病毒定量方法

2023-04-26 03:02:01 2

專利名稱：病毒定量方法
技術領域：
本發明涉及對從體液採集的人皰疹病毒(HHV)數進行定量的方法、以及用於進行 該方法的試劑盒。
背景技術：
「疲勞」的蓄積會引起過勞死、自殺、生活習慣病等許多嚴重問題。但是，針對」疲 勞」的科學或醫學研究與其它領域相比明顯遲滯，對於「疲勞」帶給個人健康、社會生活的問 題尚未找到解決的突破口。作為針對「疲勞」的研究或預防方法/治療方法的開發遲滯的主要原因，可以列舉 出沒有客觀地測定「疲勞」的方法。特別是，關於對生活、健康影響最大的「疲勞的蓄積」、 「中長期持續疲勞」，其測定方法尚未確立，而對於這樣的測定方法的需求非常迫切。本申請的發明人之一曾經開發出通過測定唾液中再活化的人皰疹病毒的量來測 定疲勞的蓄積的方法(W02006/006634)。根據目前為止的研究可以判定通過利用該方法， 能夠定量地測定因1周以上時間的各種緊張狀態而蓄積的疲勞。而且，在該方法中，優選 使用唾液作為試樣，而關於唾液，已知唾液腺中的內源生物素含量高(Green，Μ.，et al.， J. Clin. Pathol. , (1992)45(9) :788_790)。傳統上，作為對病毒進行定量的方法，已知有通過PCR對病毒DNA量進行定 量的方法(Kido, S.，et al.，J. Med. Virol.，(1990)32 139-142)、通過雙嵌套 PCR 法 (Double-Nested PCR)進行測定的方法(Kondo, K.，et al.，J. Infect. Dis.，(1993) 167 1197-1200)等。此外，在逆轉錄病毒的定量方面，還公開了在通過定量PCR測定病毒DNA量 時，使用包含含標記序列的病毒核酸的逆轉錄病毒作為內部標準的方法(W095/034684)。此外，作為測定病毒蛋白質的量的方法，有例如使用抗病毒蛋白質的抗體的免疫 測定方法(immunoassay法)。作為代表性的免疫測定方法，可以列舉出例如夾心ELISA法 等(Gerna, G.，et al.，J. Clin. Microbiol.，(1983) 17 :942_944)。另一方面，作為提高溶液中病毒的濃度、濃縮病毒的方法，可以列舉出例如超離心 法，但是，該方法需要昂貴的儀器和漫長的分離時間，且作業中需要大量的勞力。此外，還有 用硫酸銨、聚乙二醇等沉澱病毒來進行濃縮的方法，但由於這些方法中使用的試劑會阻礙 其後的用於病毒檢測的PCR，因而存在的問題是病毒沉澱後必須進行試樣的純化。作為其 它的病毒濃縮方法，公開了例如使用結合有甘露糖結合型凝集素的磁性粒子的方法(特開 2002-165591)。此外，作為提高逆轉錄病毒的效價或者從待檢物樣品中分離逆轉錄病毒的 方法，還公開了利用鏈黴抗生物素蛋白和生物素化凝集素的方法(W02001/079456)。現有技術文獻專利文獻1國際公開第W02006/006634號小冊子專利文獻2國際公開第W095/034684號小冊子專利文獻3特開2002-165591號公報專利文獻4國際公開第W02001/079456號小冊子
非專利文獻lGreen，M.，et al. , J. Clin. Pathol.，(1992)45(9) :788_790非專利文獻2Kido，S.，et al. , J. Med. Virol. , (1990)32:139-142非專利文獻3Kondo, K.，et al.，J. Infect. Dis.，(1993) 167 1197-1200非專利文獻4Gerna, G.，et al.，J. Clin. Microbiol.，(1983) 17 942~94
發明內容
發明所要解決的問題發明人等判明在定量評價針對日常生活中的疲勞的疲勞度時，如果採用傳統方 法來測定體液中的人皰疹病毒(以下記作HHV)的量，則視情況而異，試樣中的HHV數會非 常少，例如人皰疹病毒6(HHV-6)會小於100拷貝/ml、人皰疹病毒7(HHV-7)也會小於100 拷貝/ml，在相當多的情況下，測定途中會損失病毒DNA，因而準確且有效率的定量需要技 術熟練。而且，在這種情況下，將HHV定量方法試劑盒化從而簡便地對大量試樣進行定量是 困難的。本發明的目的是解決傳統病毒定量方法中的上述問題。解決問題的方法本發明人等進行了深入研究，結果發現通過將結合有可與HHV結合的物質的載 體混合在體液中並使之與對象病毒結合，並且利用磁鐵、離心處理等回收該載體，可以將其 製備成能夠採用PCR、LAMP、ELISA等方法容易地進行定量的濃度。而且，本發明人等通過在定量過程中，在試樣中加入一定量的作為基準的病毒並 進行一系列步驟，能夠成功地進行準確的定量。在該方法中，通過利用突變型HHV作為基準 病毒，能夠簡單容易地進行更準確的定量。基於以上認識，本發明提供能夠更簡便且準確地對體液中的HHV進行計量的新定 量方法，以及用於進行本發明的方法的試劑盒。即，本發明如下。實施方式1 一種對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包括以下步驟(1)在採集到的體液中添加預先確定了濃度的基準病毒；(2)使(1)的液體與病毒結合物質接觸，其中，(i)該病毒結合物質上連接有能夠與載體結合的分子，並且該病毒結合物質通過 該分子結合於載體，從而結合有病毒結合物質的病毒間接地結合於載體，或者(ii)該病毒結合物質直接結合於載體，從而使結合有病毒結合物質的病毒通結合 於載體；(3)將該載體從(1)的液體中分離；(4)對從分離出的載體處回收得到的病毒數進行定量以及(5)對回收得到的基準病毒數與(1)中添加的基準病毒數進行比較來評價回收 率，由(4)中定量的人皰疹病毒數與該回收率確定從體液中採集的人皰疹病毒數。實施方式2 一種對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包括以下步驟(1)在採集到的體液中添加預先確定了濃度的基準病毒；(2)使(1)的液體與凝集素接觸，其中，(i)該凝集素上連接有能夠與載體結合的分子，並且該凝集素通過該分子結合於載體，從而與凝集素結合的病毒間接地結合於載體，或者(ii)該凝集素直接結合於載體，從而使與凝集素結合的病毒結合於載體；(3)將該載體從⑴的液體中分離；(4)對從分離出的載體處回收得到的病毒數進行定量以及(5)對回收得到的基準病毒數與(1)中添加的基準病毒數進行比較來評價回收 率，由(4)中定量的人皰疹病毒數與該回收率確定從體液中採集的人皰疹病毒數。實施方式3:一種對從唾液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包括以下步驟(1)在採集的唾液中添加預先確定了濃度的基準病毒；(2)在(1)的液體中混合生物素化凝集素，使病毒與生物素化凝集素接觸，再添加 結合有生物素結合蛋白質的珠子，使與生物素化凝集素結合的病毒結合於珠子；(3)將該珠子從(1)的液體中分離；(4)對從分離出的珠子處回收的病毒數進行定量以及(5)對回收得到的基準病毒數與(1)中添加的基準病毒數進行比較來評價回收 率，由(4)中定量的人皰疹病毒數與該回收率確定從唾液中採集的人皰疹病毒數。實施方式4 根據實施方式1 3中任一項所述的方法，其中，所述人皰疹病毒是人皰疹病毒 6 (HHV-6)或人皰疹病毒7 (HHV-7)。實施方式5 根據實施方式1 3中任一項所述的方法，其中，所述基準病毒是HHV-6或HHV-7 來源的重組病毒。實施方式6 根據實施方式2或3所述的方法，其中，所述凝集素是與包含N-乙醯半乳糖胺 (GalNAc)、α 2-6鍵的唾液酸(Siaa 2-6)、Ν_乙醯葡糖胺(GlcNAc)中的至少一種的糖鏈結 合的凝集素。實施方式7 根據實施方式6所述的方法，其中，所述凝集素選自SBA (大豆來源)、SSA (無梗接 骨木來源)、DSA(白曼陀羅來源)和WGA(小麥胚芽來源)。實施方式8 根據實施方式1 3中任一項所述的方法，其中，所述步驟(4)包括採用選自PCR、 LAMP和ELISA中的方法對病毒數進行定量。實施方式9 一種對從唾液採集的人皰疹病毒6 (HHV-6)或人皰疹病毒7 (HHV-7)的數量進行定 量的方法，該方法包括以下步驟(1)在採集的唾液中添加預先確定了濃度的基準病毒，並使得基準病毒濃度是 10 100，000基因組拷貝/ml，其中，該基準病毒是HHV-6或HHV-7來源的重組病毒；(2)在(1)的液體中混合生物素化凝集素，使病毒與生物素化凝集素接觸，並且再 添加結合有生物素結合蛋白質的珠子，使與生物素化凝集素結合的病毒結合於珠子，其中， 該凝集素選自SBA(大豆來源)、SSA(無梗接骨木來源)、DSA(白曼陀羅來源)和WGA(小麥胚芽來源)；(3)將該珠子從(1)的液體中分離；(4)採用選自PCR、LAMP和ELISA中的方法對從分離出的珠子處回收的病毒數進 行定量；以及(5)對回收得到的基準病毒數與(1)中添加的基準病毒數進行比較來評價回收 率，由(4)中定量的人皰疹病毒數與該回收率確定從唾液中採集的人皰疹病毒數。實施方式10 一種對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包括以下步驟(1)在採集到的體液中添加預先確定了濃度的基準病毒；(2)使(1)的液體與直接結合在直徑IOnm IOOnm的納米珠上的病毒結合物質相 接觸，從而使病毒結合於納米珠；(3)將該納米珠從(1)的液體中分離；(4)對從分離出的載體處回收得到的病毒數進行定量以及(5)對回收得到的基準病毒數與(1)中添加的基準病毒數進行比較來評價回收 率，由(4)中定量的人皰疹病毒數與該回收率確定從體液中採集的人皰疹病毒數。實施方式11:—種用於對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的試劑盒，該試劑盒包括生物素化凝集素；結合有生物素結合蛋白質的珠子。實施方式12 一種用於對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的試劑盒，該試劑盒包括；生物素化凝集素；結合有生物素結合蛋白質的珠子；預先確定了濃度的基準病毒。實施方式13:根據實施方式11或12所述的試劑盒，其中，所述凝集素是與包含N-乙醯半乳糖 胺(GalNAc)、α 2-6鍵的唾液酸(Siaa 2-6)、Ν_乙醯葡糖胺(GlcNAc)中至少一種的糖鏈結 合的凝集素。實施方式14 根據實施方式13所述的試劑盒，其中，所述凝集素選自SBA (大豆來源)、SSA (無 梗接骨木來源)、DSA(白曼陀羅來源)和WGA(小麥胚芽來源)；且所述基準病毒是HHV-6 或HHV7-來源的重組病毒。實施方式15 一種對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包括以下步驟(1)使採集的體液與病毒結合物質接觸，其中，(i)該病毒結合物質上連接有能夠與載體結合的分子，並且該病毒結合物質通過 該分子結合於載體，從而結合有病毒結合物質的病毒間接地結合於載體，或者(ii)該病毒結合物質直接結合於載體，從而使結合有病毒結合物質的病毒結合於 載體；
(2)將該載體從(1)的液體中分離；(3)對從分離出的載體處回收得到的病毒量進行定量。實施方式16 一種對從唾液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包括以下步驟(1)在採集的唾液中混合生物素化凝集素，使病毒與生物素化凝集素接觸，再添加 結合有生物素結合蛋白質的珠子，使與生物素化凝集素結合的病毒結合於珠子；(2)將該珠子從(1)的液體中分離；(3)對從分離出的珠子處回收的病毒數進行定量。發明的效果根據本發明，對於體液中的濃度非常低、直接定量困難、需要熟練度的HHV的定 量，能夠簡單容易地進行更準確的定量。


圖1為螢光顯微鏡照片，顯示了針對HHV-6對tamavidin珠的非特異性吸附進行 試驗的結果。發綠色光的點表示EGFP重組HHV-6感染作為指示細胞(indicator cell)的 MT-4細胞，1個點表示1個感染性病毒粒子(各點的亮度差異是由感染後病毒基因表達的 差異引起的)。左側照片表示使HHV-6病毒液(原液)作用於MT-4細胞的情況。右側照片 表示在不存在凝集素的條件下使HHV-6病毒液(原液)與tamavidin珠接觸、並使吸附於 tamavidin珠的病毒作用於MT_4細胞的情況。圖2為螢光顯微鏡照片，顯示了針對ABA、DSA、Lotus、MAM和PHA-E4各凝集素的 HHV-6濃縮效果進行試驗的結果。發綠色光的點表示EGFP重組HHV-6感染作為指示細胞的 MT-4細胞，1個點表示1個感染性病毒粒子(各點的亮度差異是由感染後病毒基因表達的 差異引起的)。圖3為螢光顯微鏡照片，顯示了針對PHA-L4、UEA-I、SBA、和SSA各凝集素的HHV-6 濃縮效果進行試驗的結果。發綠色光的點表示EGFP重組HHV-6感染作為指示細胞的MT-4 細胞，1個點表示1個感染性病毒粒子(各點的亮度差異是由感染後病毒基因表達的差異引 起的)。發明的
具體實施例方式以下，對本發明進行更具體的說明。1.體液中的HHV的定量方法本發明提供一種對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包括以下 步驟(1)使採集的體液與病毒結合物質接觸，其中，(i)該病毒結合物質上連接有能夠與載體結合的分子，並且該病毒結合物質通過 該分子結合於載體，從而結合有病毒結合物質的病毒間接地結合於載體，或者(ii)該病毒結合物質直接結合於載體，從而使結合有病毒結合物質的病毒與載體 結合；(2)將該載體從(1)的液體中分離；(3)對從分離出的載體處回收得到的病毒量進行定量。
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此外，本發明提供一種對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包 括以下步驟(1)在採集到的體液中添加預先確定了濃度的基準病毒；(2)使⑴的液體與病毒結合物質接觸，其中，(i)該病毒結合物質上連接有能夠與載體結合的分子，並且該病毒結合物質通過 該分子結合於載體，從而結合有病毒結合物質的病毒間接地結合於載體，或者(ii)該病毒結合物質直接結合於載體，從而使結合有病毒結合物質的病毒與載體 結合；(3)將該載體從⑴的液體中分離；(4)對從分離出的載體處回收得到的病毒數進行定量以及(5)對回收得到的基準病毒數與(1)中添加的基準病毒數進行比較來評價回收 率，由(4)中定量的體液中的人皰疹病毒數與該回收率確定從體液中採集的人皰疹病毒 數。以下，對本發明的方法的各要素進行具體說明。MS在本發明的方法中，作為定量的對象的病毒是能夠對人的疲勞進行定量的病毒， 具體可以是感染人的屬於皰疹病毒科(Herpesviridae)的病毒，即人皰疹病毒(以下也記 作HHV)。優選可以是選自人皰疹病毒6 (人皰疹病毒6的變體A和B 以下也合稱HHV-6)、 人皰疹病毒7(以下也記作HHV-7)、巨細胞病毒(Cytomegalovirus)(別名人皰疹病毒5)以 及愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus)(以下也記作EBV)中的1種以上的病毒。更 優選為HHV-6和HHV-7，更優選為HHV-6。人皰疹病毒是感染人雙鏈DNA的病毒。HHV-6是直徑200nm左右的病毒。作為本發明的方法的分析對象的體液可以是血液、唾液、血清、精液、母乳、咽喉擦 出液(pharyngeal swab)、腦脊髓液、腹水、汗、淚、尿等採集自人體的體液，其中唾液是優選 的。在本說明書中，作為本發明的方法的分析對象的體液有時也簡稱為「試樣」。作為唾液的採集方法，可以列舉出用棉棒拭取出咽部的粘液的方法、將唾液直接 吐至採集管中的方法、使用唾液採集器具例如唾液收集管(Salivette) (Sarstedt公司)等 的方法等，優選使用唾液收集管的方法。這種情況下，可以通過將棉含於口中，使唾液浸入 棉中來採集唾液，然後通過將含浸有唾液的棉轉移至離心管，並進行離心，可以回收唾液。此外，作為採集唾液前的口腔處理，可以列舉出例如長時間不進食而安靜化的方 法、在將要採集唾液前用水漱口的方法，優選在將要採集唾液前用水漱口的方法。此外，對於唾液以外的體液，可以採用本領域技術人員公知的方法進行採集。而且，對於採集的體液，在不影響病毒粒子、病毒DNA的定量的前提下，也可以視 需要在測定前進行稀釋、過濾、離心等適當處理。或者，在不立即進行病毒定量的情況下，視 需要，可以採用本領域技術人員公知的方法冷藏保存或冷凍保存，直至進行測定。病毒結合物質在本發明中，病毒結合物質是指可與HHV結合的物質。可與HHV結合的物質包括 凝集素、抗HHV的抗體等。
在本說明書中，「凝集素」是指識別糖鏈並與之結合的糖結合性蛋白質。就與凝集 素結合的糖鏈而言，各種凝集素具有特異性。在本發明的方法中所用的凝集素只要是能夠結合HHV即可，沒有特殊限制，優選 與作為定量對象的病毒的親和性高、該病毒的回收率高的凝集素。更優選與包含N-乙醯 半乳糖胺(GalNAc)、α2_6鍵的唾液酸(Sia α 2-6)、N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)中的至少 一種的糖鏈結合的凝集素，更優選選自SBA(大豆來源凝集素。結合糖鏈含N-乙醯半乳 糖胺(GalNAc)的糖鏈)、SSA(無梗接骨木來源凝集素。結合糖鏈含α 2_6鍵的唾液酸 (Sia α 2-6)的糖鏈)、DSA (白曼陀羅來源凝集素。結合糖鏈含N-乙醯葡糖胺(GlcNAc) 的糖鏈)，和WGA (小麥胚芽來源凝集素。結合糖鏈含N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)或唾液酸 的糖鏈)中的凝集素。特別是，當作為定量對象的病毒是HHV-6時，更優選SBA和WGA。對於本發明中所使用的抗HHV的抗體沒有特殊限制，只要可與HHV結合即可，可以 是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。在本發明的一類實施方式中，病毒結合物質可以與載體直接結合併使用。在其它實施方式中，病毒結合物質可以間接與載體結合併使用。作為間接結合的 例子，可以是生物素-生物素結合性蛋白質的結合介導的病毒結合物質與載體的結合。更 具體地，通過將病毒結合物質生物素化，並在載體表面結合生物素結合性蛋白質，使生物素 與生物素結合性蛋白質結合，從而可以實現病毒結合物質與載體的間接結合。鍵在本發明中，載體只要是作為固體或不溶性材料(例如，能夠通過過濾、沉澱、磁 性分離等從反應混合物分離的材料)的載體即可，沒有特殊限制。構成固體載體的材料包括纖維素、特氟隆(teflon)(註冊商標)、硝酸纖維素 (nitrocellulose)、瓊脂糖、高交聯球形瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、聚 酯、聚碳酸酯、聚醯胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯(polydivinylidene difluoride)、膠 乳、二氧化矽、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、銀、銅、鐵、不鏽鋼、鐵氧體、矽晶片(silicon wafer)、 聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白質(白蛋白等)、碳以及它們的組合，但不 限於此。固體載體的形狀包括但不限於珠子、磁珠、薄膜、微細管、濾膜、板、微板、碳納米 管、傳感器晶片等。正如本技術領域公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設置凹 坑、溝槽、濾膜底部等。在本發明的一類實施方式中，磁珠可以具有約IOnm 約Imm範圍的球體直徑。在 優選的實施方式中，磁珠具有約25nm 約1mm、約50nm 約IOOym範圍的直徑。磁珠的尺 寸可以根據特定的用途來進行選擇。在本發明的一類實施方式中，由S^harose等高交聯球形瓊脂糖製成的珠子可以 具有約24μπι 約165μπι範圍的直徑。在優選的實施方式中，高交聯球形瓊脂糖珠具有約 24 μ m 約44 μ m範圍的直徑。高交聯球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選 擇。具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences公司或Spherotech公 司購買的製品等聚苯乙烯膠乳珠。二氧化矽(SiO2)處理或二氧化矽(SiO2)基的固體載體的例子包括可從Polysciences公司購買的超常磁性二氧化矽珠等。或者，還可以使用可從Dynal Biotech 公司購買的M-280等。 作為具有親水性表面的磁珠的例子，可以列舉出Polysciences公司銷售的名稱 為Biomag (註冊商標)羧基的珠子、或者Bangs Laboratory公司的珠子(MC02N/2928)等。 或者，可以使用Dynal Biotech公司銷售的M-270等。在本發明的一類實施方式中，病毒結合物質與載體可以直接結合來使用。這種情 況下，從提高病毒與結合有凝集素的載體的結合可能性的觀點出發，載體可以是能夠做布 朗運動程度大小的納米珠。納米珠的優選球體直徑的範圍是IOnm IOOnm的球體直徑、更 優選30nm 70nm的球體直徑。此外，這種情況下，優選包含能夠用磁鐵簡便回收的磁體， 例如可以列舉出但不限於Miltenyi Biotech公司的MACS MicroBeads (直徑50nm)等磁性 納米珠。病毒結合物質多為蛋白質，因而，該病毒結合蛋白質與載體的連接可以採用本領 域技術人員公知的蛋白質與載體的偶聯方法來進行。例如，對載體表面進行修飾，使得羧基 露出來，然後使該羧基與蛋白質的氨基在交聯試劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化 二亞胺(EDC)的存在下進行偶聯反應，從而將蛋白質與載體連接起來。或者，例如，通過在 不含伯氨基的PH6. 5 9的緩衝液中混合載體表面的羧基被N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活 性酯化後的載體與蛋白質，可以將載體表面的羧基與蛋白質的氨基連接起來。或者，可以使用交聯試劑BS3(雙[磺基琥珀醯亞胺基]辛二酸鹽)或DSS(雙 琥珀醯亞胺基辛二酸酯(Disuccinimidyl suberate))，將載體表面的氨基與蛋白質的氨 基連接起來，或者使用交聯試劑SPDP(N-琥珀醯亞胺基3-[2_吡啶基二硫]丙酸酯)或 GMBS (N-(4-馬來醯亞胺丁醯基氧)琥珀醯亞胺)將載體表面的氨基與蛋白質的硫醇基(千 才一>基)連接起來。病毒結合物質與載體的間接結合在本發明的其它實施方式中，病毒結合物質可以間接與載體結合來使用。例如，通過將病毒結合物質生物素化，並在載體表面結合生物素結合性蛋白質，使 生物素與生物素結合性蛋白質結合，可以實現病毒結合物質與載體的間接結合。這種情況下，作為載體，可以優選使用珠子，珠子的優選球體直徑的範圍是 0. 1 μ m 100 μ m的球體直徑，更優選0. 5 μ m 10 μ m的球體直徑，更優選1 μ m 5 μ m的 球體直徑。在本說明書中，「生物素」是指D-[(+)-cis-六氫-2-氧代-IH-噻吩並_(3，4)_咪 唑-4-戊酸]的通用名。生物素是屬於B族維生素的一種水溶性維生素，也稱作維生素B7、 維生素H或輔酶R。生物素是卵清中包含的一種糖蛋白質，其非常強烈地結合抗生物素蛋 白。在本說明書中，「生物素」除了上述的生物素以外，還包括亞氨基生物素 (iminobiotin) (Hofmann, et al.，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :4666_4668)、脫硫 生物素(desthiobiotin) (Hirsch,et al.，(2002) Anal. Biochem.，308 :343_357)、生物胞素 (biocytin)或生物素亞碸(biotin sulfoxide)等生物素類似物。在對凝集素等病毒結合物質進行生物素化時，可以列舉出使用生物素化試劑的方法。作為生物素化試劑，可以利用例如=PIERCE公司製造的EZ-Link (注 冊商標)SUlf0-NHS-Bi0tin(13.5A、伯胺)(括號內依次為接頭長度、反應基團)、 EZ-Link (註冊商標)Sulfo-NHS-LC-Biotin (22. 4 A、伯胺)、EZ-Link (註冊商標) Sulfo-NHS-LCLC-Biotin(30. 5 A、伯胺)、EZ-Link(註冊商標)PFP-Biotin(9. 6 A、胺)、 EZ-Link(註冊商標)Maleimide-PEO2-Biotin(29. 1 A、硫醇基)、EZ-Link(註冊商標) Biotin-PEO2 Amine (20. 4 A、羧基)、EZ_Link (註冊商標)Biotin-PEO3-LC Amine (22. 9 A、 羧基)、EZ-Link (註冊商標)Biotin-Hydrazide (15. 7 A 、醛基)、EZ-Link (註冊商標) Biotin-LC-Hydrazide (24. 7 A 、醛基)、EZ_Link (註冊商標)NHS-Iminobiotin (13. 5 A、 伯胺)等，但不限於此。使用這樣的生物素化試劑，可以通過公知方法使生物素結合於凝集素等病毒結合 物質。例如，在使用含NHS酯的生物素化試劑的情況下，通過用DMSO ( 二甲基亞碸)這樣 的有機溶劑或PH7-9的磷酸緩衝液進行溶解、並添加凝集素等病毒結合物質，可以結合生 物素。此外，例如，在使用含氨基的生物素化試劑的情況下，通過使用EDC (1-乙基-3- (3- 二 甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽)這樣的碳化二亞胺，在將凝集素等病毒結合物質的羧 基轉換為活化酯後，添加用PH5附近的緩衝液溶解的生物素化試劑，可以結合生物素。此外，結合有生物素的凝集素等病毒結合物質例如可以從J-Oil Mills公司 以生物素標記凝集素的形式購入。此外，還可以通過使用生物素標記試劑盒(例如但 不限於 Pierce 公司製造的 EZ-Link (註冊商標)NHS-Lc-Biotin, Dojindo Molecular Technologies公司製造的Biotin Labeling Kit_NH2等)使生物素結合於期望的病毒結合 物質來製作。此外，通過將凝集素等病毒結合物質的基因與編碼含生物素化序列的肽的DNA相 融合，構建表達該融合基因的載體，並在任意宿主中以與生物素化序列的融合蛋白質的形 式進行表達(Schwarz et al.，(1988). J. Biol. Chem. 263 :9640_9645)，也可以製作例如生 物素化凝集素。這樣的載體可以列舉出但不限於例如Irwitrogen公司的含BioEase (商 標)標籤的載體。這其中，哺乳類細胞表達用的有PcDNA (商標)6載體，大腸桿菌表達用的 有PET104載體，或者果蠅(Drosophila)表達用的有pMT/BioEase載體。在本發明中，作為生物素結合性蛋白質，只要是抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋 白、中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)、AVR 蛋白質(Biochem. J.，(2002)，363 :609_617)、 BradavidinQ. Biol. Chem.，(2005)，280 13250-13255)、Rhizavidin (Biochem. J.，(2007)， 405 :397-405)、tamavidin或它們的突變體等，與生物素和生物素/抗生物素蛋白結 合的蛋白質，均可以適宜使用。特別是，可以優選使用tamavidin及其突變體。而且， tamavidin是在食用蘑菇白黃側耳(pleurotus conucopiae)中發現的生物素結合性蛋白 質(W002/072817 ；Takakura et al.，(2009) FEBS J.，276 1383-1397)。作為 tamavidin 的 突變體，可以列舉出例如高結合能力低非特異性結合tamavidin(日本特願2008-208766， 未公開)等。本發明中的「tamavidin」是指tamavidin 1(胺基酸序列SEQ ID N0:11、編碼其 的核酸序列SEQ ID NO 10)、tamavidin 2(胺基酸序列SEQ ID NO 13、編碼其的核酸序 列SEQ ID NO 12)或它們的突變體。具體地，本發明的tamavidin典型地可以是包含SEQ
13ID N0:11或SEQ ID NO 13的胺基酸序列的蛋白質，或者可以是由包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO :12的鹼基序列的核酸編碼的蛋白質。或者，本發明的tamavidin可以是包含SEQID N0:11或SEQ ID NO :13的胺基酸序列的蛋白質，或由包含SEQ ID N0:10或SEQ ID NO 12 的鹼基序列的核酸編碼的蛋白質的突變體、且具有與tamavidin 1或2相同的生物素結合 活性的蛋白質，或具有高結合能力低非特異性結合的活性的蛋白質。在本說明書中，有些情 況下也簡單地將tamavidin 1、tamavidin 2以及它們的突變體統稱為tamavidin。tamavidin 1或2的突變體可以是包含在SEQ ID NO 11或13的胺基酸序列中包 含1個或多個胺基酸的缺失、取代、插入和/或添加的胺基酸序列而形成的蛋白質、並且具 有與tamavidin 1或2等同的生物素結合活性的蛋白質。取代可以是保守取代，即將特定 的胺基酸殘基替換為具有相似物理化學特徵的殘基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪 族基團的胺基酸殘基之間的取代(例如lie、Val, Leu或Ala間的相互取代)、極性殘基之 間的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之間的相互取代)等。胺基酸缺失、取代、插入和/或添加而產生的突變體可以通過對編碼野生型蛋白 質的DNA實施例如作為公知技術的定點誘變(例如參見NucleicAcid Research, Vol. 10， No. 20,p. 6487-6500，1982，通過引用將其全文弓丨入到本說明書中)來製作。在本說明書中， 「一個或多個胺基酸」是指通過定點誘變方法能夠缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基 酸。此外，在本說明書中，「一個或多個胺基酸」根據情況也可以指1個或數個胺基酸。tamavidin 1或2的突變體還可以是包含與SEQ ID NO :11或13的胺基酸序列 具有至少60%以上、優選65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、 95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上、更優選99. 3%以上的胺基酸同一性 的胺基酸序列的蛋白質，並且該蛋白具有與tamavidin 1或2等同的生物素結合活性或者 具有高結合能力/低非特異性結合的活性。兩個胺基酸序列的同一性％可通過目測和數學計算來確定。或者，兩個蛋白質序 列的同一性百分比可以通過使用以Needleman，S. B.及Wunsch，C. D. (J. Mol. Biol. ,48 443-453,1970)的算法為基礎的、可從威斯康星州大學遺傳學計算機組(UWGCG)獲得的GAP 電腦程式進行序列信息比較來確定。GAP程序優選的默認參數包括=(I)Henikoff, S.以 R Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 10915-10919,1992)所記載的得分 / 矩 陣、bloSUm62; (2) 12分的空位罰分；(3) 4分的空位長度罰分；以及(4)末端空位不罰分。也可使用該領域技術人員使用的進行序列比較的其它程序。關於同一性百分比， 例如=Altschul 等(Nuc 1. Acids. Res.，25，p. 3389-3402，1997)中記載的可用 BLAST 程序 對序列信息進行比較和確定。該程序可於網絡上在National Center for Biotechnology Information(NCBI)或 DNA Data Bank of Japan (DDBJ)網站使用。在相同站點，對利用 BLAST 程序進行同一性檢索的各種條件(參數)進行了詳細記載，可對部分設定進行適當變更，但 檢索通常使用默認值來進行。此外，兩個胺基酸序列的同一性％也可用遺傳信息處理軟體 GENETYX Ver. 7 (GENETYX制)等程序或FASTA算法等來確定。此時，也可用默認值檢索。兩個核酸序列的同一性％可通過目測和數學計算來確定，此外，該比較更優選使 用電腦程式對序列信息進行比較。具有代表性的優選電腦程式為遺傳學計算機組 (GCG ；威斯康星州Madison)的威斯康星·軟體包、10. 0版「GAP」程序(Devereux等，1984， Nucl. Acids Res. ,12 :387)。使用該「GAP」程序，不僅可對兩個核酸序列進行比較，還可比較兩個胺基酸序列，並可對核酸序列和胺基酸序列進行比較。在本發明中，優選的tamavidin包含以下的tamavidin修飾體(日本特願 2008-208766，未公開)。在包含SEQ ID NO :13所述的胺基酸序列、或者在該序列中具有1 數個胺基酸突 變的胺基酸序列、或者與該序列具有80%以上同一性的胺基酸序列，且顯示生物素結合活 性的蛋白質中，選自下組中的1或多個殘基被取代成酸性胺基酸殘基或中性胺基酸殘基而 得到的修飾型生物素結合蛋白質DSEQ ID NO 13的104位的精氨酸殘基；2) SEQ ID NO 13的141位的賴氨酸殘基；3) SEQ ID NO 13的26位的賴氨酸殘基；以及4) SEQ ID NO 13的73位的賴氨酸殘基。更優選選自下組中的修飾型生物素結合蛋白質在SEQ ID NO 13中，104位的精氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基、且141位的賴氨 酸殘基被取代成穀氨酸殘基而得到的修飾型生物素結合蛋白質(R104E-K141E)；在SEQ ID NO 13中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、且104位的精 氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基而得到的修飾型生物素結合蛋白質(D40N-R104E)；在SEQ ID NO 13中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、且141位的賴 氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基而得到的修飾型生物素結合蛋白質(D40N-K141E)；以及在SEQ ID NO 13中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬醯胺殘基、且104位的精 氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成穀氨酸殘基而得到的修飾 型生物素結合蛋白質(D40N-R104E-K141E)。生物素結合性蛋白質與載體的連接可以採用本領域技術人員公知的蛋白質與載 體的偶聯方法來進行。例如，對載體表面進行修飾，使得羧基露出來，然後使該羧基與蛋白 質的氨基在交聯試劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)的存在下進行偶 聯反應，從而可以將蛋白質與載體連接起來。或者，例如，通過在不含伯氨基的PH6. 5 9 的緩衝液中混合載體表面的羧基被N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活性酯化後的載體與蛋白質， 可以將載體表面的羧基與蛋白質的氨基連接起來。或者，可以使用交聯試劑BS3(雙[磺基琥珀醯亞胺基]辛二酸鹽)或DSS(雙琥 珀醯亞胺基辛二酸酯)將載體表面的氨基與蛋白質的氨基連接起來，或者使用交聯試劑 SPDP (N-琥珀醯亞胺基3- [2-吡啶基二硫]丙酸酯)或GMBS (N- (4-馬來醯亞胺丁醯基氧) 琥珀醯亞胺)將載體表面的氨基與蛋白質的硫醇基連接起來。在利用諸如上述的結合將生物素結合性蛋白質固定於載體時，表面配置有各種 官能團的各種載體是商品化的，因此可以優選使用這些載體。可以列舉出但不限於例如 在表面配置有官能團的微板方面，作為馬來酸酐板有例如Reacti-Bind(商標)Maleic Anhydride Activated Polystyrene 96-WellPlates (PIERCE 公司)，作為活性型氨基板有 例如Immobilizer -AminoModules/Plates (Nunc公司)，作為羧基板有例如ELISA用平板 MS-8796F(96孔、C型、平底、羧基)(Sumitomo Bakelite公司)。此外，在表面配置有官能團 的微珠方面，作為高交聯瓊脂糖珠有例如S印harose (商標)(GE HealthcareBio-Science 公司)，作為磁珠有例如Dynabeads (商標)(Dynal公司)等，但不限於此。生物素結合性蛋
15白質與固體載體的連接可以按照載體附帶的說明書來進行。此外，作為固定有生物素結合性蛋白質的載體，還可以列舉出例如Reacti-Bind Streptavidin Coated Plates (PIERCE 公司)、Nunc StreptavidinCoated 96Micro Well Plates (Nalge Nunc 公司)等微板類，或者 DynabeadsM-280 Streptavidin (Dynal 公司)、 MagnaBind Streptavidin Beads (PIERCE公司)等磁珠類等市售品，但不限於此。在不使用生物素與生物素結合性蛋白質的情況下，例如，可以在病毒結合物質上 結合組氨酸標籤、FLAG 標籤或穀胱甘肽硫轉移酶(GST)，並在載體上分別結合Ni-NTA (氮 川三乙酸)、抗FLAG抗體或穀胱甘肽，通過它們之間的結合，也可以使病毒結合物質與載體 間接結合。基準病毒(基準々彳^ 7 )在本發明的方法中，作為定量的對象的病毒的回收率並非一定是100%，還會因試 樣、條件而發生微妙的變化，因此回收率並不是嚴格一定的。如果目的是一次性地獲得病毒 的概數，則這樣倒也無妨。但是，為了進行能夠評價中長期疲勞的病毒定量，必須要對在一 定期間內採集的體液中的病毒量進行計量，並持續地對該量進行比較，而如果回收率發生 變化，則存在的問題是對持續採集/定量的病毒量的比較變得困難。與此相對，發明人等進行了研究，結果通過將下述病毒(以下稱為「基準病毒」)導 入系統成功地解決了該問題所述病毒與作為定量對象的病毒具有同等程度的回收率、且 即使在混有定量對象病毒的情況下，也能夠分別判別並計量各自的病毒數。具體地，將經過 定量的基準病毒添加一定量到初始試樣(例如唾液)中，進行本發明的方法後，基於初始試 樣中加入的基準病毒的量與回收的基準病毒的量來評價回收率。然後，將該回收率乘以定 量對象病毒的測定值，來對病毒量的測定值進行修正，從而能夠穩定且準確地對定量對象 病毒進行定量。此外，當在試樣中加入基準病毒進行測定、評價回收率、對定量對象病毒的測定值 進行修正時，優選其在一個測定系統中進行，但也可以這樣進行例如，將試樣分成2份，僅 其中的一份加入基準病毒並評價回收率，而另1份進行定量對象病毒的測定，從兩者的結 果來對定量對象病毒的測定值進行修正。而且，在本發明的方法中，當進行大量的待檢物的病毒定量時，優選在所有待檢物 中導入基準病毒來進行定量，但如果病毒回收率穩定，也並非必須要針對所有的待檢物均 導入基準病毒，可以適當地省略基準病毒導入。即，通過在一部分待檢物中導入基準病毒， 來確認系統的回收率是穩定的，而對於其它待檢物可以不進行基準病毒的導入而進行病毒 定量，這樣的實施方式也包含在本發明的方法中。基準病毒應與進行定量的病毒具有相同的特徵，且必須能夠容易地與進行定量的 病毒相區別。即，在本發明的定量方法中，其必須能夠與作為定量對象的病毒一樣與病毒結 合物質結合、一樣能夠用珠子回收，且必須能夠採用PCR、LAMP、ELISA等容易地且與對象病 毒相區別地進行定量。發明人等發現作為滿足該條件的基準病毒，在定量對象病毒是HHV-6時，突變型 HH-6是合適的；而當定量對象病毒是HHV-7時，突變型HHV-7是合適的。 作為突變型HHV-6，優選HHV-6來源的重組病毒，且該重組病毒的與HHV-6的U2 U8區域相當的部位、或者與U24和U25區域相當的部位中具有野生型HHV-6基因組中不存在的外源性核苷酸序列。此外，作為突變型HHV-7，優選HHV-7來源的重組病毒，且該重組病 毒的與HHV-7的U2 U8區域或U24 25區域相當的部位中具有野生型HHV-7基因組中 不存在的外源性核苷酸序列。在利用PCR、LAMP等高靈敏度地檢測核苷酸本身的系統對病毒進行定量時，對於 外源性核苷酸序列沒有特殊限制，只要是作為定量對象的野生型HHV的基因組或人基因組 中不存在的序列即可，可以不必是結構基因。這種情況下，對外源性核苷酸序列的長度沒有 特殊限制，優選是100鹼基以上且20，000鹼基以下，更優選200鹼基以上且10，000鹼基以 下。此外，在這樣的系統中，當插入結構基因作為外源性核苷酸序列時，優選編碼下述蛋白 質的核苷酸序列對作為定量對象的HHV的回收率沒有影響(例如，對HHV-6糖鏈-凝集素 結合沒有影響)的蛋白質，例如螢光蛋白質(可以列舉出例如綠色螢光蛋白(GFP)或增強 綠色螢光蛋白(EGFP)等，但不限於此)或者抗生素抗性蛋白質(可以列舉出例如四環素、 氨苄青黴素、卡那黴素、新黴素、潮黴素或壯觀黴素等的抗性蛋白質，但不限於此)等。此外，當使用抗病毒的抗體對病毒進行定量時，在例如通過ELISA法等免疫測定 進行的定量中，突變型HHV必須表達野生型HHV中不存在的外源性蛋白質，這樣的蛋白質由 外源性核苷酸序列編碼，對於該核苷酸序列沒有特殊限制，只要是作為定量對象的野生型 HHV基因組中不存在的序列即可，優選人基因組中不存在的序列。此外，作為外源性蛋白質， 優選對作為定量對象的HHV的回收率沒有影響的、例如上述那樣的螢光蛋白質或抗生素抗 性蛋白質等。或者，也可以優選使用測定容易的酶等。作為這樣的突變型HHV-6的例子，優選可以利用重組了下述基因的重組病毒(參 照例如專利第3923505號)，所述基因編碼用於與野生型HHV-6相區別地進行計量的蛋白 質。此外，作為這樣的突變型HHV-7的例子，優選可以利用重組了下述基因的重組病毒(參 照例如特開2007-159586)，所述基因編碼用於與野生型HHV-7相區別地進行計量的蛋白質。對於這樣的基準病毒在試樣中的添加量沒有特殊限制，只要是能夠進行基準病毒 的定量的量即可，例如，對於突變型HHV-6，可以以每ImllO拷貝 1，000, 000拷貝左右、優 選每ImllO拷貝 100，000拷貝左右、更優選每lml50拷貝 50，000拷貝左右、更優選每 ImllOO拷貝 10，000拷貝左右來進行定量。在使用基準病毒進行的定量中，基準病毒具有諸如上述的特性，因而，其不僅能夠 在利用載體進行的對象病毒回收或濃縮中作為基準，還能夠優選在其後的利用PCR、LAMP 進行的定量中作為內部標準，或者在利用ELISA法進行的定量中作為基準，直接使用。體液與病毒結合物質的接觸本發明的方法包括使體液與病毒結合物質相接觸的步驟。對於使體液與病毒結合 物質相接觸的條件沒有特殊限制，只要是使試樣中的病毒與病毒結合物質的結合達到可以 對病毒進行定量的程度的條件即可。作為接觸條件的要素，包括溫育溫度和溫育時間。此外，體液可以直接與病毒結合物質接觸，或者可以在該體液中加入期望的緩衝 液等，然後再與病毒結合物質接觸。而且，在加入所望的緩衝液等時，加入的緩衝液的量有 必要在計算病毒量時予以考慮。溫育溫度的下限可以是4°C或10°C，上限可以選自50°C、45°C、4(TC、37°C、3(rC、 25°C和20°C。作為優選的溫育溫度，可以列舉出10°C 37°C、10°C 25°C、10°C 20°C、15°C。溫育時間的下限可以選自1分鐘、3分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘和30分 鍾，上限可以選自一夜、10小時、8小時、5小時、3小時、2小時、1. 5小時和1小時。作為優 選的溫育時間，可以列舉出5分鐘 2小時、10分鐘 1. 5小時、30分鐘 1小時。在本發明的方法中的病毒結合物質與載體間接結合的實施方式中，在使病毒結合 物質與體液接觸前、或接觸的同時、或接觸後，通過能夠與載體結合的分子使病毒結合物質 與載體相接觸並結合。對於使病毒結合物質與載體相接觸的條件沒有特殊限制，只要是病 毒結合物質通過能夠與載體結合的分子可以充分地結合於載體的條件即可。作為接觸條件 的要素，包括溫育溫度和溫育時間。可以適宜地選擇與上述的使病毒與病毒結合物質相接 觸的條件相同的條件，作為特別優選的溫育時間，可以列舉出1分鐘 2小時、3分鐘 1小 時、5分鐘 30分鐘。載體的分離通過病毒結合物質而捕捉到作為定量對象的病毒的載體，可以根據該載體的性 質，採用本領域技術人員公知的方法，從作為試樣的體液中分離。例如，對於珠子等粒狀載體，通過離心分離並進而除去上清，可以實現將載體從試 樣分離。在載體為磁珠的情況下，通過使用磁鐵收集載體並除去上清，可以將載體從試樣分 離。在載體為薄膜、濾膜等形狀的情況下，通過將載體從試樣中撈起來、或者使試樣通過載 體後，可以將載體從試樣分離。當載體被設計由病毒來填充起孔結構的內部(例如微板等) 時，簡單通過將試樣從孔中除去，即可將載體從試樣分離。此外，視需要為了除去非特異性結合在從試樣分離的載體上的物質，可以增加對 分離出的載體進行洗滌的步驟。對於洗滌步驟中採用的洗滌液、溫度的條件沒有特殊限制， 只要維持病毒與病毒結合物質間的結合和/或病毒結合物質與載體間的結合的條件得以 保持即可。優選地，洗滌液具有緩衝能力，可以是以pH7 8的緩衝液、例如Tris/EDTA(TE)、 PBS、HEPES、TBS等為基礎的緩衝液。此外，洗滌液的pH可以為6 9、優選7 8。對於洗滌溫度沒有特殊限制，洗滌溫度的下限可以是4°C或10°C，上限可以選自 50 V、45°C、40 V、37°C、30°C、25°C和20 V。作為優選的洗滌溫度，可以列舉出10°C 37°C、 10°C 25°C、10°C 20°C、15°C。濃縮病毒溶液的定量將捕捉了作為定量對象的病毒的載體從作為試樣的體液分離和/或洗滌後，向該 載體中加入少於該體液的初期體積的量的緩衝液。由此，與體液的HHV濃度相比，使回收的 試樣中的HHV濃度提高。對於少於體液的初期體積的量沒有特殊限制，可以是初期體積的 1/2、1/10、1/20、1/40、1/60、1/80、1/100。加入到捕捉了作為定量對象的病毒的載體中的緩衝液，可以根據其後採用的病毒 的定量方法適宜選擇。與體液中的HHV濃度相比，提高了如上述回收的試樣中的HHV濃度之後，進行病毒 數的定量。在本說明書中，「對病毒數進行定量」是指對試樣中存在的病毒的量進行定量。 因此，「對病毒數進行定量」包括例如，以絕對病毒數、病毒濃度或病毒效價的形式，直接或 間接地進行定量。作為病毒數的計量方法，有對病毒DNA量進行定量的方法、對病毒粒子來源的抗原的數量進行定量的方法，可以適宜採用公知的定量方法。作為前者，可以列舉出 基於實時 PCR 法等 PCR(Science，(1985) ,230 1350-1354)的方法、利用 LAMP 法(Nucleic Acids Res. , (2000)，28 :Ε63)等的DNA定量方法。作為後者，可以列舉出利用夾心ELISA 法等的抗原蛋白質的定量方法。此外，還有使病毒感染期望的感染用細胞，以病毒效價的形 式進行定量的方法。而且，在測定病毒DNA量時，必須破環病毒外膜蛋白質。為此，並非限定，可以優選 在適當的緩衝液中進行熱處理、添加表面活性劑、蛋白酶K( ^nr f-^K)處理或它們的 組合等。對於緩衝液沒有特殊限制，進行反應的pH可以是5. 0 9. 0、優選6. 0 8. 0、更 優選7. 0 8. 0。pH7 8的緩衝液可以是以例如Tris/EDTA(TE)、PBS、HEPES、TBS等為基 礎的緩衝液。對於熱處理的溫度沒有特殊限制，優選的熱處理溫度可以是60°C 100°C、更 優選70°C 95°C、更優選80°C 95°C，處理時間可以是5分鐘 1小時、優選10分鐘 30 分鐘。對於表面活性劑的種類沒有特殊限制，只要不影響後續的病毒定量測定即可，可以列 舉出例如NonidetP-40、Tween20、Triton X-IOO等，其濃度分別可以是0. 01%~ 1%、優選 0. 05 % 0. 5 %、更優選0. 05 % 0. 25 %。在組合熱處理和表面活性劑時，可以在上述條件 的範圍內適宜組合。2.試劑盒此外，本發明還提供用於基於本發明的方法對從體液採集的人皰疹病毒數進行定 量的試劑盒。在一類實施方式中，本發明的試劑盒至少包含生物素化病毒結合物質和結合了 生物素結合蛋白質的載體。優選地，本發明的試劑盒至少包含生物素化病毒結合物質、結合 了生物素結合蛋白質的載體、和預先確定了濃度的基準病毒。關於病毒結合物質、生物素結 合蛋白質、載體和基準病毒，如上述定義。在其它實施方式中，本發明的試劑盒至少包含結合有病毒結合物質的納米珠。優 選地，本發明的試劑盒至少包含結合有病毒結合物質的納米珠和預先確定了濃度的基準病 毒。關於病毒結合物質、納米珠和基準病毒，如上述定義。本發明的試劑盒中還可以包含本發明的方法中的、用於使病毒與病毒結合物質結 合的緩衝液、用於洗滌分離出的病毒結合載體的緩衝液、和/或用於其後加入到該載體中 的緩衝液。此外，本發明的試劑盒中還可以包含用於進行病毒的定量的試劑和/或緩衝液。 例如，當病毒的定量方法是基於DNA量的定量的方法時，可以列舉出DNA聚合酶、引物、視需 要而定的合適的探針、合適的緩衝液等。當病毒的定量方法是基於抗原的數量的定量的方 法時，可以列舉出識別抗原的抗體、用於檢測的合適的二次抗體、合適的緩衝液等。 本發明的試劑盒中，各種試劑可以封裝在合適的容器中。此外，本發明的試劑盒還 可以包含用於對其中所含的試劑等進行適當捆包的包裝。 此外，本發明的試劑盒還可以包含合適的使用說明資料。使用說明資料包括但 不限於包裝上記載的使用方法或印刷品、電子記錄媒體(例如磁碟、磁帶、盒式存儲器 (cartridge)、晶片)和光學媒體(例如CD ROM)等可向使用者傳達本發明的試劑盒的使用 方法的媒體。此外，連接至提供使用說明資料的網際網路站點的地址的記載也包含在使用說
19明資料中。 實施例以下，通過實施例對本發明進行具體說明，但這些並不是對本發明的技術範圍的 限定。本領域技術人員可以基於本說明書的記載容易地對本發明加以修飾、變更，這些也包 含在本發明的技術範圍內。實施例1能夠檢測HHV的凝集素的探索
使生物素化的凝集素與培養的HHV-6溶液反應，研究了是否能夠通過與結合有 tamavidin的磁珠相結合來濃縮HHV-6。1.從培養T細胞製作HHV-6溶液使表達EGFP的重組HHV-6 (專利第3923505號)感染人臍帶血來源培養T細胞， 製作了 EGFP型HHV-6溶液。2. tamavidin 磁珠的製作將表面用羧基包覆的磁珠(DynabeadsM-270 Carboxylic Acid, Dynal 公 司)300 μ 1用0. OlN氫氧化鈉300 μ 1洗滌10分鐘後，再用超純水300 μ 1洗滌3次，每次 10分鐘。對於洗滌完畢的磁珠，添加用冷超純水溶解的鹽酸1-乙基-3_(3- 二甲基氨基丙 基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC) (PIERCE公司)使得最終濃度為0. 2M,室溫振蕩30分鐘。然 後，用冷超純水300 μ 1、再用50mM MES緩衝液(pH5. 0) 300 μ 1洗滌磁珠，混合0. 6mg/ml的 tamavidin 300 μ 1 (180 μ g)來替代50mM MES緩衝液(pH5. 0)。通過室溫振蕩30分鐘，使 tamavidin與磁珠通過共價鍵結合。用磁鐵回收磁珠，除去上清。接下來，用50mM TRIS緩 衝液(pH7. 0)300 μ 1除去珠子的未反應羧基，然後用含0. 5% BSA、0. 1% Tween20的PBS緩 衝液300 μ 1封閉磁珠，從而完成了磁珠的製作。tamavidin磁珠的生物素結合活性為每Iml 珠懸浮液15nmol。3.重組HHV-6溶液的濃縮利用上述項目1中製作的EGFP型HHV-6溶液，以重組HHV-6的感染效價為指標， 嘗試進行了病毒濃縮。生物素化凝集素使用了 J-OIL MILLS公司製造的15種凝集素(Con A, DBA, LCA, ΡΗΑ-Ε4, PNA, RCA120, UEA-I, WGA, ΑΒΑ, DSA, Lotus, MAM, PHA-L4, SBA, SSA)。首先，在進行凝集素的探索之前，進行了作為背景的tamavidin的非特異性吸附 的確認。首先，混合EGFP 重組 HHV-6 液 100 μ 1 (濃度 IO4 個 /ml TE)與 PBS 500 μ 1，15°C溫 育1小時(顛倒混合)。接著，將上述項目2中製作的tamavidin磁珠添加到反應液中，再次 15°C溫育1小時(顛倒混合)。然後，將裝有反應液的埃芬道夫管立於Dynabeads用磁鐵臺 後，用PBS 2mM EDTA 0. 5% BSA 200 μ 1洗滌2次。接著，將其懸浮於培養液(RPMI1640+10% 胎牛血清)500 μ 1後，將全部與0.5ml的指示細胞(MT4細胞)一起懸浮。而且，可以認為 如果存在EGFP型HHV-6，則EGFP型HHV-6感染指示細胞，HHV-6的DNA進入細胞中，其中重 組到病毒中的EGFP基因得以表達，從而發出GFP螢光。上述實驗的結果如圖1所示，可以確認基本上沒有HHV-6針對tamavidin珠子的 非特異性吸附。接下來，考察了使用各種凝集素進行病毒濃縮是否可行。
首先，混合EGFP 重組 HHV-6 液 100 μ 1 (濃度 IO4 個 /ml TE)與 PBS 500 μ 1,生物 素化凝集素 ο μ g，15°C溫育1小時(顛倒混合)。接著，將上述項目2中製作的tamavidin 磁珠添加到10μ 1反應液中，再次15°C溫育1小時(顛倒混合)。然後，將裝有反應液的試 管立於Dynabeads用磁鐵臺後，用PBS 2mMEDTA 0.5% BSA 200 μ 1洗滌2次。接著，將其懸 浮於培養液(RPMI1640+10%胎牛血清)500 μ 1後，將全部與0. 5ml的指示細胞(MT4細胞) 一起懸浮，觀察了 EGFP的表達。可以認為如果能夠濃縮EGFP型HHV-6，則通過凝集素-生 物素-tamavidin與磁珠結合在一起的EGFP型HHV-6感染指示細胞，HHV-6的DNA進入細 胞中，其中重組到病毒中的EGFP基因得以表達，從而發出GFP螢光。作為實驗結果，例如圖2、圖3所示，在使用SBA、SSA、DSA或WGA時，觀察到了比病 毒原液更多的EGFP的表達。該事實表明，使用這些凝集素能夠有效率地濃縮HHV-6。t施例2某準病毒的唾液中HHV-6的定量在不使用基準病毒的情況下，利用生物素化凝集素和tamavidin磁珠對唾液中的 HHV-6濃度進行了定量。1.睡液的採集使用唾液收集管(Salivette Cotton、Sarstedt公司製造)採集來自受試者的唾 液。在即將進行唾液採集之前，受試者用蒸餾水漱口 2次，然後將唾液收集管的棉芯含於口 腔內2分鐘，採集了唾液。2.採用傳統方法講行HHV-6的定量首先，採用傳統方法對唾液中的HHV-6濃度進行了定量。對於上述項目1中採集的唾液400 μ 1，使用BioRobot EZl (QIAGEN公司)與EZl Virus Mini Kit v2. 0 (QIAGEN 公司)，按照 EZl Virus MiniHandbook (QIAGEN 公司)的規 程，對唾液中的HHV-6DNA進行了純化。將所得DNA用於定量PCR。在定量PCR中，採用實時PCR法對HHV-6的TO5/66區 域進行了定量。PCR中使用的序列是引物5' -GACAATCACATGCCTGGATAATG-3『 (SEQ ID NO :1)；和引物5' -TGTAAGCGTGTGGTAATGGACTAA-3 『 (SEQ ID NO 2)；以及TaciMan 探針FAM5' -AGCAGCTGGCGAAAAGTGCTGTGC-3 『 TAMRA (SEQ ID NO 3)；使用 FastStart Universal Probe Master (Rox) (Roche 公司)進行了 反應溫度 950C 10分鐘1次，95°C 5秒+60°C 31秒的循環45個的實時PCR。而且，本試驗中病毒實驗由極熟練的實驗者來進行。作為以上結果，唾液Iml中的HHV-6DNA是14616拷貝/ml。3.利用生物素化凝集素、tamavidin磁珠進行的HHV-6的定量在上述項目1中採集的唾液400 μ 1中混合44 μ 1的10倍濃度PBS、生物素化SBA lnmol, 15°C溫育1小時(顛倒混合)。接著，將實施例1的項目2中製作的tamavidin磁 珠100 μ 1添加到反應液中，再次於15°C溫育1小時(顛倒混合)。然後，將裝有反應液的 埃芬道夫管立於Dynabeads用磁鐵臺上後，用PBS 500 μ 1洗滌3次。向其中加入10μ1的 TE，98°C處理10分鐘後，在磁鐵臺上回收上清，將其中的5μ 1用於定量PCR。定量PCR中， 像上述項目2那樣對HHV-6TO5/66區域採用實時PCR法進行了定量。作為其結果，經測定，洗脫液5μ1中的HHV-6量是2934拷貝。因此，可以計算出
21TElO μ 1中存在的HHV-6是5868拷貝。這是最初存在於唾液400 μ 1中的HHV-6量，因而換 算成每Iml的量，經計算為14670拷貝/ml。該值與上述2中採用傳統方法測定的值(14616 拷貝/ml)十分一致。這種情況下，可以認為病毒的回收率基本上為100%。以上事實顯示，可以利用生物素化SBA進行HHV-6的定量。t施例3 #用某準病毒講行的唾液中HHV-6的定量對於唾液中的HHV-6濃度，利用生物素化凝集素、tamavidin磁珠和基準病毒進行
了定量。1.睡液採集方法使用唾液收集管(Salivette Cotton、Sarstedt公司製造)採集來自受試者的唾 液。在即將進行唾液採集之前，受試者用蒸餾水漱口 2次，然後將唾液收集管的棉芯含於口 腔內2分鐘，採集了唾液。2.利用傳統方法講行的HHV-6的定量採用與實施例2的項目2相同的方法，進行了唾液中的HHV-6的定量。而且，本試 驗中病毒實驗由極熟練的實驗者來進行。其結果示於表1。3.利用牛物素化凝集素、tamavidin磁珠、某準病毒講行的HHV-6的定量(1)使用生物素化WGA進行的HHV-6的定量在上述項目1中採集的唾液400 μ 1中添加含1000拷貝的EGFP型HHV-6的EGFP 型HHV-6溶液。接著，混合44 μ 1的10倍濃度PBS、生物素化WGAlnmol，15°C溫育30分鐘 (顛倒混合)。然後，在反應液中添加實施例1中製作的tamavidin磁珠100 μ 1，再次於 15°C溫育30分鐘(顛倒混合)。然後，將裝有反應液的埃芬道夫管立於Dynabeads用磁鐵 臺上後，用PBS 500 μ 1洗滌3次。接著，加入蛋白酶K緩衝液(加入TE中lmg/ml的蛋白 酶K、0. 45% ΝΡ-40、0. 45% Tween20而得到)40 μ 1，56°C溫育1小時，破壞病毒粒子，使基 因組DNA游離出來。然後，在磁鐵臺上回收上清。對於上清，98°C處理10分鐘使蛋白酶K 失活後，使用其中的5 μ 1進行了定量PCR。在定量PCR中，採用實時PCR法對僅EGFP重組 病毒具有的EGFP基因、和野生型HHV-6中存在而重組病毒中缺損的HHV-6TO基因進行了定 量。作為用於對EGFP基因進行定量的引物和Taqman探針，使用了 引物5' -CTGCTGCCCGACAACCA-3『 (SEQ ID NO 4)；和引物5' -TGTGATCGCGCTTCTCGTT-3『 (SEQ ID NO 5)；以及TaqMan 探針 FAM5 『 -CTGAGCACCCAGTCCGCCCTG-3 『 TAMRA (SEQID NO :6)。作為用於對HHV-6TO基因進行定量的引物，使用了 引物5' -CGAAGAAAAGTAGCACAGGTCTCC-3『 (SEQ ID NO 7)；和引物5' -ACCGTGTCATAAATGCTGAGTTGG-3 『 (SEQ ID NO :8)；以及，TaciMan 探針FAM5 『 -AGGCACCCGTTCCGCCCCAGC-3 『 TAMRA (SEQID NO :9)。實時 PCR 法使用 FastStart Universal Probe Master (Rox) (Roche 公司)如下進行反應溫度 950C 10分鐘1次，95°C 5秒+60°C 31秒的循環45個。根據從EGFP基因的上述實時PCR法的結果定量得到的EGFP型HHV-6數與初始添 加的EGFP型HHV-61000拷貝之比，計算出了各實驗中EGFP型HHV-6的回收率。在該回收 率的基礎上乘以從上述HHV-6TO基因的上述實時PCR法的結果測定得到的野生型HHV-6數來進行修正，即為通過本方法的方法定量得出的值。使用不同的3種唾液待檢物進行了以上實驗。其結果示於表1。表權利要求
一種對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包括以下步驟(1)在採集到的體液中添加預先確定了濃度的基準病毒；(2)使(1)的液體與病毒結合物質接觸，並且，(i)該病毒結合物質上連接有能夠與載體結合的分子，並且該病毒結合物質通過該分子結合於載體，從而結合有病毒結合物質的病毒間接地結合於載體，或者(ii)該病毒結合物質直接結合於載體，從而使結合有病毒結合物質的病毒結合於載體；(3)將該載體從(1)的液體中分離；(4)對從分離出的載體處回收得到的病毒數進行定量以及(5)對回收得到的基準病毒數與(1)中添加的基準病毒數進行比較來評價回收率，由(4)中定量的人皰疹病毒數與該回收率確定從體液中採集的人皰疹病毒數。
2.一種對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包括以下步驟(1)在採集到的體液中添加預先確定了濃度的基準病毒；(2)使(1)的液體與凝集素接觸，並且，(i)該凝集素上連接有能夠與載體結合的分子，並且該凝集素通過該分子結合於載體， 從而與凝集素結合的病毒間接地結合於載體，或者( )該凝集素直接結合於載體，從而使與凝集素結合的病毒結合於載體；(3)將該載體從(1)的液體中分離；(4)對從分離出的載體回收得到的病毒數進行定量以及(5)對回收得到的基準病毒數與(1)中添加的基準病毒數進行比較來評價回收率，由 (4)中定量的人皰疹病毒數與該回收率確定從體液中採集的人皰疹病毒數。
3.—種對從唾液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包括以下步驟(1)在採集的唾液中添加預先確定了濃度的基準病毒；(2)在(1)的液體中混合生物素化凝集素，使病毒與生物素化凝集素接觸，再添加結合 有生物素結合蛋白質的珠子，使與生物素化凝集素結合的病毒結合於珠子；(3)將該珠子從(1)的液體中分離；(4)對從分離出的珠子處回收的病毒數進行定量以及(5)對回收得到的基準病毒數與(1)中添加的基準病毒數進行比較來評價回收率，由 (4)中定量的人皰疹病毒數與該回收率確定從唾液中採集的人皰疹病毒數。
4.根據權利要求1 3中任一項所述的方法，其中，所述人皰疹病毒是人皰疹病毒 6 (HHV-6)或人皰疹病毒7 (HHV-7)。
5.根據權利要求1 3中任一項所述的方法，其中，所述基準病毒是HHV-6或HHV-7來 源的重組病毒。
6.根據權利要求2或3所述的方法，其中，所述凝集素是與包含N-乙醯半乳糖胺 (GalNAc)、α 2-6鍵的唾液酸(Siaa 2-6)、Ν_乙醯葡糖胺(GlcNAc)中的至少一種的糖鏈結 合的凝集素。
7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述凝集素選自SBA(大豆來源)、SSA(無梗接 骨木來源)、DSA(白曼陀羅來源)和WGA(小麥胚芽來源)。
8.根據權利要求1 3中任一項所述的方法，其中，所述步驟⑷包括採用選自PCR、LAMP和ELISA中的方法對病毒數進行定量。
9.一種對從唾液採集的人皰疹病毒6 (HHV-6)或人皰疹病毒7 (HHV-7)的數量進行定量 的方法，該方法包括以下步驟(1)在採集的唾液中添加預先確定了濃度的基準病毒，並使得基準病毒濃度是10 100, 000基因組拷貝/ml，其中，該基準病毒是HHV-6或HHV-7來源的重組病毒；(2)在(1)的液體中混合生物素化凝集素，使病毒與生物素化凝集素接觸，再添加結合 有生物素結合蛋白質的珠子，使與生物素化凝集素結合的病毒結合於珠子，其中，該凝集素 選自SBA (大豆來源)、SSA (無梗接骨木來源)、DSA(白曼陀羅來源)和WGA (小麥胚芽來 源)；(3)將該珠子從(1)的液體中分離；(4)採用選自PCR、LAMP和ELISA中的方法對從分離出的珠子處回收的病毒數進行定 量；以及(5)對回收得到的基準病毒數與(1)中添加的基準病毒數進行比較來評價回收率，由 (4)中定量的人皰疹病毒數與該回收率確定從唾液中採集的人皰疹病毒數。
10.一種對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包括以下步驟(1)在採集到的體液中添加預先確定了濃度的基準病毒；(2)使(1)的液體與直接結合在直徑IOnm IOOnm的納米珠上的病毒結合物質相接 觸，從而使病毒結合於納米珠；(3)將該納米珠從(1)的液體中分離；(4)對從分離出的載體處回收得到的病毒數進行定量以及(5)對回收得到的基準病毒數與(1)中添加的基準病毒數進行比較來評價回收率，由 (4)中定量的人皰疹病毒數與該回收率確定從體液中採集的人皰疹病毒數。
11.一種用於對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的試劑盒，該試劑盒包括生物素化凝集素；結合有生物素結合蛋白質的珠子。
12.一種用於對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的試劑盒，該試劑盒包括生物素化凝集素；結合有生物素結合蛋白質的珠子；預先確定了濃度的基準病毒。
13.根據權利要求11或12所述的試劑盒，其中，所述凝集素是與包含N-乙醯半乳糖胺 (GalNAc)、α 2-6鍵的唾液酸(Siaa 2-6)、Ν_乙醯葡糖胺(GlcNAc)中至少一種的糖鏈結合 的凝集素。
14.根據權利要求13所述的試劑盒，其中，所述凝集素選自SBA(大豆來源)、SSA(無梗 接骨木來源)、DSA(白曼陀羅來源)和WGA(小麥胚芽來源)；且所述基準病毒是HHV-6或 HHV7-來源的重組病毒。
15.一種對從體液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包括以下步驟(1)使採集的體液與病毒結合物質接觸，並且，(i)該病毒結合物質上連接有能夠與載體結合的分子，並且該病毒結合物質通過該分 子結合於載體，從而結合有病毒結合物質的病毒間接地結合於載體，或者(ii)該病毒結合物質直接結合於載體，從而使結合有病毒結合物質的病毒結合於載體；(2)將該載體從(1)的液體中分離；(3)對從分離出的載體處回收得到的病毒量進行定量。
16. 一種對從唾液採集的人皰疹病毒數進行定量的方法，該方法包括以下步驟(1)在採集的唾液中混合生物素化凝集素，使病毒與生物素化凝集素接觸，再添加結合 有生物素結合蛋白質的珠子，使與生物素化凝集素結合的病毒結合於珠子；(2)將該珠子從(1)的液體中分離；(3)對從分離出的珠子處回收的病毒數進行定量。
全文摘要
本發明涉及對從體液採集的人皰疹病毒(HHV)數進行定量的方法、以及用於進行該方法的試劑盒。傳統上，對來自體液的HHV數準確進行定量需要熟練的技術。本發明的方法提供能夠對體液中的HHV數更簡便、準確且有效率地進行計量的新定量方法。本發明的方法是能夠勝任對體液中的HHV數進行持續評價的方法，因而，也可以適用於針對疲勞蓄積的定量評價。
文檔編號C12Q1/06GK101983244SQ200980112159
公開日2011年3月2日 申請日期2009年3月31日 優先權日2008年3月31日
發明者市川雅子, 清水昭宏, 近藤一博, 高倉由光 申請人:日本菸草產業株式會社