評估和鑑定或發展條件活性治療蛋白的方法

2023-04-25 10:49:26 2

專利名稱：評估和鑑定或發展條件活性治療蛋白的方法
技術領域：
本發明提供發展或選擇不良副作用降低的治療蛋白的方法和所得的蛋白。
背景技術：
蛋白作為藥劑或治療劑具有治療廣泛多種人類疾病的作用，例如癌症、血友病、貧血以及糖尿病，並且對於許多疾病而言，它們是唯一有效的治療方案。因此，需要鑑定活性或特性改變或改善的蛋白治療劑。鑑定或產生此類蛋白是本發明的目的之一。發明概述本發明提供鑑定/選擇條件活性蛋白的方法。在所述方法中，在期望該活性正常或增強的條件下測試蛋白的活性，並且在期望與正常活性相比活性降低的條件下測試蛋白的活性。可以將在期望該活性正常或增強的條件下的蛋白的活性，與在期望與正常活性相比活性降低的條件下的蛋白的活性進行比較。可以選擇和/或鑑定，相比期望與正常活性相比活性降低的條件，在期望該活性正常或增強的條件下活性更大的蛋白。

在所述方法中，與正常活性相比，可以降低期望與正常活性相比活性降低的條件下的蛋白的活性。在所述方法中，除了使蛋白是條件活性的一種條件或多種條件之外，期望該活性正常或增強的條件和期望與正常活性相比活性降低的條件可以是相同的。在本發明的方法中，所測試的活性可以是與蛋白靶標的結合。可以將靶標固定於固相支持物。在本發明的方法中，可以利用免疫測定評估活性。免疫測定包括ELISA免疫測定、異相免疫測定以及均相免疫測定。在本發明的方法中，期望蛋白活性正常或增強的條件可以模擬疾病微環境，並且期望與正常活性相比活性降低的條件可以模擬健康組織環境。健康組織環境的實例是非腫瘤組織環境，如系統環境或健康組織。健康組織的實例是GI道、皮膚、脈管系統、血液以及細胞外基質。患病微環境的實例是腫瘤微環境。腫瘤或疾病微環境的PH可以比中性pH低或者比健康組織微環境的PH低。腫瘤或疾病微環境可以包括下述中的一種或多種:血管形成增加、缺氧、PH降低、組織間隙液壓增加、標誌腫瘤或其他疾病的代謝物或代謝改變。例如，與健康微環境相比，腫瘤或其他疾病微環境的乳酸鹽濃度可以升高和/或丙酮酸鹽濃度增加。本發明還提供這樣的方法，在所述方法中，與期望與正常活性相比活性降低的條件相比，期望蛋白的活性正常或增強的條件可以包括低於中性的pH和升高的乳酸。在本發明的方法中，所測試的蛋白可以是治療蛋白和/或具有在健康組織中表現出不期望的副作用的蛋白。在本發明的方法中，在期望與正常活性相比活性降低的條件下降低蛋白的活性，可以改善或防止不期望的副作用。在本發明所提供的方法中，可以在存在人血清的情況下，測試蛋白的活性。人血清可以以模擬生理條件的量存在，並且在期望該活性正常或增強的條件下存在的血清的量，可以與在期望與正常活性相比活性降低的條件下存在的血清的量相同。例如，按體積計，可以在存在下述百分比的人血清的情況下實施本發明所提供的方法:至少約或為3%_30%，含 3% 和 30%,或 5%-30%，含 5% 和 30%,或 5%_25%，含 5% 和 25%, 10%_30%，含 10% 和 30%,或15%-30%，含15%和30%，或15%-25%，含15%和25%中的任一濃度的人血清，包括25%或約25% (加減10%)的人血清。在本發明所提供的方法中，可以在期望該活性正常或增強的條件下和在期望與正常活性相比活性降低的條件下測試多種蛋白的活性。在這個具體方法中，可以在兩種條件下測試每種蛋白，並且可以選擇在期望該活性正常或增強的條件下比在期望與正常活性相比活性降低的條件下活性更大的任何蛋白。在一些實例中，活性高於預定量或比。例如，活性增強至少 5%、10%、15%、20%、25%、35%、50%、100%、2 倍、5 倍、10 倍、20 倍或更多。在本發明所提供的方法中，靶蛋白可以是受體或其結合配體的一部分。靶蛋白的實例是受體，所述受體是腫瘤抗原。例如，革巴蛋白Her受體家族的成員，或革巴蛋白是EGFR受體或其細胞外結構域。在本發明所提供的方法中，活性受到測試的蛋白(受試蛋白)可以是治療腫瘤或其他疾病的治療蛋白。在一些實例中，治療蛋白是抗體、酶、激素、細胞因子或其活性部分，並且在本發明中提及抗體指抗體或其抗原結合片段。在本發明所提供的方法的其他實例中，蛋白可以是治療蛋白的修飾變體。治療蛋白的實例是靶受體的配體。在本發明所提供的方法的一些實例中，蛋白含有多聚化結構域，諸如，例如，含有Fe結構域或修飾的Fe結構域的多聚化結構域。在實例性方法中，治療蛋白是抗體、酶、激素或細胞因子。例如，治療蛋白是抗體。

在本發明所提供的方法中，在所述方法中受到測試的蛋白可以是選自表5(即本說明書中列舉了示例性抗腫瘤抗體的表)所列那些抗腫瘤抗體的抗體。在一些實例中，抗腫瘤抗體在健康組織中表現出不期望的副作用。例如，所述抗體是在健康組織中表現出不期望的副作用的抗EGFR抗體或抗CTLA4抗體。在本發明所提供的方法的其他實例中，蛋白可以是治療蛋白的修飾變體。修飾變體可以含有胺基酸取代、插入和/或缺失。在一些實例中，測試了變體的集合。在一些實例中，每種變體與野生型或非修飾蛋白和所有其他變體的不同之處在於一個胺基酸。在其他實例中，每種變體含有2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或更多個不同於非修飾的或野生型蛋白的胺基酸。在本發明所提供的方法中，在變體的集合中，在每一改變的位置處的胺基酸，被除了最初胺基酸之外的多達1-19種胺基酸取代。在其他實例中，組氨酸是取代胺基酸，或蛋白中的胺基酸被非鹼性或不帶電荷的胺基酸取代。可以單獨測試每一變異蛋白。例如，可以以高通量模式或自動化方法測試每一變異蛋白。在本發明所提供的方法中，所選的蛋白可以是條件活性的，從而使得其與在非腫瘤環境中相比，在腫瘤或其他疾病微環境中的活性更強。可以將本發明所提供的方法重複多次，其中在每一次重複中，測試所選的一種或多種蛋白的其他變體，由此使治療蛋白發展為表現出毒性降低或不良副作用降低。在本發明所提供的方法中，可以通過由含有編碼變異蛋白的核酸分子的載體表達，產生所述變異蛋白。在本發明所提供的方法的一些實例中，所測試的蛋白是在CDR中含有一個或多個胺基酸取代的變異抗體。在具體實例中，沿著蛋白或其所選部分的長度，用多達19種其他胺基酸逐一取代每一胺基酸。在其他實例中，蛋白是抗體，並且所選部分是CDR。在一實例中，治療蛋白是抗EGFR抗體，並且降低的不良副作用是與抗體的系統暴露相關的降低的皮膚毒性。在本發明所提供的方法的一些實例中，腫瘤或其他疾病微環境的PH約為或為5.8-6.8，並且含5.8和6.8。在其他實例中，所選的蛋白是在這樣的腫瘤微環境中優先結合EGFR的抗EGFR抗體，即與正常生理pH7.3-7.4和低於12mM的正常乳酸鹽濃度相比，所述所述微環境PH降低為5.8-6.8，並且乳酸鹽濃度約為12-20mM。本發明提供用於鑑定條件活性蛋白的方法，其中所述方法通過以下方式實施:使塗覆了 EGFR或EGFR E⑶的固相支持物與pH約為7.3-7.4、含有ImM乳酸和約25%人血清的緩衝液接觸；使第二副本支持物與PH約為6、含有12-20mM如16.6mM乳酸和約25%人血清的緩衝液接觸；用相應的緩衝液(PH6.0或pH7.4)洗滌所述支持物；在具有乳酸和人血清的pH7.4的緩衝液中或在具有乳酸和人血清的pH6.0的緩衝液中將抗EGFR標記的如FLAG標記的標準品結合於相應的支持物；以及通過在相應的緩衝液中添加山羊抗Tag酶如辣根過氧化物酶(HRP)和酶底物，檢測抗EGFR與EGFR的結合，以檢測或定量抗EGFR與每一支持物的結合。本發明還提供利用本發明所提供的任何方法選擇/鑑定或發展的治療蛋白。本發明還提供與非修飾的抗體相比表現出降低的皮膚毒性的變異抗腫瘤抗體。本發明還提供與Erbitux相比表現出降低的皮膚毒性的抗EGFR抗體。 本發明提供用於鑑定/選擇治療腫瘤且在低pH下比在中性pH更具有活性的治療蛋白。在所述方法中，在包 括低PH的條件下測試所述蛋白的活性，且在包括中性pH的條件下測試所述蛋白的活性。可以將在包括低PH的條件下的所述蛋白的活性，與在包括中性pH的條件下的所述蛋白的活性進行比較。可以選擇和/或鑑定在低PH下比在高pH下更具有活性的蛋白。低pH可以是小於7.4的任何pH，例如介於或約介於5.8-6.8之間。中性pH也可以是介於或介於約7.2-7.6之間的任何pH，如7.4。在所述方法中，包括低pH的條件可以包括選自乳酸鹽濃度增加、丙酮酸鹽濃度增加以及缺氧的一種或多種條件。例如，包括低pH的條件可以包括選自以下的增加的乳酸鹽濃度:10mM至20mM的乳酸或15mM至18mM的乳酸；或至少約或16mM、16.5mM或17mM的乳酸。在所述方法中，包括中性PH的條件可以包括選自以下的乳酸鹽濃度:0.5-5mM或0.2mM至4mM的乳酸；或0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸，或為或約為0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。本發明還提供用於鑑定鑑定/選擇在腫瘤微環境中比在非腫瘤微環境中更具有活性的治療蛋白。在所述方法中，在存在於期望該活性的腫瘤微環境而不是非腫瘤環境中的條件下測試所述蛋白，並且在存在於非腫瘤微環境中的條件下測試所述蛋白的活性。可以將在存在於腫瘤微環境中的條件下的蛋白活性，與存在於非腫瘤微環境中的條件下的蛋白活性進行比較。可以選擇和/或鑑定與在存在於非腫瘤微環境中的條件下相比，在存在於腫瘤微環境中的條件下活性更強的蛋白，從而鑑定在腫瘤微環境中比在非腫瘤微環境中更具有活性的蛋白。非腫瘤微環境可以是系統微環境和/或健康組織，如胃腸(GI)道、皮膚、脈管系統、血液或細胞外基質。除了存在於腫瘤微環境中而不存在於非腫瘤微環境中的一種或多種條件之外，可以在相同的條件下測試在包括低pH的條件下和在包括中性pH的條件下的蛋白活性。存在於腫瘤微環境中的條件的實例包括諸如血管形成增加、缺氧、PH降低、乳酸鹽濃度增加、丙酮酸鹽濃度增加、組織間隙液壓增加以及標誌腫瘤的的代謝物或代謝改變的一種或多種特性。存在於腫瘤微環境中的條件可以包括比中性pH低的pH或比非腫瘤微環境的pH低的pH。例如，存在於腫瘤微環境中的條件可以是低於7.4的pH。在一些實例中，腫瘤的PH約為或為5.8-6.8，含5.8和6.8，並且存在於腫瘤微環境中的條件是pH介於或約介於5.8-6.8之間。存在於腫瘤微環境中的條件可以包括與存在於非腫瘤微環境中的條件相比升高的乳酸鹽濃度和/或增加的丙酮酸鹽濃度。存在於期望該活性的腫瘤微環境而不是非腫瘤環境中的、測試蛋白的條件可以包括比中性pH低的pH和與包括存在於非腫瘤微環境中的條件的、測試蛋白的條件相比升高的乳酸濃度。例如，比中性PH低的pH可以介於5.8-6.8之間，含5.8和6.8，或5.8-6.5之間，含5.8和6.5。存在於期望該活性的腫瘤微環境而不是非腫瘤環境中的、測試蛋白的條件可以包括選自以下的增加的乳酸鹽濃度:10mM至20mM的乳酸或15mM至18mM的乳酸；或至少約或是16mM、16.5mM或17mM的乳酸。存在於非腫瘤微環境中的、測試蛋白的條件可以包括選自以下的乳酸鹽濃度:0.5-5mM或0.的乳酸；或0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸，或約0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。在所述方法的一些實例中，所述蛋白是治療腫瘤的治療蛋白。在一些實例中，治療蛋白是抗體、酶、激素、細胞因子或其活性部分。在本文中提到本發明的抗體，包括抗體或其抗原結合片段。在一些實例中，所述治療蛋白是靶受體的配體和/或抗腫瘤抗體。用於本發明所提供的方法中的抗腫瘤抗體包括西妥昔單抗(Cetuximab (Erbitux ))、曲妥珠單抗(Trastuzumab (Herceptin ))、利妥昔單
抗(Rituximab (Ritlixan , MabThera ))、貝伐單抗(Bevacizumab (Avastin ))>
阿侖單抗(Alemtuzumab (Campath ))、帕尼單抗(Panitumumab (Vectibix ))、
雷珠單抗(Ranibizumab (LllCCntis )) ^ Ibritumomab λ 替伊莫單抗(Ibritumomab
tiuxetan) (Ze￥alin )).、託西莫單抗(Tositumomab)、碘1131託西莫單抗
(BEXXAR⑩)、卡妥索單抗(Catumaxomab (Removab ))、吉妥珠單抗、
吉妥珠單抗奧唑米星(Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg ))、阿貝西普
(Abatacept (CTLA4_Ig，Orencia;H )) ^ 貝拉西普(Belatacept (L104EA29YIg; LEA
29Y;LEA))λ 伊匹單抗(Ipilimumab(MDX-010，MDX-101))、曲美目單抗(Tremelimumab (ticilimumab，CP-675，206))、PRS-0 10、PRS-050、阿桕西普(Af Iiberc印t (VEGFTrap, AVE005))、伏洛昔單抗(Volociximab (M200))、F200、M0RAb-009、SSlP (CAT-5001)、西妥木單抗(Cixutumumab (IMC-A12))，馬妥珠單抗(Matuzumab (EMD72000))、尼妥珠單抗(Nimotuzumab (h_R3))、扎魯目單抗(Zalutumumab (HuMax-EGFR))、奈昔木單抗(Necitumumab) IMC-1lF8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。在一些實例中，所述抗腫瘤
抗體是西妥昔單抗(E l b it U X.Η')...
本發明所提供的方法可以在體外或體內實施。在本發明所提供的方法中，可以測試多種蛋白，並且可以選擇與中性pH相比在低PH條件下活性更強的蛋白。在本發明所提供的方法中，可以測試多種蛋白，並且可以選擇在存在於腫瘤微環境中的條件下比非腫瘤微環境活性更強的蛋白。所述多種蛋白可以包括治療蛋白的修飾變體，並且可以測試變體的集合。治療蛋白可以包括多聚化結構域，且多聚化結構域可以包括Fe結構域或修飾的Fe結構域。治療蛋白可以是抗體(包括抗腫瘤抗體)、酶、激素或細胞因子。在本發明所提供的方法中，抗腫瘤抗體可以選自西妥昔單抗(Erbitux )、曲妥珠單抗(Herceptin )、
利妥昔單抗(Rituxan , MabThera )、貝伐單抗(Avastin )、阿侖單抗(Campath )、
帕尼單抗CVectibk )、雷珠單抗(Lueentis )、Ibritumomab、替伊莫單抗
(Ibritumomab tiuxetan, Zevalin )、託西莫單抗、碘 Il3I 託西莫單抗(BEXXAR )、
卡妥索單抗(Removab )、吉妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星(Mylotarg )、阿貝
西普(CTLA4-1g, Orenda )、貝拉西普(L104EA29YIg; LEA29Y; LEA)、伊匹單抗
(MDX-010, MDX-101)、曲美目單抗(ticilimumab, CP-675, 206)、PRS-010、PRS_050、阿柏西普(VEGF Trap, AVE005)、伏洛昔單抗(M200)、F200、M0RAb-009、SSlP (CAT-5001)、西妥木單抗(IMC-A12)、馬妥珠單抗(EMD72000)、尼妥珠單抗(h_R3)、扎魯目單抗(HuMax-EGFR)、奈昔木單抗 MC-llF8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。

治療蛋白或多種治療蛋白的修飾變體，與所述治療蛋白的非修飾形式相比，可以包括一個胺基酸殘基或多個胺基酸殘基的取代、插入和/或缺失。例如，每一變異蛋白，與所述治療蛋白的非修飾形式相比，可以含有單個胺基酸取代。每一變異蛋白，與所述變異蛋白如治療抗體的非修飾形式相比，可以含有2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或更多個胺基酸取代。在一些實例中，所測試的蛋白是與抗體的非修飾形式相比在互補性決定區(OTR)中包含一個或多個胺基酸取代的變異抗體。在本發明所提供的方法中，可以測試治療蛋白的變體，所述變體可以在每一改變的位置包括被多達1-19種除了在所述位置的最初胺基酸以外的其他胺基酸取代的胺基酸，並且每個胺基酸可以沿著所述治療蛋白或其所選部分的長度被取代。本發明提供修飾蛋白是抗體並且其受到修飾的所選部分是CDR的方法。取代胺基酸可以選自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys>Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp> Tyr以及Val,前提條件是取代胺基酸不同於所述治療蛋白相應位置處的胺基酸。取代胺基酸的實例是組氨酸。在一些實例中，蛋白中的組氨酸被非鹼性或不帶電荷胺基酸取代。在一些方法中，修飾包括用選自Arg、Asp、Glu、His以及Lys的胺基酸進行的胺基酸取代，在一些實例中，用Hi s進行取代。
在本發明所提供的方法中，可以在例如陣列，包括可尋址陣列中，測試每一變異蛋白，如集合中的變異蛋白。在本發明所提供的方法中，測試的活性可以是與治療蛋白的靶蛋白的結合。結合可以利用免疫測定如ELISA來評估。免疫測定的實例是異相免疫測定，所述異相免疫測定可以包括，將靶蛋白固定於固相支持物；使治療蛋白與靶蛋白接觸，其中可檢測地標記治療蛋白；除去未結合的治療蛋白；以及檢測或測量標記的治療蛋白與靶蛋白的結合。免疫測定可以是均相的，包括使治療蛋白與靶蛋白接觸，其中可檢測地標記治療蛋白；並檢測或測量標記的治療蛋白與靶蛋白的結合。本發明提供利用細胞表面表達系統評估結合活性的方法，所述細胞表面表達系統包含在表面表達治療蛋白的一種或多種細胞。治療蛋白可以在細胞表面表達，可使靶蛋白與細胞群接觸；可以鑑定結合靶蛋白的一種或多種細胞，從而鑑定表現出結合活性的治療蛋白。可以可檢測地標記或可以檢測靶蛋白。可以螢光標記或利用螢光標記的第二試劑檢測靶蛋白。利用螢光激活細胞分選術(FACS)，可以檢測或測量結合。可以在利用細胞表面表達系統的方法中測試結合活性，所述細胞表面表達系統包含表達治療蛋白的細胞，並且可以選擇結合靶蛋白的一種或多種細胞，和選擇不結合靶蛋白的一種或多種細胞。可以分離所選的不結合靶蛋白的一種或多種細胞，並使其於細胞培養基中生長，以便產生在表面表達治療蛋白的第二細胞群。在一些實例中，在條件下測試結合活性，從而使來自第二細胞群的細胞與靶蛋白接觸，並且鑑定結合靶蛋白的一種或多種細胞。附圖的簡單描述

圖1.單克隆抗體ErbituxOI的序列。圖1描繪了 ErbiUixt的序列(seq ID NO: I和2)。圖1A描繪了重鏈的序列。 圖1B描繪了輕鏈的序列。可變鏈加有下劃線，且修飾所選的殘基以粗體、斜體顯示。詳細描述概要A.定義B.方法綜述C.體外生理敏感方法1.含有靶蛋白的支持物2.在濃密的結合條件下接觸結合生物分子a.變異蛋白產生b.抗體變體 示例性的抗體結合分子:抗EGFR抗體3.腫瘤特異性結合分子的檢測和鑑定D.表達蛋白的方法1.載體2.細胞和表達系統a.原核表達
b.酵母c.昆蟲d.哺乳動物細胞e.植物3.純化E.實施例A.定義除非另有定義，否則本文所用的所有科技術語與本發明所屬技術領域技術人員通常所理解的具有相同的涵義。除非另有指出，否則將本文的整個公開所提到的所有專利、專利申請、公開的申請和出版物、GenBank序列、資料庫、網站和其他公開的材料通過引用整體併入。在本文的術語由多個定義的情況下，以本部分中的定義為準。如果參考URL或其他測量標示符或地址，應當理解到，這類標示符可以變化，並且網際網路上的具體信息可能來來往往，但是通過檢索網際網路，可以發現等同信息。對其進行參考，證明了這類信息的可利用性和公眾傳播。本文所用的條件活性蛋白在一種環境、特別是一種體內環境中，與第二環境相比，更具有活性。例如，條件活性蛋白可以在腫瘤環境中比在非腫瘤環境如皮膚、GI道的非腫瘤環境或其他非腫瘤環境中更具有活性。本發明所用的治療蛋白是已經用於治療患有疾病或疾病狀況的個體、可以用於治療或是用於治療的候選者的蛋白。例如，用於療法的候選者是已經用於療法的治療蛋白的變體(例如含有胺基酸修飾)。出於本發明的目的，治療蛋白，包括已經用於治療、可以用於治療或是治療的候選者的 蛋白在內，可以用於本發明所述方法實踐中，作為測試蛋白來鑑定在一組條件下比在另一在條件下表現出更多活性的治療蛋白，並因此是治療活性的。本文所用的「測試蛋白」、「受試蛋白」 「結合分子」、「結合蛋白」或其其他變型，指用於本發明所述方法中的分子或蛋白。本發明所述方法可以使用任何分子或蛋白來鑑定是條件活性的並且與存在於非患病微環境中的一種或多種條件相比在存在於患病微環境(如腫瘤微環境)中的一種或多種條件中表現出活性的蛋白。為了發展條件活性的治療劑，受試蛋白的實例是治療蛋白。示例性的受試蛋白列於表3中。本發明所用的抗體指免疫球蛋白或免疫球蛋白部分，無論其是天然的或部分或全部合成的，如重組產生的，包括其含有免疫球蛋白分子的足以形成抗原結合位點的可變區的至少一部分的任何部分。因此，抗體或其部分包括具有與免疫球蛋白抗原結合位點同源或基本上同源的結合結構域的任何蛋白。例如，抗體指含有兩條重鏈(其可以表示為H和H』 )和兩條輕鏈(其可以表示為L和L』 )的抗體，其中每一條重鏈都可以是全長免疫球蛋白重鏈或其足以形成抗原結合位點的一部分(例如，重鏈包括但不限於Vh鏈、Vh-ChI鏈、以及Vh-Ch1-Ch2-Ch3鏈)，並且每條輕鏈都可以是全長輕鏈或其足以形成抗原結合位點的一部分(例如，輕鏈可以包括但不限於\鏈和鏈)。每一條重鏈(H和H』)都與每一條輕鏈(分別為L和L』)配對。通常，抗體最低限度包括所有或至少部分可變重(Vh)鏈和/或可變輕鏈。抗體還可以包括所有或部分恆定區。出於本發明的目的，術語抗體包括全長抗體和其部分，包括抗體片段，如但不限於Fab、Fab』、F(ab，)2、單鏈 Fv (scFv)、Fv、dsFv、雙價抗體(diabody)、Fd 和 Fd，片段、Fab 片段、Fd片段以及scFv片段。其他已知的片段包括但不限於scFab片段(Hust et al.，BMCBiotechnology (2007), 7:14)。抗體包括任何免疫球蛋白類別的成員，包括IgG、IgM、IgA、IgD 以及 IgE0本發明所用的全長抗體是具有兩條全長重鏈(如Vh-Ch1-Ch2_Ch3或Vh-Ch1-Ch2-Ch3-Ch4)和兩條全長輕鏈('-CJ以及鉸鏈區的抗體，如抗體分泌B細胞所產生的人類抗體和具有合成產生的相同結構域的抗體。對於抗體的「其部分」「其片段」，本文所用的抗體片段或抗體部分指全長抗體的任何部分，其小於全長，但是含有足以形成抗原結合位點的抗體可變區的至少一部分(如一個或多個CDR)並且因此保留了全長抗體的結合特異性和/或活性；抗體片段包括全長抗體的酶促處理所產生的抗體衍生物以及合成如重組產生的衍生物。抗體片段的實例包括但不限於Fab、Fab』、F (ab，) 2、單鏈Fv (scFv)、Fv、dsFv、雙價抗體、Fd以及Fd』片段(參閱例如Methods in Molecular Biology, Vol207: Recombinant抗體for Cancer Therapy Methodsand Protocols (2003) ; Chapterl; p3_25, Kipriyanov)。片段可以包括諸如通過二硫鍵和 /或通過肽連接體而連接在一起的多條鏈。抗體片段通常含有至少約50個胺基酸並通常含有至少200個胺基酸。因此，提到「抗體或其足以形成抗原結合位點的部分」表示，抗體或其部分含有足以保留含有所有6個⑶R的相應全長抗體的至少一部分結合特異性的Vh和\的至少I個或2個、通常3個、4個、5個 或所有6個⑶R。通常，足夠的抗原結合位點至少需要重鏈的⑶R3(⑶RH3)。其通常還需要輕鏈的⑶R3(⑶RL3)。如本文所述，本領域技術人員知道並且能夠基於卡巴特(kabat)或 Chothia 編號(參見例如 Kabat, E.A.et al.(1991) Sequencesof Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Healthand Human Services, NIH Publication N0.91-3242,和 Chothia, C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)鑑定 CDR。本發明所用的互補決定區(CDR ;也稱為高變區)是抗體內決定蛋白對特異性抗原的親和性和特異性的區域。因此，CDR是結合抗原決定子的抗原可變區內的有限區域。抗體的CDR是已知的或可以基於卡巴特或Chothia編號來確定,這對於本領域技術人員而言是已知的。本發明所用的，「抗原結合位點」指一個或多個互補決定區(⑶R ;也稱為高變區)所形成的界面。每一個抗原結合位點含有3個來自重鏈可變區的CDR和3個來自輕鏈可變區的CDR。抗體分子具有2個抗原結合位點，每個位點都含有重鏈可變區的部分和輕鏈可變區的部分。除了 CDR之外，抗原結合位點還可以含有可變區結構域的其他部分。本發明所用的Fv抗體片段由通過非共價相互作用而連接的一可變重鏈結構域(Vh)和一可變輕鏈結構域構成。本發明所用的dsFv指具有穩定Vh-V1j對的改造的分子間二硫鍵的Fv。本發明所用的Fd片段是含有抗體重鏈的可變結構域(Vh)和一個恆定區結構域(ChI)的抗體片段。本發明所用的「Fab片段」是含有用木瓜蛋白酶消化全長免疫球蛋白所產生的部分全長抗體的抗體片段，或合成或重組產生的具有相同結果的片段。Fab片段含有輕鏈(含有'和Q部分)以及含有重鏈(Vh)的可變區和重鏈的一個恆定區結構域部分(ChI)的另一鏈；其可以重組產生。本發明所用的F(ab』)2片段是用胃蛋白酶於pH4.0-4.5消化免疫球蛋白而產生的抗體片段或合成如重組產生的具有相同結構的抗體。F(ab』)2片段含有兩個Fab片段，但是其中每條重鏈部分都含有形成連接所述兩個片段的二硫鍵的少數其他胺基酸，包括半胱
氨酸殘基；其可以重組產生。Fab』片段是含有一半F(ab』 )2片段的片段(一條重鏈和一條輕鏈)。本發明所用的Fd』片段是含有F(ab』)2片段的一重鏈部分的抗體的片段。本發明所用的Fv』片段僅含有抗體分子的Vh和\結構域的片段。本發明所用的scFv片段指含有通過多肽連接體以任何順序共價連接的可變輕鏈(Vl)和可變重鏈(Vh)的抗體片段。連接體具有的長度使得兩個可變結構域橋接，而無實質幹擾。示例性的連接體是(Gly-Ser)n殘基，伴隨一些Glu或Lys殘基分散於其中，以增加溶解度。本發明所用的雙價抗體是二聚scFv ;雙價抗體通常具有比scFv短的肽連接體,並且它們優先二聚化。本發明所用的，hsFv指這樣的抗體片段，在所述抗體片段中，通常存在於Fab片段中的恆定結構域已經被異二聚體捲曲螺旋結構域取代(參見例如Arndt et al.(2001) JMol Biol.7:312:221-228)。本文針對抗體所用的「可變結構域」是抗體重鏈或輕鏈的、含有在不同抗體間變化的胺基酸序列的特定Ig結構域。每一條輕鏈和每一條重鏈都具有一個可變區結構域('和Vh)。可變結構域提供了抗原特異性，並因此負責抗原設別。每一可變區結構域都含有是抗原結合位點結構域的一部分的CDR和構架區(FR)。如本發明所用，提到可變重(Vh)鏈或可變輕(')鏈(也稱為Vh結構域或\結構域)指構成抗體的可變結構域的多肽鏈。本發明所用的構架區(FR)是抗體可變區結構域內位於β摺疊內的區域；FR區在其胺基酸序列方面比較而言比高變區保守。本發明所用的恆定結構域是抗體重鏈或輕鏈中含有在抗體間相比較而言比可變區結構域更保守的胺基酸序列的結構域。每一條輕鏈都具有單個輕鏈恆定區(Q)結構域，且每一條重鏈都含有一個或多個重鏈恆定區(Ch)結構域』其包括^^、^^、^^以及Ch4。全長IgA、IgD以及IgG同種型含有CH1、Ch2、Ch3和鉸鏈區，而IgE和IgM含有CH1、CH2、CH3和Ch4。ChI和Q結構域延長抗體的Fab臂，因此有助於與抗原的相互作用和抗體臂的旋轉。抗體恆定區可以發揮效應子功能，諸如但不限於清除抗體例如通過與各種細胞、生物分子和組織的相互作用特異性結合的抗原、病原體和毒素。本發明所用的抗體形式指抗體的具體結構。本發明的抗體包括全長抗體和其部分，諸如，例如Fab片段或其他抗體片段。因此，Fab是抗體的具體形式。如本發明所用，提到抗體的「相應形式」表示，當比較兩個抗體的特性或者活性時，利用相同形式的抗體比較特性。例如，如果提到與第一抗體的相應形式的活性相比，抗體的的活性較少，這表示，所述抗體的具體形式，如Fab，與第一抗體的Fab形式相比具有較少的活性。 本發明針對相應殘基所用的相應的，例如「對應於……的胺基酸殘基」，指在為相關序列的兩條多肽(如等位基因變體、同一家族的基因、物種變體)之間或之中比較的殘基。本領域技術人員能夠容易地鑑定在多肽之間或之中對應的殘基。例如，通過比對兩條序列，本領域技術人員能夠利用保守和相同胺基酸作為指導鑑定相應的殘基。本領域技術人員能夠手動比對序列或可以使用可用的許多比對程序中的任何程序(例如，BLAST)。因此，彼此對應的胺基酸殘基或位置，是基於與指定的參照多肽的序列和/或結構比對，經測定彼此對應的殘基。本發明所用的「連接」或「間隔」肽指連接兩條多肽序列的短胺基酸序列(或編碼這類胺基酸序列的核酸)。「肽連接體」指連接兩條多肽序列的短胺基酸序列。多肽連接體的實例是，將肽截短結構域連接於抗體的連接體或連接合成抗體片段如scFv片段的兩條抗體鏈的連接體。連接體是熟知的，並且任何已知的連接體都可以用於所提供的方法中。多肽連接體的實例是(Gly-Ser)n胺基酸序列，伴隨一些Glu或Lys殘基分散於其中，以增加溶解度。其他示例性的連接體在本文中有描述；這些和其他已知的連接體中的任何連接體都可以與所提供的組合物和方法一起使用。本文所用的「人血清」指正常血清，其可以通過匯集約等量的來自未患有任何可通過輸血傳播的疾病的人的凝結的全血的液體部分而獲得。如本文所用，提到「可檢測的」或「可檢測標記的」指原子、分子或組分，其中可以直接或間接測量原子、分子或組分的存在。可檢測標記可以用於在本發明所提供的方法中鑑定一種或多種蛋白。可檢測標記可以用於本發明所提供的任何方法中。可檢測標記包括例如化學發光部分、生物發光部分、螢光部分、放射性核素以及金屬。檢測標記的方法在本領域是熟知的。可以通過視覺檢查、螢光光譜、反射測量以及流式細胞術來檢測這類標記。間接檢測指測量直接或間接結合可檢測標記的原子、分子或組分的物理現象，如直接或間接結合可檢測標記的原子、分子或組分的能量或粒子發射或吸收。在間接檢測的非限制性實例中，可檢測標記可以是生物素，其可以通過結合抗生物素而得到檢測。因此，包括於可檢測標記或可檢測部分範圍內的是，涉及原子、分子或組分的結合標記或結合部分，其中作為結合另一原子、分子或組分的標記或部分的結果，可以檢測原子、分子或組分的存在。本文所用的 標記是可以直接或間接附著於或連接於分子或與之結合的可檢測標記。檢測方法可以是本領域已知的任何方法。本文所用的「篩選」指基於抗體或其部分的活性或特性的確定，從許多抗體如抗體集合或文庫和/或其部分中鑑定或選擇蛋白，例如人抗體或其部分。篩選可以以多種方式中的任何方式實施，並且通常涉及使集合的成員與靶蛋白或抗原接觸，並評估特性或活性，例如利用評估抗體與靶蛋白直接結合(結合親和性)的測定或利用評估靶蛋白活性調節的功能測定。從獲得抗體或其部分與靶蛋白結合的絕對值和/或抗體或其部分對靶蛋白調節的絕對值的意義上講，以及從獲得標誌結合或活性水平的指數、比、百分比、視覺或其他值的意義上講，本文所用術語「評估」或「測試」意圖包括定量和定性測定。評估可以是直接的或間接的。例如，結合可以通過用可檢測標記直接標記抗體或其部分和/或通過利用自標記的第二抗體測定。此外，利用本領域技術人員已知的多種測定中的任何測定例如中和測定和本文所述的其他測定，並比較在存在與不存在抗體或其部分的情況下的膜伴隨抗原(如住病毒的細胞)的活性，來測定功能活性。
本文所用的「高通量」指允許操作大量分子或化合物、通常從數十到數百到數千化合物的大規模方法或過程。例如，可以使純化和篩選方法是高通量的。高通量方法可以手動進行。然而，高通量方法通常涉及自動化、機器人或軟體。本文所用的「靶蛋白」或「蛋白的靶標」是能結合測試分子或蛋白或與之相互作用的蛋白、抗原或基質。本文所用的"疾病」指起因於包括但不限於感染、後天條件、基因條件等的原因或條件並且特徵為可確認的症狀的生物體的病理狀態。疾病包括癌症和腫瘤。本文所用的「患病微環境」指在具體微環境中與正常組織相比，在疾病組織中發生改變或變化的具體條件。這些條件包括例如血管形成改變升高或變化，缺氧、pH改變、輔因子、組織間隙液壓以及代謝物水平如乳酸鹽或丙酮酸鹽水平改變。本文所用的「非患病微環境」或「健康組織環境」條件指在正常生理條件下存在的條件。例如，在正常的生理條件下，非患病微環境如非患病組織的pH可以是中性的。本文所用的「模擬疾病或非患病微環境的條件」指對應於存在於體內環境中的一種或多種條件的體外或體內測定條件。例如，如果微環境的特徵是低PH，則模擬微環境的條件包括具有低pH的緩衝液或測定條件。本文所用的存在於腫瘤微環境中的條件包括，與非腫瘤微環境(如健康或非患病細胞或組織)相比存在於其中的條件。存在於腫瘤微環境中的條件包括血管形成增加、缺氧、低pH、乳酸鹽濃度 增加、丙酮酸鹽濃度增加、組織間隙液壓增加以及標誌腫瘤的代謝物或代謝改變。例如，存在於腫瘤微環境中的條件是小於7.4的低pH，通常介於或約介於
5.6-6.8,如小於或約或 ρΗ5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7 或 6.8。在另一實例中，存在於腫瘤微環境中的條件是為或約為5mM至20mM的乳酸的高乳酸鹽濃度，例如IOmM至20mM的乳酸，如15mM至18mM，並且特別是至少為或至少約為或為16mM、
16.5mM或17mM的乳酸。本文所用的存在於非腫瘤微環境中的條件包括不存在於腫瘤微環境中的一種或多種條件。出於本發明的目的，所述多種或一種條件是存在於腫瘤微環境和非腫瘤環境中，但在所述兩種微環境中不同的相應特性或特徵，如pH、乳酸鹽濃度或丙酮酸鹽濃度。存在於非腫瘤微環境中的條件是從約7.0至約7.8的pH，如至少為或約為或為pH7.1,7.2,7.3、7.4、7.5、7.6、7.7 或 7.8(參見例如 US Patent N0.7781405)，在一些實例中為 ρΗ7.4。存在於非腫瘤微環境中的條件是為0.5-5mM乳酸鹽的乳酸鹽濃度，諸如，例如0.的乳酸，如0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。本文所用的「蛋白的集合」或「抗體的集合」指含有至少10個不同的蛋白和/或其活性部分並且通常含有至少50、100、500、1000、IO4UO5或更多個成員的集合。集合通常含有待進行活性篩選的蛋白。包括於集合中的是天然存在的蛋白(或其活性部分)和/或修飾蛋白，特別是抗體變體或其活性片段。修飾包括沿著蛋白長度的隨機突變和/或在靶向或所選區域的修飾(即集中的突變)。修飾可以是組合的，並且可以包括通過取代具體基因座或所有基因座或其子集處的所有胺基酸的所有排列。集合可以包括全長或較短的蛋白。集合的大小和具體集合可以由用戶確定。在本文中術語集合與術語「文庫」交換使用，並表示相同事物。本文所用的「模板蛋白」或「不含有突變的蛋白」指具有用於誘變的胺基酸序列的蛋白。模板蛋白可以是野生型蛋白的序列，或其可以是被進行了其他突變的變異蛋白的序列。本文所用的「選擇」或其語法變型，指基於蛋白的一種或多種活性挑選或選擇蛋白。選擇可以基於蛋白的絕對活性，或者選擇可以基於，與在不同條件下的另一蛋白、在不同條件下的相同蛋白或在不同條件下的不同蛋白相比的蛋白相對活性的比較。本文所用的「鑑定」和其語法變型，指識別或了解在期望的條件下具有限定的活性的蛋白。通常，在本發明的方法中，通過蛋白在模擬與非患病或正常生理環境相比的患病環境的條件下優先結合，鑑定所述蛋白。本文所用的為了檢測或分離而標記的分子表示，諸如抗體或蛋白的分子與諸如螢光團的可檢測標記結合或與標籤或其他部分結合，用於例如純化或分離(isolation)或分開(s印aration)。可檢測地標記指為了檢測或分離而標記的分子。本文所用的附加表位指對應於表位以促進已附加表位的蛋白或肽的隨後生化和免疫學分析的一段短胺基酸殘基序列。通過在合適的表達載體中將附加表位的序列添加於蛋白編碼序列，可以實現表位附加。可以利用針對標籤而產生的高特異性抗體，對已附加表位的蛋白進行親和純化。本發明針對反應混合物所用的均相，表示反應物位於液相中，作為混合物，包括作為溶液或懸浮液。本發明針對反應混合物所用的異相,表示反應物位於固相中或位於液相中，作為混合物，包括作為溶液或懸浮液。異相反應混合物的實例是ELISA測定。本文所用的「變異蛋白」、「修飾蛋白」或「突變蛋白」或其變型，指與野生型或模板蛋白相比在一級序列上具有一個或多個修飾的多肽(蛋白)。一個或多個突變可以是一個或多個胺基酸取代(替換)、插 入、缺失、以及其任意組合。修飾蛋白多肽包括具有1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個修飾位置的那些蛋白多肽。修飾蛋白可以是全長蛋白，如全長抗體，或可以是其抗體片段。修飾蛋白與不含有突變的野生型或支架蛋白通常具有 60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列相同性。如本文所用的，提到「重要(critical)胺基酸殘基」指當發生改變(例如通過胺基酸取代)時降低或消除蛋白活性的蛋白中的殘基。通常，活性降低小於70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或小於不含有改變的或取代的胺基酸的修飾蛋白的活性。如本文所用的，提到「關鍵(key)殘基」指這樣的殘基，其位於重要胺基酸位置附近或鄰近重要胺基酸位置，並且當發生改變(例如通過胺基酸取代)時不產生表現出不期望的或預定的活性或狀況，例如在不期望的條件(如PH7.4時，具有活性，但是在pH6.0時無活性)下，蛋白表達降低或無表達或活性降低或無活性。因此，關鍵殘基是表達且表現出期望的活性的殘基。本文所用的活性指與全長(完整)蛋白相關的多肽或其部分的功能活性或活性。功能活性包括但不限於生物活性、催化或酶促活性、抗原性(能結合多肽或與多肽競爭與抗多肽抗體的結合的能力)、免疫原性、形成多聚體的能力以及特異性結合多肽的受體或配體的能力。本文所用的結合活性指分子例如多肽的特徵，涉及其是否和如何結合一個或多個結合伴侶。結合活性包括結合結合伴侶的能力、其結合結合伴侶的親和性(例如高親和性)、其結合結合伴侶的親和力、與結合伴侶的鍵的強度以及與結合伴侶結合的特異性。本文所用的「結合」、「結合的」或其語法變型，指分子參與與另一分子的任何有吸引力的相互作用，從而導致所述兩個分子彼此緊密接近的穩定締合。結合包括但不限於非共價鍵、共價鍵(例如可逆和不可逆的共價鍵)，並包括分子間的相互作用，所述分子包括但不限於蛋白、核酸、碳水化合物、脂質以及小分子，如化學化合物，包括藥物在內。鍵的實例是抗體抗原相互作用和受體配體相互作用。當抗體「結合」特定抗原時，結合指抗體在抗體結合位點通過同源抗體抗原相互作用特異性識別抗原。結合也可以包括通過二硫鍵相互作用的多肽的多條鏈如抗體鏈的締合。本文針對抗體或其抗原結合片段所用的「特異性結合」或「免疫特異性結合」在本文中交換使用，並指抗體或抗原結合片段與同源抗原通過抗體和抗原的抗體結合位點之間的非共價相互作用形成一個或多個非共價鍵的能力。通常，免疫特異性結合(或特異性結合)抗原的抗體是以親和常數Ka約為或為IxiO7M-lOrixiO8M-1或更大(解離常數(Kd)為I X KT7M或I X KT8M或更小)結合抗原的抗體。親和常數可以利用抗體反應的標準動力學方法來測定，例如免疫測定、表面等離子體共振(SPR) (Rich and Myszka(2000)Curr.0pin.Biotechnolll: 54; Englebienne (1998) Analyst.123:1599)、等溫滴定量熱法(ITC)或本領域已知的其他動力學相互作用測定(參見例如Paul, ed., Fundamental Immunology, 2nded.，Raven Press, New York, pages332_336 (1989);有關示例性 SPR 和 ITC 方法的描述還參見U.S.Pat.N0.7，229，619)。實時監測和監測結合速率的儀器和方法是已知的，並且可商購獲得(例如，BiaCore2OOO, Biacore AB, Upsala, Sweden 和 GE Healthcare LifeSciences;Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27:335)。在提到本發明所提供的多肽或抗體時，本文所用的術語「選擇性結合(bindselectively) 」或「選擇性結合(selectively binds) 」,表示多肽或抗體與表位、抗原或基質結合，而基本上不結合另一表位、抗原或基質。通常，選擇性結合所選表位的抗體或其片段，特異性結合表位，且親和常數Ka為例如約為或為I X IO7W1A X IOl1或更大。本文所用的"親和性"或"結合親和性"指抗體分子或其部分結合靶蛋白或抗原上表位的強度。經常利用平衡締合常數(Ka)或平衡解離常數(Kd)測量親和性。低親和性抗體抗原相互作用是弱的，並且分子傾向於快速解離，而高親和性抗體抗原結合是強的，並且分子保持更長時間的結合。高抗體親和性表示，抗體特異性結合靶蛋白，並且平衡締合常數(Ka)大於或等於約IO6M'大於或等於約IO7M'大於或等於約IO8M4或大於或等於約IO9M-1UOiciM-1UO11M-1或IO12M'抗體的特徵還以平衡解離常數(Kd)為10_4M、10_6M_10_7M或ιοΛμο,μ'κ^μ或10_12M或更低為特徵。通常，具有納摩爾或或亞納摩爾解離常數的抗體被視為高親和性抗體。利用常規技術，例如通過平衡透析，使用BIACore2000儀器、利用製造商所概述的通用程序，通過利用放射性標記的靶抗原的放射免疫測定或利用本領域技術人員已知的另一方法，可以很容易地測定這類親和性。例如利用Scatchard et al., AnnN.Y.Acad.ScL, 51:660 (1949)的方法，可以分析親和性數據。本文所用的「可尋址的」表示，成員是可鑑定的或先天已知的，例如可通過以下來鑑定:通過它們的地址、在諸如微量滴定板孔的空 間陣列中的位置或在固相支持物上的位置，或通過可鑑定的或可檢測標記，如通過顏色、螢光、電子信號(即基本上不改變目的分子的相互作用的RF、微波或其他頻率)、條形碼或其他符號、化學或其他此類標記。本文所用的可尋址陣列是這樣的陣列，在所述陣列中，陣列的成員位於固相表面的可鑑定位置，或直接或間接連接於可鑑定標記或與之締合，如附著於微球體或其他微粒支持物(在本文中也稱為珠)，並懸浮於溶液中或散布於表面。本文所用的螢光激活細胞分選術(FACs)指基於螢光鑑定或分選細胞的方法。例如，在FACS中，將細胞染色，以表達一種或多種螢光標記。在這種方法中，使細胞穿過從標記激發螢光並檢測螢光的儀器。在檢測到細胞的給定光譜部分的螢光後，FACS儀器允許將所述細胞與未表達所述螢光光譜的細胞分開。如本文所用的，提到「細胞表面表達系統」或「細胞表面展示系統」指在細胞表面展示或表達蛋白或其部分。通常，產生表達與細胞表面蛋白融合的目的蛋白的細胞。例如，將蛋白表達為與跨膜結構域的融合蛋白。本文所用的「多聚化結構域」促進多肽分子與一個或多個其他多肽分子穩定相互作用的胺基酸序列，每個多肽分子都含有互補的多聚化結構域，從而與第一結構域形成穩定的多聚體，所述多聚化結構域可以是相同的或不同的多聚化結構域。通常，直接或間接將多肽連接於多聚化結構域。示例性多聚化結構域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉鏈、疏水區、親水區以及相容的蛋白-蛋白相互作用結構域。多聚化結構域，例如可以是免疫球蛋白恆定區或結構域，諸如，例如IgG的Fe結構域或其部分，包括IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型，IgA、IgE、IgD和IgM以及其修飾的形式。本文所用的人類蛋白是存在於人類基因組中的核酸分子如DNA所編碼的蛋白，包括其所有等位基因變體和保守變異。如果修飾是基於人類蛋白的野生型或突出序列，則蛋白的變體或修飾是人類蛋白。本文所用的天然存在的α胺基酸的殘基，是自然界中發現的、在人類中通過帶電荷的tRNA分子與其同源mRNA密碼子的特異性識別併入蛋白中的20個α胺基酸殘基。本文所用的非天然存在的胺基酸指非基因編碼的胺基酸。本文所用的核酸包括DNA、RNA及其類似物，包括肽核酸(PNA)和其混合物。核酸可以是單鏈的或雙鏈的。當涉及諸如用可檢測標記如螢光或放射性標記任選地標記的探針或引物時，考慮了單鏈分子。這類分子的所具有的長度通常使得它們的靶標是統計上獨特的或具有低拷貝數(通常小於5，一般小於3)，用於探測或引發文庫。通常，探針或引物含有至少14、16或30個與目的基因互補或相同的連續核苷酸序列。探針和引物的長度可以為10、20、30、50、100或更多個核酸。本文所用的肽指長度為2-40個胺基酸的多肽。本文所用的存在於本發明所提供的各種胺基酸序列中的胺基酸，根據它們已知的三字母或一字母(表I)縮寫來確定。存在於各種核酸片段中的核苷酸，以本領域通常所用的標準單字母命名法來命名。本文所用的「胺基酸」是含有氨基和羧酸基的有機化合物。多肽含有2個或更多個胺基酸。出於本發明的目的，胺基酸包括20種天然存在的胺基酸、非天然胺基酸以及胺基酸類似物(即α碳具有側鏈的胺基酸)。
本文所用的「胺基酸殘基」指在其肽連接處化學消化(水解)多肽後所形成的胺基酸。假定本文所述的胺基酸殘基採取「L」同分異構型。「D」同分異構型的殘基，其根據上述指定，可以被用來取代任何L-胺基酸殘基，只要多肽保留了期望的功能特性。NH2指存在於多肽的氨基末端的游離氨基。COOH指存在於多肽的羧基末端的游離羧基。與J.Biol.Chem.，243:3557-3559(1968)所述的標準多肽命名法一致，並且接受37C.F.R.§ § 1.821-1.822，胺基酸殘基的縮寫顯示於表I中:表1-對應表
權利要求
1.鑑定/選擇治療腫瘤且在低PH下比在中性pH下更具有活性的治療蛋白的方法，其中: 所述方法包括: a)測試所述蛋白在包括低pH的條件下的活性； b)測試所述蛋白在包括中性pH的條件下的活性； c)將a)中的所述活性與b)中的所述活性進行比較；以及 d)選擇/鑑定與b)相比在a)中活性更強的蛋白，由此鑑定在低pH比在高pH更具有活性的蛋白。
2.權利要求1的方法，其中低pH小於7.4。
3.權利要求1或2的方法,其中低pH介於或約介於5.8-6.8。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中中性pH為或約為7.2-7.6。
5.權利要求1-4任一項的方法，其中中性pH約為或為7.4。
6.權利要求1-5任一項的方法，其中a)中的所述條件包括選自乳酸鹽濃度增加、丙酮酸鹽濃度增加以及缺氧的一種或多種條件。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中: a)中的所述條件包括選自以下的增加的乳酸鹽濃度:10mM至20mM的乳酸或15mM至18mM的乳酸；或至少約或16mM、16.5mM或17mM的乳酸；和/或 b)中的所述條件包括選自以下的乳酸鹽濃度:0.5-5mM或0.2mM-4mM的乳酸；或為或約為0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。
8.鑑定/選擇在腫瘤微環境中比在非腫瘤微環境中更具有活性的治療蛋白的方法，其中: 所述方法包括: a)在存在於期望該活性的腫瘤微環境中而非存在於非腫瘤環境中的條件下測試所述蛋白的活性， b)在存在於非腫瘤微環境的條件下，測試所述蛋白的活性， c)將a)中的所述活性與b)中的所述活性進行比較；以及 d)選擇/鑑定與b)相比，在a)中活性更強的蛋白，從而鑑定在腫瘤微環境比非腫瘤微環境中更具有活性的蛋白。
9.權利要求8的方法，其中所述非腫瘤微環境是系統微環境。
10.權利要求8或9的方法，其中所述非腫瘤微環境是是健康組織。
11.權利要求8-10任一項的方法，其中所述健康組織是胃腸(GI)道、皮膚、脈管系統、血液或細胞外基質。
12.權利要求8-11任一項的方法，其中除了存在於腫瘤微環境中而非存在於非腫瘤微環境中的一種或多種條件之外，a)和b)中的每一個均在相同的條件下進行。
13.權利要求8-12任一項的方法,其中所述存在於腫瘤微環境中的條件包括選自以下的一種或多種特性:血管形成增加、缺氧、pH降低、乳酸鹽濃度增加、丙酮酸鹽濃度增加、組織間隙液壓增加以及標誌腫瘤的代謝物或代謝的改變。
14.權利要求8-13任一項的方法，其中所述存在於腫瘤微環境中的條件包括比中性pH低的PH或比非腫瘤微環境pH低的pH。
15.權利要求8-14任一項的方法,其中所述存在於腫瘤微環境中的條件包括低於7.4的pH。
16.權利要求8-15任一項的方法，其中所述腫瘤的pH約為或為5.8-6.8，含5.8和6.8，並且所述存在於腫瘤微環境中的條件包括介於或約介於5.8-6.8的pH。
17.權利要求8-16任一項的方法,其中所述存在於腫瘤微環境中的條件包括與存在於非腫瘤微環境中的條件相比升高的乳酸鹽濃度和/或增加的丙酮酸鹽濃度。
18.權利要求8-17任一項的方法，其中與b)中的條件相比，a)的所述條件包括比中性低的PH和升高的乳酸濃度。
19.權利要求18的方法，其中所述pH介於5.8-6.8，含5.8和6.8，或5.8-6.5，含5.8和 6.5。
20.權利要求8-19任一項的方法，其中a)中的所述條件包括選自以下的增加的乳酸鹽濃度:10mM至20mM的乳酸或15mM-18mM的乳酸；或至少約或16mM、16.5mM或17mM的乳酸；和/或 b)中的所述條件包括選自以下的乳酸鹽濃度:0.5-5mM或.0.2mM至4mM的乳酸；或為或約為0.5、1、2、3、4或5mM的乳酸。
21.權利要求8-20任一項的方法，其中所述蛋白是治療腫瘤的治療蛋白。
22.權利要求1-21任一項的方法，其在體外進行。
23.權利要求1-22任一項的方法，其中所述治療蛋白是抗體、酶、激素、細胞因子或其活性部分，且所述抗體指的是抗體或其抗原結合片段。
24.權利要求1-23任一項的方法，其中所述治療蛋白是靶受體的配體。
25.權利要求1-24任一項的方法，其中所述治療腫瘤的治療蛋白是抗腫瘤抗體。
26.權利要求25的方法，其中所述抗腫瘤抗體選自西妥昔單抗(Erbitux )、曲妥珠單抗(Herceptin )、利妥昔單抗(Rituxan , MabThera )、貝伐單抗(Avastin )、阿侖單抗(Campath )、帕尼單抗(Vectibix⑩)、雷珠單抗(Lueentis, 、Ibritumomabλ替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan, Zevaiinli )、託西莫單抗、碘1131託西莫單抗(BEXXAR )、卡妥索單抗(Removab )、吉妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星(Mylotarg )、阿貝西普(CTLA4-1g, Orenda )、貝拉西普(L104EA29YIg;LEA29Y;LEA)、伊匹單抗(MDX-010, MDX-101)、曲美目單抗(ticilimumab, CP-675, 206)、PRS-010,PRS-050、阿柏西普(VEGF Trap, AVE005)、伏洛昔單抗(M200)、F200、M0RAb-009、SSlP(CAT-5001)、西妥木單抗(MC-A12)、馬妥珠單抗(EMD72000)、尼妥珠單抗(h_R3)、扎魯目單抗(HuMax-EGFR)、奈昔木單抗 MC-11F8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。
27.權利要求25或26的方法，其中所述抗腫瘤抗體是西妥昔單抗(HrbitnxH)..
28.權利要求1-27任一項的方法，其中: 在a)和b)中的每一個中測試多種蛋白； 在a)和b)中測試每一種蛋白；以及 選擇與b)相比在a)中活性更強的任何蛋白。
29.權利要求28的方法，其中所述多種蛋白包含治療蛋白的修飾變體或者是治療蛋白的修飾變體，並且在a)和b)中的每一個中測試變體的集合。
30.權利要求1-29任一項的方法，其中所述治療蛋白包含多聚化結構域。
31.權利要求30的方法，其中所述多聚化結構域包含Fe結構域或修飾的Fe結構域。
32.權利要求1-31任一項的方法，其中所述治療蛋白是抗體、酶、激素或細胞因子。
33.權利要求32的方法，其中所述治療蛋白是抗體。
34.權利要求1-33任一項的方法，其中所述治療蛋白是抗腫瘤抗體。
35.權利要求34的方法，其中所述抗腫瘤抗體選自西妥昔單抗(Erbitux )、曲妥珠單抗(Herceptin )、利妥昔單抗(Rituxan , MabThera⑩)、貝伐單抗(Avastin )、阿侖單抗(Campath )、帕尼單抗(Vectibix )、雷珠單抗(Lucentis )、帕尼單抗、替伊莫單抗(Ibritumomabtiuxetan, Zevalhl )、託西莫單抗、碘 1131 託西莫單抗(BEXXAR )、卡妥索單抗<Removab )、吉妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星(Mylotorg_；h阿貝西普(CTLA4-1g, Orencia )、貝拉西普(L104EA29YIg;LEA29Y;LEA),伊匹單抗(MDX-010, MDX-101)、曲美目單抗(ticilimumab, CP-675, 206)、PRS-010、PRS_050、阿柏西普(VEGF Trap, AVE005)、伏洛昔單抗(M200)、F200、M0RAb-009、SSlP (CAT-5001)、西妥木單抗(IMC-A12)、馬妥珠單抗(EMD72000)、尼妥珠單抗(h_R3)、扎魯目單抗(HuMax-EGFR)、奈昔木單抗 MC-llF8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。
36.權利要求29-35任一項的方法，其中所述修飾變體與治療蛋白的非修飾形式相比含有一個或多個胺基酸殘基的胺基酸取代、插入和/或缺失。
37.權利要求1-36任一項的方法，其中測試的所述蛋白是與抗體的非修飾形式相比在互補性決定區(CDR)中包含一個或多個胺基酸取代的變異抗體。
38.權利要求29-37任一項的方法，其中每一變異蛋白與治療蛋白的非修飾形式相比含有單個胺基酸取代。
39.權利要求29-37任一項的方法，其中每一變異蛋白與治療抗體的非修飾形式相比含有2、3、4、5、6、7、8、9或更多個胺基酸取代。
40.權利要求29-39任一項的方法，其中: 在所述集合中，在每一改變的位置處的胺基酸，被不同於所述位置處的最初胺基酸的多達1-19種胺基酸取代；且 沿著所述治療蛋白或其所選部分的長度，取代每一胺基酸。
41.權利要求29-40任一項的方法,其中所述取代胺基酸選自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp> Tyr 以及 Val,前提條件是所述取代胺基酸不同於所述治療蛋白中相應位置處的胺基酸。
42.權利要求29-41任一項的方法，其中組氨酸是取代胺基酸或所述蛋白中的組氨酸被非鹼性或非帶電荷胺基酸取代。
43.權利要求29-42任一項的方法，其中所述修飾包括用選自Arg、Asp、Glu、His以及Lys的胺基酸進行胺基酸取代。
44.權利要求29-43任一項的方法，其中所述修飾包括用His進行胺基酸取代。
45.權利要求29-44任一項的方法，其中所述蛋白是抗體，且修飾的所選部分是CDR。
46.權利要求29-45任一項的方法，其中單獨測試所述集合中的每一變異蛋白。
47.權利要求29-46任一項的方法，其中在陣列中測試每一變異蛋白。
48.權利要求29-46任一項的方法，其中所測試的每一變異蛋白是可尋址的。
49.權利要求1-48任一項的方法，其中所測試的活性是與所述治療蛋白的靶蛋白的結合。
50.權利要求49的方法，其中所述結合通過免疫測定評估。
51.權利要求49或50的方法，其中所述免疫測定包括ELISA。
52.權利要求50或51的方法，其中所述免疫測定是異相的，包括: 將所述靶蛋白固定於固相支持物； 使所述治療蛋白與所述靶蛋白接觸，其中所述治療蛋白被可檢測地標記； 除去未結合的治療蛋白；以及 檢測或測量所述標記的治療蛋白與所述靶蛋白的結合。
53.權利要求50或51的方法，其中所述免疫測定是均相的，包括: 使所述治療蛋白與革巴蛋白接觸，其中所述治療蛋白被可檢測地標記；和 檢測或測量所述標記的治療蛋白與所述靶蛋白的結合。
54.權利要求1-53任一項的方法,其中利用包含在表面表達治療蛋白的一種或多種細胞的細胞表面表達系統評估結合活性。
55.權利要求54的方法，其中: 在所述細胞的表面表達治療蛋白； 使靶蛋白與所述細胞的群接觸；以及 鑑定結合所述靶蛋白的一種或多種細胞，由此鑑定表現出結合活性的治療蛋白。
56.權利要求55的方法，其中所述靶蛋白被可檢測地標記或可被檢測。
57.權利要求56的方法，其中以螢光標記所述靶蛋白或利用螢光標記的第二試劑檢測所述靶蛋白。
58.權利要求49-57任一項的方法，其中通過螢光激活細胞分選術(FACS)檢測或測量所述結合。
59.權利要求1-58任一項的方法，其中 首先在條件b)下利用包含表達治療蛋白的細胞的細胞表面表達系統測試結合活性，由此選擇結合所述靶蛋白的一種或多種細胞，並且選擇不結合所述靶蛋白的一種或多種細胞； 分離所選的不結合所述靶蛋白的所述一種或多種細胞並使其於細胞培養基中生長，以產生在表面表達所述治療蛋白的第二細胞群； 在a)條件下測試結合活性，由此使來自所述第二細胞群的細胞與所述靶蛋白接觸；以及 鑑定結合所述靶蛋白的一種或多種細胞，從而鑑定在a)條件而非b)條件下表現出結合活性的治療蛋白
60.權利要求1-58任一項的方法，其中 首先在a)條件下利用包含表達治療蛋白的細胞群的細胞表面表達系統測試結合活性，由此選擇結合所述靶蛋白的一種或多種細胞，並選擇不結合所述靶蛋白的一種或多種細胞； 分離所選的結合所述靶蛋白的所述一種或多種細胞，並使其生長於細胞培養基中，以產生第二細胞群； 在b)條件下測試結合或，由此使來自所述第二細胞群的細胞與所述靶蛋白接觸；以及 鑑定不結合所述靶蛋白的一種或多種細胞，並鑑定結合所述靶蛋白的一種或多種細胞， 選擇不結合所述靶蛋白的一種或多種細胞，由此鑑定表現出結合活性的治療蛋白。
61.權利要求1-60任一項的方法，其中將所述治療蛋白給予個體伴隨一種或多種不良副作用。
62.權利要求61的方法，其中與a)相比在b)中降低所述蛋白的活性改善或防止所述不良副作用。
63.權利要求1-62任一項的方法，其中在存在人血清的情況下，在a)和b)中測試所述治療蛋白的活性。
64.權利要求1-63任一項的方法，其中 在存在人血清的情況下在a)和b)中測試所述治療蛋白的活性，所述人血清的量是存在於生理環境中的量；和 在a)中的所述血清濃度等於在b)中的所述血清濃度。
65.權利要求1-64任一項的方法,其中，按體積計,在存在選自至少介於或約介於以下濃度的人血清的情況下，進行a)和b):3%-30%,含3%和30% ;5%_30%，含5%和30% ;5%_25%，含 5% 和 25% ； 10%-30%，含 10% 和 30% ；15%-30%,含 15% 和 30% ；以及 15%_25%，含 15% 和 25%。
66.權利要求65的方法，其中所述人血清的濃度按體積計為或約為25%(加減10%)或15%-35%。
67.權利要求1-66任一項的方法，其中所述治療蛋白的靶蛋白是結合配體的受體或其部分。
68.權利要求67的方法，其中所述治療蛋白的靶蛋白是受體，所述受體是腫瘤抗原。
69.權利要求68的方法，其中所述治療蛋白的靶蛋白是Her受體家族的成員。
70.權利要求69的方法，其中所述治療蛋白的靶蛋白是EGFR受體或其細胞外結構域。
71.權利要求1-70任一項的方法，其中a)中的所述活性以預定量或比例高於b)中的所述活性。
72.權利要求71的方法，其中所述活性高出的比例為或至少為1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、.1.7、1.8、1.9,2.0、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50 或更聞。
73.權利要求1-72任一項的方法，其中在a)中的所述活性比在b)中的所述活性高至少 5%、10%、15%、20%、25%、35%、50%、100%、2 倍、5 倍、10 倍、20 倍或更多。
74.權利要求1-73任一項的方法，其中給予所述抗腫瘤抗體伴隨一種或多種不良副作用。
75.權利要求74的方法，其中所述抗體是抗EGFR抗體或抗CTLA4抗體。
76.權利要求1-75任一項的方法，其以高通量模式進行。
77.權利要求1-76任一項的方法，其中所述方法是自動化的。
78.權利要求1-77任一項的方法，其中所選的蛋白是條件活性的，從而其在腫瘤微環境中與在非腫瘤環境中相比具有更強的活性。
79.權利要求1-78任一項的方法，將其重複多次，其中在每一重複中，產生所選的一種或多種蛋白的其他變體並對其進行測試，由此使所述治療蛋白發展為在腫瘤環境中比在非腫瘤環境中表現出增強的活性，從而表現出降低的毒性或降低的不良副作用。
80.權利要求61-79任一項的方法，其中所選治療蛋白是抗EGFR抗體，且所述降低的不良副作用包括降低的與抗體的系統暴露有關的皮膚毒性。
81.權利要求1-80任一項的方法，其中所述所選的蛋白是抗EGFR抗體變體，與在b)正常生理pH7.3-7.4和低於12mM的正常乳酸鹽濃度的條件下相比，其在5.8-6.8的降低的pH和乳酸鹽濃度約為12-20mM的腫瘤微環境內的條件下，優先結合EGFR。
82.權利要求1-81任一項的方法，其中: 在步驟a)-d)之前，所述方法包括 e)使第一固相支持物和第二副本固相支持物與EGFR或EGFR細胞外結構域(ECD)在PH為或約為pH7.4的緩衝液中接觸； f)用PH為或約為pH7.4的緩衝液洗滌所述第一支和第二支持物； g)將包含25%或約25%人血清的緩衝液添加於所述第一和第二固相支持物；其中: i)添加於所述第一固相支持物的所述緩衝液的條件包括pH為或約為6.0的12-20mM的乳酸；和 )添加於所述第二固相支持物的所述緩衝液的條件包括ImM或約的ImM的乳酸，pH為或約為7.4 ； h)從所述固相支持物除去在步驟c)中添加的所述緩衝液；和 在進行步驟e)-h)後，進行步驟a)-d)，其中: 步驟a)包括: 將可檢測標記的修飾的抗EGFR抗體添加於pH6.0的、包含12_20mM乳酸、25%人血清的結合緩衝液中的第一支持物； 用PH為或約為6.0的包含12-20mM乳酸的緩衝液洗滌所述第一支持物；以及將檢測結合的修飾的抗EGFR的試劑添加於所述第一固相支持物，並檢測所述修飾蛋白與所述EGFR或EGFR E⑶在所述第一固相支持物上的結合；和步驟b)包括: 將可檢測標記的修飾的抗EGFR抗體添加於pH7.4的包含ImM乳酸、25%人血清的結合緩衝液中的第二支持物； 用PH為或約為7.4的包含ImM或約ImM的乳酸的緩衝液洗滌所述第二支持物；以及將檢測結合的修飾的抗EGFR的試劑添加於所述第二固相支持物，並檢測所述修飾蛋白與所述EGFR或EGFR E⑶在所述第二固相支持物上的結合。
83.權利要求82的方法，其中所述抗EGFR抗體含有FLAG標籤，以便用抗FLAG-TAG酶試劑進行檢測。
84.權利要求82或83的方法，其中檢測結合包括分光光度法測量。
85.鑑定/選擇在第一組條件下比在第二組條件下更具有活性的治療蛋白的方法，其中:所述第一組條件包括與非腫瘤微環境相比存在於腫瘤微環境中的選自以下條件中的一種或多種條件:低pH、乳酸鹽濃度增加、丙酮酸鹽濃度增加以及缺氧；和 第二組條件包括存在於所述非腫瘤微環境中的相應條件；和 所述方法包括: a)在所述第一組和第二組條件下，測試多種蛋白的活性；其中: 所述多種蛋白包含治療蛋白的修飾變體或所述多種蛋白是治療蛋白的修飾變體；和 在所述第一和第二組條件中的每一組條件下測試變體的第一集合； b)選擇/鑑定以下蛋白: 與所述非修飾的治療蛋白相比，在所述第一組條件下活性降低的蛋白；和 與所述非修飾的治療蛋白相比，在所述第二組條件下活性降低的蛋白； c)分析在步驟在b)中選擇/鑑定的蛋白，以鑑定受到修飾的胺基酸位置，由此所述胺基酸被鑑定為重要胺基酸位置； d)產生包含取代胺基酸對鄰近重要胺基酸位置或其附近的胺基酸殘基的取代的變異蛋白的第二集合，其中所述文庫的每一成員與所述治療蛋白相比包含單胺基酸取代； e)在所述第一組條件下和在所述第二組條件下測試所述修飾蛋白第二集合成員的活性；和選擇/鑑定所述第二集合中表現出高於或約等於所述第二組條件下的活性的成員； f)分析在e)中選擇/鑑定的蛋白，以鑑定被取代的胺基酸位置，其中所鑑定的位置被稱為關鍵殘基位置； g)產生變異蛋白的第三集合；其中每一成員都包含取代胺基酸對一個或多個關鍵殘基位置的取代； h)在所述第一組條件下和在所述第二組條件下，測試組合文庫成員的活性，並選擇/鑑定所述第二文庫中在所述第一組條件下比在所述第二組條件下具有更強活性的成員，由此鑑定在所述第一組條件下比在所述第二組條件下更具有活性的治療蛋白。
86.權利要求85的方法，其中步驟h)包括: 1)在所述第一組條件下測試所述第三集合成員的活性，並選擇/鑑定所具有的活性高於預定活性蛋白；和 2)在所述第二組條件下測試在步驟I)中選擇/鑑定的蛋白的活性，並選擇/鑑定所具有的活性低於預定活性的蛋白。
87.權利要求85的方法，其中步驟h)包括: 1)在所述第二組條件下測試所述第三集合文庫成員的活性，並選擇/鑑定所具有的活性低於預定活性的蛋白；和 2)在所述第一組條件下測試在步驟I)中選擇/鑑定的蛋白的活性，並選擇/鑑定所具有的活性高於預定活性的蛋白。
88.權利要求85-87任一項的方法，其中將步驟g)重複多次，其中在每一重複中，測試選擇/鑑定的蛋白。
89.權利要求88的方法，其中將步驟g)重複1、2、3或4次。
90.權利要求85-89任一項的方法，其中所述治療蛋白是抗體、酶、激素、細胞因子或其活性部分，並且所述抗體指抗體或其抗原結合片段。
91.權利要求85-90任一項的方法，其中所述治療蛋白是靶受體的配體。
92.權利要求85-91任一項的方法，其中所述治療蛋白是治療腫瘤的蛋白。
93.權利要求92的方法，其中所述治療腫瘤的蛋白是抗腫瘤抗體。
94.權利要求93的方法，其中所述抗腫瘤抗體選自西妥昔單抗(Erbitux )、曲妥珠單抗(Herceptin_、利妥昔單抗(Rituxan , MabThera )、貝伐單抗(Avastin )、阿侖單抗(Campath )、帕尼單抗(Vectibix )、雷珠單抗(Lueentis_、帕尼單抗、替伊莫單抗(Ibritumomab tiuxetan, Zevalin )、託西莫單抗、碘1131託西莫單抗(BEXXAR )、卡妥索單抗(Removab )、吉妥珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星(Mylotarg )、阿貝西普(CTLA4-1g, Orencia ),貝拉西普(L104EA29YIg;LEA29Y；LEA)、伊匹單抗(MDX-010, MDX-1OI)、曲美目單抗(ticilimumab, CP-675, 206)、PRS-010、PRS-050、阿柏西普(VEGF Trap, AVE005)、伏洛昔單抗(M200)、F200、M0RAb-009、SSlP(CAT-5001)、西妥木單抗(MC-A12)、馬妥珠單抗(EMD72000)、尼妥珠單抗(h_R3)、扎魯目單抗(HuMax-EGFR)、奈昔木單抗 MC-11F8、mAb806/ch806、Sym004 以及 mAb-425。
95.權利要求93或94的方法，其中所述抗腫瘤抗體是西妥昔單抗(ErbltUX )。
96.權利要求85-95任一項的方法，其中所測試的活性是與靶蛋白的結合。
97.權利要求96的方法，其中通過免疫測定測試結合活性。
98.權利要求97的方法，其中所述免疫測定包括ELISA。
99.權利要求85-98任一項的方法，其中在基於細胞的測定中測試結合活性。
100.權利要求85-99任一項的方法，其中在細胞表面表達系統中測試結合活性。
101.權利要求85-100任一項的方法，其中: 將所述第二文庫的成員表達於細胞表面； 使靶蛋白與所述細胞的群接觸；以及 鑑定結合所述靶蛋白的一種或多種細胞，由此鑑定表現出結合活性的蛋白。
102.權利要求99-101任一項的方法，其中所述細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
103.權利要求99-102任一項的方法，其中所述基於細胞的測定是螢光激活細胞分選術(FACS)。
104.權利要求96-103任一項的方法，其中所述靶蛋白被可檢測地標記或是可以檢測的。
105.權利要求96-104任一項的方法,其中所述祀蛋白被突光標記或通過突光標記的第二試劑檢測所述靶蛋白。
106.權利要求96-105任一項的方法，其中通過螢光激活細胞分選術(FACS)檢測或測量結合。
107.權利要求96-106任一項的方法，其中所述靶蛋白是Her受體家族的成員。
108.權利要求96-107任一項的方法，其中所述靶蛋白是EGFR受體或其細胞外結構域。
109.權利要求85-108任一項的方法，其中: 所述第一組條件包括低於7.4的低pH ;和 重要胺基酸選自包含由帶電荷殘基組成的胺基酸取代的蛋白變體。
110.權利要求109的方法,其中所述帶電荷殘基選自Arg、Asp、Glu、His以及Lys。
111.權利要求85-110任一項的方法，其中所述第二和第三集合中的胺基酸取代是用His進行的胺基酸取代。
112.權利要求85-111任一項的方法，其中所述第一組條件包括pH約為或為5.8-6.8、含 5.8 和 6.8。
113.權利要求85-112任一項的方法，其中與所述第二組條件相比，所述第一組條件包括比中性pH低的pH和升高的乳酸濃度。
114.權利要求85-113任一項的方法，其中: 所述第一組條件包括約12-20mM的乳酸，pH為6.0或約為6.0 ;和 所述第二組條件包括ImM或約ImM的乳酸，pH7.4為或約為7.4。
全文摘要
本發明提供發展或選擇不良副作用降低的治療蛋白的方法和所得的蛋白。例如，本發明提供鑑定在一體內環境中比在另一體內環境中表現出更好的活性的條件活性治療蛋白的體外測定法。所述方法包括以下步驟a)在期望該活性正常或增強的條件下測試蛋白的活性；b)在期望與正常活性相比活性降低的條件下測試所述蛋白的活性；以及c)將在a)中的活性與b)進行比較，並選擇/鑑定與b)相比活性更強的蛋白。選擇/鑑定的蛋白即為條件活性蛋白。
文檔編號G01N33/68GK103201293SQ201180053564
公開日2013年7月10日 申請日期2011年9月8日 優先權日2010年9月8日
發明者L·科達達帕尼, L·H·布克班德, G·I·弗羅斯特, P·L·謝裡登, H·M·謝潑德, G·衛, L·黃 申請人:哈洛齊梅公司