二苯乙烯甙在製備治療缺血性腦血管疾病的藥物的用途的製作方法

2023-04-25 11:43:56 1

專利名稱：二苯乙烯甙在製備治療缺血性腦血管疾病的藥物的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及二苯乙烯甙化合物、其衍生物和藥用鹽的用途，具體說是在製備治療缺血性腦血管疾病，例如腦血栓、腦梗死、腦栓塞、腦供血不足等的藥物中的用途。
腦組織的急性或慢性缺血，會導致腦細胞缺氧、腦水腫，脂質過氧化，細胞內鈣離子濃度增高等系列病理生理反應，腦水腫引起細胞缺氧，酸中毒，自由基增多，細胞功能減低；脂質過氧化是細胞膜和細胞器膜受到自由基的損傷，形成過氧化脂質，它可引起膜損傷、酶抑制、溶酶體釋放、蛋白交聯、DNA和RNA結構破壞等生化毒性，最終可導致細胞死亡；細胞內鈣離子增多，出現鈣超載，損傷神經細胞。
發明人經動物試驗發現，二苯乙烯甙化合物能夠減低急性腦缺血再灌注小鼠腦含水量，抑制腦缺血再灌注小鼠模型腦組織脂質過氧化，增強腦缺血再灌注小鼠模型腦組織超氧化物歧化酶活性，減低腦缺血再灌注小鼠模型腦片細胞內鈣離子濃度，減低光化學誘導急性腦梗塞小鼠模型腦血管損傷，提高雙側頸總動脈夾閉致腦缺血沙土鼠模型學習記憶能力，該化合物同時具備腦保護劑、鈣拮抗劑、抗氧化劑等的用途，從而能夠有效地防治缺血性腦血管疾病。
本發明的另一個目的是提供含有上述化合物、其衍生物或藥用鹽的藥物組合物作為缺血性腦血管疾病的治療劑的應用。在該組合物中還可以含有載體(如賦型劑)和其它任選成分。在該組合物中，本發明的二苯乙烯甙佔10-90wt％，優選佔50-90wt％。載體包括賦型劑等，例如硬脂酸鎂、澱粉、乳糖、纖維素等。任選成分例如是著色劑、甜味劑等。
本發明的化合物、其衍生物或藥用鹽可以製成任何一種適合於臨床上應用的劑型，包括固體製劑，如膠囊、片劑、顆粒製劑等，液體製劑如口服液等，或者注射劑。本發明化合物、其衍生物或藥用鹽的日劑量例如可以是5-50mg/kg體重，可以分一次或多次使用。
該化合物可以從中藥何首烏中提取。該化合物可以用何首烏根通過普通高壓液相色譜法製備。例如在LIQ.CHROM.TECHNOL.，21(18)，2897-2904(1998)(Xueli Cao等人)中公開了它的製備方法。上式化合物可以進行衍生化，例如用酸，使上述結構式的化合物上的3-、5-和4』-位上的羥基的氫被醯基，如乙醯基、丙醯基、丁醯基等所取代，或與滷代烴反應，使3-、5-和4』-位上的羥基的氫用烴基取代，如用C1-6烴基取代。上式化合物也可以其藥學可接受的鹽的形式使用。
實施例1 二苯乙烯甙(TSG)提高雙側頸總動脈夾閉致腦缺血沙土鼠模型學習記憶能力1.實驗目的急性全腦缺血可造成神經元功能減退，包括膽鹼能神經，導致學習記憶功能降低。本實驗旨在觀察TSG對雙側頸總動脈夾閉致腦缺血沙土鼠模型學習記憶能力降低的影響。(注沙土鼠天生缺如椎動脈系統，雙側頸總動脈夾閉可造成嚴重全腦缺血)2.實驗方法沙土鼠連續灌胃給TSG 7天。.第7天後行雙側頸總動脈夾閉10分鐘，再灌注5天後進行Morris水迷宮實驗，檢測其學習記憶能力。
Morris水迷宮測定主要由由圓形水池和自動錄象及分析系統兩部分組成。實驗當天各組給藥60分鐘後，每隻動物第一天訓練4次，入池位置為站臺所隊象限及所鄰象限，於象限邊1/2弧度處將動物頭朝池壁入水，120S未找到站臺者，將其引致站臺，放置30S引導其學習與記憶。第2、3和4天重複測試，數據採集和處理均由有圖像自動監視和處理系統完成。
3.實驗結果TSG給藥組水迷宮遊出時間和遊泳距離與模型組相比明顯縮短(表1)，表明該藥能提高腦缺血沙土鼠學習記憶能力。
表1. TSG對腦缺血再灌注沙土鼠Morris水迷宮遊出時間和距離的影響組別N遊出時間(秒) 遊泳距離(釐米)對照組(假手術組)518.28±15.38*377.4±354.7*模型組(缺血再灌)436.45±36.91 687.5±610.3TSG 38mg/kg+缺血再灌337.10±41.11 593.5±41.1TSG 114mg/kg+缺血再灌 525.57±22.75 508.6±422.6TSG 342mg/kg+缺血再灌 412.04±9.89**311.4±319.6*M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，與缺血模型組比較。實施例2 TSG減低急性腦缺血再灌注小鼠腦含水量1.實驗目的急性全腦缺血再灌注導致神經細胞缺氧，能量代謝不足，離子通道開放等，進一步引起腦水腫，可產生嚴重的後果。本實驗旨在觀察TSG對急性腦缺血再灌注小鼠腦含水量增高的影響。
2.實驗方法雄性昆明小鼠，體重22-28克，動物隨機分組，實驗前各組連續灌胃給藥7天，假手術組及缺血模型組分別給予自來水。手術當日小鼠空腹給藥後1小時，麻醉後，用動脈夾夾閉雙側頸總動脈15分鐘，再灌注15分鐘後迅速斷頭取腦，去掉小腦，採用幹—溼重方法計算腦水分含量，將分離的腦組織立即在分析天平稱取溼腦重量，然後放入恆溫乾燥箱(110C±2)24小時烘乾至恆重，稱取幹腦重量，根據溼腦重量和幹腦重量差，計算出腦標本水分含水量值。
計算公式腦水分％＝(腦溼重量-幹腦重量)/溼腦重量*100％3.實驗結果TSG灌胃給藥可降低急性腦缺血再灌注小鼠腦含水量(表2)，表明該藥有利於防治腦缺血所致的腦水腫。
表2. TSG對急性腦缺血再灌注小鼠腦含水量的影響組別N腦含水量(％)對照組(假手術組)90.7796±0.0134*模型組(缺血再灌)90.7899±0.0041海得琴0.75mg/kg+缺血再灌10 0.7838±0.0116TSG 38mg/kg+缺血再灌10 0.7833±0.0119TSG 114mg/kg+缺血再灌 10 0.7801±0.0130*TSG 342mg/kg+缺血再灌 10 0.7830±0.0134M±SD；*P＜0.05，與缺血模型組比較實施例3 TSG抑制腦缺血再灌注小鼠模型腦組織脂質過氧化1.實驗目的腦缺血後產生脂質過氧化增高，過氧化脂質增多。過氧化脂質是生物膜和細胞中磷質所含多元不飽和脂肪酸被自由基損傷、氧化而成的過氧化產物。它可引起膜損傷、酶抑制、溶酶體釋放、蛋白交聯、DNA和RNA結構破壞等生化毒性，最終可導致細胞死亡。本實驗旨在觀察TSG對腦缺血再灌注小鼠模型腦組織脂質過氧化代謝產物丙二醛(MDA)含量增高的影響。
2.實驗方法雄性昆明小鼠，體重22-28克，動物隨機分組，實驗前各組連續灌胃給藥7天，假手術組及缺血模型組分別給予自來水。手術當日空腹給藥後1h，於小鼠麻醉後，用動脈夾夾閉雙側頸總動脈15分鐘，再灌注15分鐘後迅速斷頭取腦，去掉小腦。腦組織稱重，1∶10加入0.2M磷酸鹽緩衝液勻漿，3000轉/分離心10分鐘，取上清0.5ml，用硫代巴比妥酸(TAB)法測定腦組織中MDA含量。
3.實驗結果TSG灌服可降低急性腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量(表3)，表明該藥可抑制脂質過氧化，其機理可能為減少自由基生成或增強自由基清除。
表3. TSG對急性腦缺血再灌注小鼠腦組織MDA含量的影響組別N MDA(nmol/mg蛋白)對照組(假手術組)101.093±0.151*模型組(缺血再灌)9 1.180±0.190海得琴0.75mg/kg+缺血再灌101.111±0.116TSG 38mg/kg+缺血再灌101.158±0.150TSG 114mg/kg+缺血再灌 101.002±0.147**TSG 342mg/kg+缺血再灌 101.030±0.131**M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01與缺血模型組比較實施例4 TSG增強腦缺血再灌注小鼠模型腦組織超氧化物歧化酶活性1.實驗目的超氧化物歧化酶(SOD)對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基(O-2)，保護細胞免受損傷。本實驗旨在觀察TSG對腦缺血再灌注小鼠模型腦組織SOD活性降低的影響，探討TSG抑制腦缺血小鼠模型脂質過氧化的機理。
2.實驗方法雄性昆明小鼠，體重22-28克，動物隨機分組，實驗前各組連續灌胃給藥7天，假手術組及缺血模型組分別給予自來水。手術當日空腹給藥後1h，於小鼠麻醉後，用動脈夾夾閉雙側頸總動脈15分鐘，再灌注15分鐘後迅速斷頭取腦，去掉小腦。腦組織稱重，1∶10加入0.2M磷酸鹽緩衝液勻漿，3000轉/分離心10分鐘，取上清0.1ml，用亞硝酸鹽法測定腦組織中SOD活性。
3.實驗結果TSG灌胃口服可增高急性腦缺血再灌注小鼠腦組織SOD活性(表4)，表明該藥具有增強機體清除自由基的作用，這可能是其抑制脂質過氧化的機理。
表4. TSG對急性腦缺血再灌注小鼠腦組織SOD活性的影響組別N SOD(NU/mg蛋白)對照組(假手術組)105.219±0.051*模型組(缺血再灌)9 4.913±0.051海得琴0.75mg/kg+缺血再灌104.779±0.034TSG 38mg/kg+缺血再灌105.152±0.049TSG 114mg/kg+缺血再灌 105.111±0.074TSG 342mg/kg+缺血再灌 105.317±0.060**M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，與缺血模型組比較實施例5 TSG減低腦缺血再灌注小鼠模型腦片細胞內鈣離子濃度
1.實驗目的腦缺血再灌注後，出現神經細胞內鈣離子濃度升高，導致隨後的鈣超載、氧應激等損傷，最終可導致細胞死亡。本實驗旨在觀察TSG對腦缺血再灌注小鼠模型腦片細胞內鈣離子濃度增高的影響。
2.實驗方法雄性昆明小鼠，體重22-28克，動物隨機分組，實驗前各組連續灌胃給藥7天，假手術組及缺血模型組分別給予自來水。手術當日空腹給藥後1h，於小鼠麻醉後，用動脈夾夾閉雙側頸總動脈15分鐘，再灌注15分鐘後迅速斷頭取出全腦，放入通有95％的CO2和5％O2的預冷的人工腦脊液中，在振動切片機上切出400um的腦片，放入CO2培養箱中，37℃孵育30min，加入5uM的Fluo-3AM 500ul，在CO2培養箱中負載1h後，衝洗數次，在雷射掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)上進行光學切片，觀察螢光強度。
光學切片(光切)是雷射掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)的特色之一，可以實現對離體活腦片進行連續無損切割，又稱為「顯微CT」，光切可以獲得樣品表面的和深層的信息，通過三維重建技術，可以獲得三維圖象和立體結構信息。鈣螢光指示劑Fluo-3AM是一種脂溶性試劑，本身無螢光，穿過細胞膜後，在膜內酶的作用下，脫去酯基(AM)，與胞內游離鈣結合後，出現螢光，利用雷射掃描共聚焦顯微鏡測定螢光強度可以檢測細胞內游離鈣的水平。
圖象處理利用LaserSharp圖象處理系統，測定左右海馬區、皮層區的面積或體積和總的螢光強度，以單位面積或單位體積螢光強度及螢光強度分布中值(即Mean，系統給出)為指標，觀察海馬、皮層的細胞內游離鈣的水平。
統計方法實驗數據均採用均值±標準差(x±s)表示，組間差異的顯著性用t檢驗。
3.實驗結果TSG灌胃口服可降低腦缺血再灌注小鼠模型大腦皮層和海馬區神經細胞內鈣離子濃度(表5)，這對於保護神經細胞具有重要意義。
表5. TSG對腦缺血再灌注小鼠模型神經細胞內鈣離子的影響組別 N 細胞內鈣離子螢光值皮層(Pix/um2)海馬(Pix/um2)對照(假手術組) 3 0.6039±0.6350* 0.4718±0.4104*模型(缺血再灌組) 3 1.0439±0.26360.8385±0.2849海得琴0.75mg/kg+缺血再灌 3 0.3719±0.1379* 0.4406±0.2073*TSG 38mg/kg+缺血再灌 3 0.4476±0.1095** 0.4371±0.1013*TSG 114mg/kg+缺血再灌3 0.4735±0.2651** 0.6536±0.3179TSG 342mg/kg+缺血再灌3 0.5927±0.3140* 0.6607±0.3926M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較實施例6 TSG減低光化學誘導急性腦梗塞小鼠模型腦血管損傷1.實驗目的造模原理將光敏物質(玫瑰紅)注入小鼠尾靜脈，以560nm波長的冷光源照射小鼠顱部，發生光化學反應，生成大量氧自由基，引起血管內皮細胞損傷，血小板聚集，在照射區內形成血栓，局部皮層缺血壞死。
本實驗旨在觀察TSG對光化學誘導急性腦梗塞小鼠模型腦血管損傷及缺血半暗區的影響。
2.實驗方法給小鼠灌服不同劑量TSG，15天後造模。將光敏物質(玫瑰紅)注入小鼠尾靜脈，以560nm波長的冷光源照射小鼠顱部。在造模後3小時經舌靜脈注入伊文斯蘭染料，1小時後處死動物。處死後取腦組織製成勻漿，並以比色法測定平均腦組織的光密度。梗塞嚴重者，染色深，光密度大，缺血半暗區面積大。
3.實驗結果實驗發現灌服TSG可降低模型小鼠腦組織伊文斯蘭的光密度，表明減輕了腦血管損傷和腦梗塞程度；TSG可減少模型小鼠缺血半暗區的面積(見表6)。
表6. TSG對光化學誘導腦梗塞小鼠模型的影響組別 n伊文斯蘭(OD值)缺血半暗帶面積模型組60.1333±0.0759++++海得琴(1mg/kg)70.1121±0.0441* +TSG(33mg/kg) 60.1067±0.0452* ++TSG(100mg/kg) 90.1039±0.0843* +TSG(300mg/kg) 70.0805±0.0385* +M±SD；*p＜0.05，與模型組相比缺血半暗帶+，++，+++，++++代表面積依次由小到大。實施例7 化合物的製備在超聲破碎下，何首烏根的乾燥粉末用氯仿萃取三次，除去蒽醌，然後殘留物以類似方式用乙醇萃取3次。合併乙醇萃取物並濃縮乾燥。乾燥的萃取物溶解在HSCCC(高速逆流液相色譜法)分離的流動相中。HSCCC用北京新技術應用研究所製造的GS10A2多層盤旋行星式離心機進行。
在各分離中，盤旋柱首先完全填充上層有機固定相。然後儀器在800rpm下旋轉，同時下層含水流動相泵入到柱中。在流動相前面出現和體系建立穩定狀態的流體動力平衡之後，樣品溶液經注射閥注入。來自柱的出口的流出物用在254nm的UV檢測器連續監控。峰級分根據色譜圖收集，產物純度為96％。
上述化合物125mg，乳糖80mg，羧甲基澱粉40mg和硬脂酸鎂5mg，按常規方法壓片製成片劑。
權利要求
1.下式的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽在製備治療缺血性腦血管疾病的藥物中的用途 其中R為-O-β-D-葡萄糖。
2.權利要求1的用途，其中所述缺血性腦血管疾病是腦血栓。
3.權利要求1的用途，其中所述缺血性腦血管疾病是腦梗死。
4.權利要求1的用途，其中所述缺血性腦血管疾病是短暫性腦缺血發作。
5.權利要求1的用途，其中所述缺血性腦血管疾病是腦栓塞。
6.權利要求1的用途，其中所述缺血性腦血管疾病是腦供血不足。
7.一種治療缺血性腦血管疾病的藥物組合物，其特徵在於含有權利要求1的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽的組合物。
8.根據權利要求7的藥物組合物，它可以是固體製劑，如片劑、膠囊、顆粒製劑，液體製劑如口服液，或者注射劑。
9.根據權利要求7的組合物，其中所述缺血性腦血管疾病是腦血栓、腦梗死、腦栓塞、短暫性腦缺血發作或腦供血不足。
10.權利要求1的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽在製備腦保護劑中的應用。
11.權利要求1的二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽在製備抗氧化劑或鈣拮抗劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及二苯乙烯甙化合物、其衍生物或藥用鹽在製備治療缺血性腦血管疾病的藥物中的用途。經動物試驗證實,二苯乙烯甙化合物能夠減低急性腦缺血再灌注小鼠腦含水量,抑制腦缺血再灌注小鼠模型腦組織脂質過氧化,增強腦缺血再灌注小鼠模型腦組織超氧化物歧化酶活性,減低腦缺血再灌注小鼠模型腦片細胞內鈣離子濃度,減低光化學誘導急性腦梗塞小鼠模型腦血管損傷,以及提高雙側頸總動脈夾閉致腦缺血沙土鼠模型學習記憶能力。
文檔編號A61K31/7034GK1347698SQ0113428
公開日2002年5月8日 申請日期2001年10月30日 優先權日2001年10月30日
發明者李林 申請人:首都醫科大學宣武醫院