用於以核酸為模板的合成中的游離反應物的製作方法

2023-04-25 21:03:11 3

專利名稱:用於以核酸為模板的合成中的游離反應物的製作方法
用於以核酸為模板的合成中的游離反應物
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本申請要求提交於2005年I月21日的美國專利申請序列號No. 60/646，584的優先權和權益，該公開的全文通過引用併入本文。
政府基金
本申請中描述的研究部分受the Office of Naval Research (合同號No. N00014-03-1-0749)和NIH/NIGMS(補助R01GM065865)的資助。美國政府可能具有本發明的某些權利。發明領域
一般而言，本發明涉及用於進行以核酸為模板的合成的方法和組合物。更具體地，本發明涉及下述方法和組合物，其用於開展以核酸為模板的合成，以生產反應中間產物，反應中間產物然後可使用游離反應物被化學轉化為反應產物，所述游離反應物與反應中間產物反應，產生反應產物。
_7]發明背景
以核酸為模板的有機合成使得可採用在傳統合成方式中不可能的反應活性控制模式，並且允許使用以前僅可被生物大分子使用的翻譯、選擇和擴增方法對合成分子加以操作(Gartner et al. (2001) J. AM. CHEM. S0C. 123 :6961-3 ；Gartner et al. (2002)ANGEff. CHEM.，INT. ED. ENGL. 123 :61796-1800 ；Gartner et al. (2002) J. AM. CHEM. Soc. 124 10304-6 ；Calderoneetal. (2002)ANGEff. CHEM.，INT.ED. ENGL. 41 :4104-8 ；Gartner etal. (2003) ANGEff. CHEM.，INT. ED. ENGL. 42 :1370-5 ；Li et al. (2004) J. AM. CHEM. SOC. 124 5090-2 ；Kanan et al (2004)NATURE431:545-9 ； (artneret al. (2004)SCIENCE305 :1601-5 ；Li et al. (2004) ANGEff. CHEM. INT. ED. 43 :4848-70 ；Brenner et al. (1992) PROC. NATL.ACAD. SCI. USA89 :5181 ；Doyon et al. (2003) J. AM. CHEM. SOC. 125 :12372-3 ；Halpin etal (2004)PLoS BIOL. 2 el74)。可通過以核酸為模板合成(特別地，以DNA為模板的有機合成，或DTS)得到的結構已基本被限制為由兩個與核酸連接的反應物之間的偶聯反應的產物。但是，在一些情況下，難於或不可能將反應物與寡核苷酸聯結。因此，對能使不與寡核苷酸連接的小分子試劑以序列程序化或序列記錄的方式反應的策略的開發，將顯著擴大以核酸為模板的合成的合成能力。

發明內容
本發明提供了方法和組合物，用於擴大以核酸為模板的有機合成的範圍，這通過解決對與寡核苷酸聯結(tether)的試劑的需要來實現。在試劑與核酸(例如DNA)的連接是不可能或不方便的情況下，這些轉化仍允許此類試劑作用於小分子合成，並同時保持核酸序列與產物結構之間的對應性。此外，通過從偶聯反應去偶聯核酸模板的步驟，該手段允許在不一定支持核酸雜交的條件下發生鍵的形成。
在ー個方面，本發明提供了ー種合成反應產物的方法。該方法包含如下步驟(a)提供ー種混合物，其包含第一反應單元和第二反應單元，所述混合物在允許第一和第二反應單元之間發生反應的條件下提供，以形成反應中間產物；(b)提供寡核苷酸，其包含與反應中間產物附著(attach)的鑑定序列(identifying sequence);以及(C)將反應中間產物與能選擇性地與反應中間產物反應的游離反應物混合，由此產生與鑑定序列相連的反應產物。在此方法中，游離反應物與反應中間產物的反應活性較之游離反應物與起始混合物中的任何反應單元的反應活性更高。
在另ー個方面，本發明提供了ー種合成反應產物的方法，這通過例如美國專利申請序列號10/643，752 (其以US2004/0180412的美國專利申請公開號公開)所述的以核酸為模板的合成來進行。該方法包括如下步驟(a)提供ー種混合物，其包含(i)與包含密碼子序列的第一寡核苷酸附著的第一反應單元和(ii)與包含與所述密碼子序列互補的反密碼子序列的第二寡核苷酸附著的第二反應單元；(b)將第一寡核苷酸的密碼子序列與第二寡核苷酸的反密碼子序列退火，誘發第一和第二反應單元之間的反應，以形成至少與第一寡核苷酸附著的反應中間產物；以及(c)將反應中間產物與能選擇性地與反應中間產物反應的游離反應物混合，由此合成仍與第一寡核苷酸序列附著的反應產物。優選地，游離反應物與反應中間產物的反應活性比游離反應物與起始混合物中反應單元中的至少ー種的反應活性更高。
類似地，在多種不同的第一反應單元(以及可選地，第二反應單元)存在於初始反應混合物中時，在某些反應條件下，可能可以產生多種不同的反應中間產物。因此，對於游離反應物來說，選擇性地僅與混合物中ー種特定類型的反應中間產物反應可能是有利的。或者，對於游離反應物來說，選擇性地與ー組或ー亞組反應中間產物反應可能是有利的，其中，所述反應中間產物具有有特定化學功能性的官能團。例如，游離反應物可能選擇性地與含有游離胺的反應中間產物發生反應，而不與缺少游離胺的其它反應中間產物反應。
此外，通過知曉密碼子和/或反密碼子序列，可以確定何種第二反應單元與第一反應單元反應，以產生反應中間產物和/或反應產物。此外，如果第一寡核苷酸提供了針對與第一寡核苷酸附著的第一反應單元的序列鑑定物(identifier)，那麼可以確定何種第一反應單元與第二反應單元反應，以產生反應中間產物和/或反應產物。基於反應條件，含有反應中間產物的反應混合物中存在的反應物，以及關於某些游離反應物何時添加進含有反應中間產物的混合物的信息，可以確定何種游離反應物與反應中間產物反應，以產生特定的反應產物。該信息可用於鑑定反應產物以及製造反應產物的反應途徑。
將參照下述附圖、詳述、實施例和權利要求
來進ー步理解本發明的前述方面和特徵。
定義
本文中使用的術語「密碼子」和「反密碼子」指分別在模板和轉移單元中的互補寡核苷酸序列，其允許轉移単元在以核酸為模板的合成期間退火到模板上。
本文中使用的術語「游離反應物」指不與能參與以核酸為模板的合成的寡核苷酸相連的化學試劑或化學基元(moiety)。相比之下，第一和第二反應單元和轉移單元與能參與以核酸為模板的合成的寡核苷酸相附著。
本文中使用的術語「寡核苷酸」或「核酸」指核苷酸的聚合物。聚合物可包括但不限於天然核苷(例如，腺嘌呤核苷、胸腺嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核 苷、脫氧腺嘌呤核苷、脫氧胸腺嘧啶核苷、脫氧鳥嘌呤核苷以及脫氧胞嘧啶核苷)、核苷類似物(例如，2-氨基腺嘌呤核苷、2-硫代胸腺嘧啶核苷、次黃苷、吡咯並嘧啶、2-甲基腺嘌呤核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、C5-溴尿嘧啶核苷、C5-氟尿嘧啶核苷、C5-碘尿嘧啶核苷、C5-丙炔基-尿嘧啶核苷、C5-丙炔基-胞嘧啶核苷、C5-甲基胞嘧啶核苷、7-脫氮腺嘌呤核苷、7-脫氮鳥嘌呤核苷、8-羥腺嘌呤核苷、8-羥鳥嘌呤核苷、0(6)-甲基鳥嘌呤和2-硫代胞嘧啶核苷)、經化學修飾的鹼基、經生物修飾的鹼基(例如，甲基化鹼基)、嵌入鹼基(intercalatcdbase)、經修飾的糖(例如,2』 -氟核糖、核糖、2』 _脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖)或者經修飾的磷酸基團(例如，硫代磷酸酯和5』 -N-亞磷醯胺連接)。核酸和寡核苷酸還可包括具有經修飾的主鏈的鹼基的其它聚合物，例如鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、蘇糖核酸(TM)以及能用作模板用於使用擴增技術(例如聚合酶鏈式反應、連接酶鏈式反應或非酶促模板定點複製)的擴增反應的任何其它聚合物。
本文中使用的術語「反應單元」指下述化學試劑或化學基元(包括例如但不限於，構造塊(building block)、單體、單體單元、小分子骨架(scaffold)或者可用於以核酸 為模板的化學合成的其它反應物)，其能與另ー種化學試劑或化學基元一起參與化學反應以產生反應中間產物和/或反應產物。
本文中使用的術語「反應中間產物」指下述化學試劑或化學基元，其能被游離反應物化學轉化為不同的試劑或化學基元。
本文中使用的術語「小分子」指在實驗室合成或在自然界發現的、具有小於每摩爾10000克，可選地，小於每摩爾5000克，以及可選地，小於每摩爾2000克的有機化合物。
本文中使用的術語「小分子骨架」指具有適合用於官能化(functionalization)的至少ー個位點或化學基元的化學化合物。小分子骨架或分子骨架可能具有適合用於官能化的兩個、三個、四個、五個或更多個位點或化學基元。這些官能化位點可被保護或被掩蔽，這是本領域技術人員已知的。位點還可被發現於基礎環狀結構或主鏈上。小分子骨架並非核酸、核苷酸或核苷酸類似物。
本文中使用的術語「轉移單元」指包含下述寡核苷酸的分子，所述寡核苷酸具有與反應單元附著的反密碼子序列,所述反應單元包括,例如但不限於,構造塊、單體、單體單元、小分子骨架或者可用於以核酸為模板的化學合成的其它反應物。
本文中使用的術語「模板」指包含下述寡核苷酸的分子，所述寡核苷酸具有適合用於以核酸為模板的化學合成的至少一條密碼子序列。可選地，模板可以包含(i)多條密碼子序列，( )擴增設施，例如，PCR引物結合位點或與其互補的序列，(iii)與其相聯的反應單元，(iv)⑴和(ii)的組合，(V)⑴和(iii)的組合，(vi) (ii)和(iii)的組合,或者(i)、(ii)和(iii)的組合。
在說明書全文中，在組合物被描述為具有、包括或包含特定的多個組分的情況下，或者方法被描述為具有、包括或包含特定的多個エ藝步驟的情況下，則認為，本發明的組合物基本上由，或由提到的組分構成，以及，本發明的方法也基本上由，或由提到的エ藝步驟構成。此外，應當理解，用於進行某動作(action)的順序或步驟順序是不重要的，只要本發明保持可操作即可。此外，除非有相反指明，可同時進行兩個或多個步驟或動作。


圖I是本發明的一方面的示意性圖示，其中，第一反應單元(FRU)與第二反應單元(SRU)反應，形成反應中間產物(RI)。反應中間產物(RI)與鑑定序列(IS)附著。RI-IS複合體與游離反應物(FR)混合,該游離反應物(RU)選擇性地與RI反應,產生與IS相連的反應產物(RP)。
圖2是本發明ー個方面的示意性圖示，其中，在反應中間產物(RI)形成之前，第一反應單元(FRU)和第二反應單元(SRU)分別與密碼子序列(CS)和互補的反密碼子序列(ACS)連接。CS和ACS互相退火，以允許FRU和SRU互相反應，產生RI。CS保持與RI相連。當RI已與游離反應物(FR)反應時，CS保持與反應產物(RP)的附著。
圖3是對圖I所示方案的一種實施方式的示意性圖示，其中，多種第一反應單元(FRU1-FRU4)的混合物中，第一反應單元中的至少ー種(FRU1)與第二反應單元(SRU1)反應，形成反應中間產物(RI1),其與多種第一反應單元(FRU2-FRU4)共同存在。反應中間產物(RI1)與鑑定序列(IS)相連。然後，令與IS相連並與多種第一反應單元(FRU2-FRU4)共同 存在的反應中間產物(RI1)與游離反應物(FR)反應，游離反應物選擇性地與RI1反應，產生與IS相連的反應產物(RP1)。
圖4是圖2所示的方案的一種實施方式的示意性圖示，其中，在反應中間產物(RI1)形成之前，第一反應單元(FRU1-FRU4)和第二反應單元(SRU)分別與密碼子序列(CS)和互補的反密碼子序列(ACS)連接。CS保持與RI1相連。當RI1已與游離反應物(FR)反應產生RP1吋，CS保持與反應產物(RP1)的附著。
圖5A描述了通過以DNA為模板的方式將疊氮化物轉化為ー級胺(最上面的方案)、羧酸(中間的方案)和硫醇(底下的方案)的過程。圖5B描述了使用底物疊氮化物1-12進行的示例性的以DNA為模板的反應，其中，列出的產率代表下限。
圖6A是在來自圖5B的疊氮化物3經過以DNA為模板的從疊氮化物向胺的轉化之後，變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)凝膠的示意圖。道I含有連接疊氮化物的30體模板。道2含有連接疊氮化物的30體模板+連接羧酸的20體捕獲試劑(capture reagent)+30mMEDC+15mM硫-NHS (顯示沒有產物形成)。道3含有連接疊氮化物的30體模板+連接膦的10體試劑(10體不可見)。道4含有連接疊氮化物的30體模板+連接膦的10體試劑+連接羧酸的20體捕獲試劑+30mM EDC+15mM硫-NHS，從疊氮化物到胺的轉化之後進行以DNA為模板的胺醯化反應產生的50體次級產物是可見的。道5含有連接疊氮化物的30體模板+連接膦的10體試劑(含有錯配序列)+連接羧酸的20體捕獲試劑+30mM EDC+15mM硫-NHS。道6含有連接疊氮化物的30體模板+5mM TCEP-HCl+連接羧酸的20體捕獲試劑+30mM EDC+15mM硫-NHS (陽性對照，其中疊氮化物被TCEP原位還原)。看起來，在電泳開始時30體模板和20體捕獲反應物之間的雙體的不完全變性導致了模糊的條帶(道2和4-6)。
圖6B是在來自圖5B的疊氮化物7經過以DNA為模板的從疊氮化物向胺的轉化之後，變性PAGE凝膠的示意圖。道I含有連接疊氮化物的30體模板+連接醛的20體捕獲試劑+3mM NaBH3CN0道2含有連接疊氮化物的30體模板+連接膦的10體試劑+連接醛的20體捕獲試劑+3mMNaBH3CN。道3含有連接疊氮化物的30體模板+連接膦的10體試劑(含有錯配序列)+連接醛的20體捕獲試劑+3mM NaBH3CN0在道I和道3中觀察到了少量的50體捕獲產物的形成，這是在連接底物的模板製備期間和以DNA為模板的反應期間苯基疊氮化物緩慢自發還原產生的。減去道I和道3中觀察到的背景反應活性(〈13%)，以測定道2的報導產率。
圖6C是在來自圖5B的疊氮化物8經過以DNA為模板的從疊氮化物向羧酸的轉化之後，變性PAGE凝膠的示意圖。道I含有連接疊氮化物的30體模板+連接胺的20體捕獲試劑+30mM EDC+15mM硫-NHS。道2含有連接疊氮化物的30體模板+連接膦的10體試劑+連接胺的20體捕獲試劑+30mM EDC+15mM硫-NHS。道3含有連接疊氮化物的30體模板+連接膦的10體試劑(含有錯配序列)+連接胺的20體捕獲試劑+30mM EDC+15mM硫-NHS。
圖6D是在來自圖5B的疊氮化物11經過以DNA為模板的從疊氮化物向硫醇的轉化之後，變性PAGE凝膠的示意圖，其中使用10%的聚丙烯醯胺凝膠。道I含有連接疊氮化物的30體模板+連接烷基溴的20體捕獲試劑。道2含有連接疊氮化物的30體模板+連接膦的10體試劑+連接烷基溴的20體捕獲試劑。道3含有連接疊氮化物的30體模板+連接膦的10體試劑(含有錯配序列)+連接烷基溴的20體捕獲試劑。
圖7是來自以DNA為模板的官能團轉化的代表性MALDI-T0F譜(在該情況下，是來自疊氮化物I的胺產物)。
圖8描述了含有四種疊氮化物的單種溶液與四種未連接DNA的小分子親電試劑的反應，所述反應生成四種序列程序化的磺胺、氨基甲酸酷、尿素和硫脲產物。模板13與具有密碼子序列a的寡核苷酸附著。含有三苯基膦的轉移單元17與具有反密碼子序列a』的寡核苷酸附著。在模板化合成期間，密碼子序列a退火到反密碼子序列a』上。類似地，模板
14、15和16分別含有密碼子序列b、c和d，它們分別通過反密碼子序列b』、c』和d』退火到轉移單元18、19和20上。
圖9是示出了圖8所用的起始試劑和生成的反應產物的示意圖。
圖IOA到圖IOD是在對連接胺的模板和小分子試劑的反應進行IIPLC分析之後的HPLC痕跡圖(在260nm監測的)。SM代表未反應的起始材料，連接胺的模板，的峰。PRD代表經衍生的產物。如無特別指明，除標記為SM或PRD之外的峰不對應於連接DNA的物質(通過在230nm的UV吸收和MALDI-T0F分析判斷的)。圖IOA示出了連接胺的模板13與丹磺醯氯21(圖8中的試劑13和21)的反應結果。圖IOB示出了連接胺的模板14與氯甲酸こ酯22(圖8中的試劑14和22)的反應結果。圖IOC示出了連接胺的模板15與4-甲氧基苯基異氰酸酯23(圖8中的試劑15和23)的反應結果。圖IOD示出了連接胺的模板16與6-嗎啉代吡啶基3-甲氧基苯基異氰酸酯24(圖8中的試劑16和24)的反應結果。
圖IlA示出了ー種溶液中四種疊氮化物起始材料(圖8中的試劑13-16)的MALDI-T0F譜。圖IlB示出了疊氮化物起始材料13-16的四種序列特異性轉化產物(圖8中的產物25-28)的MALDI-T0F譜。
發明詳述
本發明可用於合成分子(例如小分子)的文庫(library)。本文所述的官能團轉化特別有用於擴大以核酸為模板的有機合成的範圍，這通過解決對與寡核苷酸聯結的試劑的需要來實現。在試劑與寡核苷酸的連接是不可能或不方便的情況下，這些轉化仍允許此類試劑作用於小分子合成，並同時保持核酸序列與產物結構之間的對應性。
在ー個方面，本發明提供了ー種合成反應產物的方法。該方法包含如下步驟(a)提供ー種混合物，其包含第一反應單元和第二反應單元，所述混合物在允許第一和第二反應單元之間發生反應的條件下提供，以形成反應中間產物；(b)提供寡核苷酸，其包含與反應中間產物附著的鑑定序列；以及(C)將反應中間產物與能選擇性地與反應中間產物反應的游離反應物混合，由此產生與鑑定序列相連的反應產物。在此方法中，游離反應物與反應中間產物的反應活性較之游離反應物與起始混合物中的任何反應單元的反應活性更高。
該手段示意性示於圖I中。簡言之，第一反應單元(FRU)與相異的第二反應單元(SRU)反應，產生反應中間產物(RI)。RI與鑑定序列(IS)附著，優選地，共價附著。IS可以是寡核苷酸(例如，DNA或其衍生物，RNA或其衍生物)。然後RI-IS複合體與游離反應物(FR)在允許FR將RI化學轉化為反應產物(RP)的條件下混合。RP仍與IS相連，這可用於對RP以及RP的合成歷史加以鑑定。
在ー種手段中，在產生RI的反應之前，IS，例如，限定了特定密碼子序列或反密碼子序列的核酸序列與FRU相連。在反應之後IS保持與RI相連，從而提供與RI相連的IS。 在產生RP之後，IS保持與RP相連，使得可以對RP及其合成歷史加以鑑定。應當考慮，SRU還可能與互補於IS的序列相連。結果，在步驟(a)中，IS與互補於IS的序列雜交，從而使FRU和SRU進入反應鄰近狀態(reactive proximity)。
在另ー種手段中，在通過FRU和SRU之間的反應形成RI之後，IS，例如，限定了特定密碼子序列或反密碼子序列的核酸序列與RI相連。然後可通過FR將RI化學轉化為RP。IS保持與RP相連。RI形成後，可通過酶促方式，例如通過聚合酶或連接酶，將IS與RI相連。
在一種實施方式中，FR與RI的反應活性是FR與起始混合物中的其它反應中間產物或反應單元中的至少ー種以及可選地全部的反應活性的至少五倍。此外，取決於反應物和反應條件，在其它實施方式中，RF與RI的反應活性是RF與起始混合物中其它反應中間產物或反應單元中的至少ー種以及可選地全部的反應活性的至少10倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，至少500倍，或者至少1000倍。此外，取決於反應物和反應條件，以高於或等於50 %，高於或等於75 %，高於或等於85 %，或高於或等於98 %的產率合成RP。
可以實驗測定FR對RI的反應活性(相對於起始材料FRU和SRU而言)。可以測定在標準反應條件下FR和RI混合產生的產物的量。可以測定在同樣的反應條件下，FR和FRU或SRU以等摩爾混合所產生的產物的量。可以通過化學領域的標準技術來測定產物的產率。基於每種反應中產生的產物的相對量，可以測定FR是否比FRU或SRU更具反應活性，以及如果是的話，反應活性大多少。類似的手段可用於測定游離反應物與一種反應中間產物的反應活性是否比其與其它不同的反應中間產物的反應活性更高。
在另ー個方面，本發明提供了ー種合成反應產物的方法，該方法通過以核酸為模板的合成來實現，例如，美國專利申請公開號US2004/0180412所述的合成。該方法包括如下步驟(a)提供ー種混合物，其包含(i)與包含密碼子序列的第一寡核苷酸附著的第一反應單元和(ii)與包含與所述密碼子序列互補的反密碼子序列的第二寡核苷酸附著的第二反應單元，其中，所述反密碼子序列是第二反應單元的指示物；(b)將第一寡核苷酸的密碼子序列與第二寡核苷酸的反密碼子序列退火，誘發第一和第二反應單元之間的反應，以形成至少與第一寡核苷酸附著的反應中間產物；以及(c)將反應中間產物與能選擇性地與反應中間產物反應的游離反應物混合，由此合成與第一寡核苷酸序列附著的反應產物。優選地，游離反應物與反應中間產物的反應活性比游離反應物與起始混合物中其它中間產物或反應單元中的至少ー種以及可選地全部的反應活性更高。[0049]該手段示意性示於圖2中，其中，第一反應單元(FRU)與包含密碼子序列(CS)的第一寡核苷酸附著，例如，共價附著。第一反應單元和寡核苷酸的組合可稱為模板。密碼子序列可鑑定FRU，例如，如IS。或者，CS可還包含能鑑定FRU的単獨的鑑定序列(IS)。在後ー情況下，CS可鑑定與FRU反應產生反應中間產物的第二反應單元(SRU)，IS可鑑定FRU。
在此方法中，SRU與第二寡核苷酸附著，例如，共價附著，第二寡核苷酸含有與CS互補的反密碼子序列(ACS)。第二反應單元與反密碼子序列的組合被稱為轉移単元。當在合適的反應條件下混合模板和轉移單元吋，CS和ACS互相退火，使得FRU和SRU進入反應鄰近狀態。然後FRU和SRU互相反應，例如通過鄰近狀態催化來進行，產生仍與CS相連的RL·當與游離反應物(FR)混合吋，RI被FR化學轉化為仍與CS相連的反應產物(RP)。假設附著到RP上的寡核苷酸含有CS，那麼可以確定何種SRU參與對RI和/或RP的合成。類似地，如果附著到RP上的寡核苷酸含有IS，那麼可以確定何種FRU參與對RI和/或RP的合成。因此，該信息可用於確定RI和/或RP的身份以及合成歷史。
此外，可考慮，FRU可以是小分子骨架，其可在以核酸為模板的合成期間使用，以產 生小分子。特別地，小分子骨架可用作為核心，在其上裝配小分子的取代基。
在一種實施方式中，FR與RI的反應活性是FR與起始混合物中其它反應中間產物或反應單元中至少ー種以及可選地全部的反應活性的至少五倍。此外，取決於反應物和反應條件，在其它實施方式中，FR與RI的反應活性是FR與起始混合物中其它反應中間產物或反應單元中至少ー種以及可選地全部的反應活性的至少10倍，至少50倍，至少100倍，至少250倍，至少500倍，或者至少1000倍。此外，取決於反應物和反應條件，以高於或等於50%，聞於或等於75%，聞於或等於85%，或聞於或等於98%的廣率合成RP。
在另ー個方面，本發明提供了ー種合成反應產物的方法。所述方法包括如下步驟(a)提供第二反應單元和多種不同的第一反應單元的混合物，該混合物在能誘發第一反應単元中的至少ー種與第二反應單元之間發生反應的條件下提供，由此形成與多種第一反應単元共同存在的反應中間產物；(b)提供與反應中間產物附著的鑑定序列，其中，該序列能將反應中間產物與第一反應單元區別開；以及將與第一反應單元共同存在的反應中間產物與能選擇性地與反應中間產物反應的游離反應物混合，由此合成與鑑定序列相連的反應產物，反應產物與多種第一反應單元共同存在。游離反應物與反應中間產物的反應活性比游離反應物與起始混合物中其它反應中間產物或反應單元中的至少ー種的反應活性更高。
該手段示意性地展示於圖3中，其與圖I示意性展示的手段相似，不同之處在幹，第一反應單元作為多種第一反應單元的混合物存在。簡言之，含有被稱為FRU1, FRU2, FRU3和FRU4的四種第一反應單元的起始混合物與被稱為SRU1第二反應單元混合。在合適的條件下，FRU1和SRU1相互反應，產生被稱為RI1的反應中間產物。鑑定序列(IS)可與RI1附著，其能鑑定RI115之後，在允許將RI化學轉化為被稱為RP1的反應產物的條件下，將游離反應物(FR)混合進前述的混合物。RPJB與可用於鑑定RP及RP的合成歷史的IS相連。此夕卜，可以考慮，RP1可經過多輪其它官能團轉化，尤其是FRU是小分子骨架時，以產生經過進ー步修飾的產物。
在另ー個方面，本發明提供了ー種合成反應產物的方法，該方法通過以核酸為模板的合成來進行。該方法包括如下步驟(a)提供ー種混合物，其中包含⑴多種不同的第一反應單元，它們每種都與包含密碼子序列的第一寡核苷酸相連，其中，每種寡核苷酸序列還是與其附著的第一反應單元的指示物；(b)提供與第二寡核苷酸附著的第二反應單元，第二寡核苷酸包含與至少ー種第一反應單元的密碼子序列互補的反密碼子序列，其中，所述反密碼子序列是第二反應單元的指示物；(C)將至少ー種第一寡核苷酸的密碼子序列與第二寡核苷酸的反密碼子序列退火，以誘發第一和第二反應單元之間的反應，以形成至少與第一寡核苷酸相連的第一反應中間產物；以及(d)將第一反應中間產物與能選擇性地與第一反應中間產物反應的游離反應物混合，由此合成與鑑定序列相連的第一反應產物，其中，所述游離反應物與第一反應中間產物的反應活性高於游離反應物與混合物中存在的其它反應中間產物或反應單元的至少ー種以及可選地全部的反應活性。
該手段示意性展示於圖4中，其與圖2示意性展示的手段類似，不同之處僅在幹，第一反應單元作為多種第一反應單元的混合物存在。簡言之，最初的反應含有多種模板，其中每種模板含有第一反應單元(被稱為FRU1, FRU2, FRU3和FRU4)，它們分別與其各自的寡核苷酸(含有其自己的密碼子獨特序列(CS))附著，優選 地，共價附著。寡核苷酸優選還含鑑定序列，該序列能鑑定出何種第一反應單元與模板的何種密碼子序列附著。含有與含有反密碼子序列的寡核苷酸附著(優選地，共價附著)的第二反應單元(SRU)的轉移單元與模板混合，所述反密碼子序列與密碼序列互補。轉移單元的ACS退火到模板的CS上，以使FRU1和SRU進入反應鄰近狀態，由此FRU1和SRU相互反應，產生仍保持與含CS的寡核苷酸附著的反應中間產物(RI1)。當與游離反應物(FR)混合吋，RI被FR化學轉化以產生仍與CS相連的反應產物(RP)。假設附著到RP上的寡核苷酸含有CS，那麼可以確定何種SRU參與對RI和/或RP的合成。類似地，如果附著到RP上的寡核苷酸含有IS，那麼可以確定何種FRU參與對RI和/或RP的合成。因此，該信息可用於確定RI和/或RP的身份以及合成歷史。如所討論的，可以考慮，第一反應單元可以是用於設計和合成小分子文庫的小分子骨架。
此外，多種不同的官能團轉化在同一反應容器中同時發生是可能的。因此，所述方法還可包括如下額外步驟提供相異的第三反應單元，其與包含反密碼子序列的第三寡核苷酸相連，所述反密碼子序列與至少ー種不同的第一反應單元的密碼子序列互補，其中，該反密碼子序列是第三反應單元的指示物；將ー種不同的第一寡核苷酸的密碼子序列與第三寡核苷酸的反密碼子序列退火，以誘發第一和第三反應單元之間的反應，以形成至少與不同的第一寡核苷酸附著的第二反應中間產物；以及將第二反應中間產物與能選擇性地與第ニ反應中間產物反應的游離反應物混合，由此合成與鑑定序列附著的第二反應產物，其中，所述游離反應物與第二反應中間產物的反應活性高於游離反應物與混合物中存在的其它反應中間產物或反應單元的至少ー種以及可選地全部的反應活性。
此外，可以考慮到，反應產物可經過其它輪次的官能團轉化(例如，當FRU1是小分子骨架時)，用於產生經過進ー步修飾的產物。
本領域技術人員將理解，本發明的方法可用於擴大在以核酸為模板的化學合成期間可以使用的化學劑的範圍。關於對模板、轉移單元、反應條件、反應化學、選擇方案的選擇和使用方面的一般性考慮是本領域已知的。關於這些考慮的一般性討論見下文。
I.模板考慮
核酸模板可指導多種化學反應，沒有明顯的結構要求，這通過序列特異性地引來與互補寡核苷酸相連的反應物實現。在合成期間，模板與一種或多種轉移單元雜交或退火，以指導反應中間產物的合成，反應中間產物隨後可被游離反應物轉化為反應產物。然後可基於某些標準，例如與預先選擇的目標分子結合的能力，對反應產物加以選擇或篩選。一旦已鑑定出了反應產物，那麼可對其相聯的模板加以測序，以破譯反應中間產物和/或反應產物的合成歷史。
⑴模板形式
模板的長度可在很大範圍變化，這取決於所關注的以核酸為模板的合成的類型。例如，在某些實施方式中，模板可以為10至10000個核苷酸長，20至1000個核苷酸長，20至400個核苷酸長，40至1000個核苷酸長，或者40至400個核苷酸長。模板的長度當然將取決於，例如，密碼子的長度、文庫的複雜程度、反應產物的複雜程度和/或大小、間隔序列的使用等。
模板可在ー個末端包括以反應單元結尾的髮夾環(hairpin)，其可與ー種或多種與轉移單元相聯的反應單元反應。例如，DNA模板可包含以5』-氨基結尾的髮夾環，其可以或可以不是受保護的。氨基可充當形成非天然聚合物或小分子的起始點。
(ii)密碼子使用
可以考慮到，可以以多種方式來設計模板序列。例如，必須確定密碼子長度，必須設定密碼子序列。如果使用的密碼子長度為2，那麼使用四種天然存在的鹼基，將僅有16種可能的組合用於對文庫加以編碼。如果密碼子的長度增加至3(編碼蛋白質天然使用的數字)，可能的組合的數量就増加至64。如果密碼子的長度增加至4，那麼可能的組合的數量就増加至256。在確定密碼子的長度中要考慮的其它因素是錯配、讀碼框位移(frame-shifting)、文庫複雜程度等。隨著密碼子長度増加至某個點，錯配的數量會降低；但是，過長的密碼子在有多個錯配鹼基對時可能也將雜交。
雖然密碼子長度可變，但密碼子可能在2至50個核苷酸，2至40個核苷酸，2至30個核苷酸，2至20個核苷酸，2至15個核苷酸，2至10個核苷酸，3至50個核苷酸，3至40個核苷酸，3至30個核苷酸，3至20個核苷酸，3至15個核苷酸，3至10個核苷酸，4至50個核苷酸，4至40個核苷酸，4至30個核苷酸，4至20個核苷酸，4至15個核苷酸，4至10個核苷酸，5至50個核苷酸，5至40個核苷酸，5至30個核苷酸，5至20個核苷酸，5至15個核苷酸，5至10個核苷酸，6至50個核苷酸，6至40個核苷酸，6至30個核苷酸，6至20個核苷酸，6至15個核苷酸，6至10個核苷酸，7至50個核苷酸，7至40個核苷酸，7至30個核苷酸，7至20個核苷酸，7至15個核苷酸，7至10個核苷酸，8至50個核苷酸，8至40個核苷酸，8至30個核苷酸，8至20個核苷酸，8至15個核苷酸，8至10個核苷酸，9至50個核苷酸，9至40個核苷酸，9至30個核苷酸，9至20個核苷酸，9至15個核苷酸，9至10個核苷酸的範圍內。但是，密碼子優選為3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸長。
優選地，用於模板中的密碼子的組使得密碼子組中任何兩個密碼子之間錯配的數量最大化，以確保僅正確的轉移單元反密碼子退火到模板的密碼子位點上。此外，下述是重要的模板在一個密碼子組的所有成員間以及不同密碼子組的所有密碼子間都具有錯配，以確保反密碼子不會與錯的密碼子組錯誤結合。對示例性密碼子組的選擇以及產生功能性密碼子組的方法在例如美國專利公開號US2004/0180412中有描述。採用這種手段和其它手段，可以產生不同的密碼子組，使得沒有密碼子重複。
當以核酸為模板的合成被用於產生聚合物或小分子時，還可在密碼子之間放置間隔序列，以防止讀碼框位移。例如，可對編碼聚合物亞基的模板(即，用於聚合物的「遺傳密碼，，)的鹼基加以選擇，以使得讀碼框外退火的可能性最小化。這些遺傳密碼減少了不想要的對經過讀碼框位移的以核酸為模板的聚合物的翻譯，並且預期熔點溫度範圍不同，在讀碼框外的退火期間導致的錯配最小數量不同。
(iii)模板合成
可以使用本領域公知的方法來合成模板。這些方法包括體內和體外方法，包括PCR、質粒製備、內切核酸酶消化、固相合成(例如，使用自動合成儀)、體外轉錄、鏈分離等。合成之後，如果需要的話，可使用本領域已知的標準偶聯化學，將模板附著(例如，共價或非共價附著)到感興趣的反應單元上。
用於合成大量模板的一種有效方法是使用「分裂庫(split-pool)」技木。使用標準的3』至5』化學方法來合成寡核苷酸。首先，合成恆定的3』末端。然後將其分進η個不 同的容器，η是在該模板中的該位置出現的不同密碼子的數量。對於每個容器，在恆定的3』末端的(伸長中的)5』末端上合成η個不同密碼子中的ー個。由此，每個容器從5』到3』含有與恆定的3』末端附著的不同的密碼子。然後合併η個容器，使得單個容器含有與恆定的3』末端附著的η個不同密碼子。現在合成了臨近密碼子的5』末端的任何恆定鹼基。然後將該庫分進m個不同的容器，其中m是在模板的下ー個(更5』的)位置出現的不同密碼子的數量。在m個容器的每個中合成不同的密碼子(在伸長中的寡核苷酸的5』末端)。在單個容器中合併得到的寡核苷酸。按照需要重複分開、合成及合井，以合成寡核苷酸中的所有密碼子和恆定區域。
II.轉移單元
轉移單元包含含有反密碼子序列的寡核苷酸和反應單元。反密碼子被設計為與模板中存在的密碼子互補。因此，當設計反密碼子時應當考慮模板中使用的序列和密碼子長度。與模板中使用的密碼子互補的任何分子都可使用，包括天然的或非天然的核苷酸。在某些實施方式中，密碼子包括ー個或多個自然界中發現的鹼基(即，胸腺嘧啶苷、尿嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶和腺嘌呤)。因此，反密碼子可包括ー個或多個具有鹼基、糖以及可選的磷酸基團的、在自然界中正常發現的核苷酸。
如上文所討論的，反密碼子與特定種類的反應單元相聯，以形成轉移單元。反應單元可代表不同的實體，或者可以是反密碼子単元的官能部分。在某些其它實施方式中，當要生成小分子文庫而非聚合物文庫時，通常將反密碼子與用於修飾小分子骨架的反應物或反應單元相聯。在某些實施方式中，通過長到足以允許反應物與小分子骨架進入反應鄰近狀態的接頭(linker)，將反應物與反密碼子連接起來。接頭優選具有允許分子內反應但最小化分子間反應的長度和組成。反應物包括大量試劑，如可用於以核酸為模板的合成的多種反應所證實的，並且其可以是化學領域已知的任何化學基團、催化劑(例如，有機金屬化合物)或反應基元(例如，親電試劑、親核試劑)。
在某些實施方式中，每種反密碼子序列與ー種單體類型相聯。例如，反密碼子序列ATTAG可與具有異丁基側鏈的氨基甲酸殘基相聯，反密碼子序列CATAG可與具有苯基側鏈的氨基甲酸殘基相聯。這種將反密碼子與單體單元一一對應的方式允許通過對合成中所用的核酸模板進行測序來對文庫中任何聚合物加以破譯，以及允許通過知道原來的聚合物的序列而對同樣的聚合物或相關的聚合物加以合成。通過改變(突變)模板的序列，可以引入不同的單體單元，由此允許合成相關聚合物，其隨後可被選擇及發展(evolve)。在某些優選的實施方式中，若干反密碼子可針對ー種單體編碼，與自然界中情況一祥。
反密碼子可通過接頭基元與反應物相聯。連接可被光照、氧化、水解、暴露給酸、暴露給鹼、還原等切開。Fruchtel et al. (1996)ANGEff. CHEM. INT. ED. ENGL. 35 :17描述了多種可用於實踐本發明的連接。接頭協助反應物與小分子骨架的接觸，以及在某些實施方式中，取決於想要的反應，將DNA定位為離去基團(「可自動切割」策略)，或者可以通過「無痕」接頭策略(其產生不留下具有化學功能性的額外ー個或多個原子的產物)或「有用的疤痕」策略(其中，接頭的一部分留下，以在接頭切割後的後續步驟中被官能化)將反應基團與模板連接起來。有用的接頭、對它們的設計和用途在美國專利申請公開號No. US2004/0180412中有所描述。
轉移單元對模板的特異性退火允許以比很多傳統有機合成中所用的濃度更低的濃度來使用轉移單元。因此，轉移單元可以以小於I毫摩爾的濃度使用(例如，小於100 μ M，小於10 μ Μ,小於I μ Μ,小於IOOnM,或者小於IOnM)。III.化學反應
可以使用本文所述的方法來製備多種化合物和/或文庫。在某些實施方式中，根據本發明的方法合成不是或者不類似核酸或其類似物的化合物。在某些其它實施方式中，根據本發明的方法合成不是或不類似蛋白質、肽或其類似物的化合物。
(i)用於小分子合成的偶聯反應
在一些實施方式中，可使用本文所述的方法製造化合物，例如小分子。這些小分子可以例如是類天然產物，非多聚的，和/或非寡聚的。小分子中的實質性興趣部分在於它們在很多藥物製劑中作為活性成分的用途，但是它們還可用作為，例如催化劑、材料或添加齊 。
在使用本發明的方法合成小分子的過程中，可以使用可發展的(evolvable)模板。模板可包括小分子骨架，在其上將構建小分子，或者可向模板中加入小分子骨架。小分子骨架可以是具有用於官能化的兩個或多個位點的任何化學化合物。例如，小分子骨架可包括具有可官能化的基團的環系統(例如，在膽固醇中發現的ABCD類固醇環系統)，所述基團與組成環的原子偶聯。在另ー個例子中，小分子可以是藥物試劑的基礎結構，例如，嗎.、埃博黴素(印othilone)或頭孢菌素抗生素。可用本領域已知的方法和保護基團對小分子骨架上將被官能化的位點或基團進行保護。用於小分子骨架的保護基團可以是互相垂直的，使得保護基團可以一次被去除ー個。
在此方法中，轉移單元包含下述反密碼子，其與用於修飾小分子骨架或加到小分子骨架上或從小分子骨架消去的反應物或構造塊相連。試劑或反應塊可以是，例如，親電試劑(例如，こ醯基、醯胺、醯氯(acidchloride)、酷、腈、亞胺)、親核試劑(例如,胺、輕基、硫醇)、催化劑(例如，有機金屬催化劑)或側鏈。在雜交條件下令轉移單元與模板接觸。作為寡核苷酸退火的結果，附著的反應物或構造塊被允許與小分子骨架上的位點反應，產生一種或多種反應中間產物。然後反應中間產物可與游離反應物反應，產生反應產物。
對反應條件、接頭、反應物和將被官能化的位點進行選擇，以避免分子間反應，以及促進分子內反應。可將模板與轉移單元順序或同時接觸，這取決於將被合成的特定化合物。[0086]在骨架上的位點被修飾之後，新合成的小分子保持與編碼其合成的模板相接觸。對模板序列的破譯允許掲示(deconvolution)合成歷史，以及由此揭示小分子的結構。還可對模板加以擴増，以製造更多的目標小分子和/或模板可被發展(誘變)，以製造相關的小分子。還可從模板切下小分子，用於純化或篩選。
(ii)用於聚合物合成的偶聯反應
在某些實施方式中，可使用本文所述的技術來製備聚合物，特別是非天然聚合物。示例性非天然聚合物包括但不限於，肽核酸(PNA)聚合物、聚氨基甲酸酷、聚脲、聚酯、聚丙烯酸酷、聚烯烴(聚こ烯、聚丙烯)、聚碳酸酷、具有非天然立體化學的多肽、具有非天然胺基酸的多肽及其組合。在某些實施方式中，聚合物包含10、25、75、100、125、150個單體單元或更多。使用本文所述的方法合成的聚合物可用作為，例如催化劑、藥物、金屬螯合劑或催化劑。
在製備某些非天然聚合物的過程中，附著到反密碼子的單體單元可以是能連接起 來形成聚合物的單體或寡聚體。單體單元可以是，例如，氨基甲酸酷、D-胺基酸、非天然胺基酸、PNAs、尿素、羥酸、酷、碳酸酯、丙烯酸酯或醚。
(iii)反應條件
應當理解，以核酸為模板的反應，例如用於生產反應中間產物的以核酸為模板的反應，可在水性或非水性(即有機)溶液或ー種或多種水性及非水性溶液的混合物中發生。在水性溶液中，反應可以在大約2至大約12的pH範圍進行,或者優選地,大約2至大約10，或者更優選地，大約4至大約10。用於以DNA為模板的化學方法中的反應優選不需要非常鹼性的條件(例如，pH>12、pH>10)或者非常酸性的條件(例如pH〈l、pH〈2、pH Tetrahedron 矛ロ しarruther sSome Modem Methods ofOrganic Chemistry中列出的反應。選擇的反應優選與核酸(例如DNA或RNA)兼容，或者與用作為模板的經修飾的核酸兼容。
儘管如上所述，但是應當考慮到，本發明特別有用於進行某些官能團轉化，其包括但不限於從疊氮化物到胺的轉化、從疊氮化物到硫醇的轉化、從疊氮化物到羧酸的轉化、從羥基到胺的轉化、從羥基到硫醇的轉化、從縮醛到醛的轉化、從縮酮到酮的轉化、從碳酸酯到羥基的轉化、從氨基甲酸酯到胺的轉化、從硫代碳酸酯到硫 醇的轉化、從硝基到胺的轉化、從磺胺到胺的轉化、從烯烴到環氧化物的轉化、從α，β_不飽和酮到環氧化物的轉化、從環氧化物到1，2_ ニ醇的轉化、從環氧化物到1，2_羥胺的轉化、從環氧化物到1，2_羥基硫化物的轉化、從烯烴到氮丙啶的轉化、從氮丙啶到1，2_ ニ胺的轉化、從氮丙啶到1，2_氨基硫化物的轉化、從膦酸酯到膦酸的轉化、從醯亞胺到胺的轉化以及從腈到羧酸的轉化。其它示例性轉化可在例如 Greene et al. (ed.) (1999)PROTECTIVE GROUPS INORGANICSYNTHESIS3RD ED.，Wiley-Interscience 和 Kocienski(1994)PROTECTING GROUPS, Thieme中找到。
IV.對產物的選擇、篩選和鑑定
(i)選擇和篩選手段
針對具有想要的活性(例如，催化活性、結合親和性或者活性試驗中的特定效果)的反應產物的選擇和/或篩選可使用本領域使用的及本領域已知的方法來進行。例如，親和性選擇可按照基於文庫的選擇方法(例如，噬菌體展示、多核糖體展示以及mRNA融合蛋白展示的肽)中所用的原則來進行。對催化活性的選擇可通過在過渡態類似物親和柱上的親和性選擇(Baca et al. (1997)PROC. NATL. ACAD. SCI. USA94 (19) :10063-8)來進行或者通過基於功能的選擇方案(Pedersen et al. (1998)PROC. NATL. ACAD. SCI.USA95(18) :10523-8)來進行。因為可以通過PCR擴增微小量DNA(大約1(T2°摩爾)(Krameret al. (1999)CURRENT PR0T0C0LSIN MOLECULAR BIOLOGY (ed. Ausubel, F. Μ.) 15. 1-15. 3,Wiley)，因此可以用比通過目前的方法進行反應分析所需要的數量少十個或更多數量級的規模來進行這些選擇，進行真正寬廣的經濟高效搜索。
可針對對靶分子的結合，對模板和反應產物加以選擇(或篩選)。在該上下文中，選擇或分開(partitioning)指下述任何過程,通過所述過程,與祀分子結合的文庫成員與未和靶分子結合的文庫成員分離開。選擇可通過本領域已知的多種方法來進行。
本發明的模板含有用於直接選擇和擴增的內建功能。在多種應用中，與靶分子結合優選是選擇性的，使得模板和得到的反應產物優先與特定靶分子結合，這有可能阻止或誘發特定的生物學效應。最終，使用本發明鑑定的結合分子可用作為治療和/或診斷試劑。一旦完成了選擇，可選地，選出的模板可被擴增和測序。選出的反應產物如果以足夠量存在，那麼其可與模板分離，被純化(例如，通過HPLC、柱色譜或其它色譜方法)，以及被進ー步分析。[0103]可開展選擇策略，以允許針對幾乎任何靶來選擇。重要地，選擇策略不需要關於靶分子或文庫中分子的任何詳細的結構信息。整個過程由文庫中分子對給定的靶的特異性識別和結合所涉及的結合親和性驅動。
模板分子和反應產物之間的連接允許使用多種選擇策略對結合分子進行快速鑑定。以核酸為模板的合成廣泛地允許鑑定出針對任何已知靶分子的結合分子。此外，可通過下述方法發現新穎的未知靶分離出針對未知抗原(表位)的結合分子，使用這些結合分子進行鑑定和確認。
從文庫中選擇結合分子可以以任何形式進行，以鑑定最優結合分子。典型地，結合選擇包括固定想要的靶分子，加入可能的結合子的文庫，以及通過洗滌除去未結合物。當展示出針對被固定靶的低親和性的分子被洗去時，通常，具有更強的親和性的分子保持與靶的附著。優選地，對嚴謹洗滌後保持與靶結合的經富集群體進行洗脫，這用例如酸、離液(chaotropic)鹽、加熱、用已知配體的競爭性洗脫或者通過靶和/或模板分子的蛋白水解性釋放來進行。經洗脫的模板適合用於PCR，導致很多數量級的擴増，由此，幾乎每種選出的模板都可以劇烈増加的拷貝數獲得，用於克隆、測序和/或進ー步富集和多祥化
(diversiiicationノ。
靶分子(肽、蛋白、DNA或其它抗原)可被固定到固體支持物上，例如，容器壁、微滴定板孔壁。優選地，將文庫溶解於ー個罐中的水性結合緩衝液中，在存在固定的靶分子的情況下對其進行平衡。用緩衝液洗去未結合物。可通過用缺少PCR引物結合位點的非官能化模板對經結合的文庫加以洗滌，除去可能通過其附著的DNA模板而非通過其合成基元與靶分子結合的那些分子。然後例如通過變形可洗脫保持結合的文庫成員。
或者，可將靶分子固定到珠粒(bead)上，特別是當懷疑靶分子將充分吸附到容器壁上吋，如在從SDS-PAGE凝膠洗脫的未摺疊靶的情況下。然後可將經過衍生化的珠粒用於分離高親和性文庫成員和未結合物，這通過在臺式離心機上簡單地沉澱珠粒來進行。或者，可將珠粒用於製造親和柱。在此類情況下，文庫經過該柱一次或多次，以允許結合。然後對該柱進行洗滌，以除去未結合的文庫成員。磁性珠粒本質上是上述珠粒的變體；靶與磁性珠粒附著，然後珠粒用於選擇。
可通過變性、酸或離液鹽來釋放結合靶分子的文庫成員。或者，洗脫條件可以更特異，以減少背景，或者針對想要的特異性來選擇。可使用蛋白水解，以切割靶分子和固定表面之間的接頭，或者切割反應產物和模板之間的接頭來完成洗脫。或者，洗脫可以通過與針對靶分子的競爭性配體的競爭來完成。或者，可在選擇程序末尾，存在洗過的靶分子吋，直接進行PCR反應。由此，結合分子無須可從靶上洗脫即具有選擇性，因為進ー步擴增或克隆僅需要模板，而非反應產物本身。事實上，ー些靶分子與最渴望的配體非常緊密地結合，使得難於進行洗脫。
(ii)鑑定產物
—旦完成了所有輪次的選擇，優選地，使用任何合適的技術對與或曾經與選出的反應產物附著的模板加以擴増，以便於測序或者對模板的後續操作。可通過本領域的任何已知方法來擴增天然的寡核苷酸。這些方法包括，例如，聚合酶鏈式反應(PCR);基於核酸序列的擴增(見，例如，Compton (1991) NATURE350 :91-92)，擴增的反義RNA(見，例如，vanGelder et al. (1988)PR0C. NATL. ACAD. SCI. USA85 :77652-77656);自我維持的序列複製系統(Gnatelli et al. (1990) PROC. NATL. ACAD. Sci. USA87 :1874-1878);不依賴聚合酶的擴增(見，例如 Schmidt et al. (1997)NUCLEIC ACIDS RES. 25 :4797-4802)以及對攜帶克隆DNA片段的質粒的體內擴增。對PCR方法的描述例如可以在Saiki et al. (1985)Science230 :1350-1354 ；Scharf et al. (1986) Science233 1076-1078 ;以及美國專利No. 4683202中找到。還可使用連接酶介導的擴增方法，例如連接酶鏈式反應(LCR)。通常，允許對選出的核酸序列進行可靠、有效擴增的任何手段可用於本發明的方法中。優選地，但是非必須地，擴增後序列的成比例情況反映了擴增前混合物中序列的相對比例。
對於非天然核苷酸來說，對高效擴增程序的選擇較少。因為非天然核苷酸可被某些酶(包括聚合酶)包括進去，因此，將可能通過在每個延伸循環期間加入聚合酶來進行人エ的聚合酶鏈式反應。
一旦被擴增，編碼感興趣的產物的模板序列即可被確定。測序例如可通過標準的 雙脫氧鏈終止法來進行，或者通過化學測序，例如使用Maxam-Gilbert測序程序來進行。或者，可通過雜交實驗來測定模板(或者，如果使用較長模板的話，其可變的部分)的序列。例如，與可探測基元(例如螢光基元)相聯的單鏈模板分子被暴露給晶片，該晶片攜帶有已知序列的單鏈核酸或核酸類似物的大量克隆群體，每種克隆群體存在於晶片上可設定地址的特定位置。模板序列被允許退火到晶片序列上。然後測定晶片上可探測基元的位置。基於可探測基元的位置以及處於該位置的被固定序列，可以確定模板的序列。可以考慮在晶片或其它固體支持物上的陣列中固定大量的此類核酸。
可通過在DNA水平引入突變來發展文庫，例如，使用易錯PCR(Cadwell etal.(1992) PCR METHODS APPL. 2 :28)或通過對 DNA 進行體外同源重組(Stemmer (1994) PR0C.NATL. ACAD. SCI. USA91 :10747 ；Stemmer (1994)NATURE370 :389)或通過盒誘變來進行。例如在美國專利申請公開號No. US2004/0180412中描述了模板發展和發展性合成。
下述實施例含有重要的額外信息、示例和指導，其可用於在本發明的多種實施方式或其等同方式中實踐本發明。將從下面這些實施例更好地理解本發明的實踐，但實施例僅作闡述目的，而不應被理解為以任何方式進行限制。
實施例
下述實施例證實了序列程序化官能團轉化的可行性。實施例I和2描述了三種序列程序化官能團轉化，即，從疊氮化物到胺、從疊氮化物到硫醇以及從疊氮化物到羧酸的轉化，其中，已通過凝膠電泳(實施例I)或通過質譜(實施例2)對轉化的終產物進行了分祈。實施例3示出，可使用小分子試劑，例如不連接到DNA的磺醯氯、氯甲酸酷、異氰酸酯以及異硫氰酸酯反應物，將連接胺的模板轉化為磺胺、氨基甲酸酷、尿素或硫脲。實施例4示出，可在單種溶液中，將有機疊氮化物的混合物以序列特異性方式轉化為胺中間產物，然後使用不連接到DNA的游離反應物(例如，磺醯氯、氯甲酸酷、異氰酸酯和異硫氰酸酷)將胺中間產物以序列特異性方式轉化為磺胺、氨基甲酸酷、尿素和硫脲產物。
實施例I以DNA為樽板將疊氮化物轉化為ー級胺、羧酸和硫醇(通過PAGE分析)
本實施例描述序列程序化官能團轉化，其中，可將疊氮化物特異性轉化為胺、硫醇或羧酸。各反應方案和得到的反應產率示於圖5A和5B中。
I.材料和方法
⑴合成疊氮酸[0121]按下文所述，從相應的羧酸前體來製備用於合成圖5B所示的化合物1-12的疊氮底物
疊氮乙酸(用幹牛產圖5B的樽板I)。桉照Lundauist et al. (2001) ORG LETT. 3 781所述來生產該試劑。該產物被發現具有如下特徵=1HNMR (300MHz ADCl3) δ 3. 96 (2Η，s)。
疊氮-3-甲基戊酸(用於生產圖5B的模板2)。按照上述Lundquist etal. (2001)所述來生產該試劑。該產物被發現具有如下特徵=1HNMR(300MHz，⑶Cl3) δ 3. 92 (1H，br),
3.88 (2H, dd, J = 5. 7Hz, J = 9Hz)，I. 77 (2H, m)，O. 99 (6H, t, J = 6. 6Hz)。
4-疊氮甲基苯甲酸(用於製備圖 5B的模板3)。將疊氮化鈉(1.3g，20mmOl)和18-冠-6醚(O. 2mL, Immo I)溶解於DMSO (4mL)中。向得到的溶液中加入4-氯甲基苯甲酸(I. 71g，IOmmol)，在25°C對反應混合物進行12小時的攪拌。在EtOAc中稀釋反應體系，用O. IN HCl (2x)洗滌，然後用鹽水洗。用Na2SO4乾燥有機層，濃縮以提供白色固體(I. 75g，定量的)。得到的產物被發現具有如下特徵=1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 8. 15 (2Η，d，J =
8.4Hz) 7. 45 (2H, d, J = 8. 4Hz) (1H，s);針對 C8H6N3O2 計算的 ESMS :176. 0460 ;觀察到的176.0461。
按照上述Lundquist et al. (2001)中描述來通過重氮轉移合成疊氮酸的方法，合成I-疊氮環己基羧酸(用於製備圖5B的模板5)和疊氮異穀氨酸(用於製備圖5B的模板4)。I-疊氮環己基羧酸被發現具有如下特徵,H NMR(300MHz，CDCl3) δ 1.86 (4H，m) I. 63 (4H, m) I. 36 (2H, m);針對 C7H7N3O2 (M+NH:)計算的 CIMS :1187. 1195 ；觀察到的1187. 1188。疊氮異穀氨酸被發現具有如下特徵=1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 6. 43 (2Η，d，J =
17.4Hz) 3. 14 (lHdd, J = 14. 1Hz，J = 6. 9Hz) 2. 54 (2H, tj = 7. 5Hz) 2. 23 (2H, dd, J = 13. 6HzJ=6. 6Hz);針對 C7H7N3O2 (M+NH:)計算的 CIMS :190. 0931 ;觀察到的:190. 040。
I-疊氮甲基苯甲酸(用子牛產圖5B的樽板6)。按照Wada et al. (2001)TETRAHEDRON LETT. 42 :1069-72 以及還按照Love et al. (2001). J. ORG CHEM. 66 :68165-76所述來生產該試劑。該產物被發現具有如下特徵=1H NMR(300MHzADCl3) δ 8. 18(lH，dd，J =
7.6Hz, J = I. 2Hz)，7. 63 (1H, td, J = 7. 5Hz, J = I. 2Hz)，7. 55 (1H, d, J = 6. 6Hz)，7. 46 (1H,td, J = 7. 5Hz, J=L 5Hz) ,4. 894 (2H, s)。
4-疊氮苯甲酸(用於生產圖5B的模板7)。該試劑購自Sigma-Aldrich (St. Louis,MO)。
4-疊氮苯甲基-環己基ニ羧酸單酯(用於製備圖5B的模板8)。將反-環己基ニ竣酸(200mg, I. 16mmol)、EDC (223mg, 2. 32mmol)和 N, N-ニ異丙基こ胺(O. 4mL, 2. 32mmol)溶解於CH2Cl2(4mL)中，在25°C攪拌30分鐘。向該混合物中加入4-疊氮苯甲醇(86. 6mg，O. 58mmol)。在25°C對反應體系進行12小時的攪拌。濃縮反應混合物，通過快速色譜純化(30% EtOAc/己烷)。想要的酯作為黃色固體獲得(18. 2mg,5% )。得到的產物被發現具有如下特徵: NMR(300MHz, CDCl3) δ 7. 34(2H，d，J = 8. 4Hz) 7. 03(2H，d，J = 8. 4Hz) 5. 08 (1H,s) 2. 33 (2H, m) 2. 09 (4H, d, J = 9. 3Hz) I. 47 (4H, t, J = 9. 9Hz);針對 C15H17N3O4 (M+HCOf)計算的 ESMS 348. 1196 ;觀察到的348. 1195。
4-疊氮苯甲基-琥珀酸單酯(用於製備圖5B的模板9)。將4_疊氮苯甲醇(100mg，
0.67mmol)、琥拍酸酐(134mg, I. 37mmol)和N, N-甲基氨基卩比唳(3. 7mg, 30 μ mol)溶解於DMF(ImL)中，在25°C攪拌12小時。濃縮反應混合物，通過快速色譜純化(30% EtOAc/己烷)。想要的酯作為黃色固體獲得(75.9mg，45% )。得到的產物被發現具有如下特徵1H NMR (300MHz, CDCl3) δ 7. 28 (2Η, d, J = 7. 8Hz)6. 96 (2H, d, J = 7. 8Hz), 5. 05 (2H, s)，
2.63 (4H, m);針對 C7H6N3O2 計算的 ESMS :248. 0672 ;觀察到的:248. 0660。
4-疊氮苯甲基-聯苯甲酸單酯(用於製備圖5B的模板10)。將4-疊氮苯甲醇(112mg,O. 5mmol)和聯苯甲酸酸酐(74. 5mg,O. 5mmol)溶解於卩比唳(ImL)中，在25°C攪拌12小時。將反應混合物稀釋於EtOAc中，用磷酸緩衝液(pH6.0，2x)洗，然後用鹽水洗。在Na2SO4上乾燥有機層，真空下濃縮。通過快速色譜(25% EtOAc/己烷)純化粗產物。想要的酯作為黃色固體獲得(193mg，99% )。得到的產物被發現具有如下特徵=1H NMR(300MHz,CDCl3) δ 9. 87 (1Η, s) 7. 92 (1H, dd, J = 7. 2Hz，J = I. 2Hz) 7. 86 (1H, dd, J = 7. 8Hz, J =I. 2Hz) 7. 43 (2H, dd, J = 5. 7HzJ = I. 5Hz) 7. 38 (2H, dd, J = 5. 7Hz, J = I. 2Hz) 7. 32 (2H, dd,J = 7. 5Hz, J = I. 2Hz) 7. 28 (2H, dd, J = 7. 3Hz, J = I. 2Hz) 6. 98 (2H, J = 8. 4Hz) 6. 85 (2H,J = 8. 4Hz) 4. 91 (2H，J = 2. 7Hz);針對 C21H16N3O4 (M+H.)計算的 ESMS :374. 1141 ;觀察到的374.1149。
I-疊氮甲基苯甲醯硫代乙酸硫酯(用於制各圖5B的模板11)。將2-疊氮甲基苯甲酸(40mg,O. 23mmol)與 EDC(64. 9mg,O. 34mmol)和 N-輕基玻拍酸亞胺(NHS) (39. Img,
O.34mmol)在CH2Cl2中於25°C混合2小時。用NaHCO3(2x)洗反應混合物，然後用鹽水洗。濃縮有機層，粗產物不經進一步純化即直接用於下一步。令2-疊氮甲基苯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(16. 4mg,47ymol) DMF(250 μ L)中的硫代乙酸(3. 2 μ L)在25°C反應24小時。在EtOAc中稀釋反應混合物，用NaHCO3 (2x)洗，然後用鹽水洗。在Na2SO4上乾燥有機層，真空下濃縮。通過快速色譜(30% EtOAc/己烷)純化粗製混合物，以提供硫酯(9. 8mg,83% )。得到的產物被發現具有如下特徵=1H NMR (300MHz ,CDCl3) δ 7. 95 (d，1H，J = 7. 8Hz) 7. 56 (t，
1H,J = 7. 8Hz) 7. 50 (d, 1H, J = 6. 6Hz) 7. 41 (t, 1H, J = 7. 8Hz) 4. 64 (s, 2H) 3. 88 (s, 2H);針對 C7H6N3O2 計算的 ESMS 250. 0287 ;觀察到的:250. 0284。
2-疊氮甲基苯甲醯硫丙酸硫酯(用於製備圖5B的模板12)。通過將等體積的I-疊氮甲基苯甲酸(用於生產圖5B中的模板6) (900mM, DMF中)、EDC (900mM, DMF中)和NHS (900mM, DMF中)在25°C混合I小時，來製備2-疊氮甲基苯甲醯N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯。在平行製備中，將硫醇基團附著到DNA寡核苷酸上，在模板形成時將其併入模板(見下文，製備5』連接2-疊氮甲基苯甲醯硫丙酸硫酯的DNA)。
(ii)製備官能化寡核苷酸
在本實施例以及下述實施例中，使用標準的亞磷醯胺(phosphoramidite)方案，在Perseptive Biosystems Expedite8090DNA合成儀上合成寡核苷酸,並使用製備規模的反相HPLC進行純化。用於自動固相寡核苷酸合成的試劑購自Glen Research。針對下述以胺結尾的、生物素化的DNA寡核苷酸,用5』氨基-修飾物(modifier) 5 (Glen Research)製備5』 -氨基經修飾的寡核苷酸；用3』氨基-修飾物C7CPG(GlenResearch)製備3』 -氨基經修飾的寡核苷酸；以及，用生物素TEG CPG (Glen Research)製備3』-經生物素標記的寡核苷酸。通過分析規模的反相HPLC來純化官能化的DNA寡核苷酸。
基於在Hewlett_Packard8453UV-可見光分光光度計(AgilentTechnologies)上測量到的260nm吸收，測定溶液中經純化的寡核苷酸的濃度。通過UV透視法，以及使用Eagle Eye II densitometer(Stratagene)進行密度測定,來觀察和定量用溴化乙唳染色的寡核苷酸。
(a)模板寡核苷酸
5』連接疊氮化物的DNA寡核苷酸模板(用於生產圖5B的模板1_11)。將等體積的各疊氮酸(900mM，DMF 中)、EDC (900mM, DMF 中)和 NHS(900mM，DMF 中)在 25 °C 混合I小時，來製備想要的疊氮酸的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酷。將粗製的NHS酯以兩部分(每份50 μ L)加入到含有處於IOOmM磷酸鈉緩衝液(ρΗ7. 2，350 μ L)中的5』氨基經修飾的DNA寡核苷酸(50 μ L，典型地，300 μ Μ)的溶液中。用於這些製備中所用的30體模板是 5' NH2(C2H4O)2-PO3H-GGT ACG AAT TGCACT CGG GAA ATC CAC CTT (SEQ ID NO:I)。偶聯反應在25°C進行I小吋。將得到的反應混合物直接上樣到NAP-5尺寸排除柱(AmershamBiosciences)上，去除有機溶劑、鹽和過量的小分子，通過分析規模的反相HPLC(8-30 % MeCN/0. IM TEAA梯度)進ー步純化連接疊氮化物的DNA寡核苷酸。通過MALDI-T0F質譜分析想要的寡核苷酸產物。5』連接2-疊氮甲基苯甲醯硫丙酸硫酯的DNA(用於生產圖5B的模板12)。將DMF中的2，2』(b)轉移單元
3』連接三苯基膦的DNA。在連接到CPG樹脂上的3』氨基經修飾的寡核苷酸上進行三苯基膦基團的附著。與模板完全互補的10體試劑具有下述結構5' AATTCG TaCC-OPO3H-CH2CH (CH2OH) (CH2) 4NHC0C6H4PPh2 (SEQ ID NO :2)。含有相對模板而言三鹼基錯配的10體試劑具有下述結構5 ' AAT ACA TCC C-OPO3H-CH2CH (CH2OH)(CH2)4NHCOC6H4PPh2 (SEQ ID NO :3)。後者在這些實驗中用作為對照。
通過三個循環的下述過程⑴用DMF中的20%哌啶處理10分鐘；⑵用DMF洗；以及(iii)用MeCN洗，去除3』 FMOC-NH-寡核苷酸上的Fmoc基團。在氮氣流下乾燥樹脂。將 4_ ニ苯基勝基苯甲酸(30. 6mg, 100 μ mol)、EDC (19. I mg, 100 μ mol)、N, N- ニ異丙基こ胺(36. 8 μ L，211 μ mol)的處於DMF(O. 6mL)中的溶液加入樹脂，混合物在37°C溫育2小吋。用DMF(2x)以及用MeCN(2x)洗樹脂，然後在氮氣下乾燥。從CPG樹脂上切割下經衍生化的寡核苷酸，這通過在I :1的羥基銨甲基胺(AMA)(含有鹽酸三(2-羧こ基)膦(TCEP-HCI，Img))中於55°C溫育45分鐘來實現。過濾切割溶液，通過分析規模的反相HPLC(8_30%MeCN/O. IM TEAA梯度)對其進行純化。通過MALDI-TOF質譜分析想要的寡核苷酸產物。
(C)捕獲試劑
為了進行聚丙烯醯胺凝膠電泳，使用退火到模板上的20體第二試劑(捕獲試劑)來捕獲反應產物。
氨基經修飾的DNA (該試劑用於捕獲模板8-10的產物)。20體第二試劑含有序列5' TCC CGA GTG CAA TTC GTA CC-OPO3H-CH2CH(CH2OH) (CH2)4NH2(SEQ ID NO :4)。該寡核苷酸用作用於下述捕獲試劑的起始材料。
3』連接滇乙酸酯的DNA(該試劑用於捕獲模板11和12的產物)。通過將等體積的溴乙酸(900mM，DMF 中)、EDC(900mM, DMF 中)和 NHS(900mM，DMF 中)在 25°C混合 I 小時，來製備溴乙酸的NHS酯。將粗製的NHS酯(100 μ L)加入到5』氨基經修飾的DNA寡核 苷酸(50 μ L，典型地，300 μ Μ)在IOOmM磷酸鈉緩衝液(ρΗ7. 2，350 μ L)中的溶液中。偶聯反應在25°C進行I小時。將得到的反應混合物直接上樣到NAP-5尺寸排除柱上，去除有機溶劑、鹽和過量的小分子，通過分析規模的反相HPLC(8-30%MeCN/0. IM TEAA梯度)對其進行進一步純化。通過MALDI-T0F質譜分析想要的寡核苷酸產物。
3』連接4-甲醯苯甲酸酯的DNA(該試劑用於捕獲模板7的產物)。按照用於連接溴乙酸酯的DNA的方案，製備連接4-甲醯苯甲酸酯的20體的DNA，其中使用4-甲醯苯甲酸代替溴乙酸。
3』連接琥珀酸單酯的DNA(該試劑用於捕獲模板1_6的產物)。在25 °C用DMF(200 μ L)中的 NHS(10mg，0. ImmoI)對琥珀酸酐(22mg，0. ImmoI)進行 15 分鐘活化。將100 μ L該混合物加入到IOOmMHEPES緩衝液(ρΗ8. 5,850 μ L)中的3』氨基經修飾的模板(50 μ L，典型地，300 μ Μ)中，在37°C溫育16小時。通過NAP-5尺寸排除柱對反應混合物進行脫鹽，通過分析規模的HPLC (8-30% MeCN/0. IM TEAA梯度)對其進行進一步純化。通過MALDI-T0F質譜分析想要的寡核苷酸產物。
II.結果和結論
(i)以DNA為模板的從疊氮化物到胺的轉化
用多種與30體DNA寡核苷酸模板5』末端相連的有機疊氮化物與與互補的DNAlO體3』末端接合的三苯基膦反應(見圖5A)。通過將5』連接疊氮化物的30體模板(12pmol)和3』連接三苯基膦的10體試劑(24pmol)(在總體積為200 μ L的IOOmM CAPS緩衝液(pHIO)中，其中含有500mM NaCl)在25°C混合16小時，來進行以DNA為模板的從疊氮化物到胺的官能團轉化。對於底物4和5，IM NaCl，加入O. 5mM DTT以抑制膦氧化被發現能增加產率。代表性反應條件包括對1-7而言，60nM疊氮化物，120nM膦，O. IM CAPS (pHIO), O. 5M NaCl ；對8-11而言，同上，差別在於O. IM MES (pH6. O)，IM NaCl ;對12而言，同上，差別在於O. IMMOPS (pH7. 5)，IM NaCl。
與以DNA為模板的偶聯反應不同，從疊氮化物到胺的轉化可能不能被變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)直接監測，因為起始材料和產物具有相近的分子量。為檢測這些反應的進程，在存在碳二亞胺的情況下用連接20體的羧酸，在存在NaBH3CN的情況下用連接20體的醛來捕獲可能的胺產物。這些第二試劑或捕獲試劑置換連接10體的氧化膦，高效偶聯一級胺，而不會偶聯疊氮化物。得到的醯胺或二級胺產物獲得了 20體的分子量，易於通過PAGE與起始的疊氮化物區分開。
為了捕獲從底物1-6獲得的胺產物，向反應混合物(含有處於MES緩衝液(pH6. 5)中的EDC(30mM)和硫-NHS(15mM))中加入3』連接羧酸的20體試劑(24pmol)。為了捕獲從底物7獲得的胺產物，在存在處於MES緩衝液(pH6. 5)中的NaBH3CN(3mM)時，用3』連接醛的20體試劑來捕獲產物。產物捕獲之後，用NaOAc (pH5)、こ醇和糖原(glycogen)來沉澱連接DNA的物質。
將得到的沉澱溶解於變性凝膠上樣緩衝液中，進行變性PAGE分析。如無特別指明，用15%聚丙烯醯胺凝膠(TBE-尿素)來進行PAGE分析。
通過凝膠的溴化こ啶染色、產物和模板條帶的UV顯示以及基於CXD的密度測定，來定量反應產率。產率計算假設變性凝膠中的產物和模板按照每鹼基等密度的方式被染色。產物在定量期間是部分雙鏈的情況下，染色密度的改變可能導致更高的表觀產率。通過變性PAGE分析獲得典型結果示於圖6。圖6A示出了對圖5B中疊氮化物3的以DNA為模板的、從疊氮化物到胺的轉化的變性PAGE分析。圖6B示出了對圖5B中疊氮化物7的以DNA為模板的、從疊氮化物到胺的轉化的變性PAGE分析。
對測試的七種疊氮化物(圖5B中的底物1-7)而言，以DNA為模板的疊氮化物還原在PHlO時高效進行。反應產物的真實產率概括於圖5B中。在每種情況下，其中膦與非互補的錯配寡核苷酸相連的對照反應不產生顯著的醯胺或ニ級胺產物，這表明這些以DNA為模板的從疊氮化物到胺的轉化以序列特異性的方式進行。
(ii)以DNA為模板的從疊氮化物到羧酸或硫醇的轉化
反應範圍被進ー步擴展到實現從疊氮化物到羧酸以及從疊氮化物到硫醇的官能團轉化(見圖5A)。在兩種情況下，疊氮化物還原誘發了自發片段化，以暴露羧酸或硫醇基團。為評估這些反應的效率，在存在碳ニ亞胺的情況下，用連接DNA的胺來捕獲羧酸(從底物8-10獲得的產物)，而連接DNA的烷基溴則被用於捕獲硫醇產物(從底物11和12獲得的產物)。
以DNA為模板的從疊氮化物到羧酸的轉化的進行類似從疊氮化物到胺的轉化，差別在於緩衝液含有O. IM MES(pH6. O)和IM NaCl。為捕獲羧酸產物，向反應混合物(含有處於MES緩衝液(ρΗ6· 5)中的EDC(30mM)和硫-NHS (15mM))中加入3，連接胺的20體試劑。來自變性PAGE的典型結果示於圖6C(代表為使用來自圖5B的試劑8的情況)。
以DNA為模板的從疊氮化物到硫醇的轉化按上文進行，差別在於緩衝液含有O. IMMES (pH6. O)(對底物11而言)或M0PS(pH7. 5)(對底物12而言)和IM NaCl。為捕獲硫醇產物，向反應混合物中加入3』連接烷基溴的20體試劑，在37°C溫育6小時。來自變性PAGE的典型結果示於圖6D (代表為使用來自圖5B的試劑11的情況)。
對於從羧酸到胺以及從硫醇到胺的轉化而言，變性PAGE分析表明，暴露羧酸和硫醇基團(圖5B中的底物8-12)的以DNA為模板的官能團轉化也以高效且序列特異性的方式進行。
實施例2以DNA為樽板將疊氮化物轉化為ー級胺、羧酸和硫醇(通過質譜分析)
本實施例類似實施例1，除了通過質譜而非PAGE來分析反應產物。為方便起見，在同樣的或相似的條件下，採用更小的模板以及不同的捕獲系統。
I.材料和方法[0165](i)合成疊氮酸
按照實施例I所述，來製備用於合成圖5B所示的化合物1-12的疊氮底物。
(ii)製備經官能化的寡核苷酸
以與實施例I類似的方式來製備用於本實施例的寡核苷酸，其中具有如下改變。
(a)模板寡核苷酸
按照實施例I所述來製備模板寡核苷酸，區別在於不使用30體模板，而使用下述10 體模板5' -NH2 (C2H4O) 2-P03H-GGT ACG AAT T-OPO3H-CH (CH2OH) CH2 (OC2H4) 4CH2NHC0_ 生物素(SEQ ID NO 5) ο
(b)轉移單元
按照實施例I所述製備連接三苯基膦的試劑。
(iii)質譜分析
在Applied Biosystems Voyager-DE Pro Biospectrometry Workstation上進行MALDI-TOF質譜,用Voyager Data Explorer軟體進行處理。在所有實驗中，九份輕基卩比唳甲酸(HPA，50mg/mL，處於50% MeCN/H20中)和一份檸檬酸銨(50mg/ml，處於H2O中)的混合物被用作為基質。
II.結果和結論
向含有500mM NaCl的IOOmM CAPS緩衝液(pHIO)中的5』連接疊氮化物、3』生物素化的10體模板(12pmol)溶液中加入連接互補性DNA的膦試劑(24pmol)。在25°C對混合物進行0. 5小時的攪動，然後在37°C進行12小時攪動。通過用連接鏈親和素磁性顆粒(Roche)處理反應混合物來純化經生物素化的產物和未反應的模板，按照廠商方案進行洗脫。用乙醇和糖原沉澱洗脫液中的DNA。對底物11-12直接進行後續質譜分析。通過使用ZipTip C18柱(Millipore)對溶解於基質溶液中的沉澱脫鹽，來製備用於MALDI-T0F分析的樣品。
通過MALDI-T0F質譜鑑定得到的亞胺基正膦(iminophosphorane),發現其出人意料地對水解穩定，尤其是在酸性條件下，推測這是由於形成了穩定的HCl鹽(Shalev，etal. (1996) J. 0RG. CHEM. 61 :1689-1701)。但是，用連接 DNA 的膦在 pHIO 的緩衝液中於 25°C對連接模板的疊氮化物的處理卻產生了定量的亞胺基正膦水解，產生了相應的一級胺。
來自MALDI-T0F分析的結果概括於表I中，其中，試劑1_12如圖5B所指示的。由於在用於MALDI-T0F實驗的條件下不穩定,通過在以DNA為模板的Staudinger反應之後，用碘乙醯胺(5mM)處理，捕獲作為烷基硫醚加合物(adduct)的連接硫醇的產物(11_12)(表I中針對11-12的MALDI-T0F數據是被捕獲的硫醚加合物的)。
表I

試劑(見圖5B) j預期質量 j觀察到的質量^
1_5866. 05_5868. 02±9
25922. 16 —5926. 50±9
35942. 15 —5945. 18±9
45937. 13 —5940.98±9
55934. 17 —5934.61±9
6|5942. 15|5944.46 + 9
權利要求
1.ー種通過以核酸為模板的合成來合成反應產物的方法，該方法包括如下步驟 (a)提供ー種混合物，其包含(i)與包含密碼子序列的第一寡核苷酸附著的第一反應単元和(ii)與包含與所述密碼子序列互補的反密碼子序列的第二寡核苷酸附著的第二反應單元； (b)將所述第一寡核苷酸的所述密碼子序列與所述第二寡核苷酸的所述反密碼子序列退火，誘發所述第一和第二反應單元之間的反應，以形成至少與所述第一寡核苷酸共價附著的反應中間產物；以及 (c)將與所述第一反應單元共存的所述反應中間產物與能選擇性地與所述反應中間產物反應的游離反應物混合，由此合成與所述第一寡核苷酸序列附著的反應產物，其中，所述游離反應物與所述反應中間產物的反應活性較之所述游離反應物對來自步驟(a)中提供的所述混合物的反應單元中的至少ー種的反應活性更高。
2.如權利要求
I所述的方法，其中，所述反應產物以高於或等於50%的產率合成。
3.如權利要求
I所述的方法，其中，所述反應產物以高於或等於75%的產率合成。
4.如權利要求
I所述的方法，其中，所述反應產物以高於或等於85%的產率合成。
5.ー種通過以核酸為模板的合成來合成反應產物的方法，該方法包括如下步驟 (a)提供ー種混合物，其包含多種不同的第一反應單元，所述第一反應單元與包含密碼子序列的其各自的第一寡核苷酸相連，其中，所述寡核苷酸序列是與其附著的第一反應單元的指示物； (b)提供與第二寡核苷酸附著的第二反應單元，所述第二寡核苷酸包含與至少ー種第一反應單元的所述密碼子序列互補的反密碼子序列； (C)將至少一種所述第一寡核苷酸的所述密碼子序列與所述第二寡核苷酸的所述反密碼子序列退火，以誘發所述第一和第二反應單元之間的反應，以形成至少與第一寡核苷酸共價附著的第一反應中間產物；以及 (d)將與所述第一反應單元共存的所述第一反應中間產物與能選擇性地與所述第一反應中間產物反應的游離反應物混合，由此合成與所述第一寡核苷酸相連的第一反應產物，其中，所述游離反應物與所述第一反應中間產物的反應活性較之所述游離反應物與來自所述混合物的所述反應単元的至少ー種的反應活性更高。
6.如權利要求
5所述的方法，其還包括如下步驟 (e)提供第三反應單元，其與包含下述反密碼子序列的第三寡核苷酸相連，所述反密碼子序列與至少ー種第一反應單元的所述密碼子序列互補； (f)將所述第一寡核苷酸中至少ー種的所述密碼子序列與所述第三寡核苷酸的所述反密碼子序列退火，以誘發所述第一和第三反應單元之間的反應，以形成至少與至少ー種所述第一寡核苷酸附著的第二反應中間產物；以及 (g)將所述第二反應中間產物與能選擇性地與所述第二反應中間產物反應的游離反應物混合，由此合成與至少ー種所述第一寡核苷酸附著的第二反應產物，其中，所述游離反應物與所述第二反應中間產物的反應活性高於所述游離反應物與所述混合物中的所述反應單元中的至少ー種的反應活性。
7.ー種進行以核酸為模板的合成的體外方法，所述方法包括如下步驟 (a)提供ー種混合物，其包含(i)每種都包含第一反應單元的多種不同模板，所述第一反應單元與限定了密碼子序列的第一寡核苷酸共價附著，以及(ii)包含第二反應單元的轉移單元，所述第二反應單元與限定了反密碼子序列的第二寡核苷酸共價附著，所述反密碼子序列與所述模板的所述密碼子序列互補； (b)將ー種模板的所述密碼子序列和所述轉移単元的所述反密碼子序列退火，以使所述第一反應單元與所述第二反應單元進入反應鄰近狀態，使得所述第一和第二反應單元相互反應，產生反應中間產物；以及 (c)在所述中間反應產物與未反應的模板共同存在的情況下，將所述反應中間產物與游離反應物接觸，所述游離反應物與所述反應中間產物發生化學反應，產生反應產物，其中，所述游離反應物與所述反應中間產物的反應活性比所述游離反應物與起始混合物中至少ー種所述反應単元的反應活性高，並且其中，所述第一寡核苷酸保持與所述反應產物附著。
8.如權利要求
7所述的方法，其中，所述第一反應單元是小分子骨架。
9.如權利要求
7所述的方法，其中，步驟(b)中，所述第一反應單元的官能團被轉化為所述反應中間產物中不同的化學基元。
10.如權利要求
8所述的方法，其中，所述小分子骨架含有受保護的官能團。
11.如權利要求
10所述的方法，其中，在步驟(b)中，所述官能團被去保護，以產生反應中間產物，其中，所述小分子骨架含有去保護的官能團。
12.如權利要求
7所述的方法，其中，所述反應產物 (a)不是核酸；或 (b)不是核苷酸或核苷酸類似物。
13.如權利要求
7所述的方法，其中，在步驟(b)中，所述第一和第二反應單元互相反應，以在沒有核糖體的協助下產生所述反應中間產物。
14.如權利要求
7所述的方法，還包括選擇與所述第一寡核苷酸附著的所述反應產物的步驟。
15.如權利要求
14所述的方法，還包括擴增所述第一寡核苷酸的步驟。
16.如權利要求
15所述的方法，包括如下額外步驟測定與所述反應產物附著的所述第一寡核苷酸的序列，以確定所述反應產物的身份或合成歷史。
17.如權利要求
1-16中任一項所述的方法，其中，所述游離反應物與所述反應中間產物的反應活性是所述游離反應物與起始混合物中至少ー種所述反應單元的反應活性的至少5倍。
18.如權利要求
1-16中任一項所述的方法，其中，所述游離反應物與所述反應中間產物的反應活性是所述游離反應物與起始混合物中至少ー種所述反應單元的反應活性的至少50倍。
19.如權利要求
1-16中任一項所述的方法，其中，所述游離反應物與所述反應中間產物的反應活性是所述游離反應物與起始混合物中至少ー種所述反應單元的反應活性的至少1000倍。
20.如權利要求
17所述的方法，其中，所述游離反應物與所述反應中間產物的反應活性是所述游離反應物與起始混合物中任何所述反應單元的反應活性的至少5倍。
21.如權利要求
18中任一項所述的方法，其中，所述游離反應物與所述反應中間產物的反應活性是所述游離反應物與起始混合物中任何所述反應單元的反應活性的至少50倍。
22.如權利要求
19中任一項所述的方法，其中，所述游離反應物與所述反應中間產物的反應活性是所述游離反應物與起始混合物中任何所述反應單元的反應活性的至少1000倍。
專利摘要
本發明提供了方法和組合物，用於擴大可在以核酸為模板的有機合成期間進行的化學反應的範圍。特別地，以核酸為模板的化學方法用於產生反應中間產物，其與可用於鑑定反應中間產物和/或得到的反應產物的寡核苷酸附著。然後反應中間產物與游離反應物(例如，與寡核苷酸的偶聯是困難的或不切實際的反應物)反應，產生反應產物。該手段擴大了可用於以核酸為模板的合成中的試劑的範圍，將其擴大為不需要或者不能與寡核苷酸聯結的試劑。但是，這些試劑仍允許合成與可用於鑑定反應產物的寡核苷酸附著的反應產物。
文檔編號C12Q1/68GKCN101107357 B發布類型授權 專利申請號CN 200680002864
公開日2013年1月2日 申請日期2006年1月20日
發明者戴維德·劉, 櫻井馨 申請人:哈佛大學校長及研究員協會導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (1),