一種製備基因工程N-乙醯化胸腺素α1的方法

2023-04-25 12:45:51

專利名稱：：一種製備基因工程N-乙醯化胸腺素α1的方法
技術領域：
：本發明涉及一種製備基因工程N-乙醯化胸腺素a1的方法。
背景技術：
：胸腺素a是一族具有相同或相似N-端序列的免疫調節多肽，包括胸腺素a原、胸腺素a1和胸腺素a11等。其中，胸腺素a1和胸腺素a11是胸腺素a原在體內降解的產物。天然來源的胸腺素a的N-端都具有N-乙醯化修飾，N-乙醯化修飾對胸腺素a1的體內穩定性具有重要作用。採用化學方法合成的N-乙醯化胸腺素a1已經上市，商品名為"日達仙"，用於治療病毒性肝炎等，療效顯著。但是採用化學方法合成N-乙醯化胸腺素al成本高、汙染大，制約了該藥的廣泛使用。利用基因工程大腸桿菌製備多肽具有成本低、安全性好、適合於規模化生產等優勢，但利用大腸桿菌生產的多肽一般沒有N-乙醯化修飾，因此目前已經報導的基因工程方法製備的胸腺素al均為非乙醯化的。目前已發現用基因工程大腸桿菌可以製備N-乙醯化胸腺素a原(WuJ，ChangS，GongX，LiuD，Ma.Q.IdentificationofN_terminalacetylationofrecombinanthumanprothymosinalphainEscherichiacoli.BiochimBiophysActa.2006;1760(8):1241-7.)，並發現將N-乙醯化胸腺素a原通過羥胺切割可以獲得N-乙醯化胸腺素a1的類似物，但該N-乙醯化胸腺素a1類似物的C-端為羥胺化修飾的，與天然的N-乙醯化胸腺素a1的游離羧基端不同，這種不同，在N-乙醯化胸腺素al作為藥物時可能造成具有免疫原性、影響生物活性等問題。由於胸腺素a原具促進正常細胞轉化和異常增生的作用，因此具有潛在的致瘤性(RodriguezP，Vi皿uelaJE.OverexpressionofprothymosinaacceleratesproliferationandretardsdifferentiationinHL_60cells.BiochemJ，1998，331:753-761.)，這種致瘤性是由胸腺素a原C端的核定位序列(TKKQKTDEDD)介導的，缺失或替換該C端核定位序列後，胸腺素a原就不再具有致瘤性(FreireJ，CoveloG，SarandesesC，etal.Identificationof皿clear—importandcell—cycleregulatoryproteinsthatbindtoprothymosinalpha.BiochemCellBiol，2001，79:123-31;StevenA，Enkemann，RHWang.FunctionalDiscontinuitiesinProthymosinaCausedbyCaspaseCleavageinApoptoticCells.JournalofCellularPhysiology,2000，182:256-68)。
發明內容本發明的目的是提供一種製備基因工程N-乙醯化胸腺素a1的方法。本發明所提供的製備N-乙醯化胸腺素a1的方法，包括以下步驟1)用基因工程大腸桿菌製備含N-乙醯化胸腺素a1多肽序列的前體蛋白或多肽；2)內肽酶酶切上述步驟1)的含N-乙醯化胸腺素a1多肽序列的前體蛋白或多肽，純化得到N-乙醯化胸腺素a1。上述方法中，所述含N-乙醯化胸腺素a1多肽序列的前體蛋白或多肽可以是含N-乙醯化胸腺素al多肽序列的融合蛋白或多肽，也可以是含N-乙醯化胸腺素al序列的N-乙醯化胸腺素a原或其突變體。在保持N-乙醯化胸腺素a1序列不變的條件下，可以通過改變其它部分的序列來提高表達、方便純化和減少這些蛋白進入人體後潛在的副作用。上述方法中，所述含N-乙醯化胸腺素a1多肽序列的融合蛋白或多肽，可以是為了方便N-乙醯化胸腺素a1的表達和純化，在含N-乙醯化胸腺素a1多肽序列的蛋白或多肽上融合多聚組氨酸標籤(Histag)、Myc標籤、HA標籤、穀胱甘肽轉移酶(GST)或麥芽糖結合蛋白(MBP)等。具體可為N-乙醯化胸腺素a1與穀胱甘肽轉移酶形成的融合蛋白。這些標籤序列的編碼基因可以用人工合成的方法製備，也可以從商業化的載體上獲得，這些標籤序列的編碼基因與上述含N-乙醯化胸腺素a1多肽序列的蛋白或多肽的編碼序列可以用常規的分子生物學方法連接，如用連接酶連接或PCR方法等。上述方法中，所述胸腺素a原突變體，是至少滿足下述條件之一的多肽1)缺失序列表中序列3的自氨基末端第100-109位的胺基酸殘基；2)將序列表中序列3的自氨基末端第100-109位這10個胺基酸殘基中至少一個胺基酸殘基進行替換；3)將序列表中序列3的自氨基末端第36位和第43位均由甘氨酸替換為丙氨酸；4)將序列表中序列3的自氨基末端第35位、第37位、第39位、第42位和第49位這5個位置的Asn中的至少一個替換或缺失；5)缺失序列表中序列3的自氨基末端第32-52位的胺基酸殘基；6)缺失序列表中序列3的自氨基末端第69-109位的胺基酸殘基。上述胸腺素a原變異體是下述多肽之一1)是由缺失序列表中序列3的自氨基末端第100-109位的胺基酸殘基得到的多肽，其胺基酸序列如序列表中序列4所示；2)是將序列表中序列3的自氨基末端第100-109位這10個胺基酸殘基中至少一個胺基酸殘基進行替換得到的多肽；3)是將序列表中序列3的自氨基末端第36位和第43位均由甘氨酸替換為丙氨酸得到的多肽，其胺基酸序列如序列表中序列5所示；4)是將序列表中序列3的自氨基末端第35位、第37位、第39位、第42位和第49位這5個位置的Asn中的至少一個替換或缺失得到的多肽；5)是由缺失序列表中序列3的自氨基末端第32-52位的胺基酸殘基得到的多肽；6)是由缺失序列表中序列3的自氨基末端第32-52位和第69-109位的胺基酸殘基得到的多肽，其胺基酸序列如序列表中序列9所示。上述方法中，所述N-乙醯化胸腺素a1是指至少具有一種與天然或化學合成的N-乙醯化胸腺素al相同或相似的免疫調節功能，且序列與其同源的多肽。不同哺乳動物來源的N-乙醯化胸腺素a1的序列略有差別，且即使是人源的胸腺素a1也存在一定的序列多態性，如大多數人的胸腺素a1具有序列表中序列1的胺基酸序列(Goodall，G.J.，Dominguez，F.，andHorecker，B丄MolecularcloningofcDNAforhumanprothymosin.ProcNatlAcadSciUSA.(1986)，83:8926-8928.)，但少數人的胸腺素a1的第13位蘇氨酸被異亮氨酸替代(RubtsovIuP，VartapetianAB.Newintronlessmembersofhumanprothymosinalphagenes.(1995)MolBiol(Mosk)29(6):1320-5)，即具有序列表中序列2的胺基酸序列。但這些序列略有差別的胸腺素al具有相同或相似的免疫調節功能。所述胸腺素al包括這些胸腺素al，優選為與序列表中序列l或序列2具有90X以上同源性的多肽，更優選的為與序列表中序列1或序列2具有95%以上同源性的多肽，具體可為序列1或序列2的多肽。上述N-乙醯化胸腺素a原或其變異體的胺基酸序列如序列3-9所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列10-18所示。這些變異體具有以下優點1)序列3的自氨基末端第100-109位的胺基酸殘基為胸腺素a原的C_端核定位序列。由於胸腺素a原具有促進正常細胞轉化和異常增生的作用，因此具有潛在的致癌性。這種促細胞異常增生的作用是通過胸腺素a原C端核定位序列介導的核定位發生的，去除或改變了C端核定位序列的胸腺素a原不再具有致瘤性，而且又不影響N-乙醯化胸腺素a1的製備，因而即使在最後的N-乙醯化胸腺素a1製品中含微量的胸腺素a原也不會存在安全隱患，因而明顯提高了本發明方法產物的臨床適用性。2)胸腺素a原序列上除第28位的天冬醯胺(N28)位點外，還有N35、N37、N39、N42和N49等多個天冬醯胺位點，這些位點均可以被天冬醯胺內肽酶切割，因此切割產物較為複雜，純化困難。本發明提供了用這些位點突變或缺失(如序列表中序列3的自氨基末端第32-52位的胺基酸殘基的缺失)的胸腺素a原製備N-乙醯化胸腺素al的方法，使切割產物的複雜性明顯降低，方便了純化。3)G36A和G43A突變可以提高胸腺素a原的表達水平，從而提高N-乙醯化胸腺素a1的生產效率。4)去除了部分胸腺素a原中的非胸腺素al部分的序列，提高了表達的蛋白或多肽中N-乙醯化胸腺素a1的比例(如序列表中序列3的自氨基末端第69位以後的胺基酸殘基的缺失)。上述N-乙醯化胸腺素a原或其變異體的編碼基因可以用PCR、RT-PCR、人工合成或構建篩選cDNA文庫等方法獲得，用作PCR模板和用於構建cDNA文庫的mRNA或cDNA可以來源於任何含有相應mRNA或cDNA的組織、細胞及文庫等，如從人胚胎胸腺獲得；也可以用人工合成的方法獲得，人工合成時可選用宿主偏愛的密碼子，這樣可以提高產物的表達。可用現有的PCR、酶切連接等方法對多聚核苷酸進行突變、缺失、插入或與其它多聚核苷酸連接等。本發明的製備N-乙醯化胸腺素a1的方法中，所述N-乙醯化胸腺素a原或其變異體是將含有N-乙醯化胸腺素a原或其變異體的編碼基因導入表達載體中構建重組表達載體，再將構建好的重組表達載體轉入宿主細胞中表達得到的；所述表達載體上可以帶有複製位點、篩選標記等，具體可為PET系列、PBV220載體等，所述表達載體上還可以帶有各種誘導型或組成型啟動子，具體可為誘導型啟動子，這樣有利於提高重組大腸桿菌的穩定性。其中誘導型啟動子具體可為化學誘導啟動子，如T7、Lac、Tac、Trp等及溫敏啟動子，如PLPR啟動子。所述宿主細胞可為大腸桿菌細胞，如DH5a、BL21(DE3)等。重組大腸桿菌細胞具有生長快、培養成本低廉、易於大規模生產、已成功用於大量重組藥用蛋白的生產等優6勢，因此在工業生產上具有明顯的優勢。可以用搖瓶或生物反應器等培養上述重組菌，生產時具體可使用生物反應器；培養基應能提供菌體生長和產物表達所需的各種營養物質，包含氮源、碳源、PH緩衝成份等。重組菌的培養分兩個階段，第一階段主要用於菌體的生長，第二階段主要用於合成產物。從培養物中分離含N-乙醯化胸腺素al多肽序列的蛋白或多肽的方法可以用各種蛋白分離的方法，如破菌、萃取、沉澱、超濾、液相層析等技術及這些技術的組合。液相層析可以用離子交換、凝膠排阻、親和、疏水、反相等層析技術。本發明所提供的製備基因工程N-乙醯化胸腺素a1的方法中，所述內肽酶為天冬醯胺內肽酶，天冬醯胺內肽酶是一類廣泛存在於生物界的內肽酶，又被稱為leg咖ain或VPE(vacuolarprocessingenzyme)，它特異性切割多肽或蛋白中天冬醯胺的C端，在植物、動物中均有發現，Abe，Y(JBC1993，3525-3529)報導了從刀豆(canavaliaensiformis)種子中提取天冬醯胺內肽酶的方法及刀豆天冬醯胺內肽酶的核苷酸和胺基酸序列(GenBankL05515)。Dalton，JP(Parasitology,1995，111:575-580)等報導了曼森血吸蟲(Schistosomamansoni)的天冬醯胺內肽酶，chenJM(JBC1997，272:8090-8098)報導了人的天冬醯胺內肽酶。各物種的天冬醯胺內肽酶的編碼序列及其對應的胺基酸序列可以從美國國立衛生研究院的GenBank或歐洲的EMBL等公開的基因或蛋白資料庫中直接獲得(在GenBank中人、小鼠、大鼠的天冬醯胺內肽酶基因收錄號分別為NM_005606、NM_011175、NM_022226)。或者根據人、曼森血吸蟲、刀豆等物種的天冬醯胺內肽酶序列，在上述資料庫中通過同源比對獲得。本發明優選的天冬醯胺內肽酶為人天冬醯胺內肽酶。天冬醯胺內肽酶可以用基因工程製備或從各物種提取，優選的是用基因工程方法製備，包括用基因工程酵母、昆蟲細胞、大腸桿菌或哺乳動物細胞等製備得到。其中用基因工程酵母製備天冬醯胺內肽酶具有表達水平高、蛋白可溶、不需要復性、製備成本低廉、適合於規模生產等優勢。天冬醯胺內肽酶可以先以酶原形式製備，以提高其在表達和製備過程中的穩定性，使用前通過調節溶液的PH至酸性，使其自活化。為了提高酶活性、表達量、穩定性及方便酶純化等，天冬醯胺內肽酶還可以進行替換、缺失和融合等改造。本發明製備的N-端乙醯化修飾胸腺素al還可以有各種衍生物，這些衍生物可以但不局限於其不同形式的鹽或修飾產物等。所述修飾劑可以但不局限於聚乙二醇、葡聚糖或及其衍生物等。本發明製備的N-端乙醯化修飾胸腺素a1可用於製備治療和/或預防各種傳染病和腫瘤的藥物，如治療和/或預防病毒性肝炎、流行性感冒或肝癌等。本發明的製備基因工程N-乙醯化胸腺素a1的方法具有成本低廉，適合於規模生產等優點，製備的基因工程N-乙醯化胸腺素a1具有廣泛的臨床應用前景。圖1為N-乙醯化胸腺素a原粗製品的SDS-PAGE分析結果。圖2為N-乙醯化胸腺素a原粗製品的RP-HPLC分析結果。圖3為人天冬醯胺內肽酶原活化分析。圖4為人天冬醯胺內肽酶對胸腺素a原切割效果分析。圖5為N-乙醯化胸腺素a1純化的色譜圖。圖6為N-乙醯化胸腺素a1的RP-HPLC分析。圖7為利用本發明方法製備的N-乙醯化胸腺素a1的質譜分子量分析圖8為天然基因和人工合成基因表達C-端缺失或G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的工程菌的SDS-PAGE分析。圖9為用人工合成基因表達自氨基末端第32-52位區段缺失或截短的G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的工程菌的SDS-PAGE分析。圖10為以del53/G68胸腺素a原變異體為原料製備的N_乙醯化胸腺素a1的純化色譜圖。圖11為以del53/G68胸腺素a原變異體為原料製備的N_乙醯化胸腺素a1的RP-HPLC分析。具體實施例方式實施例1、以N-乙醯化胸腺素a原製備N-乙醯化胸腺素a1實驗中的pfu酶、內切酶、連接酶、試劑盒等均購自上海生工生物工程技術服務有限公司和北京博大泰克生物基因技術有限公司。1、表達N-乙醯化胸腺素a原的基因工程菌的構建取流產的人胎兒胸腺，用總RNA製備試劑盒，按試劑盒提供的方法製備總RNA;用RT-PCR試劑盒，按試劑盒提供的方法將mRNA逆轉錄成cDNA;以該cDNA為模板，以Protl:5，-CCCATATGTCTGATGCAGCTGTAGATACC-3，和Prot2:5，-CGGGATCCCTAGTCATCCACGTCGGTCTTCTG-3'為引物，PCR擴增胸腺素的cDNA。100y1反應體系中加入1P1cDNA，20ymol/L的Protl、Prot2引物各3ii1，2,1/L的dNTP10ul，10X反應緩衝液10ul，pfuDNA聚合酶5U。用Perk-Elmer公司的9600PCR儀，PCR條件為先94。C變性1分鐘，然後52。C退火30秒，最後72t:延伸1分鐘，共35個循環。將PCR產物純化回收後用Ndel和BamHI進行雙酶切，酶切產物與經同樣酶切的載體PET22b(購自Novagen公司)相連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞(購自北京博大泰克生物基因技術有限公司)，用含氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克隆。對陽性克隆進行酶切鑑定並測序，測序結果表明，擴增得到的胸腺素基因與天然人胸腺素a原(其脫氧核糖核苷核酸序列如序列表中序列10所示，所編碼的胺基酸殘基序列如序列表中序列3所示)的序列一致，將得到的重組質粒命名為pET-NproT，將得到的陽性克隆命名為BL21(DE3)(pET-NproT)。將BL21(DE3)(pET-NproT)單菌落接種於100mlLB液體培養基中，37。C搖床培養過夜，然後轉接至含3L培養基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白腖10g/L，磷酸二氫鈉20mM，磷酸氫二鈉30mM，葡萄糖10g/L)的B5發酵罐中(購自德國貝朗公司)，37。C培養，通過攪拌和通氣控制溶氧大於20%。培養4h後，加入3ml0.2mol/L的IPTG誘導，繼續培養4-8h，發酵液離心，收集菌體。將收集的菌體用水重懸(每克菌加10ml水)，超聲波破壁，離心收集上清，在上清液中加入冰乙酸調節pH至4.5，靜置30分鐘，離心收集上清，即為含有N-乙醯化胸腺素a原的粗提液。將該粗提液用SPFF①2.5X30cm柱(介質購自美國GE公司，空柱購自華美實驗儀器廠)進行純化。具體條件為A液(20mM乙酸鈉和乙酸組成的緩衝液，pH4.5)，B液(A液+1MNaCl)，SPFF柱先用A液平衡，然後從A通道將上述含有N_乙醯化胸腺素a原的粗提液上樣至SPFF柱中，再用A液洗去未結合的蛋白，最後在0—30分鐘A從100%8—0%;8從0%—100%線性梯度洗脫，分段收集洗脫液。將收集到的各級份洗脫液取樣作SDS-PAGE分析，合併含12KDa胸腺素a原的洗脫液(30%-60%B洗脫液中)，獲得N-乙醯化胸腺素a原的粗製品，取樣作SDS-PAGE和RP-HPLC分析，結果如圖l和圖2所示。圖l為SDS-PAGE結果，其中，l為N-乙醯化胸腺素a原的粗製品，2為分子量標準。RP-HPLC分析採用HP1090高壓液相色譜儀，C18柱(4.6X250mm，中科院大連化學物理所，A液為含0.1%TFA(體積百分含量)的純水；B液為含O.1%TFA(體積百分含量)的色譜純乙腈，梯度洗脫Omin，A液100%，B液OX30min，A液10%，B液90%)，RP-HPLC結果如圖2所示。其中，A峰為非乙醯化胸腺素a原，B峰為N-乙醯化胸腺素a原(WuJ，ChangS，GongX，LiuD，Ma.Q.IdentificationofN_terminalacetylationofrecombinanthumanprothymosinalphainEscherichiacoli.BiochimBiophysActa.2006;1760(8):1241-7.)。結果表明，上述得到的胸腺素a原粗製品中，70X以上為N-乙醯化胸腺素a原。2、製備天冬醯胺內肽酶取人肝癌細胞H印G2(購於中國科學院上海細胞庫)，用總RNA製備試劑盒，按試劑盒提供的方法製備總RNA，用RT-PCR試劑盒，按試劑盒提供的方法將mRNA逆轉錄成cDNA，以該cDNA為模板，以legl:5，-AGAGTCGACAAAAGAGTTCCTATAGATGATCCTGAAG_3，禾Pleg2:5'-TATGTCGACGCGGCCGCTTAGTAGTGACCAAGGCACACGTG-3'為引物，PCR擴增人天冬醯胺內肽酶原基因的cDNA。50iU反應體系中加入liilcDNA，20iimol/L的legl、leg2引物各liil，2.5mmol/L的dNTP4ul，10X反應緩衝液5ul，pfuDNA聚合酶5U。用Perk-Elmer公司的9600PCR儀，PCR條件為先94。C變性1分鐘，然後52。C退火30秒，最後72。C延伸2分鐘，共35個循環。將PCR產物純化回收後用XhoI和NotI進行雙酶切，酶切產物與經同樣酶切的載體pPIC9(購自Invitrogen公司)相連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，用氨苄青黴素篩選抗性菌落，對陽性克隆提取質粒進行測序。將測序結果與人天冬醯胺內肽酶原基因(序列表中序列19)的核苷酸序列一致的質粒轉化畢赤酵母GS115(購自Invitrogen公司)，採用MD培養基(1.34%YNB(質量百分含量)，4X10—5%生物素(質量百分含量)，2%葡萄糖(質量百分含量)，1.5%瓊脂(質量百分含量))平板進行篩選；然後將轉化子轉至YPD培養基(1%酵母提取物(質量百分含量)，2%蛋白腖(質量百分含量)，2%葡萄糖(質量百分含量))中，3(TC條件下250rpm培養24h;然後再以4X(體積百分含量)的接種量接種於25mLBMGY(1X酵母提取物(質量百分含量)，2%蛋白腖(質量百分含量)，1%甘油(質量百分含量)，1.34%YNB(質量百分含量)，4X10—5%生物素(質量百分含量)，100mMpB，p朋.0)培養基中，3(TC250rpm培養24h，然後在培養基中加入甲醇，使其在培養基中的體積百分含量達O.05%，進行適應性誘導；12h後再將培養基中的甲醇含量升至0.5%進行誘導，其後每隔12h每升培養基中補加5ml甲醇；誘導72h後，離心取上清，SDS-PAGE電泳分析，取表達量較高的克隆作為製備人天冬醯胺內肽酶原的基因工程酵母。取上述基因工程酵母的單克隆，接種到5mlYPD培養基中，3(TC250rpm培養24h;然後以2X的接種量接種於200mLYPD培養基中，3(TC250rpm培養24h;再以5%的接種量接種於4LBMGY培養基中，3(TC250rpm培養24h;最後在培養基中加入甲醇，使其在培養基中的體積百分含量達O.5%，進行誘導；其後每隔12h每升培養基中補加5ml甲醇；誘導72h9後，離心取上清，用冰乙酸調pH至5.5，用SPFF①5.0X30cm柱(介質購自美國GE公司，空柱購自華美實驗儀器廠購自GE公司)純化。具體條件為A液(20rnM乙酸鈉和乙酸組成的緩衝液，PH5.0)，B液(A液+iMNaCl)各2L，SPFF柱先用A液平衡，然後從A通道將上述含有人天冬醯胺內肽酶原的培養上清上樣至SPFF柱中，再用A液洗去未結合的蛋白，最後在0—30分鐘A從100%—0%;B從0%—100%線性梯度洗脫，收集紫外吸收主峰(50-70%B)即為人天冬醯胺內肽酶原。取上述收集到的濃度為0.lmg/ml的人天冬醯胺內肽酶原1ml，加入0.lmllmol/LpH4.5檸檬酸鈉溶液、1P1lmol/LDTT，37。C孵育，分別於0.25、1和2小時取樣進行SDS-PAGE分析，結果如圖3所示。其中，人天冬醯胺內肽酶原由416個胺基酸組成，有4個^糖基化位點，分子量約為56KDa;而活化的人天冬醯胺內肽酶由298個胺基酸組成，分子量約為46KDa。結果表明，隨著孵育時間的增加，56KDa的人天冬醯胺內肽酶原逐漸減少，46KDa的人天冬醯胺內肽酶逐漸增加，2小時後人天冬醯胺內肽酶原基本轉化為活性形式的人天冬醯胺內肽酶。3、以N-乙醯化胸腺素a原製備N_乙醯化胸腺素a1將上述步驟2的活化2小時的lml人天冬醯胺內肽酶加入到50ml上述步驟1的N-乙醯化胸腺素a原粗製品溶液中，再加5mllmol/LpH4.5檸檬酸鈉和50lmol/LDTT，37°C孵育切割N-乙醯化胸腺素a原，分別於0.25、1和4小時取樣進行SDS-PAGE分析，結果如圖4所示。其中，1、2、3分別為孵育0.25、1和4小時的樣品，M為分子量標準。其餘樣品孵育過夜。結果表明，隨著孵育時間的增加，N-乙醯化胸腺素a原逐漸減少，而生成了N-乙醯化胸腺素al。4、N_乙醯化胸腺素a1的純化及鑑定取上述步驟3的經過天冬醯胺內肽酶酶切的反應液，用C18①2.0X20cm柱(購自大連化學物理研究所)進行純化，A液為水+0.1%體積百分含量TFA，B液為50%體積百分含量乙腈+0.1%體積百分含量TFA的水溶液。先用A液平衡，然後以5ml/min的流速上樣，上樣完成後，再用A液平衡，然後進行線性梯度洗脫，程序為0—5分鐘A液從100%—70%，B液從0%—30%;5—20分鐘A液從70%—40%，B液從30%—60%。214nm紫外檢測，色譜圖見圖5所示。收集40-45%B組份為製備的N-乙醯化胸腺素a1。採用C18。4.6X250mm柱(購自大連化學物理所)，A液(水+0.1%體積百分含量三氟乙酸)，B液(乙腈+0.1%體積百分含量三氟乙酸)。HP1090色譜儀，梯度洗脫0—5min，B液0%—15%，A液100%—85%;5—20min，B液15%—30%，A液85%—70%;20—25min，B液30X—100X，A液70X—0%;25—26min，B液100%。參考品為化學合成的N-乙醯化胸腺素a1(商品名Zadaxin，購自解放軍302醫院)，濃度160yg/ml，上樣量均為10ul。結果如圖6所示。其中，A為N-乙醯化胸腺素al參考品的色譜圖，保留時間為15.4分鐘，B為上述步驟3純化後的N-乙醯化胸腺素a1。其在HPLC上的保留時間也是15.4分鐘，說明純化的是^乙醯化胸腺素al，且該組份為均一的單峰(5分鐘前的峰為純化組份中的鹽和乙酸的吸收峰)。進一步將A、B溶液以1:1的體積比混合後再用HPLC分析，結果發現，其為均一的單峰(C)，說明兩者為同一物質。將上述步驟3製備的N-乙醯化胸腺素a1作Edman降解法測序，結果未能測到降解的胺基酸峰，說明樣品的N-端已被修飾。測定上述步驟3製備的N-乙醯化胸腺素a1的質譜分子量(國家生物醫學分析中心分析)，結果如圖7所示。結果表明其分子量為3107.66，與N-乙醯化胸腺素a1的理論分子量3107.33—致(差別小於儀器誤差IDa)，比非乙醯化胸腺素a1的理論分子量3065Da大42Da(乙醯基修飾的分子量)。表明上述步驟3製備的為N-乙醯化胸腺素a1。實施例2、N-乙醯化胸腺素a1(Ilel3)(序列表中序列2)的製備以上述實施例1構建的重組質粒pET-NproT為模板，以Prot3:5'-cccatatgtctgatgcagctgtagataccagctccgaaatcaccatcaaggactta-3，禾口Prot2為弓|物，進行PCR擴增，獲得的脫氧核糖核苷酸序列所編碼的胺基酸殘基為自氨基末端第13位胺基酸為異亮氨酸的胸腺素a原，將該基因命名為NproT(Ile13)。採用與上述實施例1相同的方法將NproT(Ile13)插入到載體PET22b的Ndel和BamHI酶切位點間，得到重組質粒pET-NproT(Ilel3);再將重組質粒pET-NproT(Ilel3)轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，採用與上述實施例l相同的篩選方法得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-NproT(Ilel3))，培養BL21(DE3)(pET-NproT(Ilel3))，表達得到自氨基末端第13位為異亮氨酸的N-乙醯化胸腺素a原。將得到的自氨基末端第13位為異亮氨酸的N-乙醯化胸腺素a原用上述實施例l步驟2製備的天冬醯胺內肽酶進行酶切，純化獲得N-乙醯化胸腺素al(Ilel3)。具體方法同實施例1。實施例3、用天然基因和人工合成基因表達C-端缺失和/或自氨基末端第36位由G替換為A、自氨基末端第43位由G替換為A的胸腺素a原變異體，製備N_乙醯化胸腺素a11、表達C-端缺失的胸腺素a原變異體的工程菌的構建以上述實施例1構建的重組質粒pET-NproT為模板，以Protl和Prot4:5'-gtggatccttaATCGACATCGTCATCCTCATC-3'為引物，PCR擴增獲得C_端缺失的胸腺素a原變異體的基因(NproT-C)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列ll所示，其編碼的胺基酸序列如序列表中序列4所示。採用與上述實施例1相同的方法將NproT-C插入到載體PET22b的BamHI和Ndel酶切位點間，得到重組質粒pET-NproT-C;再將重組質粒pET-NproT-C轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，採用與上述實施例1相同的篩選方法得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-NproT-C)。2、表達G36A和G43A替換(即胸腺素a原自氨基末端第36位和第43位的甘氨酸(G)替換為丙氨酸(A))的胸腺素a原變異體的工程菌的構建以上述實施例l構建的重組質粒pET-NproT為模板，以Protl和Prot5:5'_ATTGTCAGCCTCCTGCTCagcATTTTCCTCATTAGCATTagcGTTAGCAGGGGCGTCTCT-3'為引物，PCR擴增含G36A和G43A編碼序列的約150bp的核酸片段；以該150bp的核酸片段為megprimer，以Prot2為反向引物，以pET-NproT為模板，PCR擴增含G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體基因(NproTG36A，G43A)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列12所示，其編碼的胺基酸序列如序列表中序列5所示。採用與上述實施例1相同的方法將NproTG36A，G43A插入到載體PET22b的Ndel和BamHI酶切位點間，得到重組質粒pET-NproTG36A，G43A;再將重組質粒pET_NproTG36A，G43A轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，採用與上述實施例1相同的篩選方法得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A)。3、表達C-端缺失且G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的工程菌的構建以上述步驟2獲得的pET-NproTG36A，G43A為模板，以Protl和Prot4為引物，PCR擴增G36A和G43A替換且C-端缺失的胸腺素a原變異體基因(NproTG36A，G43A-C)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列13所示，其編碼的胺基酸序列如序列表中序列6所示。採用與上述實施例1相同的方法將NproTG36A，G43A-C插入到載體PET22b的NdeI和BamHI酶切位點間，得到重組質粒pET-NproTG36A，G43A-C;再將重組質粒pET-NproTG36A，G43A-C轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，採用與上述實施例1相同的篩選方法得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A-C)。4、用人工合成基因表達G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的工程菌的構建根據大腸桿菌偏愛密碼，優化mRNA的二級結構，減少發卡結構，設計出編碼G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的DNA序列(序列表中序列14)。為了合成該基因，我們採用分段合成，PCR拼接的方法。即先合成序列3的DNA正向片段，每段58bp，及其反向互補序列，每段58bp，每條反向片段分別與正向序列前一段和後一段各有29bp互補。所有DNA片段各取lpmol，混合作為模板，以Prot6:5'-CCCATATGTCTGACGCTGCTGTTGAC-3'和proT7:5'-cgggatccTTAGTCGTCTTCGTCAGTTTTCTG-3'為正向和反向引物，PCR擴增拼接基因。PCR反應體系為模板lpmol，Prot6和proT7各100pmo1，10mmol/L的dNTP1ii1，10X反應緩衝液5iil，pfuDNA聚合酶5U，加水到50iil。PCR條件為先94。C變性30秒，然後54。C退火30秒，最後72t:延伸30秒，共35個循環。獲得人工合成的G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的基因(SproTG36A，G43A)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列14所示，其編碼的胺基酸序列如序列表中序列5所示。採用與上述實施例1相同的方法將SproTG36A，G43A插入到載體PET22b的Ndel和BamHI酶切位點間，得到重組質粒pET-SproTG36A，G43A;再將重組質粒pET-SproTG36A，G43A轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，採用與上述實施例1相同的篩選方法得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A)。5、用人工合成基因表達C-端缺失且G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的工程菌的構建以上述步驟4獲得的pET-SproTG36A，G43A為模板，以Prot6和Prot8:5'-cgggatccTTAGTCAACGTCGTCGTCTTCGTC-3'為引物，PCR擴增G36A和G43A替換且C-端缺失的胸腺素a原變異體的基因(SproTG36A，G43A-C)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列18所示，其編碼的胺基酸序列如序列表中序列6所示。採用與上述實施例1相同的方法將SproTG36A，G43A-C插入到載體PET22b的NdeI和BamHI酶切位點間，得到重組質粒pET-SproTG36A，G43A-C;再將重組質粒pET-SproTG36A，G43A-C轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，採用與上述實施例1相同的篩選方法得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A-C)。6、製備N-乙醯化胸腺素a1分別取上述實施例1構建的BL21(DE3)(pET-NproT)與上述步驟1_5構建的工程菌BL21(DE3)(pET-NproT-C)、BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A)、BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A—C)、BL21(DE3)(pET—SproTG36A，G43A)禾PBL21(DE3)(pET—SproTG36A，G43A-C)的單菌落，分別接種到5mlLB液體培養基中，37。C搖床培養過夜；然後再轉接至100ml培養基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白腖10g/L，磷酸二氫鈉20mM，磷酸氫二鈉30mM，葡萄糖2g/L)中，37。C培養4h，分別加入100yl0.2mol/L的IPTG(異丙基-D-硫代半乳糖苷，購自上海生工生物工程技術服務有限公司)繼續培養4-8h，各取lml菌液，離心收集菌體，加50iil水重懸，再和50ii12XSDS-PAGE上樣緩衝液混合，沸水浴裂解菌體，裂解液離心取上清，進行SDS-PAGE分析，結果如圖8所示。其中，1為BL21(DE3)(pET-NproT)的SDS-PAGE結果，2為BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A)的SDS-PAGE結果，3為BL21(DE3)(pET-NproT-C)的SDS-PAGE結果，4為BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A)的SDS-PAGE結果，5為BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A)的SDS-PAGE結果，6為BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A-C)的SDS-PAGE結果，M為分子量標準。結果表明，BL21(DE3)(pET-NproT-C)(圖中樣品3)與BL21(DE3)(pET-NproT)(圖中樣品1)的表達水平相似、BL21(DE3)(pET-NproTG36A，G43A)(圖中樣品4)的表達水平高於BL21(DE3)(pET-NproT)(圖中樣品1)，而BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A)(圖中樣品2和樣品5)和BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A-C)(圖中樣品6)的表達水平最高，即C端核定位序列的缺失不影響胸腺素a原的表達，G36A和G43A替換可以明顯提高胸腺素a原的表達，人工合成的基因比天然基因更有利於胸腺素a原的表達。採用與上述實施例1相同的方法培養上述各工程菌，表達得到胸腺素a原變異體。將得到的各胸腺素a原變異體用上述實施例1步驟2方法製備的天冬醯胺內肽酶進行酶切，製備得到N-乙醯化胸腺素al。具體的方法同實施例l。由於BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A)(圖中樣品5)禾卩BL21(DE3)(pET-SproTG36A，G43A-C)(圖中樣品6)的表達量較高，因此單位體積的培養物製備的N-乙醯化胸腺素al也較多。實施例4、用部份天冬醯胺內肽酶酶切位點缺陷的胸腺素a原變異體或截短的胸腺素a原變異體製備N-乙醯化胸腺素a11、用人工合成基因表達自氨基末端第32-52位胺基酸殘基序列缺失，並截短的胸腺素a原變異體的工程菌的構建以上述實施例3構建的pET-SproTG36A，G43A-C為模板，以Prot10:5，-ggcatATGTCTGACGCTGCTGTTGAC-3，和Prot9:5，-ACCACCTTCTTCCTCTTCTTCGTCACGACCGTTTTCAGCTTC-3'為引物，PCR擴增編碼自氨基末端第32-52位胺基酸序列缺失(含多個天冬醯胺位點)的約110bp的核酸片段；以該110bp的核酸片段為megprimer，以Prot8為反向引物，pET-SproTG36A，G43A-C為模板，PCR擴增編碼自氨基末端第32-52位胺基酸序列缺失，並缺失C-端核定位序列的胸腺素a原變異體基因(del53-C)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列17所示，其編碼的胺基酸序列如序列表中序列8所示。將擴增得到的del53-C基因用Ndel和BamHI雙酶切後，與經同樣酶切的載體PET-22b(購自Novagen公司)相連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(PET-del53-C)。採用同樣的方法，以Protll:5'-cgggatccTTAACCTTCTTCCTCTTCTTCCTC-3'代替Prot8，PCR擴增編碼自氨基末端第32-52位胺基酸序列缺失，且C-端截短至G68的胸腺素a原變異體基因(del53/G68)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列16所示，其編碼的胺基酸序列如序列表中序列9所示。將擴增得到的del53/G68基因用Ndel和BamHI雙酶切後，與經同樣酶切的載體PET-22b(購自Novagen公司)相連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(PET-del53/G68)。以上述實施例3構建的pET-SproTG36A，G43A為模板，以ProtlO和Protll為引物，PCR擴增C-端截短至G68的胸腺素a原變異體基因(G68基因)，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列15所示，其編碼的胺基酸序列如序列表中序列7所示。將擴增得到的G68基因分別用Ndel和BamHI雙酶切後，與經同樣酶切的載體PET22b(購自Novagen公司)相連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(PET-G68)。2、製備N-乙醯化胸腺素a1將上述重組大腸桿菌BL21(DE3)(PET-G68)、BL21(DE3)(PET-del53/G68)、BL21(DE3)(PET-del53-C)及實施例3構建的BL21(DE3)(PET-SprotG36A，G43A)、BL21(DE3)(PET-SprotG36A，G43A-C)的單菌落分別接種到100mlLB液體培養基中，37。C搖床培養過夜，然後再接種至含3L培養基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白腖10g/L，磷酸二氫鈉20mM，磷酸氫二鈉30mM，葡萄糖10g/L)的B5發酵罐中(購自德國貝朗公司)，37。C培養，通過攪拌和通氣控制溶氧大於20%。培養4後，溶氧突然回升，提示葡萄糖已耗盡，每升培養物加入lm10.2mol/L的IPTG進行誘導，繼續培養4-8和小時，各取50yl菌液，離心收集菌體，加50iil水重懸，再和50ii12XSDS-PAGE上樣緩衝液混合，沸水浴裂解菌體。裂解上清液進行SDS-PAGE分析，結果如圖9所示。其中，M為分子量標準，1為表達G36A和G43A替換的胸腺素a原變異體的工程菌BL21(DE3)(PET-SprotG36A，G43A)的SDS-PAGE結果，2為表達C端截斷至G68的胸腺素a原變異體的工程菌BL21(DE3)(PET-G68)的SDS-PAGE結果，3為表達自氨基末端第32-52位胺基酸序列缺失，且C-端截短至G68的胸腺素a原變異體的工程菌BL21(DE3)(PET-del53/G68)的SDS-PAGE結果，4為表達自氨基末端第32-52位胺基酸序列缺失，且C-端核定位序列缺失的胸腺素a原變異體的工程菌BL21(DE3)(PET-del53-C)的SDS-PAGE結果，5為表達C-端核定位序列缺失的胸腺素a原變異體的工程菌BL21(DE3)(PET-SprotG36A，G43A-C)的SDS-PAGE結果。圖9結果表明，BL21(DE3)(PET-SprotG36A，G43A)、BL21(DE3)(PET-SprotG36A，G43A-C)、BL21(DE3)(PET-G68)和BL21(DE3)(PET-del53/G68)的表達較高，而BL21(DE3)(PET-del53—C)的表達較低。由於del53/G68的分子量最小，因此其中含的胸腺素al比例最高。為了進一步比較這些工程菌的N-乙醯化胸腺素a1的產率，各取1L上述工程菌的培養產物，用上述實施例1步驟2製備的天冬醯胺內肽酶進行酶切，製備N-乙醯化胸腺素a1。具體方法同實施例1。將得到的N-乙醯化胸腺素a1進行RP-HPLC分析，具體方法同實施例1。各工程菌所獲得的N-乙醯化胸腺素a1的分析結果見表1。表IN-乙醯化胸腺素a1的含量tableseeoriginaldocumentpage15可見工程菌BL21(DE3)(PET-del53/G68)的N-乙醯化胸腺素a1產率最高，其純化過程的色譜圖如圖IO所示。比較圖10與圖5可以發現，用工程菌BL21(DE3)(PET-de153/G68)表達胸腺素a變異體製備N-乙醯化胸腺素a1時，雜峰明顯減少，因此更易於純化，方便大規模生產。圖11為其製備的N-乙醯化胸腺素a1的RP-HPLC分析，保留時間與圖6中化學合成的N-乙醯化胸腺素a1參考品一致，且純度良好。實施例5、用含N-乙醯化胸腺素a1的穀胱甘肽轉移酶融合蛋白製備N-乙醯化胸腺素al1、表達含N-乙醯化胸腺素a1的穀胱甘肽轉移酶融合蛋白工程菌的構建以上述實施例3構建的pET-SproTG36A，G43A-C為模板，以Ta5:5，-GGCATATGTCTGACGCTGCTGTTGAC-3，和Ta3:5'-GTTTTCAGCTTCTTCAACAAC-3，為引物，PCR擴增得到約100bp的編碼胸腺素a1的DNA片段，電泳回收該片段。以GST5:5'-GTTGTTGAAGAAGCTGAAAACGGTATGTCCCCTATACTAGGTTAT-3，和GST3:5，-AGGGATCCTTAACGCGGAACCAGATCCGATTT-3;為引物，以pGEX-4T-l載體(構自美國GE公司)為模板，PCR擴增得到約680bp的編碼穀胱甘肽轉移酶的DNA片段，電泳回收該片段。以這兩個DNA片段為模板，以Ta5和GST3為引物，PCR擴增獲得用於表達含N-乙醯化胸腺素a1的穀胱甘肽轉移酶融合蛋白的基因(其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列20所示，其編碼的胺基酸序列如序列表中序列21所示)。該基因用Ndel和BamHI雙酶切後，與經同樣酶切的載體PET-22b(購自Novagen公司)相連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，得到重組大腸桿菌BL21(DE3)(PET-TaGST)。將上述重組大腸桿菌BL21(DE3)(PET-TaGST)的單菌落接種到100mlLB液體培養基中，37t:搖床培養過夜，然後再接種至含3L培養基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白腖10g/L，磷酸二氫鈉20mM，磷酸氫二鈉30mM，葡萄糖10g/L)的B5發酵罐中(購自德國貝朗公司)，37°C培養，通過攪拌和通氣控制溶氧大於20%。培養4-6h後，溶氧突然回升，提示葡萄糖已耗盡，每升加入lm10.2mo1的IPTG(異丙基-D-硫代半乳糖苷，購自上海生工生物工程技術服務有限公司)進行誘導，繼續培養4-8和小時，離心收集菌體64g。將20g收集的菌體用水重懸(每克菌加10ml水)，超聲波破壁，離心收集上清，為含有N-乙醯化胸腺素al-穀胱甘肽轉移酶融合蛋白的粗提液。將該粗提液用GlutathioneS印harose4FastFlow①2.5X30cm柱(介質購自美國GE公司，空柱購自華美實驗儀器廠)進行純化。具體條件為A液(20mMTri-HCl，pH7.0)，B液(A液+10mM還原型穀胱甘肽)，層析柱先用A液平衡，然後從A通道將上述含有N-乙醯化胸腺素a1-穀胱甘肽轉移酶融合蛋白的粗提液上樣，再用A液洗去未結合的蛋白，最後用100%B洗脫，收集洗脫液30ml，為純化的N-乙醯化胸腺素a1-穀胱甘肽轉移酶融合蛋白。用G25①2.5X50cm柱(介質購自美國GE公司，空柱購自華美實驗儀器廠)層析更換緩衝體系，具體條件為，流動相20mM乙酸-乙酸鈉緩衝液，pH4.5。流速5ml/min。收集17_35min的組分為N_乙醯化胸腺素al-穀胱甘肽轉移酶融合蛋白。用上述實施例1步驟2的方法製備活化的天冬醯胺內肽酶，在上述N-乙醯化胸腺素a1-穀胱甘肽轉移酶融合蛋白組分中加入2ml活化的天冬醯胺內肽酶和40yllmol/LDTT，37t:孵育切割融合蛋白12小時。切割產物用C18①2.0X20cm柱(購自大連化學物理研究所)進行純化。A液為水+0.1%體積百分含量TFA，B液為50%體積百分含量乙腈+0.1X體積百分含量TFA的水溶液。先用A液平衡，然後以5ml/min的流速上樣，上樣完成後，再用A液平衡，然後從30XA液到60X進行線性梯度洗脫。收集40-45XB組份(25ml)為製備的N-乙醯化胸腺素a1(濃度為0.9mg/ml)。用實施例1相同的方法分析，在HPLC上的保留時間是15.4分鐘，與化學合成的^乙醯化胸腺素a1的保留時間一致。實施例6、製備的N-乙醯化胸腺素a1的活性分析採用T細胞-E玫瑰花試驗(方法見國家食品藥品監督管理局。WSl-XG-042-2000-2003，附錄-T細胞活性測定法_脫E受體法。《國家藥品標準》第十六冊，2003版；夏天瑤等，T淋巴細胞-E玫瑰花試驗檢測胸腺肽生物學活性影響因素的探討，藥物生物技術，2007，14(3):215-217。)，分析上述實施例1_5製備的N-乙醯化胸腺素a1的生物學活性，參考品為化學合成的N-乙醯化胸腺素a1(商品名Zadaxin，購自解放軍302醫院)。試驗結果見表2。根據國家相關規定，E-花環形成率大於10%為活性合格，即有明顯的活化T細胞的作用。表2N-乙醯化胸腺素a1的活性分析tableseeoriginaldocumentpage16tableseeoriginaldocumentpage17結果表明，上述實施例1-5製備的N-乙醯化胸腺素a1與參考品均具有活化T細胞的作用，且生物活性相似。序列表〈160>21〈210>1〈211>28〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223〉〈400〉1SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGlulieThrThrLysAspLeu151015LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsn2025〈210>2〈211>28〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>2SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGlulieThrlieLysAspLeu151015LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsn25〈210>3〈211>109〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>3SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGlulieThrThrLysAspLeu151015LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsnGlyArgAspAla202530ProAlaAsnGlyAsnAlaAsnGluGluAsnGlyGluGinGluAlaAsp354045AsnGluValAspGluGluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGluGlu505560GluGluGluGlyAspGlyGluGluGluAspGlyAspGluAspGluGlu65707580AlaGluSerAlaThrGlyLysArgAlaAlaGluAspAspGluAspAsp859095AspValAspThrLysLysGinLysThrAspGluAspAsp105〈210>4〈211>99〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>4SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGlulieThrThrLysAspLeu151015LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsnGlyArgAspAla202530ProAlaAsnGlyAsnAlaAsnGluGluAsnGlyGluGinGluAlaAsp354045AsnGluValAspGluGluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGluGlu505560GluGluGluGlyAspGlyGluGluGluAspGlyAspGluAspGluGlu65707580AlaGluSerAlaThrGlyLysArgAlaAlaGluAspAspGluAspAsp859095AspValAsp〈210>5〈211>109〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>5SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGlulieThrThrLysAspLeu151015LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsnGlyArgAspAla202530ProAlaAsnAlaAsnAlaAsnGluGluAsnAlaGluGinGluAlaAsp354045AsnGluValAspGluGluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGluGlu505560GluGluGluGlyAspGlyGluGluGluAspGlyAspGluAspGluGlu65707580AlaGluSerAlaThrGlyLysArgAlaAlaGluAspAspGluAspAsp859095AspValAspThrLysLysGinLysThrAspGluAspAsp105〈210>6〈211>99〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉19(400)6SetAspAlaAlaValAsp／hrSetSetGluIle／hr／hrLysAspLeul5lo15LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAShGlyArgAspAla]202530ProAlaAShAlaAShAlaAShGluGluAShAlaGluGlnGluAlaAsp354045AShGluValAspGluGluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGluGlu505560GluGluGluGlyAspGlyGluGluGluAspGlyAspGluAspGluGlu65707580AlaGluSetAla／hrGlyLysArgAlaAlaGluAspAspGluAspAsp859095AspValAsp<210)7<211)68PRT<213)人工序列(220)(223)(400)7SetAspAlaAlaValAsp／hrSetSetGluIle／hr／hrLysAspLeul5lo15LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAShGlyArgAspAla202530ProAlaAShAlaAShAlaAShGluGluAShAlaGluGlnGluAlaAsp354045AShGluValAspGluGluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGluGlu505560GluGluGluGly65<210)8<211)78PRT9〈211>47〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>9SerAspAlaAlaValAspThrSerSerGluI1510LysGluLysLysGluValValGluGluAlaGluAsnGlyArg202530GluGluGluGluGlyGlyGluGluGluGluGluGluGluGlu354045〈210>10〈211>333〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>10atgtctgatgcagctgtegateccagctccg朋3tc3ccacc朋ggactt朋3ggag朋g60朋gg朋gttgtgg朋gaggc3g朋朋tgg33gagacgcccctgcteacggg朋tgct朋t120gagg朋朋tggggagc3ggaggctgac朋tgaggtegacg朋g朋g3gg3ag朋ggtggg180g3gg3卿ggElggElggEl卿卿3ggtg3tggtg3gg朋g3gg3tgg卿tg3卿tg3g240gaagctgagtcagctacgggcaagcgggcagctgaagatgatgaggatgacgatgtcgat3CC33g33gC3g33g3CCg3Cg3gg3tg3Ctaa〈210>11〈211>303AspLeu15AspGluGly21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>11atgtctgatgcagctgtagataccagctccccaaggactt3肌ggag肌g60肌gg肌gttgtgg肌gElggCag肌肌tgga3g3g3CgCCCctgctaacgg120g3gg肌肌tgggg￡lgC￡lgg￡lgaggtegacg肌g肌gaggaag肌ggtggg180g￡lgg￡l￡lg￡lgg￡lgg￡lgg￡l￡lg￡lag肌ggtgatggtg3gg肌gtg肌gatgag240gaagctgagtcagctacgggc肌gcgggcagctg肌gatgcgatgtcgat300ta303〈210>12〈211>333〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>12atgtctgatgcagctgtagataccagctccccaaggactt3肌ggag肌g60肌gg肌gttgtgg肌gElggC3g3g3CgCCCctgctaacgctaatgctaat120g3gg肌肌tgCtg3gC3gg3gaggtegacg肌g肌gaggaag肌ggtggg180g￡lgg￡l￡lg￡lgg￡lgg￡lgg￡l￡lg￡lag肌ggtgatggtgagg肌gtg肌gatgag240gaagctgagtcagctacgggc肌gcgggcagctg肌gatgcgatgtcgat300g33g3ccgacgagg"gactaa333〈210>13〈211>303〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>13atgtctgatgcagctgtagataccagctccccaaggactt3肌ggag肌g60肌gg肌gttgtgg肌g3ggCag肌肌tgga3g3g3CgCCCctgctaacgctaatgctaat120g3gg肌肌tgCtg3gC3gg3gaggtegacg肌g肌gaggaag肌ggtggg180g￡lgg￡l￡lg￡lgg￡lgg￡lgg￡l￡lg￡lag肌ggtgatggtg3gg肌gtg肌gatgag240gaagctgagtcagctacgggc肌gcgggcagctg肌gatgcgatgtcgat300ta303〈210>14〈211>333〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>14atgtctgacgctgctgttgacacttcttctctaaagacctga肌ga肌肌60肌3g肌gttgttg肌g肌gctg肌肌cggtcgtgacgctccggctaacgctaacgctaac120g肌g肌肌cgCtg肌C3gg3g肌gttgacg肌g肌gaggaag肌ggtggt180g￡l￡lg￡lgg￡lgg￡l￡lg￡l￡lg￡lgg￡l3g肌ggtg3Cggtg肌g肌g3gg3Cggtg3Cg肌g3Cg肌240gaagctgaatctgctactggtaaacgtgctgctg肌gacg3Cg肌g3Cg3cgacgttgac300g3333ctgacg33g3cgactaa333〈210>15〈211>210〈212>DNA〈213〉人工序列23601201802106012014760120180240Ct肌3g3CCtg肌3g肌3肌cggctemcgct肌cgctaac￡l￡lg￡l￡lg￡lgg￡l3g肌ggtggt〈220〉〈223〉〈400>15atgtctgacgg肌g肌肌cg〈223〉〈400>16atgtctgacga肌g肌gttgg3gga肌3g肌gttggaggaggEuaggctgaatctgctgctgttgattgemgemgcctg肌caggactgctgttgattg肌g肌gcgg33gttg肌g朋gc肌gaggaag;actactggtaacacttcttcttg肌肌cggt3gctgac肌caagaatg肌肌cggtcgtgacgctcg肌gttg;acgg3gg3cgtgacg朋gctaaagacct肌gagg朋gaacggtgacga肌g3Cg3Cg33ggtggtg肌gtta3aggtggtg肌cgttgactaa3ggtg;acggtgaagEuagEiggacgtgctgctgaagacgacgg￡iag￡lgg￡lgg〈210>16〈211>147〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉cacttcttctgaaatcactactaaagaccttg肌肌cggtcgtgeicg肌g肌gagg肌gaaag3ggaaga3g〈210>17〈211〉240〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>17atgtctgacgctgctgttgacacttcttctgaaatcacta〈210>18〈211>303〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>18atgtctgacgctgctgttgacacttcttctctaaagacct60a肌g肌gttgttg肌g肌gctg肌肌cggtcgtgacgctccggctaacgctaacgctaac120g肌g肌肌cgCtg肌C3gg3g肌gttgacg肌g肌gaggaag肌ggtggt180g肌gElggElgg肌g肌gagga3g肌ggtg3Cggtg肌g肌g3gg3Cggtg3Cg肌g3Cg肌240g肌gctg肌tctgctactggtaaacgtgctgctg肌gacg3Cg肌g3Cg3cgacgttgac300ta303〈210>19〈211>1251〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>19gttcctatagatgatcctga3g3tgg3ggC肌gcactgggtggtgatcgtggC3ggttC360肌tggctggt3t肌ttataggC3CC3ggC3gacgcgtgccatgcctaccagatcattcac120cgcaatgggattcctgacgaacagatcgttgtgatgatgttgcttactct180g肌gac肌tcccactccaggaattgtgatc肌C3ggCCC3tgtctatcag240ggagtcccga3gg3Ct3C3Ctgg3gaggatgttaccccacaaaatttccttgctgtgttg300ElgElggCgEltgC3g肌gC3gtg肌gggcateggatccggcagagtggcccc360C3gg3tC3Cgtgttcatttacttcactgaccatggatctactggaatactggtttttccc420肌tg肌gatcttcatgtaaagagaccatccattacatgta■atgtaccg肌agatggtgttctacattgaagcctgtgagtctgggtccatgatg肌ccac540ctgccggataacatcaatgtttatgcaactactgctgcca3CCCC3g3g3gtcgtcctac600gcctgttact3tgatgag肌gaggtccacgtacctgggggcgtcaactgg660atgg肌gactcggacgtggaagatctgact肌3g3g3CCCtgC3C肌gC3gtaccacctg720gt肌肌tcgccagccacgtcaatctccacc780atg肌3gtg3tgcagtttcaCgC3肌gCC3gttctcccgtccccctacct840ccagtcacacaccttgacctC3CCCCC3gCcctgatgtgcctctcaccatcatg肌肌gg900肌3Ctg3tg3tctggaggagtccaggcagctC3Cgg3gg3gatccagcgg960catctggatgccaggcaccttcagtgcgtaagatcgtctccttgctggca1020gcgtccgaggctgaggtggagcagctcctgtccgagagagccccgctcacggggC3C3gC1080tgctacccagaggccctgctgcacttccggacccactgcttcaactggcactcccccacg1140tacgagtatgtttgtacgtgctggtcaacctttgtgag肌gccgtatcca1200cttcacaggataaaattgtccatggaccacgtgtg'ccttggtcactactaa1251〈210>20〈211>765〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>20atgtctgacgctgctgttgacacttcttctctaaagacctga肌ga肌肌60a肌g肌gttgttg肌g肌gctg肌肌cggtatgtcccctatactaggtta26120肌gggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatc180catttgtatgagcgcgatgatggCg肌3C3肌肌gtttgaattgggtttg240gagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgtteaattaacacagtctatggcc300atcatacgttatatagctgaC肌gC3C33CatgttgggtggttgtCC肌33g3gCgtgC3360gagatttc肌tgcttg肌ggagcggttttg3CggtgtttCgag肌ttgca420tat3gta肌gactttgaaactctcaaagttgattttcttagc肌gctecctga肌tgctg■肌肌tgttcgaagatcgtttatggtgatcatgt肌cccat540cctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctg600gatgcgttccc肌肌ttagtttgttttaaaaagctatcccacaaattgat660肌gtacttga肌tccagc肌tggcctttgc3gggCtggC33gCC3Cgttt720ggtggtggcgaccatcctccaaaatcgg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