一種生產脫氧紫色桿菌素的方法及其專用重組菌的製作方法

2023-05-10 16:53:26 1

專利名稱：：一種生產脫氧紫色桿菌素的方法及其專用重組菌的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種生產脫氧紫色桿菌素的方法及其專用重組菌。
背景技術：
：formulaseeoriginaldocumentpage3紫色桿菌素(violacein)、脫氧紫色桿菌素是微生物的代謝產物，它屬於吲哚衍生物，由兩個色氨酸分子氧化縮合而成。自從19世紀末紫色桿菌素被發現以來，人們對其生物功能進行了大量的探索，發現它具有很強生物功能，越來越受人們關注。研究證明，紫色桿菌素具有很強的生物活性(1)具有廣譜的抗菌活性，如抗stsp7oy7ococcoiASswrew51、jaci7Jw51sp，streptococcyssp，/HycoZacferj'"/z，yVeisse".g，j09ei/flb/ff。;73s(Sanchezetal.，ReevaluationoftheViolaceinBiosyntheticPathwayanditsRelationshiptoIndolocaxbazoleBiosynthesis.Journal2006.7，1231-1240);(2)抗氧化(Konzenetal.，Antioxidantpropertiesofviolacein:possiblerelationonitsbiologicalfunction.Journal2006.14，8307-8313);(3)抗腫瘤細胞(deCarvalhoetal.，Cytotoxicactivityofviolaceininhumancoloncancercells.Journal2006.);(4)抗病毒性；(5)抗原生動等等，還可以作為染料加工各種材質布料(AkiraSHIRATA,IsolationofBacteriaProducingBluish—PurplePigmentandUseforDyeing.JapanAgriculturalResearchQuarterly.2000.34)，總之，紫色桿菌素具有很高的醫學價值及工業應用前景。在己發現的產紫色桿菌素的菌株中，對紫色色桿菌(C.violaceum)的研究最為廣泛。2003年，C.violaceum全基因組測序完成，為紫色桿菌素合成途徑解析及應用提供了保證。但起初認為有4個相關基因控制整個紫色桿菌素的生物合成，直到最近，第5個基因才得以發現，整個代謝途徑基本明朗化。紫色桿菌素的生物合成涉及一個基因簇，長約7.3kb，包括5個基因，分別是VioA、VioB、VioEVioC和VioD。脫氧紫色桿菌素是紫色桿菌素合成途徑的副產物，產量很低，分離困難，因此對其性質及生物活性研究較少。目前急需一種便利的方法來生產脫氧紫色桿菌素，加強對脫氧紫色桿菌素的研究和應用。
發明內容本發明的目的是提供生產脫氧紫色桿菌素的方法及其專用重組菌。本發明所提供的生產脫氧紫色桿菌素的方法，是將脫氧紫色桿菌素合成相關基因簇導入大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中獲得的重組菌，該重組菌以色氨酸為底物發酵生產脫氧紫色桿菌素。其中，所述的脫氧紫色桿菌素合成相關基因簇，是將由VioA、VioB、VioC、VioD和VioE組成的紫色桿菌素合成基因簇中的VioD基因敲除，獲得重組基因簇。其中，所述基因簇具體為如下l)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；2)在嚴格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼紫色桿菌素合成途徑中的VioA、VioB、VioC和VioE四種酶的DNA分子；3)與l)的基因具有90%以上的同源性，且編碼紫色桿菌素合成途徑中的VioA、VioB、VioC和VioE四種酶的DNA分子。所述步驟3)中的DNA分子，與l)的DNA分子最好有95X以上的同源性。上述嚴格條件可為在6XSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在68。C下雜交,然後用2XSSC,0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。本發明的另一個目的是提供一種產脫氧紫色桿菌素的重組大腸桿菌。本發明所提供的產脫氧紫色桿菌素的重組大腸桿菌，是將所述的基因簇導入大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中獲得的重組菌，命名為大腸桿菌BL-DV;大腸桿菌BL-DV已於2008年06月25日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.2557。含有所述基因簇的表達盒和含有所述基因簇或所述表達盒的重組表達載體也屬於本發明的保護範圍。其中，所述重組表達載體具體可為在原核表達載體的多克隆位點插入所述的基因簇或含有所述基因簇的表達盒。大腸桿菌BL-DVCGMCCNo.2557具體可用如下方法構建將所述的重組表達載體導入大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，獲得產脫氧紫色桿菌素的重組菌。本發明的大腸桿菌BL-DVCGMCCNo.2557能以L-色氨酸為底物發酵生產脫氧紫色桿菌素。所述L-色氨酸的濃度優選為0.3-0.5g/L;所述發酵溫度為10-37。C。脫氧紫色桿菌素與紫色桿菌素均為藍紫色，且產量很少，分離困難。用本發明的大腸桿菌BL-DVCGMCCNo.2557生產脫氧紫色桿菌素的產率較高，可以達到0.17g/L發酵液，且提取方便，分離純化簡單；並且，本發明的重組菌BL-DVCGMCCNo.2557是大腸桿菌，方便控制，便於工業化生產。圖1為重疊延伸PCR重組脫氧紫色桿菌素合成相關基因簇。圖2為PCR擴增獲得紫色桿菌素合成相關基因簇片段A、B和C的結果。圖3為色素高效液相色譜結果圖。具體實施例方式實施例l、產脫氧紫色桿菌素的重組菌BL-DV1)構建脫氧紫色桿菌素合成途徑的相關酶的重組表達載體將杜擀氏菌屬(Zfe卵77eWa印.)B2CGMCCNs2056轉接入液體培養基(澱粉15g/L、硫酸亞鐵0.03g/L、硝酸鉀lg/L、磷酸氫二鉀0.7g/L、硫酸鎂0.5g/L、色氨酸0.5g/L，調節pH為7.0)，25°C，200rpm培養36小時，按上海生工基因組DNA提取試劑盒說明書提取杜擀氏B2菌基因組DNA。根據紫色桿菌素基因簇序列，採用01igo7.10軟體設計3對引物，引物序列如表l，其中P1、P2擴增vioA及部分vioB基因部分序列，擴增產物命名為片段A;P3、P4擴增部分vioB及vioC基因，擴增產物命名為片段B;P5、P6擴增vioE基因，擴增產物命名為片段C;P4和P5兩條引物之間有48bp的重複序列(圖l)。表l.PCR引物設計tableseeoriginaldocumentpage5P45'-TGGCGTGCGGTGGCATGGCGTCTCCTTAGTTTACCCTTCCAAGTTTGTACC-3'—P55'-GGTACAAACTTGGAAGGGTAAACTAAGGAGACGCCATGCCACCGCACG-3'—P65'-GGAATGTCCTCGAGTTCCGACACGAAAACGCTGGC-3'I分別使用Pl和P2、P3和P4及P5和P6引物及高保真PfuDNA聚合酶對杜擀氏B2菌基因組DNA進行PCR擴增，PCR反應體系為50uL，DNA模板為0.5ug，上下遊引物各25pmol，2.5UPfuDNA聚合酶。擴增片段A和B採用表2中的PCR程序I，擴增片段C採用表2中的PCR程序II。_表2.PCR擴增程序_PCR程序~~^~~循環次溫度設定及時間驟數1194°C，3minI23094。C1min，57°C1min,72°C3min3172。c10min1194°c，3minII23094°c1min，68°C172°C1min3172°c10minIII1194°c，3min2294。c1min，50°C1min，72°C5min33094。c1min，50°C1min，72°C5min4172°c10minPCR擴增獲得紫色桿菌素基因簇片段A、B和C的結果如圖2所示。PCR產物片段B和C按1:1的體積比混合，然後稀釋10倍，作為進一步PCR擴增的模板。PCR反應體系為50L，上述含有片段B、C的混合物1.5uL，2.5UTaKaRaPfuDNA聚合酶。PCR反應程序為PCR程序m，當運行完第2步時停止程序，向反應體系中加入P3、P6引物各25pmol後接著運行PCR程序III中的3、4步驟，將片段B和C連接在一起形成片段D。用PCR產物試劑盒純化片段D，將片段D克隆到pMD18-T載體中，獲得pMD18-T-D載體，領^序，測序結果表明片段D的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第3058-6198位所示。用AeI和I雙酶切片段A、yfetI和J力o/1雙酶切pMD18-T-D載體及NdeI和XholI雙酶切表達載體pET30a，回收3057bp的片段A、3140bp的片段D和pET30a載體酶切後的大片段，將上述回收的三個片段在T4DNA連接酶的作用下連接構建重組表達載體pET30aVioAD。將重組表達載體pET30aVioAD轉化入大腸桿菌DH5a感受態細胞，轉化產物塗於含氨苄青黴素(100txg/ml)的LB平板上，挑取轉化子培養後採用鹼裂解法提取質粒，篩選含插入片斷的陽性克隆，進行測序，測序結果表明VioAD片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列1自5'末端第1-1308位為VioA基因，編碼紫色桿菌素合成途徑中的VioA酶；自5'末端第1305-4322位為VioB基因，編碼紫色桿菌素合成途徑中的VioB酶；自5'末端第4323-5612位為VioC基因，編碼紫色桿菌素合成途徑中的VioC酶；自5'末端第5622-6197為VioE基因，編碼紫色桿菌素合成途徑中的VioE酶。VioAD片段中不含有紫色桿菌素基因簇中的VioD基因。該VioAD即為脫氧紫色幹菌素合成相關基因簇。2)表達宿主的選擇將重組載體pET30aVioAD分別轉入￡BL21及Acoh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，獲得重組菌￡BL21-VioAD及ABL21-CodonPlus(DE3)-RIL-VioAD，以pET30a載體分別轉入Acoh'BL21及￡colz'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，獲得的重組菌￡BL21-pET30a和￡BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET30a為對照。在LB培養基中37。C培養菌體濃度0D600為0.7，加入0.lmMIPTG，20。C誘導30h。將50mL發酵液在7000Xg下離心10min,棄上清液，在沉澱物中加入無水乙醇5mL，用漩渦混合器將其混勻，然後在200W超聲波清洗器中振蕩0.5h，將振蕩液9000Xg離心5min，保留乙醇溶液。在￡coh'BL21-pET30a和￡coh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-pET30a中沒有得到藍色物質；在Ecoh'BL21-VioAD中也沒有得到藍色物質，而在Ecoh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-VioAD中能合成藍色素，表明重組表達載體pET30aVio△D在￡BL21中合成脫氧紫色桿菌素的4個酶沒有完全正確表達或者某些酶表達量很低，而在Acoh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中合成脫氧紫色桿菌素的4個酶正確表達，說明脫氧紫色桿菌素合成基因簇中可能含有稀有密碼子，將產脫氧紫色桿菌素的Acoh'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-VioAD命名為大腸桿菌BL-DV;大腸桿菌BL-DV已於2008年06月25日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.2557。3)重組菌BL-DVCGMCCNo.2557中合成的色素鑑定重組菌BL-DVCGMCCNo.2557的菌體經破碎乙醇提取後得到藍紫色物質，將色素甲醇溶液進行高效液相色譜分析，使用Agilent-1100高效液相色譜儀，色譜柱為AgilentEclipseXDB-C18，150mmX4mm，5um;柱溫30°C;洗脫劑為體積比為70%的甲醇水溶液;流速l.OmL/min;檢測波長570nm。高效液相色譜檢測結果如圖3所示，由重組菌BL-DVCGMCCNo.2557合成的色素與杜擀氏菌屬B2紫色桿菌素副產物——脫氧紫色桿菌素保留時間一致(4.9rain)，並且只有一個峰值。上述實驗結果表明，構建的載體pET30aVioAD在菌株￡co7i'BL21-CodonPlus(DE3)-RIL成功表達合成脫氧紫色桿菌素相關的酶，並在體內催化合成脫氧紫色桿菌素。圖3中，I:杜擀氏菌屬(Duganellasp.)B2CGMCCNs2056所產色素高效液相色譜圖，第一峰為紫色桿菌素，第二峰為脫氧紫色桿菌素；II:重組菌BL-DVCGMCCNo.2557所產色素粗提物色高效液相譜圖。實例2、重組菌BL-DVCGMCCNo.2557生產脫氧紫色桿菌素對重組菌BL-DVCGMCCNo,2557以L-色氨酸、加入誘導劑時的細胞濃度(0D6。。值)、誘導劑的量、誘導時間4因素為試驗因素，以脫氧紫色桿菌素產量為指標，對上述四因素進行4因子3水平的正交試驗，其結果見表3。色素的提取同實施例l;色素濃度的測定是通過測定色素的乙醇溶液在最大吸收波長的吸光度值來衡量，DuganellaspB2所產脫氧紫色桿菌素測定波長為562rai，以無水乙醇作空白對照，通過吸光度值——色素濃度標準曲線得到相對應的色素濃度值，每個試驗重複3次，取平均值，得到的吸光係數e為9.09551g—'cm—'。表3.正交試驗設計及結果tableseeoriginaldocumentpage8表3結果表明，在這4因素中，影響脫氧紫色桿菌素產量的主次順序為細胞濃度〉L-色氨酸〉誘導時間〉誘導劑的量，根據計算結果可知最佳組合應為在LB培養基中添加L-色氨酸0.4g/L，誘導劑的量l.Ommol/L，加誘導劑時的細胞濃度為0D600=0.8，20。C誘導30h。在上述最佳條件下，進行三批驗證試驗，脫氧紫色桿菌素產量分別為0.183g/L、0.165g/L和0.153g/L，平均為0.167g/L。0.0900.1190.1270.1110.1110.0980.0370.0210.1200.1230.1210.1370.0870.0680.0340.069123值值值差均均均極序列表清華大學<120〉一種生產脫氧紫色桿菌素的方法及其專用重組菌CGGNARW81479〈160〉1<210〉1<211〉6197〈212〉醒杜擀氏菌屬(A^朋eWa砂.)<400〉1atgacaaattattctgacatttgcatagttggcgcaggcat鄉gggcctcagttgtgcg60acccagttgatcaacgccgccgccggc卿aMttacggatcagggtgttcgdcatggeit120acgscggtgggcgggcgcatccagtcgcataaagtagacgcgccgaactc180ggcgccgcccgctactcgccgcaactccatccgcatttcgagcaactcatgcaggaMgc240gggctggcgcatgcgacctaccctttcacccaggtggtgtcgctcgatcaggcgc鄉鄧300肌actg3aggcaactctgctg3gCCtg3g"tgcgatgctgaaaaaacatccga已cg3ttcc360ttccttgaattcgtcagccagt織tgggcgccgccg肌gcgacccgcatgatc卿gcg420accggttacgacgccttgctgctgccggtggtctcggcagcgatggcctacgacatcatc480a^sagcacccggaaacacaaagctttaccgaaaacgccgccaacgagtggcgctatgcc540sccgacggctacagcgagctgctgcgtxagttgcagcgccsggcccaggacgccggcgtg600gaattccggctggggC3tCgcttgctgtcggttga肌agtccggc已ccgaccatgtcctc660gccttccgccatatgggcgatactcagatgcaccgggcgcgccatgtgatcacgaccctc720ccgccgaccgccatgaagcgcctgaacatggattttccggccgccttcagtcccttccag780tacgattxcctgcctttgttcaaaggattcctgaccttcgsaacagcctggtgggacgcg840ctcgggctgaccgacaaagtgctgatggccgataatcctcttcggaa肌tctacttcaag900ggcgacaaatacctggtgttctacaccgacagcgccagcgccacctattggcgggagtac960ctggagc卿ggga卿cgtttacctggaccgggtccgccatcacctgaa1020ccgctgaacggtcagccgctgccgcagatcaaggcgcatttttacaagcactggccgcat1080ggcgtcgagttcagcctgg已gccgg卿ccgagcatccagcaaccctgctccaccgcgac1140ggc已txatctcctgctcggacgcgtatacctcgcattgcggctgg已tggaaggcagcttg1200atcagcgccgggcacgctacccgcctgttgctggaacggctcagccatccgccagcaca31260tccgggcacgactttaccctcgccacctctcttactgagcgcgcatgagcattctcgact1320ttccccgctttcattttcgggggtttgcccgcgctaatgtgcccactgccaaccgcaata1380cgcacggccatatcgatatcgcgacgaatgcggtatcgatcgcgggcgaaccattcgacc1M0tgagccgcccgccgtcggaattccatgagcacatgaaacagcttgctcccaggttcgatg1500cggcgggcaagccggatccggagggcatcttcagcgaggcggccggctacaatttttgcg1560gcaacaatcacttttcgtgggaaaacgccaggatcaccggcgtccagctgcgcgatggcg1620aggtcgataccgaggacgcgctggtcggcgccaagctggccctgtggggacattacaacg1680actatctgcgcaccacggtcaax:cgcgccagatgggtcgacaacaaccccgccgagccgg1740acaccaccctcatttacgcgggccagttcacgctcagcggcaagcaagccacgcccaaca1800caccgagcctgttcagcgccgatatcgggcaggcgcattcggtacgctgggtcggcagcg1860gccatatcagcgagcgcagcgggcattttctcgacgatgaattcggccgttccaggctgt1920tccagttttccgtggcgaagctcgatccgcatttcctcttcaatccggacacaccgctgc1980cggccagcatgcgcgccttgcaagaggcgcttgccgacgaggatgtgctggggctgacgg2040tccagtatgcgctgttcaatatgtcgacgccgcaga^acccgattcgccggtgttctacg2100acctggccggcggcatcggcctgtggcgccgcgacgagctggccacctatccggccggcc2160gtttgctgctgccgcgccagagcagcctggggccggtactggtgaaggtgcatgcggacc2220gggtgtcggtgaatatgccgacggccatcccgttcaccacgcgcgaggccggcgccgtgt2280ccgaacagcatcctacccatgcgctgggcggcaagcttgcgctgggcgatctcatgctgc2340acggtgccaccggcaagctgatcgcccgcatcccgcaacagctgtacctcgactactggc2400gccatcatggtgtcttcgatgtgccgctgctccacccggccacggcctcgggt"tcgctca2460gcatgt:ccagcgcgcaggcgcagtgggacgaagccgactgggtgctgcagtccgacagca2520accatctgtatctggaagcgcccaaccggcaacgacagcaggactttccgcagacgatca2580cggtacaaagccgcttgcgcggcgagctggcggcgcatccggcgctgacggcgcaggcgc2640aggatggcgagatcgtcggcgtgcgcgtggcgccatcggcgctgggagttggctatgcgg2700acctgaccctcacgggccgccgttcaggcgcgacccgcatcatgctgggcgaggcacagg2760ggcagcagttcatcggcgcgagggtgctgcccgacgactggcatctggacgacataccgg2820ccgaacaggtcgattacgcctttctctaccagcacgtgatgagctactacgagctggtct2880atcccttcatgtcggacaaggtgttcagcctggcggaccactgcaagtgcgaaacctatt2940cgcgcctgatgtggcagatgtgcgatccgcagaaccgggacaagagctattacatgccga3000gcacgcgtgaactgtcgctgccgaaatcgcgcctgttcctgaaatacctgacccaggtcg3060aagcggccgccaagtccacgcttcctcaagcggtcgcaccgcatgtcatcggctgcaagg3120ccgagtggatcgccgagctgaaaaaggcgatcgacctggaactgtcgctcatgctgcagt3180acctgtacgccgcgtatgccattcccaactatgcgcagggagtgaaactggtcgaggccg3240gccgctggctgccggacgagctggagctggcctgcggcaccgaggaccggcgccgcaaca3300gcggagcgcgtggcgccctgctcgaaatcgcccatgaagaaatgattcactacctgatgg3360tcaacaatgtgctgatggcgctcggcgagccgttxtacgccggcgccccggcgctgggag3420aacaggcgcgccagcgcttcggcctggacacggaatttgccttcgacccttt"ttccgagc3480formulaseeoriginaldocumentpage12aagacgacgaggtcacttccggctattgctggttcgactatgcccgcgacatttgccgca5760tcgacggcctgttcaatccctggtcggaaaaggagacgggacaccggctctggatgtcgg5820aaatcggcgacgccaggcgcggacaaagccgcaaacagaaagtcgcttatgccagggagg5880cggagccggccggcgtgaagctgtacgagcgggcgctggccgatgaggtcacgcccttcc5940acgagctgttcctgccgcaggcgatcctgatcgacggcgaagcgcgtcatgacggccgcc6000acacggtgctgggccaggcggccgacgcctgggtggtggagcggccgggcaaagccgcct6060cggtgttctatctccaggccggcggcaatcacttgctgcgcatggtcaccggcaacgacg6120cgcagcatcagtcggtacgcgactttccgaacttccttgccggcgacatcgcggccagcg6180ttttcgtgtcggaataa619權利要求1、一種脫氧紫色桿菌素合成相關基因簇，是將由VioA、VioB、VioC、VioD和VioE組成的紫色桿菌素合成基因簇中的VioD基因敲除，獲得重組基因簇。2、根據權利要求1所述的基因簇，其特徵在於所述基因簇為如下l)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；2)在嚴格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼紫色桿菌素合成途徑中的VioA、VioB、VioC和VioE四種酶的DNA分子；3)與l)的基因具有90%以上的同源性，且編碼紫色桿菌素合成途徑中的VioA、VioB、VioC和VioE四種酶的DNA分子。3、一種重組大腸桿菌，是將權利要求1或2所述的基因簇導入大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中獲得的產脫氧紫色桿菌素的重組菌。4、根據權利要求3所述的重組大腸桿菌，其特徵在於所述重組大腸桿菌為大腸桿菌BL-DVCGMCCNo.2557。5、含有權利要求1或2所述基因簇的表達盒。6、含有權利要求1或2所述基因簇或權利要求5所述的表達盒的重組表達載體。7、根據權利要求6所述的重組表達載體，其特徵在於所述重組表達載體為在原核表達載體的多克隆位點插入權利要求1或2所述的基因簇或者權利要求5所述的表達盒。8、構建權利要求3或4所述重組大腸桿菌的方法，是將權利要求6或7所述的重組表達載體導入大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，獲得產脫氧紫色桿菌素的重組菌。9、一種生產脫氧紫色桿菌素的方法，是以L-色氨酸為底物利用權利要求3或4所述的重組菌發酵生產脫氧紫色桿菌素。10、根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述L-色氨酸的濃度為0.3-0.5g/L;所述發酵溫度為10-37°C。全文摘要本發明公開了一種生產脫氧紫色桿菌素的方法及其專用重組菌。該方法是將脫氧紫色桿菌素合成相關基因簇導入大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中獲得的重組菌，該重組菌以色氨酸為底物發酵生產脫氧紫色桿菌素。其中，脫氧紫色桿菌素合成相關基因簇，是將由VioA、VioB、VioC、VioD和VioE組成的紫色桿菌素合成基因簇中的VioD基因敲除，獲得重組基因簇。所述重組菌是將所述的基因簇導入大腸桿菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中獲得的產脫氧紫色桿菌素的重組菌。本發明生產脫氧紫色桿菌素的方法產率較高，可以達到0.17g/L發酵液，且提取方便，分離純化簡單。文檔編號C12P17/16GK101319219SQ20081011660公開日2008年12月10日申請日期2008年7月11日優先權日2008年7月11日發明者姜瑞波,愷婁,翀張,王海勝,蔣培霞,趙洪新,邢新會,東魏申請人:清華大學