶和巴豆醯-CoA還原酶的構建體。自丙酮丁醇4炎菌(CaAr)、嗜水氣單胞菌04/7-fer)、和纖細眼蟲(五g-^0克隆了反式-烯醯還原酶基因，而且自山丘鏈黴菌(&re/tow_ycwco〃/""力ccr)克隆了巴豆醯-coA還原酶。使用設計成剛好在起始密碼子上遊引入^/I位點和剛好在終止密碼子下遊引入iVo/I位點的引物，自丙酮丁醇梭菌基因組DNAPCR擴增了Ca:/^。使用設計成剛好在起始密碼子的上遊引入Sa/I位點和剛好在終止密碼子的下遊引入萬amM位點的引物，分別自pGVl114、pGVl115、和pGVl166PCR擴增了l/er、￡g*、和Sc-ccr。這三種基因的序列已經為大腸桿菌中的表達進行了密碼子優化。還有，五g-fer序列編碼缺失可能牽涉線粒體定位的N-末端區域的蛋白質。使用適宜的限制酶將相應的PCR產物克隆入pGV1103以生成pGV1155(Ca-/eO、pGVl156(屈勿)、pGVl157(五g漏敏)和pGVl158(&償)。為了用於在酵母中表達丁醇途徑，將k^/"/4/e〖/B複合物的這些替代物中每一種與硫解酶基因在一個質粒上組合。將Ca-fer、J/2-fer、五g-er和Sc-ccr基因與03-^"0基因組合，通過分別將來自pGV1155、pGV1156、pGV1157和pGV1158的五co/C/I至Wol片段克隆入pGV1207的^m//1(用Klenow補平)至屈ol位點以生成pGV1225(0^/z/匿co+Ca-^0、pGV1226(Ca-A/-co+J/7-&0、pGV1227(C"W-co+五g智)和pGV1228(0^/，+&-<^)。實施例2:酵母提取物/Western印跡分析為了分析蛋白質表達，通過快速TCA沉澱方案製備粗製酵母蛋白質提取物。收集l個OD600當量的細胞並在冰上用200pL1.85NNaOH/7.4。/o2-巰基乙醇處理10分鐘。添加200(aL50。/。TCA並將樣品在水上再溫育10分鐘。通過以25，000rcf離心2分鐘來收集所沉澱的蛋白質並用lml水冷的丙酮清洗。再次通過以25,000rcf離心2分鐘來收集蛋白質。然後將沉澱物重懸於SDS樣品緩沖液並煮沸(99。C)10分鐘。將樣品在離心機中以最大速離心30秒以清除不溶物。將樣品通過SDS-PAGE分開並轉移至硝酸纖維素。4吏用TMBWestern印跡試劑盒(KPL)進行Western分析。HA.ll、myc(9E10)、和AU1抗體得自Covance。如製造商所述的那樣實施Westerns，只是在使用myc抗體時，使用補充有1。/o檢測塊粉(detectorblockpowder)的0.3x至0.5x檢測塊溶液(detectorblocksolution)。利用這種方法檢驗了實施例l中所描述的所有基因的表達。實施例3:酵母轉化使用乙酸鋰法(Gietz,R,D.a.R.A.W.，2002,Me/ZzoA&￡"z_ymo/ogy，350,87-96)進行了釀酒酵母(W303a)轉化。簡言之，將lml過夜酵母培養物稀釋入50mL新鮮YPD培養基並在30。C搖床中溫育5-6小時。收集細胞，用50mL無菌水清洗，再用25mL無菌水清洗。用lmLlOOmM乙酸鋰重懸細胞並轉移至微量離心管。通過離心10秒來沉澱細胞。丟棄上清液並將細胞重懸於4倍體積的100mM乙酸鋰。將15jiL細胞添加至DNA混合物(72(iL50Q/oPEG、lOpL1M乙酸鋰、3uL10mg/ml變性鮭魚精DNA、2pL每種期望的質粒DNA和無菌水至總體積100(iL)。將樣品於30。C溫育30分鐘並於42。C熱激22分鐘。然後通過離心10秒來收集細胞，重懸於100pLSOS培養基(Sambrook,J.,Fritsch，E.F.,Maniatis,T.,1989)，並在不含尿嘧啶、色氨酸、亮氨酸或組氨酸的適宜SC選擇板(KaiserC,M.，S.和Mitchel,A，1994)上塗布。實施例4:正丁醇的生成對表達與所建議的丁醇生成途徑有關的酶的不同組合的轉化體(上文表l)評估正丁醇生成。如下製備隔離群的預培養物，即將來自SC瓊脂板的少數菌落接種入3mlSC培養基(KaiserC，M.，S.和Mitchel,A，1994),在需氧條件下於30。C以250rpm搖動16小時。將所得細胞以4000xg沉澱5分鐘並重懸於500jalSC培養基。通過合適稀釋度的600nm吸光度來評估細胞生長。對於所測試的每一種隔離群，將產生15個OD的細胞注射(200nl)入裝有5ml先前已經用N2氣飽和以消除溶解氧的SC厭氧培養基的厭氧balch管。將管於30。C溫育，以250rpm搖動來防止細胞沉降。在接種後IO、26、44和70小時對管取樣，即用無菌注射器取出500ial培養物。之後，將250{1140%葡萄糖溶液注射入每一個管以維持培養基中適量的碳。在每一個時間點，將所回收的樣品離心以沉澱細胞，並立即冷凍上清液直至收集了所有樣品。通過氣相層析(GC)分析測定轉化體的正丁醇生成。將所有冷凍樣品於室溫融化並將400nl每一種樣品及作為內部對照添加的80(^110mM戊醇通過0.21im濾器過濾。將20(V1所得濾出液置於GC管形瓶中並進行GC分析。在配備有HP-7673自動取樣系統的帶火焰離子化檢測儀(FID)的系列IIPlus氣相層析儀上運行樣品。基於可信標準品的保留時間來鑑定分析物，並使用5點校準曲線來定量。以ljil體積注射所有樣品。在連接FID檢測儀的DB-FFAP毛細管柱(30m長度，0.32mmID,0.25|im薄膜厚度)上實施正丁醇產物的直接分析。用於將醇產物分開的溫度程序為225。C注射器，225。C檢測儀，50°C烤箱O分鐘、然後8。C/分鐘梯度至80。C、13。C/分鐘梯度至170。C、50。C/分鐘梯度至220。C、然後220。C3分鐘。為了評估丁醇生成，測試了每一種質粒組合的兩個獨立轉化體。上文表3總結了結果。"隔離群名稱"下的兩個Gevo名稱指為每一種質粒組合所評估的兩個獨立轉化體。下文(圖6)顯示了相對於僅用空載體即GevolllO和Gevollll轉化的隔離群，最好的兩種生產者即轉化體Gevol099和Gevoll02隨時間變化所生成的丁醇量。Gevol099和Gevoll02展現出丁醇生成隨時間的升高，在接種後24-72小時丁醇濃度分別自123!iM升高至313pM和自57^iM升高至317nM。51實施例5:大腸桿菌丙酮酸脫氫酶亞基在釀酒酵母中的克隆和表達此實施例的目的是描述如何自一起包含在大腸桿菌中找到的丙酮酸脫氫酶(PDH)的三種亞基的大腸桿菌克隆ace五、aceF、和//^基因。使用PCR自基因組DNA擴增這三種基因。此實施例還例示了這三種基因的蛋白質產物如何在宿主生物體即釀酒酵母中表達。使用大腸桿菌基因組DNA作為模板，通過PCR擴增來自大腸桿菌的//%^基因。為了特異性擴增/;^」，使用引物Gevo-610和Gevo-611;製造商的試劑盒中供應了其它PCR擴增試劑，例如，KOD熱啟動聚合酶(Novagen，Inc.,產品目錄#71086-5)，並依照製造商的方案來使用。正向和反向引物分別摻入編碼^/I和A72oI限制性內切核酸酶位點的核苷酸。將所得PCR產物用Sa/I和^zo1消化並克隆入pGV1103，產生pGV1334。對所插入的//^4DNA完整測序。使用與上文所述類似的辦法，將來自大腸桿菌的ace五和aceF基因插入pGV1334。使用引物Gevo-606和Gevo-607自大腸桿菌基因組DNA擴增ace五基因，用5W/I+loI消化，並克隆入經5WI+loI切割的載體pGV1334，產生pGV1379。對ace五插入物完整測序。為了獲得具有適合於釀酒酵母表達的不同原養型選擇標誌的質粒，作為S"/I+屈o1片段自pGV1379克隆出ace五插入物並克隆入經5WI+^oI切割的pGV1104,產生pGV1603。使用引物Gevo-653和Gevo-609自大腸桿菌基因組DNA擴增aceF基因。將所得1.9kb產物用Sa/I+ioI消化並克隆入經相同酶切割的載體pGV1334，產生pGV1380。對aceF插入物完整測序。為了獲得具有適合於釀酒酵母表達的不同選擇標誌的質粒，自pGV1380克隆出aceF插入物並克隆入pGV1105,產生pGV1604。為了在釀酒酵母中表達這些蛋白質，用pGV1334、pGV1603、和pGV1604的任意組合轉化釀酒酵母菌4朱Gevo1187(CEN.PK)，並在適宜淘汰培養基(dropoutmedia)上選擇轉化體，正如實施例3中所描述的。作為對照，用相應的空載體即pGV1103、pGV1104、和pGV1105分別轉化細胞。如下對自轉化體培養得到的培養物測定LpdA、AceE、或AceF表達，即製備粗製酵母蛋白質提取物並通過Western印跡分析它們(基於檢測每一種蛋白質中所存在的Myc表位)，正如實施例2中所描述的。實施例6:自基因組DNA克隆釀酒酵母PDH亞基，消除內源線粒體靶向序列的修飾，和它們在釀酒酵母細胞中的表達在大多數真核生物中，丙酮酸脫氫酶(PDH)複合物定位在線粒體內部。右的胺基酸，包含PDH的各種蛋白質被引向進入線粒體。這樣的序列的存在可通過實驗或計算(例如通過程序MitoProt:http:〃mi。s.。sf.de/cqi-bin/proi/medqen/mitofilter)來測定。蛋白質成功車#入線#立體後發生特異性蛋白水解切割，靶向序列被消除，導致"經過切割的"輸入形式。眾所周知，通過遺傳改變蛋白質的編碼序列自該蛋白質消除這樣的序列引起該蛋白質變得不能夠移行入線粒體。如此，一種用於將正常情況中在線粒體中的蛋白質改向進入胞質溶膠的誘人策略牽涉只表達編碼蛋白質在線粒體輸入和後續蛋白酶切割之後剩餘的"經過切割的"部分的那部分基因。此實施例的目的是描述構成釀酒酵母丙酮酸脫氫酶複合物的數種基因的克隆，及這些基因在釀酒酵母細胞培養物中的表達和檢測。通過PCR克隆編碼PDH各亞基的數種基因，其基本上使用實施例5中所描述的規程，只是模板是釀酒酵母基因組DNA。表l中顯示了要擴增的釀酒酵母基因和所使用的相應引物。為了生成編碼預測定位在胞質溶膠中的蛋白質的基因，每一對引物(表1中所列舉的)中所列舉的第一種引物設計成擴增每一種基因中預測編碼線粒體把向序列的那部分下遊的區域。使用用於擴增每一種基因的引物中所編碼的獨特限制酶位點，將所得PCR產物克隆入載體pGV1103,產生表2中所列舉的質粒。對每一種插入物完整測序。為了測試每一種基因的表達，僅用pGV1381、pGV1383、pGV1384、或pGV1385中每一種轉化釀酒酵母菌抹Gevo1187(CEN.PK)，其基本上遵循實施例3中所描述的規程，並在SC-his限定的淘汰培養基上選擇HIS+菌落。通過溶胞物製備和和Western印跡(用以^r測每一種蛋白質中所存在的Myc標籤)來測定蛋白質表達，正如實施例2中所描述的。實施例7:釀酒酵母亞基/:屍Z)i的克隆和表達及其在釀酒酵母細胞中的表達此實施例描述了如何通過PCR自釀酒酵母基因組DNA克隆基因丄屍D7，53及如何檢測丄屍D7在宿主釀酒酵母細胞中的表達。在PCR反應中使用引物Gevo-658加Gevo-659擴增缺乏那些預測編碼線粒體靶向序列的核香酸的Lpdl可讀框，基本上如實施例5中所描述的。將1.5kb產物用^7zoI+SamM消化並克隆入經相同限制酶切割的pGVl103。將所得克隆pGVl103-lpdl轉化入Gevol187並通過HIS+原養型來選擇所得菌落，基本上如實施例3中所描述的。培養含有pGV1103-lpdl的細胞的培養物並如下檢測丄屍D/表達，即收穫細胞，接著是Western印跡(針對蛋白質上所存在的Myc標籤)，基本上如實施例2中所描述的。實施例8:大腸桿菌PDH亞基的克隆及其在乳酸克魯維酵母中的表達某些酵母，尤其是那些已知是"Crabtree陰性"，提供了作為生產宿主的獨特優點。與在需氧條件下將過量葡萄糖發酵成乙醇的Crabtree陽性菌林(例如釀酒酵母)不同，Crabtree陰性菌抹(諸如克魯維酵母屬的那些)取而代之地會經TCA循環來代謝葡萄糖以生成生物質。因此，Crabtree陰性酵母耐受所謂的葡萄糖異化PDH旁路路徑的滅活(例如通過刪除/i7屍Z)C7基因)(在需氧生長期間)。以下實施例描述了如何將編碼大腸桿菌PDH的三種亞基的基因克隆入適合於在酵母乳酸克魯維酵母中表達的載體，以及還有如何檢測那些基因的表達。如實施例5中所述PCR擴增大腸桿菌基因/;^4、ace五、和aceF。將所得PCR產物用&/1+^01消化並分別克隆入均經5"a/I+WoI切割的載體pGVl428、pGV1429、和pGV1430。這些步驟產生了質粒pGV1428-lpdA、pGV1429-aceE、和pGV1430-aceF。對每一種插入物完整測序。依照已知方法(例如KooistraR，HooykaasPJ,SteensmaHY.(2004)reaW.15;21(9):781-92)用這些質粒之一或任意組合轉化乳酸克魯維酵母菌種(例如Gevo1287),並通過適宜的原養型來選擇所得菌落。如實施例2中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Western印跡分析(基於檢測每一種蛋白質中所存在的Myc表位)對自轉化體培養得到的培養物測定LpdA、AceE、或AceF表達。實施例9:過表達PDH亞基的細胞中PDH活性的測量此實施例的目的是描述如何通過體外測定法的手段來測量PDH活性。文獻中記載了對細胞溶胞物中PDH活性定量的方法(WenzelTJ等(1992).￡wJ歷oc/zew209(2):697-705)。此方法利用自富含線粒體的細胞級分衍生的溶胞物。此方法的一個不同實施方案利用自全細胞獲得的細胞溶胞物作為PDH來源。此類溶胞物是如先前(實施例2)所述製備的。此測定方法的另一個實施方案使用自高度富含胞質(非線粒體)蛋白質的細胞級分衍生的細胞溶胞物。此生物化學分級會降低內源線粒體PDH在測定法中的貢獻。製備此類富集溶胞物的方法是商品化的且本領域技術人員公知的(例如線粒體/胞質溶膠分級試劑盒，BioVision,Inc.,MountainView,CA)。在另一個實施方案中，藉助一種或多種表達質粒中所編碼的Myc表位標籤的存在自細胞免疫純化PDH活性。免疫純化帶表位標籤的蛋白質的方法是本領域4支術人員公知的(例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,(1988)CSHLPress)。經過免疫純化的PDH複合物如此有別於內源複合物並充當前述PDH體外測定法中的活性來源。實施例10:過表達PDH的細胞中增加的胞內乙醯-CoA的測量此實施例的目的是描述如何能在一群培養的酵母細胞中測量乙醯-CoA(即PDH的產物)的胞內水平。為了測量胞內乙醯-CoA,對那些攜帶表達整套PHD基因所必需的適宜質粒組合(例如pGV1334、pGV1603、和pGV1604)的酵母轉化體評估細胞乙醯-CoA水平，與只含載體的對照轉化體(例如pGV1103、pGV1104、和pGV1105)進行比較。在搖瓶中在適當限定的淘汰培養基(例如SC-His、-Leu、-Trp)中將酵母細胞培養至飽和。測定培養物的光密度(OD600)並通過以2800xg離心5分鐘來沉澱細胞。使用珠式破碎儀(beadbeater)裂解細胞並將溶胞物用於使用已建立方法(Zhang等,ConnectionofPropionyl-CoAMetabolismtoPolyketideBiosynthesisinAspergillusnidulans.G認"cs,168:785-794)進行的蛋白質觀'J定和乙醯-CoA測定分析。實施例ll:大腸桿菌PDH亞基基因和丁醇生成途徑在釀酒酵母中的共表達此實施例的目的是描述如何在宿主釀酒酵母中與那些構成丁醇生成途徑的基因一起共表達編碼大腸桿菌PDH亞基的基因。與丁醇生成途徑一起共表達PDH會相對於只表達丁醇途徑而胞質溶膠中沒有異源表達的功能性PDH提高所生成的丁醇的產率。將所克隆的基因、aceE和aceF(見實施例5)亞克隆入丁醇途徑基因質粒，具體是pGV1208、pGV1209和pGV1213(表2)。為此，將pGV1334、pGV1603和pGV1604均用限制酶五co/C7I+^oI消化，並將所得釋放的插入物連接入pGV1208、pGV1209和pGV1213，這些質粒經Bam/7I消化，用KlenowDNA聚合酶補平懸垂，然後經iol消化，所有這些操作均使用標準分子生物學方法(Sambrook，J.Fritsch，E.F.，Maniatis，T.,1989)。這些步驟分別產生了pGV1208-lpdA、pGV1209-aceE和pGV1213-aceF。將所得質粒與pGV1227—起轉化入Gevoll87並選擇HIS、LEU、TRP和URA原養型，所有操作基本上如實施例3中所描述的。使用經親本質粒pGV1208加pGV1209加pVG1213加pGV1227轉化的菌抹作為對照，用以評估PDH共表達對丁醇生成的影響。丁醇生成是如實施例4中所述實施的。正丁醇產率大於10%。實施例12:在厭氧條件下或在過量NADH條件下功能性的一種PDH形式的生成此實施例的目的是描述在厭氧下有活性的，或在存在相對於正常需氧生長期間所存在的比要高的[NADH]/[NAD+]比時有活性的突變型PDH的分離。這樣的突變型PDH是想要的，因為它可容許甚至在^(敖需氧或厭氧條件下都有持續的PDH酶活性。先前(Kim，Y.等(2007).J;//.￡"v/raww.M/craZ/o/"73，1766-1771;美國專利申請No.11/949,724,完整收入本文)記載了獲取和鑑定允許微需氧或厭氧活性的改變型式PDH的方法。實施例13:具有降低的丙酮酸脫羧酶活性或沒有丙酮酸脫羧酶活性的釀酒酵母菌林中大腸桿菌PDH亞基基因和丁醇生成途徑的共表達此實施例的目的是描述如何在具有降低的丙酮酸脫羧酶(PDC)活性或沒有丙酮酸脫羧酶(PDC)的宿主釀酒酵母菌林中與構成丁醇生成途徑的基因共表達編碼大腸桿菌PDH亞基的基因。PDC和PDH二者利用並因此竟爭可利用的丙酮酸池。儘管PDH的產物乙醯-CoA能直接被丁醇途徑所利用，但是PDC的產物乙醛能被進一步還原成乙醇(經醇脫氫酶)，丁醇發酵的一種不想要的副產物，或者能經乙醛脫氬酶加乙醯-CoA合酶的協同作用被轉化成乙醯-CoA。如此，降低或消除PDC活性會提高在胞質溶膠中還過表達功能性PDH的細胞中丙酮酸變成丁醇的產率。pdc-釀酒酵母菌抹的生成文獻(例如Flikweert，M.T.等，(1996).ifea^15;12(3):247陽57;FlikweertMT等，(1999).F￡MSM/cra&o/丄e".l;174(l):73-9;vanMarisAJ等，(2004)^p/￡"v/rawM/cra&'o/.70(1):159-66)中記載了具有降低的PDC活性或沒有PDC活性的釀酒酵母菌株，而且它們是本領域技術人員公知的。在一個實施方案中，缺乏所有PDC活性的釀酒酵母菌林具有基因型pdclApdc5Apdc6A。此類菌林缺乏可檢測到的PDC活性，而且不能夠在作為唯一碳源的葡萄糖上生長，但是能在生長培養基補充有作為替代碳源的乙醇或乙酸時存活。在另一個實施方案中，此菌林的衍生物已經進化成在葡萄糖上生長，葡萄糖是方便且常用的碳源。具有大大降低的PDC活性的菌林的第三個實施方案是有關基因型pdc2A的菌林，在文獻(FlikweertMT等，(1999).所o&c/wo/66(1):42-50)中也有記載。任何這些菌株均能充當PDH加丁醇途徑表達的有用宿主。在必要時，可以通過標準分子生物學手段和酵母遺傳技術來工程化改造任何pdc-突變抹，使得那些營養缺陷型標誌可利用，使得能選擇質粒pGV1208-lpdA、pGV1209-aceE、和pGV1213-aceF並在宿主細胞中穩定維持。此類遺傳工程會通過破壞有關內源基因來發生，其通過基於[7/M3的破壞盒，及後續通過FOA反選擇來消除L^43標誌來實施。過表達PDH的pdc-菌抹中的丁醇生成將所克隆的基因/pW、ace五和aceF(見實施例5)亞克隆入丁醇途徑基因質粒，具體是pGV1208、pGV1209和pGV1213(表2)，基本上如實施例ll中所描述的。將質粒組pGV1208-lpdA加pGV1209-aceE加pGV1213-aceF加pGV1227、或作為對照的組pGV1208加pGV1209加pGV1213加pGV1227轉化入適宜的pdc-酵母突變林並在液體培養物中培養所得菌落。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於50%。有可能的是，具有降低的PDC活性或沒有PDC活性的菌林會展現出顯著的生長缺陷，並因此可能不得不補充另外的碳源(例如乙酸或乙醇)。因為pdc-釀酒酵母中的生長缺陷源自它們胞質乙醯-CoA池的缺失，所以預期PDH在胞57復可充當胞質溶膠中PDH活性的有用體內讀出。實施例14:釀酒酵母中的pfl(丙酮酸曱酸裂合酶)和FDHl(甲酸脫氫酶)表達大腸桿菌/7yw(無活性的丙酮酸曱酸裂合酶)和p/M(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)的克隆為了克隆大腸桿菌p/L5和;/L4,分別使用大腸桿菌基因組DNA和pflB—forw、PflB—rev和PflA—forw、PflA—rev引物擴增基因。為了克隆博伊丁氏假絲酵母屍D///(OkFDZ/7)基因，與fdh一forw和fdh—rev引物一起使用博伊丁氏假絲酵母的基因組DNA。利用分別摻入正向和反向基因擴增引物的限制性位點5^/I和五coRI，將所擴增的DNA連接到經Sa/I和五coiI消化的pGV1103、pGV1104和pGV1102上，產生pGV1103pflA、pGV1104pflB和pGV1002fdhl。自所得質粒表達的蛋白質分別帶myc、myc和HA標籤。利用所得質粒(pGV1103pflA、pGV1104pflB和pGV1002fdhl)和載體(pGV1103、pGV1104和pGV1102)來轉化酵母菌抹Gevo1187，如實施例3所指出的，以生成表達PflA、PflB、Fdhl(PFL+)的轉化體和對照(PFL-)轉化體。通過HIS、TRP和URA原養型選擇來選擇這兩組轉化體。如實施例2中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Western印跡分析對所得轉化體評估PflA、PflB和Cb-Fdhl表達。對那些被證實表達所有三種蛋白質的酵母轉化體評估細胞乙醯-CoA水平，與只含載體的對照轉化體進行比較。為此，以搖瓶形式在Sc-ura,his，trp培養基中培養PFL+和PFL-細胞。測定培養物的光密度(OD600)並通過以2800xrcf離心5分鐘來沉澱細胞。使用珠式破碎儀裂解細胞並將溶胞物用於使用已建立方法(Zhang等,ConnectionofPropionyl-CoAMetabolismtoPolyketideBiosynthesisinAspergillusnidulans.GWe"'cs,168:785-794)進行的蛋白質測定和乙醯-CoA測定分析。評估每mg細胞總蛋白質的乙醯-CoA量。為了評估PflA、PflB和Fdhl表達對正丁醇生成的影響，將p/L4、//75和C6-FD7/7亞克隆入含有pGV1208、pGV1209和pGV1213的丁醇途徑基因(表1)。為此，使用標準分子生物學方法(Sambrook,J.Fritsch,E.F.，Maniatis，T.,1989)，將pGV1103pflA、pGV1104pflB和pGV1002fdhl用Eco/C7I+^zoI限制58酶消化並連接入經Saw/7I(隨後用Klenow補平末端)+^7zoI消化的pGVU08、pGV1209和pGV1213以生成pGV1208PflA、pGV1209PflB和pGV1213Fdhl。將所得質粒與pGV1227—起轉化入Gevoll87並選擇His、Leu、Trp和Ura原養型。使用GevolllO和Gevollll作為對照隔離群(表l)。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於10%。實施例15:具有降低的丙酮酸脫羧酶活性或沒有丙酮酸脫羧酶活性的釀酒酵母中的PflA、PflB和Fdhl表達如實施例14中所述進行大腸桿菌;/75(無活性的丙酮酸曱酸裂合酶)和pyi4(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)和O)-F￡>///的克隆。利用所得質粒(pGV1103pflA、pGV1104pflB和pGV1002fdh1)和載體(pGV1103、pGV1104和pGV1102)來轉化釀酒酵母(有關基因型wra3、^7、A&3、/ew2、/7dc7、/&5、；t/c6)酵母菌抹，如實施例3所指出的，以生成表達PflA、PflB、Cb-Fdhl的(PFL+)轉化體和對照(PFL-)轉化體。通過HIS、TRP和URA原養型選擇來選擇這兩組轉化體。如實施例2中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Western印跡分析對所得轉化體評估PflA、PflB和Fdhl表達。如實施例14中所述，對那些被證實表達所有三種蛋白質的酵母轉化體評估細胞乙醯-CoA水平，與只含載體的對照轉化體進行比較。為了評估表達PflA、PflB和Fdhl對正丁醇生成的影響，將pGV1208PflAl、pGV1209PflB和pGV1213Fdh1與pGV1227—起轉化入釀酒酵母(MATA、腦3、trpl、his3、leu2、pdcl、pdc5、pdc6)並選擇His、Leu、Trp和Ura原養型。使用GevolllO和llll作為對照隔離群(表l)。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於50%。實施例16:具有降低的^lD^/活性或沒有^Dfl7活性的釀酒酵母中的Pfl和Fdhl表達大腸桿菌/7j^(無活性的丙酮酸曱酸裂合酶)和;乂L4(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)的克隆如實施例14中所述進行大腸桿菌;/B(無活性的丙酮酸曱酸裂合酶)和p/L4(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)和C6-FZ)/7/的克隆。如實施例3中所迷，利用所得質粒(pGV1103pflA、pGV1104pflB和pGV1002fdhl)和載體(pGVl103、pGV1104和pGVl102)來轉化酵母菌林Gevo1253(adhlA)以生成表達PflA、PflB、Fdhl的(PFL+)轉化體和對照(PFL-)轉化體。通過HIS、TRP和URA原養型選擇來選擇這兩組轉化體。如實施例2中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Western印跡分析對所得轉化體評估PflA、PflB和Fdhl表達。如實施例14中所述對那些被證實表達所有三種蛋白質的酵母轉化體評估細胞乙醯-CoA水平，與只含載體的對照轉化體進行比較。為了評估過表達PflA、PflB和Fdhl對正丁醇生成的影響，將pGV1208PflA、pGV1209PflB和pGV1213Fdhl與pGV1227—起轉化入Gevol253並選擇His、Leu、Trp和Ura原養型。使用GevolllO和llll作為對照隔離群(表l)。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於10%。實施例17:自釀酒酵母克隆屍Z)C7基因及其在釀酒酵母中的過表達此實施例的目的是描述在組成性有活性的啟動子控制下克隆編碼丙酮酸脫羧酶的基因，及描述這樣的基因在釀酒酵母宿主細胞中的表達。在基本上如實施例5中所述實施的PCR反應中使用引物Gevo-639加Gevo-640自釀酒酵母基因組DNA擴增完整PDC7ORF。將所得1.7kb產物用A72oI+5am//1消化並連接入經切割的載體pGVl106,產生pGV1389(見表2)。將插入物完整測序。為了在釀酒酵母中過表達Pdcl,用pGV1389轉化釀酒酵母菌林Gevo1187(CEN.PK)並在SC-ura淘汰培養基上選擇轉化體，如實施例3中所描迷的。使用粗製酵母蛋白質提取物和Westem印跡分析(基於對重組表達蛋白質中所存在的Myc表位的檢測)對自轉化體培養得到的培養物測定Pdcl表達，如實施例2中所描述的。實施例18:克隆以容許丙酮酸脫羧酶基因的誘導型表達基因(例如丙酮酸脫羧酶)的組成性表達在培養物生長期間的某些點可能是不想要的，或可能對那些過表達細胞施加意外代謝或選擇壓力。如此，需要釆用基因表達受調節的'系統，由此感興趣基因可主要在最佳時間表達以使培養物生長以及在後續發酵中的性能最大化。60此實施例的目的是描述在可誘導調節的啟動子控制下克隆編碼丙酮酸脫羧酶的基因，及描述這樣的基因在釀酒酵母宿主細胞中的表達。作為^Z^I+5am別片段釋放pGV1389(見實施例19)中所存在的戶DC7ORF並克隆入經JwII+5am別消化的載體pGV1414，產生載體pGV1483。如此，驅動屍ZX7基因的表達。M五:n啟動子在存在曱硫氨酸時在轉錄方面是沉默的，但是在曱硫氨酸水平落到某闊值以下時變得有活性。將質粒pGV1483轉化入Gevol187並通過SC-ura培養基上的選擇來鑑定轉化體，如實施例3中所描述的。培養攜帶pGV1483的Gevoll87的培養物並測定PDCl表達，基本上如實施例2中所描述的。在此實施例的另一個實施方案中，屍DC7基因在釀酒酵母銅誘導的CM3/基因啟動子(SEQIDNO:178)控制下表達。首先，在基本上如實施例5中所述的反應中使用引物通過PCR自釀酒酵母基因組DNA擴增Cf/屍/基因啟動子。將PCR產物用消化並插入經fecI+5""/1切割的pGVl106,產生pGV1388。對所插入的Ct/屍7啟動子序列完整測序。接著，將來自pGV1389、含有屍DC7基因的^&dKSa/77/7I片段插入經Jwn+BamM消化的pGV1388，產生pGV1388-PDCl。將質粒pGV1388-PDCl轉化入Gevo1187，如實施例3中所描述的，並在缺少銅的SC-ura限定培養基上鑑定轉化體。在沒有補充銅的SC-ura培養基中培養轉化細胞的培養物，直至它們達到OD600〉0.5,那時添加硫酸銅至終濃度0.5mM。將培養物根據需要再培養24小時至48小時，然後通過Western印跡測定Pdc1表達，基本上如實施例2中所描述的。實施例19:測量過表達丙酮酸脫羧酶的酵母細胞的培養物中所生成的PDC活性的體外測定法此實施例的目的是描述對於測定細胞(特別是來自過表達PDC酶的一群細胞)中所存在的總丙酮酸脫羧酶活性有用的體外測定法。用於測量來自總細胞溶胞物的PDC活性的測定法已有記載而且是本領域技術人員公知的(MaitraPK和LoboZ.1971.JAo/C/2e附.25;246(2):475-88;SchmittHD和ZimmermannFK.1982.J5acfenV/.151(3):1146-52;Eberhardt等，(1999)五w5/oc/2ew.262(1)，191-201)。在此實施例的另一個實施方案中，如下測量通過如實施例17和18中所述表達PDC所生成的PDC活性，即首先使用針對PDC的特異性抗體或使用針對如實施例RF20和RF21中所表達的過表達的(但不是內源的)PDC中所存在的Myc表位標籤的抗體免疫沉澱PDC。用於特異性免疫沉澱複合物混合物中所存在的蛋白質的方法是本領域技術人員公知的(例如Harlow和Lane，1988，Antibodies:ALaboratoryManual,CSHLPress)。然後免疫沉澱的PDC複合物充當要使用前述測定法測定的材料的來源。此方法如此容許異源的、過表達的PDC的特異性測定。實施例20:還含有功能性丁醇生成途徑的釀酒酵母中PDC過表達引起的升高的丁醇生產率此實施例的目的是例示PDC過表達如何提高還表達丁醇生成途徑的釀酒酵母培養物中的丁醇生產率。過表達PDC基因的釀酒酵母菌抹先前已有記載(vanHoek等，(1998).々少/五"w'rawM/cra6/o/.64(6):2133-40)。這些實驗揭示了(l)酉良酒酵母中的內源PDC水平雖然佔總細胞蛋白質的高達3.4%，仍能通過過表達構建體的存在而進一步提高；和(2)處於高生長速率的過表達PDC的培養物的發酵能力(乙醇生成的最大比速率)相對於對照菌抹升高。這些結果提示PDC在某些生長條件下的過表達會提高經由異源提供的丁醇生成途徑的通量。為了在存在丁醇途徑的情況中過表達PDC基因，通過&el消化自pGV1389切出屍DC7基因，用KlenowDNA聚合酶片段將切出的DNA懸垂補平，然後用^7zoI消化載體。將片段插入pGV1213(此載體經Sam/n消化，用Klenow酶補平切過的末端，然後用^7zoI消化)，產生質粒pGV1605。將質粒pGV1605或pGV1057(Mumberg,D.，等(1995)156:119-122)與質粒pGV1208、pGV1209、和pGV1213—起轉化入Gevo1187，基本上如實施例3中所述，並選擇His、Leu、Trp、和Ura原養型。實施發酵以生成丁醇，如實施例4中所述測量。包含pGV1605導致比前述發酵中包含pGV1057及質粒pGV1208、pGV1209、和pGV1213更高的丁醇生產率(每單位時間所生成的丁醇量)。正丁醇產率大於5%。實施例21:具有降低的醇脫氫酶活性且還含有功能性丁醇生成途徑的釀酒酵母細胞中PDCit^達引起的升高的丁醇生產率此實施例的目的是演示如何通過在醇脫氬酶(ADH)活性缺陷的酵母菌抹中在存在丁醇生成途徑的情況中過表達PDC基因來獲得增強的丁醇生產率。由PDC自丙酮酸生成的乙醛有兩種主要命運它能通過乙醛脫氫酶和乙醯-CoA合酶的作用被進一步代謝成乙醯-CoA，它然後可以作為丁醇合成途徑的有用底物；或者，它能通過醇脫氫酶(ADH)的作用通過還原過程被進一步代謝成乙醇。因此，降低或消除ADH(尤其是那些偏愛乙醛的ADH酶)會降低或消除這種不想要的乙醛異化路徑並提高丁醇途徑可利用的乙醯-CoA池。同時將質粒pGV1208、pGV1209、pGV1213、和pGV1605共轉化入菌抹Gevoll87(其具有有關基因型^D/77+)或菌林Gevol266(其具有有關基因型a^/zJ)。對轉化菌落選擇His、Leu、Trp、和Ura原養型，基本上如實施例3中所描述的。實施發酵以生成丁醇，如實施例4中所述測量。正丁醇產率大於10%。菌林Gevol266(^/WJ)展現出比在菌抹06"01187(^0///+)中實施的平行發酵改善的丁醇產率。實施例22:具有降低的醇脫氫酶活性且表達功能性丁醇生成途徑的乳酸克魯維酵母細胞中PDC過表達引起的升高的丁醇產率此實施例的目的是描述具有大大降低的ADH活性或沒有ADH活性的乳酸克魯維酵母菌抹中的丁醇生成。預測這樣的菌抹中表達丁醇途徑會產生比在具有ADH活性的菌林中表達丁醇途徑顯著更大的丁醇產率每輸入葡萄糖。具有降低的醇脫氫酶活性的乳酸克魯維酵母菌林的生成。用選擇標誌替換功能性可讀框，接著後續消除標誌)先前已有記載(KooistraR，HooykaasPJ，SteensmaHY.(2004)15;21(9):781-92)。乳酸克魯維酵母具有四種編碼ADH酶的基因，其中兩種(即/1^4/)//7和^14/)//2)定位於胞質。文獻(Saliola,M.,等,(1994)腸f10(9):1133-40)中已經記載了刪除了這所有四地i養這種菌抹所要求的培養條件。這種辦法的一種備選型式採用賦予對藥物G418/遺傳黴素(geneticin)的抗性的標誌，例如如kanj^因所提供的。這樣的辦法是有用的，因為它留下WM3標誌可供用作後'續轉化中的選擇標誌。乳酸克魯維酵母adhG菌林中丁醇表達途徑的表達同時將質粒pGV1208、pGV1209、pGV1213、和pGV1605共轉化入菌抹Gevol287(其是ADH+)或adhG菌抹。對轉化菌落選擇His、Leu、Trp、和Ura原養型。實施發酵以生成丁醇，如實施例4中所述測量。正丁醇產率大於10%。菌抹Gevol287生成比在其它方面同基因的adhG菌抹中實施的平行發酵顯著更多的丁醇。實施例23:釀酒酵母中的/^Z)6it^達為了克隆釀酒酵母的爿丄D6基因，採用兩步融合PCR法，其消除內部Sa/1限制酶位點以便於後續分子生物學操作。使用引物對Gevo-643+Gevo-644和Gevo-645+Gevo-646及作為模板的釀酒酵母基因組DNA生成跨越釀酒酵母y!LD6基因序列的兩種交疊PCR產物。用Sa/I+^w7M消化所得PCR片段並連接入經類似限制性消化的pGV1105和pGV1101以生成pGV1321和pGV1326。隨後，亞克隆y!LD6，即用五co/CRI+WoI消化pGV1321和pGV1326並分別連接入BamM(並隨後用Klenow補平末端)+Wo1消化的pGV1209和pGV1208以生成pGV1339和pGV1399。來轉化酵母菌林Gevo1187，如實施例3中所描述的，以生成過表達^丄D6的("Ald6+，，)轉化體或對照轉化體。通過在適宜淘汰培養基中選擇TRP和LEU原養型來選擇這兩組轉化體。使用粗製酵母蛋白質提取物和Western印跡分析對所得轉化體評估Ald6表達，如實施例2中所描述的。對那些被證實表達Ald6蛋白的酵母轉化體評估增強的乙醛脫氫酶活性，與只含載體的對照轉化體進行比較。為此，在搖瓶中在適宜的淘汰培養基中培養Ald6+和對照細胞。測定培養物的光密度(OD600)並通過以2800xg離心5分鐘來沉澱細胞。使用珠式破碎儀裂解細胞並將溶胞物用於使用已建立方法(例如VanUrk等，5/oc/n'm.所o;/2;as.Jcto.191:769)進行的蛋白質測定和醛脫氫酶活性分析。為了評估過表達Ald6對正丁醇生成的影響，將pGV1339與pGV1208、pGV1227和pGV1213—起轉化入Gevoll87並選擇His、Leu、Trp和Ura原養型。使用GevolllO和llll作為對照隔離群(表l)。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於5%。實施例24:沒有醇脫氫酶I活性(flrf/^J)的釀酒酵母中的Ald6過表達如實施例23中所述實施^LD6基因的克隆。如實施例3中所述分別利用所得質粒(pGVl339和pGVl399)和載體(pGV1100和pGV1101)來轉化酵母菌林Gevol253以生成過表達Ald6+的轉化體和對照轉化體。在適宜的淘汰培養基上選擇這兩組轉化體。如實施例2中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Western印跡分析對所得轉化體評估Ald6表達。如實施例23中所述對那些被證實表達Ald6蛋白的酵母轉化體評估增強的乙醛脫氫酶活性。為了評估過表達對正丁醇生成的後果，將pGV1339與pGV1209、pGV1227和pGV1213—起轉化入Gevol253並選擇His、Leu、Trp和Ura原養型。使用GevolllO和llll作為對照隔離群(表l)。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於10%。實施例25:乙醯-CoA合酶基因在釀酒酵母中的過表達此實施例的目的是描述編碼乙醯-CoA合酶活性的基因的克隆，及這樣的基因在宿主釀酒酵母細胞中的表達。具體而言，釀酒酵母基因」CS7或JCS2任一或二者編碼乙醯-CoA合酶活性。為了克隆爿C^和^CS2基因，利用作為模板的釀酒酵母基因組DNA，及引物Gevo-479+Gevo-480(v4CW)和Gevo-483+Gevo-48404CS2)，每一組分別在正向和反向引物中含有5"a/I和BamT/I限制性位點。將所得PCR片段用Sfl/I+5am/ZI消化並連接入經類似限制性消化的pGV1101和pGV1102以生成pGV1262和pGV1263。隨後，亞克隆JCW和^C&,即用五co/CRI+WoI消化pGV1262和pGV1263並連接入經BawM(且隨後用Klenwo補平末端)+Wo1消化的pGV1213以生成pGV1319和pGV1320。如實施例3中所述分別利用所得質粒pGV1262和pGV1263及載體pGV1101和pGV1102來轉化酵母菌抹Gevo1187以生成過表達」、^的轉化體和對照轉化體。通過LEU、URA原養型選擇來選擇這兩組轉化體。如實施例2中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Western印跡分析對轉化體評估Acsl或Acs2表達。65對那些被證實表達Acsl或Acs2蛋白的酵母轉化體評估增強的乙醯-CoA合酶活性，與只含載體的對照轉化體進行比較。為此，以搖瓶型式在SC-LEU、URA培養基中培養ACS1+或ACS2+和對照細胞。測定培養物的光密度(OD600)並通過以2800xrcf離心5分鐘來沉澱細胞。使用珠式破碎儀裂解細胞並將溶胞物用於使用已建立方法(VanUrk等，所ocWm.所o//^.爿cto191:769)進行的蛋白質測定和乙醯-CoA合酶活性分析。為了評估Acsl或Acs2過表達對正丁醇生成的影響，將pGV1319和1320與pGV1208、pGV1209和pGV1227—起轉化入Gevoll87並選擇His、Leu、Trp和Ura原養型。使用GevolllO和llll作為對照隔離群(表l)。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於5%。實施例26:沒有醇脫氫酶I活性(fl^/力的釀酒酵母細胞中乙醯-CoA合酶的#達如實施例25中所述克隆釀酒酵母的JCW和^CS2基因。如實施例3中所述分別利用所得質粒pGV1262和pGV1263及載體pGV1101和pGV1102來轉化酵母菌林Gevol253以生成過表達ACSl+、ACS2+的轉化體和對照轉化體。通過LEU、URA原養型選擇來選擇這兩組轉化體。如實施例25中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Western印跡分析對轉化體評估Acsl或Acs2表達。如實施例26中所述對那些被證實表達Acsl或Acs2蛋白的酵母轉化體評估增強的乙醯-CoA合酶活性。為了評估過表達Acsl或Acs2對丁醇生成的影響，將pGV1319和1320與pGV1208、pGV1209和pGV1227—起轉化入Gevol253並選擇His、Leu、Trp和Ura原養型。使用GevolllO和llll作為對照隔離群(表l)。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於5%。實施例27:爿丄ZM、^CW和JCS7在釀酒酵母中的it^達如實施例23和25中所述克隆」LD(5、^C^和^C^基因。載體pGVl105和pGVl102來轉化酵母菌林Gevol187以生成過表達ALD6+ACSl+、ALD6+ACS2+的轉化體和對照轉化體。通過LEU和URA原66養型選擇來選擇這兩組轉化體。對轉化體ALD6+ACSl+和ALD6+ACS2+評估增強的乙醯-CoA合酶活性，與只含載體的對照轉化體進行比較。為此，如實施例25中所述以搖瓶型式在SC-LEU、URA培養基中培養ALD6+ACSl+、ALD6+ACS2+和對照細胞。為了評估Ald6加Acs1或Acs2的過表達如何導致更高的丁醇生成，將Gevo1187用pGV1208、pGV1339、pGV1227和pGV1319或1320轉化並選4奪His、Leu、Trp和Ura原養型。使用GevolllO和llll作為對照隔離群(表l)。如實施例4中所述評估丁醇生成。正丁醇產率大於5%。實施例28:沒有醇脫氫酶I活性(adhlA)的釀酒酵母中的^丄ZM加^CS/或y4C52過表達如實施例23和25中所述克隆」丄D(5、^GS/和爿GS2基因。載體pGV1105和pGV1102來轉化酵母菌林Gevo1253(AADH1)以生成過表達ALD6+ACSl+或ALD6+ACS2+的菌抹或對照轉化體。通過LEU和URA原養型選擇來選擇這兩組轉化體。對轉化體ALD6+ACSl+或ALD6+ACS2+評估增強的乙醯-CoA合酶活性，與只含載體的對照轉化體進行比較。為此，如實施例25中所述以搖瓶型式在SC-LEU、URA培養基中培養ALD6+ACSl+或ALD6+ACS2+和對照細胞。為了評估過表達S^X)(5和JCS7或^CS7對丁醇生成的影響，將Gevo1253用pGV1208、pGV1339、pGV1227和pGV1319或1320轉化並選擇HIS、LEU、TRP和URA原養型。使用GevolllO和llll作為對照隔離群(表l)。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於10%。實施例29:將丁醇途徑克隆入用於在克魯維酵母屬的酵母中進行表達的栽體為了將丁醇途徑基因克隆入適合於在菌林乳酸克魯維酵母中進行表達的載體，通過5^cI和7Vort限制性消化自pGV1208、pGV1209和pGV1227釋放hbd、Crt、Thl+TER並克隆入經類似消化的pGV1428、1429和1430以生成pGV1208KI、pGV1209KI和pGV1227KI。為了將ADHE2克隆入乳酸克魯維酵母，將pGV1213用MwI和&cI消化並連接入經類似消化的pGV1431以生成pGV1213KI。將所得質粒pGV1208KI、pGV1209KI、pGV1227KI和pGV1213KI轉化入乳酸克魯維酵母(菌抹Gevol287;有關基因型MATa、trpl、his3、leu2、ura3)並對轉化體選擇TRP、HIS、LEU和URA原養型(KooistraR,HooykaasPJ,SteensmaHY.(2004)reaW.15;21(9):781-92)。如實施例4中所述實施丁醇生成。實施例30:丙酮酸曱酸裂合酶和曱酸脫氫酶I在乳酸克魯維酵母中的表達大腸桿菌/yw(無活性的丙酮酸曱酸裂合酶)和p/L4(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)的克隆為了克隆大腸桿菌//7萬和//L4,分別使用大腸桿菌基因組DNA和pflB_forw、PflB—rev和PflA—forw、PflA—rev引物擴增基因。為了克隆博伊丁氏假絲酵母FZ)/77基因，在PCR^應中使用作為模板的博伊丁氏假絲酵母的基因組DNA及fdh—forw和fdh—rev引物。利用分別摻入正向和反向基因擴增引物的限制性位點&ZI和五coRI，將所擴增的DNA連接到經Sa/I和五coRI消化的pGV1428、pGV1429和pGV1430上，生成pGV1428pflA、pGV1429pflB和pGV1430fdhl。自所得質粒表達的蛋白質帶myc標籤，用以進行蛋白質表達研究。通過已知方法(KooistraR,HooykaasPJ,SteensmaHY.(2004)Ko^.15;21(9):781-92)利用所得質粒(pGV1428pflA、pGV1429pflB和pGV1430fdhl)和載體(pGV1428、pGV1429和pGV1430)來轉化酵母菌林乳酸克魯維酵母(Gevol287;有關基因型MatA、trpl、his3、leu2和ura3)以生成表達PflA、PflB、Cb-Fdhl的(PFL+)轉化體和對照(PFL-)轉化體。通過HIS、TRP和LEU原養型選擇來選擇這兩組轉化體。如實施例2中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Westem印跡分析對所得轉化體評估PflA、PflB和Fdhl表達。對那些被證實表達所有三種蛋白質的酵母轉化體評估細胞乙醯-CoA水平，與只含載體的對照轉化體進行比較。為此，以搖瓶型式在SC-LEU、HIS、TRP培養基中培養PFL+和PFL-細胞。測定培養物的光密度(OD600)並以2800xrcf離心5分鐘以沉澱細胞。使用珠式破碎儀裂解細胞並將溶胞物用於使用已建立方法(Zhang等,ConnectionofPropionyl-CoAMetabolismto68PolyketideBiosynthesisinAspergillusnidulans.GewWcs,168:785-794沐行的蛋白質測定和乙醯-CoA測定分析。評估每mg細胞總蛋白質的乙醯-CoA量。為了評估PflA、PflB和Fdhl表達對丁醇生成的影響，將pflA、pflB和Cb-FD/Z/亞克隆入含有pGV1208KI、pGV1209KI、pGV1227KI和pGV1213KI的丁醇途徑基因(表l)。為此，使用標準分子生物學方法(Sambrook，J.Fritsch，E.F.，Maniatis，T.,1989),將pGV1428pflA、pGV1429pflB和pGV1002fdhl用五co/CRI+^zoI限制酶消化並連接入經BamM(隨後用Klenow補平末端)十IoI消化的pGV1208KI、pGV1209KI和pGV1213KI以生成pGV1208KIPflA、pGV1209KIPflB和pGV1213KIFdhl。將所得質粒與pGV1227KI—起轉化入乳酸克魯維酵母菌抹(MATa、pdcl、trpl、his3、leu2ura3)並選擇His、Leu、Trp和Ura原養型。使用包含pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431的乳酸克魯維酵母轉化體作為對照隔離群。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於10%。實施例31:丙酮酸甲酸裂合酶和曱酸脫氬酶I在缺乏丙酮酸脫羧酶活性的乳酸克魯維酵母中的表達如實施例30中所述克隆大腸桿菌;/W(無活性的丙酮酸曱酸裂合酶)和p乂L4(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)C6-FD///。通過已知方法(KooistraR，HooykaasPJ，SteensmaHY.(2004)^as.15;21(9):781-92)利用所得質粒(pGV1428pflA、pGV1429pflB和pGV1430fdhl)和載體(pGV1428、pGV1429和pGV1430)來轉化酵母菌抹乳酸克魯維酵母(MatA、pdcl、trpl、his3、leu2和ura3)以生成PflA、PflB、Cb-Fdhl的(PFL+)轉化體和對照(PFL-)轉化體。通過HIS、TRP和LEU原養型選擇來選擇這兩組轉化體。如實施例2中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Western印跡分析對所得轉化體評估PflA、PflB和Cb-Fdhl表達。對那些被證實表達所有三種蛋白質的酵母轉化體評估細胞乙醯-CoA水平，與只含載體的對照轉化體進行比較。為此，如實施例30中所述以搖瓶型式在SC-LEU、HIS、TRP培養基中培養PFL+和PFL-細胞並評估。為了評估PflA、PflB和Fdhl的表達如何導致更高的丁醇生成，將pGV1208KIPflA、pGV1209KIPflB和pGV1213KIFdh1與pGV1227KI—起轉化入乳酸克魯維酵母(MATa、pddA、trpl、his3、leu2、ura3)並選擇His、Leu、Trp和Ura原養型。使用包含pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431的乳酸克魯維酵母轉化體作為對照隔離群。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於50%。實施例32:Pfl(丙酮酸曱酸裂合酶)和Fdhl(曱酸脫氬酶I)在缺乏Adhl活性的乳酸克魯維酵母中的表達如實施例30中所述克隆大腸桿菌//^(無活性的丙酮酸曱酸裂合酶)、p/L4(丙酮酸曱酸裂合酶活化酶)和C6-FD//7。通過已知方法(KooistraR,HooykaasPJ,SteensmaHY.(2004)^as.15;21(9):781-92)利用所得質粒(pGV1428pflA、pGV1429pflB和pGV1430fdhl)和載體(pGV1428、pGV1429和pGV1430)來轉化酵母菌抹乳酸克魯維酵母(MATa、trpl、his3、Leu2、ura3)以生成表達PflA、PflBl、Fdhl的(EcPFL+)轉化體和對照(EcPFL-)轉化體。通過HIS、TRP和LEU原養型選擇來選擇這兩組轉化體。如實施例2中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Western印跡分析對所得轉化體評估PflA、PflB和Fdhl表達。對那些被證實表達所有三種蛋白質的酵母轉化體評估細胞乙醯-CoA水平，與只含載體的對照轉化體進行比較。為此，如實施例30中所述以搖瓶型式在SC-LEU、HIS、TRP培養基中培養EcPFL+和EcPFL-細胞並評估。為了評估PflA、PflB和Fdhl的表達如何導致更高的丁醇生成，將pGV1208KIPflA、pGV1209KIPflB和pGV1213KIFdh1與pGV1227KI—起轉化入乳酸克魯維酵母(MATa、adhlA、trpl、his3、leu2、ura3)並選擇His、Leu、Trp和Ura原養型。使用包含pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431的乳酸克魯維酵母轉化體作為對照隔離群。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於20%。實施例33:AL4ZJ)6在乳酸克魯維酵母中的過表達為了克隆《/」丄/)6，在PCR反應中使用作為模板的乳酸克魯維酵母基因組DNA及引物KI4丄D6Jeft5和ii^4丄D(5一right3(見表l),其它方面與實施例5中所述類似。前述引物分別包含S"/I和^W7/7I限制性位點，將所得PCR片段用Sa/I+Bam/H消化並連接入經類似限制性消化的pGV1428以生成pGV1428KLALD6。隨後，亞克隆XL4LD6,即將pGV1428ALD6用￡co/CRI+ioI消化並連接入經5aw//1(隨後用Klenow補平末端)+^7zo1消化的pGV1208KI以生成pGV1208KIALD6。通過已知方法(KooistraR，HooykaasPJ,SteensmaHY.(2004)7eo^.15;21(9):781-92)分別利用所得質粒pGV1428ALD6KI和載體pGV1428來轉化酵母菌株乳酸克魯維酵母(MATa、trpl、his3、leu2、ura3)以生成過表達KIALD6+和KIALD6-的轉化體和對照轉化體。通過HIS原養型選擇來選擇這兩組轉化體。如實施例2中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Westem印跡分析對所得轉化體KIALD6+和KIALD6-評估KIAld6表達。對那些被證實過表達KIAld6蛋白的乳酸克魯維酵母轉化體評估增強的乙醛脫氬酶活性，與只含載體的對照轉化體進行比較。為此，如實施例23中所述以搖瓶型式在SC-HIS培養基中培養KIALD6+和KIALD6-細胞並評估。為了評估KIALD6的過表達如何導致更高的丁醇生成，將pGV1208KIALD6與pGV1209KI、pGV1227KI和pGV1213KI—起轉化入乳酸克魯維酵母(MATa、trpl、his3、leu2、ura3)並選擇HIS、LEU、TRP和URA原養型。使用用pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431轉化乳酸克魯維酵母產生的轉化體作為對照隔離群。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於5%。實施例34:醛脫氫酶在缺乏Adhl活性的乳酸克魯維酵母中的過表達實施例33中記載了克魯維酵母KIALD6基因的克隆。通過已知方法(KooistraR,HooykaasPJ,SteensmaHY.(2004)FeaW.母菌抹乳酸克魯維酵母(MATa、adhlA、trpl、his3、leu2、ura3)以生成過表達KIALD6+和KIALD6-的轉化體和對照轉化體。通過HIS原養型選擇來選擇這兩組轉化體。如實施例2中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Westem印跡分析對所得轉化體評估KIAld6表達。如實施例30中所述對那些被證實表達KIAld6蛋白質的乳酸克魯維酵母轉化體評估增強的乙醛脫氫酶活性。為了評估KIAld6的過表達如何導致更高的丁醇生成，將pGV1208KIALD6與pGV1209KI、pGV1227KI和pGV1213KI—起轉化入乳酸克魯維酵母(MATa、adhlA、trpl、his3、leu2、ura3)並選擇HIS、LEU、TRP和URA原養型。使用用pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431轉化乳酸克魯維酵母產生的轉化體作為對照隔離群。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於10%。實施例35:乙醯-CoA合酶基因在酵母乳酸克魯維酵母中的it^達酵母乳酸克魯維酵母基因組中的兩種側向同源基因(即尺Z4CS/和^L4CS刁編碼乙醯-CoA活性。為了克隆AX4C57和/^4GS2,利用作為模板的乳酸克魯維酵母基因組DNA及引物KIACS1—left5+KIACS2—Right3(ACSl)和KIACS2—Left5+KIACS2—Right3(ACS2)(見表l)，其分別在正向和反向引物中含有7VM+S"/I和Sa/1+jgam/ZI限制性位點。將所得PCR片段用適宜酶消化並連接入經類似限制性消化的pGV1429和pGV1431以生成pGV1429ACS1和pGV1431ACS2。隨後，亞克隆XL4CS/和XL4C^2，即將pGV1429ACSl和pGV1431ACS2用Sacld和消化並連接入經類似消化的pGV1209KI和pGV1213KI以生成pGV1209KIACS1和pGVKIACS2。體pGV1429和pGV1431來轉化乳酸克魯維酵母(MATa、trpl、his3、leu2、ura3)以生成過表達KIACSl+、KIACS2+和KIACS-蛋白的轉化體和對照轉化體。通過TRP、URA原養型選擇來選擇這兩組轉化體。如實施例2中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Western印跡分析對轉化體評估KIAcsl和KIAcs2表達。對那些被證實表達KIAcsl和KIAcs2蛋白的酵母轉化體評估增強的乙醯-CoA合酶活性，與只含載體的對照轉化體進行比較。為此，如實施例25中所述以搖瓶型式在SC-TRP、URA培養基中培養KIACSl+、KIACS2+和KIACS-細胞並評估。為了評估KIACS1和KIACS2的過表達如何導致更高的丁醇生成，將入菌抹Gevol287並對轉化細胞選擇His、Leu、Trp和Ura原養型。使用用pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431轉化乳酸克魯維酵母(MATa、trpl、his3、leu2、um3)產生的轉化體作為對照隔離群。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於5%。實施例36:乙醯-CoA合酶基因在缺乏Adhl活性的酵母乳酸克魯維酵母中的過表達實施例35中記載了乳酸克魯維酵母/i^4CS7和ia4C52基因的克隆。通過已知方法利用所得質粒pGV1429ACSl和pGV1431ACS2及空載體pGV1429和pGV1431來轉化乳酸克魯維酵母(MATa、adhlA、trpl、his3、leu2、1^3)以生成過表達/040^/+和^04(^2+的轉化體和對照轉化體。通過TRP和URA原養型選擇來選擇這兩組轉化體。如實施例2中所述使用粗製酵母蛋白質提取物和Western印跡分析對轉化體評估KIAcsl和KIAcs2表達。如實施例25中所述對那些被證實表達KlAcsl和KIAcs2蛋白的酵母轉化體評估增強的乙醯-CoA合酶活性。為了評估^/^CW和XZ4CS2的過表達如何導致更高的丁醇生成，將pGV1209KIACSl和pGV1209KIACS2與pGV1208KI和pGV1227KI—起轉化入乳酸克魯維酵母(MatA、adhl、trpl、his3、leu2和ura3)。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於10%。實施例37:《"丄2)6和^^40^或^//4(:^在乳克魯維氏酵母中的過表達如上文實施例33和35中所述克隆XL4ZZ)6、尺L4CS/和/i^4GS7基因。通過已知方法分別利用所得質粒pGV1428ALD6和pGV1429ACSl或pGV1430及載體pGV1428和pGV1429或pGV1430來轉化乳酸克魯維酵母(MATa、trpl、his3、leu2、ura3)以生成過表達KIALD6+KIACS1+、KIALD6+KIACS2+和KIALD-KIACS-的轉化體和對照轉化體。分別通過HIS、TRP和HIS、LEU原養型選擇來選擇這兩組轉化體。對轉化體KIALD6+KIACSl+和KIALD6+KIACS2+評估增強的乙醯-CoA合酶活性，與只含載體的對照轉化體(ALD-ACS-)進行比較。為此，如實施例25中所述以搖瓶型式分別在SC-HIS、TRP和HIS、LEU培養基中培養KIALD6+KIACSl+、KIALD6+KIACS2+和KIALD-KIACS-細胞並評估。為了評估KIAld6和KIAcs1或KIAcs2的過表達如何導致更高的丁醇生成，73將乳酸克魯維酵母(MATa、trpl、his3、leu2ura3)用pGV1208KIALD6、pGV1209KIACSl或pGV1209KIACS2、pGV1227KI、pGV1213KI轉化並選擇HIS、LEU、TRP和URA原養型。使用用pGV1428、pGV1429、pGV1430和pGV1431轉化乳酸克魯維酵母(MATa、trpl、his3、leu2ura3)產生的轉化體作為對照隔離群。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於5%。實施例38:AL4丄D6、兀"CW和AL4CS2在缺乏KIAdhl活性(KladhlA)的乳酸克魯維酵母中的過表達如實施例33和35中所述克隆/J^LD6、AZ4GS/和XL4CS2基因。通過已知方法分別利用所得質粒pGV1428ALD6和pGV1429ACS1或母(MATa、KladhlAtrpl、his3、leu2ura3)以生成過表達KIALD6+KIACSl+、KIALD6+KIACS2+和KIALD-KIACS-的轉化體和對照轉化體。分別通過HIS、TRP和HIS、LEU原養型選擇來選4奪這兩組轉化體。如實施例14中所述對轉化體KIALD6+KIACS1十和KIALD6+KIACS2+評估細胞乙醯-CoA水平。為了評估KIAld6和KIAcs1或KIAcs2的過表達是否導致更高的丁醇生成，將乳酸克魯維酵母(MATa、KladhlAtrpl、his3、leu2ura3)用pGV1208KIALD6、pGV1209KIACSl或pGV1209KIACS2、pGV1227KI、pGV1213KI轉化。如實施例4中所述實施丁醇生成。正丁醇產率大於10%。權利要求1.一種代謝工程化酵母，其能夠代謝碳源以生成正丁醇，至少一種途徑配置成生成相對於野生型酵母所生成的另一胞質乙醯-CoA量增加的胞質乙醯-CoA量，且至少一種異源基因編碼並表達能夠利用NADH來將乙醯-CoA轉化成正丁醇的代謝途徑的至少一種酶。2.權利要求l的酵母，其中所述至少一種異源基因單獨地編碼並表達能夠利用NADH來將乙醯-CoA轉化成正丁醇的代謝途徑的至少一種酶。3.權利要求l的酵母，其中所述至少一種異源基因與至少一種天然酵母基因組合地編碼並表達能夠利用NADH來將乙醯-CoA轉化成正丁醇的代謝途徑的至少一種酶。4.權利要求l的酵母，其中所述酵母過表達丙酮酸脫羧酶以提高胞質乙醯-CoA生成。5.權利要求4的酵母，其中所述丙酮酸脫羧酶是由釀酒酵母基因屍DC7所編碼的。6.權利要求4的酵母，其中所述丙酮酸脫羧酶是由釀酒酵母基因屍DC7、屍DC5、和屍Z)C6中至少一種所編碼的。7.權利要求l的酵母，其中所述酵母過表達醛脫氫酶以提高胞質乙醯-CoA生成。8.權利要求7的酵母，其中所述醛脫氫酶是由釀酒酵母基因」ZX)6所編碼的。9.權利要求7的酵母，其中所述醛脫氫酶是由乳酸克魯維酵母基因JZi)6所編碼的。10.權利要求l的酵母，其中所述酵母過表達乙醯-CoA合成酶以提高胞質乙醯-CoA生成。11.權利要求10的酵母，其中所述乙醯-CoA合成酶是由釀酒酵母基因」CS/和釀酒酵母基因^C52中至少一種所編碼的。12.權利要求10的酵母，其中所述乙醯-CoA合成酶是由乳酸克魯維酵母基因^CS7和乳酸克魯維酵母基因JCS2中至少一種所編碼的。13.權利要求l的酵母，其中所述酵母過表達醛脫氬酶和乙醯-CoA合成酶二者以提高胞質乙醯-CoA生成。14.權利要求13的酵母，其中所述醛脫氫酶是由釀酒酵母基因^LD6所編碼的，且所述乙醯-CoA合成酶是由釀酒酵母基因^CS7和釀酒酵母基因^C52中至少一種所編碼的。15.權利要求13的酵母，其中所述醛脫氬酶是由乳酸克魯維酵母基因J丄Z)6所編碼的，且所述乙醯-CoA合成酶是由乳酸克魯維酵母基因」C57和乳酸克魯維酵母基因」CS2中至少一種所編碼的。16.權利要求13的酵母，其中所述酵母過表達丙酮酸脫羧酶以提高胞質乙醯-CoA生成。17.權利要求16的酵母，其中所述丙酮酸脫羧酶是由屍Z)C7、戶Z)C5和屍DC6中至少一種所編碼的，醛脫氫酶是由釀酒酵母基因J丄D6所編碼的，且所述乙醯-CoA合成酶是由釀酒酵母基因^GS7和釀酒酵母基因^GS2中至少一種所編碼的。18.權利要求16的酵母，其中所述丙酮酸脫羧酶是由乳酸克魯維酵母基因屍Z)C7所編碼的，醛脫氫酶是由乳酸克魯維酵母基因v4丄D(5所編碼的，且所述乙醯-CoA合成酶是由乳酸克魯維酵母基因^CW和乳酸克魯維酵母基因^CS2中至少一種所編碼的。19.權利要求l的酵母，其中所述酵母過表達丙酮酸脫氫酶以提高胞質乙醯-CoA生成。20.權利要求19的酵母，其中所述酵母過表達由大腸桿菌基因ace五、aceF、/;^4所編碼的丙酮酸脫氫酶以提高胞質乙醯-CoA生成。21.權利要求20的酵母，其中PDC活性是降低的和消除的之一。22.權利要求19的酵母，其中所述酵母過表達由刪除了N-末端線粒體靶向信號的釀酒酵母基因屍」〖X4/、屍DB7、屍Z)X7、丄v477、￡屍/)/所編碼的丙酮酸脫氬酶以提高胞質乙醯-CoA生成。23.權利要求22的酵母，其中PDC活性是降低的和消除的之一。24.權利要求23的酵母，其中所述酵母是(l)基因型;^/cZ4,及(2)基因型;^fc/zl、基因型;dc5zl、和基因型^/c6zl之一的釀酒酵母。25.權利要求23的酵母，其中所述酵母是基因型/x/c/zl的乳酸克魯維酵母。26.權利要求l的酵母，其中所述酵母過表達丙酮酸曱酸裂合酶和曱酸脫氬酶二者以提高胞質乙醯-CoA生成。27.權利要求26的酵母，其中所述酵母過表達由大腸桿菌基因;^/L4和大腸桿菌基因//W所編碼的丙酮酸曱酸裂合酶，並與博伊丁氏假絲酵母基因組合以提高胞質乙醯-CoA生成。28.權利要求27的酵母，其中PDC活性是降低的和消除的之一。29.權利要求27的酵母，其中所述酵母是(l)基因型/^cW，及2)基因型/3&"、基因型/^c5丄和基因型/^c6z/之一的釀酒酵母。30.權利要求27的酵母，其中所述酵母是基因型;^c/z/的乳酸克魯維酵母。31.權利要求l的酵母，其中所述至少一種異源基因中至少一種已經進行了分子進化以增強由其所編碼的蛋白質的酶活性。32.權利要求l的酵母，其中至少一種另外的編碼醇脫氬酶的基因被滅活，使得醇脫氬酶活性充分降低以相對於野生型生成提高胞質乙醯-CoA生成。33.權利要求32的酵母，其中所述酵母是釀酒酵母，且所述醇脫氫酶是由JZ)7/7所編碼的。34.權利要求32的酵母，其中所述酵母是乳酸克魯維酵母，其所述醇脫氫酶是由所編碼的。35.權利要求32的酵母，其中所述酵母是釀酒酵母，且所述醇脫氫酶是由yiD/W、^D//2、ylD/73和ylDf"所編碼的。36.權利要求32的酵母，其中所述酵母是乳酸克魯維酵母，且所述醇脫氬酶是由爿￡)/7/、AD////、爿/)/////和爿￡>///7所編碼的。37.權利要求l的酵母，其中所述酵母是來自以下屬之一的物種酵母屬、德克酵母屬、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬、西洋蓍黴屬、麴黴屬、克魯維酵母屬、管嚢酵母屬、裂殖酵母屬、假絲酵母屬、絲孢酵母屬、Kwwt/a矽附G、有孢圓酵母屬、和隱球菌屬。38，權利要求l的酵母，其中所述途徑在代謝碳源以生成正丁醇時提供平衡的NADH生成和消耗。39.—種生產正丁醇的方法，該方法包括(a)提供如下代謝工程化酵母，其能夠代謝碳源以生成正丁醇，至少一種途徑配置成生成相對於野生型酵母所生成的另一胞質乙醯-CoA量增加的胞質乙醯-CoA量，且至少一種異源基因編碼並表達能夠利用NADH來將乙醯-CoA轉化成正丁醇的代謝途徑的至少一種酶；並(b)培養該代謝工程化酵母，培養的時間和條件用以生成正丁醇。40.—種使用酵母生產正丁醇的方法，該方法包括(a)代謝工程改造酵母以提高胞質乙醯-CoA生成；(b)代謝工程改造酵母以表達將碳源轉化成正丁醇的代謝途徑，其中該途徑需要至少一種對於該酵母而言非天然的酶，其中步驟(a)和(b)可以以任一次序實施；並(c)培養該酵母，培養的時間和條件用以生成可回收量的正丁醇。41.一種使用酵母生產正丁醇的方法，該方法包括(a)培養代謝工程化酵母，培養的時間和條件用以生成酵母細胞生物質但不激活正丁醇生成；並(b)在另一段時間改變培養條件，培養的時間和條件用以生成可回收量的正丁醇。42.—種代謝工程化酵母，其能夠代謝碳源並生成相對於野生型酵母所生成的胞質乙醯-CoA量增加的乙醯-CoA量。43.權利要求42的酵母，其中所述酵母過表達丙酮酸脫羧酶、醛脫氫酶和乙醯-CoA合成酶以提高胞質乙醯-CoA生成。44.權利要求42的酵母，其中所述丙酮酸脫羧酶是由釀酒酵母基因屍DC7、i^C5和PZ)C6中至少一種所編碼的，醛脫氫酶是由釀酒酵母基因^LZ)6所編碼的，且乙醯-CoA合成酶是由釀酒酵母基因v4GW和^CS2中至少一種所編碼的。45.權利要求44的酵母，其中所述醇脫氫酶是通過刪除釀酒酵母基因710///而滅活的。46.權利要求42的酵母，其中所述酵母是克魯維酵母屬的，所述丙酮酸脫羧酶是由乳酸克魯維酵母基因^/屍DC所編碼的，醛脫氫酶是由乳酸克魯維酵母基因^L4丄ZM所編碼的，且乙醯-CoA合成酶是由乳酸克魯維酵母基因i04CW和AX4CW中至少一種所編碼的。47.權利要求46的酵母，其中所述醇脫氫酶是通過刪除乳酸克魯維酵母基因^D7/7而滅活的。48.權利要求42的酵母，其中所述酵母過表達丙酮酸脫氫酶以提高胞質乙醯-CoA生成。49.權利要求48的酵母，其中所述酵母過表達由大腸桿菌基因flc^:、大腸桿菌基因ace屍和大腸桿菌基因/;^4所編碼的丙酮酸脫氫酶以提高胞質乙醯-CoA生成。50.權利要求49的酵母，其中PDC活性是降低的和消除的之一。51.權利要求49的酵母，其中所述酵母是(l)基因型/^cZ^，及(2)基因型;^c7zl、基因型;^/c5zl、和基因型/^c^之一的釀酒酵母。52.權利要求49的酵母，其中所述酵母是基因型;&"的乳酸克魯維酵母。53.權利要求48的酵母，其中所述酵母過表達由刪除了N-末端線粒體靶向信號的釀酒酵母基因屍A47、屍￡必7、屍DX7、丄J77、和丄屍Z)/所編碼的丙酮酸脫氫酶以提高胞質乙醯-CoA生成。54.權利要求53的酵母，其中PDC活性是降低的和消除的之一。55.權利要求53的酵母，其中所述酵母是(l)基因型/^c2z1,及(2)基因型;7&"、基因型/A5zl、和基因型;^/cW之一的釀酒酵母。56.權利要求53的酵母，其中所述酵母是基因型/^c"的乳酸克魯維酵母。57.權利要求42的酵母，其中所述酵母過表達丙酮酸曱酸裂合酶和曱酸脫氬酶二者以提高胞質乙醯-CoA生成。58.權利要求57的酵母，其中所述酵母過表達由大腸桿菌基因;/7丄/7/W所編碼的丙酮酸曱酸裂合酶，並與博伊丁氏假絲酵母基因FD7/7組合以提高胞質乙醯-CoA生成。59.權利要求58的酵母，其中PDC活性是降低的和消除的之一。60.權利要求59的酵母，其中所述酵母是(l)基因型;^c2J，及(2)基因型/7&/丄基因型;^c5丄和基因型/^/c(5J之一的釀酒酵母。61.權利要求59的酵母，其中所述酵母是基因型;^c/的乳酸克魯維酵母。62.權利要求42的酵母，其中至少一種基因已經進行了分子進化以增強由其所編碼的蛋白質的酶活性。63.—種提高酵母的代謝活性的方法，該方法包括酵母生成相對於野生型酵母所生成的另一胞質乙醯-CoA量增加的胞質乙醯-CoA量。64.—種代謝工程化酵母，其具有至少一種途徑，該途徑配置成生成相對於野生型酵母所生成的另一胞質乙醯-CoA量增加的胞質乙醯-CoA量。全文摘要公開了代謝工程化酵母及生產正丁醇的方法。在一個實施方案中，代謝工程化酵母能夠代謝碳源以生成正丁醇，至少一種途徑生成相對於野生型酵母所生成的胞質乙醯-CoA增加的胞質乙醯-CoA，且至少一種異源基因編碼並表達能夠利用NADH來將乙醯-CoA轉化成正丁醇的代謝途徑的至少一種酶。在另一個實施方案中，生產正丁醇的方法包括(a)提供如下代謝工程化酵母，其能夠代謝碳源以生成正丁醇，至少一種途徑生成相對於野生型酵母所生成的胞質乙醯-CoA增加的胞質乙醯-CoA，且至少一種異源基因編碼並表達能夠利用NADH來將乙醯-CoA轉化成正丁醇的代謝途徑的至少一種酶；並(b)培養該酵母以生成正丁醇。還公開了其它實施方案。文檔編號C12P7/16GK101652482SQ200780051627公開日2010年2月17日申請日期2007年12月21日優先權日2006年12月21日發明者尤維尼·古納沃德納,彼得·邁因霍爾德,瓊·尤拉諾,裡德·M·R·費爾德曼,馬修·W·彼得斯申請人:格沃股份有限公司