用於同時分析能夠彼此絡合的蛋白質的校準物/對照物的製作方法

2023-04-25 13:04:56 1

專利名稱：用於同時分析能夠彼此絡合的蛋白質的校準物/對照物的製作方法
技術領域：
本發明涉及組合物和方法，該方法包括改變兩種或更多種蛋白質以抑制其相互識 別和結合。該組合物可在分析檢測時用作能夠檢測改變的和未改變的兩者形式或天然形式 的蛋白質中的一種或多種的參照物、校準物或對照物。
背景技術：
先兆子癇是高血壓、浮腫和蛋白尿的症候群，影響5%到10%的妊娠，並導致大量 的母體和胎兒的發病率和死亡率。先兆子癇每年造成全世界至少200，000例孕產婦死亡。 先兆子癇的症狀通常在妊娠第20周後出現。胎兒和胎盤的發育由若干生長因子介導。血管內皮生長因子(VEGF)是一種內皮 細胞特異性有絲分裂原和血管生成誘導因子。VEGF介導血管滲透性，並已表明參與腎小球 毛細血管的修復。VEGF作為同源二聚體結合到兩種同源跨膜受體酪氨酸激酶(fms樣酪氨 酸激酶(Flt-I)和激酶結構域受體(KDR))中的一種。胎盤生長因子(PlGF)為VEGF家族成員，該成員也與胎盤發育有關。PlGF由細胞 滋養層細胞和合體滋養層細胞表達，並能夠誘導內皮細胞的增殖、遷移和活化。PlGF作為同 源二聚體結合到Flt-I受體，但不結合到KDR受體。PlGF和VEGF兩者均有助於提高有絲分 裂活性和促進血管生成，這對於發育中的胎盤很關鍵。一種可溶形式的Flt-I受體(sFlt-Ι)已在人臍靜脈內皮細胞培養基中被鑑別出， 並隨後在胎盤組織中實現了體內表達。sFlt-Ι是Flt-I受體的剪接變體，缺乏跨膜域和胞 質域。sFlt-Ι以高親和性結合到VEGF，但sFlt-1不促進內皮細胞的有絲分裂。據信sFlt_l 充當「生理性匯點」來抑制VEGF的信號通路。因此，sFlt-Ι含量的調控起到調節VEGF和 VEGF信號通路的作用。精細調控VEGF和VEGF的信號通路對於通過發育中的胎盤中的滋養 層細胞維持適當的增殖、遷移和血管生成是很關鍵的。單個基因進行編碼以用於人P1GF。然而，對成熟PlGF mRNA進行剪接會產生三種 不同長度的同工型P1GF-1(P1GF131)、P1GF-2(P1GF152)和 P1GF-3 (P1GF203)。已報導存在 另一禾中變體 P1GF-4 (Yang，et al, JReprod Immunol, ν 60，ρ53_60，2003 (Yang 等人，《生殖 免疫學雜誌》，第60卷第53-60頁，2003年))。PlGF以糖基化同源二聚體的形式分泌。最近已表明SFlt-I和PlGF可以單獨或聯合用作生物標記來預測、診斷或監測先 兆子癇(Levine et al，NEJM，v 350, ρ 672-683，2004 (Levine等人，《新英格蘭醫學雜誌》， 第 350 卷第 672-683 頁，2004 年))。成熟人PlGF-I的胺基酸序列(胺基酸殘基1-132)已公布，並可得自Protein Data Bank(蛋白質資料庫)，標識為PDB IFZV(Iyer, et al, J. Biol Chem, ν 276，ρ 12153-12161， 2001 (Iyer等人，《生物化學雜誌》，第276卷第12153—12161頁，2001年))。該序列在本文標識為序列標識號1 MLPAVPPQQff ALSAGNGSSE VEVVPFQEVff GRSYCRALERLVDVVSEYPS EVEHMFSPSC VSLLRCTGCC GDENLHCVPVETANVTMQLL KIRSGDRPSY VELTFSQHVR CECRPLREKMKPERC⑶AVP RR對易患先兆子癇或患有先兆子癇的個體的診斷可以通過確定在取自個體的生物 樣品(例如尿液、全血、血清、血漿、唾液等)中的血管內皮生長因子(尤其是P1GF)和/或 受體酪氨酸激酶(尤其是sFlt-Ι)的存在或含量來進行。在分析檢測中，參照物、校準物和 對照物組合物對於確定目的被分析物的含量或確認被分析物的存在，以用於建立準確和精 密的分析檢測是很重要的。只要被分析物易得，可溶於適當的溶劑_對於生物被分析物通 常為含水的、穩定的，並且不會與可能存在於該組合物中的其他組分有害地進行交互，製備 此類液體或乾物形式的組合物通常不會存在困難。如上所述，PlGF結合sFlt-Ι以形成穩 定的締合複合物。因此，不能製備包含一起以獨立量存在的天然蛋白質的組合物，這些天然 蛋白質在分析檢測中適於用作參照物、校準物或對照物來檢測PlGF或sFlt-Ι或檢測PlGF 和sFlt-Ι兩者。雖然可以製備含有各個分離的蛋白質的組合物，但有利的是能夠製備含有 蛋白質兩者一起的組合物。因此，存在對包含這些已知量和獨立量一起的蛋白質的參照物、 校準物或對照物組合物的需求。本發明滿足了該需求。

發明內容
在一個方面，本發明涉及組合物，該組合物含有兩種或更多種蛋白質，該蛋白質中 的一種或多種經過改變以充分地減弱或基本防止或消除相互識別和結合。在分析檢測組合 物中的蛋白質中的一種或多種時，此類組合物可用作參照物、校準物或對照物。為了清楚說明，鑑於形成非共價鍵締合複合物的未改變的/天然蛋白質A和B這 兩種蛋白質，術語「基本防止或消除其相互識別和結合」意指在測定其相互結合的分析中， 改變的A結合到未改變的/天然的B、或未改變的/天然的A結合到改變的B、或改變的A 結合到改變的B不可檢測或幾乎不可檢測，或通過親和常數的測定所定量測量的相互親和 力小於觀察到的未改變的/天然的A與未改變的/天然的B的相互親和力的大約10%。術 語「充分地減弱」意指進行相互結合，但已減弱到對於特定應用為合格的程度。考慮凡是有待在分析檢測中確定未改變的或天然蛋白質A的存在或含量的情況， 該分析檢測採用了蛋白質A表位特異性的一種或多種受體。並且考慮蛋白質A經過改變以 減弱或基本消除與蛋白質B的結合。雖然蛋白質A經過改變，但該表位一直為完整或合格 地完整，使得它們保持識別並結合受體的能力。從而，改變的蛋白質A在校準分析中使用為 合格的，從而確認樣品中未改變的/天然蛋白質A的存在或用於驗證分析未改變的/天然 的蛋白質A的準確性和精密性。因此，受體通常能夠識別並結合改變的和未改變的/天然 形式的蛋白質兩者。包括受體的分析檢測通常為免疫分析法，該分析法使用以下物質作為 受體多克隆或單克隆抗體；完整的、聚合的和/或嵌合形式的抗體或抗體片段。也使用其 他類型的受體，例如適體(US 5, 840, 867 ；US 6，207，388)。在使用蛋白質B表位特異性受 體來測定未改變的/天然蛋白質B的分析檢測中，改變的蛋白質A的表位不必要一直為完 整的。唯一重要的是改變的蛋白質A和蛋白質B的相互識別和結合已充分地減弱或基本消
如果蛋白質A和蛋白質B兩者均被改變以減輕或基本消除其相互識別和結合，那 麼，在測定未改變的/天然蛋白質A的分析檢測中、或在測定未改變的/天然蛋白質B的分 析檢測中、或在分析未改變的/天然蛋白質A和B兩者的分析檢測中(該分析使用蛋白質 A表位特異性受體和蛋白質B表位特異性受體)，這些改變的蛋白質中的表位在分析中保持 識別和結合受體的能力。然後，含有改變的蛋白質A和改變的蛋白質B兩者一起的組合物 可用於校準檢測，從而確認存在未改變的/天然蛋白質A、或存在未改變的/天然蛋白質B、 或存在未改變的/天然蛋白質A和未改變的/天然蛋白質B兩者，並用於驗證檢測的準確 性和精密性。在另一方面，本發明涉及用於分析第一蛋白質或第二蛋白質或分析第一和第二蛋 白質兩者的參照物、校準物或對照物組合物，其中第一蛋白質或第二蛋白質或第一蛋白質 和第二蛋白質的一個或多個胺基酸或一個或多個非胺基酸基團已被刪除、修飾或被不同的 胺基酸基團或非胺基酸基團替換，從而減弱或基本消除了第一蛋白質和第二蛋白質的相互
糹口口。在另一方面，本發明涉及含有受體酪氨酸激酶(優選fms樣酪氨酸激酶，更優選 sFlt-Ι)和血管內皮生長因子(其中任一者或兩者被胺基酸或糖基刪除、修飾或置換而改 變)的組合物。血管內皮生長因子可以是胎盤生長因子，並優選P1GF-1。優選的組合物包 含sFlt-Ι和改變的PlGF-I，改變的PlGF-I使丙氨酸取代以下物質a)序列標識號1的第25位脯氨酸，或b)序列標識號1的第27位穀氨醯胺，或c)序列標識號1的第60位半胱氨酸，或d)序列標識號1的第72位天冬氨酸，或e)序列標識號1的第73位穀氨酸，或f)序列標識號1的第84位天冬醯胺，或g)序列標識號1的第98位脯氨酸，或h)序列標識號1的第100位酪氨酸，或改變的PlGF-I具有取代序列標識號1的第 70位半胱氨酸的甘氨酸、或在a)到h)中的丙氨酸置換和甘氨酸置換的任何組合。優選的組合物包含sFlt_l ；和改變的P1GF-1，其具有取代序列標識號1的第72 位天冬氨酸的丙氨酸和取代序列標識號1的第73位穀氨酸。另一個優選的組合物包含sFlt-l ；和改變的P1GF-1，其具有取代序列標識號1的 第70位半胱氨酸的甘氨酸、取代序列標識號1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代序列標 識號1的第73位穀氨酸的丙氨酸。在另一方面，本發明涉及用於對樣品中蛋白質的檢測進行校準的方法，該方法包 括以下步驟將上述含有已知量的蛋白質的組合物與蛋白質的第一表位特異性受體接觸，從而 形成包含受體和組合物的蛋白質的複合物；將第1)步驟中形成的複合物與蛋白質的第二表位特異性標記受體接觸，從而形 成包含受體、組合物的蛋白質和標記受體的複合物；檢測來自結合的標記受體的信號或來自游離的標記受體的信號；以及，
將來自游離的或結合的標記受體的信號與組合物中已知量的蛋白質相關。在另一方面，本發明涉及用於對樣品中蛋白質的檢測進行校準的方法，該方法包 括以下步驟1)將上述含有已知量的蛋白質的組合物與蛋白質的第一表位特異性的固定的受 體接觸，從而形成包含固定的受體和組合物的蛋白質的複合物；2)將第1)步驟中形成的複合物與蛋白質的第二表位特異性標記受體接觸，從而 形成包含固定的受體、組合物的蛋白質和標記受體的複合物；將結合的標記受體與游離的 標記受體分離；3)檢測來自結合的標記受體的信號或來自游離的標記受體的信號；以及，4)將來自游離的或結合的標記受體的信號與組合物中已知量的蛋白質相關。在另一方面，本發明涉及對樣品中受體酪氨酸激酶和/或血管內皮生長因子的檢 測進行校準的方法，該方法包括以下步驟1)製備含有已知量或預先確定量的受體酪氨酸激酶和已知量或預先確定量的血 管內皮生長因子(其中任一者或兩者如上所述被改變以減弱或基本消除其相互識別和結 合)的組合物；2)將組合物與受體酪氨酸激酶的第一表位特異性受體和/或血管內皮生長因子 的第一表位特異性受體接觸，從而形成受體酪氨酸激酶的第一表位特異性受體和受體酪氨 酸激酶和/或血管內皮生長因子的第一表位特異性受體和內皮生長因子的第一複合物；3)將第2)步驟中形成的複合物與受體酪氨酸激酶的第二表位特異性標記受體和 /或內皮生長因子的第二表位特異性標記受體接觸；從而形成包含受體酪氨酸激酶的第一 表位特異性受體、受體酪氨酸激酶和受體酪氨酸激酶的第二表位特異性標記受體和/或內 皮生長因子的第一表位特異性受體、內皮生長因子和內皮生長因子的第二表位特異性標記 受體的第二複合物；4)將結合的受體酪氨酸激酶的特異性標記受體與游離的受體酪氨酸激酶的特異 性標記受體分離和/或將結合的內皮生長因子的特異性標記受體與游離的內皮生長因子 的特異性標記受體分離；5)檢測來自結合的受體酪氨酸激酶的特異性標記受體的信號或來自游離的受體 酪氨酸激酶的特異性標記受體的信號；和/或，6)檢測來自結合的內皮生長因子的特異性標記受體的信號或來自游離的內皮生 長因子的特異性標記受體的信號；和7)將來自游離的或結合的受體酪氨酸激酶的特異性標記受體的信號和/或來自 游離的或結合的內皮生長因子的特異性標記受體的信號與組合物中已知量的受體酪氨酸 激酶和/或內皮生長因子相關。在一個優選的實施例中，受體酪氨酸激酶為sFlt-Ι並且內皮生長因子為P1GF-1， 該PlGF-I已被改變以使丙氨酸取代以下物質a)序列標識號1的第25位脯氨酸，或b)序列標識號1的第27位穀氨醯胺，或c)序列標識號1的第60位半胱氨酸，或d)序列標識號1的第72位天冬氨酸，或
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e)序列標識號1的第73位穀氨酸，或f)序列標識號1的第84位天冬醯胺，或g)序列標識號1的第98位脯氨酸，或h)序列標識號1的第100位酪氨酸，或改變的PlGF-I具有取代序列標識號1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、或在a)到h) 中的丙氨酸置換和甘氨酸置換的任何組合。在一個更優選的實施例中，受體酪氨酸激酶為sFlt-Ι並且內皮生長因子為 PlGF-I，該PlGF-I已被改變以使丙氨酸取代序列標識號1的第72位天冬氨酸以及使丙氨 酸取代序列標識號1的第73位穀氨酸。在另一個更優選的實施例中，受體酪氨酸激酶為sFlt-Ι並且內皮生長因子為 PlGF-I，該PlGF-I已被改變以使甘氨酸取代序列標識號1的第70位半胱氨酸、使丙氨酸取 代序列標識號1的第72位天冬氨酸以及使丙氨酸取代序列標識號1的第73位穀氨酸。另一方面，本發明涉及測定樣品中蛋白質的量或確認樣品中蛋白質存在的方法， 該方法包括以下步驟a)將樣品與蛋白質的第一表位特異性的固定的受體接觸，從而形成包含蛋白質的 第一表位特異性的固定的受體和蛋白質的第一複合物；b)將第一複合物與蛋白質的第二表位特異性標記受體接觸，從而形成蛋白質的第 一表位特異性受體、蛋白質和蛋白質的第二表位特異性標記受體的第二複合物；c)將在第二複合物中結合的標記受體與游離的標記受體分離；d)測定來自在第二複合物中結合的標記受體的信號或來自游離的標記受體的信 號；e)將蛋白質的第一表位特異性的固定的受體與上述含有已知量或預先確定量的 蛋白質的組合物接觸，從而形成包含蛋白質的第一表位特異性的固定的受體和組合物的蛋 白質的第三複合物；f)將第三複合物與蛋白質的第二表位特異性標記受體接觸，從而形成蛋白質的第 一表位特異性受體、組合物的蛋白質和蛋白質的第二表位特異性標記受體的第四複合物；g)將在第四複合物中結合的標記受體與游離的標記受體分離；h)測定來自在第四複合物中結合的標記受體的信號或來自游離的標記受體的信 號；和i)比較d)和h)中測定的信號，進而確認蛋白質存在或測定樣品中蛋白質含量。在一個優選的實施例中，待測定的蛋白質為血管內皮生長因子。在一個更優選的 實施例中，待測定的蛋白質為P1GF，尤其是P1GF-1，並且組合物中的第二蛋白質為受體酪 氨酸激酶。在一個更優選的實施例中，待測定的蛋白質為PlGF-I並且組合物中的第二蛋白 質為sFlt-Ι。在一個更優選的實施例中，待測定的蛋白質為P1GF-1，組合物中的第二蛋白 質為sFlt-Ι，組合物的PlGF-I已被改變以具有取代以下物質的丙氨酸a)序列標識號1的第25位脯氨酸，或b)序列標識號1的第27位穀氨醯胺，或c)序列標識號1的第60位半胱氨酸，或d)序列標識號1的第72位天冬氨酸，或
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e)序列標識號1的第73位穀氨酸，或f)序列標識號1的第84位天冬醯胺，或g)序列標識號1的第98位脯氨酸，或h)序列標識號1的第100位酪氨酸，或改變的PlGF-I具有取代序列標識號1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、或在a)到h) 中的丙氨酸置換和甘氨酸置換的任何組合。在一個更優選的實施例中，待測定的蛋白質為P1GF-1，組合物中的第二蛋白質為 sFlt-Ι，並且組合物的PlGF-I具有取代序列標識號1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代 序列標識號1的第73位穀氨酸的丙氨酸。在另一個更優選的實施例中，待測定的蛋白質為P1GF-1，組合物中的第二蛋白質 為sFlt-Ι，並且組合物的PlGF-I具有取代序列標識號1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、取 代序列標識號1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代序列標識號1的第73位穀氨酸的丙氨酸。


圖IA示出了基於ELISA的P1GF-1變體結合到Flt-I的可溶性部分。用濃度在1 和16ng/ml之間的範圍遞增的可溶性蛋白質進行PlGF-I變體到人Flt-I (以0. 5 μ g/ml在 96孔板上塗布)的結合。野生型PlGF-I用作陽性對照。圖IB示出了基於ELISA的P1GF-1變體結合到Flt-I的可溶性部分。計算P1GF-1 變體在濃度為8ng/ml時的結合相對於野生型PlGF-I的結合的百分比。所示結果代表三次 獨立實驗的平均值。圖2示出了三種PlGF重組蛋白質的純度。銀染(A 通道1、2和3)和用單克隆 Rat-4進行的蛋白質印跡出通道4、5和6)。通道分配M :SeaBlue Iadder(Invitrogen)； 通道 1、4 :P126(DE)；通道 2、5 :P126 (AA)以及通道 3、6 :P126 (GAA)。
具體實施例方式雖然本發明將以與先兆子癇和生物標記蛋白質sFlt-Ι和PlGF-I相關的某些優選 的實施例進行描述，但應當理解本發明涉及任何蛋白質組合物及其用途，其中該組合物的 一種或多種蛋白組分已被改變以減弱相互識別和結合。不管先兆子癇生物標記蛋白質是使用單個分析平臺或單個試劑盒測定，或在獨立 分析或試劑盒中獨立地測定，有利的是具有在同一配方中包含生物標記蛋白兩者一起的對 照物或校準物，這兩種生物標記蛋白具有已知的或預先確定的濃度和所需的濃度比率。至 少有兩個問題與一起使用天然或未改變形式的sFlt-Ι和PlGF來製備參照物、校準物或對 照物組合物相關首先sFlt-Ι和PlGF通過上述每一個蛋白質上存在的特定結合域彼此結 合；其次，在中期到晚期孕婦的血清中，無論她們是否患有先兆子癇，sFlt-Ι相對於PlGF通 常都顯著過剩。由於PlGF幾乎可以定量結合到sFlt-Ι，因此，將未修飾的或天然的PlGF與 未修飾的或天然的sFlt-Ι —起混合併保存，在用於校準PlGF或sFlt-1的檢測的分析的組 合物中不會起到符合要求的作用。已對PlGF進行了胺基酸置換以減弱或基本消除sFlt-Ι和PlGF的相互識別和結合(Errico et al J. Biol. Chem. 279，43929-43939，2004 (Errico 等人，《生物化學雜誌》，第 279卷第43929-43939頁，2004年))。這些胺基酸置換對PlGF的整個蛋白質結構沒有顯著 的影響。結合表位一直為完整的，並使得這些改變的蛋白質與組合物中的sFlt-1 —起混合 和保存用作分析檢測的參照物、校準物或對照物，這些分析檢測設計用於檢測未改變的或 天然P1GF、未改變的或天然sFlt-Ι或兩者。由於可獲得PlGF的胺基酸序列和三維晶體結構，因此為針對PlGF進行胺基酸修 飾、刪除或置換以便減弱或基本消除與sFlt-Ι的結合提供了便利。通常，有利的是知道結合蛋白質的二級、三級和四級結構、翻譯後修飾(如磷酸 化、糖基化、硫酸化和泛素化)、三維晶體結構以及與之共同形成締合複合物的蛋白質的三 維晶體結構。然而，該信息對於實踐本發明是不需要的。雖然可進行與翻譯後修飾相關的 基團修飾、刪除或置換，但優選可相互識別和結合的蛋白質中的一種或多種的一個或多個 胺基酸的修飾、刪除或置換。蛋白質位點特異性化學修飾為本領域所熟知(Techniques in Protein Modif ication, Lundblad RL, CRC Press，1995 (《蛋白質修飾技術》，Lundblad RL, CRC 出版社，1995 年)Chemical Reagents for Protein Modification, Lundblad, RL, CRCPress, 3rd Ed，2005 (《蛋白質修飾化學試劑(第三版)》，Lundblad，RL，CRC出版社，2005 年))。可用胺基酸化學/合成修飾實踐本發明。優選的方法涉及基因工程技術。直接獲 得蛋白質的胺基酸序列是本領域的標準作法。相似地，從編碼蛋白質的基因的核苷酸序列 間接獲得蛋白質的胺基酸序列是本領域的標準作法。可輕易地獲得基因的核苷酸序列。並 且，當可獲得該基因時，可進行定點誘變以刪除、置換或修飾一個或多個胺基酸。可以隨機 的方式或預定的方式進行。用定點誘變改變或突變的蛋白質可被克隆並易於得到。蛋白 質和基因工程的詳細資料和方案易於從許多出版物和其中的引用文獻中得到(Molecular Cloning,Sambrook Jand Russell Dff,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002( Vjf 子克隆》，Sambrook J 和 Russell Dff,Cold Spring Harbor Laboratory 出版社，2002 年)； Recombinant Gene Expression Protocols, Tuan RSed, Humana Press, 1997 (《重組基因 的表達方案》，Tuan RS 編輯，Humana 出版社，1997 年)^Methods in Molecular BioIory andProtein Chemistry, Spangler BD, John Wiley & Sons Ltd. 2002 (《分子生物學和蛋 白質化學方法》，Spangler BD, John Wiley &SonsLtd.，2002 年);Genetic EnRineerinR Fundamentals, Kammermeyer Kand Clark VL, Marcel Dekker Inc, 1989 (《基因工禾呈基本 原理》，Kammermeyer K 禾口 Clark VL, Marcel Dekker Inc, 1989 年)；Mayo etal, Nature ν 306，ρ 86-88，1983 (Mayo 等人，《自然》，第 306 卷第 86-88 頁，1983 年)；Suggs et al,Proc Nat Acad Sci USA ν 78，ρ6613_6617 1981 (Suggs等人，《美國國家科學院院刊》，第78卷 第 6613-6617 頁，1981 年)；Scott et al Nature ν 302，ρ 538-540，1983 (Scott 等人，《自 然》，第 302 卷第 538-540 頁，1983 年)；Helfman et al, Proc Nat Acad Sci USA, ν 80，ρ 31-35，1983 (HeIfman等人，《美國國家科學院院刊》，第80卷第31-35頁，1983年)；Young et al, Proc Nat Acad Sci USA, ν 80，ρ 1194-1198，1983 (Young 等人，《美國國家科學院 院刊》，第 80 卷第 1194-1198 頁，1983 年)；US 4, 237, 224 ；US 4, 273, 875 ；US 4, 293, 652 ； US4, 870，009)。可檢測改變的蛋白質來測定與它的伴侶蛋白質的相互識別和結合是否已減弱或 基本消除。可使用本領域熟知的實驗方案進行該檢測。也可用表位特異性受體/抗體來
12檢測改變的蛋白質，以測定表位相比於未改變的或天然蛋白質是否充分地保持了原狀。 可定量地或定性地鑑別親和力。(Errico et al, J Biol Chem, ν 279，ρ 43929-43939， 2004 (Errico等人，《生物化學雜誌》，第279卷第43929-43939頁，2004年)；Piehler et al, J Immunol Methods, ν 201 (2)，ρ189_206，1997 (Piehler 等人，《免疫學方法雜誌》， 第 201 卷第 2 期第 Ι89-2。6 頁，1"7 年)；Casasnovas et al, ν 270, ρ 13216-13224, 1995 (Casasnovas 等人，第 270 卷第 13216-13224 頁，1995 年)；Boone etal, J Virol, ν 11， P 515-519，1973 (Boone等人，《病毒學雜誌》，第11卷第515-519頁，1973年)；美國專利 7，081，346 ；US7, 081，346 ；US 5，324，633 ；US 4，340，668 ；US 2005/0175999)。無論基團(胺基酸和/或非胺基酸)的性質如何改變，或蛋白質性質如何改變(基 團的修飾(直接化學修飾氧化、還原等)、刪除或置換)，無論參與相互識別和結合的蛋白 質中的一個或每一個被改變，兩個重要的功能特徵是1)改變的蛋白質與未改變的伴侶蛋 白質的相互識別和結合的特性、或當每一個已被改變時伴侶蛋白質的結合使得相互識別和 結合被充分地減弱或基本消除，以及2)如果該特性如前所討論為特定的應用所需的話，任 何改變的蛋白質中的一個或多個表位保持的結合特性與未改變的或天然蛋白質中的表位 充分地類似或基本相同。實例I人PlGF-I和變體、sFlt-Ι、涉及人PlGF的抗人PlGF-I抗體、與sFlt-Ι結合的PlGF 和變體的結合特性、ELISA分析測定PlGF和其他材料以及實驗方案在Errico et al,J Biol Chem, ν 279，ρ 43929-43939，2004 (Errico 等人，《生物化學雜誌》，279 卷第 43929-43939 頁，2004年)中描述，並在本文中部分再現。關於本文沒有明確說明的細胞培養、質粒、細胞 系的選擇和其他材料以及實驗方案，可查閱Errico等人的參考文獻獲取詳細內容。材料如Errico等人所述，抗人PlGF單克隆抗體和人Flt-I (Flt-1/Fc嵌合體)可得自 R&DSystems (Minneapolis,Minnesota USA)。羊抗小鼠 IgG-辣根過氧化物酶(HRP)可得自 Santa Cruz Biotechnology(SantaCruz, California USA ;www. scbt. com)。PlGF變體的構建Errico等人用PCR技術獲得PlGF變體，該PCR技術使用稱為pchPlGF-1的質粒作 為模板進行，並且PCR使用映射區域的互補引物進行，該區域對有待突變為丙氨酸的氨基 酸進行編碼並且進行特定的核苷酸修飾。為了製備具有雙重突變的PlGF變體，採用具有突 變兩者的引物。將擴增的DNA純化，並用來轉化感受態細菌。用雙脫氧核苷酸法對質粒進行 雙向測序。以下PlGF-I單個殘基突變為丙氨酸Asn-16、Pro-25、Gln-27、Cys-60、Asp-72、 Glu-73、Asn-74、Asn-84、Pro-98 和 Tyr-100。也產生 P1GF-1 的雙重突變體Asp 72 突變為 Ala, Glu 73 突變為 Ala。含有改變的PlGF-I的校準物/對照物組合物通過將未改變的sFlt-Ι與改變的P1GF-1、尤其是雙重突變體(其中丙氨酸置換序 列標識號1的第72位天冬氨酸以及序列標識號1的第73位穀氨酸)、或三重突變體(其中 還有另一個突變為甘氨酸置換第70位半胱氨酸)混合來製備含有改變的PlGF-I和sFlt-1 的校準物/對照物。這些組合物可以由乾物形式的製劑或由工作儲備水溶液單獨混合而 成，其中工作儲備水溶液是使用在所需PH的任何合適的緩衝液(例如磷酸鹽(PBS)，pH7. 5)
13所製備，包含任何其他可用的或所需的附加物(例如抗氧化劑、防腐劑等)。為了進行示意 性的說明，改變的PlGF-I的濃度在0到約1000pg/mL的範圍內，並且sFlt_l固定在IOOpg/ mL，但兩者可以使用其他濃度範圍。將未改變的sFlt-Ι與雙重突變體或三重突變體的改變 PlGF 混合於 PBS (10g NaCl.O. 25g KCl、1.8g Na2HP04、0. 3g KH2PO4,pH7. 5)中以產生以下參
照物、校準物或對照物組
ELISA 法檢測 PlGF用檢測PIGF的ELISA法確定取自孕婦血清樣品中的PlGF的量。用含有上述改變 的PlGF-I和sFlt-Ι的溶液組校準ELISA (以下詳細描述)。觀察到的該組的每一個PIGF-I 水平的信號與改變的PlGF-I的濃度相關。該關聯可以圖形形式表示或用適當的統計學和 數學校準方法相聯繫。將在使用血清樣品的ELISA分析中所觀察到的信號與校準圖形作比 較，以確定樣品中PIGF的濃度或用建立的數學聯繫轉化為濃度單位。按如下操作進行ELISA 為了測定樣品中的PIGF，用1 μ g/ml抗人P1GF-1單克 隆抗體的PBS溶液塗布96孔板，每孔100 μ 1，並在4°C下孵育過夜。用含0. 05 %的TWEEN 20 (PBT)的PBS清洗孔一次，通過每孔加入280 μ 1的1 %牛血清白蛋白的PBS溶液並在室 溫(RT)下孵育3小時來封閉非特異性結合位點。將孔脫氣並保持在冷態下直至使用。檢 測期間，每一個校準物水平或血清樣品取100 μ 1，並用PBET (含有0. 牛血清白蛋白、5mM EDTA、0. 05%的Tween 20)適當稀釋，然後在37°C下孵育1小時。用PBT清洗孔五次，並加 入另一種用PBET稀釋到37ng/ml的抗人PlGF-I單克隆抗體(此抗體為HRP共軛的)，並在 37°C下孵育1小時。用PBT清洗孔五次，加入100μ 1由lmg/ml的鄰苯二胺(溶於50mM檸 檬酸磷酸鹽緩衝液，PH5)和0. 006% H2O2組成的HRP底物，並在室溫暗處孵育30分鐘。每 孔加入25 μ 1的4當量H2SO4終止反應，用微板讀數器在490nm處測定信號吸光度。改變的PIGF-I和未改變的PlGF與sFlt_l結合的比較Errico等人描述了測定改變的PIGF-I和未改變的/天然PlGF-I與Flt-I結合的 實驗。基本上，96 孔板用 0. 5 μ g/ml 的可溶性人 Flt-I (Flt-l/Fc chimera)的 PBS (ρΗ7· 5) 溶液塗布，每孔100 μ 1，並在室溫下孵育過夜。用PBT清洗板五次，在用上述的牛血清白蛋 白溶液封閉孔的非特異性位點後，通過向孔中加入改變的PlGF-I或未改變的/天然PlGF 以使結合反應進行，在37°C下孵育1小時並在室溫下孵育1小時。如上所述用PBT清洗孔並用生物素醯化的抗人PlGF-I多克隆抗體孵育(300ng/ml，溶於PBET中)，在37°C下孵育 1小時並在室溫下孵育1小時。如上所述用ELISA分析法進行檢測，比較用改變的PIGF-I 和未改變的/天然PlGF-I獲得的信號。Errico等人獲得的結果在圖IA和圖IB中得到再 現。實例II比較重組 PlGF(DE)和 PlGF(AA)實驗目的:就以下兩種情況評估兩種重組PIGF蛋白質(1)它們與人PIGF特異性單克隆抗 體的結合活性；以及(2)它們與sFlt的結合活性，即配體受體複合物的形成。材料和試劑(1)重組 PlGF 使用兩種形式的純化的重組P1GF。該蛋白質由21個不屬於PIGF的胺基酸前導序列組成。前導序列含有「6XHis」 標籤和4-胺基酸Xa識別和裂解位點。前導序列序列標識號2 :MRGSHHHHHHGSGSGSGIEGRPlGF (DE)中的PlGF部分序列胺基酸序列對應野生型PIGF的序列標識號1中第 4-132位胺基酸，從而導致以下的DE胺基酸序列序列標識號3:AVPPQQffALS AGNGSSEVEV VPFQEVffGRS YCRALERLVD VVSEYPSEVEHMFSPSCVSL LRCTGCCGDE NLHCVPVETA NVTMQLLKIR SGDRPSYVELTFSQHVRCEC RPLREKMKPE RC⑶AVPRRPlGF (AA)中的PIGF部分序列胺基酸序列對應野生型PIGF的序列標識號1中第 4-132位胺基酸，具有在序列標識號1的第72和73位胺基酸處製備的兩個突變，從而導致 以下AA胺基酸序列序列標識號4:AVPPQQffALS AGNGSSEVEV VPFQEVffGRS YCRALERLVD VVSEYPSEVEHMFSPSCVSL LRCTGCCGAA NLHCVPVETA NVTMQLLKIR SGDRPSYVELTFSQHVRCEC RPLREKMKPE RC⑶AVPRR(2)重組 sFlt 得自 Scios Inc. (Mountain View, California USA ；www. sciosinc. com)(批號 9225-89)的全長sFlt，由687個可溶性fms樣酪氨酸激酶1 (sFlt_l)的胺基酸組成。sFlt-Ι 序列序列標識號5:MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSKLKDPELSLKGTQHIMQAGQTLHLQCRGEAAHKWSLPEMVSK ESERLSITKSACGRNGKQFCSTLTLNTAQANHTGFYSCKYLAVPTSKKKETESAIYIFISDTGRPFVEMYSEIPEII HMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTH RQTNTIIDVQISTPRPVKLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKRASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDK MQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDKAFITVKHRKQQVLETVAGKRSYRLSMKVKAFPSPEVVWLKDGLPAT EKSARYLTRGYSLIIKDVTEEDAGNYTILLSIKQSNVFKNLTATLIVNVKPQIYEKAVSSFPDPALYPLGSRQILTCTAYGIPQPTIKWFWHPCNHNHSEARCDFCSNNEESFILDADS匪GNRIESITQRMAIIEGKNKMASTLVVADSRISG IYICIASNKVGTVGRNISFYITDVPNGFHVNLEKMPTEGEDLKLSCTVNKFLYRDVTWILLRTVNNRTMHYSISKQK MAITKEHSITLNLTIMNVSLQDSGTYACRARNVYTGEEILQKKEITIRGEHCNKKAVFSRISKFKSTRNDCTTQSNV KH (3)人sFlt-Ι和人PlGF的單克降抗體
0134]單克隆抗體名稱來源目錄號批號克隆號0135]RD-I小鼠抗sFltRDSysCGG07605B495600136]RD-2小鼠抗sFltRDSysBYC01605A495430137]Rat-I大鼠抗PlGFRDSys不適用11039253589030138]Rat-2大鼠抗PlGFRDSys不適用11039333589390139]Rat-3大鼠抗PlGFRDSys不適用11039313589320140]Rat-4大鼠抗PlGFRDSys不適用11039263589050141]Rat-5大鼠抗PlGFRDSys不適用11039273589070142]MS-I小鼠抗PlGFRDSysMAB264不適用37203實驗實例(I)ELISA 分析 1 用0. 5 μ g/mL的重組PlGF (DE)或PlGF (AA)塗布高結合微孔板並用BSA/PBS封 閉·標準的ELISA步驟由以下組成將單克隆抗體稀釋於酪蛋白/PBS中；將HRP標 記的驢抗小鼠IgG或驢抗大鼠IgG以1 3K稀釋於酪蛋白/PBS中；每孔加入100μ L樣品 或綴合物體積；每一個步驟在37°C /30分鐘/振搖條件下孵育；清洗板6次，100 μ L的OPD 底物在25°C下顯色30分鐘；加入25 μ L的終止溶液；記錄492nm處的OD值。·分析1的ELISA結果在表1中示出。表1抗PIGF單克隆抗體與重組PIGF (未改變的和改變的)的識別 ·結論所有檢測的單克隆抗體對PlGF(DE)和PlGF(AA)兩者均做出反應，指示出 D72/E73A突變沒有影響單克隆抗體的結合併且這些抗體表位的位點不在這兩個突變位點 處。(2) ELISA 分析 2 用0. 5 μ g/mL的重組PlGF(DE)或PlGF(AA)塗布高結合微孔板並用BSA/PBS封 閉·標準ELISA步驟由以下組成第一板使用以不同的濃度稀釋於酪蛋白/PBS的 sFlt孵育；第二板使用含有RD-I和RD-2兩種單克隆抗體(每一種的濃度為0. 1 μ g/mL)的抗sFlt混合溶液孵育；第三板使用HRP標記的驢抗小鼠IgG(以1 4K稀釋於酪蛋白/ PBS中)孵育；以及第四板使用100 μ L的OPD底物孵育，使OPD底物在25°C下顯色30分 鍾。第一、第二和第三板孵育步驟為37°C下振搖15-20分鐘；每一個步驟之間清洗板6次。 第4次孵育後加入25 μ L的終止液並記錄492nm處的OD值。·分析2的ELISA結果在表2中示出。表2sFlt ^nm PIGF( Bt奪的和未奪的)的結合 ·益論=SFlt與塗布的PlGF(DE)形成受體配體複合物。然而，使用PlGF(AA)突 變體時，這種複合物的形成極大地減少，指示出序列標識號1的第72和73位胺基酸對於 sFlt-1結合和複合物的形成是十分重要的。(3) Biacore 分析.sFlt 經 NHS/EDC 與 RU = 6738 偶聯固定於 Biacore 晶片 FC-2 上。FC-1 為空白， 作為陰性對照。·將PlGF(DE)或PlGF(AA)注入FC-1和FC-2來評估複合物的形成· Biacore結果在表3中示出。表3 sFlt :P1GF 複合物的 Biacore 測定
CM5晶片重組人 PlGF 20 μ g/mLPlGF (DE)PlGF (AA)FCl: Bicore (RU) t2· FC2空白 sFlt11 15612 30-FCl14518· M^ 注入的PlGF(DE)結合於固定的sFlt，從而形成受體配體複合物，而注入 的PlGF(AA)與固定的sFlt的結合較弱。實例III野生型重組PlGF和兩個額外的PlGF突變體之間的比較實驗目的:構建三種額外的重組PlGF蛋白質，並進行評價以用於⑴它們與人PIGF特異性 單克隆抗體的結合活性；以及(2)它們與sFlt的結合活性，即配體受體複合物的形成。材料和試劑(1)按照如下方式構建三種額外的重組PlGF蛋白質-P 126 (DE)重組PlGF野生型序列標識號6 MRGSAVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSP
17
SCVSLLRCTGCCGDENLHCVPVETANVTMQLLKIRS⑶RPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERCGDAVGPGQIVGGVYLL前四個胺基酸殘基為無關胺基酸(MRGS)；最後的十個胺基酸為IOG表位(C端標 籤)；位於IOG表位前面的兩個胺基酸也是無關胺基酸(Gly-Pro)；在無關胺基酸(即在 MRGS之後開始和在GP之前)之間的126位胺基酸序列是與序列標識號1的第4至129位 胺基酸相同的PlGF序列。-P 126 (AA) =PlGF突變體1 序列標識號7 MRGSAVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCCGMNLHCVPVETANVTMQLLKIRS ⑶ RPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERCGDAVGPGQIVGGVYLL與P126(DE)類似，不同的是帶下劃線的胺基酸(AA)是兩個突變的胺基酸-P 126 (GAA) =PlGF 突變體 2 序列標識號 8 MRGSAVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCGGMNLHCVPVETANVTMQLLKIRS ⑶ RPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERCGDAVGPGQIVGGVYLL與PlGF突變體1 P126(AA)類似，不同的是在AA前二位的胺基酸的另外突變是由 C突變為G所有三種重組蛋白質都在細菌中表達並都形成不溶性包涵體。超聲波降解後，用 4M尿素的PBS溶液和2M尿素的PBS溶液洗滌，包涵體最終溶解於8M尿素/15mM還原穀胱 甘肽(GSH)/50mM Tris-HCL(pH7. 8)中。PlGF蛋白質通過以下三個步驟的透析進行再折 疊(1)在透析緩衝液中透析24小時，該透析緩衝液包含3M尿素/50mM TRIS (pH7. 5) /2mM EDTA/0. 2M精氨酸/2mM GSH ； (2)在透析緩衝液中透析24小時，該透析緩衝液包含2M尿素 /50mM TRIS (pH7. 5)/2mM EDTA/0. 2M 精氨酸/1. 2mM GSH/0. 4mM 氧化穀胱甘肽(GSSG)；以 及(3)在透析緩衝液中透析24小時，該透析緩衝液包含0. 8M尿素/20mM TRIS (pH7. 5) /2mM EDTA/0. 2M精氨酸/0. 48mM GSH/0. 16mMGSSG。通過將透析的蛋白質溶液裝載到親和柱中來 進一步純化再摺疊的PIGF，通過交聯IOG標籤特異性單克隆抗體和CNBr活化的S印harose 4Fast Flow(瓊脂糖凝膠4FF)樹脂(GE目錄號17-0981-01)而製備。然後用40%的乙腈 洗提結合的PIGF。最後在緩衝液交換為PBS後得到純化的PIGF蛋白質。(2)抗人PIGF單克隆抗體、抗人sFlt單克隆抗體可得自R&D Systems (Minneapolis, Minnesota USA) ；HRP 標記的驢抗大鼠 IgG (目錄號 712-035-150) 可得自 Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (WestGrove, Pennsylvania, USA)； ELISA 板為得自 Corning Life Sciences 的 Costar hind binding (目錄號 2592)；電泳凝 膠 NuPAGE 4-12%、PVDF 轉移膜和 SeeBlue ladder 得自 Invitrogen (Carlsbad CA, USA)； 阻滯劑酪蛋白/PBS和SuperSignal West Dura蛋白質印跡底物購自Pierce (Rockford，IL， USA)。CNBr活化的S印harose 4 Fast Flow (瓊脂糖凝膠4FF)樹脂(目錄號17-0981-01) 和銀染試劑盒(目錄號 17-1150-01)得自 GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)實驗實例(1)重組PlGF 圖2示出了通過銀染和蛋白質印跡方法檢測的三種PIGF重組蛋白 質的純度。 ·高結合微孔板用0. 5 μ g/mL的重組P126 (DE)或P126 (AA)或P126 (GAA)塗布並 用BSA/PBS封閉·標準的ELISA步驟由以下組成將單克隆抗體稀釋於酪蛋白/PBS中；將HRP標 記的驢抗小鼠IgG或驢抗大鼠IgG以1 3K稀釋於酪蛋白/PBS中；每孔加入100μ L樣品 或綴合物體積；每一個步驟在37°C /30分鐘/振搖條件下孵育；清洗板6次，100 μ L的OPD 底物在25°C下顯色30分鐘；加入25 μ L的終止溶液；記錄492nm處的OD值。· ELISA結果在表4中示出。
表4抗PIGF單克隆抗體與重組PIGF (未改變的和改變的)的識別
塗布的重組
PlGF (0. 5 μ g/mL)
對塗布的PIGF的抗體結合活性(OD)
Pl26(DE) P126(AA) Pl 26 (GAA)
Ing/mL 的抗體
抗PIGF單克隆抗體名稱、克隆號和濃度(ng/mL)
Ms-IRatiRat2Rat4372033589033589393589051. 0231. 3681. 4971. 6340. 9671. 3011. 6331. 6811. 1341. 2261. 5301. 591
10ng/mL 的抗體
Rat3Rat53589323589070. 7790. 8340. 6810. 6970. 8060. 799·結論所有檢測的單克隆抗體都對P126 (DE)、P126 (AA)和P126 (GAA)做出反應， 指示出D72A/E73A的雙重突變和C70G/D72A/E73A的三重突變沒有影響單克隆抗體結合併 且這些抗體表位的位點不在這些突變位點處。(3) ELISA 分析 2 ·高結合微孔板用0. 5 μ g/mL的重組P126 (DE), P126 (AA)和P126 (GAA)塗布並用 BSA/PBS 封閉·標準ELISA步驟由以下組成第一板使用以不同的濃度稀釋於酪蛋白/PBS的 sFlt孵育；第二板使用含有RD-I和RD-2的兩種單克隆抗體(每一種的濃度為0. 1 μ g/mL) 的抗sFlt混合溶液孵育；第三板使用HRP標記的驢抗小鼠IgG(以1 4K稀釋於酪蛋白/ PBS中)孵育；以及第四板使用100 μ L的OPD底物孵育，使OPD底物在25°C下顯色30分 鍾。第一、第二和第三板孵育步驟為37°C下振搖15-20分鐘；每一個步驟之間清洗板6次。 第4次孵育後加入25 μ L的終止液並記錄492nm處的OD值。
ELISA結果在表5中示出。
表5sFlt與重組PIGF (改變的和未改變的)的結合塗布的重組PlGFsFlt與塗布的PIGF形成複合物(0. 5 μ g/mL)孵育時sFl t的浪度(ng/mL)180060020066. 67BSA (對照)0. 0090. 0080. 0050. 003Pl26 (DE)>31. 8330. 8330. 347P126(AA)0. 2100. 1820. 1150. 143Pl26 (GAA)0. 1500. 1010. 0950. 088*用小鼠抗sFU和HRP標記的抗小鼠綴合物檢測結合的sFU: PIGF複合物
19
·結論sFlt與塗布的P126 (DE)形成受體配體複合物。然而，使用P126 (AA)突 變體和P126(GAA)突變體時，這種複合物的形成極大地減少，指示出序列標識號1的第70、 72和73位胺基酸對於sFlt-Ι結合和複合物的形成是十分重要的。(4) ELISA 分析 3 用0. 5 μ g/mL的重組sFlt塗布高結合微孔板並用BSA/PBS封閉·標準ELISA步驟由以下組成第一板使用以不同的濃度稀釋於酪蛋白/PBS的 P126 (DE)或 P126 (AA)或 P126 (GAA)孵育；第二板使用 0. 1 μ g/mL 的抗 PIGF Rat-4 單克隆 抗體溶液孵育；第三板使用HRP標記的驢抗大鼠IgG(以1 4K稀釋於酪蛋白/PBS中)孵 育；以及第四板使用100 μ L OPD底物孵育，使OPD底物在25°C下顯色30分鐘。第一、 第二和第三板孵育步驟為37°C下振搖15-20分鐘；每一個步驟之間清洗板6次。第4次孵 育後加入25 μ L的終止液並記錄492nm處的OD值。· ELISA結果在表6中示出。
結論未改變的P1GF、P126(DE)與塗布的sFlt形成配體受體複合物。然而，改 變的PlGF (P126 (AA)和P126(GAA))未能形成此類複合物，指示出序列標識號1的第70、72 和73位胺基酸對於sFlt結合和複合物的形成是十分重要的。本發明具體實施例的描述出於示例性的目的。本發明並非意圖進行窮舉性的說明 或將本發明的範圍限制為本文所述的具體形式。本領域的普通技術人員將理解，如權利要 求書中所述，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下可進行各種修改。本文引用的所有專利、專利申請和出版物據此以引用方式併入。
權利要求
一種用於分析第一蛋白質或第二蛋白質或第一蛋白質和第二蛋白質兩者的參照物、校準物或對照物組合物，其中所述第一蛋白質或所述第二蛋白質或所述第一蛋白質和所述第二蛋白質的一個或更多個胺基酸或一個或更多個非胺基酸基團已被刪除、修飾或被不同的胺基酸或非胺基酸基團置換，從而減弱或基本消除了所述第一蛋白質和所述第二蛋白質的相互結合。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述第一蛋白質為受體酪氨酸激酶並且所述第 二蛋白質為血管內皮生長因子。
3.根據權利要求2所述的組合物，其中所述血管內皮生長因子為P1GF。
4.根據權利要求2所述的組合物，其中所述血管內皮生長因子為P1GF-1。
5.根據權利要求2所述的組合物，其中所述受體酪氨酸激酶為sFlt-1。
6.根據權利要求2所述的組合物，其中所述受體酪氨酸激酶為sFlt-1並且所述血管內 皮生長因子為P1GF。
7.根據權利要求2所述的組合物，其中所述受體酪氨酸激酶為sFlt-Ι並且所述血管內 皮生長因子為PlGF-I。
8.根據權利要求4或權利要求7所述的組合物，其中所述PlGF-I包含取代以下物質的丙氨酸a)序列標識號1的第25位脯氨酸，或b)序列標識號1的第27位穀氨醯胺，或c)序列標識號1的第60位半胱氨酸，或d)序列標識號1的第72位天冬氨酸，或e)序列標識號1的第73位穀氨酸，或f)序列標識號1的第84位天冬醯胺，或g)序列標識號1的第98位脯氨酸，或h)序列標識號1的第100位酪氨酸，或改變的PlGF-I具有取代序列標識號1的第70 位半胱氨酸的甘氨酸、或在a)到h)中所述丙氨酸置換和所述甘氨酸置換的任何組合。
9.根據權利要求4或權利要求7所述的組合物，其中所述PlGF-I包含取代序列標識號 1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代序列標識號1的第73位穀氨酸的丙氨酸。
10.根據權利要求4或權利要求7所述的組合物，其中所述PlGF-I包含取代序列標識 號1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、取代序列標識號1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代 序列標識號1的第73位穀氨酸的丙氨酸。
11.一種用於對樣品中受體酪氨酸激酶或血管內皮生長因子的檢測進行校準的方法， 所述方法包括以下步驟1)將權利要求2中所述的包含已知量的所述受體酪氨酸激酶和所述血管內皮生長因 子的組合物與受體酪氨酸激酶的特異性受體或血管內皮生長因子的特異性受體接觸；以 及，2)將第1)步驟中形成的複合物與受體酪氨酸激酶的特異性標記受體和內皮生長因子 的特異性標記受體接觸；以及，3)將結合的受體酪氨酸激酶的特異性標記受體與游離的受體酪氨酸激酶的特異性標 記受體分離，或將結合的內皮生長因子的特異性標記受體與游離的內皮生長因子的特異性標記受體分離；以及，4)檢測來自與所述組合物的受體酪氨酸激酶複合的結合的受體酪氨酸激酶的特異性 標記受體的信號、或來自游離的受體酪氨酸激酶的特異性標記受體的信號；或者，5)檢測來自與所述組合物的內皮生長因子複合的結合的內皮生長因子的特異性標記 受體的信號、或來自游離的內皮生長因子的特異性標記受體的信號；以及，6)將來自游離的或結合的受體酪氨酸激酶的特異性標記受體的信號、或來自游離的或 結合的內皮生長因子的特異性標記受體的信號與所述組合物中已知量的受體酪氨酸激酶 或內皮生長因子相關。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述內皮生長因子為胎盤生長因子。
13.根據權利要求11所述的方法，其中所述血管內皮生長因子為胎盤生長因子-1。
14.根據權利要求11所述的方法，其中所述受體酪氨酸激酶為sFlt-1。
15.根據權利要求11所述的方法，其中所述受體酪氨酸激酶為sFlt-Ι並且所述血管內 皮生長因子為胎盤生長因子。
16.根據權利要求11所述的方法，其中所述受體酪氨酸激酶為sFlt-Ι並且所述血管內 皮生長因子為胎盤生長因子-1。
17.根據權利要求13或權利要求16所述的方法，其中所述胎盤生長因子-1包含取代 以下物質的丙氨酸a)序列標識號1的第25位脯氨酸，或b)序列標識號1的第27位穀氨醯胺，或c)序列標識號1的第60位半胱氨酸，或d)序列標識號1的第72位天冬氨酸，或e)序列標識號1的第73位穀氨酸，或f)序列標識號1的第84位天冬醯胺，或g)序列標識號1的第98位脯氨酸，或h)序列標識號1的第100位酪氨酸，或改變的PlGF-I具有取代序列標識號1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、或在a)到h)中 所述丙氨酸置換和所述甘氨酸置換的任何組合。
18.根據權利要求13或權利要求16所述的方法，其中所述PlGF-I包含取代序列標識 號1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代序列標識號1的第73位穀氨酸的丙氨酸。
19.根據權利要求13或權利要求16所述的方法，其中所述PlGF-I包含取代序列標識 號1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、取代序列標識號1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代 序列標識號1的第73位穀氨酸的丙氨酸。
20.一種用於確認樣品中蛋白質的存在或測定樣品中蛋白質含量的方法，包括以下步驟a)將所述蛋白質特異性的固定的受體與所述樣品接觸，從而形成第一複合物，所述第 一複合物包含固定的受體和所述樣品的蛋白質；b)將所述第一複合物與所述蛋白質特異性標記受體接觸，從而形成第二複合物，所述 第二複合物包含受體、所述樣品的蛋白質和標記受體；c)將在所述第二複合物中結合的標記受體與游離的標記受體分離；d)測定來自在所述第二複合物中結合的標記受體的信號或來自游離的標記受體的信號；e)將所述蛋白質特異性的固定的受體與權利要求1中所述的蛋白質的組合物接觸，其 中所述組合物中的所述蛋白質含量為已知的，從而形成第三複合物，所述第三複合物包含 固定的受體和所述組合物的蛋白質；f)將所述第三複合物與所述蛋白質特異性標記受體接觸，從而形成受體、所述組合物 的蛋白質和標記受體的第四複合物；g)將在所述第四複合物中結合的標記受體與游離的標記受體分離；h)測定來自在所述第四複合物中結合的標記受體的信號或來自游離的標記受體的信 號；和i)比較d)和h)中測定的所述信號，進而確認所述樣品中的所述蛋白質存在或測定所 述樣品中的所述蛋白質含量。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述蛋白質為血管內皮生長因子。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述血管內皮生長因子為P1GF。
23.根據權利要求21所述的方法，其中所述血管內皮生長因子為P1GF-1。
24.根據權利要求20所述的方法，其中所述蛋白質為血管內皮生長因子並且所述組合 物包含受體酪氨酸激酶和所述血管內皮生長因子。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述血管內皮生長因子為PlGF並且所述組合物 包含受體酪氨酸激酶和P1GF。
26.根據權利要求24所述的方法，其中所述血管內皮生長因子為PlGF-I並且所述組合 物包含受體酪氨酸激酶和PlGF-I。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述受體酪氨酸激酶為sFlt-1。
28.根據權利要求27所述的方法，其中所述組合物中的所述PlGF-I包含取代以下物質 的丙氨酸a)序列標識號1的第25位脯氨酸，或b)序列標識號1的第27位穀氨醯胺，或c)序列標識號1的第60位半胱氨酸，或d)序列標識號1的第72位天冬氨酸，或e)序列標識號1的第73位穀氨酸，或f)序列標識號1的第84位天冬醯胺，或g)序列標識號1的第98位脯氨酸，或h)序列標識號1的第100位酪氨酸，或改變的PlGF-I具有取代序列標識號1的第70位半胱氨酸的甘氨酸、或在a)到h)中 所述丙氨酸置換和所述甘氨酸置換的任何組合。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述PlGF-I包含取代序列標識號1的第72位 天冬氨酸的丙氨酸和取代序列標識號1的第73位穀氨酸的丙氨酸。
30.根據權利要求28所述的方法，其中所述PlGF-I包含取代序列標識號1的第70位 半胱氨酸的甘氨酸、取代序列標識號1的第72位天冬氨酸的丙氨酸和取代序列標識號1的 第73位穀氨酸的丙氨酸。
31.一種對樣品中蛋白質的檢測進行校準的方法，包括以下步驟1)將權利要求1中所述的包含已知量的所述蛋白質的組合物與所述蛋白質特異性的 受體接觸；2)將第1)步驟中形成的複合物與所述蛋白質特異性標記受體接觸；3)將結合的標記受體與游離的標記受體分離；4)檢測來自結合的標記受體的信號或來自游離的標記受體的信號；和5)將來自游離的或結合的標記受體的信號與所述組合物中所述已知量的所述蛋白質 相關。
32.—種對樣品中蛋白質的檢測進行校準的方法，包括以下步驟1)將權利要求1中所述的含有已知量的所述蛋白質的組合物與所述蛋白質特異性 固定的受體接觸，從而形成複合物，所述複合物包含固定的受體和所述組合物的所述蛋白 質；2)將第1)步驟中形成的所述複合物與所述蛋白質特異性標記受體接觸，從而形成復 合物，所述複合物包含固定的受體、所述組合物的蛋白質和標記受體；3)將結合的標記受體與游離的標記受體分離；4)檢測來自結合的標記受體的信號或來自游離的標記受體的信號；和5)將來自游離的或結合的標記受體的所述信號與所述組合物中所述已知量的所述蛋 白質相關。
全文摘要
本發明公開了組合物和方法，該組合物和方法包括兩種或更多種蛋白質，其中蛋白質中的至少一種已被改變以減弱其相互識別和結合。此類組合物在方法和分析中可用作參照物、校準物或對照物，該方法和分析用於測定可能存在於所關注的樣品中的蛋白質中的一種或多種的量、或確認該樣品中的該蛋白質中的一種或多種的存在。更具體地講，本發明涉及組合物和方法，該組合物和方法包括改變的胎盤生長因子-1(P1GF-1)和可溶性fms樣酪氨酸激酶(sFlt-1)，以及用於測定所關注的樣品中的sFlt-1和/或P1GF-1的量或確認所關注的樣品中的sFlt-1和/或P1GF-1的存在的方法。
文檔編號G01N33/53GK101918834SQ200980101750
公開日2010年12月15日 申請日期2009年1月7日 優先權日2008年1月7日
發明者G·巴什裡安斯, J·W·貝庫斯, J·鄭 申請人:奧索臨床診斷有限公司